JPH06505144A - ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・クレモリスからの新規なバクテリオシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・クレモリスからの新規なバクテ リオシン 本発明は新規なバクテリオシン、およびその単離、合成および用途に関する。

本発明者らは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・クレモリス（Ｌ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌 株から新規なバクテリオシンを単離した。この微生物は、これまで文献未載であ った。

前記の微生物は、細胞濃度が高い場合に自己溶菌性であり、本発明者らは、この 微生物が生育培地、例えばＭ１７培地において細胞外に見出されるバクテリオシ ンを産生ずることを発見した。この細菌の自己溶菌は、バクテリオシンの溶菌特 性によるものとして示すことができる。溶菌は、バクテリオシンを分解するプロ テアーゼの添加により防止することができる。

本明細書において「バクテリオシン」なる用語は、溶菌を含む河らかの機構によ って、産生微生物それ自体のみならず他の細菌株をも殺す、細菌によって放出さ れる物質を包含するものとして用いられる。従って、本願発明に係る新規なバク テリオシンは、既知のバクテリオシンであるディプロコシン（ｄｉｐｌｏｃｏｃ ｃｉｎ　）およびナイシン（ｎｉｓｉｎ　）を産生ずる菌株を含む１ａＣｔＯＣ ＯＣＣｕＳ属の１２０以上の菌株の生育を阻害することが知られた。しかし、産 生微生物自体は、無差別な溶菌を防ぐために、バクテリオシンに対する耐性を与 える免疫ファクターについてコードする遺伝子を担持しており、本バクテリオシ ンは、その産生微生物を高い細胞濃度においてのみ溶菌するものと思われる。

本発明者らは、新規なバクテリオシンのアミノ酸シークエンスを決定した。本発 明のｍ一つの観点によれば、下記のアミノ酸シークエンス １６−Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔ ｙｒ　ＧＩｒ＋　Ｇｌｎ　ｎｖ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ４６−ＡＬａ　Ａｌａ 　ＧｌｙＧｌｙＰｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓを有するかまたは含む ポリペプチド、およびバクテリオシン活性を有するその誘導体またはフラグメン トが提供される。

前記の構造は、ナイシンの構造と異なっており、５ＷＩＳＳ　ＰＲＯＴデータバ ンクの既知のポリベブチドシークエンスと有意なシＩ畦 一りエンス相同生を有しない。本発明のバクテリオシンの溶菌活性は、すてに知 られているり、　１ａＣｔｉＳバクテリオシンの活性よりも実質的に大きい。

新規なバクテリオシンは熱安定性であり、水中で３０分間煮沸した後にも活性を 保持している。この性質は、Ｌ、　１ａｃｔｉｓ微生物を用いる工業的方法、例 えばチーズおよびヨーグルトの製造へのその使用を可能にする上で価値がある。

本バクテリオシンは、１ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ＨＡ菌を溶菌によって殺すと思 われる。１ａｅｔｏｅｏｃｃｕｓ属菌の溶菌を促進することはチーズの熟成を促 進するのに有益であり、従って新規なバクテリオシンは、特にチーズの製造に用 いられる。

本バクテリオシンの溶菌活性は、細胞壁調製物の製造または核酸物質の放出にも 使用できる。

ある種の細菌、例えばグラム陰性菌は、バクテリオシンに対して耐性であるので 、本発明のバクテリオシンの使用により、例えば発酵用のスターター培養物中の 混合細胞集団から、ある種の細胞、倒木発明のバクテリオシンをスターター培養 物に添加すると、異種微生物を除去するのに役立ち、また、例えば胞子形成性ｃ ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌またはり、　ＩａＣｔｉＳの望ましくない株に対して 有効である。

本バクテリオシンは、有利には、チーズまたはヨーグルト発酵の比較的遅い段階 において、Ｌ、　Ｉａｃｔｉｓ微生物による乳酸、プロテアーゼおよびフレーバ ーの生成がすでに行われた後で添加することができる。

産生菌株をスターター培養物、あるいはミルクまたは他の培地のいずれかにおい て純粋に保つことによって、均一な産生を向上することができる。

本バクテリオシンは、ビール発酵および蒸留発酵において乳酸産生細菌株を選択 的に殺すのにも使用できる。なぜならばこれらの株は、文献によると低温殺菌さ れていないビールの腐敗の主な原因とされており、また、発酵中の感染を最高率 で引き起こすからである。

本発明は特に、夾雑する１ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属種の阻害剤として本バクテリ オシンを含有する微生物のスターター培養物を包含する。このような微生物は、 例えば本バクテリオシンに耐性のり、　１ａｃｔｉｓの株、例えば産生微生物で あってよく、従ってビール発酵または蒸留発酵に用いられたスターター培養物ま たは酵母から、望ましくない微生物だけが除去される。このようなスターター培 養物は、通常は凍結乾燥された形態にある。

本バクテリオシンは、その高い選択性からみて、１ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属種の 同定における分類用手段として使用できる。

新規なバクテリオシンは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ 、　ｅｒｅｍｏｒｉｓの培養物から、生育培地の分別によって単離することかで き、こうして本バクテリオシンに富んだフラクションが集められる。公知の分別 技術を適用することにより、本バクテリオシンを電気泳動的純度で得ることかで きる。従って、例えば微生物を好適な培地、例えばＭ１７ブロス中で生育させ、 その上澄液を例えば硫酸アンモニウムにより分別沈澱させた後、リン酸塩緩衝液 で溶離するカルボキシメチルアガロース上でのクロマトグラフィーおよび／また はエタノールを上昇する濃度で含有するリン酸塩緩衝液で勾配溶離するフェニル スペロース上でのクロマトグラフィーによって処理する。

本発明者らは、Ｌ、Ｉａｃｔｉｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓから二遺伝子オペロン（ブ ロー形で本バクテリオシンについてコードする）、並びにもう一つのタンパク質 Ｃ本バクテリオシンによる自己分解に対する耐性を与える免疫ファクターと考え られる）をクローン化し、シーフェンス決定することかできた。このオペロンの 完全なシーフェンスを図１に示す。この図には、対応するタンパク質、すなわち 本バクテリオシンおよび本免疫ファクターのシーフェンスも示されている。この オペロンは、遺伝子発現の調節領域で始まる。これは、領域−３５および−ＩＯ にあるプロモーターと、リポソーム結合部位とを含むと考えられる。プロシーフ ェンスについてコードする遺伝子は、塩基３１２から塩基３７４までである。本 バクテリオシンについてコードする遺伝子は、塩基３７５から塩基５３６までで ある。本推定免疫ファクターについてコードする遺伝子は、異なるリーディング フレーム内の塩基５５４から塩基８４７までである。三つの推定プロモーターは 、領域−３５および一１ＯにおいてＰｌ、Ｐ２およびＰ３として示されており、 リポソーム結合部位はＲＢＳとして示されている。

本発明のもう一つの態様によれば、それぞれ本バクテリオシンおよび本免疫ファ クターについてコードするＤＮＡが提供される。請求の範囲第１項に記載のアミ ノ酸シークエンス全体および／または本ブローバクテリオシンについてコードす るＤＮＡシークエンスの知識は、本成熟バタテリオシンについてコードする最初 のコドンの位置の指示を与えないことが認められる。

従って、本発明は、図１に示すＤＮＡシークエンスだけでなく、コードの縮重に よって当該タンパク質についてもコードすることができるシーフェンスをも包含 する。

本発明はまた、本成熟物バクテリオシンおよび／または本免疫ファクターについ てコードするＤＮＡを含有するクローニングベクターおよび発現ベクターも包含 する。Ｌ、　１ａｃｔｉｓに適する発現ベクターが特に好ましい。

さらに本発明は、このようなベクターで形質転換されたし。

１ａｃｔｉｓの株も包含する。

本発明の免疫ファクターは、１．１ａｃｔｉｓバクテリオシンの作用の除去、例 えば本発明のバクテリオシンの作用の抑制に用いることができる。

本免疫ファクターについてコードする遺伝子は、食品グレードのクローニングベ クターを以後に構築する際に、例えば抗生物質の代わりに選択的マーカーとして 使用できる。

図１に示すオペロンは、Ｌ、　１ａｃｔｉｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓのフラグメント 化プラスミドＤＮＡから、図１に示すＤＮＡストランドの成熟バクテリオシンを コードする部分に対応する非コードＤＮＡストランドの全部または一部を含むプ ローブを用いて得られた。本成熟バクテリオシンまたは本免疫ファクターについ てコードするＤＮＡは、増幅用の任意の従来のクローニングベクターに、および り、　Ｉａｃｔｉｓのようなホスト微生物の形質転換用発現ベクターに、例えば クローニングベクターｐ　Ｉ　Ｌ　２５３　（Ａ、Ｃｈｏｐｉｎ、　Ｂｉｏｃｈ ｉｍｅ　７０．１９８８．５９−５６６　）に挿入することかできる。好適な培 養条件下で生育させると、生育培地中に本バクテリオシンか産生され、この培地 から前記文献の教示により本バクテリオシンを単離することができる。

る改良株を与えるために必要なりＮＡシークエンスを含有するプラスミドまたは 他のベクターの多重コピーで形質転換することができる。このような改良株は、 より速い溶菌を与えるので、チーズ製造に用いると、チーズの熟成が促進される 。特に、本バクテリオシンを産生じ、従って耐性遺伝子をも担持している１、　 １ａｃｔｉｓの株が、ベクターのこのような多重コピーで得ることができる。従 ってこの株は、本バクテリオシンにより成熟前に分解することなしに増殖できる 。

