JPH03190898A

JPH03190898A - 合成ポリペプチド及びそれを用いたｈｃｖ抗体測定試薬

Info

Publication number: JPH03190898A
Application number: JP1329746A
Authority: JP
Inventors: Nakanobu Hayashi; 仲信林; Masakatsu Hashimoto; 正勝橋本
Original assignee: SHIMA KENKYUSHO KK
Current assignee: SHIMA KENKYUSHO KK
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1991-08-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎の起因ウィルスとして知られ
ているＣ型肝炎ウィルス（以下ＨＣＶとする）と共通の
抗原決定基を有する合成ポリペプチド及びそれを用い７
’、　ＨＣＶ抗体測定試薬に関するものである。

〔従来の技術〕

我国においては、肝炎は患者数も多く、しかも死亡率の
高い肝硬変や肝細胞筋に進展し易いため、２１世紀の国
民病ともいわれている。

近年、肝炎の発症原因も徐々に解明されつつあり、その
中でウィルスによるものか”多くの割合を占めている。

起因ウィルスとしてはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ａ
型肝炎ウィルス（ＨＡ−Ｖ）、サイトメガロウィルス、
エプスタイン−バーウィルス等が知られており、抗原抗
体反応に基づく血清学的検査法により、これらのウィル
ス粒子及びこれらのウィルスに由来する蛋白抗原或はこ
れらに対する抗体の検出・測定系が多数開発され、実用
化されている６一方、ウィルス性肝炎の感染経路としては輸血によるも
のが最も多く、他に静注薬物濫用、医療機関内感染、血
液透析、家族内感染垂直感染等が知られている。

一＝４− そのため我国では、供血者の血液を免疫血清学的に金側
検査し、ＨＡＶ、ＨＢＶ又はこれらの抗体のいずれかを
含む血液を輸血用から除外している。又、Ｂ型肝炎ワク
チンも開発され、使用されるに至っている。

従って、輸血後にＡ型又はＢ型肝炎を発症する例は著し
く低下してきている。

しかしながら、輸血後に肝炎を発症する例は少なからず
あり、これらの肝炎はＡ型、Ｂ型肝炎のいずれでもない
ことから、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれてい
た。

最近になって、非Ａ非Ｂ型肝炎の起因ウィルスが分離さ
れ、ＨＢＶ、ＨＡＶ、サイトメガロウィルス、エプスタ
イン−バーウィルスのいずれとも異なることが確認され
て、Ｃ型肝炎ウィルス（トｒｃＶ）と命名された。

Ｃ型肝炎は、多数例に輸血の前歴があることが指摘され
ており、輸血後６ケ月以上経過してから発症する等、発
症までに比較的長期間かかることから、慢性化する例が
多く、肝硬変や肝細胞筋への進展率も低くない。

ＨＣＶ感染者の流血中ＨＣＶ抗原量はＨＢＶに比し極め
て少ないなめ、血中のＨＣＶの検出は容易でなく、メＨ
ＣＶによる感染により宿主が免疫反応を起こす程度も弱
いため、血中の抗体価もＨＢ　Ｖ抗体に比し低い。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来は）ＩＣＶ抗体の検出に用いるＨ　ＣＶ由来の抗原
を、遺伝子及び細胞工学的に産生じ、培養液から分離・
精製していたため、精製品を得るのに特殊な設備と熟練
した技術者を必要とし、長い期間と多大な労力か費やさ
れていた。

従って、ＨＣＶ由来の精製抗原はコスト的に高く、これ
を用いて製造されるＨ　ＣＶ抗体測定用試薬も高価とな
り、しかも大量生産も難しい。そのため、かかる）ＩＣ
Ｖ抗体測定用試薬は一般に広く普及する迄には至ってい
ない。

本発明は、ＨＣＶ由来のｖｃＪＸと共通する抗原決定基
を有するポリペプチドをペプチド合成により得られるよ
うにして安価に大量生産可能とし、しかも優れたＨＣＶ
抗原特異性を付与することにより高感度なＨＣＶ抗体測
定系を確立することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本願の合成ポリペプチドの発明は、Ｃ型肝炎ウィルスと
共通の抗原決定基を有する合成ポリペプチドに関するも
のであり、−例としては式ＩＨ−１１ｅ−１１ｅ−Ｐｒｏ−八ｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＴｙｒＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＣｙｓＳｅｒ
−Ｇｌｎ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ
−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｉｎＧｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｎ−Ｐｈｅ−ＬｙｓＧｉｎ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ−＝　
　Ｉに示すアミノ酸配列を有するものがある。

