JPH09500092A - Ｂ群れんさ球菌の多くの菌株に対する免疫を与える細胞表面タンパク質であるタンパク質Ｒｉｂ、そのタンパク質の精製方法、薬剤キットおよび医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Rib と呼称される新しいタンパク質およびそのサブフラグメント、多重体または変異体に関し、そしてこの新しいタンパク質は、多数のＢ群れんさ球菌菌株特に血清型IIIのＢ群れんさ球菌菌株による感染症に対する防御免疫を与える。本発明には該タンパク質の精製方法、高度に特異的な抗体の製造方法、薬剤キット、該タンパク質をコードするDNA 配列、および該タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体を含有する医薬組成物が含まれている。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ群れんさ球菌の多くの菌株に対する免疫を与える細胞表面タンパク質である タンパク質Rib 、そのタンパク質の精製方法、薬剤キットおよび医薬組成物 本発明は、Ｂ群れんさ球菌（group B streptococcus）の大部分の侵入性菌 株に対する免疫を与える、Rib と呼称される新規なタンパク質〔ならびにそのサ ブフラグメント、変異体および多重体（multiple）〕、そのタンパク質の精製方 法、そのタンパク質に特異的な抗体、薬剤キット、ならびに該タンパク質または そのフラグメントを含有する医薬組成物に関する。 最近の３０年間に、西欧世界に、新生児の疾患の主原因としてＢ群れんさ球菌 が出現した。米国だけで、この細菌で起こる侵入性疾患は一年間当り約１０００ ０の症例がある。これらの感染症は、全死亡率が約２０％であり、そして生残る 小児の多くには永久的な神経後遺症がみられる。これらの知見から、予防法と治 療法を見つけかつＢ群れんさ球菌が感染症を起こす機構を分析するため大きな努 力がなされている。 全女性の約２０％はＢ群れんさ球菌の腟内保菌者であり、母体生殖器官からの 垂直伝播が恐らく、この細菌によって起こる新生児の疾患の最も普通の感染源で あろう。しかし、出産時、Ｂ群れんさ球菌が定着している小児の１〜２％しか重 篤な感染症にかからない。それ故、出産中この細菌に暴露されること以外の要因 が新生児疾患の発生に関与しているに違いない。感染した小児の母はIII型きよ う膜に 対する抗体のレベルが大幅に低いが、このことはこれらの抗体が新生児疾患に対 して防御するのに重要であることを意味している（Baker，C．J．およびD．L．K asper，N．Engl．J．Med．,２９４巻、７５３頁、１９７６年）。 Ｂ群れんさ球菌の菌株は、その多糖類のきよう膜の構造に基づいて４種の主要 血清型（Ｉａ、Ｉｂ、IIおよびIII）に区分されている（Baker，J Inf Dis， １６１巻、９１７頁、１９９０年）。血清型Ｉ、IIおよびIIIは、通常のフロー ラ中の細菌内でほぼ等しい比率で発生するが、III型は侵入性感染症由来のすべ ての分離菌の約２／３を占めている。そのきよう膜は公知の毒性因子であるから かなり詳細に研究されており、特にIII型菌株のきよう膜が詳細に研究されてい る。III型の多糖類きよう膜が必須成分であるワクチンを開発する努力がなされ ている。しかし多糖類のきよう膜をワクチンとして使用すると、ヒトの組織と交 差反応を起こすので問題がある（Pritchardら、Infect Immun，６０巻、１５９ ８頁、１９９２年）。したがって、多糖類以外のタンパク質に基づいたワクチン を開発できれば非常に有益である。 またＢ群れんさ球菌は雌ウシの乳腺炎も起こす、これは、経済的に非常に重大 なウシの疾患である。したがってＢ群れんさ球菌感染症に対するワクチンを開発 することは獣医学の面でも大切である。 ２種のＢ群れんさ球菌細胞表面タンパク質すなわちαタンパク質とβタンパク 質がすでに詳細に研究されている。これらのタンパク質は、これらタンパク質を 発現する菌株 に対する防御免疫を与えるが、III型の菌株（大部分の重篤な感染症を起こす） は通常これらのタンパク質を発言しないので、Ｂ群れんさ球菌の疾患に対する重 要性は限られたものになっている。 本発明は一つのれんさ球菌の細胞表面タンパク質、およびその変異体とサブフ ラグメントに関する。このタンパク質は、タンパク質Rib と呼称されているが、 別個の９５KDのタンパク質として血清型IIIのＢ群れんさ球菌から単離した。タ ンパク質Rib は、血清型IIIのＢ群れんさ球菌菌株のほとんどすべてと、II型の ような他の血清型の少数の菌株とによって発現される。タンパク質Rib を精製す る方法を考案し、そしてタンパク質Rib を発現する菌株による致死感染症に対し て、このタンパク質の抗体が防御することを立証した。 また本発明は、タンパク質Rib を発現する細菌すなわち特に血清型IIIのＢ群 れんさ球菌の菌株で起こる感染症に対して防御する性能を有する、該タンパク質 の天然産のおよび人工的に修飾した変異体、サブフラグメントおよび多重体に関 する。 また本発明は、非ヒトの宿主生物中に挿入して前記宿主から発現させるのに適 切な、タンパク質Rib ならびにその変異体、サブフラグメントおよびフラグメン トの遺伝コードを含有しているプラスミド、コスミドまたはファージのようなベ クターに関する。本発明は特に、寄託番号がそれぞれDSM ..．である３種のファ ージクローンすなわちλRib １−３、λRib １−５およびλRib １−７に関する 。 また本発明は、タンパク質Rib ならびにその変異体、サブフラグメント、フラ グメントおよび多重体をコードするDNA 配列であって、プラスミド、コスミドま たはファージのような適切なベクター中に挿入できるDNA 配列に関する。このDN A 配列は、寄託されているファージ類であるλRib １−３、λRib １−５または λRib １−７から得ることができる。 Rib タンパク質は各種のIII型菌株によって発現される。いくつもの異なる菌 株から調製した抽出液を、ウエスタンブロッティング法で分析用抗Rib 血清を用 いて分析したところ、ほとんどすべての抽出液はタンパク質Rib を含有していた が、そのタンパク質の分子量は、６５KD〜１２５KD（データは記載していない） の間を変動していることが分かった。大きさの変動は他のＢ群れんさ球菌タンパ ク質であるαタンパク質とβタンパク質についてもすでに報告されているので上 記の結果は予想外のことではなかった。 入手可能なデータは、このタンパク質は単位体（unit）の多重体で構成され、 各単位体は約９KDの分子量に相当している。したがって本発明には、９５KDのタ ンパク質のサブフラグメントと多重体または同じ特性を有する基本単位体のサブ フラグメントおよび多重体が含まれる。変異体には、該タンパク質を発現する細 菌によって起こる感染症に対して防御する性能を変えることなくアミノ酸を置換 もしくは挿入したものが含まれる。 Ｂ群れんさ球菌の菌株は公知であり、感染したヒトの血液から単離することが できる。本発明の発明者らが使用し たBM１１０菌株は、S．Mattingly博士（テキサス州、サンアントニオ所在のテキ サス大学）から入手した。本願で引用する菌株はすべて、ルンド大学およびルン ド大学付属病院の本発明の発明者らから入手できる（Gunnar Lindahl博士、ス エーデン、Ｓ２２３６２ルンド、Soelvegatan ２３、医学微生物学部）。 タンパク質Rib は、血清型IIIのＢ群れんさ球菌の菌株、好ましくは菌株BS３ ０またはBM１１０から単離することができる。また本発明はタンパク質Rib の精 製方法に関する。 該タンパク質は以下の手順で単離することができる。すなわち該タンパク質を 発現するＢ群れんさ球菌菌株を培養し、培地および／または該微生物を単離し、 該細菌を酵素好ましくはムタノリシンで消化し、プロテアーゼインヒビターを任 意に添加し、消化された細菌を上澄み液から分離し、次いでその上澄み液からタ ンパク質Rib を抽出する。培地は、例えばトッド・ヒューイットブロス（Oxoid ）のごときれんさ球菌を培養するのに適したいずれの培地でもよく、そして細胞 は１〜３０時間とくに１２〜２０時間培養することが好ましい。酵素好ましくは ムタノリシンによる消化は、１〜３０時間、特に１０〜２０時間、好ましくは１ ５〜１８時間、２０〜４０℃好ましくは３７℃で、振盪せずに実施する。該タン パク質は培地から単離することができ、このような場合、細胞壁を破るのに使用 される酵素で消化する必要はない、塩化ベンズアミジン、ヨード酢酸またはフェ ニルメチルスルホニルフルオリドのようなプ ロテアーゼインヒビターを添加して、ムタノリシンを汚染しているかまたは微生 物中に存在していることがあるプロテアーゼからの作用を防止する。 該タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー好ましくはアニオン交換クロ マトグラフィーおよびゲル濾過法によって精製することができ、該タンパク質を 含有する画分を当該技術分野で確立された方法にしたがって収集する。 本発明は特に、実質的に純品のタンパク質Rib またはそのサブフラグメントに 関する。“実質的に純品の”という用語を、本発明の発明者らは、医薬として有 害な物質を含有していない物質と理解している。 また本発明は、タンパク質Rib ならびにそのサブフラグメント、変異体または 多重体に対応する抗体に関する。抗原で、本発明の場合タンパク質Rib で動物を 免疫化し、その血液を収集し、その血清を単離し、次いで該タンパク質と反応す る抗体を使用する方法は公知である。この抗体を含有する血清またはIgG 画分は 該タンパク質を分析するのに使用できる。 タンパク質Rib に対する抗体はＢ群れんさ球菌菌株による致死感染症に対して 防御することができるので、このような抗体のレベルを測定する方法は、例えば 妊婦が乳児をかような感染症から防御するのに充分な抗体をもっているか否かを 推定するのに有益である。タンパク質Rib またはそのサブフラグメントは該タン パク質に対するかような抗体を検出するのに用いることができる。したがって本 発明は、タンパク質Rib またはそのサブフラグメントが入って いる薬剤キットに関する。 タンパク質Rib の存在について各種の試料を分析することも重要である。該タ ンパク質に対する抗体はこの目的のために使用できる。それ故、本発明はタンパ ク質Rib またはそのサブフラグメントに対する抗体が入っている、該タンパク質 を検出するのに用いる薬剤キットに関する。薬剤キットには、該抗体を含有する 上記血液の画分のいずれかが入っている。またその薬剤キットには、標準として 用いる該タンパク質、そのサブフラグメントまたは多重体も入っている。 タンパク質Rib の特性は、このタンパク質がＢ群れんさ球菌に対するワクチン を開発するのに用いることができることを示している。したがって本発明は、該 タンパク質またはそのフラグメントを活性成分として含有しならびに医薬として 許容される佐剤と賦形剤を含有していてもよい医薬組成物に関する。医薬として 許容される適切な佐剤はこの技術分野で通常用いられる佐剤である。適切な賦形 剤の例をいくつか挙げるとマンニトール、ラクトース、デンプン、グルコースな どがある。佐剤と賦形剤として挙げる例によって本発明は限定されない。 本発明は下記の添付図面によってさらに詳細に説明する。 図１は、４種の主要血清型を示すＢ群れんさ球菌菌株（Ｉａ型：菌株Ａ９０９ ；Ｉｂ型：SB３５；II型：Ｂ１２８４；III型：BS３０）から調製した抽出物の ウエスタンブロット法による分析結果を示す。その免疫ブロットに示すよ うに、Ｉａ型とＩｂ型の菌株はαとβのタンパク質を発現し、これらのタンパク 質の染色ゲル中の位置を矢印で示す（下側矢印：α抗原；上側矢印：β抗原）。 