JPH06503417A - 光散乱法を用いた微小細胞のスクリーニング法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光散乱法を用いた微小細胞のスクリーニング法及び装置技術分野 本発明は、光散乱技術或いは光散乱技術と電子検出技術の組合せを用いて、選択 特性を発現する微視細胞を判別検査するための方法と装置に関する。更に詳細に は、本発明は、細胞集団の中に隠蔽された少くとも一種の標的細胞群を、モノク ローナル抗体の結着した小球（ミクロスフイア）を利用して各特定細胞の被検出 特性を変化させて前記標的細胞群の細胞を前記細胞集団から分化させることによ り分析を行なう方法と装置に関する。

背景技術 本発明は、研究、診断、医療或いは産業上の目的で、選択特性を発現する細胞集 団を計数するため生物細胞或いは細胞形成体を判別検査するための自動分析装置 及び前記装置を用いる分析方法に関する。更に詳細には、本発明の自動分析装置 と分析方法は、例えば、細胞と細胞形成体の詳細分類、細胞と細胞形成体の機能 表現型分類、白血病、リンパ腫或いは充実腫瘍細胞の分類なと多くの分類のため 用いることができ、これらの分類のため光学技術或いは光学・電子技術と抗体な どの特定の生物由来化合物分子の特異性の独特の組合せを利用して細胞と細胞形 成体の判別検査と選択的計数を遂行する。

自動血球計数装置による通常のヒト末梢血完全血球（ＣＢＣ）分析の自動化は既 に成功しており、その成功はフロリダ州、ハイアリア（ｌ（ｉａｌｅａｈ　）の クールターエレクトロニクス社（ＣｏｕｌｔｅｒεＩｅｃｔｒａｎｉｃｓ、Ｉｎ ｃ）　＄２クールターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲＣＯＵＮＴＥＲ１登録商標） 、型式Ａによるものである。本分析装置に採用された電子式粒子検出システムの 原理は、ワラス　エッチ、クールター（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒ） に１９５３年１０月２０日付で付与された米国特許第２，６５６．５０８号に記 載されている。このクールター検出原理はより高度な分析装置、例えば、クール ターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ１登録商標）、型式Ｓに発展し た。本装置には独特のコンピュータープログラムが組込まれ、ＣＢＣパラメータ ー分析、完全細胞計数、血小板計数と形態分析、赤血球（ＲＢ　Ｃ）形態分析、 正常血或いは異常車試料の識別分析等か可能になった。

前記クールター電子式粒子検出原理の実施のため、直流電流（ＤＣ）の開口供給 を伴う開口検出回路が採用される。これらの粒子検出装置は構造が単純であり、 極めて簡素且つ信頼性の高いものである。これは、米国のみならず全世界の診療 機関でほぼ普遍的にクールターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ１登 録商標）自動分析装置が採用されていることからも明白である。この基本的な開 口検出回路の改良がワラス　クールター（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　） とワルター　ホック（ＷａｌｔｅｒＨＯｇｇ）に１９７０年に付与された米国特 許第３．　５０２．　９７４号に開示されている。この擁準的直流電流開口供給 方式の外に、高周波開口電流が適用されるようになり、その結果、分類識別のた め好都合な別のパラメーター検出が可能になった。この高周波開口電流は血球内 雇導率と血球容積の関数である信号を発生する。直流電流開口回路により同時に 発生する信号は、主として細胞容積を示唆する通常のＤＣ振幅信号である。高速 割算回路を用いて、化層波数振幅を直流電流パルス振幅で割ることにより細胞容 積と、便宜的に“濁り度”と呼ばれる内部抵抗の関数である商を得る。この原理 の詳細は、１９７０年にワラス　クールターとワルター　ホックに付与された米 国特許第３．５０２，９７３号に記載されている。濁り度パラメーターは細胞分 類識別システムで利用可能であり、この目的のために、−個のあるいは一対の別 個の開口が用いられる。

発生時の信号対、即ち、一方は粒子容積の尺度であり他方は細胞内部抵抗すなわ ち濁り度の尺度である信号対のデータを照合することにより、相異なる細胞集団 の分類識別を行なうことができる。このデータを表示するための簡単な方法は散 乱プロット或いは散乱図と呼ばれる二元プロットによる。前記プロットの詳細は 、メラメド　メラニ−（Ｍｅｌａｍｅｄ　Ｍｅｌａｎｅｙ　）とメデルソーン（ Ｍｅｄｅｌｓｏｈｎ　）編、１９７９年、ニューヨーク州−ユーヨークのジョン 　ウィリー　アンド　ソング（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ）出版、フロ ー　サイトメトリー　アンド　ソーティング（Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　 ａｎｄ　ｔｒｙ　ａｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ　）の３７１頁に記されている。

クールター電子式粒子検出原理の初期の適用例は、赤血球の計数であり、それに 続くものとして、より高度な赤血球の外のパラメーターの測定への適用を挙げる ことかできる。末梢全血から赤血球を除去することにより、その赤血球除去が測 定されるへき残存白血球集団の特性を損じない限り白血球（ＷＢＣ）集団の分析 を行なうことが可能になった。この目的にそって赤血球溶解剤が開発され、これ は有用で広く利用されたか、後続の白血球測定の観点からはすべての点で全く満 足であると言えるものてはなかった。

ＤＣ容積のみ或いは多様な角度での光散乱を用いた従来の白血球流動分析法によ り、白血球はリンパ球、単球及び顆粒球の三群に分類され、顆粒球は好中球、好 塩基球、好酸球集団を含有することが証明されている。試料が適当であれば、好 酸球濃度については粗であっても有用な評価が可能である。第５番目の主細胞集 団である好塩基球については然しなから相対的に小さすぎて本アプローチには適 さない。

末梢血塗抹標本に異常が認められる時は免疫学的検査を行なうことも重要である 。白血病についても、好適な治療法を選ぶためにも又患者にできるだけ詳しい予 後を説明するためにもその病気の特定の亜型を決定することが必要である。例え ば、急性白血病の場合には、末梢血中に芽細胞が多く認められる。これらの未熟 細胞は分化しておらずリンパ球様とも顆粒球様とも分類することが困難なことが ある。急速に増殖している芽細胞亜集団かＴ１１受容体を担持していると認めら れる時は、その白血病は急性リンパ芽細胞性白血病、Ｔ細胞型と分類される。

一般に、Ｔ系ＡＬＬはＢ系ＡＬＬより予後が不良である。これらの白血病を分化 間に応じてさらに細分類することも慣例である。グループ　とグループ　は早期 の胸腺前駆細胞上に認められる抗原を発現するが、グループに発現する抗原は成 熟Ｔ細胞上に認められる表面抗原に類似する。白血病細胞上に発現する表面抗原 に関するこれらの情報は、患者の予後と治療に有用である。

最初の免疫学的実験は、リンパ球サブセットの測定のため光顕微鏡を用いて開発 された。ヒトリンパ球と羊赤血球間のロゼツト形成は、１９７０年ターム（Ｃｏ ｏｍｂｓ）らによって観察された。後続の研究により、適当な条件下では、胸腺 由来リンパ球（Ｔ細胞）のすへて或いは少くとも主要部はロゼツト形成現象を呈 することが明らかになった。これらの研究は、フィコール単離リンパ球を用い、 光顕微鏡により単離リンパ球のサブセット分類識別に通常採用される時間行われ た。

現在に至るまでリンパ球サブセットは蛍光標識されたモノクローナル抗体を有す る試料中で、細胞の蛍光標識により測定される。蛍光標識モノクローナル抗体は 抗原を発現する細胞表面りの標的抗原に結合する。次に、この細胞試料は蛍光顕 微鏡を用いるか或いは高度流動細胞測定装置を用いることにより測定する。流動 細胞測定装置を用いる時は、細胞試料の作成、データ収集及びデータ分析は特に 訓練を受けた専門家が担当すべきである。流動細胞測定装置は、レーザー、複雑 な光学システム、高性能計算機及び電気並びに流体システムを包含するものであ り、この流動細胞測定装置の各構成システムは適切に維持保守を行ない定期的に 数多くのキャリブレーションを実施すべきである。この流動細胞測定装置は現在 では基準のリンノく球サブセット測定法をなすものであるか、本装置を用いる方 法は装置か高価であり、本装置を正しく操作するためには熟練を要するなどの欠 点を伴う。

リンパ球ザブセットはまた、本願の譲受人であるクールターエレクトロニクス社 か開発した自動分析装置と方法によっても測定することができる。単純で改良型 の自動分析装置と同装置を用いる方法が、発明の名称が［選択特性を発現する細 胞集団計数のための細胞或いは細胞形成体の判別検査を行う自動分析装置と方法 」であり１９９０年９１２０日出願の米国特許出願第５８７，６４６号に開示さ れている。本特許出願は同じ発明の名称で１９８７年３月１３日出願された米国 特許出願第０２５．３４５号の継続出願である。上記出願には、電子式検出開口 原理の適用と、所定の細胞集団或いは細胞形成体を同定及び／又は計数するため の選択生物由来分子の特異性と、顕微鏡による粒子測定技術の組合せが記載され ている。この出願で用いる自動分析装置は、特定の溶解剤及び／又は多様な組成 の微視的小球或いは支持体に結合させた抗体と共に用いることができる。

発明の名称が「選択特性を発現する細胞集団を用いる細胞或いは細胞形成体を判 別検査するための方法と装置Ｊであり１９８８年１２月１６日出願の第二の米国 特許出願第２８５．８５６号には、全血試料或いはその分画からの直接サブセッ ト判別検査が開示されている。

発明の名称か［少くとも一つの検出パラメーターを用いて、選択特性を発現する 細胞集団により細胞或いは細胞形成体を判別検査する方法と装置」であり１９８ ９年４月１４日に出願された第三の米国特許出願第３３９，１５６号には、白血 球の多分化若しくは５分化と、リンパ球のサブセットと、全血試料から或いは赤 血球及び／又は白血球集団を一以上の光或いは電子パラメーターにより細胞集団 及び／又はそのサブセットを排除することにより除去した試料から行なう重複測 定が開示されている。

発明の名称が「隠蔽された或いは部分的に隠蔽された細胞を判別検査するための 方法と装置Ｊであり１９９０年５月１７日に出願された第四の米国特許第０７１ ５２５．２３１号には、特定のモノクローナル抗体の結着した小球を用いて被隠 蔽細胞の被検出特性を散乱図上のある細胞集団域から別の域へ移動させる被隠蔽 細胞の分析方法が開示されている。上記の四つの特許出願はいずれも本発明の説 明の一部をなすものとして引用する。

改良された血液学的分析装置とそれを用いる分析方法が、発明の名称が共に［光 散乱法を用いる多分化分析装置」である１９８７年３月１３日出願の米国特許出 願第０２５．４４２号と１９８７年１２月４日出願の継続米国特許出願第１２９ ．９５４号に開示されている。これらの出願も同じく本発明の説明の一部をなす ものとして引用する。本血液学的分析装置は、白血球（Ｌ）ＷＢＣ集団の多分化 実現のため光散乱と電子検出技術を利用する。この血液学的分析装置は、然しな からＬサブセットの分化に用いることはできない。理由は、前記サブセットがＬ 集団中に隠蔽されるからである。

細胞集団の各細胞に微視的粒子を選択的に付着させると、全細胞集団の内の少く とも一つの最初の位置を規定するパラメーターを変化させることか可能となる。

選択標的集団の各細胞に複数の微視的粒子を付加すると、この集団内で前記付加 か被測定容積及び／又は濁り度に作用して細胞集団を示す散乱国内に小点位置の 転移をもたらす。

特異性の判明している抗体を微視粒子の被覆に用いる。この被覆は被覆粒子に、 前記抗体か特異的に作用する抗原を発現する特定の細胞に選択的に付着する能力 を与える。これらの被覆された若しくは標識された細胞は粒子と細胞の結合体で あり、新規な実体として挙動する。前記被覆された若しくは標識された細胞の濁 り度、容積或いは濁り度ど容積の両者等のパラメーターは、細胞と粒子の双方が 得られる信号に及はす作用の累計を示すものと考えることができる。もし成分の 特性が異なると、その新規な実体は散乱図上で正味の作用力に対応して新位置へ 移動する。この新位置は、細胞のみの前位置と比較することにより前記新実体或 いは新実体の群の識別を可能にする。細胞に付着した粒子が磁性を有すれば、当 然、現行の技術を用いて前記新実体を磁性体によりとらえることができる。急速 混合を行えば、検討下の細胞特性に悪影響を与えることなく細胞集団を完全に捕 獲できるなどの予測されなかった効果が得られる。