上記アミノ酸配列のポリペプチドを合成する方法として
は、−船釣なペプチド合成法が適用でき、活性化エステ
ル法、混合酸無水物法、アジド法等のＣ端活性化法、カ
ルボジイミド等のカップリンク剤を用いるカップリンク
法、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）法、酸化還元法、
酵素法或は固層合成法等がある。

本発明のＨＣＶ抗体測定試薬は、固層にＣ型肝炎ウィル
スと共通の抗原決定基を有する合成ポリペプチドを固定
した固層試薬と、凛識抗ヒトグロブリン抗体又は標識し
た前記合成ポリペプチドのいずれかとからなる。

固層としては合成樹脂性のマイクロタイタ用の各種プレ
ー１−、ビーズ、シート、多孔膜、磁性ラテックス等が
ある。

固層への固定化法としては、物理的吸着法或はグルタル
アルデヒド、水溶性カルボジイミド等を用いる化学的結
合法かある。又、固定化する場合、ヘキサメチレンジア
ミン等のスペーサを介して結合してもよく、前記合成ポ
リペプチドを牛血清アルブミン等の蛋白質に結合したも
のを前記固層に固定してもよい標識抗ヒトグロブリン抗
体として用いる抗ヒトグロブリン抗体の動物種はヤギ、
ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスタ
ー、イヌ等が使用可能であり、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩ
ｇＧ＜γ鎖）、抗ヒトＩＢＭ、抗ヒトＩｇＭ（μ鎖）の
いずれでもよい。又、ヒ１〜ＩｇＧ及びヒｌ−１ｇＭの
いずれとも反応できるように調製した標識抗ヒトグロブ
リン抗体でもよい。又ポリクロナール抗体ばかりでなく
モノクロナル抗体も使用できる。

標識抗ヒトグロブリン抗体又は標識合成ポリペプチドの
標識剤としては、１２５１．１３１１．３Ｈ５”Ｃ等の
放射性同位元素、ベルオキシターセ、アルカリフォスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトジターゼ等の酵素、ビオチ
ン、又はフルオレッセインインチオシアネート、テトラ
メチルローダミンインチオシアネート、３−カルボエ１
〜キシ−７−ヒトロキシクマリン等の螢光色素、更には
Ｅｕキレ−１−等の標識剤か使用できる。これらの標識
剤は公知の方法により前記抗ヒトグロブリン抗体又は合
成ポリペプチドに標識することがてきる。

更に、本発明の別のＨＣＶ抗体測定試薬は、Ｃ型肝炎ウ
ィルスと共通の抗原決定基を有する合成ポリペプチドを
不溶性粒子状担体に感作したものである。

不溶性粒子状担体としてはラテックス粒子又はシリカ、
カオリン、金属等の無機質を核としてその外表面に合成
樹脂層を有する沈降速度の大きな高比重ラテックス粒子
、或はニワトリ、ヒツジ等の赤血球をホルマリン等で固
定化した固定化赤血球、種々の細菌々体を固定化した固
定化細菌、更にはゼラチン粒子等の免疫学的に不活性な
粒子状の担体を使用することができる。

感作方法としては、前述と同様に物理的吸着法、或はグ
ルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、タンニン酸
等を用いる化学的結合法がある。又、感作する場合、ヘ
キサメチレンジアミン等の２官能性スペーサを介して結
合してもよく、前記合成ポリペプチドを牛血清アルブミ
ン等の蛋白質に結合したものを前記固層に固定してもよ
い。

前記合成ポリペプチドを感作した不溶性粒子状担体を用
いて、ＨＣＶ抗体を検出　測定する手段としては、ラテ
ックス粒子を担体として用い、被験検体中のＨＣＶ抗体
との抗原抗体反応により生ずるラテックス粒子の凝集に
比例しな濁度、吸光度又は散乱光強度の変化を光学的に
測定する方法、或はこの抗原抗体反応に基づくラテック
スの凝集反応によって形成される凝集塊をスライド板上
において目視で判定する方法、更には高比重ラテックス
粒子又は固定化赤血球に感作された前記合成ポリペプチ
ドと被験検体中のＨＣＶ抗体との抗原抗体反応に基づく
凝集反応を、沈降後の管底像により判定する方法がある
。

