JPH06505250A - 癌の養子免疫療法におけるインターロイキン−１０の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

癌の養子免疫療法におけるインターロイキン−１０の使用発明の分野 本発明は、概して、ヒトの新生物すなわち癌を治療するための方法および組成物 に関し、更に詳しくは、ヒトの癌の養子免疫療法におけるインターロイキン−１ ０（ＩＬ−１０）の使用に関する。 背景 癌療法への免疫学的アプローチは、癌細胞が異常なまたは外来の細胞および分子 に対する生体の防御をどうにかして免れたこと、そしてこれらの防御を治療によ って刺激して失われた基盤を回復することができるかもしれないという概念に基 いている。例えば、クライン（Ｋｌｅｉｎ）、Ｉｍ　ｕｎｏｌｏ　ｙ（ウィリ一 番インターサイエンス（Ｗｉ　１ｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、　ニュー ヨーク、１９８２）６２３〜６４８頁。種々の免疫エフェクターが直接的または 間接的に腫瘍成長を阻害することができるという最近の観察は、癌療法に対する このアプローチへの関心を復活させた。例えば、ハーバ−マン（Ｈｅｒｂｅｒｍ ａｎ）、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、、１巻、９６〜１３２ 頁（１９８５）（自然キラー細胞は腫瘍細胞成長に抵抗する）；ローゼンバーグ （Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉ　ｍｕｎｏｌ、。 ４巻、６８１〜７０９頁（１９８８９（癌を治療するためのＩＬ−２活性キラー 細胞の臨床的使用）；ラルフ（Ｒａｌｐｈ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６７ 巻、７１２〜７１７頁（１９８８）（リンホカインによって刺激されたマクロフ ァージによる殺腫瘍活性）、チッパ−（Ｔｅｐｐｅｒ）ら、Ｃｅ１ｌ、５７巻。 ５０３〜５１２頁（１９８９）（ＩＬ−４は抗腫瘍活性を有する）、Ｍ、コーエ ン（Ｃｏ　ｈ　ｅ　ｎ）、「リンホカインおよび腫瘍免疫（Ｌｙｍｐｈｏｋ　１ ｎｅａｎｄ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍｍｕｎｆ　ｔｙ）Ｊ、Ｓ、コーエン（Ｃｏ　ｈ　 ｅ　ｎ）監修、臨床的に見込みがあった一つの免疫学的アプローチは、インター ロイキン−２（ＩＬ−２）によって活性化したキラー細胞を用いるいわゆる養子 免疫療法であった：ローゼンバーグら（上記に引用）およびローゼンバーグ、Ｓ ｅｉ。 Ａｍｅ　ｒ、、６２〜６９頁（１９９０年５月）。残念ながら、ＩＬ−２によつ て直接的または間接的に生じた苛酷な副作用は、このアプローチに基いた日常的 治療プロトコルの開発に対して障害であった。例えば、ゲイナー（Ｇａｙｎｏｒ ）ら、Ａｎｎ、Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、、１０９巻、９５３〜９５８頁（１９８８）、 リ−（Ｌｅｅ）ら、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、０ｎｃｏ１．．７巻、７〜２０頁（１９８ ９）；およびローゼンバーグら、Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈ、、２２巻、４９３〜５ ０２頁（１９９０）。ＩＬ−２によって直接的および／または間接的に生じた苛 酷な副作用を減少させる方法を発見することができるならば、それは癌療法に対 するこのアプローチにおける重大な進歩であろう。 発明の概要 本発明は、癌の養子免疫療法におけるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の 使用に関する。本発明は、更に、養子免疫療法において用いるためのインターロ イキン−１０を含む薬剤組成物を含む。本発明は、一つには、養子免疫療法にお いて現在見出される多数の有害な副作用の原因となっていると考えられるサイト カインの生産をＩ　Ｌ−１０が防止または減少することができるという発見に基 いている。本明細書中で用いられる「養子免疫療法」という用語は、機能的に癌 を克服する免疫細胞を患者に転移させる療法を意味する。癌を克服する免疫細胞 は、好ましくは、患者自身に由来する腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を含む。