JPH06503552A - 細胞質ゾル内にペプチドを導入する方法 - Google Patents

細胞質ゾル内にペプチドを導入する方法

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JPH06503552A JP3510777A JP51077791A JPH06503552A JP H06503552 A JPH06503552 A JP H06503552A JP 3510777 A JP3510777 A JP 3510777A JP 51077791 A JP51077791 A JP 51077791A JP H06503552 A JPH06503552 A JP H06503552A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞質ゾル内にペプチドを導入する方法又貝ｎ技玉並分万 本発明１＆　細胞質ゾル内にペプチドを導入する方法、更に詳細に檄　ウィルス 、細胞内寄生体およびバクテリア、並びに悪性細胞に対するワクチンの製造にお ける新規な原理に関する。
公匪の貨１ 病原虫微生物に対して防御する際およびｔｑｍ生微生物生物去する際に、クラス Ｉの主要組織適合性抗ｆｆ　（ＭＨＣ）により抗体が出現すること１　重要な役 割を演じる。細胞毒性Ｔ−リンパ球檄　外来のまたは異常な抗原を細胞表面上で 発現する細胞を認識獣　この細胞を破壊する。このことは感染を除去するのに重 要である。同じ機構（礼　悪性細胞の除去においても作用している。クラスエの ＭＭＣによる抗原の出現に鷹　出現すべき抗原が細胞質ゾル中または外胞体中に 存在していることが必要である（Ｇｅｒｍａｉｎ、　ＲＮ、　Ｎａｔｕｒｅ　３ ２２６８７−６８９　（１９８６））。従って、外部から加えたポリへブチ自失 　通常はクラスＩ応答を出現させない。しかしながら、抗原を細胞質ゾル中に人 為的に導入すると、ＭＨＣクラスエによる出現を引き起こすことができる（Ｍｏ ｏｒｅ、　ＫＮ、、　Ｃａｒｂｏｎｅ、　Ｆ、Ｒ，＆　Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、Ｊ、 　Ｃｅ遅賞、　’１７７−’１８１５　（１９掲））。この上うな構造体に対し て免疫す石ための今日の一般的な方法法　弱毒化された生きたウィルスであって 、細胞内に入ることができ、かつ問題のペプチドを細胞内で生成し細胞表面に出 現できるように自己複製することのできるウィルスを用しすることである。こう して、細胞毒性ＣＤ８−細胞の適切な集団が拡大さね、後で対応するビルレント ウイルス株にさらされたとき、この微生物は免疫防御を有する。このアプローチ の問題頃　一部鷹弱毒化ウイルスが時としてビルレントに逆戻りすることがある という事実のためであり、また一部鷹多くの場合に弱毒化ウィルスの調製に問題 があるためである。それ故＆ミ　細胞質ゾル中に外来ペプチド、例えばウィルス 性抗原を導入するための好都合で損傷のない方法法　ワクチンの目的のためにＣ Ｄ８−ＭＨＣクラスＩで制限された細胞毒性Ｔ−リンパ球の適切な集団を拡大す るのに有用であろう。
細胞質ゾルに入る外来タンパク質の確立された例は、ある種の細菌性および植物 性トキシン、例えばジフテリアトキシン、顯些俳■凹り些匹鮭殴嬰エキソトキシ ンＡ、リシン（ｒｉｃｉｎ）　、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ビスクミン（ｖｉｓ ｃｕｍｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）　 ）キシン、コレラトキシン、パーツシス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　トキシンであ る（Ｏｌｓｎｅｓ、Ｓ、＆　Ｓａｎｄｖｉｇ、Ｋ、　：”Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉ ｎｓ”（Ａ、Ｅ、　Ｆｒａｎｋｅｌ、　ｅｄ　）、　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄａ ｎｉｃ　ＰｕｂｌｉｓｈｅｒＢＢｏｓｔｏｎ　１９８Ｂ、　ｐｐ、　３９−７３ ；　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　＆　Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、　：　”Ｒｅｃｅｐｔ ｏｒ−ｍｅｄｉｔａｔｅｄ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ”　（１，Ｐａ５ｔａｎ　 ＆　ＫＣ，ＷｉｌＬｉｎｇｈａｍ、　ｅｄｓ、　）。
Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌ、　Ｃｏｒｐ、、１９８５．　ｐｐ、　１９５−２３４ ）。この群のトキシン叫細胞質ゾルに入り、そこで細胞または器官に対して有害 な酵素反応を行う。遺伝子操作によって、毒性が著しく低いトキシン分子を形成 することが可能である（Ｂａｒｂｉｅｒｉ、　Ｊ、　Ｔ、　＆　Ｃｏ１１ｉｅｒ 、　Ｒ，Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。
和■ｎ、　５５．１６４７−１６５１　（１９８７）　）。トキシンが細胞内に 追加のペプチド物質を運び込むことができるなｌ−１１１ｆ、このような無毒性 突然変異体叫　ワクチンの目的のために細胞質ゾル内に抗原性ペプチドを運び込 むのに有用であり（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３４５． 　４４９（１９９０））　、これをクラスエのＭＨＣ抗原によって出現させるこ とができる。このような抗原性シーフェンス（戴　多数のウィルス　細菌および 寄生体から得ることができ、このような構造体（戴　ある種の悪性細胞から誘導 することもできる。
本発明の目的檄　抗原性ペプチドシークエンスを細胞質ゾルに安全な手段で転移 させて、対応する抗原と反応することができ、抗原性ペプチドを出現させる細胞 を除去することができる細胞毒性Ｔ−リンパ球の集団を拡大することである。前 記の種々のトキシンについてそれらが入る機構は原理的には同じであるカー　ジ フテリアトキシンの場合が最も詳細に研究されている。本発明者らが本発明に関 する研究の大部分に用いたの（戴　このトキシンである。
久盟ｎ見！ 本発明者ら１も　ジフテリアトキシンの本質的に無毒性の突然変異体カー　その Ｎ末端に結合したオリゴペプチドを細胞質ゾルに転移させることができることを 実証した。本発明者らが研究したペプチド頃　多種多様なペプチドを同じ手段で 細胞内に運び込むことができるという結論を許すのに充分に、そのシーフェンス が異なっている。
従って本発明代　ペプチドを細菌性または植物性のトキシンまたはそのフラグメ ントに結合することを特徴とする、ペプチドを細胞質ゾル内に導入する方法に関 する。更に本発明；戴　ペプチドを細菌性または植物性のトキシンまたはそのフ ラグメントに結合獣　このペプチドを細胞質ゾル内に転移させ、後Ｇミ　クラス ＩのＭＭＣ抗原により細胞表面で出現させることにより、クラスＩ制限免疫応答 を顕現させ、かつＣＤ◆Ｔ−りンバ球の適切な集団を拡大させることを特徴とす る、ワクチンの製造方法に関する。本発明はまた、前記の方法により製造された ワクチン、並びにこのようなワクチンをウィルス、細胞内細菌および寄生体に対 して、および悪性腫瘍に関連する分子に対して使用することに関する。
匿里Ａゑ朋 図１：　ジフテリアトキシンのＮ末端の延長。
Ａ、三速りに突然変異が変化するＧｌ　１１１４＠からＳｅｒを有するジフテリ アトキシン遺伝子のコード化領域である。Ｇｌｙｌ　をＴ３−ブロモターの後に 位置するイニシェータ−Ｍｅｔで置き換えて、ｐＢＤ−Ｉｓを与えた（ＭｃＧｉ ｌｌ、　Ｓ、、　Ｓｔｅｎｍａｒｋ、　Ｈ，、Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ＆　０１ｓ ｎｅｓ、　Ｓ、　：　ＥＭＢＯＪ、　８．２８４３−２８４８　（１９８９）） 。ｐＢ−Ｂ３−ＤＩを得るためＥ、ｐＢＤ−１をＮｃｏｌで開裂し　オリゴペプ チド、ＭＧＶＤＥＹＮＥＭＰＭＰＶＮ　（Ｂ３と呼Ｊ）　をコ−）’するオＩＪ ゴヌクレオチドを挿入した。ｐＧＤ−２３４３Ｐ６の後にあるその天然シグナル シーフェンス、ＭＳＲＫＬＦＡＳＩＬＩＧＡＬＬＧＩＧＡＰＰＳＡＨＡ　（ｓ　 ｓと呼ぶ）でジフテリアトキシンをコードする。