〔実施例〕

以下、本発明を製造例及び実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

製造例１０イシンのα−アミン基を常法により第三ブチルレオキ
シ力ルホニル（Ｂｏｃ）基によりブロックする。

すなわち、ロイシン（１０ｍ　ｍｏｌ　）をジオキザン
ー水（２：　１　）　３０ｍＱに溶かし、水冷下かき混
ぜながら、Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ（ＩＤｍＱ　）と（Ｂｏｃ
）　２０　（２，４ｇ　０．０１１ｍｏｌ　）とを加え
る。室温で３０分かき混ぜたのち減圧濃縮し、５％ＫＨ
８Ｏ，ｔでｐＨ２，：ｌにして、酢酸エチルで３回抽出
する。

全酢酸エチル層を水洗、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥、減圧濃縮
し、残渣を結晶化させる。

Ｂ　ｏ　ｃ−ロイシン（３当量）、オキシメチル樹脂（
１当量）及びカルボジイミド（ＣＤＩ）にＤＭＦ　（樹
脂１ｇ当り約１０ｍＱ）　　を加え室温で一夜かき混ぜ
る。ガラスフィルタに移し、ＤＭＦ、ＥｔＯＨ及びＣＨ
，ＣＩ□で洗った後室温で減圧乾燥する。次いで、樹脂
をＤＭＦに懸濁し、未反応水酸基に対し約１０当量のＡ
ｃ２０及びＮＥｔ３を加え２時間＠盪して未反応水酸基
のアセチル化を行い、ＤＭＦ、Ｅ１− １２− ｔＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して乾燥する。加水分解
法によりオキシメチル樹脂に導入されたアミノ酸の定量
を行う。

グリシンのアミノ基を９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル（Ｆｍｏｃ　）基でブロックする。

反応容器にＢＯＣ−Ｌｅｕ−樹脂を入れ、これにＣＨ２
Ｃｌ２を加え５回振盪（各１分）して樹脂を洗うと共に
膨潤させる。次いで６０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２を加え
２０分振盪して脱Ｂｏｃを行う。

ＣＨ２Ｃｌ２で５回（各１分）洗った後５％ＤＩＥＡ／
Ｃ１１２Ｃ１□て３回（各２分）振盪して中和反応を行
い、ＣＨ２Ｃｌ２で５回（各１分）洗う。

カイザーテスト陽性を確認する。

洗浄した脱Ｂｏｃ　−Ｌｅｕ−樹脂のアミン成分に対し
３当量のＦｎｏｃ−グリシンのＣ）Ｉ２Ｃ］。溶液を加
えて１０分振盪し、Ｆｍｏｃ−グリシンを樹脂内に充分
分散させる。

容器から溶液を除去せずに、混合物の中に更にＤＣＣの
ＣＨ２Ｃｌ２溶液を加え９０分カップリングを行う。反
応後ＣＨ２Ｃｌ２　（３回、各２分）及びｉ−プロパツ
ール（２回、１分）で洗う。

Ｇｌｙの導入はカイサーチスト陰性で確認し、２０％ピ
ペリジン、／　Ｄ　Ｍ　Ｆで１０分間反応させて脱Ｆｍ
ｏｃする。脱Ｆｍｏｃの確認はカイザーテスト陽性か若
しくは遊離Ｆｍｏｃの吸光度測定により行う。

以下、Ｆｍｏｃ化しなＬｅｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、　Ｇｉ
ｎ等を順次同様にアミノ酸合成機を用いて反応させる。

側鎖のアミン基、カルボキシル基、水酸基等は適宜の保
護基により保護しておく。

最後のＦｍｏｃ−１１ｅのカップリングか終了したら乾
燥ポリペプチド樹脂を反応容器に入れ、アニソールを加
えて浸透させな後ＨＦを加え０℃で１時間反応させ、次
いでＯ′ＣでＨＦを除去する。