III型菌株BS３０の９５KDのタンパク質Rib の染色ゲル中の位置は星印で示す。 分子量マーカーはKDの単位で左側に示す。 図２Ａと２ＢはIII型菌株BS３０由来のタンパク質Rib の精製を示す。（図２ Ａ）予め行ったDEAEイオン交換クロマトグラフィーで部分的に精製したムタノリ シン抽出物を、DEAE Bio − GelＡの３０ mlカラムを用いるイオン交換クロマ トグラフィーに付した。すなわち１０mMトリス、ｐＨ８．０中のNaClの直線勾配 液（８００ ml）次いで１Ｍ NaCl（６０ ml）で溶出した。斜線領域がタンパク 質Rib を含有する画分を示す。挿入図は SDS - PAGE で分析したタンパク質Rib 含有画分のプールを示し、分子量マーカーをKD単位で左側に示し、そしてタンパ ク質Rib （９５KD）の位置を矢印で示してある。（図２Ｂ）上記イオン交換クロ マトグラフィ由来のタンパク質Rib 含有画分のプールを、セファロースCL６Ｂの カラム（４．２×９０cm）を用いるゲル濾過に付した。斜線領域はタンパク質Ri b を含有する画分を示し、挿入図はSDS − PAGE によって分析したこれら画分の プールを示す（Ｖ_oはボイドの容積；Ｖ_tは全容積）。 図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、α、βおよびRib のタンパク質を細胞表面が発現 する、４種の主要血清型のＢ群れんさ球菌菌株の分析結果を示す。５種の菌株： Ａ９０９（Ｉａ型）；SB３５（Ｉｂ型）；Ｂ１２８４（II型）；BS３０ （III型）；およびBM１１０（III型）を試験した。これら５種の菌株に用いた記 号をパネルＣに示す。細菌の懸濁液を、図に示すように、異なる希釈度の、α、 βまたはRib のタンパク質に対するウサギ抗血清とともにインキュベートした。 Ｘ軸の数字は細菌混合物中の最終抗体希釈度を示す。捕捉された抗体は、放射能 標識を付けたプロテインＧとともにインキュベートすることによって検出した。 免疫前ウサギ血清を含有する対照をすべての試験に含めたが、すべての場合、完 全に陰性であった。 図４は、精製タンパク質に対して生成したウサギ抗血清で、α、βおよびRib の精製タンパク質のウエスタンブロット分析を行った結果を示す。抗血清は１： １０００の希釈度で使用し、そして捕捉された抗体は放射能標識を付けたプロテ インＧで検出した。分子量のマーカーをKD単位で左側に示してある。 図５は、トリプシンまたはペプシンで処理したα、βおよびRib の精製タンパ ク質のSDS − PAGE分析結果を示す。トリプシンによる処理はｐＨ７．５で行い 、ペプシンによる処理はｐＨ４．０で行った。試料を中和してからSDS− PAGE分 析に付した。対照はトリプシンまたはペプシンを含有する試料と同じ方式で処理 したが酵素は全く添加しなかった。このような処理ではタンパク質の分解は全く 起こらなかった。Ｐ＝ペプシン；Ｔ＝トリプシン。分子量マーカーをKDの単位で 左側に示す。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、菌株BM１１０由来のrib 遺伝子のクローン化と、 エシェリキア・コリ（Escherichia coli）内でのタンパク質Rib の発現の結果を示す。（図６Ａ）７種のλクローン のウエスタンブロット分析の結果。抗Rib とともにインキュベートした。（図６ Ｂ）菌株BM１１０由来の染色体DNAの制限消化。（図６Ｃ）Rib を発現するλ− クローンλrib ３の制限消化。 異なる血清型のいくつもの菌株のムタノリシン抽出物を、SDS − PAGEに付し 次いでαとβのタンパク質に対する抗血清を用いて免疫ブロッティングを行うこ とによって、分析した（実施例１参照）。４種の主要血清型を示す４種の菌株で 得た試験結果を図１に示す。αタンパク質とβタンパク質は、Ｉａ型菌株とＩｂ 型菌株の両者によって発現されるが、染色ゲルの高分子量領域に別個のバンドを 生成した。これらのタンパク質は２種の菌株間で大きさが異なり、これは先の観 察結果と一致している。高分子量領域における主要タンパク質種はIII型菌株か ら調製した抽出物中に存在していたが、この菌株はαタンパク質またはβタンパ ク質を発現しない。高分子量のかような別個のタンパク質種は他のIII型菌株の 抽出物中にもみとめられ、そしてそのタンパク質は異なる菌株間では大きさが変 化して出現した。αタンパク質とβタンパク質にこのように類似しているので、 III型菌株の高分子量タンパク質を一層詳細に研究することが重要になった。菌 株BS３０をこの研究用に選択した。というのはこの菌株はマウス毒性であること が知られていたからである。この菌株が発現した９５KDのタンパク質（図１）を 、イオン交換クロマトグラフィーの二つの連続ステップ次いでゲル濾過法を用い て（図２）、ムタノ リシン抽出物から精製した（実施例２）。９５KDのタンパク質の存在について、 画分をSDS − PAGEで分析した。ゲル濾過で得た妥当な画分をプールし分析した ところ、二つのタンパク質種だけが見出された。すなわち大きい９５KDのタンパ ク質と小さい９０KDのタンパク質である（図２Ｂ中の挿入図参照）。この９０KD のタンパク質は恐らく９５KDのタンパク質の分解生成物であろう。というのはこ れらの二つのタンパク質は同じNH₂末端配列を有していることがその後に分かっ たからである。この精製されたタンパク質はタンパク質Rib と呼称される（resi stance to proteases，immunity，group B）。９５KD型のタンパク質Rib に 対する抗血清は、SDS − PAGEのゲルから切り取ったスライスでウサギを免疫化 することによって調製した。 タンパク質Rib が細胞表面タンパク質であるか否かを分析するため、４種の主 要血清型を示す菌株について、抗Rib 血清を捕捉する性能を試験した（図３）。 