プラスミドＬ　ｐＧＤ−１（ＩＡｃＧｉｌｌ、　Ｓ、、　Ｓｔｅｒｍｍｒｋ、　 ）Ｌ、　５ａｎｄｖｉ＆に、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　：　堺毀Ｊ、　８． ２８４３−２８４８　（１９８９））をＨｉｎｄＩＩ工およびＰｓｔＩで消化り 、、Ｓｔ−ヌクレアーゼでオーバーハングを除去し、再結合してｐＧＤ−２を形 成することにより得られた。
Ｂ　遺伝子をインビトロで転写し得られたｍ　ＲＮ　Ａをウサギ網赤血球消化物 培地中で［３ＳＳ］メチオニンの存在下で翻訳した（ＭｃＧｉｌｌ、　Ｓ、　、 　Ｓｔｅｎｍａｒｋ、　）Ｌ　、　Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ　＆　０１ｓｎｅｓ、 　Ｓ、　：　ＥＭＢＯＪ。
８、２８４３−２８４８　（１９８９））。還元剤を除去し、ジスルフィド橋を 形成させるため、翻訳混合物をＰ　Ｂ　Ｓ　（０，１４Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ 　リン酸Ｎａ、　ｐＨ７，４）に対して一夜透析し、次いでＨｅｐｅｓ培地（重 炭酸塩を２０ｍＭＨｅｐｅｓ、　ｐＨ７，４で置き換えたＤｕｌｂｅｃｃｏ変性 イーグル培地）に対して４時間透析した。各サンプルのアリコートを、ドデシル 硫酸ナトリウムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ ）により還元条件下で分析した（Ｏｌｓｎｅｓ、Ｓ、＆　Ｅｉｋｌｉｄ、Ｋ、　 ：　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
９児へ２５５．２＆４−２８９　（１９８０））。幾つかの場合、ウサギ抗Ｂ３ 抗血清（レーン３および４）または抗リシン（レーン５）と共に予めインキュベ ートしたタンパク質Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｓｗ ｅｄｅｎ）で翻訳生成物を処理した。吸着した物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分 析した。
ＤＴはｐＢＤ−１からの翻訳生成物であり、Ｂ３−ＤＴはｐＢ−８３−Ｄｌから の翻訳生成物であり、５ｓ−ＤＴはｐＧＤ−２からの翻訳生成物である。
図２．　Ｎ末端に付加したＢ３オリゴペプチドを有するＡ−フラグメントの細胞 質ゾルへの転移。ｐＢＤ−１およびｐ　Ｂ−Ｂ　３−Ｄｌを、インビトロで転写 して翻訳した。対応する翻訳生成物（ＤＴおよびＢ３−ＤＴ）を、２４穴マイク ロタイタープレートで単層として生長している　Ｖｅｒｏ細胞に添加し、１０Ｍ Ｍのモネンシン（ｍｏｎｅｒｍｉｎ）　ノ存在下で２４℃に２０分間保持した（ ＭｃＧｉｌｌ、　Ｓ、。
Ｓｔｅｎｍａｒｋ、　Ｈ，、Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ 、　：　Ｅｌｌａ３０　Ｊ、　８．２８４３−２８４８（１９８９））。細胞を Ｈｅｐｅｓ　培地で２回洗浄医次いで１０ＭＭのモネンシンを含有するＨｅｐｅ ｓ　培地中の、０．　４　ｐ　ｇ／ｍｌのＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニル アラニンクロロメチルケトン）で処理したトリプシンを用いて２０℃で５分間処 理しへ細胞を洗浄し低ｐＨでの緩衝能を高めるため、１０ｍＭのグルコン酸ナト リウムを含有するＨｅｐｅｓ培地、ｐＨ４，８にさらした。３７℃で２分後に、 細胞をＨｅｐｅｓ培地、ｐＨ７，４で洗浄獣　１０ＭＭのモネンシンを含有する Ｈｅｐｅｓ培地、ｐＨ７，４中の３１＠ｇ／ｍｌのプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ ）を用いて３７℃で５分間処理した。