残渣に］％ＡｃＯＨを加えてペプチドを抽出し、溶液を
エーテルて洗った後凍結乾燥する。

この凍結乾燥物を水で溶出し、再び凍結乾燥して前記式
■の合成ポリペプチドを得る。

製造例２ＣＨ２Ｃ１２１０ｒｎＱ中にオギシメチル樹脂０　、４
ｍｅｑを加え、次いでＦｍｏｃ　−Ｌｅｕ−ＯＨＩ　、
　２ｍ　ｍｏ　ｌを加え完全に溶解し、トＴＯＢｔ（水
和物）　１．２ｍ　ｍｏｌも同様に完全に溶解する。更
にＮ、Ｎ″−ジイソプロピルカルボジイミド１．２ｍ　
ｍｏｌを加え氷中約１時間攪拌しつつ反応さぜＦｍｏｃ
−Ｌｅｕ崩脂を得る。

このＦｍｏｃ　−Ｌｅｕ−樹脂をアミノ酸合成機に入れ
、２０％ピペリジン／ＤＭＦを１０分間反応させＦｍｏ
ｃ基を切断する。カイザーテスト陽性でＦｍｏｃか完全
に切れたことを確認した後、ＤＭＦで洗浄し、中和する
。

Ｄ　Ｍ　Ｆ　ｌこＦｒｎｏｃ−Ｇｌｙを溶解し、中和し
た樹脂中に加え、３０分反応させる。カイザーテスト陽
性て導入を確認する。

以下、順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸を導入し、最後のＦｍｏ
ｃ−Ｉ　］　ｅのカップリングが終了したら合成ペプチ
ドを樹脂から切り離し、抽出して凍結乾煤し、式Ｉの合
成ポリペプチドを得る。

実施例１製造例１て合成したポリペプチドの溶液（５０μｓ／ｍ
Ｑ＞をマイクロタイター用反応プレトのウェルに各々１
００μＱ注入し、４°Ｃで一夜静置しな後０，０５％（
’／／Ｖ）ツイーン２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓ（食塩加リン酸
緩衝液ｐＨ６，４＞にて洗浄する。

各ウェルに２％（Ｗ／Ｖ）　ＢＳＡ−ＰＢＳ　（ｐＨ６
，４）を各々加え４°Ｃで保存する。

前記プレートを０．０５％ツイーン２Ｏ−ＰＢＳ（ｐＨ
６，４＞で１回洗浄し、被験血清を１００倍希釈した検
体を各ウェルに５０ｕＱ注入し、室温で１時間静置し、
被験血清中の抗ＨＣＶ抗体を固定化された合成ポリペプ
チドと反応させる。

０．０５％ツイーン２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ６，４
）で２回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒ
ト■８Ｇ抗体又は西洋ワサビベルオキシダゼ標識抗ヒト
Ｉｇｌ／ｌ抗体を各ウフユルに５０μＱ加え、室温で１
時間静置して前記固定化合成ポリペプチドに結合したＨ
ＣＶ抗体と反応させる。

１５− １６０．０５％ツイーン２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ６，４
）て３回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン
、Ｈ２Ｏ２）を各ウェルに４０μＱ加え、室温で１０分
間静置後、ＩＮ硫酸溶液を２００μＱ加え反応を停止し
た＠４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。

ＨＣＶ抗体抗体除血清検体の吸光度は０．０１〜０．０
５と著しく低く、通常見られるプレートへのＩｇＧ、　
ＩｇＭ又は標識抗体の非特異的吸着に基づくバックグラ
ウンドの吸光度の上昇は生じなかっな。

ＨＣＶ抗体陽性の血清検体の吸光度はその抗体価に応じ
て鋭敏に変化し、バックグラウンドの吸光度が低いこと
からカッ１〜オフレヘルが明瞭であり、ＨＣＶ抗体弱陽
性例の検出が可能である。

ＨＣＶ抗体抗体性陽性例光度も高く、測定レンジが広い
。

実施例２実施例］と同様の操作において、合成ポリペプチド固定
化プレートに５０倍希釈した検体を注入して反応後、２
回洗浄し、西洋ワサビペルオキターゼ標識合成ポリペプ
チドを各ウェルに５０μＱ加え、室温で１時間静置して
、固定化合成ポリペプチドに結合した被験血清中のＨＣ
Ｖ抗体に、標識合成ポリペプチドを反応させる。

同様に洗浄した後、基質溶液を４０μＱ加え発色後反応
を停止し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。

