JPH06503968A

JPH06503968A - 遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター

Info

Publication number: JPH06503968A
Application number: JP4505166A
Authority: JP
Inventors: ギルド，ブレイドン　シー．; ラフィールド，ロリ　エフ．; コーエン，ローレンス　ケー．; ロビンズ，ポール; ミュリガン，リチャード　シー．
Original assignee: Somatix Therapy Corp; Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Somatix Therapy Corp; Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1991-10-31
Publication date: 1994-05-12
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: EP0568537B1; JPH07503121A; WO1992007943A1; DE69123981T3; AU659824B2; EP0556345A4; EP0556345A1; EP0556345B2; DE69123981T2; WO1992007573A1; EP0568537A4; DE69128893D1; DE69123981D1; CA2095153A1; AU1266692A; DK0556345T3; CA2095153C; DK0568537T3; EP0556345B1; ATE163046T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子治療のためのレトロウィルスのベクタ一本発明は、身体の遺伝子治療において使用することができる新規なレトロウィルスのベクターに関する。これらのレトロウィルスのベクターは問題の遺伝子のための挿入部位を含み、そして広範な種類のトランスフェクションされた細胞のタイプにおいて問題の遺伝子から誘導されたタンパク質をコントロールしたレベルで発現することができる。本発明の新規なレトロウィルスのベクターの１つのクラスは選択可能なマーカーを欠如し、こうしてマーカー遺伝子生成物、例えば、抗体を同時に生成しないで種々の疾患の状態の処置において、ヒトの身体の治療のために適当である。本発明のレトロウィルスのベクターはある種のパンケージング細胞系において使用するためにことに通する。

背景哺乳動物細胞を遺伝子操作する多数の方法が存在する９種々のポリペプチドを大量に生産する必要性および哺乳動物細胞の中の種々の遺伝学的欠陥を補正する必要性を含むい（つかの理由のために、哺乳動物細胞を遺伝子操作することに大きい関心がもたれている。

これらの方法は効率、外来遺伝子の発現のレベル、および全体の遺伝子操作法の効率のような因子に関して互いに劇的に異なった。

とくに有用であることが証明された哺乳動物細胞を遺伝子操作する１つの方法は、レトロウィルスのベクターによる。レトロウィルスのベクターおよびそれらの使用は多数の刊行物に記載されており、このような刊行物は次のものを包含する：　Ｍａｎ　ら、釦旦３３：１５３−１５９（１９８３）およびＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ’、　ＵＳＡ８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。レトロウィルスのベクターはレトロウィルスを遺伝子操作することによって生産される。

レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわち、ウィルスのゲノムはＲＮＡ　である。しかしながら、このゲノムのＲＮ＾はＤＮＡ　コピーに逆転写され、このコピーは形質導入された細胞の染色体はＤＮＡの中に安定にかつ効率よく組み込まれる。この安定に組み込まれたＤＮＡコピーはプロウィルスと呼ばれ、そして娘細胞により他の遺伝子として遺伝される。第１図に示すように、野生型のレトロウィルスのゲノムおよびプロウィルスのＩ）ＮＡは３つのＰｓｉ遺伝子：　ｇａｇ＋ｐｏｌおよびｅｎν遺伝子を有し：これらは２つの長い末端の反復（ＬＴＲ）的ＤＮ＾ポリメラーゼ（逆転写酵素）をエンコードする；そしてｅｎｖ遺伝子はウィルスのエンベロープ塘タンパク質をエンコードする。

５′および３′のＬＴＲはヴイリオンのＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。

ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウィルスのＲＮＡの効率よい包膜に必要な配列（Ｐｓｉ部位）が、５’ＬＴＲ隣接して存在するａ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，ｃ、Ｉ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ！ｉ嶋１ｙ１」１１凱」ニーＧｅｎｅ　ｈ１凹−特（卯、　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ　（編）　、　１５５−１７３（１９８３）；　Ｍａｎｎ、　Ｒ，ら、釦旦、　３３：１５３−１５９　（１９８３）；　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、およびＲ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃ　ｄｃ　ｄ±−司Ｉジ工汎り１」ニー針】ニー８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。

包膜（または感染性ヴイリオンへのレトロウィルスのＲＮＡのパンケージング）のために必要な配列がウィルスのゲノムから除去される場合、ゲノムのＲＮＡの包膜を防止するｃｉｓ作用性欠陥が生ずる。

しかしながら、生ずる突然変異体はなおすべてのヴイリオンタンパク質の合成を指令することができる。Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らは、これらのＰｓｉ配列が欠失されたレトロウィルスのゲノム、ならびに染色体の中に安定に組み込まれた突然変異体のゲノムを含有する細胞系を記載した。Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ−＋　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｕｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓ旦ｏｎ、　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ　（Ｗ）　、１５５−１７３　（１９８３）；　Ｍａｎｎ。

Ｒ１ら、皿、　３３：１５３−１５９　（１９８３）；　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、およびＲｌＣ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。入手可能なレトロウィルスのベクターについての追加の詳細およびそれらの使用は、次のものを含む特許および特許刊行物の中に見いだすことができる：欧州特許出願（ＥＰＡ　）第０１７８２２０号、米国特許第４．４０５．７１２号、Ｇ１１ｂｏａ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅＳ４：５０４−５１２　（１９８６）　（これはＮ２レトロウィルスのベクターを記載している）。これらの特許および刊行物の教示を引用によってここに加える。

レトロウィルスのベクターは哺乳動物細胞の修飾にとくに有用である。なぜなら、レトロウィルスのベクターがターゲット細胞を「怒染」しそしてターゲット細胞のゲノムの中に組み込む効率が高いからである。さらに、レトロウィルスのベクターは広範な種類の種および組織からの哺乳動物細胞を怒染することができるレトロウィルスに基づ（ことができるので、レトロウィルスのベクターは高度に有用である。

レトロウィルスのベクターは哺乳動物細胞のゲノムの中に挿入することができるので、ヒトおよび動物における遺伝病の遺伝子治療において使用するためのとくに有望な候補である。典型的には、遺伝子治療は（１）新しい遺伝学的材料を患者の細胞にｉｎ　ｖｉｖｏ添加するか、あるいは（２）体から患者の細胞を取り出し、新しい遺伝学的材料を細胞に添加し、そしてこれらの細胞を体の中に再導入する、すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子治療を包含する。レトロウィルスのベクターを使用して種々の細胞において遺伝子治療を実施する方法は、例えば、次に記載されている：米国特許第４，８６８，１１６号、１９８９年９月１９日発行、および米国特許第４，９８０，２８６号、１９９０年１２月２５日発行（上皮細胞）　、ｗｏ８９１０７１３６号、１９８９年８月１０日公開（肝細胞）、欧州特許（ＥＰ）第３７８，５７６号、１９９０年７月２５日公開（線維芽細胞）、および−０８９１０５３４５号、１９８９年６月１５日公開および罰／９０１０６９９７号、１９９０年６月２８日公開（内皮細胞）、それら開示をここに引用によって加える。

種々の遺伝子治療技術について有用であるためには、適当なレトロウィルスのベクターはこれまで入手可能でなかった特別の特性を必要とする。遺伝子治療において患者の細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子操作に使用するベクターのこれらの特別の要件の主要な要求の源は、「患者」の細胞のゲノムの中にベクターを組み込むための選択を必要とするレトロウィルスのベクターを通常使用することができないためである。例えば、典型的なレトロウィルスのベクター、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３１０：４７６−４８０　（１９８４）に記載されているＭＳＶＤＨＦＲ−ＮＥＯは、遺伝学的に修飾された細胞を検出するためのマーカーとしてネオマイシン耐性を使用する。こうして、このようなネオマイシン耐性のレトロウィルスのベクターを使用すると、患者を高いレベルのネオマイシンに暴露して、ｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝子治療を通して細胞の遺伝学的修復を実施することが要求されるであろ・）。そのうえ・ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏの両者の遺伝子治療において、ヒトの遺伝子の身体の治療を行うマーカー遺伝子の遺伝子生産物を細胞の中に生成することが望ましくないことがある。

例えば、サラセミアを治癒するためにヘモグロビン遺伝子の置換を行うネオマイシンホスホトランスフェラーゼを血球の中に高いレベルで生成する治療学的理由は存在しない。したがって、ゲノムの中に効率よく組み込み、問題の遺伝子生産物を所望のレベルで発現しそして、マーカー生成物、例えば、抗体を同時に生成または発現しないで、高い力価で生成されるレトロウィルスを開発することは望ましいであろう。

発明の要約本発明は、身体の遺伝子治療において使用することができる新規なレトロウィルスのベクターに関する。これらのレトロウィルスのベクターは問題の遺伝子のための挿入部位を含み、そして広範な種類のトランスフェクシヨンされた細胞のタイプにおいて問題の遺伝子から誘導されたタンパク質を所望のレベルで発現することができる。

本発明の１つの面において、操作可能な組み合わせにおいて、問題のレトロウィルスから誘導された５　’　ＬＴＲおよび３　’　ＬＴＲ、および問題の遺伝子のための挿入部位からなり、そしてレトロウィルスのベクターの中のｇａｇ＋　ｅｎＶまたはｐｏｌ遺伝子の少なくとも１つが不完全であるか、あるいは欠陥のある、レトロウィルスのベクターが提供される。ベクターは、好ましくは、スプライスドナ一部位およびスプライスアクセプタ一部位を含有し、そしてスプライスアクセプタ一部位は問題の遺伝子が挿入されている部位から上流に位置する。