この処理によってプラスチックから分離し た細胞を、遠心分離により回収り、１ｍＭのＮＥＭ　（Ｎ−エチルマレイミド） および１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有するＨ ｅｐｅｓ培地で１回洗浄した。幾つかの場合（レーン１〜３および８〜１０）！ 、１ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍＭのＮＥＭを含有するリン酸塩で緩衝した生理食 塩水中のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で細胞を溶解医　核を遠心分離により除去し 上澄液中のタンパク質を、１０％（Ｗ／Ｖ）のトリクロロ酢酸で沈澱させるか、 あるいはタンパク質Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させた抗Ｂ３抗体で免疫沈 降させた。
他の場合（レー：／４〜７）　ｉｉ、１ｍＭのＦＭＳＦおよび１ｍＭのＮＥＭを 含有するＰＢＳ中の５０Ｍｇ／ｍｌのサポニンで細胞を処理し　転移しなＡ−フ ラグメントを放出させ、次いでベレット中および上澄液フラグメントの両方のタ ンパク質を、トリクロロ酢酸で沈澱させた。全ての場合＆ミ沈澱した物質を５Ｄ Ｓ−Ｐ庇（１３，５％ゲル）により匪濫工ヵ条件下で分析した。
図３．　シグナルシーフェンスを有するジフテリアトキシンの細胞質ゾルへの転 移。レーン１〜４：　＋２ｓ工で標識した天然トキシン（ｗｔ　−ＤＴ、レーン １）およびインビトロで翻訳したｐＧＤ−２（シグナルシーフェンスを有する　 ［”Ｓ］メチオニン標識トキシン、５ｓ−ＤＴ）を、Ｖｅｒｏ細胞に結合させ、 細胞上にニックを入れた（レーン１および２）。レーン３で（戴　細胞をレーン ２と同様にして、ただし翻訳生成物を６倍量多く用い、次いで細胞を図２と同様 にｐＨ４，８およびプロナーゼにさらした。細胞をＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で 溶解し　核を除去した。上澄液を、ウサギ抗ジフテリアトキシン血清と共に予備 インキュベートしたタンパク質Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅと共にインキュベート した。吸着した物質を、１工避（レーン１および２）まｆ、：　は史１ｚ缶（レ −ン３および４　）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＩＯＸゲル）により分析した。レー ン４で檄　プロナーゼ処理細胞を、５０μｇ／ｍ１のサポニンで処理狐　培地に 放出された物質を直接に分析した。レーン５〜１２：　ｐＢＤ−１（ＤＴ）およ びｐ　ＧＤ　−２（ｓ　５−ＤＴ）からの翻訳生成物を、Ｖｅｒｏ細胞に結合し 、ニックを入れ、ｐＨ４８にさら−次いでプロナーゼで処理した。溶解した細胞 を非１ｚ勺５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５χゲル）により直接に分析するか（レーン ５〜８）、あるいは溶解した細胞をサポニンで処理し膜ベレット（レーン９およ び１０）および上澄液フラクション（レーン１１および１２）を別個に分析した 。
３朋！」１町ダ調載 ジフテリアトキシンは、Ｃｏ　ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉ　ｈｔｈｅｒｉａｅ ノ病原殊により１本鎖ポリペプチドとして合成される。このタンパク質＋４　） リプシン感受性部位で容易に開裂しく５ｐｌｉｔ）　にツクが入れられ、’ｎ１ ｃｋｅｄ”　）、２つのジスルフィド結合フラグメント、ＡおよびＢを生成する （Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ、　Ａ、Ｍ、、　Ｊｒ、　Ａｎｎｗ　Ｒｅｖ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｕ　４６．６９−９４　（１９７７））。