本実施例の場合も、ＨＣＶ抗体陰性例の吸光度は著しく
低く、ＨＣＶ抗体陽性例の吸光度は高かった。

（ンＸ　−Ｆ　′、ゴ冑実施例３ＢＳＡに過剰の水溶性カルボジイミドを反応させ、透析
により未反応のカルボジイミドを除去した後、製造ＦＡ
３−で合成したポリペプチドを加えて４°Ｃで一夜反応
させ、モノエタノールアミンにより活性部位をブロック
する。

透析により未反応のモノエタノールアミンを除去する。

この合成ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を、ナイロン製多
孔質メンプランの表面にカルボキシル基及び共有結合性
リガンドを導入したイムノダインアフィニティーメンプ
ラン（日本ボール社、孔径１．２１Ｉｍ）の上に乾燥状
態で２μ重滴下し、５分間風乾する。合成ポリペプチド
−ＢＳＡ複合体のメンプランへの共有結合反応は約１分
で終了する。

メンプランをＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐｉ−１７，０）に浸漬し
振盪しながら、数回取り替えることにより未結合の合成
ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を洗い流す。

０．３％カゼイン−Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐｔ（７，０）加熱
溶解液又は０２〜１．０Ｍグリシンに前記メンプランを
３０分間浸漬し、メンプランの共有結合活性部位をフロ
ックする。その後室温て３０分以上風乾する。

合成ポリペプチド−ＢＳＡ複合体結合メンプランの複合
体結合部位に、被験血清を希釈調製した検体を１０１Ｑ
滴下し５５分間放置後０．１％（Ｖ／’Ｖ＞１〜リドン
Ｘ−１００を含む］７伺５ＭＰＢ（ｐＨ７，０）に浸漬
して洗浄する６再度洗浄操作を繰り返した後、！／１５
Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ７，０＞で１分間メンプランをリン
スする。

西洋ワサビペルオキシダーゼ標識合成ポリペプチド溶液
を１０μＱ滴下し、５分間放置後０．１％（ハｌ）トリ
トンＸ　−１００を含むＰ　Ｂ　（ｐＨ７，０）に浸漬
して洗浄する。再度洗浄操作を繰り返した後蒸留水で１
分間メンプランをリンスする。

０．０５％（Ｗ／′Ｖ）［）−クロロナフトール及びＨ
２０□を含む基質溶液を５０μ９滴下し、１０分間反応
＝１９＝０接水でリンスして反応を停止し、メンプランを風乾させ
、発色した色の強さを目視により観察し、或はリフレフ
Ｉ・メータで測定する。

ＨＣＶ抗体陰性例の発色は殆ど認められず、ＨＣＶ抗体
弱陽性例では明らかな発色が認められ、肉眼的にも容易
に識別できた。ＨＣＶ抗体強陽性例では発色も強く、被
験血清中の抗体価に比例しな発色が得られた。

実施例４カルボキシル基を有する粒子径０．２６μｍのラテック
スの１％（Ｗ／Ｖ）水浮遊液１容と０．１Ｍ１−エチル
−３（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミ
ド・ＨＣＩ水溶液１容とを混合し、室温で２時間若しく
は４°Ｃで一夜静置する。遠心分離後ペレットをｐＨ５
の水で洗い、再び遠心分離する。

ペレットをＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ６，４）　１容に浮遊し
、これに製造例２で合成したポリペプチドを１ｍｇ／ｍ
Ｑの濃度になるよう１／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ７，０
）に溶解した溶液を１容加え、４°Ｃで一夜静置する。

遠心分離して、０．０５％ツイーン２０−１／１５ＭＰ
　Ｂ　（ｐＨ７，０）で２回洗浄し、孜いで０．２％Ｂ
ＳＡ−４／１５ＭＰＢ　（ｐＨ７，０）で２回洗浄し、
１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−１／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ７，０
）に０．４％のラテックス濃度となるよう浮遊する。

被験血清を希釈調製した検体１０μａと、３５０μＱの
１／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ７，０）と混合し、次いで
合成ペプチド結合ラテックス浮遊液を５０μΩ添加し、
波長６００ｎｍ　（４５０〜８００ｎｍ　）の吸光度を
３分間（１〜５分間）測定し、吸光度の増加量を演算す
る。

