JPH06503843A - Ｈｉｖ−２ウイルスの一部分に対応する合成ペプチドおよび改良されたイムノアッセイにおけるその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩ　Ｖ−２ウイルスの一部分に対応する合成ペプチドおよび改良されたイムノ ア、セイにおけるその使用方法本見所■豆景 本！■Ω圀団 本発明は、合成ペプチドおよびこれらの合成ペプチドをＨＩＶ−２に対する抗体 の改良されたイムノアッセイに使用する方法にＭする。

五百１Ｊ（四腎肌 ＨＩＶ−２はＨＩＶ−１に関係するウィルスである。Ｇｕｙａｄｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２６：６６２−６６９　（１９８７）ＨＩＶ−２の完全 なヌクレオチド配列は、イドの４２％がＨＩＶ−１と遺伝子配列相同性を示す、 しかしながら、研究は、ＨＩＶ−２感染を存する患者はＨＩＶ−１を検出する血 清学的テストによっては同定されないことを示した。いくつかのＨＩＶ−２抗原 は、ＨＩＶ−２５染された患者の血清中の抗体によって認識されるとして同定さ れた。これら抗原は組換えまたは合成によって製造することができる。例えば、 Ｖａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許に４，８１２．５５６を見よ。この特許 において、Ｖａｈｌｎｅはいくつかの抗原ペプチドのアミノ酸配列を開示した。

これら抗原ペプチド配列（配列同定Ｎα１）（配列同定障２）は、そのＮ末端に おいてペプチドの末端ＮＨｚｉのＨか、またはペプチドのアミノ末端ＮＨ，へ結 合した追加のアミノ酸を有することができ、この追加のアミノ酸はペプチドを担 体タンパクへそしてＣ末端においてＯＨがまたはＮ　Ｈｚへ連結するのを容易化 するように選定される。

ペプチドはそれ自体抗原性であり得るけれども、種々の固相ヘペプチドを結合す るときその抗原性が影響されることがあり得る。この抗原性の変化はイムノアッ セイの実行に有用でない固相をもたらし得る。イムノアッセイの実行においては 、低濃度のＨＩＶ−２抗体を検出する固相免疫反応剤の能力が要求される。これ はこれら抗体は体液中に低濃度で存在し得るからである。

本ｌ息Ω塁要 本発明は、Ｖａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌによって開示された基本配列を有し、ＨＩ 　Ｖ−２エンベロープ遺伝子によってエンコードされる糖タンパクｇｐ−４１の 部分に相当するある種の合成ペプチドに関する。本発明者らによって発見された 改良は、面相への結合のためペプチドのどちらかの末端へ実質的に隣接してリジ ンを追加することと、そしてもしリジンがペプチドのＮ末端へ追加されるならば 、追加したリジンとＶａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌのペプチドのアスパラギン酸の間 へグリシンを追加することを含む。驚くべきことに、この取扱上の便宜のために 修飾したペプチドは改良されたイムノアッセイ感震を示した。

詳しくは、本発明は式（配列同定ＮＣＬＩ）の抗原性ペプチドに関し、改良は前 記ペプチドのどちらかの末端へ実質的に隣接してリジンを付加し、そしてもしリ ジンがＮ−末端へ付加されるならば、付加したリジンとアスパラギン酸の間にグ リシンを付加することを含む加えて、本発明は式（配列同定胤２）の抗原性ペプ チドに関し、改良は前記ペプチドのどちらかの末端へ実質的に隣接してリジンを 付加し、そしてもしリジンがＮ−末端へ付加されるならば、付加したリジンとア スパラギン酸の間にグリシンを付加することを含む。

さらに詳しくは、本発明は配列リストに記載するように、２６個アミノ酸配列（ 配列同定１’ｈ３）、２７個アミノ酸配列（配列同定胤４）、２５個アミノ酸配 列（配列同定Ｎ１１５）、２６個アミノ酸配列（配列同定Ｎ１１６）を有するペ プチドであると定義することができるこれらのペプチドはサンプル中のＨＩＶ− ２に対する抗体の検出のために使用することができる。この方法は、サンプルを 前記ペプチドと、該ペプチドともしサンプル中に存在すればＨｒＶ−２に対する 抗体の間の免疫学的複合体が形成されるような条件のもとに接触させることと、 そしてもしサンプル中に存在すればＨＩＶ−２に対する抗体の存在を決定するた め前記免疫学的複合体の生成を測定することを含む。