Ｂ−フラグメント（３７ｋＤ）は細胞表面レセプターと結合するカーＡ−フラグ メント（２１ｋＤ）は細胞質ゾルに転移される酵素であり、そこでこの酵素はＡ ＤＰ−リボース化によって延長ファクター２を不活性化狐　こうしてタンパク質 の合成をブロックする（Ｖａｎ　Ｎｅ５ＢＢ、Ｇ、、　Ｈｏｖａｒｄ、　Ｊ、Ｂ 、　＆　Ｂｏｄｌｅｙ、　Ｊ、Ｋ　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２２５．１ ０７１０−１０７１６　（１９８０））。通常はエンドソームの限界膜を横切っ て行われる転移鷹　酸性小胞内で低ｐＨによって引き起こされる（Ｄｒａｐｅｒ 、　Ｒ。
Ｋ、　＆　Ｓｉｍｏｎ、　Ｋ１．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８７．　＆４ ９−８５４　（１９８０）；　Ｓａｎｄｖｉｇ。
Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　＆　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８７．８２８− 関２　（１９８０））。表面に結合したトキシンを有する細胞を酸性媒体にさら すと、転移は細胞表面から起こる（Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ　＆　０１ｓｎｅｓ、 　Ｓ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２ＥＥ。
８０６８−９０７６　（１９８１））。本発明者ら代　提示した実施例において この人ニジステムを使用した。なぜならば、このシステムは、転移された物質と 転移されない物質との識別を可能にするからである（Ｍｏｓｋａｕｇ、　Ｊ、≠ 、、　Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ。
２６２、１０３３９−１０３４５（１９８７）；　Ｍｏｓｋａｕｇ、　Ｊ、φ、 、　Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、＆０１ｓｎｅｓ。
Ｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｒＬ２６３．２５１８−２５２５　（１９８８ ））。
細胞に対するジフテリアトキシンベクターによる毒性作用を除くため＆ミ　三速 りに突然変異が変化するＧｌ　ｕｌ＆会（これはトキシンの酵素的活性部位に位 置している）からＳｅｔを含有する突然変異叉施舅 突然変異したトキシン遺伝子の２つの変形（ｖａｒｉａｎｔｓ）を使用した。そ の一方（戴　天然の２５アミノ酸シグナルシークエンスを有しておらず（ｐ　Ｂ 　Ｄ　−１）　（ＭｃＧｉｌｌ、　Ｓ、　、　Ｓｔｅｎｍａｒｋ、　）Ｌ　、　 Ｓａｎｄｖｉｇ。
Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ　：　ＥＭＢＯＪ、　８．２８４３−２８４８　 （１９８９）　）、もう一方はこれを有していた（ｐＧＤ−２）（図ＩＡ参照） 。一つの場合、Ｂ３と呼ばれる外来オリゴペプチドをトキシンのＮ末端に結合し て、プラスミドｐＢ−Ｂ３−ＤＩを生成させた。
Ｔ３またはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼブロモターの後にある構造体を、インビ トロで転写獣　翻訳した（ＭｃＧｉｌｌ、　Ｓ、、　Ｓｔｅｎｍａｒ）ｃ。
Ｈ，、Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　：　ＥＭＢＯＪ、　 ８．２８４３−２８４８　（１９８９））。
いずれの場合にも、完全な長さのタンパク質に対応する主バンドおよび痕跡量だ けの低分子量物質が得られた（図ＩＢ参照）。シグナルシーフェンスを有するト キシン（レーン７）またはＢ３を有するトキシン（レーン１）は、予期したとお り、トキシンそれ自体（レーン２および６）よりもやや遅く移行した。更Ｅ、Ｂ ３を有するトキシンＩｔ、抗Ｂ３によって選択的に沈澱したが（レーン４）、対 照の血清では沈澱しなかった（レーン５）。Ｂ３を有しないトキシン檄　抗Ｂ３ によって沈澱しなかった（レーン３）。