新規なバクテリオシンは、化学的合成により、例えば固相合成を用いて、有利に は市場で入手できるポリペプチド合成装置を用いて製造することができる。この ような合成において、それぞれのアミノ酸の活性側鎖基（例えばアミノ基または カルボキシル基）は保護され、最終工程で保護基は脱離され、および／または合 成中にポリペプチドが結合していた不活性支持体から除去される。

ペプチド鎖の増成に際しては、Ｃ末端開始操作が一般に用いられるが、原則とし てはＣ末端またはＮ末端のいずれかから開始できる。

従って、例えばヒスチジンの好適な誘導体を、ロイシンの保護された好適な誘導 体と反応させることにより、Ｃ末端から開始することかできる。ヒスチジン誘導 体は遊離α−アミノ基を有する一方で、他方の反応関与体は、遊離または活性化 カルボキシル基と、保護アミノ基とを有する。カップリングの後、中間体を例え ばクロマトグラフィーにより精製することができ、次いでもう一つのＮ−保護か つ遊離または活性化アミノ酸残基の付加を可能にするために、選択的にＮ−脱保 護することができる。この操作を、必要なアミノ酸シークエンスが完結するまで 続ける。

使用できるカルボン酸活性化置換基としては、例えば対称または混合無水物、あ るいは活性化エステル、例えばｐ−ニトロフェニルエステル、２，４，５．−ト リクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒト七キシベンゾトリアゾールエステル（ＯＢ ｔ　）、Ｎ−ヒト七キシサクシンイミジルエステル（Ｏ３ｕ　）　、またはペン タフルオロフェニルエステル（ＯＦＦＰ）が挙げられる。

遊離のアミノ基とカルボキシル基とのカップリングは、例えばシンクロヘキシル カルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて行うことができる。

使用てきる他のカップリング剤としては、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキ シ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）が挙げられる。

一般に、カップリング反応は、低温例えば−２０℃から常温で、有利には好適な 溶剤系、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、塩化 メチレンまたはこれらの溶剤の混合物の中で行うことか好ましい。

合成を固相樹脂支持体上で行うことがさらに有利なことかある。

クロロメチル化ポリスチレン（ジビニルベンゼン１％で架橋）は有用な型の支持 体の−ってあり、この場合、例えばＮ−保護ヒスチジンを支持体にカップリング させることにより、Ｃ末端から合成を開始する。

多くの好適な固相技術は、次の文献に記載されている。Ｅｒ１ｃＡｔｈｒｅｔｏ ｎ　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｙｅｒ　Ｊ、　ｌｏｎｇａｎ　ａｎｄ　Ｒｏｖｅｒｔ　Ｃ ，５ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　１．５３８−４６　（１９８１）；　Ｊ ａｍｅｓ　Ｐ、　Ｔａｍ、　Ｆｏｅ　Ｓ。

Ｔｊｏｅｋｉｎ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＪＪ、Ｃｈｅ ｍ、　Ｓｏｃ、　１０２．６１１７−２７（１９８０）；　Ｊａｍｅｓ　Ｐ、Ｔ ａｍ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｄ、Ｄｉｍａｒｃｈｉ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ。

Ｍｅｒｒｉｆｉ６１ｄ　１ｎｊ１．　Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ ｅｓ、１６．　４１２−２５（１９８０）；　Ｍａｎｆｒｅｄ　Ｍｕｔｔｅｒ　 ａｎｄ　Ｄｉｅｔｅｒ　Ｂｅ１ｌｏｆ、Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　ＣｈｉｍｉｃａＡ Ｃｔａ　６７、２００９”１６　（１９８４）。

アミノ酸の保護基は広範囲のものから選択できることが知られており、例えば次 の文献か挙げられる。５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｌｕｅｂｋｅ。

Ｋ、、　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖｏｌｓ、　１　ａｎｄ　２．　Ａｃａ ｄｅｒｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ、１９６ ５　ａｎｄ　１９６６；　Ｐｅｔｔｉｔ、Ｇ、Ｒ，、５ｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐ ｔｉｄｅｓ、　Ｖａｔｓ、　ｌ−４，Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄ、　Ｒｅ１ｎｈ ｏｌｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７０゜１９７１、１９７５　ａｎｄ　１９ ７６；　Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉ ｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ、　５ｙｎｔｈｅｓｅ　ｖｏｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｎ、　 Ｂａｎｄ　１５．　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　ＶｅｒｌａｇＳｔｕｔｔｇａｒ ｔ、　ＮＹ、　１９８３；　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ、 　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉ−７，Ｅｄ：　Ｅｒｈａｒｄ　Ｇｒｏｓｓ、Ｊｏｈａｎｎｅ ｓ　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ；　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　 ２ｎｄ　ｅｄ、、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、　Ｓｔｅｗａｅｔ、　Ｊａｎｉｓ　Ｄ、　Ｙ ｏｕｎｇ。

Ｐｉｅｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ従って使用できるアミン保護基 としては、例えばカルボベンゾキシ（Ｚ−）、ｔ−ブトキシなボニル（Ｂｏｃ− ）　、４−メトキシ−２，３，６゜−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ− ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ−）が挙げられる。Ｃ 末端からペプチドを増成する場合、付加したそれぞれ新しい残基のα−アミノ基 にアミン保護基が存在しており、次のカップリング工程の前に選択的に除去する 必要がある。このような一時的なアミン保護に特に有用な基は、育種溶剤中のピ ペリジンで処理することにより選択的に除去ＣきるＦｍｏｃ基である。。

用いられるカルボキシル保護基どしては、例えば解裂か容易なエステル基、例え ばべ］、・ジル（−０ＢＺＩ　）　、ｐ−二１・１コベ゛５・ジル（−〇ＮＢ） またはｔ−ブチル（−ｔＯＢｕ　）　、並びに固体支持体へのカップリング、例 えばポリスチレンに結合したメチル基か挙げられる。

例えば前記の文献に詳述されたよ−）な他の広範囲な基かあり、このような全て の基を前記の方法に使用することは、本発明の範囲に含まれる。

アミンおよびカルボキシル保護基を除去するための広範囲な操作法がある。しか しこれらの操作法は、採用される合成戦略と調和し７なければならない。側鎖保 護基は、次のカップリングの前に一時的α−アミノ保護基を除去するために用い られる条件に対し７て安定であるべきである。

Ｂｏｃなとのアミン保護基およびｔＯＢｕなとのカルボキシル保護基は、酸処理 、例えばトリフルオロ酢酸での処理により、同時に除去することかできる。ペプ チド鎖の増成に際しては、Ｃ末端開始操作が一般に用いられるか、原則としては Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから開始できる。

従って、例えばヒスチジンの好適な誘導体を、ロイシンの保護された好適な誘導 体と反応させることにより、Ｃ末端から開始することかできる。ヒスチジン誘導 体は遊離α−アミノ基を有する一方で、他方の反応関与体は、遊離または活性化 カルボキシル基と、保護アミノ基とを有する。カップリングの後、中間体を例え ばクロマトグラフィーにより精製することができ、次いでもう一つのＮ−保護が −）遊離または活性化アミノ酸残基の付加を可能にするために、選択的にＮ−脱 保護することかできる。この操作を、必要なアミノ酸シークエンスか完結するま で続ける。

使用できるカルボン酸活性化置換基としては、例ズば対称または混合無水物、あ るいは活性化エステル、例えばｐ−ニトロフェニルエステル、２．４．５．−１ −リクロロフェニルエステル、Ｎ−ヒＩ・ロキンベンゾトリアゾールエステル（ ＯＢｔ　）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステル（Ｏ３ｕ　）　、または ペンタフルオロフェニルエステル（ＯＰＦＰ）か挙げられる。

遊離のアミノ基とカルボキシル基とのカップリングは、例えばジシクロへキシル カルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて行うことかできる。

使用できる他のカップリング剤としては、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキ シ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）が挙げられる。

一般に、カップリング反応は、低温例えば−２０″Ｃから常温で、有利には好適 な溶剤系、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、塩 化メチレンまたはこれらの溶剤の混合物の中で行うことが好ましい。

合成を固相樹脂支持体上で行うことかさらに有利なことかある。

クロロメチル化ポリスチレン（ジビニルベンゼン１％で架橋）は有用な型の支持 体の−っであり、この場合、例えばＮ−保護ヒスチジンを支持体にカップリング させることにより、Ｃ−末端から合成を開始する。

多くの好適な固相技術は、次の文献に記載されている。Ｅｒ１ｃＡｔｈｒｅｔｏ ｎ　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｙｅｒ　Ｊ、　ｌｏｎｇａｎ　ａｎｄ　Ｒｏｖｅｒｔ　Ｃ ，５ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｉ、　５３８−４６　（１９８１）；　 Ｊａｍｅｓ　Ｐ、　Ｔａｍ、　Ｆｏｅ　Ｓ。