試験した５種の菌株は上記の４種の菌株と追加のIII型菌株BM１１０であり、BM １１０は高毒性のIII型クローンのメンバーである。比較のため、これら５種の 菌株も、これらタンパク質の高度に精製した製剤に対する抗血清を用いて、αタ ンパク質とβタンパク質の発現について試験した。 抗α血清は予想どおりＩａとＩｂの菌株と強く反応し、またIII型の二つの菌 株とは弱く反応した（図３Ａ）。しかし、III型菌株のムタノリシン抽出物は、 ウエスタンブロット法で分析したところ検出可能なαタンパク質を含有していな かった。したがって、抗α血清のIII型の全細菌との弱 い反応性は、ある種の他の細胞壁成分との交差反応性を示すようである。これら のデータは、抗α血清との反応性は、菌株が細胞表面にα抗原を発現するか否か を明確に分析するのに使用できることを示している。類似のデータを抗β血清に よって得た（図３Ｂ）。 タンパク質Rib に対する抗血清は上記２種のIII型菌株と反応したがＩａとＩ ｂ型の菌株とは反応しなかった（図３Ｃ）。中間レベルの結合性がII型菌株にみ とめられた。分析用抗Rib 血清を用いて、５種の菌株のムタノリシン抽出物をウ エスタンブロット法で分析したところ、III型菌株の抽出物は強く反応して９５K Dの位置に大きなブロッティングバンドを示したが、他の３種の菌株の抽出物は 反応性が完全に欠除していた（データは示していない）。この結果は、抗Rib 血 清のII型菌株との中位の反応性は交差反応性が原因でありこの反応性はウエスタ ンブロットの条件下では消失したことを示している。本発明の発明者らは、タン パク質Rib は上記２種のIII型菌株の細胞表面に発現されるが残りの３種の菌株 の細胞表面には発現されないと結論するものである。 公知の血清型の合計５８個の菌株（これらはすべて侵入性感染症から単離した ）を、タンパク質Rib に対する抗体を捕捉する性能について試験した（表１、実 施例６参照）。また各菌株はαとβのタンパク質に対する抗体を捕捉する性能に ついて試験した。多数の菌株の試験を簡素化するため、各抗血清は、図３に示す データに基づいて選択した１０００倍希釈度一つだけで試験した。この種の分析 によ って、実施例６の表１に要約した明確な結果が得られた。タンパク質Rib は、３ ３個のIII型菌株のうち３１個の細胞表面および１３個のII型菌株のうち１個の 細胞表面に見出されたが、１２個のＩａ型とＩｂ型の菌株のいずれからも発見さ れなかった。 細胞表面上にタンパク質Rib を欠除している菌株が、該タンパク質を倍地中に 放出することがありうると思われた。したがって、表１に列挙した５８個の菌株 の培養物の上澄み液を、分析用抗Rib 血清を用いてドットブロット法で分析した 。タンパク質Rib は、細胞表面に該タンパク質を発現しない２６個のすべての菌 株の上澄み液中に検出されなかったが、細胞表面に該タンパク質を発現する３２ 個の菌株のうち２６個の上澄み液中に見出された（データは記載していない）。 タンパク質Rib に対するウサギ抗体がＢ群れんさ球菌による致死感染症に対し て防御できるか否かを試験するため、マウスの防御モデルを使用した（表２、実 施例７）。対照の動物は、提示しているように、αタンパク質に対する抗血清ま たは免疫前の血清を投与された。得られたデータは、タンパク質Rib に対する抗 血清が、タンパク質Rib を発現する菌株による致死感染症に対してマウスを防御 することを示している。 タンパク質Rib はαタンパク質およびβタンパク質と同様に防御免疫を与える ため、これら３種のタンパク質を比較することは重要であった。分析用の精製タ ンパク質に対する抗血清を用いてウエスタンブロット試験を実施した（ 図４）。染色ゲルは、これら３種のタンパク質が高度に精製されて各製剤中に一 つの主要種として含有されていることを示したが、ウエスタンブロットに示すよ うに、これら３種のタンパク質間に血清学的交差反応は全くなかった。 αタンパク質とβタンパク質は、本来、プロテアーゼ感受性の差によって識別 された。αタンパク質はトリプシンに対して耐性であるがペプシンに対して感受 性であり、一方βタンパク質はこれら両者のプロテアーゼに対して感受性である （BevangerおよびMaeland，Acta Path Microbiol Scand Sect Ｂ、８７巻 、５１頁、１９７９年）。精製したαタンパク質とβタンパク質による試験で、 上記の差を確認しまたタンパク質Rib がトリプシンとペプシンの両者に対して耐 性であることを立証した（図５）。予想どおりに、これら３種のタンパク質はす べてプロテイナーゼＫによる分解に対して感受性であった（データは示していな い）。タンパク質Rib のプロテアーゼ耐性はインヒビターが存在するためではな い。というのは、βタンパク質は、タンパク質Rib の存在下でもトリプシンとペ プシンの両者によって完全に分解されたからである（データは提示していない） 。 本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に よって限定されない。 実施例 １ タンパク質の同定 ４種の主要血清型を示す４種のＢ群れんさ球菌菌株を参考菌株として使用した 。すなわちＡ９０９、Ｉａ／ｃ型；SB３５、Ｉｂ型；Ｂ１２８４、II型；BS３０ 、III型である 。BS３０菌株は、ルンド大学の大学病院で、新生児疾患がみられる男児から単離 した。細菌菌株はすべて、振盪することなく、トッド・ヒューイットブロス（Ox oid）中３７℃で増殖させた。これら菌株のムタノリシン抽出物は、SDS − PAGE を行い次にαとβのタンパク質に対する抗血清を用いて免疫ブロティングを行 うことによって分析した。れんさ球菌菌株の小規模ムタノリシン抽出物を、タン パク質の精製に用いた大規模抽出物について記載したのと同様にして製造したが 、わずか５０ mlの培養物を用いて２０％の細菌懸濁液を調製し、その１ mlの試 料を酵素で消化した。 SDS − PAGE は、架橋度が３．