の　な一 本発明は、合成され、そしてＶａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌ（参照として取入れた米 国特許に４，８１２，５５６）によって示されたように、ＨＩＶ−２陽性血清サ ンプルに対する免疫反応性をテストされたＨＩＶ−２のトランスメンブレン糖タ ンパクｇｐ−４１の区域に相当する改良されたペプチドを提供する。Ｖａｈｌｎ ｅ　ｅｔａｌのペプチドは以下のアミノ酸配列（配列同定ｋｌ）（配列同定Ｎ１ １２）を有し、そのＮ末端において該ペプチドのアミン末端ＮＨ。

基のＨか、または該ペプチドのアミノ末端ＮＨ，基へ結合した追加のアミノ酸を 有することができ、追加のアミノ酸はペプチドを担体タンパクへそしてＣ末端に おいてＯＨもしくはＮ　Ｈｚへ結合するのを容易化するように選定される。

本発明者らは、ペプチド中のリジンの存在は固相へのその共有結合を容易化する ことを観察した。そのため本発明者らはＶａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌのペプチドを リジンの付加によって延長した。リジンは固相への共有結合のためペプチドのど ちらの末端においても組入れることができる。このリジンは、どちらかの末端へ 実質的に隣接するように配置される。「実質的に隣接」なる句は末端１個または ２個のアミノ酸内にあることを意味する。

加えて、グリシンがリジンとＶａｈｌｎｅ　ｅｔ　ａｌペプチドのアスパラギン 酸の間に付加される。グリシンは、１）粒子上のペプチドのより良い配向のため のスペーサーとして作用するため、および２）Ａｓｐの−ＣＯＯＨとリジンのＮ Ｆ２基の間の相互作用を防止するために付加される。このため修飾されたペプチ ドは（配列同定Ｎ１１３−６）に示すアミノ酸配列を持ち得る。

ペプチドはＭｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９６００モデルペプチドシ ンセサイザー上で、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）アミノ保護方 法および１−３ジイソプロピルカルボジイミドカツプリング化学を使用してアミ ノ形に合成された。配列のアミノ形は、遊離酸形よりも、生物学的に活性な類縁 体を一層密接に真似することが期待できたために採用された。活性化されたアミ ノ酸は２．４−ジメトキシベンズヒドリルアミン樹脂へ結合された。ペプチド合 成は、プロリンを除くすべてのアミノ酸についてニンヒドリン分析によってモニ ターされ、プロリンについてはイサチン試験が実施された０合成されたペプチド は、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジオールおよびアニソールの体 積比９０：５：３：２よりなる試薬Ｒによって樹脂から開裂された。

樹脂から開裂されたペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）によっ て精製され、そして正しい配列を確認するためＰＯｒＬｏｎ　Ｐｉ　２０　９０ インテグレーテツドマイクロンーケンシングシステムによって特徴化された。純 度は、直線勾配〔（Ａ）水中０．１％トリフルオロ酢酸、（Ｂ）ＣＨ３ＣＮＮＯ ３１％トリフルオロ酢酸の（Ｂ）５％ないし６０％）を用い、４５分間の逆相カ ラム上のＨＬＰＣによって確認された。吸光度が２３０ｎｍにおいて追跡された 。このプロセスによって合成されたペプチドは（配列同定Ｎα３）に示したアミ ノ酸配列を有する。

これらのペプチドは以下の操作に従ってカルボキシル官能化磁性粒子へ共有結合 により結合された。約５μｍの常磁性粒子の２．５％Ｗ　／　Ｖのｌｄがマグネ チックセパレータ上で５ｄサイズ使い捨て無菌冷凍バイアル（コーニング、カタ ログ番号２５７０Ｂ）中に分離された。上清を除去し、粒子は７０％エタノール ｌｌ１ｉ中に１０分間再懸濁された。粒子は前と同様に分離し、上清を除去した ０粒子は０．１Ｍリン酸塩緩衝液ＰＨ５，５のｌｌｌ１中に再懸濁した。粒子を 前と同様に分離し、上清を除去した。リン酸緩衝液による以後の洗浄操作を前と 同様に２回繰返し、上清を除去した。