Ｔｊｏｅｋｉｎ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａ、Ｃｈ ｅｍ、　Ｓｏｅ、　１０２．６１１７−２７（１９８０）；　Ｊａｍｅｓ　Ｐ、 　Ｔａｍ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｄ、　Ｄｉｍａｒｃｈｉ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　［ｎｔ、、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｒｅｓ、１６．４１２−２５（１９８０）；　Ｍａｎｆｒｅｄ　Ｍｕｔｔｅｒ　 ａｎｄ　Ｄｉｅｔｅｒ　Ｂｅ１ｌｏｆ、　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ　６７、２００９−１６　（１９８４）。

アミノ酸の保護基は広範囲のものから選択できることか知られており、例えば次 の文献か挙げられる。５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｌｕｅｂｋｅ。

Ｋ、、　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖｏｌｓ、　１　ａｎｄ　２．　Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ、１９６５ 　ａｎｄ　１９６６；　Ｐｅｔｔｉｔ、Ｇ、Ｒ，、５ｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔ ｉｄｅｓ、Ｖｏｌｓ、　１−４．　Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄ、Ｒｅ１ｎｈｏｌ ｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７０゜１９７１、　１９７５　ａｎｄ　＋９７６ ；　Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｅｈ ｅｎＣｈｅｍｉｅ、５ｙｎｔｈｅｓｅ　ｖａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｎ、Ｂａｎｄ　 １５．　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　ＶｅｒｌａｇＳｔｕｔｔｇａｒｔ、　ＮＹ 、　１９８３；　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　ｌ−７，Ｅｄ：　Ｅｒｈａｒｄ　Ｇｒｏｓｓ、Ｊｏｈａｎｎｅ ｓ　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ；　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　 ２ｎｄ　ｅｄ、、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、　Ｓｔｅｗａｅｔ、　Ｊａｎｉｓ　Ｄ、　Ｙ ｏｕｎｇ。

Ｐｉｅｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ従って使用できるアミン保護基 としては、例えばカルボベンゾキシ（Ｚ−）、ｔ−ブトキシカポニル（Ｂｏｃ− ）　、４−メトキシ−２，３，６゜−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ） および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ−）か挙げられる。Ｃ− 末端からペプチドを増成する場合、付加したそれぞれ新しい残基のα−アミノ基 にアミン保護基か存在しており、次のカップリング工程の前に選択的に除去する 必要がある。このような一時的なアミン保護に特に有用な基は、有機溶剤中のピ ペリジンで処理することにより選択的に除去できるＦｍｏｃ基である。

用いられるカルボキシル保護基としては、例えば解裂か容易なエステル基、例え ばベンジル（−０ＢＺＩ　）　、りｍ；トロベンジル（−〇ＮＢ）またはｔ−ブ チル（−ｔＯＢｕ　）　、並びに固体支持体へのカップリング、例えばポリスチ レンに結合したメチル基が挙げられる。

例えば前記の文献に詳述されたような他の広範囲な基があり、このような全ての 基を前記の方法に使用することは、本発明の範囲に含まれる。

アミンおよびカルボキシル保護基を除去するための広範囲な操作法かある。しか しこれらの操作法は、採用される合成戦略とＭ和しなければならない。側鎖保護 基は、次のカップリングの前に一時的α−アミノ保護基を除去するために用いら れる条件に対して安定であるべきである。

Ｂｏｃなとのアミン保護基およびｔＯＢｕなどのカルボキシル保護基は、酸処理 、例えばトリフルオロ酢酸での処理により、同時に除去することができる。

下記の実施例は説明としてのみ挙げられる。

実施例１ 細菌株、培地、プラスミドおよび酵素。用いられた細菌株、プラスミドおよびフ ァージは、表１に挙げられている。全ての１ａｃｔＯｃＯｃｃａ１株は、Ｍ１７ ブロス（４４）中で培養され、１０％のグリセロールを含むＭ１７ブロス中、− ８０°Ｃて凍結ストックとして保存された。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ 　ＤＨ５ａが、ｐＵｃ１８およびその誘導体の増殖に用いられた。Ｍ１３ベクタ ーおよびそのクローンは、制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼおよびＤＮＡ分子量標準試料は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　 Ｒｅ５ｅｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕ ｒｇ、　Ｍｄ、）より購入した。ウシ腸アルカリフォスファターゼ、シークエン スゲレードのトリプシンおよびエンドプロテアーゼｇｌｕ−Ｃは、Ｂｏｅｈｒｉ ｈｇｅｒ　ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。シークエナーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）は、Ｕ ｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　（Ｃ１ｅｖｅ ｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）より購入した。

プラスミドキユアリングａ　Ｌ、１ａｃｊｌｓ　５ｕｂｓｐ、　ＣｒｅｍＯｒｌ Ｓ　ＬＭＧ　２１３０を、１ｍｌ当り０．１Ｍｇのノボビオシンの存在下、３８ ℃で、１％のグルコースを含むＭ１７ブロス中で生長させた。この培養物の希釈 アリコートを、Ｍ１７ブロスー１％グルコースプレートに拡散させ、３０°Ｃて 培養した。コロニーが、バクテリオシン生成の評画として数えられた。

バクテリオシンアッセイ。バクテリオシンの活性を決定するために、３つの方法 が用いられた。（ｉ）バクテリオシン生成可能な細菌のコロニーを一昼夜寒天プ レート上で生長させた。指標微生物の新鮮培養物１００μｍを含みＭ１７軟質寒 天（０，７％）３ｍｌに相当するローン（ｌａｗｎ）を、プレート上に注いだ。

３０°Ｃて一昼夜培養した後、生長阻害区域の評価として、コロニーを調査した 。

（ｉｉ）Ｍ１７軟質寒天中に、直径４ｍｍのウェルを形成し、バクテリオシンの 溶液で満たした。液体がゲルに完全に吸収された後、指標微生物を含むＭ１７軟 質寒天をこのプレート上に乗せ、上述したようにバクテリオシンの活性を示させ た。（ｉｉｉ）バクテリオシンの活性を、Ｇｅ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１５）に よって開示された方法で定量した。ただし、ここでは２００μｌのＭ１７ブロス を含むウェルを有するマイクロタイタープレートか用いられた。バクテリオシン 活性の１単位（ＢＵ）は、このアッセイにおけるり、　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓ ｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ＩＭＮＣ１８の５０％生長阻害（バクテリオシンを含 まない対照試料の５０％の混濁度）を生じさせるのに必要な量として定義した。

表　１　実施例で用いられた細菌株、プラスミドおよびファージ細菌株 ｐＯＮ　ｌ　ｌｔｎ＾を含む４−ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［１本実施例フラグメントを 有するｐＵｃ１８ ｐＯＮ　２１ｃｎ＾を含むＪ−ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　本実施例フラグメントを 有するｐＵｃＩ８＋　：　ｐｌＬ　２５３ｐｏｌｆ　Ｔ　ｌｃｎ＾を含む１．２ −ｋｂ　Ｒ＋ｌ１−Ｈｉｎｄｎ［本実施例フラグメントを有するｐＨｃ１８・： 　ｐｌＬ　２５３ＬＣＮ−Ａの精製。Ｌ、　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　ｃｒ ｅｍｏｒｉｓ　ＬＭＧ　２１３０の培養物１リツトルから、バクテリオシンを精 製した。様々な工程は、特に指示しない限り４°Ｃで行われた。細胞を、初期定 常期まで生長させ、この細菌は１０分間、１０，０００Ｘｇの遠心分離によって 除かれた。１リツトル当たり２８０ｇの硫酸アンモニウムを加えて、培養上澄み よりバクテリオシンを沈澱させた。３０分間、ｌ０１０００×ｇで遠心分離を行 った後、ペレットを水に溶解し、０．５ＭのＮａｔＨＰ○４を加えて、ｐＨ７， ３に調節した。この溶液を、ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，３）で平衡化さ れた１０ｍ１のセファ０−ス力ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｕｐｐｓａｌａ、　 Ｓｗｅｄｅｎ）に供給した。このカラムを４０ｍ１の２０ｍＭリン酸ナトリウム （ｐＨ７，３）で洗浄し、次いで０．３ＭのＮａＣ１を含む同じ緩衝液２０ｍ１ でバクテリオシンを溶離させた。バクテリオシンを、高速タンパク質溶液クロマ トクラフィー装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、逆相クロマトグラフィーに かけた。陽イオン交換体からの溶離物を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７ ，３）で平衡化された１ｍｌのフェニルスペロースカラム（Ｐｈｅｎｙｌ−３ｕ ｐｅｒｏｓｅ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供給した。１０ｍＭのリン酸ナトリウ ム（ｐＨ７，３）で洗浄した後、流速０．３ｍ１／分で、エタノール濃度を線型 的に０〜６０％の間で変化させて溶離を行った。精製したＬＣＮ−Ａは、６０％ エタノール−２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，３）中、−２０°Ｃて貯蔵し た。タンパク質濃度は、分光光度計によって、２ａｏｎｍて測定した。

アミノ酸の一次構造。アミノ酸の一次構造決定に、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　Ｃａ１ｉｆ、　）　４７７　Ａシクエンサ ーを用いた。

フェニルヂオヒダントインー誘導アミノ酸残基は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ ｔｅ＋ｎｓ　ｌ　２０フ工ニルチオヒダントイン分析器によ−）で自動的に測定 した。シーフェンスのＣ末端部分は、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｇａ１ｉａ ｎ（３）に開示されるように、Ａｓｎ−ＧＩＮ’結合をｐＨ９にてヒト冶ギシル アミンを用いて切断した後に得られた。