また、ベクターは、望ましくは、ｇａｇの転写プロモーターを含み、ｇａｇの転写プロモーターは挿入部位の中に挿入されたヌクレオチド配列の転写体が生成されるように機能的に位置し、そして転写体はｇａｇの５′未翻訳領域からなる。

本発明の好ましいベクターは選択可能なマーカーを欠如し、こうして、マーカー遺伝子生産物、例えば、抗生物質の薬物のマーカーは同時に生成または同時に発現されないので、前記ベクターはヒトの身体の遺伝子治療においていっそう望ましいものとなる。

本発明のベクターの中に組み込まれる問題の遺伝子は、問題のホルモン、酵素、レセプターおよび薬物を生成する任意の遺伝子であることができる。

レトロウィルスのベクターは、最も適当には、ここに定義するような、ある種のパッケージング細胞と組み合わせて使用され、これらのパッケージング細胞はヒトおよび動物の身体の遺伝子治療のために広範な種類の細胞のタイプにおいて使用することができる。

本発明のとくに好ましいレトロウィルスのベクターは、第２Ｃ図および第３図に描写されているような、ここにおいてｒＭＦＧ　Ｊと同定され、そしてそれを含有するプラスミド、ことにＡＴＣＣ６８，７５４の同定特性を有するプラスミドＭＦＧである。

本発明は、また、前述のものに類似するが、ＬＴＲ以外のエンハンサ−およびアルファーグロビンの転写プロモーター配列をさらに含んで種々の問題の遺伝子の発現をコントロールするレトロウィルスのベクターに関する。本発明のこの面は、サイトメガロウィルスからのエンハンサ−の使用を特別に提供する。また、エンハンサ−配列が３　’　ＬＴＩ？から欠失され、こうしてゲノムの中にベクターを組み込むとき５’ＬＴＲを不活性化するベクターが提供される。詳しくは、ベクターα−８ＧＣを含有するα−グロビンのプロモーター、およびことに第４図に描写されているもの、およびことにＡＴＣＣＮｏ、６８，７５５の同定特性を有するプラスミドα−８ＧＣが提供される。

本発明は、また、遺伝子の発現のための部位の中に挿入された発現のための遺伝子を有するレトロウィルスのベクターを包含する。

特定の例は、これらの有用な生産物の発現のための部位の中に挿入されたヒトの因子■またはｔＰＡのための遺伝子を含有するＭＦＧおよびα−５ＣＣを包含する。

図面の説明第１図は、野生型ネズミ白血病ウィルス（レトロウィルス）のゲノムの概略的表示である。

第２図は、各々が組み換えゲノムを有する、本発明において有用なレトロウィルスのベクターの概略的表示である。第２ａ図はｐＬＪであり、そして第２ｂ図はｐＨ−であり、そして第２Ｃ図はＭＦＧであり、そして第２ｄ図はα−３ＧＣである。

第３図は、レトロウィルスのベクターＭＦＧの路線図である。

第４図は、レトロウィルスのベクターα−５ＧＣの路線図である。

第５図は、ｔＰＡを発現するように遺伝学的に増強した内皮細胞でライニングした合成移植片のイヌの中への移植後の効能を示すヒストグラムである。

第６図は、因子■のポリペプチドの線図である。第６ｂ図は因子■のｃＤＮＡの線図であり、レトロウィルスのベクターの発生に使用した種々構成体の中に使用した制限酵素の部位を示す。第６Ｃ図は、垂直の線として示す欠失された領域をもつレトロウィルスのベクターの中に挿入された因子■のｃＤＮＡの欠失誘導体の線図である。第６ｄ図は、旧ｎｄｌ［［部位とＰｓｔ１部位との間のＢドメインの拡大した線図である。重鎮および軽鎖の接合におけるヌクレオチド配列は線の上に表示されており、そして対応するアミノ酸番号は線の下に表示されている。

第７図は、アセンブリソゲした最終のレトロウィルスのベクター、１’１ＦＧ− 因子■の線図である。

第８図は、α−５ＧＣ−ＬａｃＺの組み換えレトロウィルスの線図である。

第９図（ａ）および第９図（ｂ）は、本発明のＭＦＧヘクターの構成の路線図を表す。

第１０図は、ｔＰＡ遺伝子の修飾、この修飾を促進するために使用したオリゴヌクレオチドおよびＭＦＧヘクターの中への修飾されたｔＰＡ遺伝子の挿入の概略的表示である。

特定の態様の説明本発明は、いくつかのレトロウィルスのベクターを提供する。提供されたレトロウィルスのベクターは、（１）問題のレトロウィルスから誘導された５′および３′のＬＴＲ，ＬＴＲのための好ましいレトロウィルス源はモロニーネズミ白血病ウィルスである、および（２）問題の遺伝子のための挿入部位を含有する。本発明のレトロウィルスのベクターは完全なｇａｇ＋　ｅｎＶまたはｐｏｌ遺伝子を含有しないので、レトロウィルスのベクターはターゲット細胞の中で独立に複製することができない。好ましいレトロウィルスのベクターはｇａｇ解読配列の一部分を含有し、好ましくは部分的ｇａｇ解読配列はスプライスドナ一部位およびスプライスアクセプタ一部位を含み、問題の遺伝子のだめの部位特異的にスプライスアクセプタ一部位が密接しかつそれから上流に位置するように、部分的ｇａｇ配列がレトロウィルスのベクターの中に位置するように、前記部位は位置する。本発明のベクターのとくに好ましいＭｌにおいて、ｇａｇプロモーターから開始された転写体が未翻訳の５　’　ｇａｇ配列およびベクターの中の挿入部位の中に挿入された核酸配列から生成された転写体を含有するように、ｇａｇ転写プロモーターは位置する。問題のベクターは、好ましくは、選択可能なマーカーを含をしない。このようなベクターの好ましい態様は’ＭＦＧ　、と表示されるベクターである。

本発明の他の面は、３　’　ＬＴＲの中の機能エンハンサ−要素を欠如し、これによりターゲット生物のゲノムの中に組み込んだとき５′ＬＴＲを不活性化するレトロウィルスのベクターを提供することである。

本発明の他の面は、本質的に前述した通りであるが、ベクターの挿入部位の中に挿入された遺伝子の発現をコントロールするためにｇａｇプロモーターを利用する代わりに、ヒトα−グロビンを使用する、レトロウィルスのベクターを提供することである。レトロウィルスのベクターａ−５ＧＣを特別に開示する。

本発明の他の面は、問題の遺伝子の発現を増加するためにアルファグロビン転写プロモーターを使用するレトロウィルスのベクターの中に位置しないエンハンサ −配列を用いることである。エンハンサ−配列がアルファーグロビンの転写プロモーターから上流に配置されたベクターはと（に重要である。本発明の他の面は、このようなＬＴＲを含有しないベクターの中のサイトメガロウィルスから誘導されたエンハンサ−配列を提供することである。

本発明の他の面は、レトロウィルスのベクターの中で挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝子を含有するレトロウィルスのベクター構成体を提供することである。本発明のレトロウィルスのベクターの中に挿入するための遺伝子は、任意の種々のホルモン、酵素、レセプターまたは他の薬物を含む。本発明は、ＭＦＧおよびα−５ＧＣの挿入、すなわち、クローニング部位の中に挿入された（独立に）　ｔＰＡおよび因子■から成る遺伝学的構成体を特別に提供することである。

この野生型レトロウィルスのゲノムは、ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、前掲、により、新しい遺伝子を細胞の中に挿入することができるベクターとして使用するために修飾された。第２図に示すように、ｇａｇ。

ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のすべては除去され、そしてｎｅｏ遺伝子を工ンコードするＤＮＡセグメントはそれらの場所に挿入された。ｎｅｏ遺伝子は優性の選択可能なマーカーとして働く。組み換えゲノムの一部分を残すレトロウィルスの配列は、ＬＴＲ，ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパッケージング部位を含む。Ｃｅｐｋｏ、　Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　３７：１０５３−１０６２（１９８４）。