概 して、本発明の方法は、（ｉ）ｉＬ−２およびＩＬ−１０の存在下でＴＩＬを培 養し、（ｉ　ｉ）培養されたＴＩＬを患者に対して投与し、そして（ｉ　ｉ　ｉ ）　ＴＩＬの投与後に、ＩＬ−２およびＩＬ−１０を患者に対して投与する工程 を含む。 好ましくは、本発明のインターロイキン−１０は、標準的な三文字略語を用いて Ｎ末端から開始するし一アミノ酸を示している本明細書中の配列番号１および２ （全部の配列番号を請求の範囲の直前に与えている）で与えられたアミノ酸配列 によって定義される読み取り枠を有する成熟ポリペプチドから成る群より選択さ れる。ＩＬ−１０のこれら二つの形態をしばしばそれぞれヒトＩＬ−１０（すな わち、ヒトサイトカイン合成阻害因子）およびウィルスＩＬ−１０（すなわち、 ＢＣＲＦＩ）と称する。例えば、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２ ４８巻、１２３０〜１２３４頁（１９９０）ｉヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ、８８巻、１１７２〜１１７６頁（１９９１）、フィオレンチノ （Ｆｉｏｒｅｎｔｆｎｏ）　ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、、１７０巻、２０８１〜 ２０９５頁（１９８９）；およびシュー　（Ｈｓｕ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２５ ０巻。 ８３０〜８３２頁（１９９０）。更に詳しくは、本発明の方法で用いられる成熟 ＩＬ−１０は、本明細書中において配列番号３および４で与えられたアミノ酸配 列によって定義される読み取り枠を有する成熟ポリペプチドから成る群より選択 される。 図面の簡単な説明 図１は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤ（ＳＲα）の図示である。 図２は、細菌発現ベクターＴＲＰ−Ｃ１ｌの図示である。 図３は、ＩＬ−２および／または、ＩＬ−４、ｖＩＬ−１０およびｈ　Ｉ　Ｌ− １０（但し、文字ｒＶＪはウィルスを示し且つ文字ｒｈＪはヒトを示す）の存在 下で培養されたＩＬ−２活性末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のサイトカイン合成 のデータを図示する。 図４（ａ）は、ＰＢＭＣのＩＬ−２に誘導された細胞毒性に対するＩＬ−４、ｖ ｌＬ−１０およびｈ　Ｉ　Ｌ−１０の効果を示すデータを図示する。 図４（ｂ）は、ＣＤ５６＋（Ｌｅｕ１９ちＰＢＭＣｓがＩＬ−１０および１Ｌ− ２の存在下でＬＡＫ活性を発現することを示すデータを図示する。 図５（ａ）は、精製ＮＫ細胞中のＩＮＦ７生産に対するＩＬ−４、ｖｌＬ−１０ およびｈ　Ｉ　Ｌ−１０の効果を示すデータを図示する。 図５（ｂ）および（ｃ）は、ＩＬ−２および／またはｖｌＬ−１０およびｈｌＬ −１０の存在下で培養された精製ＮＫ細胞によるＩＮＦγ生産に対する単球の効 果を示すデータを図示する。 発明の詳細な説明 本発明は、ＩＬ−１０を用いて、癌の養子免疫療法においてサイトカインに誘導 された副作用を減少する方法に関する。本発明は、更に、該方法を実施するため のＩＬ−１０を含む薬剤組成物を含む。本発明において用いるためのＩＬ−１０ は、好ましくは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ロ ックビル、メリーランド州にそれぞれ受託番号６８１９Ｌ　６８１９２および６ ８１９３として寄託されているｐＨ５Ｃ，ｐＨ１５ｃおよびｐＢＣＲＦＩ　（Ｓ Ｒα）のｃＤＮＡインサートによって定義された読み取り枠でコードされた成熟 ポリペプチドの群より選択される。 好ましくは、Ｉ　Ｌ−１０は、ローゼンバーグら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、４巻、６８１〜７０９頁（１９８８）、トパリアン（Ｔｏｐ ａｌｉａｎ）　ら、Ｊ、ＩｍｍｕｎｏｌｏＭｅｔｈ、、１０２巻、１２７〜１４ １頁（１９８７）およびローゼンバーグら、Ｎｅｗ　Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、、３ １９巻、１６７６〜１６８０頁（１９８８）に記載の養子免疫療法においてＩＬ −２との組合わせで用いられる。したがって、これらの参考文献は参考として包 含体腫瘍薪ましくは、１０〜３０ｇ）を５ｍｍ３片に切分け、これを、ヒアルウ ロニダーゼＶ型０．０１％、ＤＮ７−ゼ■型０．００２％、コラゲナーゼＩＶＷ ０．