ＤＮＡ０単離、分析および操作。Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ　（２３）に開示され るスミドＤＮＡを調製した。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（２５）に開示 されるアルカリ開裂法によって、Ｅ、　ｃｏｌｉから大きい方のプラスミドを単 離した。上述（２ａ）　Ｌ、たように感染した１、５ｍｌの培養物から、シーフ ェンス決定のためのＭ１３プラス−ストランドＤＮＡ鋳型を調製した。

ＤＮＡ操作用酵素を、メーカー取扱書に従って用いた。クローニングに用いられ たＬＭｏ　２１３０株からのプラスミドＤＮＡを、ＣｓＣｌ等密度遠心法（３３ ）によって精製した。

クローニングに適した制限フラグメントを単離し、Ｇｅｎｅ−Ｃ１ｅａｎを用い て０．７％寒天から精製した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ、中でクローン化されたＤＮＡを、以下に示すように、１ａｃｔ ｏｃｏｅｃｉ中て継代クローン化した。挿入ＤＮＡを有するｐＵｃ１８プラスミ ドは、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ消化反応およびＤＮＡ連結反応によって、ｐｌＬ２５ ３に融合された。得られた生成物を、Ｌｃｏｌｉ、中に形質転換した。クローン は、エリスロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）耐性およびアンピシリン（５００μ ｇ／ｍｌ）耐性の選択性によって得られた。クロー：／から抽出されたプラスミ ドＤＮＡは、Ｈｏ１ｅ　ａｎｄＮｅｓ　（２０）に開示された工１．・りトロボ レーション（ｅｌｅｅｔｒｏｐｏｒａｔ　１ｏｎ）によ・・）て１ａｅｔｏｃｏ ｃｃｉを形質転換させるために用核酸ハイブリダイゼーションおよびヌクレオチ ドシーフェンシング。Ｌ　ＣＮ−Ａのアミノ酸２５から続くシーフェンスに基づ いて、以下のような６４倍−変性合成オリゴデオキシヌクレオチドプローブを調 製した（Ａｐｌ）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８１ＡＤＮＡシンセサイザ ーを用いた）。３’　−ＡＴＩＧＴ　（Ｔ／Ｃ）ＧＴ　（Ｔ／Ｃ）ＴＧ　（Ｉ／ Ｃ）ＴＧ　（Ｔ／Ｃ）ＴＴＩＣＧ　（Ｉ／Ｃ）ＡＡＩＣＣ−５’。

Ｈａｎａｈａｎ　ａｎｄ　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　（１８）に開示されるように、コ ロニーハイブリダイゼーションを行った。エンドヌクレアーゼで消化したＤＮＡ （０，７％寒天で分別）をＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓメンプランｘ　（Ｎ ＥＮＲｅｓｅｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　 Ｍａｓｓ、）　ヘ真空移動（Ｖａｃｕｇｅｎｅ；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）させる ことにより、サザンプロット法（４２）を行い、Ｃｈｕｒｃｈ　ａｎｄ　Ｇ１１ ｂｅｒｔ　（７）に開示されるように、２６１体オリゴデオキシヌクレオチドで ハイブリダイゼーションを行った。Ｍ１３ｍｐ　１８およびＭ１３ｍｐ１９中で クローン化された制限フラグメントに対して、デオキシヌクレオチド法（３７） によるヌクレオチドシーフェンシングを行った。標識には、［α−”Ｓ］ｄＡＴ Ｐ　（６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｌｌｎｉｔｅｄ　Ｋｎｇｄｏｍ）が用いられた。

ヌクレオチドシーフェンスの受託番号。本明細書に示されるヌクＬノオチドシー クエンスは、ＥＭＢＬ受託番号Ｍ６３６７５として認定されている。

培　養　−ヒ　澄　み　１．０００　＋４．６　１５　１０２．８　１　１００ １７培地中での生長の間、本質的にバクテリオシンを生成することが認められた 。培養物上澄みからバクテリオシンを精製する方法を開発した。精製スキームを 表２に示す。このタンパク質は、アミノ酸シークエンス分析で判定して、約９５ ％の純度であった。精製バクテリオシンのアミノ酸シークエンスは、上述した通 りである。このバクテリオシンは５４個のアミノ酸残基を含み、５．７７８の計 算分子量を有することが認められた。この分子量は、質量分析によって確認され ており、これは実質的にグリコレ−ジョンあるいはメチレーションかないことを 示している。５ｗ１ｓｓ−ＰｒｏｔあるいはＮＢＲＦデータベースにおけるとの タンパク質あるいは推定遺伝子生成物とも、有為なシーフェンス類似性は認めら れなかった。

本発明者らは、この新規バクテリオシンをＬＣＮ−Ａと命名した。

このタンパク質は、アラニン残基（５４個中８個）およびグリシン残基（５４個 中８個）か多く、荷電アミノ酸残基をたった３個しか含んでいない。このバクテ リオシンの計算上の等電点は９．２であった。２８０ｎｍでのＬＣＮ−Ａの消光 係数は、そのトリプトファンおよびチロシンの含有量から計算して、１．’　２ Ｘ１０’　ｃｍ−’Ｍ−１であった（４）。従って、精製ＬＣＮ−Ａは約４．９ ＸＩＯ５ＢＵ／ｍｇの比活性を有していた。精製の間にＬＣＮ−Ａの活性が低下 しないと考えれば、ＬＭ０２１３０株は、１リツトル当たり３ｍｇン（ｄｉｐｐ ｌｏｃｏｃｅｉｎ）を生産したことが認められた（ｌＯ）。この精製バクテリオ シンは、水に余り溶解しなかった。４°Ｃで水性緩衝液中に貯蔵すると、このバ クテリオシンは不活性な沈澱を形成した。しかしながら、精製ＬＣＮ−Ａは、検 出しうる程度の活性低下を伴わずに、２．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，３ ）を含む６０％エタノール中、−２０°Ｃで６力月以上貯蔵することができた。

プロテアーゼの効果。ＬＣＮ−Ａは、高特異的エンドプロテアーゼｇｌａ−Ｃお よびトリプシン等の種々のプロテアーゼに接触させることで、その活性を失った 。リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，８）中で、エンドプロテアーゼｇｌｕ−Ｃは、アミ ノ酸残基１２　（Ａｓｐ）と１３（Ｌｅｕ）の間の１つの部位でこのバクテリオ シンを切断することができ、トリプシンはこのバクテリオシンを、２つの分解性 残基（ｌおよび２１）のカルボキシル基において切断することかできた。

阻害スペクトルおよび作用形態。寒天拡散アッセイにより、１２０株以上のり、 　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓおよびり、　１ａｃｔｉｓ　５ｕ ｂｓｐ。

受性味は、このバクテリオシンによって急速に殺菌された。指数関数的に生長す るｒＭＮ　Ｃ２８の培養株生存数は、３０℃のＭ１７培地中２００ＢＵ／ｍｌ　 （のバクテリオシン）に５分間さらした後、２Ｘ１０”ｌ／ｍｌから減少した。

表　３：　ＬＣＮ−Ａに対するＩ＆ｃｌａｃｃｏｃｕ属菌株の感受性工ＭＮ　Ｃ １８５ ＬＭＧ　２１４１　１，００Ｏ ＮＣＤＯ６０７１，３ ＮＣＤＯ９２４１，００Ｏ ＮＣＤＯ１１９８０，４ ＢＣ１０１５０ ＢＣ１０１（ｐＯＮ２）　５，０００ ＢＣ１０１（ｐＯＮ７）　５，０００ シュ剋１誌５ｕｂｓｐ、　暉にツ５ ＮＣＤＯ６０４３０ 工Ｌ　１４０コ　０＋４ 工Ｌ　１４０３（ｐＯＮ２）　１，５００工Ｌ　１４０コ（ｐＯＮ７）　１，５ ０ＯＮＣＤＯ１７６（ｂｉｏｖａｒ　ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）　２０Ｌ旦 肛ジ旦鯨ＮＣＤ０２１５５　５，０００表３は、種々のｔａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ 属菌株のＬＣＮ−Ａに対する感受性を示している。感受性には大きなばらつきが 認められた。試験された中で最も感受性の高い株は、Ｍ１７ブロス中よりも乳汁 ブロス中で生長させた場合に、バクテリオシンに対してより高い感受性を示すよ うであった（１４）、、乳汁ブロスでは、計算上のＬＣＮ−Ａ濃度４０ｐｇ／ｍ ｌまたは７ｐＭで、ＮＣＤ０ＩＩ９８株の５０％生長阻害が観察された。この量 は、アッセイにおけるＣＰＵ当たり４００分子のＬＣＮ−Ａに相当する。

試験された株の内、２つだけ、即ちバクテリオシン生産株（１ＭＧ２１３０）自 体と、Ｌ、１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ　ｂｉｏｖａｒ　ｄｉａ ｃｅｔｙｌａｃｔｉｓＮ［ＺＯ４−２５が耐性であった。しかしながらこの後者 の株は、バクテリオシンを産生じないことがわかった。試験されたナイシン産生 株ＬＣＮ−Ａに感受性であり、１ＭＧ２１３０に対して阻害的であり、更に、こ のバクテリオシンは、１．　ｇａｒｖｉａｓｅ　ＮＣＤ０２１５５の弱い阻害効 果を示した（表３）。