基本的三種の細胞集団についてのみ、前記のＤＣ容積と濁り度パラメーターの独 特で個有の特性を利用して血液試料から同定と計数を容易に行なうことができる 。それ以上の細胞集団の検出と計数を行なうためには改良された溶解システムな どの工程の付加が必須となる。付言するまでもないが、前記のそれ以　。

上の細胞集団とは基本的三種の細胞集団であるリンパ球、単球及び顆粒球の亜集 団である。前記引用の米国特許出願に一致して行なう工程により、前記基本的三 種の細胞集団の亜集団を得る方法は明白である。

前記の単純な開口検出技術を二種以上の生物由来粒子と組合せて用いることによ り、特定の細胞集団を示す小点領域に独特の新位置を与えることができる。小点 プロット若しくは散乱図上での細胞集団の選択的移動は再現性を有し、前記基本 的三種の集団とは別の集団の分類識別に用いることができる。

ＤＣ容積と濁り度検出技術の最初で固有の組合せは、微視粒子を個々の選択細胞 へ付着させることにより修正することができる。粒子への選択性の付与は粒子表 面への被覆材として用いられる抗体などの生物由来分子の特性或いは特異性に依 存する。

細胞のみの集団であって細胞表面上に粒子を有しない集団は、他の集団或いは亜 集団と差違のない小点プロット位置を示し、そのため、相互区分が不可能なこと かある。同定、計数及び研究の対象である細胞の特定集団に対して選択的吸着性 を有する粒子の付加は、拳法により可能であり、十分な量の選択的粒子の特定の 標的細胞集団への選択付加は各細胞の量、容積及び濁り度の独特で新規な組合せ の結果として前記細胞集団の小点プロブｌ−位置の転移をもたらす。

本発明を実施するための方法と装置には、反応体と細胞形成体或いは細胞間の免 疫反応など多様な免疫反応を利用することかできる。例えば、バクテリア、ウィ ルスなとの細胞形成体の懸濁液の分析に本発明を適用することも可能である。本 発明で言う細胞とは、動物或いは植物の細胞であり、個別に或いは集合体として 同定できる細胞性バクテリアのカビをも含むものである。細胞は独立の単体とし ての機能を有する生体の最小構成体である。例えは、細胞は、組織から或いは血 液試料から得られるヒト赤血球（ＲＢ　Ｃ）及び白血球（ＷＢＣ）集団若しくは 腫瘍なとの異常細胞である。細胞形成体は特定のバクテリア及びウィルスと定義 される。適当な標識さえなされていればいかなる細胞も細胞形成体もヒト血液細 胞の例と同様に本発明の方法と装置を用いて当然に光学的に同定できるはずであ る。

前記引用の米国特許出願においては、用語“反応体“は溶解剤とモノクローナル 抗体を意味するものとして用いたが、本発明での反応体は、細胞或いは細胞形成 体の表面に認められる一種以」二の特定の分子を検出或いは同分子と反応する多 様な薬剤物質を包含するものである。そのいくつかの例を次に示す。

反応体　・　特定分子 抗体　抗原 薬　葉受容体 ホルモン　ホルモン受容体 成長因子　成長因子受容体 反応体は細胞上の特定分子と結合若しくは結着する。反応体は化学反応の一部を 構成するが、必ずしも化学的変化を受けることはない。

発明の開示 本発明は、白血球（ＷＢＣ）集団中の一種以上の標的サブセットなとの細胞集団 により隠蔽された一種以上の標的細胞群の判別検査を行うための方法と装置を提 供する。標的細胞群の計数は、モノクローナル抗体の結着した小球（ミクロスフ イア）を用いて特定細胞の被検出特性を変化させ隠蔽細胞集団から標的細胞群を 分化させて行なう。

全血試料或いはその一分画につき判別検査を行ない標的ＷＢＣサブセットの所望 の分析を達成することか可能である。試料分画は標的ＷＢＣサブセットに特異な モノクローナル抗体を含有する小球と混合され、この小球は標的細胞に結合して その細胞の被検出特性を転移させる。標的ＷＢＣサブセットを有する試料分画は 次に、内一つが光検出パラメーターである少くとも二つの検出パラメーターによ り検出され、標的ＷＢＣサブセットの特性は標的サブセットの直接測定に十分な 転移を受ける。

重複細胞集団の分析も行なわれる。

また、最初に試料分画の測定を行ない、次に特定の細胞を除去して、除去か行わ れなければ除去細胞により標的細胞群が隠蔽されたはずの領域での標的細胞群の 検出を行ない、再度、試料分画を測定して最初の測定結果と比較し標的細胞群を 分化させることができる。全血試料中の標的細胞は、未熟細胞であっても、本発 明によらなければＷＢＣ細胞集団により隠蔽される標的ＷＢＣサブセット集団で あってもよい。

図面の簡単な説明 本発明の好ましい実施態様を添付図面を参照して次に例示するが、添付図面中、 第１図は本発明の細胞判別検査分析装置の一態様を示す概略ブロック図であり、 第２図は本発明の細胞判別検査分析装置の第二の態様を示す概略ブロック図であ り、 第３図は本発明の細胞判別検査分析装置の一態様を示し、第４　Ａ−４Ｃ図は標 的ＷＢＣサブセットを得るため従来の散乱図からの本発明の技術による改変を示 す散乱図であり、第５Ａ−７Ｄ図は本発明の技術の一つを用いて得た異種標的Ｗ ＢＣサブセットの分析結果を示す散乱図であり、第８図は重複サブセットを決定 するための、本発明の細胞判別検査分析装置の一態様を示す別の概略ブロック図 であり、第９Ａ−９Ｆ図は本発明の技術の一つを用いて得た重複標的ＷＢＣサブ セットの分析結果を示す散乱図であり、第１０図は隠蔽細胞を決定するための、 本発明の細胞判別検査分析装置の一態様を示す概略ブロック図であり、第１１図 は隠蔽細胞を決定するための、本発明の細胞判別検査分析装置の別の態様を示す 概略ブロック図であり、第１２Ａ及び１２Ｂ図は本発明に従い光検出を用いて得 た正常血の分析結果を示す散乱図であり、 第１３Ａ及び１３Ｂ図は電子検出のみを用いて得た正常血の分析結果を示す散乱 図であり、 第１４Ａ及び１４Ｂ図は本発明に従い光検出を用いて得た異常車の分析結果を示 す散乱図であり、 第１５Ａ及び１５Ｂ図は電子検出のみを用いて得た異常車の分析結果を示す散乱 図であり、 第１６Ａ−Ｄ図は本発明の技術の一つを用いて得た異種標的ＷＢＣサブセットの 分析結果を示す散乱図であり、第１７Ａ−１７０図は多様なオフラインの調製技 術を用いて得た分析結果を示す散乱図であり、 第１８Ａ−１８Ｄ図は本発明に従い保存血液を用いて得た分析結果を示す散乱図 であり、 第１９Ａ−２０Ｄは本発明に従い異種検出パラメーターを用いて得た異種標的Ｗ ＢＣサブセットの分析結果を示す散乱図である。

発明を実施するための形態 第１図に本発明の細胞判別検査分析装置の第一の態様の全体構成を参照数字ｌＯ て示す。分析装置ＩＯは、少くとも第一組成いは第一集団の細胞（図省略）を含 有する試料１２を含む。

本細胞集団は後述の方法で分析すると、標的細胞集団、例えばサブセット或いは 第二組の細胞を隠蔽する。試料１２には前記細胞を添加する緩衝液を含めること ができる。

試料１２或いはその一分画は管路１４を経由して管路１８を経由して供給される 少（とも一種の反応体１６と一体化される。

標的細胞群の細胞は、細胞群転移装置２０内で変化或いは転移する少くとも一種 の被検出細胞特性を有する。標的細胞群細胞の被検出特性はこれを隠蔽細胞集団 の被検出細胞特性から分離するに十分な程度に変化或いは転移する。

反応体Ｉ６は、標的細胞群に特異な抗体の結着した複数の小球（ミクロスフイア ）でもこの小球を含んだものでもよい。反応体１Ｇと試料分画１２は前記小球の 標的細胞群への結合を強めるため共に混合することが好ましい。複数の前記小球 が標的細胞群の各細胞と結合し、一般的には前記小球が各細胞を被覆して、標的 細胞群の各細胞の被検出特性を変化或いは転移させる。試料分画１２は次に管路 ２４を経由して分析器２２に送られる。分析器では少くとも、試料分画１２の検 出を行ない同分画内の細胞数を計量する。分析器２２は後述の通り、１少くとも 一つか光学的パラメーターである少くとも二つの検出パラメーターを含む。

第２図に本発明の細胞判別検査分析装置の第二の態様の全体構成を参照数字３０ て示す。分析装置１１３０は、少くとも第一組の生存生物由来細胞（図省略）、 例えは白血球試料中のもの或いは白血球試料から得たものを含有する生物由来試 料３２を含む。生物由来試料３２の細胞は、定量及び／又は定性の分析或いは測 定において生物学的反応に関与することになる。この生物由来試料３２は、標的 ＷＢＣサブセット集団を隠蔽する少くとも一種のＷＢＣ集団を含む。試料３２は 又前記細胞を添加する緩衝液をも含むことができる。

本発明て言うＷＢＣサブセット集団は特定のモノクローナル抗体か結着すること のできるＷＢＣ集団のサブセットである。

モノクローナル抗体の命名法は世界保健機構と国際免疫学会か規定しており、モ ノクローナル抗体はクラスターデジグネーション（ＣＤ、　Ｃ１ｕｓｔｅｒ　ｄ ｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ　）命名法に従い命名される。

このクラスターデジグネーション命名法では細胞或いは細胞集団の特異性とその ＣＤ群に特異なモノクローナル抗体を規定する。例えば、下記実施例において、 ＣＤ２、ＣＤ４及びＣＤ８の３種のＣＤ群を用いたが、これらのＣＤ命名、特異 性並びにモノクローナル抗体供給業者の例は第１表に示す通りである。

０ＫＴＩＩ　（オルソ）、リセブター Ｌｅｕ５ａ　（ビーディー） ＣＤ４　（ｇｐ５６）　Ｔ４　（クールター）、　ヘルパー１０ＫＴ４ａ　（オ ルソ）、インデューサーＴＬｅｕ３ａ　（ビーディー） ＣＤ８　（ｇｐ　３２−３３）　Ｔ８　（クールター）、　細胞障害性１０ＫＴ ８　（オルソ）、サプレッサーＴＬｅｕ２ａ　（ビーディー） イｇｐ：糖タンパク、分子量（キロダルトン）ロ　クールター二フロリダ州ヒア レア（Ｈｉａｌｅａｈ　）のコールタ−社（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏ、　）　、コ ールタ−免疫事業部ピーディ一二ベクトンーディッキンソン　イミュノサイトメ トリー　システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　［ｍｍｕｎｏｏｃｙ ｔｏｍｅｔｒｅｙＳｙｓｔｅｍｓ） オルソ：ニューシャーシー州　ラリタン（Ｒａｒｉｔａｎ　）のすルソ　ディア グノスティク　システムズ（Ｏｒｔｈ。

ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）試料３２或いはその分画は管路３４を 経由して管路３８を経由して供給される少くとも一種の反応体３６と一体化され る。次に、赤血球（ＲＢ　Ｃ）を機能的に表示されたＲＢＣ除去装置４０により 混合物から除去する。装置４０による混合物からのＲＢＣの除去は多数の方法で 行なうことができる。例えば、ＲＢＣを反応体３６内の溶解素により溶解するこ とができる。好ましい溶解素とそれと共に用いることのできる消失剤の例が１９ ８７年１２月ｌＯ日に出願され発明の名称が［全血試料から白血球を単離、同定 及び／又は分析するための方法と薬剤システム１である米国特許出願第１３０， ９１１号（１９８７年３月１３日に出願され同一発明の名称を有する米国特許出 願第０２５．３０３号のＣＩＰ出願）に示されている。これらの特許出願も本発 明の説明の一部を構成するものとして引用する。反応体３６はＲＢＣに特異な抗 体の結着した複数の磁性小球（国省略）でもよいし、或いは前記小球を含んだも のでもよい。この際用いることのできる赤血球特異性抗体の例が、発明の名称か ［ヒト末梢血から白血球を回収するためのモノクローナル抗体及び同モノクロー ナル抗体を用いた回収方法」である米国特許第４．７５２，５６３号に示されて いる。本米国特許も本発明の説明の一部をなすものとして引用される。反応体１ ６は更に、試料中の緩衝液の外に或いは前記緩衝液の代りに緩衝液を含むことか できる。また、反応体３６は、選択されたＲＢＣ溶解素とＲＢＣ特異性小球の組 合せとすることかできる。

試料分画混合物３２からＲＢＣを実質的に除去した後は、前記混合物の一部をサ ブセット転移装置４２に移動させる。分析装置ＩＯにおけると同様、標的のＷＢ Ｃサブセット集団の少くとも一つの被検出細胞特性は前記装置４２中で変化ある いは転移し、その結果、標的ＷＢＣサブセット集団の被検出特性か隠蔽ＷＢＣ集 団の被検出細胞特性から分離されるに至る。

分析装置１０の場合と同様、反応体３６は、標的ＷＢＣサブセット集団に特異な 抗体の結着した複数の小球（ミクロスフイア）でもこの小球を含んだものでもよ い。反応体３６と試料分画３２は前記小球の標的ＷＢＣサブセット集団への結合 を強めるため共に混合することか好ましい。複数の前記小球か標的ＷＢＣサブセ ット集団の各細胞ど結合し、前記小球が各細胞を被覆して、標的ＷＢＣサブセッ ト集団の各細胞の被検出細胞特性を変化或いは転移させる。

本発明で用いることのできる磁性小球は特に限定されず、例えば、インディアナ 州カルメル（Ｃａｒｍｅｌ）のパン　ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）の販売する粒径が０．７ミクロン、容積対重量比カ月０％（固 形分）のポリスチレン磁性小球を用いることかできる。非磁性小球も特に限定さ れず、例えば、オレゴン州ボートランド（Ｐｏｒ　ｔ　１ａｎｄ）のインターフ ェイシャルダイナミクス（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）力月Ｄ Ｃ小球として販売する粒径が２．１Ｌミクロン、容積対重量比か８９６（固形分 ）の表面活性剤非含有硫酸化ポリスチレンラテックス小球を用いることができる 。これらの特定の小球はあくまで具体例であって、他の良く知られた販売業者か ら入手できる外の種類の父性のサイズの小球も本発明で同様に用いることができ る。

一般に、転移を行うためには、複数の小球が各細胞に結合するため、細胞の径よ り実質的に小さい径の小球を用いることが好ましい。分析装置が遊離の小球を目 的の細胞と認識して計数するのを防ぐため、通常、粒径０，６５〜３．０ミクロ ンの小球を用いる。複数の細胞が結着し巨大な小球と細胞の集団を作ることがあ るので、粒径のあまりに大きな小球は検出開口部を詰まらせたりふさぐことかあ る。被検出細胞を転移させるため、通常、安く購入できる非磁性小球か用いられ るが、磁性小球もまた利用される。

細胞の排除を磁気的に行なうためには、磁性小球のみか用いられる。本適用例に おいては、検出前に試料から細胞か排除されるため、小球の粒径はあまり重要で ない。この磁性小球は磁場内で迅速に且つ容易に除去されるものでなければなら ない。

このため、粒径０．６５〜４．５ミクロンの小球か好都合である。また、細胞の みか排除されるので、１０ミクロン以上の粒径の小球も用いることかできる。各 小球に複数の細胞か結着することかできるか、計数か行なわれないので、これは 分析装置の運転に支障をきたすことはない。

試料分画３２は、次に分析器２２と同一であって良い分析器４４に導入され、少 くとも試料分画３２中の細胞の検出と計数か実施される。

本発明を実施するため用いることかでき、前記第−及び第二の分析装置１０．３ ０による分析方法において用いることのできる分析器の具体例を第３図に総体的 に参照数字５０により示す。

分析器５０として、−具体例のみか示されているのであって、本発明の原理に従 う限りほぼ無限にその態様を変更することかできる。また、分析器５０は一般的 に機能的に図示されているか、具体的構造は多数の公知の方法により具現するこ とかできる。

分析器５０は、標的細胞試料、例えば試料１２或いは３２を分析器５０に吸入す るため用いる吸引ポンプ機構５２を有する。

吸引器５２は管路５３を経由して試料採取弁５４に連結されており、前記弁は試 料プローブ５５に連結している。希釈液ポンプ５６は希釈液或いは緩衝液を含む ことかでき、管路５８を経由して前記弁５４に連結されている。前記弁５４と前 記ポンプ５２は支障なければ前記ポンプ５６を経由する希釈液とともに細胞試料 １２或いは３２を吸引することかできる。

反応体温合物または細胞試料そのものを次に排出管路６０を経由して混合装置１ ６６中に移動させる。混合装置６６は、試料或いは反応体が導入される混合室６ ８を含む。ＲＢＣは溶解素ポンプ６２から管路６４を経由して混合室６８に導入 される溶解素により溶解される。反応が完結すると、消失剤または定着剤を装ｆ １７０から管路７２を経由して供給する。７４に機能的に図示するように混合物 ６８で溶解素及び／又は消失剤と試料を混合することにより前記反応を助けるこ とができる。

本発明で用いることのできる適当な混合装置６６の詳細は、共に発明の名称が［ 生物学的反応を効率化させるための小容積の急速混合を行う方法と装置」である １９８７年３月１３日出願の米国特許出願第０２５，３３７号とこれの継続出願 である１９９０年５月１日出願の米国特許出願第５１７．３０９号に記載されて いる。これらの特許出願も本発明の説明の一部を構成するものとして引用する。

混合装置６６を用いることにより、細胞の所望特性を損じることなく、反応温度 を上昇させることによって得られるような反応速度の顕著な上昇をもたらすこと かできる。混合装置を用いることにより、反応時間の短縮が可能で、一般に、２ 分以下のオーダーで反応を完結することができる。これにより、本自動高容積分 析装置５０を用いる分析が高速化される。

溶解素によりＲＢＣの除去された消失試料分画は管路７６を経由して直接ＷＢＣ 分析器７８（即ち、分析器２２または４４）へ搬送される。試料分画は直接、分 析器７８へ搬送され、そこではまず、前記試料から参照若しくは非転移のデータ を後の参照或いは比較のため取得する。分析器７８の物理的形態は多様であるが 、これらはいずれも米国特許第２．６５６．５０８号中にワラス　エッチ、クー ルター（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）が示した計数と粒径測定技術に 準拠するものであり、実際に商品として、鐘受入であるクールター　エレクトロ ニクス社（ＣｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、）から多数の血 球計数装置か市販されている。

分析器７８は一般に流動セル型検出室８０を含む。流動セル８０は少くとも光学 的好ましくは電子式検出装置を含む。流動セル８０は光学的に透明な材料、例え ば石英ガラスから作られる。流動セル８０は細くくびれた首状の開口８２を有し 、この間■１を試料分画がよく知られた方法で水力学的に形成された液流として 通過流動する。流動セル８０は、電磁光エネルギーの光線８４を集束させるため の、好ましくはレーザー光線源８６からのレーザー光線をレンズ構造体８８を経 由させて開口８２内の焦点に集束させるための光学平坦面を有する。開口８２を 通過する各細胞により光線は散乱され、散乱された光線８４は良く知られた方法 により検出構造体９０により検出される。本発明で用いることかできる光検出シ ステムで、以下ｖＣＳシステｌ、と称されるシステムは既に引用した米国特許出 願筒０２５゜４４２号と第１２９，９５４号に詳記されており、これらの特許出 願は本システムの説明の一部をなすものとして引用する。

流動セル８０はまた、を子検出回路を有する。流動セル８０はその第一の掌部分 ９１に内部流体と接触する第一の電極９２を有する。

前記流動せる掌部分９１と電極９２は、開口８２を介して内部に第二の電極９８ を有する第二の掌部分９６と連通ずる。電極９２と９８は反応性リード１００と １０２を介してＲＦ／ＤＣ源と検出回路１０４に連結されている。回路１０４は 電極９２と９８間でＤＣ或いは低周波電流若しくは信号と高周波信号を結合させ る。

低周波信号は開口８２を通過する細胞か発生する信号パルスの振幅を検出するた め用いる。一方、高周波信号は開口８２を通過する同一細胞の電気的濁り度を得 るため用いる。

細胞の電気的濁り度の測定に係る説明は、米国特許第３，５０２．９７４号及び 同特許に続く譲受人であるクールター　エレクトロニクス社（Ｃｏｕｌｔｅｒ　 Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　）の数々の刊行物の中でワラス　エッチ 、クールター（Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）とワルター　アール、　 ホック（Ｗａｉｔｅｒ　Ｒ，Ｈｏｇｇ）が記している。本発明で用いることので きる具体的な回路の例が、発明の名称が「粒子の抵抗とりアクタンスを測定する ための粒子分析装置Ｊである米国特許第４．７９１，３５５号に開示されており 、本特許も本発明の説明の一部をなすものとして引用する。

回路１０４が発生した被検出細胞からの信号はＤＣ信号り一部１０６とＲＦ信号 リード１０８を介して比較器１１０に送られる。比較器＋１０は試料分画から発 生の信号を保持することかできるか、これは後述の他の試料分画からの結果デー タとの比較を可能にするためである。また、比較器＋１０は、光学検出構造体９ ０からリード１１２を介して送られる光学検出インプット情報を有することがで きる。

分析器７８は、流動セル８０内で従来の方法で細胞を集束させるためのシースフ ローを有する。シースフローは、従来の方法で一対の管路１１６と１１８を介し て流動セル８０に連結された流動システム＋１４により与えられる。試料反応混 合物は導入管１２０を介して流動セル８０内に供給した後、流動セル８０から出 口管１２２を介して廃物容器１２４中に排出させることができる。

混合物の第一分画か分析器７８中で分析されている間に、混合装置６６はリンス 剤管路１２６を介しての洗浄と廃物管路１２８を介しての排出を行なって浄化す ることかできる。次に、第一試料分画を室６８に導入して、そこで前記試料分画 の被検出細胞特性を変更若しくは転移させる。或いは、その代りに、転移される へき試料分画を、第一の非転移若しくは標準試料分画結果データを最初に得るこ とはしないで、まず室６８に導入１−る。次に、ＷＢＣ小球を装置１３０から、 管路１３２、弁１３４及び基管路１３６を経由して室６８に導入し試料分画と混 合して標的のＷＢＣ或いは他の細胞群の転移を行なう。

ＷＢＣ小球は混合機構７４を用いて第二分画と混合する。転移のため、ＷＢＣ小 球と結着ＷＢＣ小球を伴う反応混合物は管路７６を経由して分析器７８（即ち、 分析器２２或いは４４）に導入され、分析器７８では第二分画か第一分画と同様 に分析され、両者の分析結果は比較器１１０内で比較される。ＷＢＣザブセット 被検出細胞特性の少くとも一つ、例えば細胞濁り度か第二分画内でＷＢＣサブセ ット結着小球によって変化を受け変化した結果を与える。この結果は分析に供す ることができる。

ＷＢＣ小球か磁性を有すれば、下記理由で、面記小球に結合したＷＢＣサブセッ ト集団を磁場或いは磁石１３８を用いた混合工程中及び／又は混合工程後に磁場 の作用で除去することができる。電磁機構或いは室６８を物理的に移動する磁石 １３８により磁場を作用させて磁気的に結合したＷＢＣサブセットを捕獲する。