３％のポリアクリルアミドを全濃度１０％で用 いて標準の方法で実施した。試料を、２％のSDS と５％の２−メルカプトエタノ ールを含有する溶液中で３分間煮沸してから電気泳動にかけた。分離したタンパ ク質はクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０で染色するか、またはSemi - Dry Electroblotter（デンマーク、Vig所在のAncos社）を用い、電気ブロッ ティングによって、メタノールで活性化させたポリジフッ化ビニリデンの膜（Im mobilon − P；フランス、Molsheim所在のMillipore Corp.社）に転移させた。 このImmobilon膜を、標準法を用いてゼラチンでブロックし、次いで１０００倍 に希釈した指定した型のウサギ抗血清とともにインキュベートし（実施例７参照 ）次に放射能標識をつけたプロテインＧを用いてオートラジオグラフィーに付し た。 タンパク質の放射能標識付けは、クロラミンＴ法を用い て担体なしの ¹²⁵Ｉ（英国、Amersham International 社）で行った。全タンパ ク質の濃度はMicroBCAタンパク質検定試薬（Pierce）で測定した。SDS − PAGE ゲルからのタンパク質の電気溶出を、Bio − Rad社から入手したmodel４２２ E lectro − Eluter で実施した。 試験結果を図１に示す。 実施例 ２ タンパク質Rib の精製 菌株BS３０の一夜培養物１０ｌ中の細菌を遠心分離し（spin down）、５０mM トリスｐＨ７．３で２回洗浄し次に同じ緩衝液に再懸濁させて２０％（ｖ／ｖ） にした。この細菌懸濁液（１２５m ml）に、１０mMリン酸カリウムｐＨ６．２に 溶解して５０００単位／ mlしたムタノリシン（米国、ミズーリ州、セントルイ ス所在のSigma Chemical Co.社）を添加し、最終濃度を３５０単位／ mlにし た。消化を、緩やかに振盪しながら３７℃で１７時間行い、次にプロテアーゼイ ンヒビター類を次の最終濃度まで添加した。すなわち塩化ベンズアミジン、５mM ；ヨード酢酸、５mM；フッ化フェニルメチルスルホニル、２mMである。得られた 懸濁液を遠心分離し、その上澄み液を直ちに１０mMトリスｐＨ８．０に対して透 析した（透析管：Spectrapor No.４）。この透析された製剤をイオン交換クロ マトグラフィーの二つの連続ステップに付した。予備試験で分かっていたように 、この方法によって純粋なタンパク質Rib を最高に回収することができた。タン パク質Rib が存在していることは、SDS − PAGE を行い次に９５KDのバンドの存 在についてゲルを視覚検査することによって分析した。第 一のクロマトグラフィーのステップでは、透析された製剤（１１０ ml）を、１ ０mMトリスＰＨ８．０中０．４ＭNaClおよび１０mMトリスｐＨ８．０で平衡化し たDEAE Bio − Gel Ａ（３０ ml）（米国、カリフォルニア州、リッチモンド 所在のBioRad Laboratories社）と混合した。この混合物を４℃で１時間ゆるや かに攪拌し、次いで未吸収物質（タンパク質Rib を含有している）をガラスフィ ルターによる濾過を行ってゲルから分離した。第二のクロマトグラフィーのステ ップ（図２Ａ）では、タンパク質Rib を含有する濾液を蒸留水で２０倍に希釈し てイオン強度を低下させ、次に先に述べたようにして平衡化させたDEAE Bio − Gel Ａ（３０ ml）と混合した。４℃で１６時間ゆるやかに攪拌した後、ゲル を濾過によって回収し１０mMトリスｐＨ８．０で洗浄した。吸収されたタンパク 質（タンパク質Rib を含有している）を、塩の直線勾配液（１０mMトリスｐＨ８ ．０中の０〜０．２Ｍ NaCl）８００ mlで続いて１Ｍ NaCl ６０ mlで溶離し た。１０ mlずつの画分を収集し、タンパク質Rib を含有する画分をプールし、 濃縮し、次にPBSA（０．１２Ｍ NaCl、０．０３Ｍリン酸塩、０．０２％ NaN₃ 、ｐＨ７．２）中のセファロース CL ６Ｂのカラム（４．２cm×９０cm）でゲル 濾過に付した（図２Ｂ）。上記の各画分は９５KDのバンドの存在についてSDS − PAGE 電気泳動によって分析した。タンパク質Rib を含有する画分（１０ mlず つ）をプールし凍結した。タンパク質Rib の収量は細菌２５ｇ当り約６mgであっ た。免疫化学分析に用いるタンパク質Rib の製剤の純度を 保証するため、この試験に使用する該タンパク質はさらにSDS − PAGE で精製し 生成した９５KDのバンドを電気溶出させた。しかし、SDS − PAGE 分析した結果 、この電気溶出がなされた物質と上記ゲル濾過ステップで回収された物質との間 に純度の差は全くみとめられなかった。 上記のように、タンパク質Rib は該タンパク質を発現する菌株の培地中にもみ とめられる。該タンパク質は、上記の方法に類似の方法を用いて、かような培地 から精製することができる。 Immobilonに転移させたタンパク質バンドの自動アミノ酸配列の分析を、Appli ed Biosystems ４７０Ａガス−液体固相シークエネータを用いて、上記膜上で 直接実施した。これらの膜をクーマシー・ブリリアント・ブルーで軽く染色して タンパク質のバンドの位置を突き止め、そのバンドを配列決定のために切り取っ た。タンパク質の配列の分析についてはSwissProt Data Bank を利用した。 菌株BS３０由来のタンパク質Rib のNH₂ 末端の配列を配列番号：１に示す。精 製されたタンパク質Rib 中の推定分子量が９５KDと９０KDの二つのタンパク質（ 図２Ｂ）は同じNH₂ 末端配列を有することが見出されたが、このことは、小さい 方の分子が大きい方の分子の分解生成物であることを示唆している。データサー チを行ったところ、タンパク質Rib のNH₂ 末端の配列は独特のものであることが 分かった。 