発現のための外来遺伝子の挿入のための部位を含有する多数のレトロウィルスのベクターを教示することに加えて、本発明は、また、レトロウィルスのベクターが挿入部位の中に挿入された遺伝子、すなわち、発現のための外来遺伝子または遺伝子を含有する遺伝学的構成体を堤供する。本発明のベクターの中に含めるための外来遺伝子は、種々のタンパク質をエンコードすることができる。問題のタンパク質は、種々のホルモン、成長因子、酵素、リンホカイン、サイトカイン、レセプターなどを包含する。用語「外来遺伝子」は、外来遺伝子を含有するレトロウィルスのベクターを挿入することができる細胞に対して内因性の核酸配列を包含する。存在しないか、減少した量の中に生産されるか、あるいは遺伝病に悩まされる個体の中で突然変異の形態で生産されるポリペプチドをエンコードする遺伝子は、発現のための遺伝子として使用するためにとくに重要である。さらに、ターゲント細胞から分泌されるポリペプチドをエンコードする外来遺伝子を使用して、外来遺伝子によりエンコードされるタンパク質により全身的作用を得ることは重要である。問題の特定の外来遺伝子は次のものを包含する：ヘモグロビン、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキンｉｏ、インターロイキン１１、など、酬−Ｃ３Ｆ　、　（、−Ｃ３Ｆ　、、Ｍ−Ｃ３Ｆ　、ヒト成長因子、インスリン、因子■、因子■、ｔＰＡ　、　ＬＤＬレセプター、腫瘍壊死因子、ＦＤＧＦ、　ＥＧＦ、　ＮＧＦ、ＥＰＯ、β−グロビンなど、ならびにこれらのタンパク質の生物学的に活性な突然変異タンパク質。レトロウィルスのベクターの中に挿入するための発現のための遺伝子は種々の種からのものであることができる：しかしながら、問題の遺伝子のために好ましい種の源は、外来遺伝子を含有するレトロウィルスのベクターをその中に挿入すべき種である。

典型的には、本発明のレトロウィルスのベクターは、核酸配列をパッケージング細胞系の中にトランスフェクションすることによって使用される。パッケージング細胞系は、これをベクターに変換する過程においてレトロウィルスから欠失されたウィルスの遺伝子機能を含有する。こうして、ベクターの挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝子を含むか、あるいは含まない、本発明のレトロウィルスのベクターをパフケージング細胞系の中にトランスフェクションすると、所望の遺伝学的構成体を含有する感染性ウィルス粒子が生成する。理想的には、パンケージング細胞系は高い力価の組み換えレトロウィルスを生産することができる。本発明の遺伝学的構成体とともに使用するために好ましいパンケージング細胞系は、Ｐｓｉ２　＋　Ｐｓｉ　−Ａ＋＊＋　Ｐｓｉ　ＣＲＩＰ、およびＰｓｉ　ＣＲＥである。Ｐｓｉ２はレトロウィルスのベクターＭＦＧおよびα−３ＧＣとともに使用するためにとくに好ましい。

Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らにより記載されたＰｓｉ２は、ＮＩＨ３Ｔ３内皮をｐＭＯＶ−Ｐｓｉｄｅ　）ランスフエクションすることによってつくり、ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ　はエコトロピックモロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ− 門ｕＬＶクローンである。　ｐＭＯＶＰｓｉはすべてのウィルスの遺伝子生産物を発現するが、ウィルスのゲノムの包膜に必要であるＰｓｉ配列を欠如する。ｐＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉは、マウス（および密接に関係する奮歯類）の細胞上にのみ存在するレセプターを認識する、エコトロピックのウィルスのエンベロープ垢タンパク質を発現する。

他の細胞系はＰｓｉ　２様パツケージング細胞系であるＰｓｉ　ａｍ系統である。これらのＰｓｉ−ａｍ細胞系は修飾されたｐＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉゲノムを含有し、ここにおいてエコトロピックエンへロープ垢タンパク質は両種性ウィルス４０７０　Ａから誘導されたエンベロープ配列で置換されている。Ｈａｒｔｌｅｙ、　Ｊ、　’４．および−、　Ｐ、　Ｒｏｗｅ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　。

１９：１９−２５　（１９７６）。結局、それらは両種性宿主範囲をもつ組み換えウィルスの生産に有用である。　Ｐｓｉ　ａｍ細胞系をつくるために使用されたレトロウィルスは非常に広い哺乳動物宿主範囲（両種性宿主範囲）を有し、そしてヒト細胞を感染させるために使用することができる。組み換えゲノムがＰｓｉパッケージング配列を有する場合、Ｐｓｉ　−ａｍ細胞系は組み換えレトロウィルスのゲノムを感染性レトロウィルス粒子の中にパンケージングすることができる。Ｃｏｎｅ、　Ｒ。

Ｄ、およびＭｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。

２つの他のパッケージング細胞系はＰｓｉ　ＣＲＩＰおよびＰｓｉ　ＣＲＥとして知られている。これらの細胞系は、それぞれ、両種性およびエコトロピック宿主範囲をもつ組み換えレトロウィルスを高い力価で安定に生産するクローンを分離するために使用であることが示された。

これらの細胞系は、Ｄａｎｏｓ、　０．およびＲ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　す胚μ咬国■ヨー止り英収順ル１」９す已堕ジニ可」彊順匹旦ｓ　Ｕ、４扛」工８５　：６４６０−６４６４（１９８８）および米国特許出願第０７／２３９，５４５号、１９９８年９月１日提出、に記載されている。この参考文献および特許出願の教示を引用によってここに加える。Ｐｓｉ　ＣＲｆＰおよびＰｓｉ　ＣＲＥは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＩｌｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国マリイランド州口、クビレ）に、それぞれ、受は入れ番号ＣＲＬ９８０８およびＣＲＬ　９８０７でブダヘスト条約の規定に従い受託された。

本発明のレトロウィルスのベクターは、次のものを限定なしに包含する広範な種類の細胞のタイプにおいて使用することができる：上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、筋芽細胞、星状細胞、リンパ球細胞、メセンシャル（ｍｅｓｅｎｔｈｉａｌ）細胞など。次の特許および特許刊行物に開示されている細胞のタイプはとくに重要である：米国特許第４，８６８，１１６号、１９８９年９月１９日発行、および米国特許第４．９８０，２８６号、１９９０年１２月２５日発行（上皮細胞）、ＰＣＴ／ＵＳ８９１００４２２、匈０８９１０７１３６号、１９８９年８月ＩＯ日公開（肝細胞）、欧州特許（ＥＰ）第３７８，５７６号、１９９０年７月２５日公開（線維芽細胞）、およびＰＣＴ／ＵＳ８８１０４３８３　、ＷＯ３９１０５３４５号、１９８９年６月１５日公開および−ｏ　／　９０　／　０６９９７号、１９９０年６月２８日公開（内皮細胞）、それら開示をここに引用によって加える。

本発明のベクターは、次のものを限定なしに包含する種々の用途において使用することができる：癌、遺伝学的に基づく病気、心肺の疾患、内分泌学的疾患など。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定することを意図しない。

実施例１（ａ）〜（Ｃ）において、本発明のＭＦＧベクターを構成のための前駆体を記載する。参考文献の開示はここに引用によって加える。

１施■土１５クツ≧が何１戊ｐＭＯＶ　（ｐＭＯＶＰｓｉ）は次のようにして構成した＝３つの精製したＤＮＡ断片を一緒に結合したｐＭＯＶ　Ｐｓｉ−を構成した。ｐ門ＯＶ　Ｐｓｉ＋をＸｈｏｌで完全に消化し、次いでＥｃｏＲＩで部分的に消化することによって、第１を得た。Ｃｈｕｗａｋｏｖ、　１．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　、　４２：１０８８−１０９８（１９８２）。ＭｕＬＶの中の２．ＯＵにおけるＸｈｏ１部位から、３　’　ＬＴＲ，３’　？ウスのフランキング配列、ｐＢ１１３２２のすべて、を通して延び、そしてＥｃｏＲ１部位において終わる断片を、電気泳動の分離後にアガロースゲルから精製した。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、およびり、　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、　７６１：６１５−６１９（１９７９）、　ｐＭＯＶ　Ｐｓｉ＋をＢａ目で完全に消化し、次いでｐＢＦ１３２２の中のＢａ１１部位から５′マウスのｆｌｋ配列および５′を通してＭｕＬＶの０．７Ｕに位置するＢａ１１部位に延びる断片を精製することによって、第２の断片を得た。次いで旧ｎｄＩ［［リンカ−（コラポレイティブ・リサーチ）をこの断片にＴ４ＤＮＡ　リガーゼに平滑末端結合し、そしてこの断片を過剰のＨｉｎｄ［およびＥｃｏＲＩで消化した。

このＬＴＲを含有する断片を電気泳動で分離後にアガロースゲルから精製した。

最終の結合反応において存在する第３の断片は、ＭｕＬＶのｇａｇ／ｐｏｔ　ｆｉＩ域がｐＳＶ２の中にサブクローニングされているｐｓＶ２ｇａｇ／ｐａｌから得た。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，、およびＰ、Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９：１４２２−１４２７　（１９８０）。

ｐＳＶ２　ｇａｇ　／ｐｏｌをＸｈｏｌおよび旧ｎｄｕｌで完全に消化し、そして旧ｎｄ■部位（１，ＯＵのＭｕＬＶにおけるＰｓｔ１部位から変化した）から２．０のＭｕＬＶにおけるＸｈｏＩに延びる断片を電気泳動で分離後にアガロースゲルから精製した。次いで、これらの３つのＤＮＡ断片を等しい量で５０μｇ／ｄの合計のＤＮＡ濃度においてリガーゼ緩衝液（５０ｓＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）　、１０５１ＭのＭｇＣＩｚ、　２０ｗＭのジチオスレイトール、１．０ＩＩＭの＾ｒｐ、　５ｏ　ｕ　ｇ／ｄのウシ血清アルブミン）の中で混合し、そしてＴ４ＤＮＡ　リガーゼと１５“Ｃにおいて１８時間インキュベーションした。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩを結合したＤＮＡでトランスフェクションし、そしてアンピシリン耐性トランスフェクション体を得た。ある数の形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてアガロースゲルで電気泳動させることによって所望の構造についてスクリーニングした。Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ。