結合ＷＢＣサブセットを有しない第二分画は次に前述の方法により管路７６を経 由して分析器７８へ搬送され分析される。

次に、分析器ｆｆ１５０は次の分析のため次の試料或いは試料分画を取り入れる 準備をする。プローブ５５はプローブ洗浄機構１４０により洗浄することかでき 、管路と室６８は通常の方法で洗浄することができる。以後の試料混合物の各分 析は高速、自動方式で行なうことができる。以後の試料混合物の分析間隔は数分 以下のオーダーである。

分析装置５０を運転する際、試料分画はまず装置１３０から供給される非磁性Ｗ ＢＣ小球と室６８内で混合した後、前記小球をＷＢＣサブセットの内の一つと結 合させることが好ましい。

次に、ＲＢＣ溶解素を混合物に加え、消失剤７０を反応混合物に加える。反応混 合物は管路７６を経由してＷＢＣ分析器７８に搬送され分析される。

溶解素を用いる代りに、試料１２或いは３２を混合装置６６へ送り、溶解素を用 いないてＲＢＣを除去することができる。

この場合は、ＲＢＣ小球装置１４２から管路１４４を経由して弁１３４へ搬送さ れ従って管路１３６を経由して室６８へ搬送されるＲＢＣ特異抗体の結着した小 球を用いることにより、ＲＢＣを磁気的に除去することができる。溶解素が用い られない時は、前記の磁気的に結合したＷＢＣと実質的に同じ方法で混合後磁石 １４０により結合ＲＢＣを磁気的に除去することができる。

第二の場合には、反応速度を高めるため、試料と、ＲＢＣ溶解素とＲＢＣ磁性ビ ードの両者との反応混合物を用いることができる。反応混合物を混合し、溶解素 を消失させ、結合ＲＢＣを磁気的に除去し、次にＷＢＣを前記の方法で分析する 。

本発明の技術は自然状態の試料、例えば分析装置１６６に直接導入される全血試 料を用いて記載したが、試料の作成はオフラインで行なうことが可能であり、ま た、所望であれば、部分的に前もって調製しておくことか可能である。試料から ＲＢＣを前もって除去しておくことも可能である。前記ＶＣＳシステムなどのシ ステムを用いることができ、この場合は、小球をオフラインで或いは調製方式で 添加することができる。次に被検出細胞特性のすてに転移した試料分画を後の分 析のため前記システム中に導入することかできる。ＶＣＳシステムの利用を含む 具体的実施例のいくつかを次に記載する。

第４Ａ−４Ｃ図を参照して説明する。第４Ａ図に示すように、感度を正しく設定 した標準■Ｃ３散乱図では、ＤＣ／光散乱中央値（ＭＬＳ）プロット上に前記小 球を有しない四つのＷＢＣ集団群、即ち単球（Ｍ）、Ｌ、好中球及び好酸球が示 される。

この散乱図は代表的な正常全血試料からの分析結果を示すものである。散乱図中 で好塩基球（Ｂ）はＬにより隠蔽されている。

Ｂは部分的にＬ領域を隠蔽するが、ＷＢＣ集団中でのこれらの割合は微々たるオ ーダーであり、所望の計数に実質的な影響を与えるものてない。然しなから、所 望であれば、Ｂの寄与を計数から減算することかできる。

小球を添加すると、小球で散乱された光は被検出特性を混成し、第４Ｂ図に示す ように、１４６のしと１４８のＭ、Ｎ、Ｅとからなるただ二つのＷＢＣ集団か分 離して計数されるようになる。ＭＬＳ感度（Ｘ軸）を低下さぜることにより、パ ターン拾しくは集団＋４６と１４８はＤＣ若しくはｙ軸方向に転移して散乱図領 域を自由化しＤＣ軸の右方か利用されるようになる。

第４Ｂ図を標準或いは対照として用いて、Ｔ４などのしサブセットに特異なモノ クローナル抗体の結着した非磁性小球を同−試料或いは前記試料の第二分画中に 混入させると転移か生じ第４Ｃ図に示すように散乱図の自由領域に直接サブセッ ト群１５０か形成される。

第４Ａ−４Ｃ図のデータは光散乱パラメーターとしてＭＬＳを用いて描いたもの であるが、任意の角度で得た光散乱データを用いることができる。本願では、前 記ｖＣ８特許出願中に記載したと同様、ＭＬＳは１０度と７０度間の角度で得た 光散乱情報と定義する。ＲＬＳＳａｌｌち回転光散乱は、ＭＡＬＳの対数＋定数 から誘導されたパルスピーク清報を前定義のＤＣ十定数により割算を行なうとこ ろの関数と定義される。このＲＬＳ関数は粒経成分を除去する効果を有し、内部 構造に、より多く関係した測定結果を与える。ＲＬＳを得るための別の方法では ＭＡＬＳ信号データの対数をＤＣ信号データの対数で割算する。

レーザー軸に対し９０度で中央化した光散乱情報は９０度若しくは高角光散乱（ ＨＡＬＳ）と称される。前方方向レーザー軸に対し約０度で得た光散乱情報はＦ ＷＤと称される。散乱図のデータは興味のデータにつき最良の表現を実現するた め相異なるパラメーターを用いて示す。

上記の手順はオフラインでもオンラインでも用いることかできる。従来のＶＣ３ 装置を利用する時は、手順の内環１〜３工程はオフラインで行なうことになる。

理由は、ＶＣ３装置は現在のところ小球の添加とそれの試料との混合のため必要 な装置を有しないからである。完全に自動化された装ｆ１５０はすべての工程を 自動的にオンラインで行なうことができる。オフラインの手順は一般に下記の通 りである。

１．１５０（或いはそれ以上）の全血を用意する。

２、単−Ｌサブセット特異モノクローナル抗体（Ｔ４、Ｔ８或いはＴｌｌを各々 別の混合容器中に入れる）の結着した非磁性２ミクロン小球を１５、或いは１５ のＭＳＩＧ対照小球を添加して対照著しくはハックグラウンド　標準を形成する （ＭＳＩＧはマウスのモノクローナル免疫グロブリンでありＷＢＣ或いはＷＢＣ サブセット集団のいずれに対しても特異性を有しない）。

３．２分間混合する（後で所定の時間、少くとも１時間まで放置することか　で きる）。

４、　（自動＞　ＶＣＳシステム中に導入する。

５　溶解、消失、オンライン分析をＶＣＳシステム中で行なう。

第５Ａ−５Ｄ図、第６Ａ−６Ｄ図及び第７Ａ−７Ｄ図は第４Ａ−４Ｃ図に対応し て、本発明の技術に従いＶＣＳシステム上で得た実際の分析結果を示す散乱図で ある。第４Ａ図は通常の感度設定で得た小球なしの正規プロットである。第４Ｂ 図はＸ軸感度を低下させて得た小球添加のプロットであり、二つの細胞群と、標 的転移細胞群のための自由領域を示す。従来のＶＣ３ｘ軸検出パラメーターのこ の変更の結果、細胞群のＸスケールか移動して散乱図上に標的転移ＷＢＣサブセ ットの被検出特性のための余白を残すことになる。実際のデータはｖＣＳシステ ムを用いて得たものであるが、第４Ｂ図の構成を得るための感度設定とともに記 載したシステムのいずれても本発明で用いることかでき、用いた場合はそれか標 準システムとなる。換言ずれは、本発明に従うシステムは第４Ａ図或いは第４Ｂ 図で具現した検出系のいずれも産生ずることができる。

第５Ａ図には、非結着対照小球を用いた対照若しくは非転移散乱図分析結果を示 す。Ｌは１５２群に認められる。一方、Ｍ、Ｎ及びＥは１５４群に認められる。

上記の通り、対照を示すことは不要である。理由は、第５Ｂ−５Ｄ図に示すよう に標的のＷＢＣサブセットの位置を直接求めることかでき、そのため参照分析結 果との比較を行なうことか不要であるからである。ＭＳＩＧ対照小球は、散乱図 パターンが干渉を受けないことを確認するためにのみ用いる。

第一の標的ＷＢＣサブセットであるＣＤ４細胞はＴ４小球の結着により第５Ｂ図 に示す転移を受ける。転移サブセットを有しないＬは１５６群に示され、Ｍ、Ｎ 、及びＥは１５８群に示される。ＣＤ４細胞の転移した被検出細胞特性は新しく １６０群を形成し、これは第５Ａ図の分析結果と比較するか、直接、全りに対す るＣＤ４細胞の分率として分析することができる。

本例では、ＣＤ４細胞の寄与率は５９．６％であることが判明した。比較のため 、同一試料を従来のＥＰＩＣ３（登録商標）流動細胞測定装置で分析したところ 、寄与率は６０．６％であるとの結果を得た。

同様な方法で、ＣＤ８細胞を分析し第５Ｃ図に示すような結果を得た。ＣＤ８細 胞はＴ８小球と結合することにより転移する。Ｌは１６２群に認められ、Ｍ、Ｎ 及びＥは１６４群に認められる。ＣＤ８細胞の転移した被検出細胞特性は別個の １６６群を形成し、これからＣＤ８細胞の寄与率がめられる。ＣＤ８の寄与率は １４．４％であった。流動細胞測定の比較値をめたところ、１４．０％の寄与率 であった。

ＣＤ２細胞の分析結果を第５Ｄ図に示す。ＣＤ２細胞はＴｌｌ小球と結合するこ とにより転移して別の１６８群を形成する。

ＣＤ２寄与率は８１．９９６とめられ、流動細胞測定の比較値をめたところ、７ ７．２９６の寄与率であった。

別の試料の分析結果を第６Ａ−６Ｄ図に示す。第６Ａ図は非転移対照散乱図てあ り、Ｌ群は１７０にＭ、Ｎ及びＥ群は１７２に認められる。

ＣＤ４の転移結果か第６Ｂ図の１７４群に示されている。ＣＤ４寄与率は４６． ３％であることが判明した。一方、流動細胞測定の比較値をめたところ、４６． ９％の寄与率であった。

ＣＤ８の転移結果か第６Ｃ図の１７６群に示されている。ＣＤ８寄与率は２４． ５％であることが判明した。一方、流動細胞測定の比較値をめたどころ、２０． ８％の寄与率であった。

ＣＤ２の転移結果か第６Ｄ図の１７８群に示されている。ＣＤ２寄与率は７１． ８％であることが判明した。

第三の試料の分析結果を第７Ａ−７Ｄ図に示す。第７Ａ図は非転移対照散乱図で あり、Ｌ群は１８０にＭ、Ｎ及びＥ群は１８２に認められる。

ＣＤ４の転移結果か第７Ｂ図の１８４群に示されている。ＣＤ４寄与率は４０． ３９６であることが判明した。一方、流動細胞測定の比較値をめたところ、３８ ．１％の寄与率であった。

ＣＤ８の転移結果が第７Ｃ図の１８６群に示されている。ＣＤ８寄与率は３３． ６％であることが判明した。一方、流動細胞測定の比較値をめたところ、３２． １％の寄与率であった。

ＣＤ２の転移結果か第７Ｄ図の１８８群に示されている。

ＣＤ２寄与率は７９．７９６であることか判明した。一方、流動細胞測定の比較 値をめたところ、７５．４！％の寄与率であった。

第８図に、本発明の細胞判別検査分析装置の第三の態様を示す。本装首の全体構 成を参照数字１９０て示す。本分折襞ｆｔ１９０は標的細胞群の重複率を測定す るため用いられる。これについては、全血試料或いはその分画から得る標的のＷ ＢＣ集団集団サブセット間して説明する。

本分折襞ｆｉ＋９０では、標的の少くとも二つのＷＢＣ集団サブセットを含有す る第一のＷＢＣ集団を含む生物学的試料１９２を用いる。この生物学的試料１９ ２或いはその分画は管路１９４を経由して管理１９８を経由する少くとも一種の 反応体１９６と一体化される。ＲＢＣは機能的に表示されたＲＢＣ除去装置２０ ０により前記試料分画から除去される。ＲＢＣの除去は上記の技術のいずれかを 用いて行われる。

ＲＢＣの除去が完了すると、混合物の分画を複数の異なる管路に供給する。第一 の管路は第一参照試料分画を管路２０６を介して直接分析器２０４へ搬送するた め用いられる。前記の分析器２２と４４と同様に、細胞特性は内一つが光検出パ ラメーターである少くとも二つの検出パラメーターにより検出される。