菌株BM１１０からのタンパク質Rib の単離も同じ精製手順にしたがって行った 。菌株BM１１０から単離されたタン パク質Rib のNH₂ 末端配列（配列番号：２）は、BS３０由来の対応するタンパク 質のNH₂ 末端配列と７位で異なっている。すなわちBM１１０の該タンパク質は７ 位にAsp の代わりにSer を有している。 実施例 ３ αタンパク質の精製 αタンパク質は、αタンパク質とβタンパク質の両方を発現するＩｂ型菌株で ある菌株SB３５から精製した。使用した方法は、菌株BS３０からタンパク質Rib を精製するのに使用したのと類似の方法である。各画分は、ウサギ抗α血清（ノ ルエーのトロンヘイム大学の L．Bevanger博士から提供された）および ¹²⁵Ｉで 放射能標識をつけたプロテインＧ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴのCa lbiochem Co．社）を用いて、ドットブロット分析法によって、αタンパク質の 存在について分析した。イオン交換ステップとゲル濾過ステップにおいて、αタ ンパク質の挙動はタンパク質Rib の挙動と類似していた（図２参照）。ゲル濾過 ステップで回収されたαタンパク質はシャープなピークで存在していた。異なる 抗血清でこの物質を分析したところ、この物質が痕跡量の汚染βタンパク質を含 有していることを示したが、この汚染βタンパク質は該製剤をIgA−セファロー スの小カラムを通過させることによって除去した。精製されたαタンパク質は、 SDS − PAGE 分析の結果、分子量が約１１００００であった（図４参照）。αタ ンパク質の収量は、細菌３９ｇ当り１２mgであった。免疫化学試験に用いるαタ ンパク質は、タンパク質Rib について先に述べたようにしてSDS − PAGE ゲルか ら電気溶出法 でさらに精製した。しかしSDS − PAGE で分析したところ、この電気溶出された 物質とゲル濾過ステップから回収した物質との間に純度の差はみとめられなかっ た。 実施例 ４ βタンパク質の精製 IgA 結合βタンパク質（Russell −Jones ら、J ExpMed 、１６０巻、１４６ ７頁、１９８４年）を、Rib タンパク質およびαタンパク質に使用したのと類似 の方法で精製した。出発物質は、洗浄したSB３５細菌を、５０mMグリシン−NaOH 緩衝液ｐＨ１１．０中でインキュベートすることによって得た（懸濁液の最終ｐ Ｈ９．７）。本発明の発明者らの実験室での以前の研究によって、このような抽 出物中の主要タンパク質の種はβタンパク質であることが分かっていた。その抽 出物（２２２ ml）を直ちに１０mMトリスｐＨ８．０に対して透析し、蒸留水で ２０倍に希釈し、次いで４０ mlのDEAE Bio − Gel Ａ（１０mMトリスｐＨ８ ．０で平衡化した）と混合した。４℃で２時間ゆるやかに攪拌した後、ゲルをカ ラムに移し、８００ mlの塩の直線勾配液（１０mMトリスｐＨ８．０中０〜０． ２ＭのNaCl）で溶離した。βタンパク質の存在について画分（１０ mlずつ）を 試験するため、分析用の、放射能標識を付けたIgA または抗β血清および放射能 標識を付けたプロテインＧを用いて、ドットブロット法を利用した。βタンパク 質は該勾配液の最初の部分で溶出した。適正な画分をプールし、濃縮し、次いで PBSA中のAcA ３４のカラム（４．２×１００cm）（スエーデン、アプサラ所在の Pharmacia− LKB社）でゲル濾過に付した。βタンパク質は明確なピ ークで溶出した。適正な画分をプールし、濃縮し次いで凍結した。その収量は、 細菌２３ｇ当り純粋なタンパク質９mgであった。このような製剤の主要タンパク 質の種は、SDS − PAGE による分子量が約１３００００であったが、そのタンパ ク質をウエスタンブロット分析に付したところ、分子量が小さい少量の分解生成 物もみとめられた。 実施例 ５ プロテアーゼ感受性の分析 プロテアーゼ感受性を分析するため（図５）、精製したα、βまたはRib のタ ンパク質（０．５mg/ ml）の試料２００μｌずつを、トリプシン、ペプシンまた はプロテイナーゼＫ（０．２mg/ ml）とともに３７℃で１時間インキュベートし た。トリプシンによる消化は、０．２５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．５中で実施 し、ペプシンによる消化は、０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中で行い、そ してプロテイナーゼＫによる消化は０．２５ＭトリスｐＨ７．４中で行った。試 料はSDS − PAGE で分析する前に中和した。 実施例 ６ α、βおよびRib のタンパク質の細胞 表面での発現に関するれんさ球菌菌株の分析 本発明の発明者らの実験室で入手できる５種の参考菌株を、第一に、α、βお よびRib のタンパク質の表面発現について分析した。その後、５８個のＢ群れん さ球菌菌株のコレクション（すべて侵入性感染症の症例から単離した）もこれら 細胞表面タンパク質の発現を試験するのに用いた（表１参照）。Ｂ群れんさ球菌 菌株の型の判定は、標準の方法を用いてルンド大学大学病院の臨床微生物学研究 所で 実施した。 １０ mlの一夜培養物中の細菌をPBSAT （０．０５％ Tween２０で補充したPBS A）で２回洗浄し次いでPBSAT による１％懸濁液を調製した。この細菌懸濁液の 試料（１８０μｌ）を、PBSAT で希釈したウサギ抗血清（２０μｌ）と混合し、 次にその混合物を２３℃で１時間インキュベートした。２ mlのPBSAT を添加し 、細菌を遠心分離し、２ mlのPBSAT で一回洗浄し、２００μｌのPBSAT に再懸 濁させた。捕捉されたIgG を検出するため、２５μｌの放射能の標識をつけたプ ロテインＧ（PBSAT 中約１０⁴ cpm ）を添加し、インキュベーションを２３℃で １時間続けた。