ＨＣＶ抗体陰性例は吸光度変化が殆ど認められず、ＨＣ
Ｖ抗体弱陽性例は吸光度の有意な増加が認められ、ＨＣ
Ｖ抗体強陽性例では０．１００以上の吸光度の増加が得
られた。

実施例５製造例１で合成したポリペプチド０．５〜数十μｇに対
して、ｉ　ｍｇの割合で高比重ラテックス浮遊液を加え
、攪拌下に室温で２時間インキュヘートする。

遠心分離によりＯ６１％ＢＳＡ〜ｉ／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ（
ｐｔ（７，０）で４回洗浄し、０．２５％濃度のラテッ
クス浮遊液となるように１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−１，／’１
５ＭＰ　Ｂ　（［））（７，０）に浮遊する。

被験血清を希釈調製した検体２５μΩと前記合成ポリペ
プヂド感作高比重ラテックス浮遊液２５μｔを■スはＵ
底の反応用プレーＩ・のウェルに加え、室温で１時間静
置し、沈降後の管底像を目視により観察して判定する。

希釈検体中にＨＣＶ抗体が存在しない場合は、合成ポリ
ペプチド感作高比重ラテックスと抗原抗体反応による凝
集反応が起こらず、合成ポリペプチド感作高比重ラテッ
クスは管底に点状乃至小リング状に沈降するので、これ
をＨＣＶ抗体陰性と判定する。

ス、希釈検体中にＨＣＶ′ｖＬ体が存在する場合は、Ｈ
ＣＶ抗体と高比重ラテックス表面に感作された合成ポリ
ペプチドとの抗原抗体反応が生じ、高比重ラテックスが
凝集し、中リング乃至大リング状若しくはリングの生じ
ないスムーズマット状に管底に沈降するので、これをＨ
ＣＶ抗体陽性と判定する。

ＨＣＶ′ｖｃ体陰性例はいずれも点状又は小リング状の
管底像が得られた。ＨＣＶ抗体弱陽性例では中リング状
乃至大リング状の管底像が得られ、ＨＣＶ抗体強陽性例
ではリングの生じないスムーズマット状の完全に１１集
しな管底像が得られた。

実施例６ホルマリン固定した３％ヒツジ赤血球浮遊液１容に対し
て、０．０２５μｇ／ｄＱのタンニン酸溶液１容を混合
し、５６°Ｃで３０分間インキュベートする。１．／１
５Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ７，０＞にて２回遠心洗浄後、１
／１５Ｍ　Ｐ　Ｈ（ｐＨ７，０）に３％濃度となるよう
に浮遊する。

実施例３におけると同様に調製した合成ポリペプチド−
ＢＳＡ複合体溶液１容と前記タンニン酸処理赤血球１容
とを混合し、５６°Ｃで２時間インキュベートする。１
／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ　＜　ｐＨ３− ２４７，０）テ２回遠心洗浄後、０．２５％（Ｖ／Ｖ）濃度
になるよう０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−１／１５Ｍ　Ｐ　Ｂ
　（ｐＨ７，０溶液に浮遊する。

被験血清を希釈調製した検体２５μｐと合成ポリペプチ
ド感作赤血球２５μＱを反応用プレートのウェル（■又
はＵ底）に加え、室温で３０分間靜装し、沈降後の管底
像を目視により観察して判定する。

本実施例の場合ら前記実施例５と同様に判定し、ＨＣＶ
抗体陰性例はいずれも点状又は小リング状の沈降像が得
られ、ＨＣＶ抗体陰性と判定した。又、ＨＣＶ抗体弱陽
性例では中リング乃至大リング状の沈降像が得られ、Ｈ
ＣＶ抗体陽性と判定した。ＨＣＶ抗体強陽性例ではリン
グの生じないスムースマット状の完全凝集した沈降像が
得られた。

〔発明の効果〕

以上述べたように、本発明の合成ポリペプチド及びそれ
を用いたＨＣＶ抗体測定試薬によれは、下記の如き種々
の優れた効果が得られる。

ＨＣＶと共通の抗原決定基を有するポリペプチドがペプ
チド合成により得られるので、従来ＨＣＶ由来の抗原を
遺伝子及び細胞工学的に産生じ、多大な設備と労力をか
けて精製していたのに対し、高純度なポリペプチドを大
量にしかも安価に製造することができる。