第二の管路２０８は第二の試料分画を“Ｘ”細胞転移装置２１Ｏに搬送する。前 記と同様に、“Ｘ”細胞は、標的の第−ＷＢＣ集団サブセットであってその少く とも一つの被検出細胞特性か装置２１０内て変更若しくは転移して前記標的のＷ ＢＣ集団サブセットの被検出特性か隠蔽ＷＢＣ集団の被検出特性から移動するＷ ＢＣ集団サブセットである。被検出細胞特性は前記のように標的のＷＢＣ集団サ ブセットに特異な抗体を有する複数の非磁性小球が前記細胞に結合することによ り転移する。試料分画は次に分析器２０４へ搬送される。分析器２０４により得 られるデータの各組は管路２１４を経由して設けられる比較器２１２での後の比 較のため保存される。

同様な方法によって、第三の試料分画は管路２１８を経由して“Ｙ”細胞転移装 置２１６へ搬送される。”Ｙ“細胞の被検出細胞特性は装置２１６内で変更若し くは転移される。次に、試料分画は分析器２０４と比較器２１２へ搬送される。

上記の結果、直接的に、或いは管路２０２を経由する非転移分析結果との比較に より“Ｘ”細胞と“Ｙ”細胞の百分率を得ることができる。前記の通り、比較は 不要であるので、管路２０２を分析値ｆｊｉ１９０から除去することかできる。

この場合は、然しなから、“Ｘ″細胞“Ｙ”細胞に重複が認められる時、どれだ け重複か生じるかのデータを得ることはできない。

重複率を決定するため、第四の試料分画を管路２２２を経由して”Ｘ”及び“Ｙ ”転移装置２２０に搬送する。本発明で言う“重複“は、細胞、細胞集団、細胞 の亜集団、細胞形成体などが少くとも二種の標的受容体或いは抗原を含むことを 意味する。この試料分画には、“Ｘ”細胞或いは標的の第一のＷＢＣ集団サブセ ットに特異な抗体を有する小球と、“Ｙ“細胞或いは標的の第二のＷＢＣ集団サ ブセットに特異な抗体を有する小球の両者を添加する。次に、試料分画を分析器 ２０４へ搬送し、データを比較器２１２へ送る。

重複率は管路２０８と２１８を経由して得られる別個の“Ｘ″百分率と“Ｙ″百 分率データを加算してめられる。この得られる和から、管１Ｍ２２２を経由して 得られる“Ｘ”と“Ｙ”の合計百分率データを減算する。これらの二つの合計百 分率が実質的に等しければ、“Ｘ”細胞と“Ｙ”細胞に重複は実質的に認められ ない。もしも差があれば、その差は“Ｘ”と“Ｙ”特異小球の両者か結合する細 胞の重複率を示す。分析値４！１９０は複数の管路を有するものとして記載した が、分析装置５０に一ついて記載したと同様に単一の管路を用いる順次分析装置 であることができる。分析装置１１’５０に対応して、複数の管路を設け、平行 に配列した管路２０８．２１８．２２２の各々に個別の混合装置６６を用いるこ とができる。本操作の具体的分析結果を第９Ａ−９Ｆ図に示す。

第９Ａ−９Ｆ図は標的ＷＢＣサブセットの重複を測定するため本発明に従い得た 具体的分析結果を示す散乱図である。第９Ａ図は標的のＣＤ４サブセツトを転移 させて得た散乱図である。

第５−７図に関して前記したように、ＣＤ４細胞は例えば、装置２１０内てＴ４ 小球に結合することにより転移する。転移群を有しないＬは２２４群を形成し、 ＣＤ４細胞の転移被検出細胞特性は新規な２２６群を形成する。本例では、ＣＤ ４細胞の寄与率は３４．７％であることか判明した。

同様に、第９Ｂ図は例えば装置２夏６内で標的のＣＤ８サブセツトを転移させて 得た散乱図である。残存しは２２８群を形成する。一方、ＣＤ８細胞の転移被検 出細胞特性は新規な２３０群を形成する。本例では、ＣＤ８細胞の寄与率は３３ ．９％であることが判明した。

重複ＣＤ４及びＣＤ８細胞の寄与率を、同一の試料分画内で標的分画内で標的Ｃ Ｄ４並びにＣＤ８サブセツトを例えば装置２２０内で転移させることにより得た 散乱図により第９Ｃ図に示す。残存りは２３２群を形成するが、ＣＤ４並びにＣ Ｄ８細胞の転移した細胞の被検出特性は新規な２３４群を形成する。

ＣＤ４とＣＤ８の合計寄与率は７０．５９６であった。ＣＤ４とＣＤ８の各々の 寄与率は３４．７％と３３．９％であり、それらの和は６８．６９６であった。

６８．６％と７０．５％の比較か比較器２１２内で実施され、実質的に等しいの でＣＤ４とＣＤ８細胞に重複は認められないとの結果が得られる。

第９図は、例えは管路２０８或いは２１８、若しくは図示されていない別の管路 内で標的ＣＤ２サブセツトを転移させて得た散乱図である。残存りが２３６群を 形成する。一方、ＣＤ２細胞の転移被検出細胞特性は新規な２３８群を形成する 。ＣＤ２細胞の寄与率は８５．８％であった。

第９Ｅ図は同−試料分画内で標的のＣＤ４並びにＣＤ２サブセツトを転移させる ことにより得た散乱図である。残存りが２４０群を形成する。一方、ＣＤ２並び にＣＤ４細胞の重複転移被検出細胞特性は新規な２４２群を形成する。ＣＤ２と ＣＤ４細胞の累計寄与率は８８．１％であった。ＣＤ２とＣＤ４の二つの個別寄 与率はそれぞれ予想通り８５．８％と３４．７％であり、その和は１２０．５％ であった。８８．１％を１２０゜５％から差引くことに予想通り、ＣＤ２とＣＤ ４細胞の重複率３２．４％が得られる。

第９Ｆ［ｌＮは同−試料分画内で標的のＣＤ８並びにＣＤ２サブセツトを転移さ せることにより得た散乱図である。残存りが２４４群を形成する。一方、ＣＤ２ 並びにＣＤ８細胞の重複転移被検出細胞特性は新規な２４６群を形成する。ＣＤ ２とＣＤ８細胞の累計寄与率は８７．０％であった。ＣＤ２とＣＤ８の二つの個 別寄与率はそれぞれ予想通り８５．８％と３３．９％であり、その和は１１９， ７９６てあった。８７．０％を１１９゜７９６から差引くことに予想通り、ＣＤ ２とＣＤ８細胞の重複率３２．７９６か得られる。

第１０図には、本発明の被隠蔽細胞判別検査分析装置の別の態様か示されており 、その全体の構成を参照数字２５０で示す。

分析値ａ２５０では、少くとも細胞の第−組若しくは第一集団（図省略）を含有 する試料２５２を用いる。この細胞集団は下記の分析を行うと標的の細胞群、例 えば細胞のサブセット若しくは第二組を隠蔽する。試料２５２は前記細胞が添加 される緩衝液を含むことかできる。

試料２５２或いはその分画は管路２５４を経由して管路２５８を経由して搬送さ れる少くとも一種の反応体２５６と一体化される。得られる混合物の第一分画は 直接、管路２６２により分析器２６０へ搬送される。分析器２６０は分析器２２ と同様でよく、それは少くとも試料分画の検出と細胞の計数を行なう。

分析結果は管路２６６を経由して比較器２６４へ送られる。

第二試料分画は管路２７０を経由して細胞除去装置２６８へ搬送される。細胞の 除去は、前記のように、転移或いは空乏により行なう。転移の場合は、非磁性小 球を隠蔽細胞集団に結合させ被検出細胞特性を転移させて標的の被隠蔽細胞集団 の被検出細胞特性から分離させる。一方、空乏の場合は、磁性小球を隠蔽細胞集 団に結合させて、次に磁力を用いて試料分画から除去する。

前記第二試料分画は次に管路２７２を経由して分析器２６０に搬送され、発生デ ータは比較器２６４へ送られる。前記二つの試料分画からのデータは比較され、 標的の被隠蔽細胞群の寄与率が決定される。

第１１図には、本発明の細胞判別検査分析装置の別の態様か示されており、その 全体の構成を参照数字２８０て示す。分析器２８０は分析器２５０に類似するが 、分析器２８０では少くとも第一組の生存生物由来細胞（図省略）、例えば全血 試料中の或いは前記試料由来のものを含有する生物学的試料２８２を用いる。生 物学的試料２８２の細胞は定量的及び／又は定性的測定或いは分析において生物 学的反応に関与するものである。

生物学的試料２８２は標的のＷＢＣ集団を隠蔽する少くとも一つのＷＢＣ集団を 含む。試料２８２は又、細胞が添加される緩衝液を含むことができる。

試料２８２或いはその分画は管路２８４を経由して管路２８８を経由して搬送さ れた反応体２８６と一体化される。ＲＢＣ除去装置１１２９０内で試料分画２８ ２からＲＢＣが除去される。

ＲＢＣの除去は前記の多数の方法のいずれかを用いて実施することができる。Ｒ ＢＣが除去された試料の一部は管路２９２を経由して分析器２９４へ搬送され、 ここでＷＢＣ集団の検出と計数が行われる。分析器２９４からのデータは、分析 器２５０と同様、管路２９６を経由して比較器２９８へ送られる。

第一試料分画は管路３０２を経由して機能的に表示された好中球（Ｎ）除去装置 ３００へ搬送される。Ｎは、いずれも前記の通り、濁り度などのパラメーターを 変更或いは転移させ、または磁気的除去を行うことによって混合物から除去する ことかできる。本例で用いられるＮ特異抗体の具体例は、米国特許第４．９３１ ，３９５号［好中球に特異なモノクローナル抗体ｊに開示されている。

Ｎを除去若しくは転移させた後の混合物は、次に、管路３゜４を経由してＷＢＣ 分析器２９４へ搬送される。分析器２９４の分析結果は比較器２９８へ送られる 。第二試料分画の分析結束を第一試料分画のものと比較してＮに以前に隠蔽され ていた細胞かＮ領域に残っているかどうかを調べる。

第１２Ａ図を参照して説明する。ＶＣ８型装置で赤血球を除去した後の正常全血 試料では、光散乱柱状図に次の細胞種の群が現れる、即ち、ＬａＯ２、Ｍ２Ｏ３ 、Ｎ３１０及びＥ３１２゜然しなから、成熟Ｎの例えば、空乏或いは転移による 除去後では、細胞集団は第１２Ｂ図に示すようにＬａＯ２と、Ｅ３１２とＭ２Ｏ ３の３つの群に減少する。正常時に成熟Ｎ集団を示すデータか占めていた領域３ １４が空になる。

第１３Ａ及び１３ＢＩＮに示すように、電子検出パラメーターのみを用いた時Ｅ が未熟細胞域を隠蔽するのを防ぐため光検出パラメーターが必要である。ＤＣと 濁り度を検出パラメーターとして用いた第１３Ａ図において、通常の散乱図には ただ三つの細胞群が現れる。第一の３１６群はしてあり、３１８群はＭであるが 、第三の３２０群はＥとＮの両者を含有する。従って、Ｎを除去すると、第１３ Ｂ図に示すように、３１６群と３１８群は残存しＮの除去により強化されるが、 Ｅは３２２群に残存する。Ｎにより隠蔽されていた外のいずれの細胞も３２２群 において引続きＥにより隠蔽される。

第１４Ａ及び１４Ｂ図に示す未熟Ｎを含有する異常試料においては、試料中のＮ の未熟度を測定するために光散乱パターンが有用である。第１４Ａ図にはＬ３２ ４、Ｍ３２６、Ｎ３２８及びＥ３３０の群が示されている。前記試料から成熟Ｎ を除去した後は、第１４Ｂ図に示すように、光散乱柱状図のＮ領域には未熟Ｎ細 胞３３２を示すデータのみが表示される。“未熟指数”を決定することが可能で あり、これは試料中のＮの未熟度を示唆する。未熟Ｎは第１４Ａ及び１４Ｂ図の データがら全ＷＢＣの３６．３％を占めると計算された。比較のため、試料上で マヌユアル・スライド・ディファレンシアルを行ない合計３７９６のバンド、後 骨髄球と骨髄法を得た。未熟Ｎを示すデータは、電子検出のみが使用された時は 第１５Ａ及び１５Ｂ図に示すようにＥにより隠蔽される。