ＬＣＮ−Ａの遺伝的決定因子の同定およびクローニング。ＬＣＮ−へのアミノ酸 シークエンスに基づくオリゴデオキシヌクレオチドプローブが、サザンハイプリ ダイゼーション分析において、遺伝子を特定するために用いられた。ＬＮＧ２１ ３０株からのプラスミドＤＮＡが探知されたとき、５５−ｋｂプラスミドに対応 する１つのシグナルが観察された。ＬＭ０２１３０株はプラスミドキユアリング に付された。ＬＮＧ−Ａを産生じなかったｌっの単離集団、即ちＬＭＧ２１３１ は、５５−ｋｂプラスミドを喪失し、サザンプロットでシグナルを与えないこと が判明した。さらに、ＬＭＧｌ　３０プラスミドＤＮＡ消化物のサザン分析は、 ４−ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、１．２−ｋｂのＨｉｎｄｌＩ　Ｉ−Ｒ ｓａ１７ラグメントおよび０．６−ｋｂのＤｒａＩフラグメントからのシグナル を現した。Ｈｉｎｄ−ＩＩＩて消化されたＬＭＧ２１３０プラスミドＤＮＡの４ −ｋｂフラクションは、ｐＵＣｌ　８を用いてベクターとしてのＥ、ｃｏｌｉ中 てクローン化した。１，４００個のクローンの内１０個か、オリゴヌクレオチド プローブによるスクリーニングで陽性であることか判明した。これら１０個のク ローンの１つからの組み換えプラスミド（ｐＯＮｌ）を、ＤｒａｌおよびＲｓａ Ｉてさらに制限消化した。プローブにハイブリッド形成したフラグメント、即ち ４−ｋｂのＨｉｎｄＩＴＴフラグメント、１．２−ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−Ｒｓ ａｌフラグメントおよび０．６−ｋｂのＤｒａｌフラグメントは、Ｍ１３Ｍｐ１ ８およびＭｌ　３ｍｐ　１９中に継代クローン化し、両方のオリエンテーション の挿入物を生産した。

１ｃｎＡのヌクレオチドシーフェンスｏ　Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−Ｒ５ａｌフラ グメントのシーフェンスを決定した。６２５および２９２ヌクレオチドの２つの 連続するＤｒａｌフラグメントのヌクレオチドシーフェンスを図１に示す。１ｃ ｎＡ遺伝子の全体か、０．　６−ｋｂのＤｒａｌフラグメントとともに含まれて いた。６つの可能なオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）のコンピュータ 解析から、ＤＮＡストランドの１つだけに長い０ＲＦｓが判明した。５４個のア ミノ酸残基からなる成熟ＬＣＮ−Ａは、ヌクレオチド位置３１６〜４７７からの ＤＮＡセグメントによりコード化された。唯一可能性の合成されたことを意味し ている。開始コドンは、可能なＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏシークエンス３’ 　ＡＧＧＡＧＡ５’　に先行される（４０）。３つの推定されるプロモータ要素 （全てＥ、　ｃｏｌｉσ７０コンセンサスおよび５ｔｒｅｐｔｃｏｃｃａｔプロ モータに対してかなりの類似性を示す）は、このリポソーム結合部位（ＲＢＳ） の直ぐ上流位置に発見された（図２）（２７，３５）。

１ｃｎＡの下流側には、第二のＯＲＦ、即ち０ＲＦ２が発見された。ヌクレオチ ド位置４９５のＡＴＧに翻訳開始部位があると仮定すると、このＯＦＲは９８ア ミノ酸ポリペプチドをコードする。可能なＲＢＳシークエンス、即ち５°　ＧＡ ＧＧＡＴＴＧＡ３’　は、Ｍｅｔコドンから７個のヌクレオチドに現れた。２つ の２回対称軸領域のヌクレオチド位置８０３および８９６から延びる０ＲＦ２の 下ステムーループ構造から形成することができた（４５）。それらの遠いステム のウリジン含有量は、これら構造が１ｃｎＡ転写のＲｈｏ−非依存性ターミネー タ−を構成することを示唆している。推定タミネーターシークエンスまたはプロ モーターシーフェンスは、ＩｃｎＡと０ＲＦ２との間には認められず、このこと は、１ｃｎＡと０ＲＦ２とがオペロンを構成しているであろうことを示している 。

ＥＭＢＬデータベースのどのＤＮＡシークエンスも、本発明のＤＮＡシークエン スと高度のＤＮＡ相同性を示さなかった。このデータベースにおいて最も近かっ たのは、１２２”概しシークエンスに対して５７．４％同一であった。

Ｌ、　１ａｃｔｉｓ中でのクローニング。ＩｃｎＡ遺伝子をり、１ａｃｔｉｓ中 でクローニングした。４−ｋｂのＨｉｎｄｌｒｌフラグメントと、１２−ｋｂの Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−Ｒ５ａ　１フラグメントとを育するＰＩＬ、２５３　： 　：ｐＵＣ１８構造は、各々ｐＯＮ２およびｐＯＮ７とじさせなかった。しかし ながら、ＢＣ１０１中にある場合、ｐＯＮ２およびｐＯＮ７の両者は、ＬＣＮ− Ａに対する耐性を与えた。いずれのプラスミドにあっても、５０％生長阻害を起 こすＬＣＮ−Ａ濃度は、５０から５，０ＯＯＢＵ／ｍｌに増加した（表３）。こ の結果は、クローニングベクターのみを含む形質転換体に見られなかった。

同様の結果は、Ｌ、　１ａｃｔｉｓの他の株にも観察された（データは示されて いない）。試験された株の内、１ｃｎＡ遺伝子による形質転換ＣＮ−Ａ産生株で あるＬＭＧ２１３０は、１，５００ＢＵ／ｍｌを産生じた。

Ｔ、、ＣＮ−Ａに対する感受性は、Ｌ、　１ａｃｔｉｓ株の間で一般的であるよ ってある。このバクテリオシンは、非常に特異的であるため、Ｌ。

１ａｃｔｉｓ株の同定に用いる。二とができる。ＬＣＮ−Ａは疎水性タンパク質 である。この疎水特性は、ｐｈｅｎｙｌ−ｓｕｐｅｒｏｓｅに対する高い親和性 によって示された。このマトリックスは、疎水的相互作用クロマトグラフィーに 用いるためのものであり、殆どのタンパク質は高い塩濃度の場合にのみこれに結 合する。Ｉ、ＣＮ−Ａは、塩がなくてもこのカラムに結合し、水よりも極性が低 い溶媒によってのみ、活性バクテリオシンとして溶離させることができた。

ナイシンの毒性効果は、細胞質膜に小孔を形成するその能力に帰されている（３ ６）。ＬＣＮ−Ａの疎水特性は、細胞質膜がこのバクテリオシンの標的となるこ とかあるということを示唆している。Ｒａ。

およびＡｒｇｏｓ　（３４）が開示したような計算によって、ＬＣＮ−Ａのアミ ノ酸３０〜５２の範囲が膜をつなぐ螺旋（ｍｅ＋＋＋ｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉ ｎｇｈｅｌｉｘ）を形成することができるということが予想される（データは示 されていない）。ＬＣＮ−Ａが膜に作用するという考えは、このバクテリオシン か、高張シュークロース含有媒体中でさえ細胞内成分の漏れを発生させるという 発見からも更に支持される（未公開データ）。

分泌されたタンパク質は、通常は、シグナルペプチドと呼ばれる短いＮ−末端部 分を存する前駆体として合成され、この部分は分泌を促進するとともに特定の酵 素によって取り除かれる（１．４３．４９゜５０、５２）。成熟ＬＣＮ−Ａのた めの遺伝子由来シーフェンスと直接のアミノ酸シークエンスデータとの比較は、 Ｌ　ＣＮ　−Ａか７５アミノ酸前駆体として合成されることを示す。２１個のア ミノ酸からなるＬＣＮ−Ａリーダーペプチドは、正に荷電されたＮ末端を存し、 続いてダラム陽性菌のシグナルペプチドとして典型的な疎水性範囲（ｓｔｒｅｔ ｃｈ）を存している（１）。成熟１、ＣＮ−Ａは、そのＮ−末端アミノ酸として リジンを有している。ＬＣＮ−Ａ前駆体では、二のリジンにＡ　１　ａ−Ａｓ　 ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙシーフェンスか先行し７ている。Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊ ｎｅ（４９，５０）の“−３，−１”則によれば、シグナルペプチダーセは２つ のグリシン（−２，−１）間を切断できるが、グリシンとリシン（−１，＋１） 間を切断することはできない。この理論は、先ず２０アミノ酸ペプチドか、次い てグリシンがＮ末端から取り除かれ、５４個のアミノ酸からなる成熟ＬＣＮ−Ａ が産出されるという段階的プロセラソングを示唆するかもしれない。

推定プロモーター要素は、１ｃｎＡ遺伝子の直ぐ上流に発見された（図１）。た ぶん、転写開始は、推定ブリブナウ（Ｐｒｉｂ口ＯＷ）ボックスの下流５〜９の ヌクレオチドで起こり、１７〜３３のヌクレオチドのリーダーを生成するであろ う。推定プロモーター要素の一１０領域の重なりは、ステム−ループ構造を取り 得る逆繰り返しシーフェンスである（図１）。この構造は、−９，６ｋｃａｌ／ ｍ。