２　本発明の合成ポリペプチドはＨＣＶ感染者のＨＣＶ
抗体と良好な反応性を示し、ＨＣＶ由来の精製抗原と同
様の免疫学的反応性を有する。従来、合成ポリペプチド
の免疫学的反応性は抽出抗原に比し、−船釣に低いとさ
れている。

３　本発明の合成ポリペプチドは免疫学的測定法に用い
られる種々の固層に、物理的吸着又は化学的結合により
容易に固定化することができ、しかも固定化された後も
ＨＣＶ抗体と良好な反応性を示す６４　前記合成ポリペプチドを固定しな固層試薬と標識抗
ヒトグロブリン抗体又は標識した合２６成ポリペプチドのいずれかとからなるＨ　ＣＶ抗体測定
試薬は、合成ポリペプチドを固定化した固層へのＩｇＧ
、ＩｇＭ、製織抗体或は標識合成ポリペプチドの非特異
的な吸着が著しく低下し、バックグラウンドの標識活性
が大幅に減少する。しかも、被験検体中の抗体価に応じ
て鋭敏に標識活性か”増加するため、カットオフレベル
が明瞭であり、ＨＣＶ抗体弱陽性から強雨性まて高感度
に且つ広いレンジで測定できる。従来のＨＣＶ由来の抽
出精製抗原を用いた同様の測定系では、非特異的な吸着
が強く、バックグラウンドの標識活性が高いため、感度
及び特異性が低かった。

５　前記合成ポリペプチドを不溶性粒子状担体に感作し
てなるＨＣＶ抗体測定試薬は、合成ポリペプチドが各種
の不溶性粒子状担体に容易に感作、固定化されるので調
製が容易であり、目的及び用途に応じて適切な測定系を
利用することができて便利であり、しかも操作が簡単で
高感度である。

手続補正書平成２年１月１２日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）Ｃ型肝炎ウィルスと共通の抗原決定基を有する合
成ポリペプチド。
（２）式 I 【遺伝子配列があります】・・・ I のアミノ酸配列を有する請求項（１）記載の合成ポリペ
プチド。
（３）固層に請求項（１）の合成ポリペプチドを固定し
た固層試薬と、標識抗ヒトグロブリン抗体又は標識した
請求項（１）の合成ポリペプチドのいずれかとからなる
ＨＣＶ抗体測定試薬。
（４）固層がマイクロタイター用反応プレート、ビーズ
、シート、多孔膜、磁性ラテックスのいずれかである請
求項（３）記載のＨＣＶ抗体測定試薬。
（５）請求項（１）の合成ポリペプチドの固層への固定
が物理的吸着、化学的結合のいずれかである請求項（３
）記載のＨＣＶ抗体測定試薬。
（６）スペーサを介して請求項（１）の合成ポリペプチ
ドを固層に固定した固層試薬である請求項（３）記載の
ＨＶＣ抗体測定試薬。
（７）標識剤が放射性同位元素、酵素、ビオチン、螢光
色素、Ｅｕキレートのいずれかである請求項（３）記載
のＨＣＶ抗体測定試薬。
（８）抗ヒトグロブリン抗体が抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩ
ｇＭのいずれかである請求項（３）記載のＨＣＶ抗体測
定試薬。
（９）請求項（１）の合成ポリペプチドを、不溶性粒子
状担体に感作してなるＨＣＶ抗体測定試薬。
（１０）不溶性粒子状担体がラテックス粒子、高比重ラ
テックス粒子、固定化赤血球、ゼラチン粒子、固定化細
菌のいずれかである請求項（９）記載のＨＣＶ抗体測定
試薬。
（１１）高比重ラテックス粒子が無機質を核としてその
外表面に合成樹脂層を有する請求項（１０）記載のＨＣ
Ｖ抗体測定試薬。
（１２）スペーサを介して合成ポリペプチドを不溶性粒
子状担体に結合してなる請求項（９）記載のＨＣＶ抗体
測定試薬。
（１３）ラテックス凝集比濁法、ラテックス凝集光散乱
法のいずれかにより定量測定する請求項（９）記載のＨ
ＣＶ抗体測定試薬。
（１４）凝集反応により沈降する管底像を判定する請求
項（９）記載のＨＣＶ抗体測定試薬。
（１５）ラテックス凝集反応により凝集像を目視で判定
する請求項（９）記載のＨＣＶ抗体測定試薬。