粒子のスラリーへ、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６■と、１−エチル −３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩７■を加えた。粒子を 再懸濁し、室温で５分間ときどき振とうして放置した。活性化した粒子へ、ＨＩ Ｖ−２ペプチド溶液（０，１Ｍリン酸塩緩衝液ｐｉ４７．３中１■／Ｈ１）１２ ５μ２を加え、次に０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，３の８７５μ２を加えた。

粒子をよく混合し、室温で１２〜１５時間傾けた。

共有結合したペプチド粒子は次にマグネチンクセパレータ−上で分離された。上 清を除去し、粒子は’ｌ”ｗｅｅｎ２０洗剤０．０５％添加した等張緩衝化食塩 水中に再懸濁された。粒子はさらに分離され、等張緩衝化食塩水中に３回再懸濁 された。被覆された粒子は次に等張緩衝化食塩水中に、最終粒子濃度０．２５％ ｗ　／　ｖに再懸濁された。Ｃ末端は所望の最終用途に応じ、アミドまたは酸基 よりなることができることを注意すべきである。

ペプチドはまた、以下の操作に従って常磁性粒子上へ受動的に被覆された。約５ μｍ常磁性粒子２．５％ｗ　／　ｖのｌｄがマグネチ・ツクセパレーター上で５ ａｆサイズ使い捨て無菌冷凍バイアル（コーニング、カタログ番号２５７０８） 中に分離された。上清を除去し、粒子は７０％エタノールＩＩｄ中に再懸濁され た。粒子を前と同様に分離し、上清を除去した。粒子を０．ＬＭ　ＣＨＥＳｇ衝 液ｐ８９．３　（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン＃）ｌｄ中 に再懸濁した０粒子は前と同様に分離し、上清を除去した。ＣＨＥＳ緩衝液によ る前と同様な洗浄をさらに繰返し、上清を除去した粒子のスラリーへ０．１Ｍ　 ＣＨＥＳ緩衝液８７５μ２およびペプチド溶液（０，１Ｍ　ＣＨＥＳ緩衝液中１ ■／Ｉｄ）１２５μ２を加えた０粒子を再懸濁し、室温で１８時間傾けた。

受動的に被覆された粒子は次にマグネチックセパレータ上で分離され、上清が除 去され、そして粒子は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０洗剤を含む等張緩衝化食塩水中 に再懸濁された。被覆した粒子は次に等張緩衝化食塩水中に最終粒子１度０．２ ５％ｗ／ｖに再懸濁された。

実施例１ 前に記載したようにして調製された、ペプチドを被覆した粒子を用いる常磁性粒 子アンセイを以下のように実施した。ヒト血清もしくは血漿をウェル緩衝液（２ ０％ウシ新生児血清、１．０６Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７，４±０．３．０．０９ ％ナトリウムアジド、および１．０１％ＮＰ−４０）中に１　：　１００希釈し た。

希釈したサンプル５０μ２をＰａｎｄｅｘｉ色マイクロタ色マークロタイタ−プ レート加えた。サンプルは少なくとも２回反復してテストした。実施例１または ２に記載した、ペプチドで被覆した常磁性粒子を各ウェルへ加えた（２０μｌ） 、プレートを次に４２℃で３０分間放置した。

インキュベーション終了時、ウェル中の粒子をリン酸緩衝化食塩水およびＴｗｅ ｅｎ２０　（二塩基性リン酸ナトリウム２．０６ｇ。

−塩基性リン酸ナトリウム０．３１８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０　０．５ｄ、塩化ナト リウム８．７６ｇ、およびナトリウムアジド１．Ｏｇ／Ｉ！、ｐＨ７，４）１０ ０μ２で洗った。洗浄ステップの間、常磁性粒子は、プレートの底へ印加した磁 場によりマイクロタイタープレート中に保持した。粒子はこの態様で６回洗浄さ れた。