ら、メリンス・Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ＋ｏｌｏｇｙ、　６５：４０１−４１１　（１９８０）。

ｐＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉおよびｐｓＶ２ｇｐｔ、　ＸＧ　ＰＲＴを発現することができるＳＶ４０ハイブリッドベクターを同時形質転換することによって、染色体の中に安定に組み込まれたＰｓｉ突然変異体を含有する細胞系をつくった。Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，、およびＰ、　Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９：１４２２−１４２７（１９８０）。このようにして得られたｇｐｔ＋コロニーからの細胞をクローニングし、そして３つの系統に推定した：　Ｐｓｉ　１．　Ｐｓｉ−２およびＰｓｉ−３゜大施斑上ユ亙ＬｐＬＪ、このベクターの特性は、Ｋｏｒｍａｎ＋　＾、Ｊ、ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、　８４：２１５０　（１９８７）により記載された。このベクターは２つの遺伝子を発現することができる二問題の遺伝子および優性の選択可能なマーカー、例えば、ｎｏｅ遺伝子。問題の遺伝子を５′に対してちょうど基部のＢａｍＨＩ／５ｒｓａｒ／５ａｌｌクローニング部位の中に直接の向きでクローニングし、同時に、ｎｅｏ遺伝子をクローニング部位より３′離れている（クローニング部位の３′に位置する）内部のプロモーター（ＳＶ４０から）に対して基部に配置する。ｐＬＪからの転写は２の部位において開始する：１）５’ＬＴＲ１これは問題の遺伝子の発現のために要求される、および２）内部のＳＶ４０プロモーター、これはｎｅｇ遺伝子の発現のために要求される。ｐＬＪの構造は第２ａ図に表されている。

ベクターｐＬＪは第２ａ図に表されている。ｐＬＪにおいて、問題の遺伝物質は５　’　ＬＴＲのちょうど後に挿入される。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転写され、そしてｎｅｏ遺伝子の発現は内部のＳＶ４０プロモーターから転写される。

スＩＬＬＬ二とｐＥ＋ｗ。この実施例において、野生型ウィルスのｇａｇ、ρｏｌおよびｅｎｖのための全体の解読配列を、発現される唯一の遺伝子である問題の遺伝子で置換する。ｐＥｍヘクターの成分を下に記載する。５′フランキング配列、５　’　ＬＴＲおよび４００ｂｐの隣接する配列（Ｂａｍ８１部位まで）はｐＺｒｐからのものである。３′フランキング配列およびＬＴＩ？ばまたｐＺＩＰからのものである；しかしながら、３’ＬＴＲから１５０ｂｐ上流のＣｌａｌ部位は合成りａｍＨＩ　と結合されており、そしてベクターの中に存在するＢａＩＩＩＨＩ　クローニング部位の他方の半分を形成する。ｐＢＲ３２２の旧ｎｄ　ＤＩＥ　／　ＥｃｏＲＩ断片はプラスミドの主鎖を形成する。

このベクターはモロニーネズミ白血病ウィルスの株からクローニングされた配列から誘導される。類似のベクターは、骨髄増殖性肉腫ウィルスから誘導される配列から構成された。ｐＥｍの構造は第２ｂ図に表されている。

また、選択可能なマーカーをもたないベクターを使用して、種々の細胞のタイプ、例えば、問題の遺伝物質をもつ内皮細胞を形質導入することができる。このようなベクターは基本的には従来記載されたベクターの簡素化である、この中にこのようなマーカーが存在する。ベクターｐＥｎ＋は第２ｂ図に表されている；表されているように、このベクターの主な成分は５′および３′のＬＴＲであり、そして問題の遺伝物質は２つのＬＴＩ？の間に挿入されている。

夫施■工ＭＦＧヘク　−のＡＴＣＣＮｏ、６８７５４の同定特性を有する肝ＧヘクターはρＥＭから誘導するが、パンケージング細胞系の中の組み換えゲノムの包膜を増加するためにＭＭＬＶからのｇａｇ配列の１０３８ｂｐ、およびスプライスアクセプタ一部位および転写開始を含有するＭＯＶ〜９から誘導された３５０ｂｐを含有する。Ｎｃｏ［およびＢａｍＨ１部位を含有する１８ｂｐのオリゴヌクレオチドは、Ｎ０Ｖ− ９の直ぐ後に存在し、そして適合性部位をもつ遺伝子の便利な挿入を可能とする。ＭＭＬＶ　ＬＴＲは転写をコントロールし、そして生ずるｍＲＮＡは自然ｇａｇ転写体の真性の５′未翻訳領域を含有し、これに直ぐに引き続いて挿入された遺伝子のオープンリーディングフレームが存在する。Ｉ’ｌＦＧの構造は第２Ｃ図に表されている。

ＭＦＧのより詳細な地図は第１３図に記載されている。ＭＦＧの構成についての詳細は第９図（ａ）および第９図（ｂ）に記載されている。

？ＩＦＧは、半分のＧＡＧレトロウィルスのベクター（半分のＧＡＧはＢｅｎｄｅｒら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：１６３９−１６４６に記載されている）の χｈｏｔ／Ｎｄｅｌ断片を含有する５　’　ＬＴＲを、χｈｏＩ／ＢａｍＨＩ　Ｈ４のヒストンプロモーター断片に結合することによって構成した。レトロウィルスのベクターｐＥＭをＮｄｅｌおよびＢａｔａＨＩで消化し、そして３　’　ＬＴＲを含有する断片を既にＨ４断片に結合された半分のＧＡＧに結合して、適切な向きに２つのＬＴＲを含有し、そしてまたベクターのウィルス部分内にＨ４を含有する中間のレトロウィルスのベクターを生成した。次いで中間のベクターをＮｄｅ　Ｉで消化して線状にし、そしてこのベクターのｐＢＲ３２２部分の中のＮｄｅ１部位をポリメラーゼによりフィルインし、そして結合により破壊した。このベクターを引き続いてＸｈｏｌで消化し、そしてＸｈｏ１部位をＮｄｅｌリンカ−に接合した。このベクターを引き続いてＢａ＋＊ＨＩで切断し、そして両者のＬＴＲおよびｐＢＲ３２２配列を含有する大きい断片を精製した。

ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩを有しそして次の配列：ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧを存するリンカ−を合成し、そして清浄化した（ｃｌｅａｒｅｄ）中間体のベクターおよびｐ門ＯＶ９からのＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ断片（Ｎｄｅｌのへりの次にスプライスアクセプタ一部位を含有する）の両者に結合して、第２Ｃ図、第３図および第９図（ａ）〜第９図（ｂ）に示されているような、円形のベクター、ＭＦＧを形成した。ベクターＭＦＧを含有するプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）受託され、そして受け入れ番号６８．７５４を有する。

災施側−町免二並（皇１−戒 α−５ＣＣヘクター（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８７５５）は、α−グロビン遺伝子バンクからの転写プロモーター配列を利用してｔｐ＾遺伝子の発現を調節する。プロモーター要素を含有する６００塩基対の断片は、転写開始のための配列および真性のα−グロビンｍＲＮＡの５′未翻訳領域をさらに含有する。サイトメガロウィルス遊離転写エンハンサ−を含む３６０塩基対の断片はα−グロビンのプロモーターより前に存在し、そしてこの要素からの転写を増強するために使用される。

さらに、ＭＭＬＶエンハンサ−は３　’　！、ＴＲから欠失される。この欠失は感染のとき５’ＬＴＲに転移され、そしてこの要素の転写の活性化の活性を本質的に不活性化する。α−３ＧＣの構造は第２ｄ図に表されている６α−５ＧＣのより詳細な記載は第４図に示されている。α−３ＧＣヘクターを含有するプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そして受け入れ番号６８．７５５を有する。

以下の実施例は、内皮細胞とともに本発明のレトロウィルスのベクターを使用する実施例を提供する。理解されるように、他の細胞のタイプは同様によく適当であり、限定なしに、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞などを包含する。

組織のプラスミノゲンアクチベータ−（ｔＰＡ）は、血液のクロ・ントの線維素溶解を促進する内皮細胞により通常分泌されるタンパク質である。ヒトｔｐ＾をエンコードする組み換えレトロウィルスのベクターを構成し、そしてイヌ内皮細胞の形質導入に使用して、形質導入された内皮細胞からの治療的に関係するタンパク質のデリバリ−の増強を証明する。

組み換えレトロウィルスのベクターの中にクローニングするためのｔｐ＾遺伝子の修飾を第１０図に示す、ヒト子宮のｔＰＡの解読配列は、インチグレイテッド・ジェネティックス・インコーボレーテノド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）、マサチェセツツ州フラミングハムから入手したｐＵＣに基づ＜’５ａｌｌＤＮＡ断片内に含有されていた。もとのｃＤＮＡの塩基対６における５ＦａＮ１部位および塩基対２０９０におけるＢｇｌ１１部位に５ａｌＩリンカ−を配置することによって、５ａｌＩ断片を誘導した。