２ mlのPBSAT を添加してから、細菌を遠心分離し、得られたペ レットを、２ mlのPBSAT を添加することによって洗浄した。最終の遠心分離を 行った後、上澄み液を排棄してペレットの放射能を測定した。多くの菌株をα、 βおよびRib のタンパク質の発現について試験したとき（表１）、１：１０００ という単一の最終抗血清希釈度を使用した。免疫前のウサギ抗血清による対照を 常に含めたがすべての場合、完全に陰性であった。タンパク質Rib は、３３個の III型菌株のうち３１個の細胞表面に見出されたが１２個のＩａ型とＩｂ型の菌 株のいずれからも見出されなかった。 α、βおよびRib のタンパク質の細胞表面発現は特異的抗血清で分析し、そし て捕捉された抗体は、図３に示すように放射能標識をつけたプロテインＧで検出 した。 ここで試験した５８個の菌株はすべて侵入性感染症の症例から単離したが、こ れら菌株の無作為のコレクションではない。というのはII型の菌株の大部分は最 初に試験したコレクションにその後つけ加えたものであり、最初のコレクション にはII型菌株は２個しか含まれていなかったからである。 実施例７ 抗血清の製造とマウス防御試験 抗血清はすべてウサギに産生させた。そのウサギは背中への皮下注射で免疫化 した。菌株BS３０によって発現されるタンパク質Rib に対する抗血清を調製する ため、SDS − PAGE ゲル中のいくつもの９５KDバンドに相当するスライスを切り取り、小片に 分割し、次に完全フロイントアジュバントと混合した。最初の免疫化を行うため 、１ mlのPBS 中６個のスライス（約６０μｇのタンパク質）を１ mlのアジュバ ントと混合した。追加注射（booster injection）用に３個のバンド（３０μｇ のタンパク質）を使った。第一の追加注射は４週間後に行い、次いで３回の追加 注射を２週間の間隔をおいて行った。次にそのウサギから３週間の間隔をおいて ３回採血し、これら３回の採血で得た血清をプールし、ここで報告する実験に使 用した。αタンパク質に対する抗血清は同様の方法で製造した。抗α血清の第一 の試料は、精製中の画分を分析するのに使用したが、これはトロンヘイム在住の Lars Bevanger博士から入手した。精製されたβタンパク質に対する抗血清は本 発明の発明者らの実験室で入手できた。 本発明の発明者らの部署で飼育したＣ３Ｈ／HeN マウスを１０〜２０週齢で使 用した。これらのマウスに、PBS で５倍に希釈したウサギ血清０．５ mlを腹腔 内注射し、次に４時間後、トッド・ヒューイットブロスで希釈した対数期の細菌 ０．５ mlを腹腔内注射することによって感染させた。使用した細菌の数は、９ ０％致死量（LD₉₀）と推定された数であり、BM１１０、BE２１０およびSB３５se dlについては２×１０⁶ c.f.u.であり、BS３０とＬ２５については２×１０⁷ c. f.u.であった。死亡動物は４日間毎日計数した。対照の動物は通常２４時間以内 に死亡した。 表２のデータは、タンパク質Rib に対する抗血清が、該タンパク質が精製され たIII型菌株であるBS３０による致死感染症に対して防御することを示している 。この防御は、対照の血清による試験で分かるように非特異的ではない。また抗 Rib 血清は、Ｂ群れんさ球菌菌株の高毒性クローンのメンバーである他のIII型 菌株のBM１１０（Musserら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、８６巻、４７３１頁 、１９８９年）による致死感染症に対して防御した。これに対して抗Rib 血清は 、タンパク質Rib を発現しないIII型菌株の一つであるＬ２５による感染症に対 して防御をしなかった（表１）。抗Rib 血清の防御作用は、タンパク質Rib を発 現するII型菌株による試験で示されているように、III型菌株に限定されなかっ た。予想どおりに、抗Rib 血清はα抗原を発現するＩｂ型菌株に対して防御しな かった。これらのデータを総合してみると、タンパク質Rib は、ほとんどすべて のIII型菌株といくつかのII型菌株、すなわち侵入性感染症を起こす大部分のＢ 群れんさ球菌菌株に毒性因子として作用することを強く示唆している。 実施例 ８ rib 遺伝子のクローン化および エシェリキア・コリ（Escherichia coli ） でのタンパク質Rib の発現 タンパク質Rib に対する構造遺伝子を、高毒性クローンのメンバーの血清型II Iの菌株である菌株BM１１０からクローン化した。この菌株が発現するタンパク 質Rib （配列番 号：２）と菌株BS３０が発現するタンパク質Rib （配列番号：１）は、類似した 大きさとNH₂ 末端配列を有している。バクテリオファージλ中に菌株BM１１０ D NAのライブラリーを構築した。菌株BM１１０の対数期のトッド・ヒューイット培 養物５００ ml中の細菌を遠心分離した。ペレットの凍結と融解を３回行い、２ ０ mlのTE緩衝液（１０mMトリス、１mM EDTA、ｐＨ８．０）中に懸濁させ、遠 心分離し、洗浄し次いで４ mlの同じ緩衝液中に再懸濁させた。１０ mMリン酸カ リウムｐＨ６．２に５０００単位／ mlまで溶解したムタノリシン（米国、ミズ ーリ州、セントルイス所在のSigma Chemical Co.）を、上記細菌懸濁液に添加 して、最終濃度５００単位／ mlにした。リゾチーム（Sigma 社）を最終濃度８m g／ mlまで添加し、次に消化を３７℃で３時間行った。最近の細胞を、２００μ ｌの１０％SDS および５００μｌのTween 溶解ミックス（２％Tween −２０、５ ０mMトリスｐＨ８．０および６０mM EDTA）を添加し、次いで別の２００μｌの １０％SDS を添加することによって溶解した。得られた溶菌液をプロテイナーゼ Ｋ（Sigma 社、１００μｇ／ ml）で５０℃にて１９時間処理し次いでフエノー ルとクロロホルムによる抽出を繰返した。