］、（−４０，２ｋＪ／ｍｏ　ｌ）　（４５）の計算上のΔＧを存しており、０ ＲＦ１のＲｈｏ−非依存性ターミネータ−を示すてあろう。

ＩｃｎＡ遺伝子を喪失したＬＭＧ３１２１株は、Ｌ　ＣＮ−Ａに感受性であった 。この結果は、産生機構かバクテリオシンに対する免疫性をコードする遺伝子を 隠していることを示唆している。組み換えプラスミドｐＯＮ７を有するＩＬ１４ ０３株は、ＬＣＮ−Ａを産生じ、（必然的に）バクテリオシンに対して耐性であ った。このように、１．２−ｋｂのＲｓ　ａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　１７ラグ メントは、ＬＣＮ−Ａをコードする遺伝子だけでなく、耐性の遺伝的決定因子も 有しているよってある。このフラグメントのＤＮＡシークエンスは、ＩｃｎＡ遺 伝子に加えて、−個だけの完全なＯＲＦ、即ち１ｃｎＡと同一のオペロン内で、 かつその下流側に位置シ２．ている０ＲＦ２である。したかって、この明らかに 同時複写されるＯＲ，Ｆ２が、ＬＣＮ−Ａ免疫機能をコードする候補者のようで ある。バクチリオシ弓／遺伝子およびその対応する免疫遺伝子の非常に近似する 機構か、幾つかのＥ、　ｃｏｌｉバクテリオシンに関して示されている（２．２ ６）。

ツク１ノオチド位置４９５にＭｅｔを存し、可能なＲＢＳシークエンス５’　Ｇ ＧＡＴＴＡＧ３’　に先行される０ＲＦ２は、９８個のアミノ酸の仮説的ポリペ プチドをコードしている。あるいは、ヌクレオチド位置５４０にＬ　ｅ　ｕを有 し、可能なＲＢＳシークエンス５’　ＡＡＧＡＡＧ３’　に先行され、仮説的な ８３アミノ酸ポリペプチドをコードしている０ＲＦ２もあり得る。しかしなから 、９８アミノ酸ポリペプチドの１５個のＮ末端アミノ酸におけるコドンの使用形 式は、０ＲＦ２ポリペプチドの残りおよびＬＣＮ−Ａのコンパイルされたコドン 使用パターンとよく相関しており、このことは、ＯＲＦ２か９８アミノ酸ポリペ プチドをコードしていることを示している。

−一い その６個のＮ末端残基（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ１．＝ｙ）−＝ＩＩｅ）は 、ダラム陽性菌のシグナルペプチドと非常に良く似ている。

７．９および１１位にＧ１１】かあるにもかかわらず、この推定シグナルシーフ ェンスは、アミノ酸位置５〜２０にわたる疎水特性を保持している。Ｖｏｎ　Ｈ ｅｉ　ｊｎｅの−３，−１則によれば、アミノ酸位置２０にあるＡｌａ−Ｔｈｒ −Ａｌａの後に可能なシグナルペブチダーセ切断位置かある。Ａｂｒａｈａｍｓ ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、　（１）がコンパイルした１４個のダラム陽性シグナルシー クエンスの内、７つかＡｌａ−Ｘ−Ａｌａを切断部位に含んでいた。さらに、Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−ＡＩか、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓβ−グルカナー七 のシグナルペプチダーゼ切断部位の−３，−１アミノ酸シークエンスであること が判明した（２９）。

このことは、７９個のアミノ酸からなる成熟０ＲＦ２タンパク質を示唆している 。○ＲＦ２にコードされたポリペプチドが膜内に分泌されるかまたはアンカーさ れるかを示すことが残されている。

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Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５ｅｒｉｅｓ。

Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ　Ｉｎｃ、　Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、 　ＮＪ。

５、　Ｂｕｃｈｍａｎ、　Ｇ、Ｗ、、　Ｓ、Ｂａｎｅｒｊｅｅ　ａｎｄ　Ｊ、　 Ｎｏｒｍａｎ　Ｈａｎｓｅｎ、１９８８゜［ナイシンの前駆体をエンコードする 遺伝子の構造発現および進化、小タンパク質抗生物質Ｊ　（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆａ　ｇｅｎｅ　ｅ ｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｏｃｕｒｓｏｒ　ｏｆ　ｎ１ｓｉｎ、ａ　ｓｍ ａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｂｏｔｉｃ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６３：１６２６０−１６２６６゜６、　Ｃｈｏｐｉｎ、　Ａ、、　Ｍ、Ｃ ，Ｃｈｏｐｉｎ、　Ａ、　Ｍａｉｌｌｏ−Ｂａｔ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｌａｎｇｅ ｌｌａ。

１９８４、　ｒプラスミドを決定された５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔ ｉｓにおける２つの制限−修飾系Ｊ　（Ｔｗｏ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｄｅｔｅｒｍ ｉｎｅｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓ ｔｅｍｓ　ｉｎ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ）、Ｐｌａｓｍｉ ｄ　Ｉ■：２６０−２６３゜ ７、　Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　１９８ ４．　ｒゲノムシーフェンシングＪ　（Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国８１：１９９１−１ ９９５゜ ８、　Ｃｏｒｎｗａｌｌ、　Ｇ、Ｇ、、ＩＩＩ、　Ｋ、　５ｌｅｔｔｅｎ、　Ｂ 、　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、　ａｎｄ　Ｐ。

Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ、　１９８８．　ｒ老人性全身アミロイド症のアミロイド 原繊維タンパク質が正常プレアルブミンから誘導されることの証明」（Ｅｖｉｄ ｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｉｂｒｉｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ 　ｉｎ　５ｅｎｉｌｅ　ｓｙｓｔｅｍｉｃａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ　ｉｓ　ｄｅ ｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｏｒｍａｌ　ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ）、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　ｒｅｓ、　Ｃｏ１ｕｎｕｎ、　１５４：６４８−６５３゜９、 　Ｄａｖｅｙ、　Ｇ、Ｐ、、　１９８４．　ｒｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃ ｒｅｍｏｒｉｓにおけるｄｉｐｌｏｃｏｃｃｉｎ産生を伴うプラスミド組み込み Ｊ　（Ｐｌａｓｍｉｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｐｌｏｃｏｃｃ ｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｅｍｏｒ ｉｓ）、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４８：８９５−８９ ６゜１０、Ｄａｖｅｙ、Ｇ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｂ、Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１ ９８１．　ｒｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ３４６から生産さ れるｄｉｐｒｏｃｏｃｃｉｎの精製およびその性質Ｊ　（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｄｉｐｒｏｃｏｃｃｉｎ 　ｆｒｏｍ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　３４６）、　Ａ ｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：８４−８９゜１１　、　Ｄｏｄｄ、　Ｈ，Ｍ、、　 Ｎ、　Ｈｏｒｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｊ、　Ｇａ５５ｏｎ、　１９９０．　ｒペプチド 抗生物質ナイシンを製造するための遺伝子決定因子分析Ｊ　（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕ ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｂｏｔｉｃ　ｎ１ｓｉｎ） 　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３６：５５５−５５６゜１２ 、　Ｅｂｉｎａ、　Ｙ、、　Ｆ、　Ｋ１５ｈｉ　ａｎｄ　Ａ、　Ｎａｋａｚａｗ ａ、１９８２．　ｒ＋リシンＥ１合成の抑制因子における１ｅｘＡタンパク質の 直接関与Ｊ　（Ｄｉｒｅｃｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｅｘＡ　ｐ ｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅｌｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５０：１４７９−１４８ １゜１３、　Ｅｂｉｎａ、　Ｙ、、　Ｔ、　Ｔａｋａｈａｒａ、　Ｆ、　Ｋ１５ ｈｉ、　Ａ、　Ｎａｋａｚａｗａ　ａｎｄ　Ｒ。