解読配列は塩基対１３から塩基対１６９９に延びる。

このもとのクローンから、この特許の主要部の中に記載されるＭＦＧおよびα− ３ＧＧベクターの中に直接クローニングすることができる断片を誘導した。　５ａｉｌフイルインをまず合成りａｓ＋ＨＩ　リンカ−の付加によりＢａ■ＨＩ断片に転化し、次いで制限酵素Ｂｇｌｌｌで消化して、１０９塩基対のＢａｍＨＩ −ＢｇｌｌＩ断片および１９７５塩基対のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂａ＋ｗＨＴ断片を生成する。ｔＰＡ解読配列のミッシング１００塩基対および翻訳開始コドンを再びつくるために、２つの１０４塩基対のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、そしてアニーリングして５′末端にＮｃｏ１部位および３′末端にＢａ１１１部位をもつ断片をつくる。このオリゴヌクレオチドを部分的１９７５塩基対のｔｐ＾遺伝子のＢｇｌ１１部位上に結合して、もとの分子の同一の解読配列をもつ２０７９塩基対のｔＰＡ遺伝子をつくるが、これはＮｃｏＩ−ＢａｍＨ［断片として容易に得ることができる。それをＭＦＧおよびα−５ＧＣベクターの中に直接挿入した（生ずるベクターは、それぞれ、ＡＴＣＣの受け入れ番号６８７２７および６８７２９を与えられた）。これらの操作は標準の分子生物学の技術（Ｍｏ　１ｅｃｕ　ｆａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｔ、　Ｍａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｓｈｃ−およびＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）により実施し、そして第２図に線図で示されている。

ＭＦＧ−ｔＰＡおよびα−３ＧＣ−ｔＰＡをエンコードする絹み換えウィルスを生産する細胞系は、両種性宿主範囲の組み換えレトロウィルスを生産することができるＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎのＰｓｉパンケージング細胞系からつくった（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８５：６４６０　（１９８８）　）　、　１０μｇの特定のＤＮＡおよび１μｇのプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏを共沈させ、そして標準のリン酸カルシウムトランスフエクシゴン手順によりパッケージンク細胞上にトランスフェクションした。安定にトランスフェクションしたクローンを、８００ｕｇ／ａｆｌのＧ４１８を含有する選択培地の中で１４日間増殖させた後分離した。２４時間培養の上澄み液を個々のクローンのコンフルエント単層から収獲し、そしてＮＩＨ３Ｔ３細胞の感染に使用した。

２４時間の暴露後、培養上澄み液を除去し、そして３Ｔ３細胞に通常の培地を供給し、そしてさらに７２時間増殖させた。新鮮な培地をこれらの細胞上に６時間の間装置し、そしてこれらの上澄み液を商業的に入手可能なヒトｔＰＡに対して特異的なＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｉｎｃ、−ニューヨーク州ニューヨーク）を使用してヒトｔＰＡについてアッセイした。このスクリーンから、ＭＦＧ　−ｔｐｎ　＆ｌｌみ換えウィルスまたはα−５ＧＣ−ｔＰＡ　＆Ｉｌみ換えウィルスを生産するパッケージング細胞系のクローンを選抜しそして、それぞれ、ＭＦＧ　６８およびα− ９ＧＣ２２と表示した。

イヌ内皮細胞は、記載されているように、外部の頚静脈の１０ｃｍのセグメントからコラゲナーゼの消化により分離した（Ｔ、　Ｊ、　Ｈｕｎｔｅｒ＋Ｓ、　Ｐ、　５ｃｈａ＋ｉｄｔ、　Ｈ，Ｖ、　５ｈａｒｐ、および（１９８３）　Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ。

紅旦ｆ、　Ｔｒｕμｍ」■註ｕ２９：１７７　）。細胞をフィブロネクチン被覆した組織培養皿上で５％の血漿誘導ウマ血清、５０μｇ／ａｄの内皮細胞の成長因子および１００　μｇ／ｄｉのヘパリンを含有するＭ１９９培地の中で増殖させた。細胞培養物の純度は、フォノ・ウィルブランドの因子の存在および平滑筋の細胞に特異的なα−アクチンの不存在についての免疫化学的アッセイにより決定した。形質導入の前日に、内皮細胞をヘパリンを含まない培地の中に５．５　ＸＩＯ’細胞／Ｃ−で接種した０次の日に、内皮細胞を、８μｇ／ｉｄのポリブレンを添加した各生産体細胞系から誘導された組み換えウィルスを含有する上澄み液に、２４時間暴露した。ウィルスの上澄み液を除去し、分析に通常の培地を供給し、そして増殖を分析前にさらに４８時間進行させた。

高分子量のゲノムＤＮＡおよび合計のＲＮＡを内皮細胞の培養物から標準の技術により分離した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒ　ｔｏｒＬＭａｎｕａＬ　Ｔ、門ａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｈｃ　、およびＪ、　５ａｓｂｒｏｏｋ）。ＤＮＡおよびＲＮＡを、全体のｔＰＡのｃＤＮＡ断片から調製した３２Ｐ標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシッン分析により分析した。標準の技術は電気泳動分離、フィルターの転移、ハイブリダイゼーシヨン、洗浄、およびｓｚｐの標識つけについて使用した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　？、　Ｍａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｈｃ、およびＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。形質導入されたイヌ内皮細胞の中のヒ）　ｔＰＡの生産は、種の特異的免疫化学的染色で実証された。形質導入された細胞を３％のホルムアルデヒドの中で１０分間室温において固定し、次いで０．１％のトリトンＸ−１００の中で５分間透過化した０次いで、固定された細胞の単層を順次にヒトｔＰＡに対するネズミモノクローナル抗体と、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウス抗体と、そして量後にアルカリ性ホスファターゼに対して特異的な色試薬とインキュベーションした。この手順はヒトｔＰＡを発現する細胞を特異的に染色し、そして普通の光学顕微鏡により可視化することができる。さらに、形質導入された細胞からのｔＰＡの分泌をコンフルエント細胞単層から決定した。新鮮な培地を細胞の上に６時間の間装置し、除去し、そして遠心により清浄にし、そしてヒトｔＰＡＯ量を商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ　（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で決定した。

形質導入プロセスの効率は、モック形譬導入された細胞またはＭＦＧ−ｔＰＡで形質導入された細胞の集団の免疫化学的染色により示された。第５図に示すように、？ｆＦＧ　６８から収獲したウィルスの上澄み液に細胞を１回暴露した後、細胞の本質的にすべてはヒトｔｐ＾を合成しており、これに対して対照において細胞はまった（合成していない、これは形質導入された細胞についていずれかのタイプを選択しないで達成された。

免疫学的アンセイを実施して、形質導入された細胞から分泌されているｔＰＡＯ量を決定した。下に示すように、ｌ’ｌＦＧ　６８またはα−５ＧＣ２２からの組み換えウィルスで形質導入された細胞は大量のヒトｔＰＡを分泌した。同様な条件下に、培養中のヒト内皮細胞は典型的にはほぼｌｏｇのｔｐ＾分泌する（Ｈａｎｓ９．　Ｍ、およびり、　Ｃｏ１１ｅｎ　（１９８７）Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、１０９：９７−１０４　）。

表　ｌ豊盗Ｚ旦！皿未感染（７）Ｋ９ＥＣＯ，ＯＭＦＧ６８　Ｋ９　ＥＣ１５０，１ α−５ＧＣ２２Ｋ９　ＥＣ３０２，８内皮細胞がＭＦＧ　６８およびα−５ＧＣ２２がらの組み換えウィルスで形質導入されたことのそれ以上の確証として、ＤＮＡおよびＲＮＡを形質導入された細胞から分離し、そして放射線標識したｔＰＡ遺伝子に対するハイブリダイゼーションにより分析した。ＤＮＡ分析のオートラジオグラフィーを実施した。ハイブリダイゼーションは未感染の対照において検出されなかったが、２つの組み換えウィルスで感染した細胞において適当な分子量の単一のハイブリダイゼーションする種が見られた。これが証明するように、遺伝情報はこれらの形質導入された細胞のゲノムに転移された。

これらの細胞から分離された合計のＲＮＡのハイブリダイゼーション分析は、タンパク譬およびＤＮＡの結果を確証する。再び対照の細胞においてハイブリダイゼーションは検出されなかったが、形質導入された細胞から誘導されたＲＮＡにおいて、適当な大きさのハイブリダイゼーションのバンドを見ることができる。

ＭＦＧ　６８およびα−３ＧＣ２２の組み換えウィルスを生産する細胞からのＲＮＡを、また、対照として示す。

Ｗ　脈　植片の　面上の　訳されたｌ　されたイヌのｉｎ　ｖｉｖｏの体重２０〜３２５　ｋｇの大人の雌の雑種のイヌの外部の頚静脈がら内皮細胞を酵素的に収獲し、実験室において培養し、そして実施例■に記載するように純度のための分析した。各動物から分離された細胞の半分を、前の節に記載するようにＭＦＧ　−ｔＰＡ組み換えウィルスを生産するＭＦＧ　６８細胞系から収獲したｔＰＡの上澄み液に２回暴露することによって形質導入した。他方の半分をモソク形賞導入した。各集団について実施した増殖曲線は、増殖特性の差を示した。形質導入された細胞の各ハンチから誘導された培養の上澄み液についてＥＬＩＳＡの測定を実施して、ｔＰＡが増強された細胞から分泌されていることを確実にした。次いでこれらの細胞を実験室においてほぼ１週間増殖させて、十分な数の細胞を得た。