得られたDNA をエタノールで沈澱させ 、SpeedVac concentrator （SAVAC）で乾燥し、次いで４．５ mlのTE緩衝液に溶 解した。得られたDNA をさらにCsCl密度勾配超遠心分離法で精製し、次にTE緩衝 液に対して透析した。そのDNA の濃度は約２．５μｇ／μｌであった。このDNA をSau ３ＡＩ（Promega 社）で部分的に消化し、λEMBL３ （Statagene 社）のBam HI で開裂されたアームに連結した。その組換えファー ジDNA を、Gigapack II Gold Packaging Extract （Stratagene社）を用い て、生体外でパッケージした。そのライブラリーをイー・コリ（E．Coli）菌株L E３９２上にプレートし、タンパク質Rib の産生について免疫ブロッティング法 で選別した。すなわち、約１０００個のプラークを有するプレートをニトロセル ロースの膜で覆って４℃で１時間放置した。膜を取り外し、ブロックし、５０倍 に希釈されたウサギ抗Rib 血清を含有する緩衝液中でインキュベートした。陽性 のプラークすなわちウサギIgG を捕捉するプラークは、ペルオキシダーゼで標識 を付けたプロテインＡ（Sigma 社）（２０μｇ／ ml）を添加することによって 検出され、そしてペルオキシダーゼの存在は標準の方法を用いて可視化した。７ 個の独立したRib 発現λクローンが単離された。これらのクローンのなかの３個 すなわち、λRib １−３、λRib １−５およびλ Rib １−７はそれぞれ寄託番 号DSM...でDeutsche Sammlung von Microorganismenに寄託されている。また DNA 濃度が約０．５μｇ／μｌである、λRib １−３クローン由来のDNA 製剤を 製造した。これら７種のクローンの溶菌液を、抗Rib 血清を用いてウエスタン免 疫ブロット分析に付した（図６参照）。これらクローンのいくつかは菌株BM１１ ０から直接単離したタンパク質Rib と同じ大きさのタンパク質Rib を発現する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/569 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Rib と呼称される精製タンパク質であって； (a) Ｂ群れんさ球菌菌株、特に血清型IIIの該菌株から得ることができ； (b) トリプシンおよびペプシンによる分解に対して比較的耐性であり； (c) 配列番号：１のＮ末端アミノ酸配列またはこの配列に対し少なくとも９０％ の相同性の配列を有し；および (d) 該タンパク質を発現するＢ群れんさ球菌菌株に対する防御免疫を与える； ことを特徴とするタンパク質；ならびに防御免疫を与える性能を有する、該タン パク質の天然産または人工的に修飾された変異体、サブフラグメントおよび多重 体。 ２．前記菌株が菌株BS３０またはBM１１０であり、前記タンパク質がSDS − P AGE で測定した場合、約９５KDの見掛けの分子量を有する請求の範囲１記載のタ ンパク質。 ３．タンパク質Rib を発現するＢ群れんさ球菌菌株を培養し、その培地および ／または微生物を単離し、その細菌を酵素好ましくはムタノリシンで消化し、任 意にプロテアーゼインヒビターを添加し、消化した細菌を上澄み液から分離し、 次いでタンパク質Rib を上澄み液から抽出することを特徴とするタンパク質Rib の単離方法。 ４．前記タンパク質を、透析、イオン交換クロマトグラフィーによる分画、お よびゲル濾過によって、前記上澄み液から抽出する請求の範囲３記載の方法。 ５．請求の範囲１に定義されているタンパク質Rib なら びにその変異体、サブフラグメントおよび多重体に対して高度に特異的な抗体。 ６．請求の範囲１に定義されているタンパク質Rib またはその変異体、サブフ ラグメントおよび多重体が入っていることを特徴とする、タンパク質Rib に対す る抗体を検出するのに用いる薬剤キット。 ７．請求の範囲１に定義されているタンパク質に特異的な抗体が入っており、 そして任意に、タンパク質Rib ならびにその変異体、サブフラグメントおよび／ または多重体が標準として入っていることを特徴とする、タンパク質Rib を検出 するのに用いる薬剤キット。 ８．請求の範囲１に定義されているタンパク質Rib またはその変異体、サブフ ラグメントもしくは多重体をコードするDNA 配列を含有しているベクター。 ９．タンパク質Rib をコードするベクターのDNA 配列が、寄託番号がDSM...で あるファージλRib １−３の対応する配列のいずれかと事実上同じであることを 特徴とする請求の範囲８記載のベクター。 10．タンパク質Rib をコードするベクターのDNA 配列が、寄託番号がDSM...で あるファージλRib １−５の対応するDNA 配列のいずれかと事実上同一であるこ とを特徴とする請求の範囲８記載のベクター。 11．タンパク質Rib をコードするベクターのDNA 配列が、寄託番号がDSM...で あるファージλRib １−７の対応するDNA 配列のいずれかと事実上同じであるこ とを特徴とする請求の範囲８記載のベクター。 12．寄託番号がDSM...であるファージλRib １−３。 13．寄託番号がDSM...であるファージλRib １−５。 14．寄託番号がDSM...であるファージλRib １−７。 15．請求の範囲８に定義されているベクターから得ることができる、タンパク 質Rib またはその変異体、サブフラグメントもしくは多重体をコードするDNA 配 列。 16．請求の範囲１に定義されているタンパク質Rib またはその変異体、サブフ ラグメントもしくは多重体を含有し、さらに医薬として許容される佐剤または賦 形剤を含有する医薬組成物。 17．請求の範囲１に定義されているタンパク質Rib またはその変異体、サブフ ラグメントもしくは多重体を含有し、さらに医薬として許容される佐剤または賦 形剤を含有するワクチン。