各ウェル中の粒子は粒子再懸濁緩衝液（１！中二塩基性リン酸ナトリウム４．３ ４６ｇ、−塩基性リン酸ナトリウム０．５２４ｇ。

塩化ナトリウム８．７６ｇ、　アジ化ナトリウムＩｇ、ｐＨ７，４）３０ｕｌ中 に再懸濁され、コンジュゲート希釈緩衝液（０，１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７， ５，０，５Ｍ塩化ナトリウム、５％　グリセロール、５．２５ｍＭ塩化マグネシ ウム、２０％ウシ新生児血清、ｐＨ７５±０．３）中に１：２０００希釈された ヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲートβ−ガラクトシダーゼ（コンジュ ゲート）２０μｌがウェルへ加えられた。４２℃で１５分間コンジュゲートとイ ンキューベーション後、ウェル中の粒子を未結合コンジュゲートの実質上全部を 除去するため、前に記載したようにリン酸塩緩衝化食塩水およびＴｗｅｅｎ２０ で６回洗った。洗液中のＴｗｅｅｎ２０は洗浄プロセスを増強し、そして非特異 的に結合したコンジュゲートを除去した。

最後に、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ”）の 基質溶液Ｃ１ｆ中ＭＵＧ０．１７８ｇ、）リシン３゜５８ｇ、ＤＭＳＯ５，ｌ１ １．メチルアルコール３０ｍ、ナトリウムアジド０．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０　０ ．５ｄ、ｐＨ８，５）５０μｌが各ウェルへ加えられた。ウェル中のβ−ガラク トシダーゼ（すなわちコンジュゲート）の存在はＭＵＧの開裂を引金し、螢光性 クマリン産物を発生する。この試薬およびコンジュゲートは感受性検出システム として使用した。螢光（励起波長４００　ｎｍ／放出波長４５０　ｎｍ）をＭＵ Ｇ添加後二つの時間間隔（すなわち２分および１４分）において測定した。二つ の値の間の差は螢光生成物発生の動力学的測定であり、そして粒子へ結合したコ ンジュゲートおよびヒトＩｇＧ／ＩｇＭの直接測定である。螢光値は、標準曲線 を作成するためクマリン自体の各種濃度およびその結果得られる螢光を使用して ｎＭクマリン値へ換算された。

（以下余白） Ｈｆ　Ｖ−２陽性　１：ｌ６００　２１８７　５０００１：３２００　１０９９ 　２７９９ １：６４００　５６３　１４８２ ＨＩＶ−２陽性　１：１６００　１８５７　３００９１：３２００　ｓｓｏ　１ ４４７ １　：６４００　４０８　６２９ ＨＩ　Ｖ−２陽性　１　：　１００　８５　６５陰性対照　１　：　１００　９ ０　８３サンプル希釈液　□　１２　１６ ＊アッセイ条件は０．０５％粒子懸ｆＡ液、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−β−ガラクトシ ドダーゼコンジュゲートであった。

＊＊アッセイ信号は螢光単位である。

（以下余白） ）ｆＩＶ−２陽性　１：１６００　１２１０　２３０７１　：　３２００　５７ ０　１０７４ １　：６４００　２４２　４８５ ＨＩＶ−２陽性　ｔ：ｔ６ｏｏ　９５９　２５８０１　：　３２００　３９６　 １２４２ １　：６４００　１９Ｂ　５９Ｂ 陰性対照　１　：　１００　２３　３８サンプル希釈液　□　２２　１３ ＊アッセイ条件は０．０５％粒子粒子液、ヤギ抗ヒト■ｇＧ−β−ガラクトシド ダーゼコンジュゲートであった。

＊＊アッセイ信号は螢光単位である。

磁性粒子へ受動的におよび共有結合で連結した修飾したペプチドは、同じ被覆お よびテスト条件のもとで、粒子上へ被覆した未修飾ペプチドに比較して、存意に より良好な感度を示す。このより良好な感度は、患者サンプル中のより低い濃度 のＨＩＶ−２抗体の検出を可能とするであろう。

本発明は主として特定のそして好ましい具体例に間して記載されたが、本発明の 範囲から逸脱することなく修飾することが可能であることが理解されるであろう 。以下の請求の範囲は、本発明の原理に一般的に従い、そして本開示から離脱を 含む、本発明のすべての変更、使用または適応化を、本発明が関係する分野にお ける既知のまたは慣用の実際に入るものとして、またはこの分野の当業者に自明 なものとして、カバーすることを意図する。

−父坦１− （１）一般情報 （１）出願人：５ｈａｈ、Ｄｉｎｅｓｈ　０３ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ａｎｄｒｅｗ （１１、発明の名称：　ＨＩ　Ｖ−２ウイルスの一部分に対応する合成ペプチド および改良されたイムノアンセイにおけるその使用方法 （山）酸列の数二６ （１ｖ）連絡住所： （Ａ）名宛人：Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ。