細胞を分離した各動物について、発泡テフロンから作られた２つの脈管移植片（Ｗ、　Ｌ、　Ｇｏｒｅ　ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、アリシナ州フラグスタッフ）に細胞を接種した。一方の移植片をモソク形賞導入された細胞で接種し、そして他方を高いレベルのｔＰＡを分泌するように形質導入された細胞で接種した。各移植片、０．４　ｃｍＸ１４ｃｍ、を１μｇ　／　ｃｄのフィフ゛：コネクチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、ミソ゛リー州セントルイス）で予備被覆し、次いで２２００．０００の内皮細胞／ｃｍで接種した。次いで移植片を追加の７２時間の培養の間インキュベーションした。移植の前に、末端を各移植片から切断しそして検査して細胞の被覆を確実にした。

細胞を収獲した同一のイヌを麻酔し、そして接種した移植片の１０１のセグメントを大動脈−腸骨のバイパスとして移植した。各イヌに２つの対側の移植片を与えた；一方は対照細胞を接種しそして他方は高いレベルのｔＰＡを分泌するように形質導入された細胞を接種した。移植後、移植片の性能をＢ−モードのスキャナーで毎日モニターし、このスキャナーは超音波で移植片を探し、そしてトンプラーＳ定（Ａｃｃｕｓｏｎ、　Ｉｎｃ、）により移植片を通る血液の流れを評価した。

血栓の形成を減少する薬物を動物に投与しなかった。

６匹の異なる動物における移植片の性能の結果分析した。結果を第５図に示す。

前述の移植のモデルは極端に厳格なものであり、そして閉鎖性クロットの形成により象、速な移植片の不合格に導く。正常の移植片の機能は充実の棒で示し、そして不合格であるが、なお機能している移植片は縞のある棒で示す。第１の動物において、対照移植片および増大したレベルのｔＰＡを分泌する形質導入された細胞でライニングした移植片（実験）は移Ｍｉ後２４時間でクロ、トの形成のために不合格であった。他の５匹の動物のすべてにおいて、増大したレベルのｔｐ＾を分泌する形質導入された細胞でライニングした移植片はモンク形質導入されたのみの細胞をもつ移植片より長く機能した。この差は２４時間から数カ月まで変化した。これらの結果が証明するように、治療的効果は形質導入された内皮細胞を使用してｉｎ　ｖｉｖｏで達成することができる。

ｘ　ノ　れた　か゛のヒト　■の修飾されたヒト因子■遺伝子を含有するレトロウィルスのベクターであるＭＦＧ　（ＡＴ（：Ｃの受け入れ番号６８７２６）で細胞を形質導入することよって、内皮細胞を遺伝学的に増強してヒト因子■を生産した。

修飾された因子■はＡｔ、　Ａ２．　Ａ３．　ＣＩおよびｃ２ドメインのための解読配列のすべてを含有するが、Ｄドメインはアミノ酸７４３から１４６８まで欠失されている。Ｂドメインの除去およびレトロウィルスのベクターＭＦＧの中への修飾された因子■の挿入を下に詳細に記載しそして第７図に描写する。

５′および３′の未翻訳配列をもたない全長のｃＤＮＡを、制限部位Ｎｃｏ！（５’　）とＸｈｏｌ（３’　）との間に挿入されたプラスミドベクターにおいて得た。Ｂドメインを除去するために、因子■のｃＤＮＡをＢドメインの５′および３′の両者の側の配列をスパンする４断片においてプラスミドベクターの中にサブクローニングした。因子■のｃＤＮＡの第１断片を、プラスミドベクタ−ｐｔｌｃ９の中の制限部位Ｓ＋ｓａ　［とＰｓｔｌとの間にサブクローニングした。このプラスミドベクターを５ａｌｌおよびＰｓｔｌで切断し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼを使用して除去した。全長のｃＤＮＡからの１５９１塩基対のＸｈｏｌ　（ヌクレオチド７２６３）　ＮｄｅＩ　（ヌクレオチド５６７２　）断片、および３５９塩基対のＮｄｅｌ　（ヌクレオチド５６７２）　Ｐｓｔｌ　（ヌクレオチド５３１３）断片を分離し、そして５ａｉｌ／Ｐｓｔｒ消化したプラスミドベクターと結合した。

同一の翻訳のリーディングフレームでアミノ酸７４２−１６４９を接合するＢドメインをエンコードする配列の大部分を除去するために、１６８塩基対を包含する５　’　）ｌｉｎｄ１部位および３　’　Ｐｓｔ１部位をもつオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは、アミノ酸７４２および引き続（軽鎖の活性化ペプチドの第１アミノ酸であるアミノ酸１６４９をエンコードするヌクレオチド２４２７におけるＨｉｎｄｎＩ部位から、ヌクレオチド５３１３におけるＰｓｔ１部位へ延びる。プラスミドベクターｐｌＪｃ９を制限酵素旧ｎｄｎｌおよびＰｓｔｌで消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼを使用して除去した。オリゴヌクレオチドを４つの別々の鎖として合成し、キナーゼ処理し、アニーリングし、そしてプラスミドベクターの）Ｉｉｎｄｌ［［とＰｓｔｌとの間で結合した。

サブクローニングしたＨｉｎｄｌＩ［／Ｐｓｔｌオリゴヌクレオチドをプラスミドベクターρｔｌｃ８の中のＰｓｔｌ／Ｘｈｏｌ断片に対して並置した。このプラスミドを発生させるために、新しいポリリンカーをｐｕｃ９プラスミドの主鎖の中に挿入し、この新しいポリリンカーは使用した制限酵素部位５　’　５ｓａｌ　−ＢａｓＨＩ　−Ｘｈｏｌ−Ｐｓｔ［−ＨｌｎｄＩ［［−Ａｓｐ７１８−Ｎｃｏｌ　−１（ｐａｌ　３　’をエンコードした。このプラスミドベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよび旧ｎｄｍで消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼで除去した。Ｐｓｔｌ／Ｘｈｏｌサブクローンの部分的Ｐｓｔ［／Ｂａｓ＋ＨＩ消化物を使用して３′末端の因子■断片を分離し、そしてサブクローニングしたオリゴヌクレオチドのＰｖｕｒ／Ｈｉｎｄｌｌｒ消化物を使用して重鎮および軽鎖の接合断片を分離した。それらをプラスミドベクターｐＵｃ８の中のＢａｓＨＩ部位とＨｉｎｄｌｆｆ部位との間に結合した。

ヌクレオチド２４２７および７２０５の間に因子■配列を含有するこのサブクローンをＡｓ−７１８およびＨｉｎｄｌ［［で消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼを使用して除去した。制限酵素部位Ａｓｐ７１Ｂ　（ヌクレオチド１９６１）と旧ｎａｍ（ヌクレオチド２４２７　）との間の因子■をエンコードする断片を分離し、そしてヌクレオチド１９６１からヌクレオチド７２０５における翻訳停止コドンまでの因子■を含有するサブクローン（ｐＦ８３ ’デルタ）を発生させた。

修飾された因子■を含有するレトロウィルスのベクターの構成を、レトロウィルスのベクターＭＦＧの制限部位ＮｃｏｌとＢａ■ＨＩ　との間に因子■遺伝子を挿入することによって実施した。因子■のサブクローニングｐＦ８３’デルタを５ｅａｌで消化し、そしてオリゴヌクレオチドのリンカ−を使用してＢｇ１１１部位に変換した。Ａｓｐ７１８／ＢｇｌｌＩ断片を３′因子■サブクローンから分離し、そして翻訳開始のための＾ＴＧを含有する５′因子■断片をＮｃｏｌ　（ヌクレオチド１５１）　／　Ａｓｐ７１８断片（ヌクレオチド１９６１）として分離した。レトロウィルスのベクターＭＦＧをＮｃｏ　ＩおよびＢａ＋ｇ旧で消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼで除去した。因子■ 断片をレトロウィルスのベクターの中に結合して最終の因子■レトロウィルス構成体を生成した、第６図参照。