分析装置２８０はＮの除去について説明したが、第１６Ａ−Ｄ図に関して説明す るように他の標的ＷＢＣサブセットについての分析も可能である。これらの図に 於ては、散乱図はＤＣとＲＬＳを用いて描いたものである。第１６Ａ図は第１２ Ａ図と同様に対照散乱図を示し、Ｌは３４０群に現れる。

第１６Ｂ図に於てＬは３４２群に現れるが、これはＣＤ２ＷＢＣサブセツトを前 記Ｎ除去技術を用いてＣＤ２抗体の結着した磁性小球により除去した後の残存り を示すものである。３４２群の残存りを３４０群の全りと比較することにより、 ８９％のＣＤ２寄与率か得られる。但し、流動細胞測定法で比較のためめた寄与 率は９３％であった。

ＣＤ４を除去した分析結果か第１６Ｃ図の３４４群に示されている。ＣＤ４寄与 率は５８９６てあったが、流動細胞測定法で比較のためめた寄与率は６２％であ った。

ＣＤ８を除去した分析結果か第１６Ｄ図の３４６群に示されている。ＣＤ８寄与 率は２１％であったが、流動細胞測定法で比較のためめた寄与率は２０％であっ た。

前記の通り本発明の技術を実施するにあたって、自動分析器で試料８合物の分析 を行なう前に一連のオフラインの或いは未前調製の工程を採用することができる 。オフラインで本発明の技術を実施する際、適正な分析結果を支障なく得るため にはいろいろな注意を心掛けるへきであることが判明した。例としてＣＤ４を用 い、第１７Ａ−１７Ｄ図に示した発生データに関して必要な工程と注意事項を次 に記す。各図とも同一試料の一部を用いる。散乱図はＲＦとＬ　Ｓ　＋　Ｄ　Ｃ を用いて作成した。

第１７Ａ図に、細胞集団の変更若しくは転移の標準手順を実施した後の分析結果 が示されている。＋５０の全血から成る試料分画とＣＤ４抗体を被覆した小球１ ５を合一し、すぐに２分間混合する。この結果、ＣＤ４細胞は３４８群に現れ、 従って適正な細胞転移か行われたことを示し、ＣＤ４寄与率は４０．３％である 。

本手順に変更を加えると適正な細胞転移が行われないことかある。小球を液剤中 に懸濁した小球の形態で供給すると、小球に結着した抗体か部分的に小球から離 れ、懸濁液或いは液剤上澄中に遊離することがある。この遊離した抗体は細胞上 の抗原部位に結着し、閉塞して小球が細胞と結合するのを妨害する。

この結果、標的細胞群は部分的に或いは完全に非転移となり。

有効な分析結果が得られないことになる。小球と試料を合一した後はすばや（混 合を行うと上記の問題は回避できると考えられる。一方、小球と試料を合一した 後まず混合することなくインキュベートすると、遊離抗体が分散して抗原部位を 閉塞することになる。

第１７Ｂ図にＣＤ４試薬上澄１５のみを試料と合一させて行った分析の結果を示 す。合一で得た混合物を１５分間インキュベート（放置）した後、小球を添加し 、２分間混合する。ＣＤ４細胞か３５０群に現れ、ＣＤ４寄与率は３４．４％で ある。

３４８群に比べ約６％のこの減少はＣＤ４細胞の一部が閉塞されたことを示唆す る。

第１７ｃ図も、ＣＤ４試薬からの上澄１５と試料分画を合一させて行った分析の 結果を示すものであるが、合−後短時間、渦混合し１５分間インキュベートする 。前記と同様にＣＤ４小球を加え２分間混合しても転移が行オ）れないので、渦 混合は遊離抗体をより迅速に分散すると考えられる。分析結果は優位差なしのＣ Ｄ４寄与率０．５％を示す。これは細胞抗原部位のほとんと総てか遊離抗体で閉 塞されていることによる。

ＣＤ４抗原部位のみが限定的に閉塞されることを示すため、ＣＤ８試薬からの１ ５の上澄を試料分画に加え、渦混合し、１５分間インキュベートする。次に、Ｃ Ｄ４小球を試料分画と合一させ、２分間混合する。第１７Ｄ図に示すように、Ｃ Ｄ４細胞が３５２群に現れ、ＣＤ４寄与率は４０．０％である。これから、ＣＤ ４抗原部位はＣＤ８で閉塞されないことか分る。

結論として、回分式分析法では、試料分画と小球は合−後早急に或いは数分内に 混合すべきである。但し、試料分画と小球を撹拌ないし渦混合しなくても、約１ ０分のインキュベーションの間は適正な分析結果か得られるものと考えらオ］る 。然しなから、好ましく最良の分析結果は迅速な混合によって得られる。

これは、一度混合を行うと、分析結果は少くとも１時間の保存期間に劣化するこ とはないことに起因する。

第１８Ａ−１８Ｄ図に、分析の約２４時間前に採取された試料につき、第１７Ａ −Ｄ図と類似の散乱図が示されている。第１８Ａ図に、非結着対照小球のみを添 加した場合で二つのＷＢＣ集団か分離して示されており、Ｌが３５４群に現れ、 ＭＳＮ及びＥが総合的に３５６群に現れる。第１８Ｂ図では標的の第−ＷＢＣサ ブセットであるＣＤ４細胞がＴ４小球の結合により転移してＣＤ４細胞か３５８ 群に現れ、寄与率は４３．３％である。Ｌの３６０ｎはＣＤ４細胞か転移され除 去された後に残存するＬによる。ＣＤ４寄与率は直接的に、或いは第１８Ａ図の 元の群との関連性にもとづきめることができる。

各々第１８Ｃ図と第１８Ｄ図に示すように標的のＣＤ８サブセットとＣＤ２サブ セットが得られた。ＣＤ８細胞３６２群の寄与率は２７．６％であった。残存し 細胞の３６４群も形成されている。ＣＤ２細胞３６６群の寄与率は６５，９９６ であった。

残存し細胞の３６８群も形成されている。これらの老化試料の結果は重要である 。これは、血液試料は時とともに劣化するという公知事実に照し重要である。こ れらの結果から、保存時間２４時間までの試料であれば本発明の分析は操作可能 であることが明かである。然しなから、遅れ（エージング）を合理的な範囲でて きるだけ少くする手順を採用することが好ましいことは当然である。

第１９Ａ−１９Ｄ［Ｎと第２０Ａ−２０Ｄ図は、ＷＢＣ集団を最初に全血試料か ら単離して得た試料からのＷＢＣサブセットの転移を示す。第１９Ａ図のＬ　Ｗ ＢＣ集団のすべてを含有する対照パターンは、９０度光散乱をＸ軸として前方角 光散乱をｙ軸として用いて得られる。第１９Ｂ−１９Ｄ図の各々のＣＤ２細胞３ ７２群、３７４群及び３７６群はいろいろの濃度、すなわち、５、ＩＯ並びに２ ５マイクログラムでＴｌｌ小球を用いて得たものである。

再度、第２０Ａ図に示すように対照パターン３７８を得た。

第２０Ｂ図に示すように、ＣＤ２細胞３８０群を得た。第２゜０図に示すように 、ＣＤ４細胞３８２群を得た。第２００図に示すように、ＣＤ８細胞３８４群を 得た。

本発明の分析装置はまた、ＷＢＣの絶対数並びにＷＢＣサブセット集団の絶対数 を計量することが可能である。エイズ（ＡＩＤＳ）患者の薬剤治療法の判断には 特定のＣＤ４集団数が用いられるので、上記絶対数の計量はエイズ患者の治療に 特に有用である。譲受人であるクールターエレクトロニクス社（Ｃｏｕ　１ｔｅ ｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　）の多くの市販細胞計数装置で行う 従来の方法に従い、絶対数の計量は特定の容積中のＷＢＣの数を数えることによ って実施される。

本発明の技術を用いて磁気的に小球を除去する時は、試料分画の溶解及び消失を 行なう前に小球を除去することが好ましい。

これは、光散乱パターンに干渉する小球をより効率的に除去するため好ましい。

例えば、ＩＤ３抗体結着小球を用いた次のオフライン手順が好ましい： １．全血試料２８を希釈剤８２とＩＤ３小球４０と合一させる： ２．１５秒のオーダーの混合を行なう：３、磁場を１−２分間印加する； ４、混合物上澄を除去する。

５、溶解素３００を１０−１２秒間で加える：６、消失剤１２０を６−８秒間で 加える；７、試料を系に加えて分析手順の残りを行なう。

ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、４Ａ ＬＳ ＦＩＧ。４Ｂ ＭＬＳ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　４Ｃ ＬＳ ＦＩＧ、７Ａ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、　ｌ○ ＦＩＧ、ｌｌ 濁り度 ＦＩＧ、１５Ａ ＦＩＧ、１５Ｂ 濁り度 ９０°　９０゜ ＦＩＧ、　２０Ａ　ＦＩＧ、　２０Ｂ 国際調査報告 フロントベージの続き （７２）発明者　クールター　ウォーレス　エムアメリカ合衆国　フロリダ州　 ３３１６６　マイアミ　スプリング　クワイル　アベニュ（７２）発明者　ロド リゲス　カルロス　エムアメリカ合衆国　フロリダ州　３３１６５　マイアミ　 ニスダブリュー　サーチイーサード　ストリート　１００１０ （７２）発明者　ハジェク　コンスタンス　マリ−アメリカ合衆国　フロリダ州 　３３０１４　マイアミ　ウィンドミル　ゲイト　ロード