（Ｂ）ストリート：Ｏｎｅ　Ｂａｘｔｅｒ　Ｐａｒｋｗａｙ。

Ｆ２−２Ｅ （Ｃ）市：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ （Ｄ）州：ｌｌｌ１ｎｏｉｓ （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰコード：６００１５ （ｖ）コンピュータ読取り形式： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＴＢＭ　ｐｃ　コ ンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（ Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃１．　２５ （ｖｉ）現行出願データ： （Ａ）出願番号二ＵＳ （Ｂ）出願日： （Ｃ）分Ｗ４： （ｖｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：Ｂａｒｔａ、Ｋｅｎｔ （Ｂ）登録番号：２９，０４２ （Ｃ）参照／ドケソト番号：９１１８３Ａ（ｖｉ）テレコミュニケーション情報 （Ａ）電話７７０Ｂ／９４８−３３０８（２）配列同定胤１についての情報： （ｉ）配列の＊＠。

（Ａ）長さ二アミノ酸２４個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記述：配列同定階１ （２）配列同定Ｎ［Ｌ２についての情報：（１）配列の特＠： （Ａ）長さ二アミノ酸２５個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （１１）分子タイプ：ペプチド （×１）配列の記述：配列同定Ｎｏ、２（２）配列同定Ｎα３についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ二アミノ酸２６個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記述：配列同定Ｎα３ Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　 Ａｓｎ（２）配列同定阻４についての情報： （１）配列の特＠： （Ａ）長さ二アミノ酸２７個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二未知 Ｃｉｉ　）分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記述：配列同定距４ （２）配列同定Ｎｔ１５についての情報：（１）配列の特＠： （Ａ）長さ二アミノ酸２５個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記述：配列同定阻５ （２）配列同定阻６についての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ二アミノ酸２６個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二未知 （１１）分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）配列の記述：配列同定に６

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．式（配列同定Ｎｏ．１）の抗原性ペプチドにおいて、ａ）前記ペプチドのど ちらかの末端へ実質的に隣接してリジンを追加し、 ｂ）もしリジンが前記抗原性ペプチドのＮ末端へ追加されるならば、前記追加し たリジンとアスパラギン酸の間にグリシンを追加する ことよりなる改良。
2. ２．ａ）サンプルと請求項１のペプチドとを、前記ペプチドとＨＩＶ−２に対す る抗体との間で、もしそのような抗体がサンプル中に存在すれば、免疫学的複合 体が形成されるような条件のもとで接触させ、そして ｂ）前記サンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体の存在を決定するため、前記免疫 学的複合体の形成を測定することよりなるサンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体 の検出方法。
3. ３．式（配列同定Ｎｏ．２）の抗原性ペプチドにおいて、ａ）前記抗原性ペプチ ドのどちらかの末端へ実質的に隣接してリジンを追加し、 ｂ）もしリジンが前記抗原性ペプチドのＮ末端へ追加されるならば、前記追加し たリジンとアスパラギン酸の間にグリシンを追加する ことよりなる改良。
4. ４．ａ）サンプルと請求項３のペプチドとを、前記ペプチドとＨＩＶ−２に対す る抗体との間で、もしそのような抗体がサンプル中に存在すれば、免疫学的複合 体が形成されるような条件のもとで接触させ、そして ｂ）前記サンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体の存在を決定するため、前記免疫 学的複合体の形成を測定することよりなるサンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体 の検出方法。
5. ５．以下のＮ末端からＣ末端までのアミノ酸配列：ａ．配列同定Ｎｏ．３ ｂ．配列同定Ｎｏ．４ ｃ．配列同定Ｎｏ．５ ｄ．配列同定Ｎｏ．６ によって表されるペプチド群から遊ばれた１種のペプチドよりなる、ＨＩＶ−２ に対する抗体へ結合することができる合成ペプチド化合物。
6. ６．ａ）サンプルと請求項５のペプチドとを、前記ペプチドとＨＩＶ−２に対す る抗体との間で、もしそのような抗体がサンプル中に存在すれば免疫学的複合体 が形成されるような条件のもとで接触させ、そして ｂ）前記サンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体の存在を決定するため、前記免疫 学的複合体の形成を測定することよりなるサンプル中のＨＩＶ−２に対する抗体 の検出方法。