透析された翻訳生成物をＶｅｒｏ細胞に結合し、低濃度のトリプシンで細胞にニ ックを人ね、次いで細胞をｐＨ４，８にさらした。これらの条件下で、結合した トキシンの一部を細胞質ゾルに転移させると、培地に添加したプロナーゼに対し て遮蔽されるようになった（Ｍｏｓｋａｕｇ、　Ｊ、φ、、　Ｓａｎｄｖｉｇ、 　Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２６３、２５１８−２５２５　（１９８８））。ジフテリアトキシン自体の場合 、２つのフラグメント（分子量２１　ｋＤおよび２５　ｋＤ）　＋４　これらの 条件下で防御された（図２、レーン１）。これらは、Ａ−フラグメント全体（分 子量２１　）ｃＤ）およびＢ−フラグメントの一部（全３７　ｋＤのうちの２５ 　）ｄ））に対応していた。インターフラグメントのジスルフィド（戴見たとこ ろ細胞質ゾルにさらされると、還元された（　Ｍｏｓｋａｕｇ、　Ｊ−φ、、　 Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　２６２．１０羽９−１０３４５（１９８７））。
叉施近」 Ｂ３を含有するトキシンを用いて同じ実験を行うと、２つの主フラグメント（２ ５ｋＤおよび２２．５　ｋＤ）　＋戴　少量の２１ｋＤのフラグメントのほかに 防御された（レーン２）。後者はおそらく、Ｂ３が開裂されたＡ−フラグメント を示している。低ｐＨにさらすのを省略すると、どのフラグメントも防御されな かった（レーン３）。２２゜５卸のフラグメントは抗Ｂ３により沈澱したが（レ ーン９）、プレ免疫血清では沈澱しなかった（レーン１０）。オリゴペプチドを 有しない防御されたＡ−フラグメント哄　抗Ｂ３により沈澱しなかった（レーン ８）。Ｂ３を有する防御されたＡ−フラグメントの量が見かけ上多いのｆ１Ｂ３ が３個のメチオニンを有り、Ａ−フラグメント単独では５個のメチオニンを有す るので、導入された放射能活性が高いためである。
転移したジフテリアトキシンを有する細胞を、細胞質マーカー酵素が膜を溶解す ることなく細胞から漏出することを許す低濃度のサポニンで処理すると、転移し たＡ−フラグメントは培地中に放出されるが、Ｂ−フラグメントがら誘導された ２５１ｄ）のポチペプチド（戯膜フラクションと会合したままである（　Ｍｏｓ ｋａｕｇ、　Ｊ、≠、、　Ｓａｎｄｉｇ。
Ｋ　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３．２５ １８−２５２５（１９８８）；　Ｍｖｓ）ｃａＬｇＪ、ｆ、、　５ａｎｄｖｉＨ ，Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４． １５７０９−１５７１３　（１９８８）；　Ｍｏｓｋａｕｇ、　Ｊ、９！、、　 Ｓａｎｄｖｉｇ、　Ｋ、　＆　０１ｓｎｅｓ、、　Ｊ。
Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＬ２６４．１１３５７−１１３７２　（１９８９））。こ のこと檄　転移したＡ−フラグメントが細胞質ゾル内に含まれていないカー　２ ５ｋＤボチペプチドが膜内に挿入されることを示している。また、Ｂ３を含有す るＡ−フラグメントの大部分（戴　正常なＡ−フラグメントと同じ様式でサポニ ンにより放出されたが（レーン６）、２５）ｃＤのフラグメントは膜に会合して いた（レーン４および５）。従って、ジフテリアトキシンはＢ３（１４アミノ酸 ）を細胞質ゾルに転移させることができるようである。
叉施湾ヱ より大きなオリゴペプチドも転移することができるかどうかを調べるためへ　正 常なシグナルシーフェンス（２５アミノ酸）を有するトキシンを選んだ。図３の レーン２に示すよう（ミ　このタンパク質をトリプシンでニックを入れて、２３ ．５ｋＤのＡ−フラグメントおよび３７）ｃＤのＢ−フラグメントに切断した。