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少くとも一種の隠蔽細胞集団を含有する細胞試料の少くとも一部から少くと も一種の標的細胞群を分析する方法であって、 第一試料分画中にあって標的の少くとも第一選択細胞群の被検出特性を変化させ て前記細胞群の被検出特性を隠蔽細胞集団の被検出特性から転移させた後、 内一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターにより前記第一 試料分画の検出と計数を行なって前記標的の選択細胞群の寄与率を得ることを特 徴とする標的細胞群分析方法。 ２．前記標的の選択細胞群上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を準備 し、前記小球を前記試料分画と混合して前記標的の選択細胞群に結合させ前記標 的選択細胞群の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより前記被検出特 性を変化させることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記標的の細胞集団サブセッ ト上の抗原に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項２に記載の方法 。 ４．全血試料の少くとも一部で前記細胞試料を形成させ、前記隠蔽細胞集団が白 血球集団であり、前記標的の選択細胞群が前記白血球集団のサブセット集団であ ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．前記白血球集団のサブセット上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料分画と混合して前記白血球集団のサブセットに結 合させ前記白血球集団のサブセットの少くとも一つの被検出特性を転移させるこ とにより前記被検出特性を変化させることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記標的の白血球集団サブセ ット上の抗原に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項５に記載の方 法。 ７．第一白血球集団のサブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球を 準備し、前記小球を前記試料と混合して前記第一サブセット集団に結合させ前記 第一サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第一白 血球集団のサブセットを転移させることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ８．第二白血球集団のサブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球を 準備し、前記小球を前記試料と混合して前記第二サブセット集団に結合させ前記 第二サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第二試 料分画中の第二白血球集団のサブセットを転移させることを特徴とする請求項７ に記載の方法。 ９．前記第一白血球集団のサブセットに特異な前記モノクローナル抗体の結着し た第一組の小球と前記第二白血球集団のサブセットに特異な前記モノクローナル 抗体の結着した第二組の小球からなる二組の小球を準備し、前記二組の小球を第 三の試料分画と混合して前記第一サブセット集団と前記第二サブセット集団に結 合させ前記第一サブセット集団と前記第二サブセット集団の各々の少くとも一つ の被検出特性を転移させることにより第三試料分画中の前記第一及び第二白血球 集団の両サブセットを転移させ、第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比 較して第一及び第二白血球集団サブセットの重複率を決定することを特徴とする 請求項８に記載の方法。 １０．ＣＤ４白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ４サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ４サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより ＣＤ４白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請求項６に記載の方 法。 １．ＣＤ８白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球を 準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ８サブセット集団に結合させ前 記ＣＤ８サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第 二試料分画中のＣＤ８白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請求 項１０に記載の方法。 １２．各々、前記ＣＤ４及びＣＤ８白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を準備し、前記二組の小球を第三の試料分画 と混合して前記ＣＤ４及びＣＤ８サブセット集団に結合させ前記ＣＤ４及びＣＤ ８サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第 三試料分画中の前記ＣＤ４及びＣＤ８白血球集団サブセットの両者を転移させ、 第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ４及びＣＤ８白血球集 団サブセットの重複率を決定することを特徴とする請求項１１に記載の方法。 １３．ＣＤ４白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ４サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ４サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより ＣＤ４白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請求項６に記載の方 法。 １４．ＣＤ２白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ２サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ２サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより 第二試料分画中のＣＤ２白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請 求項１３に記載の方法。 １５．各々、前記ＣＤ２及びＣＤ４白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を準備し、前記二組の小球を第三の試料分画 と混合して前記ＣＤ２及びＣＤ４サブセット集団に結合させ前記ＣＤ２及びＣＤ ４サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第 三試料分画中の前記ＣＤ２及びＣＤ４白血球集団サブセットの両者を転移させ、 第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ２及びＣＤ４白血球集 団サブセットの重複率を決定することを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．ＣＤ８白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ８サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ８サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより ＣＤ８白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請求項６に記載の方 法。 １７．ＣＤ２白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ２サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ２サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより 第二試料分画中のＣＤ２白血球集団サブセットを転移させることを特徴とする請 求項１６に記載の方法。 １８．各々、前記ＣＤ２及びＣＤ８白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を準備し、前記二組の小球を第三の試料分画 と混合して前記ＣＤ２及びＣＤ８サブセット集団に結合させ前記ＣＤ２及びＣＤ ８サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移させることにより第 三試料分画中の前記ＣＤ２及びＣＤ８白血球集団サブセットの両者を転移させ、 第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ２及びＣＤ８白血球集 団サブセットの重複率を決定することを特徴とする請求項１７に記載の方法。 １９．前記全血試料が赤血球集団を含有し、前記赤血球集団を前記試料から前記 白血球集団の品質及び／又は量に悪影響を与えることなく除去することを特徴と する請求項４に記載の方法。 ２０．前記被検出特性を変化させる前にまず前記第一試料分画の検出と計数を行 ない、次に前記計数結果を比較して寄与率を得ることを特徴とする請求項１に記 載の方法。 ２１．少くとも一種の隠蔽細胞集団を含有する細胞試料の少くとも一部から少く とも一種の標的細胞群を分析するための装置であって、 第一試料分画中にあって標的の少くとも第一選択細胞群の被検出特性を変化させ て前記細胞群の被検出特性を隠蔽細胞集団の被検出特性から転移させる機構と、 内一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターにより前記第一 試料分画の検出と計数を行なって前記標的の選択細胞群の寄与率を得る機構を有 することを特徴とする標的細胞群分析装置。 ２２．前記標的の選択細胞群上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を与 えることにより前記被検出特性を変化させる機構と、前記小球を前記試料分画と 混合して前記標的の選択細胞群に結合させ前記標的選択細胞群の少くとも一つの 被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする請求項２１に記載の装置 。 ２３．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記標的の細胞集団サブセッ ト上の抗原が前記特定分子を形成することを特徴とする請求項２２に記載の装置 。 ２４．全血試料の少くとも一部で前記細胞試料を形成し、前記隠蔽細胞集団が由 血球集団であり、前記標的の選択細胞群が前記白血球集団のサブセット集団であ ることを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ２５．前記白血球集団のサブセット上の特定の分子に特異な反応体の結着した小 球を与えることにより前記被検出特性を変化させる機構と、前記小球を前記試料 分画と混合して前記白血球集団のサブセットに結合させ前記白血球集団のサブセ ットの少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする請 求項２４に記載の装置。 ２６．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記標的の白血球集団サブセ ット上の抗原が前記特定分子を形成することを特徴とする請求項２５に記載の装 置。 ２７．第一白血球集団のサブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることにより第一白血球集団のサブセットを転移させる機構と、前記小球 を前記試料と混合して前記第一サブセット集団に結合させ前記第一サブセット集 団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする請求 項２６に記載の装置。 ２８．第二白血球集団のサブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることにより第二試料分画中の第二白血球集団のサブセットを転移させる 機構と、前記小球を前記試料と混合して前記第二サブセット集団に結合させ前記 第二サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有すること を特徴とする請求項２７に記載の装置。 ２９．前記第一白血球集団のサブセットに特異な前記モノクローナル抗体の結着 した第一組の小球と前記第二白血球集団のサブセットに特異な前記モノクローナ ル抗体の結着した第二組の小球からなる二組の小球を与えることにより第三試料 分画中の前記第一及び第二白血球集団の両サブセットを転移させる機構と、前記 二組の小球を第三の試料分画と混合して、前記第一サブセット集団と前記第二サ ブセット集団に結合させ前記第一サブセット集団と前記第二サブセット集団の各 々の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構と、第一、第二及び第三の試料 分画の分析結果を比較して第一及び第二白血球集団サブセットの重複率を決定す る機構を有することを特徴とする請求項２８に記載の装置。 ３０．ＣＤ４白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることによりＣＤ４白血球集団サブセットを転移させる機構と、前記小球 を前記試料と混合して前記ＣＤ４サブセット集団に結合させ前記ＣＤ４サブセッ ト集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする 請求項２６に記載の装置。 ３１．ＣＤ８白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることにより第二試料分画中のＣＤ８白血球集団サブセットを転移させる 機構と、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ８サブセット集団に結合させ前 記ＣＤ８サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有する ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。 ３２．各々、前記ＣＤ４及びＣＤ８白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を与えることにより第三試料分画中の前記Ｃ Ｄ４及びＣＤ８白血球集団サブセットの両者を転移させる機構と、前記二組の小 球を第三の試料分画と混合して前記ＣＤ４及びＣＤ８サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ４及びＣＤ８サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移 させる機構と第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ４及びＣ Ｄ８白血球集団サブセットの重複率を決定する機構を有することを特徴とする請 求項３１に記載の装置。 ３３．ＣＤ４白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることによりＣＤ４白血球集団サブセットを転移させる機構と、前記小球 を前記試料と混合して前記ＣＤ４サブセット集団に結合させ前記ＣＤ４サブセッ ト集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする 請求項２６に記載の装置。 ３４．ＣＤ２白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることにより第二試料分画中のＣＤ２白血球集団サブセットを転移させる 機構と、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ２サブセット集団に結合させ前 記ＣＤ２サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有する ことを特徴とする請求項３３に記載の装置。 ３５．各々、前記ＣＤ２及びＣＤ４白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を与えることにより第三試料分画中の前記Ｃ Ｄ２及びＣＤ４白血球集団サブセットの両者を転移させる機構と、前記二組の小 球を第三の試料分画と混合して前記ＣＤ２及びＣＤ４サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ２及びＣＤ４サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移 させる機構と、第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ２及び ＣＤ４白血球集団サブセットの重複率を決定する機構を有することを特徴とする 請求項３４に記載の装置。 ３６．ＣＤ８白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることによりＣＤ８白血球集団サブセットを転移させる機構と、前記小球 を前記試料と混合して前記ＣＤ８サブセット集団に結合させ前記ＣＤ８サブセッ ト集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特徴とする 請求項２６に記載の装置。 ３７．ＣＤ２白血球集団サブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球 を与えることにより第二試料分画中のＣＤ２白血球集団サブセットを転移させる 機構と、前記小球を前記試料と混合して前記ＣＤ２サブセット集団に結合させ前 記ＣＤ２サブセット集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有する ことを特徴とする請求項３６に記載の装置。 ３８．各々、前記ＣＤ２及びＣＤ８白血球集団サブセットの一方に特異なモノク ローナル抗体の結着した二組の小球を与えることにより第三試料分画中の前記Ｃ Ｄ２及びＣＤ８白血球集団サブセットの両者を転移させる機構と、前記二組の小 球を第三の試料分画と混合して前記ＣＤ２及びＣＤ８サブセット集団に結合させ 前記ＣＤ２及びＣＤ８サブセット集団の各々の少くとも一つの被検出特性を転移 させる機構と第一、第二及び第三の試料分画の分析結果を比較してＣＤ２及びＣ Ｄ８白血球集団サブセットの重複率を決定する機構を有することを特徴とする請 求項３７に記載の装置。 ３９．前記全血試料が赤血球集団を含有し、前記赤血球集団を前記試料から前記 白血球集団の品質及び／又は量に悪影響を与えることなく除去する機構を有する ことを特徴とする請求項２４に記載の装置。 ４０．前記被検出特性を変化させる前にまず前記第一試料分画の検出と計数を行 なう機構と、前記計数結果を比較して寄与率を得る機構を有することを特徴とす る請求項２１に記載の装置。 ４１．少くとも一種の隠蔽細胞集団を含有する細胞試料の少くとも一部から少く とも一種の標的細胞群を分析する方法であって、 内一つが光学的パラメータである少くとも二つのパラメーターにより第一試料分 画の検出と計数を行ない、第二試料分画から隠蔽細胞集団を除去するか又は転移 させ、内一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターにより前 記第二試料分画の検出と計数を行ない、前記二つの計数結果を比較して前記標的 の被隠蔽細胞群の寄与率を得ることを特徴とする標的細胞群分析方法。 ４２．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を準備し 、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ前記隠蔽 細胞集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることを特徴とする請求項４１ に記載の方法。 ４３．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記隠蔽細胞集団上の抗原 に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項４２に記載の方法。 ４４．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を準備し 、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ、前記隠 蔽細胞集団の結合した前記小球を前記試料から除去することを特徴とする請求項 ４１に記載の方法。 ４５．