１％（例えば、シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ）　、セント・ルイス、ＭＯ）、ペニ シリン５０１Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（例えば、フロー・ ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｖクリーン、ＶＡ） およびゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ（例えば、ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇｉ ｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、チャグリン・フォールズ、ＯＨ）を含む ＲＰＭｌ　１６４０培地中に浸漬する。この混合物を室温で６〜２４時間撹拌し た後、荒目ワイヤグリッドを介して濾過して未消化組織断片を除外する。 次に、得られた腫瘍細胞懸濁液を４００Ｘｇで１０分間遠心分離する。ペレット をＣａ　７Ｍ　ｇ　／フェノールレッド不含ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）（ 例えば、ホイッタカー（Ｗｈｉ　ｔ　ｔａｋｅｒ）ＭＡバイオプロダクツ（Ｂｉ ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウォーカースピル、ＭＤ）で２回洗浄した後、ＨＢＳＳ 中に再懸濁させ、モしてフィコール・ハイパクー（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ ｅ）勾配（例えば、ＬＳＭ、パイオネティクス（Ｂｊｏｎｅｔｉｃｓ）、ケンシ ントン、ＭＤ）に通過させる。生存しうる腫瘍細胞、リンパ球および単球を含む 勾配界面を採取し且つＨＢＳＳで２回以上洗浄する。リンパ球の数は目視によっ て、細胞学的検査によっておよび／または流動血球計算法によって推定すること ができる。採取された細胞は、１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯを含む種適合性ヒト血 清中で貯蔵用に冷凍することができる。 生存しうる細胞の温度約２．５〜５．０ＸＩＯ”個／ｍｌで、前記の酵素消化処 理から直接的にかまたは冷凍検体を急速解凍することによって得られた単一細胞 腫瘍懸濁液を、（下記の）ＬＡＫ細胞上澄み２０（重量）％と、１０％熱失活ヒ ト血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびアンホテリシ ン２５０ｎｇ／ｍｌ　（ファンジゾーン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、７．キブ（Ｓ ｕｉｂｂ）、フロー・ラボラトリーズ（Ｆ　ｌ　ｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）、ｖクリーン、ＶＡ）、ヘペス緩衝液１０ｍＭ並びにＬ−グルタミン２ｍＭを 含むＲＰＭＩ　１６４０培地８０（重量）％とから成る培地で希釈する。ＩＬ− ２を最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ　（但し、ＩＬ−２活性の単位はローゼンバーグ ら、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｃ１記に引用）によって定義の通り（例えば、フアシヨン （Ｆａｌｃｏｎ）、ベクトン・デイキンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、オクスナ ード、ＣＡ）等に散布することによって開始さね、そこにおいてそれらを給温し た５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃で保持する。ＴＩＬ培養物を採取し、ペレ ットにし、そして新鮮な培地および新鮮な■個／ｍｌの濃度で再開始される。９ 〜２８日間の培養後に、好ましくは、３０〜４０日間であっても、腫瘍細胞は培 養物から消失する。ＴＩＬを遠心分離によつを３０〜６０分間にわたって）。Ｔ ＩＬの注入に続いて、ＩＬ−２およびＩＬ−１０を下記のように患者に対して投 与する。 ＬＡＫ細胞は以下のように得られる。