　（この実験で番戯トキシンに部分的にのみニックを入れた。部分的にニックを 入れた１２５■で標識された天然トキシンを、比較のためにレーン１に示す。） シグナルシーフェンスを有するトキシンを細胞に結合させ、ニックを入れた後、 ｐＨ４，８にさらすと、２つのフラグメント（２３，５１ｄ）および２５　ｋＤ ）　＋ｌ　プロナーゼに対して防御された（レーン８）。開裂されていないシグ ナルシーフェンスを有する防御されたＡ−フラグメントも、レーン３に示す。こ の物質（戴　全トキシン、Ａ−フラグメント、並びに全Ｂ−フラグメントと結合 する抗ジフテリアトキシンン血清により沈殿したが（レーン１および２参照）、 ２５ｋＤのフラグメントは沈殿しなかった　プロナーゼで処理した細胞をサポニ ンで処理すると、延長したＡ−フラグメントが培地中に放出された（レーン４お よび１２）カー　２５ｋＤのフラグメントは膜フラクション中に残った。　（レ ーン１０）。
図ＩＡ 図ＩＢ 図２ 図３ 国際調査報告 １１１１．１１．．１．＾−−、−１にＴ／Ｎｏ　９１１０００９３フロントペ ージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／６２ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ 、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ 、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ。
ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＵ、　ＵＳ Ｉ

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. １．ペプチドを細菌性または植物性のトキシンまたはそのフラグメントに結合す ることを特徴とする、ペプチドを細胞質ゾル内に導入する方法。
  2. ２．ペプチドを細菌性または植物性のトキシンまたはそのフラグメントに結合し 、このペプチドを細胞質ゾル内に転移させ、後に、クラスＩのＭＨＣ抗原により 細胞表面で出現させることにより、クラスＩ制限免疫応答を顕現させ、かつＣＤ ８＋Ｔ−リンパ球の適切な集団を拡大させることを特徴とする、ワクチンの製造 方法。
  3. ３．細菌性または植物性のトキシンの変異体が、細胞質ゾルに入る能力および追 加のペプチド物質を細胞質ゾル内に運び込む能力失わせることなく、その毒性が 失われるような手段で操作された前記トキシンの変異体を使用すことを特徴とす る、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
  4. ４．ジフテリアトキシン、あるいは関連トキシン、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソトキシンＡ、リシン（ｒｉｃｉｎ）、アブリン（ ａｂｒｉｎ）、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）トキシン、コレラトキシン、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不 安定トキシンまたはパーツシス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）トキシンの無毒性突然変 異体を使用すことを特徴とする、請求の範囲第１項または第２〜３項のいずれか に記載の方法。
  5. ５．ジフテリアトキシンの無毒性突然変異体を使用すことを特徴とする、請求の 範囲第１項または第２〜４項のいずれかに記載の方法。
  6. ６．請求の範囲第２〜５項のいずれかに記載の方法によって製造されたものであ ることを特徴とする、ワクチン。
  7. ７．ウイルス、細胞内細菌および寄生体に対して、並びに悪性腫瘍に関連する分 子に対して、請求の範囲第６項に記載のワクチンを使用すること。
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