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記隠蔽細胞集団上の抗原 に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項４４に記載の方法。４６． 全血試料の少くとも一部で前記細胞試料を形成させ、前記隠蔽細胞集団が白血球 集団であり、前記標的の被隠蔽細胞群が前記白血球集団により隠蔽された集団で あることを特徴とする請求項４１に記載の方法。 ４７．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を準備し 、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ前記隠蔽 細胞集団の少くとも一つの被検出特性を転移させることを特徴とする請求項４６ に記載の方法。 ４８．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記隠蔽細胞集団上の抗原 に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項４７に記載の方法。 ４９．好中球特異性モノクローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前 記第二試料分画と混合して前記好中球集団に結合させ前記好中球集団の少くとも 一つの被検出特性を転移させる方法であって、前記標的の選択細胞群が未熟白血 球集団であることを特徴とする請求項４８に記載の方法。 ５０．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を準備し 、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ、前記隠 蔽細胞集団の結合した前記小球を前記試料から除去することを特徴とする請求項 ４６に記載の方法。 ５１．モノクローナル抗体に前記反応体を形成させ、前記隠蔽細胞集団上の抗原 に前記特定分子を形成させることを特徴とする請求項５０に記載の方法。 ５２．好中球特異性モノクローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前 記第二試料分画と混合して前記好中球集団に結合させ、前記好中球集団の結合し た前記小球を前記試料分画から除去することを特徴とする請求項５１に記載の方 法。 ５３．磁性小球と磁場を加え、前記磁場内で前記磁性小球を引着させながら前記 第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記好中球集団 を除去することを特徴とする請求項５２に記載の方法。 ５４．ＣＤ２特異性モノクローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前 記第二試料分画と混合して前記ＣＤ２集団に結合させ、前記ＣＤ２集団の結合し た前記小球を前記試料分画から除去することを特徴とする請求項５１に記載の方 法。 ５５．磁性小球と磁場を加え、前記磁場内で前記磁性小球を引着させながら前記 第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記ＣＤ２集団 を除去することを特徴とする請求項５４に記載の方法。 ５６．ＣＤ４特異性モノクローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前 記第二試料分画と混合して前記ＣＤ４集団に結合させ、前記ＣＤ４集団の結合し た前記小球を前記試料分画から除去することを特徴とする請求項５１に記載の方 法。 ５７．磁性小球と磁場を加え、前記磁場内で前記磁性小球を引着させながら前記 第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記ＣＤ４集団 を除去することを特徴とする請求項５６に記載の方法。 ５８．ＣＤ８特異性モノクローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前 記第二試料分画と混合して前記ＣＤ８集団に結合させ、前記ＣＤ８集団の結合し た前記小球を前記試料分画から除去することを特徴とする請求項５１に記載の方 法。 ５９．磁性小球と磁場を加え、前記磁場内で前記磁性小球を引着させながら前記 第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記ＣＤ８集団 を除去することを特徴とする請求項５８に記載の方法。 ６０．少くとも一種の隠蔽細胞集団を含有する細胞試料の少くとも一部から少く とも一種の標的細胞群を分析するための装置であって、 内一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターにより第一試料 分画の検出と計数を行なう機構と、第二試料分画から隠蔽細胞集団を除去するか 又は転移させる機構と、 内一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターにより前記第二 試料分画の検出と計数を行なう機構と、前記二つの計数結果を比較して前記標的 の被隠蔽細胞群の寄与率を得る機構を有することを特徴とする標的細胞群分析装 置。 ６１．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を与える 機構と、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ前 記隠蔽細胞集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特 徴とする請求項６０に記載の装置。 ６２．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記隠蔽細胞集団上の抗原が 前記特定分子を形成することを特徴とする請求項６１に記載の装置。 ６３．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を与える 機構と、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させる 機構と、前記隠蔽細胞集団の結合した前記小球を前記試料から除去する機構を有 することを特徴とする請求項６０に記載の装置。 ６４．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記隠蔽細胞集団上の抗原が 前記特定分子を形成することを特徴とする請求項６３に記載の装置。 ６５．全血試料の少くとも一部で前記細胞試料を形成させ、前記隠蔽細胞集団が 白血球集団であり、前記標的の隠蔽細胞群が前記白血球集団により隠蔽された集 団であることを特徴とする請求項６０に記載の装置。 ６６．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を与える 機構と、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させ前 記隠蔽細胞集団の少くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有することを特 徴とする請求項６５に記載の装置。 ６７．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記隠蔽細胞集団上の抗原が 前記特定分子を形成することを特徴とする請求項６６に記載の装置。 ６８．好中球特異性モノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小 球を前記第二試料分画と混合して前記好中球集団に結合させ前記好中球集団の少 くとも一つの被検出特性を転移させる機構を有し、前記標的の選択細胞群が未熟 白血球集団であることを特徴とする請求項６７に記載の装置。 ６９．前記隠蔽細胞集団上の特定の分子に特異な反応体の結着した小球を与える 機構と、前記小球を前記第二試料分画と混合して前記隠蔽細胞集団に結合させる 機構と、前記隠蔽細胞集団の結合した前記小球を前記試料から除去する機構を有 することを特徴とする請求項６５に記載の装置。 ７０．モノクローナル抗体が前記反応体を形成し、前記隠蔽細胞集団上の抗原が 前記特定分子を形成することを特徴とする請求項６９に記載の装置。 ７１．好中球特異性モノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小 球を前記第二試料分画と混合して前記好中球集団に結合させる機構と、前記好中 球集団の結合した前記小球を前記試料分画から除去する機構を有することを特徴 とする請求項７０に記載の装置。 ７２．磁性小球と磁場を加える機構と、前記磁場内で前記磁性小球を引着させな がら前記第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記好 中球集団を除去する機構を有することを特徴とする請求項７１に記載の装置。 ７３．ＣＤ２特異性モノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小 球を前記第二試料分画と混合して前記ＣＤ２集団に結合させる機構と、前記ＣＤ ２集団の結合した前記小球を前記試料分画から除去する機構を有することを特徴 とする請求項７０に記載の装置。 ７４．磁性小球と磁場を加える機構と、前記磁場内で前記磁性小球を引着させな がら前記第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記Ｃ Ｄ２集団を除去する機構を有することを特徴とする請求項７３に記載の装置。 ７５．ＣＤ４特異性モノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小 球を前記第二試料分画と混合して前記ＣＤ４集団に結合させる機構と、前記ＣＤ ４集団の結合した前記小球を前記試料分画から除去する機構を有することを特徴 とする請求項７０に記載の装置。 ７６．磁性小球と磁場を加える機構と、前記磁場内で前記磁性小球を引着させな がら前記第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記Ｃ Ｄ４集団を除去する機構を有することを特徴とする請求項７５に記載の装置。 ７７．ＣＤ８特異性モノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小 球を前記第二試料分画と混合して前記ＣＤ８集団に結合させる機構と、前記ＣＤ ８集団の結合した前記小球を前記試料分画から除去する機構を有することを特徴 とする請求項７０に記載の装置。 ７８．磁性小球と磁場を加える機構と、前記磁場内で前記磁性小球を引着させな がら前記第二試料分画の残部を除去することにより前記第二試料分画から前記Ｃ Ｄ８集団を除去する機構を有することを特徴とする請求項７７に記載の装置。 ７９．少くとも一種の白血球集団サブセットを含有する白血球集団を少くとも有 する白血球試料から少くとも一種の白血球集団或いは白血球集団サブセットを分 析する方法であって、内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つ のパラメーターを用いて少くとも前記白血球集団と前記集団のサブセットの検出 と計数を行なって第一計数結果を得た後、白血球集団の内の少くとも一つ或いは 前記集団のサブセットを除去し、 内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターを用い て少くとも前記除去集団の欠如した残存白血球集団の検出と計数を行なって第二 計数結果を得た後、上記二つの計数結果を比較して、 （イ）除去集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）除去白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と除去白血球集団の両者、の 少くとも一つを得ることを特徴とする白血球集団或いは白血球集団サブセットの 分析方法。 ８０．前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットの除去が 、前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットに特異なモノ クローナル抗体の結着した小球を準備し、前記小球を前記試料と混合して前記白 血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットに結合させ、前記白血 球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットの結合した小球を前記試 料から除去する工程を含む方法により実施されることを特徴とする請求項７９に 記載の方法。 ８１．磁性小球と磁場を加え、前記試料から前記白血球集団の内の少くとも一つ 或いは前記集団のサブセットを前記磁場内で前記磁性小球を引着させながら前記 試料残部を除去することにより除去することを特徴とする請求項８０に記載の方 法。 ８２．好中球集団を除去することを特徴とする請求項７９に記載の方法。 ８３．前記試料の一分画を順次的に用いて前記第一計数結果を得、次に前記白血 球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを除去し、前記第二計数 結果を得ることを特徴とする請求項７９に記載の方法。 ８４．前記試料の第一分画を用いて前記第一計数結果を得、次に前記試料の第二 分画を用いて前記白血球集団の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを除去 し、前記第二計数結果を得ることを特徴とする請求項７９に記載の方法。 ８５．少くとも一種の白血球集団サブセットを含有する白血球集団を少くとも有 する白血球試料から少くとも一種の白血球集団或いは白血球集団サブセットを分 析する装置であって、内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つ のパラメーターを用いて少くとも前記白血球集団と前記集団のサブセットの検出 と計数を行なって第一計数結果を得る機構と、 白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを除去する機構と、 内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターを用い て少くとも前記除去集団の欠如した残存白血球集団の検出と計数を行なって第二 計数結果を得る機構と、 上記二つの計数結果を比較して、 （イ）除去集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）除去白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と除去白血球集団の両者、の 少くとも一つを得る機構を有することを特徴とする白血球集団或いは白血球集団 サブセットの分析装置。 ８６．前記除去機構が、前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサ ブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球を与える機構と、前記小球 を前記試料と混合して前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブ セットに結合させる機構と、前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団 のサブセットの結合した小球を前記試料から除去する機構を含むことを特徴とす る請求項８５に記載の装置。 ８７．磁性小球と磁場を加える機構と、前記試料から前記白血球集団の内の少く とも一つ或いは前記集団のサブセットを前記磁場内で前記磁性小球を引着させな がら前記試料残部を除去することにより除去する機構を有することを特徴とする 請求項８６に記載の装置。 ８８．好中球集団を除去する機構を有することを特徴とする請求項８５に記載の 装置。 ８９．前記試料の一分画を順次的に用いて前記第一計数結果を得、次に前記白血 球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを除去し、前記第二計数 結果を得る機構を有することを特徴とする請求項８５に記載の装置。 ９０．前記試料の第一分画を用いて前記第一計数結果を得る機構と、前記試料の 第二分画を用いて前記白血球集団の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを 除去し、前記第二計数結果を得る機構を有することを特徴とする請求項８５に記 載の装置。 ９１．少くとも一種の白血球集団サブセットを含有する白血球集団を少くとも有 する白血球試料から少くとも一種の白血球集団或いは白血球集団サブセットを分 析する方法であって、内少くとも一つが光学的パラメーターである少なくとも二 つのパラメーターを用いて少くとも前記白血球集団と前記集団のサブセットの検 出と計数を行なって第一計数結果を得た後、 白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを転移させ、 内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターを用い て、 （イ）転移集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）転移白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と転移白血球集団の両者、の 少くとも一つの検出と計数を行ない、 上記二つの計数結果を比較して、 （イ）転移集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）転移白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と転移白血球集団の両者、の 少くとも一つを得ることを特徴とする白血球集団或いは白血球集団サブセットの 分析方法。 ９２．前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットの転移が 、前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットに特異なモノ クローナル抗体の結着した小球を加え、前記白血球集団の内の少くとも一つ或い は前記集団のサブセットの少くとも一つの被検出電子特性を転移させる工程を含 む方法により実施されることを特徴とする請求項９１に記載の方法。 ９３．好中球集団を転移させることを特徴とする請求項９１に記載の方法。 ９４．前記試料の一分画を順次的に用いて前記第一計数結果を得、次に前記白血 球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを転移させ、前記第二計 数結果を得ることを特徴とする請求項９１に記載の方法。 ９５．前記試料の第一分画を用いて前記第一計数結果を得、次に前記試料の第二 分画を用いて前記白血球集団の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを転移 させ、前記第二計数結果を得ることを特徴とする請求項９１に記載の方法。 ９６．少くとも一種の白血球集団サブセットを含有する白血球集団を少くとも有 する白血球試料から少くとも一種の白血球集団或いは白血球集団サブセットを分 析する装置であって、内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つ のパラメーターを用いて少くとも前記白血球集団と前記集団のサブセットの検出 と計数を行なって第一計数結果を得る機構と、 白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを転移させる機構と 、 内少くとも一つが光学的パラメーターである少くとも二つのパラメーターを用い て、 （イ）転移集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）転移白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と転移白血球集団の両者、の 少くとも一つの検出と計数を行なう機構と、 上記二つの計数結果を比較して、 （イ）転移集団の欠如した残存白血球集団、或いは、（ロ）転移白血球集団或い はサブセット集団、或いは、（ハ）残存白血球集団と転移白血球集団の両者、の 少くとも一つを得る機構を有することを特徴とする白血球集団或いは白血球集団 サブセットの分析装置。 ９７．前記転移機構が、前記白血球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサ ブセットに特異なモノクローナル抗体の結着した小球を加え、前記白血球集団の 内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットの少くとも一つの被検出電子特性 を転移させる機構を含むことを特徴とする請求項９６に記載の装置。 ９８．好中球集団を転移させる機構を有することを特徴とする請求項９６に記載 の装置。 ９９．前記試料の一分画を順次的に用いて前記第一計数結果を得、次に前記白血 球集団の内の少くとも一つ或いは前記集団のサブセットを転移させ、前記第二計 数結果を得る機構を有することを特徴とする請求項９６に記載の装置。 １００．前記試料の第一分画を用いて前記第一計数結果を得る機構と、前記試料 の第二分画を用いて前記白血球集団の少くとも一つ或いは前記集団のサブセット を転移させ、前記第二計数結果を得る機構を有することを特徴とする請求項９６ に記載の装置。