Ｂｒｅｎｔ、　１９８３．　ｒＬｅｘＡタンパク質はコリシンＥｌ遺伝子の抑制 因子であるＪ　（ＬｅｘＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ａ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　 ｏｆ　ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅｌ　ｇｅｎｅ）、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８：１３２５８−１３２６１゜１４、　Ｅｌｌｉ ｋｅｒ、　Ｐ、Ｒ，、Ａ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｈａｍｍｅｓｓ ｏｎ、　１９５６．　ｒ乳酸５ｔｒｅｐｔＯＣＯＣＣｉおよび１ａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｉの寒天培地Ｊ　（Ａｎ　ａｇａｒｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏ ｒ　１ａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｉ）」、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、３９：１６１１−１６１２゜ １５、　Ｇｅ１ｓ　Ａ、、　Ｊ、　Ｊａｓｊｉｔ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｔｅｕｂｅ ｒ、１９８３．　ｒｌａｃｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのバクテリオシンを 製造する能力Ｊ　（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆｌａｃｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｉ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）　、　Ａｐｐｌ、 　Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４６：２０５−２１１゜１６、　Ｇｒｏｓｓ、　Ｅ、、 　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｏｒｅｌｌ、　１９７１．　ｒナイシンの構造Ｊ　（Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｎ１ｓｉｎ）、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅａ　Ｓｏｃ 、　９３：４６３４−４６３５゜１８、　Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、、　ａｎｄ　 Ｊ、　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　１９８０．　ｒ高コロニー密度でのプラスミドスク リーニングＪ　（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｔ　ｈｉｇｈｃｏｌ ｏｎｙ　ｄｅｎｓｉｔｙ）、　Ｇｅｎｅ　１０：６３−６７゜オシンプラスミド の制限酵素分析、およびバクテリオシン製造のためにコードするＢｃＩＩフラグ メントのクローニングＪ　（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆ　１ａｃｔｏｓｅ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐｌａｓｍ ｉｄｓ　ｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、　 ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ　ｌｖＭ、　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆＢＣＩ Ｉ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、　Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５３：１１７１−１１７４゜２０、 　Ｈａｌｏ、　Ｈ，、ａｎｄ　１．Ｆ、　Ｎｅｓ、　１９８９．　ｒ浸透安定化 培地中でグリシンを用いて生育するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ ｕｂｓｐ、　ｃｒｅｍｏｒｉｓのエレクトロポレーション法による高頻度形質転 換Ｊ　（Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｔｒａｎｓｆｒｏｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　 ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉ ｓｓｕｂｓｐ、ｃｒｅｍｏｒｉｓ　ｇｒｏｗｎ　ｗｉｔｈ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｉ ｎ　ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ５ｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ｍｅｄｉａ）、　Ａｐｐｌ 、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５５：３１１９−３１２３゜２ １．　Ｈｕｒｓｔ、　Ａ、、　１９８１．　ｒナイシンＪ　（Ｎｉｓｉｎ）、　 Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。２７：８５−１２３゜２２、　Ｋａｌｅｔｔａ、　Ｃ，、 ａｎｄ　Ｋ、Ｄ、　Ｅｎｔｉａｎ、　１９８９．　ｒナイシン、ペプチド抗生物 質；　ｎ１ｓＡ遺伝子のクローニングおよびシーフェンス、およびそのペプチド 生成物の翻訳後工程Ｊ　（Ｎｉｓｉｎ、　ａ　ｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｂｏｔｉ ｃ；　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎ１ｓ Ａ　ｇｅｎｅ　ａｎｄｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉ ｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）　、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１：１５９７−１６０１゜２３、　Ｋｌａｅｎｈａ ｍｍｅｒ、　Ｔ、、　１９８４．　ｒ一般的な１ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ中のプ ラスミド単離方法Ｊ　（Ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｌａｓ ｍｉｄ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　１ｎｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、　Ｃｕｒｒ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１０：２３−２８゜２４、　Ｍａｃｒｉｎａ、　Ｆ、 Ｌ、、　Ｄ、Ｊ、　Ｋｏｐｅｃｋｏ、　Ｋ、Ｒ，Ｊｏｎｅｓ、　ＤＪ、　Ａｙｅ ｒｓａｎｄ　Ｓ、Ｍ、　ＭｃＣｏｗｅｎ、　１９７８．　ｒ多重プラスミド含有 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株：標準プラスミド分子のコンビニエンドソ ースＪ　（Ａ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　５ｔｒａｉｎ；　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｓｏｕ ｒｃｅ　ｏｆ　５ｉｚｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ）、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１：４１７−４２０゜ ２５、　Ｍａｎｌａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ａｎｄ　 Ｊ、　Ｓｕｍｂｒｏｏｋ、　１９８２．　ｒ分子クローニングの実験室？−ユア ルＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ；　ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍ ａｎｕａｌ）」、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ。

２６、　Ｍａｓａｋｉ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｔ、　０ｈｔａ、　１９８５．　ｒコリ シンＥ３および免疫遺伝子Ｊ　（Ｃｏｌｉｃｉｎ　Ｅ３　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉ［ ［１ｍｕｎｉｔｙ　ｇｅｎｅｓ）　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１８２：２１７グ２２７゜ ２７、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｊａｕｒｉｎ、　１９ ９０．　ｒ標準Ｅｓｃｈｅｒ　１ｃｈｉａ皿を有する５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ肺炎Ｊ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｐｏｓｓｅｓ ｓｅｓ　ｃａｎｏｎｉｃａｌ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（ｓｉｇｍ ａ　７０）　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）Ｊ　。

Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４＋１１４３−１１５２゜２８、　Ｍｕｒｉａ ｎａ、　Ｐ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｔ、　Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ、　１９９０．　ｒ ラクタシンＦ。

の遺伝子のクローニング、表現型発現およびＤＮＡシークエンス、Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを用いて製造されるバクテリオシン」 （Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ａｎｄ 　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅｇｅｎｅ　ｆｏｒ　１ａｃｔａｃｉ ｎ　Ｆ、ａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙＬａｃｔｏｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１ ７３：１７７９−１７８８゜２９、　Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｎ、　Ｄ、Ｊ、　ＭｃＣ ｏｎｎｅｌｌ　ａｎｄ　Ｂ、Ａ、　Ｃａｎｔｗｅｌｌ、　１９８４．　ｒ分泌Ｂ 、　５ｕｂｔｉｌｉｓ酵素β−グルカナーゼに関する遺伝子の塩基シーフェンス および遺伝子制御部位Ｊ　（ＴＨｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｓ　ｏｆ　ｔｈｅｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｉｔ ｅｓ　ｆｏｒ　ｅｘｃｒｅｔｅｄ　Ｂ、　ｓｕｂｔｉｌｉｓｅｎｚｙｍｅβ−ｇ ｌｕｃａｎａｓｅ）、　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２：５３ ５５−５３６７　。

３０、　Ｎｅｖａ、　Ｈ，、Ａ、　Ｇｅ１ｓ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｔｅｕｂｅｒ、 　１９８４．　ｒグループＮ。

（乳酸）　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ中のバクテリオシンプラスミドの接合伝達 および特徴づけＪ　（Ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　 ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｎ、（ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｅｃｉ ）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５７：８３３−８３８゜３１、　Ｎｏｒ ｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、、　Ｔ、　Ｋｅｍｐｓ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、 　１９８３．　ｒオリゴヌクレオチドによって導かれた突然変異誘起を用いる改 良Ｍ１３ベクターの構築Ｊ　（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｒｏｖ ｅｄ　Ｍ１３　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｕｓｉｎｇｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ− ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、　Ｇｅｎｅ　２６：１０１−１ ０６゜３２、　Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｄ、Ｊ、　Ｌｉｐｍａ ｎ、　１９８８．　ｒ生物学的シーフェンス比較のための改良された手段Ｊ　（ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、米国８５：２４４４−２４４８゜ ３３、　Ｒａｄｌｏｆｆ、　Ｒ，、Ｗ、　Ｂａｕｅｒ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｖｉｎ ｏｇｒａｄ、　１９６７、ｒ閉環状二重ＤＮＡの検出および単離に用いられる色 素浮遊密度方法・ＨｅＬａ細胞中の閉環状ＤＮＡＪ　（Ａ−ｄｙｅ−ｂｕｏｙａ ｎｔ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｓｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｕｐｌｅｘ　Ｄ ＮＡ：　ｔｈｅｃｌｏｓｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅ ｌｌｓ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　５７：１５１４−１５２１゜ ３４、　Ｒａｏ、　Ｊ、に、Ｍ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ａｒｇｏｓ、　１９８６．　 ｒ膜内在住タンパク質中の予測へリックスに対する確定優位パラメーターＪ　（ Ａｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ 　ｔｏ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ｈｅｌｉｃｅｓ　ｉｎｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒ ａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ ａ　８６９：１９７−２１４゜ ３５、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｃｏｕｒｔ、　１９７ ９．　ｒＲＮＡ転写のプロモーションおよびターミネーションに含まれる調節シ ーフェンス」（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ 　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ 、　１３：３１９−３５３゜ ３６、５ａｈｌ、　Ｈ，Ｇ、、　Ｍ、　Ｋｏｒｄｅｌ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｂｅｎｚ 、　１９８７．　ｒペプチド抗生物質ナイシンによる細菌膜および人工脂質二重 層の電圧減極Ｊ（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｅｐｏｌａｒｉｚａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓａｎｄ　ａｒｔｉｆ ｉｃｉａｌ　１ｉｐｉｄ　ｂｉｌａｙｅｒｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　 ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｎｉｓｉｎ）、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　１ ４９：１２０−１２４゜３７、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅ ｎ、　ａｎｄ　Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　１９７７、ｒチェーンターミネーテ ングインヒビターを用いるＤＮＡシークエンシング」（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓ）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国７４　：　５４６３−５４６７゜３８、 　Ｓｃｈｅｒｗｉｔｚ、　Ｋ、Ｍ、、　Ｋ、Ａ、、　Ｂａｌｄｗｉｎ　ｎａｄ　 Ｌ、Ｉ、、　ＭｃＫａｙ、　１９８３゜ｒＳｔｒｅｐｔｏｃｏｓｓｕｓ　１ａｅ ｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、ｄｉａｃｅｔｙｌａｅｔｉｓ　ＷＭ、中のバクテリオシン 様物質のプラスミド連鎖、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓに対する 伝達性Ｊ　（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｏｆ　ａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃ ｉｎｌｉｋｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　１ｎＳｔｒｅｐｔｏｅｏｓｓｕｓ　Ｉａｃ ｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ　ＷＭ、。

ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃ ｔｉｓ）、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４５：ｌ５０６−１５１２゜３９、５ｅｈｎｅｌｌ　Ｎ 、、　Ｋ、Ｄ、　Ｅｎｔｉａｎ、　Ｕ、　５ｅｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｆ、　Ｇｏｔ ｚ、　Ｈ。