Ｂｅｓｔｗｉｃｋら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：５４０５−５４０８　（１９８＆））により記載されているように、レトロウィルスのベクターＭＦＧ　／因子■を等しい数のエコトロピンクパッケージング細胞Ｐｓｉ　ＣＲＥおよび両種性パッケージング細胞ＣＲＩＰの中にトランスフェクションすることによって、レトロウィルスの粒子を生産する細胞系を発生させた。パッケージング細胞の２つの宿主範囲の間で起こる重感染の程度をモニターするために、生物学的に活性な因子■の生産をカビ・ダイアグノスチ力・コーチスト・フォー・ファクター■（ＫａｂｉＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｃａｏａｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｆａｃｔｏｒ■）（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、テキサス州ビーウモント）で測定し、そしてウィルスのＲＮＡの生産を１２ＮＡ　ドツトプロット分析によ／）／Ｓ定した。トランスフェクション後２１日に、トランスフェクションされたパンケージング細胞を両種性パッケージング細胞系Ｐｓｉ　ＣＲＩＰ−ｔ（ＩＳと同時培養した。ＣＲＩＰ　ＨＩＳパッケージング細胞系は従来記載されたＣＲＩＰパンケージング細胞系の変異型である。ＣＲＩＰ　）ＩＩｓパフケージング細胞系はＰｓｉ　ＣＲＩＰパッケージング細胞系と同一であるが、ただしレトロウィルスのエンベロープ遺伝子をｐｓＶ２−Ｈ１ｓプラスミドＤＮＡ、すなわち、異なる優性の選択可能なマーカー遺伝子で同時トランスフェクションすることによって細胞の中に導入した。形質導入性粒子の均質性両種性レトロウィルスのストックの分離のために、パンケージング細胞系を１＝１の比で培養した。両種性パッケージング細胞系ＣＲＩＰ　Ｈｌｓの重感染は安定性細胞系１（１ｓ　１９の発生に導き、）ＩＩｓ　２９は修飾された因子■遺伝子を効率よく形１に導入する組み換えレトロウィルスを生産する。レトロウィルスを生産する細胞系の抗生物質の選抜は、高い力価の組み換えレトロウィルスを生産する細胞系の分離に要求されない。細胞系のゲノムのＩ）ＮＡをサザンブロノトハイプリダイゼーション分析により特性決定して、生産体の細胞系の中に存在するレトロウィルスのベクターの組み込まれたコピーの数を決定した。レトロウィルスを生産する細胞系の中のコピー数はほぼ０．５であり、したがって平均するとＣＩ？ＩＰ−ｉ（１ｓパツケージング細胞の５０％は修飾された因子■遺伝子をもつレトロウィルスのベクターのコピーを含有する。レトロウィルスのベクターおよび修飾された因子■遺伝子はパッケージング細胞系の中にＤＮＡの欠失または置換を含まなくて無傷である。

レトロウィルスのベクターのコピー数は、レトロウィルスを生産する細胞系の連続的継代で一定に止まる。組み換えレトロウィルスの最高の力価を得るために、Ｈｌｓ　１９を選択ヒスチジンマイナス培地の中で４回継代し、次いで完全ＤＭＥＭ培地の中で４回継代した。レトロウィルス粒子を発生させるために、ＨＩＳ　１９を５Ｘ１０’〜１×１０ｂ細胞でｌ０ＣＩの細胞培養皿の中で接種した。

接種後４８時間に、はぼ７０％のコンフルエンシイであり、新鮮な培地（ＤＭＥＭ＋１０％の仔ウシ血清）を形質導入のための組み換えレトロウィルス源として２４時間後に集めるためにプレートに添加した。

修飾された因子■遺伝子を頚静脈から分離されたイヌ内皮細胞の中に形質導入した。５％の血漿誘導血清（ウマ）、ｌＯＯμｇ／ｄのヘパリンおよび５０μｇ／Ｉ１１の内皮細胞の成長因子を有する完全門１９９培地の中で、内皮細胞を３　Ｘ　１０５Ｓｌ［ｌ胞／　ｌ０ＣＩの皿で４〜６時間の間接種した。次いで細胞を５％の血漿誘導血清および１００μｇ／ｄの内皮細胞の成長因子を有するＭ１９９培地の中で、形質導入プロセスの効率に悪影響を及ぼすヘパリンの不存在下に、−夜インキユヘーションした。細胞を新鮮な上澄み液＋ポリブレン（８μｇ／ｄ）に２４時間暴露した。ウィルスの上澄み液を除去した後、細胞を５％の血漿誘導血清、１００μｇ／ｒｄの内皮細胞の成長因子を有するｈ１９９培地の中に入れて、はぼ７０〜８０％のコンフルエンスに増殖させた。その時、培地を５％の加熱不活性化した胎児ウシ血清（６６°Ｃに２時間加熱した）および５０μ ｇ／−のＥＣＧＦを有するＭ１９９に変えた。２４時間のインキュヘーション後、培地を集め、そしてカビ・コーチストにより生物学的に活性な因子■についてアッセイした。

このレトロウィルスを生産する細胞系では、内皮細胞の５０％〜７５％はメロ／ドブロット分析により分析した。因子■遺伝子はこの頻度において組み換えレトロウィルスへの単一の暴露で、かつ形質導入された細胞の抗生物質の選抜なしに、形質導入することができる。

形質導入された内皮細胞は、組み換えレトロウィルスのゲノムの無傷のコピー、および欠失または再記！をもたない修飾された因子■遺伝子を含有する。遺伝学的に増強された内皮細胞からの生物学的に活性な因子■の生産速度は４００ｎｇ／　５　ＸＩＯ”細胞／２４時間であった。

！ＥＪｌ［Ｌｕ　の１ｎｖｉｖｏ／　導入前の実施例に記載するようにつくった組み換えレトロウィルスのｍａａストックを使用して、内皮細胞のｉｎ　ｖｉｙ（＋形質導入を証明する予備的データをわれわれは得た。このアプローチは従来発表された観察（Ｒｅｉｄｙ　ＨＡ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ＳＭ、　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　４４：３０１−３０８　（１９８１））に基づき、これによると、動脈表面への定められた損傷は内皮細胞の小さいストリンブを除去し、そしてこの露出された区域は欠陥のへりからの新しい内皮細胞の増殖および内部成長により７２時間以内に治癒する。細胞分割は組み換えレトロウィルスによる有効な形質導入のための要件であり、そして針金を使用する内皮の損傷は内皮細胞の増殖を誘発するだめの潜在的に多数の方法の１つである。われわれの方法は内皮細胞の増殖を誘発し、次いで増殖する細胞を組み換えレトロウィルスのベクターを含有する上澄み液に直接暴露する、定められた損傷のＲｅ１ｄｙの技術を使用する。われわれの最初の実験は正常部位で内皮細胞を首尾よく形質導入し、こうして新しい遺伝学的配列を首尾よく導入する組織培養技術の必要性を回避するこの方法の能力を記載する。

この方法は２つの外科的手順を要求し、第１の手順は血管を損傷しくここで右の腸骨の動脈について記載した）そして内皮細胞の増殖を誘発する。第２手順は血管表面上で複製する細胞に組み換えレトロウィルスをデリバリ−すると同時に、増殖する細胞がレトロウィルス粒子へ暴露される間に近位の動脈管系からの血液の流れ防止する。実施を簡素化するために、この手順を腸骨の動脈について記載する。

ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子転移を証明するために、α−５ＧＣベクターに基づく改良されたベクターを用いる１９８７年に発表された（Ｐｒｉｃｅ　Ｊ、　ＴｙｒｎｅｒＤ、　Ｃｅｐｋｏ　Ｃ，１９８７Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１５６０１６０）マーカー遺伝子の概念をわれわれは使用した（第２ｄ図および第４図）。

β−ガラクトシダーゼをエンコードする１ａｃＺ遺伝子をα−３ＧＣベクターの中に挿入して、第８図に表されているα−５ＧＣ−ＬａｃＺを発生させた。この組み換え構成体をｔ　Ｃｒ１ｐパツケージング細胞系の中にトランスフェクションし、そして高い力価のα−３ＧＣ−ＬａｃＺ＆［ｌみ換えレトロウィルスを生産するｔ　Ｃｒ１ｐ細胞のクローンを実施例■に記載するように分離した。α− ５ＧＣ−ＬａｃＺ＆Ｉみ換えレトロウィルスのストックをｉｎ　ｖｉｖｏ形賞導入賞導入に使用した。

実験動物（ウサギ）を麻酔（ケタミン／キシラジ）し、両方の鼠径部をそりそして準備し、そして動物を手術テーブル上に配置した。

両側の垂直の鼠径部の切開を通して、総、浅および温存の大腿動脈を露出させた。右（損傷すべき側）において、総大腿動脈からの小さい分岐を結合して、分離した動脈セグメントからの流出が内部の腸骨の動脈を通してのみ確実に起こるようにした。必要に応じて、鼠径靭帯を分割し、そして血管を腹膜後膣の中に入れてすべての側の分岐の完全なコントロールを確実にする。右の浅大腿動脈（ＳＦＡ）を温存分枝よりほぼ１．５ｃｍ−ドにおいて３−０の絹で結合し、ＳＦＡのコントロールはＳＦＡ／ｉ在接合において得られ、そして横方向の動脈切開をつくった。細い針金（２０ゲージのイントラカス（Ｉｎ　ｔｒａｃａ　ｔｈ）のスタイレットを使用した）を二重にして弾力性を与えて血管壁との接触をｉｎ寞にし、総大腿動脈および腸骨動脈を通過させて、Ｒｅ１ｄｙらが記載する定めた損傷を生成した。針金を除去し、２０ゲージのアンギオカス（ａｎｇｉｏｃａｔｈ）を動脈切開で挿入し、そして下に横たわる筋肉に固定して、次の外科的手順における直ちのアクセスを可能にした。切開を層状に閉じ、そして動物を回復させた。