標準的なフィコール・ハイパクー分離技術 によって白血球搬出検体からかまたは末梢静脈血から得られたヒト末梢血液リン パ球を、２％熱失活ヒトＡＢ血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲン タマイシン含有ＲＰＭ１　１６４０中に細胞濃度的１．０ＸＩＯ６個／ｍｌで懸 濁させる。ＩＬ−２を約１０００Ｕ／ｍｌの濃度で加え、細胞を３〜５日間イン キュベートする。培養物上澄みを遠心分離によって採取し且つＴＩＬ培養での使 用に４℃で貯蔵する。 １１組換え体ＩＬ−１０の発現 広範囲の単１胞および多細胞発現システム（すなわち、宿主／発現ベクター組合 わせ）を用いて本発明のポリペプチドを生産することができる。宿主細胞の可能 な種類としては、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等がある。 具体的な発現システムの選択および／または変更を行なうための指針を提供する 多数の論評が入手可能であり、例えば、いくつか名前を挙げると、ド・ボーア（ ｄｅ　Ｂｏｒｅ）およびシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）、「大腸菌での外来遺伝 子発現を最適化する方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒＯｐｔｉｍｉｚｊｎｇ 　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ　Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ ａ　ｃｏｌ　ｉ）Ｊ、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）監修、Ｇｅｎｅｓ：５ｔｒｕｃｔ ｕｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ジョン・ウィリー拳アンド・サンズ（ Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）　、ニューヨーク、１９８３）、２０ ５〜２４７頁はいくつかの大腸菌システムを論評し；クチャルラパテ４　（Ｋｕ ｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｆｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒ　、１６巻、４号、３４９〜３７９頁（１９８４）およびバネル ジ（Ｂａｎｅ　ｒ　ｊ　ｉ）ら、Ｇｅｎｅ　ｔ　ｉ　ｃＥｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　 、５巻、１９〜３１頁（１９８３）は哺乳動物細胞をトランスフェクトし且つ形 質転換する方法を論評し；レズニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（ Ｇｏ　ｌ　ｄ）監修、哺乳動物細胞での遺伝子発現の抜粋された論題を論及し吋 そ（−でスイリー（Ｔｈ　ｉ　１　ｌｙ）　、　Ｍａｍｍａ　１　ｉ　ａｎ　Ｃ ，ｅム（±−−Ｔｅ　ｅｈｎｏ　ｌ　ｏ３．ｙ　（／’ツタ−−ス、ボストン、 １９８６）は哺乳動物発現システムを論評し、ている。同様に、特定のｃＤＮＡ および発現制御配列を結合しおよび／または操作して、本発明によって用いるの に適当な発現ベクターを考案するおよび／または修飾する技術および条件を記載 しでいる多数の論評が入手可能であり、例えば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ）ら佳記に引用）である。 大腸菌発現システムは、参考として包含されるリッグス（Ｒｉｇｇｓ）による米 国特許第４．４３１，７３９号明細書に開示されている。大腸菌の高発現に特に 有用な原核性プロモーターはｔａｅプロモーターであり、本明細書中に参考とし て包含されるド・ボーアによる米国特許第４．５５１．４３３号明細書に開示さ れている。大腸菌宿主に関する分泌発現ベクターも入手可能である。特に有用な のは、ブレイブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによるＥＭＢＯＪ、、３巻、２４３７〜２ ４４２頁（１９８４）に開示されたｐ　Ｉ　Ｎ　−Ｉ　Ｉ　Ｉ　−ｏｍｐＡベク ターであり、ここにおいて、転写されるｅＤＮＡはｏ　ｍ　ｐ　Ａタンパク質の シグナル＾；ブチドをコードする大腸菌ＯｍｐＡ遺伝子の部分に融合され、順次 に、成熟タンパク質が細菌の周辺腔中に分泌される。更に、米国特許第４，３３ ６，３３６号明細書および同第４．