２ａｈｎｅｒ、　Ｒ，Ｋｅｌｌｎｅｒ、　ａｎｄ　Ｇ、　Ｊｕｎｇ、１９８８． 　ｒ４ピデルミンのプレペプチドシークエンス、４つの硫化物環を有するリポゾ ーム合成抗生物質Ｊ　（Ｐｒｅｐｅｐｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅｐ ｉｄｅｒｍｉｎ、　ａ　ｒｉｂｏｓｏ［［１ａｌｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　 ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｗｉｔｈ　ｆｏｕｒ　ｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｒｉｎｇｓ） 、　Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）　３３３：２７６−２７８゜４０、５ｈｉｎｅ、 　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｌ、　Ｄａｌｇａｒｎｏ、　１９７５．　ｒ細菌リポゾーム 中のシストロン特異性の決定因子Ｊ　（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｃｉ ｓｔｒｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｒｉｂｏｓｏ ｍｅｓ）Ｊ　、　Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン’）　２５４：３４−３８゜ ４１、　Ｓｉｍｏｎ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ａ、　Ｃｈｏｐｉｎ、　１９８８．　 ｒベクターブラスミドファミリーの構築およびその５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　１ａｃｔｉｓ中の分子クローニングへの用途Ｊ　（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ 　ｏｆ　ａ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄｉｔｓ　ｕ ｓｅ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕＬａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　５ｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　７０：５５９−５６６゜４２、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、 Ｍ、、　１９７５．　ｒゲル電気泳動により分離されるＤＮＡ断片中の特異シー フェンスの検出Ｊ　（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃｓｅｑｕｅ ｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔＳｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ 　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　 ９８：５０３−５１７゜４３、　Ｔａｋａｓｅ、　ｋ、、　Ｈ，Ｍｉｚｕｎｏ　 ａｎｄ　Ｋ、　Ｙａｍａｎａ、　１９８８．　ｒＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ ｉｓ　ａ−アミラーゼのＮＨ，−末端プロセッシングＪ　（ＮＨｉ−ｔｅｒｍｉ ｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　 α−ａｍｙｌａｓｅ）、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１１５４８−１１５５３゜４４、　Ｔｅｒｚ ａｇｈｉ、　Ｂ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｗ、Ｅ、　５ａｎｄｉｎｅ、　１９７５．　 ｒｌａｃｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの改良培地およびそのバクテリオファ ージ」（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　１ａｃｔｉｃ　５ｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）、　Ａｐ ｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２９：８０７−８１３゜４５、　Ｔｉｎｏｃｏ 、　１．、　Ｊｒ、、　Ｐ、Ｎ、　Ｂａｒｅｒ、　Ｂ、　Ｄｅｎｇｌｅｒ、　Ｍ 、Ｄ、　Ｌｅｖｉｎｅ。

０、Ｃ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｄ、Ｍ、　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ　ａｎｄ　Ｊ、　 Ｇｒａｌｌａ、　１９７３．　ｒリボ核酸の二次構造の改良された予測Ｊ　（Ｉ ｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ　ｉｎ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、　Ｎａｔｕｒｅ　（ ロンドン）　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、　２４６：４０−４１゜４６、　ｖａｎ　Ｂｅ ｌｋｕｍ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｂ、Ｊ、　Ｈａｙｅｍａ　Ａ、、　Ｇｅ１ｓ、　Ｊ、 　Ｋｏｋ　ａｎｄ　Ｇ。

Ｖｅｎｅｍａ、　１９８９．　ｒｌａｃｔｏｃｏｃｃａｌバクテリオシンプラス ミドからの２つのバクテリオシン遺伝子のクローニングＪ　（Ｃｌｏｎｉｎｇ　 ｏｆ　ｔｗ。

ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ａ　１ａｃｔｏｃｏｃｃａｌ 　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｐｌａｓｍｉｄ）。

Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５５：１１５７−１１ ９１゜４７、　ｖａｎ　Ｂｅｌｋｕｍ、　Ｊ、、　Ｂ、Ｊ、　Ｈａｙｅｍａ、　 Ｒ，Ｅ、　Ｊｅｅｎｉｎｇａ、　Ｊ、　Ｋｏｋ　ａｎｄＧ、　Ｖｅｎｅｍａ、　 １９９１．　ｒ２ツのＩａｃｔｏｃｏｃｃａｌバクテリオシンオペロンの構築お よび塩基シーフェンスＪ　（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｉａｃｔｏｃｏｃｃａｌ　ｂａｃ ｔｅｒｉｏｃｉｎ　ｏｐｅｒｏｎｓ）、　Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５７：４９２−４９８゜４８、　ｖ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｉｚｅｎ、　Ｐ、Ｊ、Ｍ、、　Ｊ、　Ｍａａｔ、　Ｈ，Ｈ，Ｂ 、　Ｗａｉｔｅｒｓ、　Ｅ。

Ｖｅｌｔｋａｍｐ　ａｎｄ　Ｈ，Ｊ、Ｊ、　Ｎｉｊｋａｍｐ、１９８２．　ｒプ ラスミドＣ１ｏ　ＤＦ１３　およびＣｏｌ　Ｅｌのバクテリオシンプロモーター の塩基シーフェンス：プロモーター活性の調節における１ｃｘＡリプレツサーお よびｃＡＭＰの役割Ｊ　（Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ 　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｏｃｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｏｆｐｌａｓｍｊｄｓ　 Ｃ１ｏ　ＤＦ１３　ａｎｄ　Ｃｏｌ　Ｅｌ：　ｒｏｌｅ　ｏｆ　１ｃｘＡ　ｒｅ ｐｒｅｓｓｏｒ　ａｎｄｃＡＭＰ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏ ｍｏｔｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１０：ｌ９１３−１９２８゜ ４９、　Ｖａｎ　ｆ（ｅｉｊｎｅ、　Ｈ，、１９８３，ｒシグナルシーフェンス 開裂部位に隣接するパターンＪ　（Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃ ｉｄｓ　ｎｅａｒ　ｓｉｇｎａｌ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ　５ ｉｔｅｓ）、　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３３：１７−２１゜５０、 　Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、、　１９８４．　ｒシグナルシーフェンスが分 断特異性を維持する方法Ｊ　（Ｈｏｗ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｍ ａｉｎｔａｉｎ　ｃｌｅａｖａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｊ　、　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７３：２４３−２５１゜５１、　Ｗａｌｓｈ、　Ｐ、Ｍ 、、　ａｎｄ　Ｌ、Ｌ、　Ｍｃｋａｙ、　１９８１．　ｒ細胞凝集と結合する組 み換えプラスミドおよび５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ　Ｍ１３の 高頻度接合」（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ａｎｄｈｉｇｈイｒｅｑｕ ｅｎｃｙ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａ ｃｔｉｓ　ＭＩ３）、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４６：９３７−９４４゜５２、　Ｗｏｎｇ、　Ｓ、Ｌ、 、　ａｎｄ　Ｒ，Ｈ，Ｄｏｌ、　１９８６．　ｒＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ ｌｉｓのｐｒｅｐｒｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎのシグナルペプチド開裂部位の決定 因子」（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔ ｉｄｅｓ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅｐｒｅｐｒｏｓｕｂｔｉ ｌｉｓｉｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ。

２６１　：１０１７６−１０１８１゜ ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０１１０９ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、ｃＬ、　”　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　７／１０　 ＺＮＡ　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１１０６　７２３６−４８ Ｃ１２Ｐ　７１０６　７４３２−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：０１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ、 ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、ＭＧ、Ｎｏ、ＵＳＩ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のアミノ酸シークエンス 【配列があります】 を有するかまたは含むポリペプチド、またはバクテリオシン活性を有するその誘 導体またはフラグメント。
2. ２．下記のアミノ酸シークエンス 【配列があります】 を有するかまたは含むポリペプチド、またはバクテリオシン免疫活性を有するそ の誘導体またはフラグメント。
3. ３．微生物的方法に使用され、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを含み、 該微生物が該ポリペプチドに対して耐性である、スターター培養物。
4. ４．前記の微生物が乳酸菌または酵母である、請求の範囲第１項に記載のスター ター培養物。
5. ５．乳酸菌の溶菌を行うために、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを添加 することを含む、チーズまたはヨーグルトの製造方法。
6. ６．乳酸菌の夾雑株を選択的に殺すために、請求の範囲第１項に記載のポリペプ チドを使用する、エタノール製造のための発酵方法。
7. ７．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを発現する微生物の培養物を分別し 、これによって該ポリペプチドに富んだフラクションを集めることを含む、請求 の範囲第１項に記載のポリペプチドの単離方法。
8. ８．前記の微生物がラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシスクレモリス（ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）であ る、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項および／または請求の範囲第２項に記載のポリペプチドに ついてコードするＤＮＡシークエンス。
10. １０．請求の範囲第１項および／または請求の範囲第２項に記載のポリペプチド についてコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換されたラクトコッカス ・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉＳ）の菌株。
11. １１．対応する保護ポリペプチドまたは固定化ポリペプチドを脱保護するか、ま たは不活性支持体から分離する、請求の範囲第１項または請求の範囲第２項に記 載のポリペプチドの製造方法。