２４時間後、α−５ＧＣ−ＬＡＣ−Ｚベクターのｃｒｉｐ生産体から収穫しそして８μｇ／ｄの最終濃度にポリブレンを補充した上澄み液を含有する組み換えウィルスをｉｎ　ｖｉｖｏの形質導入のために使用した。

動物を再び麻酔し、そして両方の切開を無菌の環境において再び開いた。前に露出した右の腸骨血管を混乱させないで損傷を与えた区域の上の右の腸骨血管のコントロールを得るために、＃３フォガルティ（Ｆｏｇａｒｔｙ　”）バルーン塞栓切除のカテーテルを左の浅大腿動脈の中の動脈切開を通して挿入し、大動脈分岐に進行させ、そしてバルーンを膨張させて血流を遮る。右の温存大腿動脈を閉塞する。組み換えウィルスを含有する上澄み液（１０ａｆ）を、右のＳＦＡの中に前に配！したアンギオカスを通して手で注射して導入した。上澄み液は逆方向に右の総大腿動脈から右の外部の腸骨動脈に流れ、そして右の内部の腸骨動脈の中に入った。右の内部の腸骨動脈を去ることによって、上澄み液のだめの開いた流出を可能とし、そして十分な１（ｌｄの上澄み液を設！できた。今日まで実施された実験において、上澄み液を血管壁に４〜８分間暴露した。次いで左側および右側からのカテーテルを除去し、止血が得られ、そして切開を閉した。

１０〜１４日後、動物を殺す前に麻酔した。麻酔後かつ暴露前に、末端の血管の直接の触診により評価した。腎臓下の大動脈および下の大静脈を外科的に露出し、カニユーレ挿入し、そして下端の血管をヘパリン添加したリンゲル乳酸塩（２Ｕ／Ｍｉ）で生理学的圧力（９０ｍＨｇ）でフランシュした。致死投与量のネンプタールを投与し、そして０．１Ｍのカコジレート中の０．５％のグルタルアルデヒドの中でその部位で動脈を１０分間潅流固定した。大動脈および両方の腸骨動脈を連続的に切除し、そして１ｍＭのＭｇＣ＋□を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中ですすいだ。次いで血管をｘ−ｇａｌ基質の中で３７°Ｃにおいて１〜１．５時間インキュベーションすることによって１ａｃＺ活性のための染色した。この反応が完結したとき、ｘ−ｇａｌ溶液を洗浄除去し、そしてＰＢＳで置換する。

２つの実験をこのプロトコルを使用して実施した。両者の実験において、細胞質のパターンの選択的な強いブルーの染色により可視化したとき、動脈表面上の細胞の中の１ａｃＺ遺伝子生産物のその部位の発現により示されるように、ｉｎ　ｖｉｖｏの形質導入は１ｒ望であることが証明された。Ｒｅ１ｄｙらにより記載された損傷のパターンおよび増殖と一致する強く染色されたブルーの線は、針金で損傷し、α−５ＧＣ−ＬａｃＺ組み換えウィルスに暴露し、固定し、そして１ａｃＺ活性について染色した、外部の腸骨動脈のセグメントの表面上に見いだされる。

生物学的寄託１９９１年１０月３日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ（ＡＴＣＣ）に、ここに記載する因子■が挿入されたプラスミドＭＦＧは受託された、ＡＴＣＣ受は入れ番号６８７２７を与えられ、ここに記載する因子■が挿入されたプラスミドα−５ＧＣはＡＴＣＣ受は入れ番号６８７２８を与えられ、そしてここに記載するｔＰＡが挿入されたプラスミドα− ５ＧＣは＾ＴＣＣ受は入れ番号６８７２９を与えられた。１９９１年１０月９日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ（ＡＴＣＣ）に、ここに記載するプラスミドＭＦＧは受託された、ＡＴＣＣ受は入れ番号６８７５４を与えられ、ここに記載するプラスミドα−８ＧＣはＡＴＣＣ受は入れ番号６８７５５を与えられた。これらの寄託は特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的認識についてのブダペスト条約の規定および規則（ブダペスト条約）に従いなされた。これは受託口から３０年間の生存能力を有する培養物の維持を保証する。これらの生物は、ブダペスト条約の規定に従い、そして関係する米国特許の発行のとき制限されない入手可能性を保証する、出願人とＡＴＣＣとの合意に従い、ＡＴＣＣにより入手可能となるであろう、受託された株の入手可能性は、政府の権力の下でその特許法に従い承認された権利に違反して、実施のライセンスとして解釈すべきではない。

同等の実施態様当業者は、ここに記載した発明の特定の実施Ｂ様と同等の多くの実施態様を認識するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるであろう。このような同等の実施！！様は次の請求の範囲により包含されることを意図する。

ＦＩＧ、１ＦＩＧ、　５顕部　顕部　顕部　Ｉ癖　顕部　顕部炭械　亥誂　亥桃　亥挑　亥桃　亥誂ＦＩＧ、　６ＡＦＩＧ、　６ＢＦＩＣ，６ＣＦＩＧ、　８ｇ■０♀口Ｑ３）−＜９ｕ（５♀〆一国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４８（Ｃ１２Ｎ　９／６４Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ。

ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＥ、５Ｕ（７２）発明者　ギルド、プレイトン　シー。

アメリカ合衆国、マサチューセッツ０１７４２　、コンコード、リバーディル　ロード　１０９ＦＩ（７２）発明者　ラフイールド、ロリ　エフ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２３゜サン　フランシスコ、＃５．ビーチ　ストリート２２４９（７２）発明者　コーエン、ローレンス　ケー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４６１１゜オークランド、キャボット　ドライブ（７２）発明者　ロビンズ、ポールアメリカ合衆国、ペンシルバニア　１５２１６゜マウント　ゼバノン、オーバールック　ドライブ　５２７（７２）発明者　ミュリガン、リチャード　シー。

アメリカ合衆国、マサチューセッツ０２１３８　、ケンブリッジ、フランクリン　ストリート４４１

Claims

【特許請求の範囲】

１．操作可能な組み合わせにおいて、問題のレトロウイルスから誘導された５′ ＬＴＲおよび３′ＬＴＲ、および問題の遺伝子のための挿入部位からなり、完全なｇａｇ，ｅｎｖまたはｐｏ１遺伝子を含有しない、レトロウイルスのベクター。
２．前記ベクターは、さらに、ｇａｇの解読配列の一部分を含む、請求の範囲第１項に記載のレトロウイルスのベクター。
３．前記ｇａｇの解読配列は、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位からなり、前記スプライスアクセプター部位は前記問題の遺伝子から上流に位置する、請求の範囲第２項に記載のレトロウイルスのベクター。
４．前記ベクターは、さらに、ｇａｇの転写プロモーターを含み、前記ｇａｇの転写プロモーターは前記挿入部位の中に挿入されたヌクレオチド配列の転写体が生成されるように機能的に位置し、前記転写体はｇａｇの５′未翻訳領域からなる、請求の範囲第３項に記載のレトロウイルスのベクター。
５．前記ベクターは選択可能なマーカーを含有しない、請求の範囲第４項に記載のレトロウイルスのベクター。
６．前記ベクターはＡＴＣＣ６８，７５４の同定特性を有するＭＦＧである、請求の範囲第５項に記載のレトロウイルスのベクター。
７．前記ベクターは、さらに、前記挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝子を含む、請求の範囲第１項に記載のレトロウイルスのベクター。
８．前記発現のための遺伝子は、ホルモン、酵素、レセプターおよび薬物から成る群から選択される、請求の範囲第７項に記載のレトロウイルスのベクター。
９．前記発現のための遺伝子は因子ＶＩＩまたはｔＰＡである、請求の範囲第８項に記載のレトロウイルスのベクター。
１０．前記ベクターは、さらに、アルファ　グロビンの転写プロモーターを含む、請求の範囲第１項に記載のレトロウイルスのベクター。
１１．前記ベクターは、さらに、前記アルファーグロビンの転写プロモーターに自然に接合したａ−グロビン遺伝子の５′来翻訳領域の一部分を含む、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
１２．前記ベクターは、エンハンサー配列を含み、前記エンハンサーは前記５′ または３′ＬＴＲの中に存在しない、請求の範囲第１１項に記載のレトロウイルスのベクター。
１３．エンハンサー配列は前記転写プロモーターから上流に位置する、請求の範囲第１２項に記載のレトロウイルスのベクター。
１４．前記エンハンサー配列はサイトメガロウイルスのエンハンサー配列である、請求の範囲第１３項に記載のレトロウイルスのベクター。
１５．前記ベクターはａ−ＳＧＣでありそしてＡＴＣＣＮｏ．６８７５５の同定幽特性を有する、請求の範囲第１４項記載のレトロウイルスのベクター。
１６．前記３′ＬＴＲは機能的エンハンサー配列を含有しない、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
１７．前記ベクターは、さらに、前記挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝子を含む、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
１８．前記発現のための遺伝子は、ホルモン、酵素、レセプターおよび薬物から成る群より選択される、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
１９．前記発現のための遺伝子は因子ＶＩＩまたはｔＰＡである、請求の範囲第１８項に記載のレトロウイルスのベクター。
２０．請求の範囲第１及び１１に記載のレトロウイルスのベクターで形質転換されたパッケージング細胞系。