３３８，３９７号明細書は原核生物の分泌発 現ベクターを開示する。したがって、これらの参考文献は参考として包含される 。 多数の細菌株は原核性発現ベクターに適当な宿主であり、大腸菌の菌株、例えば 、Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ番号２７３２５）、ＪＡ２２１、Ｃ６００、ＥＤ７６ ７、ＤＨＩ、ＬＥ３９２、ＨＢＩＯＩ、Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ番号３１２４４ ）、Ｘ２２８２、ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ番号３１３４３）ＭＲＣ！　、枯草菌（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｊｌｉｓ）の菌株；並びに他の腸内細菌科、例えば、 ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｊｕｍ）または霊菌 （Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および各種シュードモナス属（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）がある。真核性タンパク質の発現において有用な、大腸 菌に１２Ｘ］、７７６などの細菌株を誘導するための一般的な方法は、カーティ ス（Ｃｕｒｔｉｓ）ＩＩＩによる米国特許第４，１９０，４９５号明細書に開示 されている。したがって、この特許は参考と１．て包含される、原核性および真 核性微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞を含む発現システムを用いて本発明 のタンパク質を製造することもできる。特に興味深いのは哺乳動物発現システム であり、それらの翻訳後プロセッシング機構が生物学的に活性の哺乳動物タンパ ク質を生産するら

【２いという理由による。若干のＤＮＡＷａウィルスが哺乳動 物宿主のベクターとし、て用いられて来た。特に重要なのは、細菌の複製制御配 列に結合したＳＶ４０複製、転写および／または翻訳制御配列を含む多数のベク ターであり、例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルブ（Ｂｅｒｇ）に よって開発され、Ｍｏ　１．　Ｃｅ　ｌ　１．一旦ｉｏ１．−、２巻、１６１− ＝　１７０頁（１９８２）およびＭｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、３巻、２８０ 〜２８９頁（１９８３）に開示されへそＩ、てタケベ（ＴａｋｃＪｅ）ら、Ｍｏ ｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、８巻、４６６〜４７２頁（１９８８）で改良されたｐｃ Ｄベクターである。したがって、これらの参考文献は参考として本明細書中に包 含される。他のＳＶ４０基剤哺乳動物発現ベクターとしては、双方ともが参考と して本明細書中に包含されるカオフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓ ｈａｒｐ）によるｙ９ユ、Ｃｅ１ｌ、Ｒｉｏｌ、、２巻、１３０４〜１３１９頁 （１９８２）およびクラーク（Ｃ１ａ　ｒ　ｋ）ら、米国特許第４．　６７５． 　２８５号明細書に開示されたものがある。通常、サル細胞は前記のベクターに 好ましい宿主である。ＳＶ４０　ｏｒｉ配列および完全なＡ遺伝子を含むこのよ うなベクターは、サル細胞において自律複製することができる（非自律複製プラ スミドよりも高いコピー数および／または安定なコピー数を与える）。更に、完 全なＡ遺伝子を含まないＳＶ４０　ｏｒｉ配列含有ベクターは、グルラマン（Ｇ ｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌ　１，２３巻、１．７５〜１８２頁（１９８１）に記載 され且つＡＴＣＣ（受託番号ＣＲＬ　１６５１）から入手可能なＣＯＳサル細胞 中で（安定ではないが）高コピー数に自律複製することができる。上記のＳＶ４ ０基剤ベクターを、更に、他の哺乳動物細胞、例えば、マウスＬ細胞を宿主細胞 ＤＮＡ中に統合することによって形質転換することができる。 更に、多細胞生物は本発明のポリペプチドの生産用宿主として役立つことがで５ ９２〜５９４頁（１，９８５）およびＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、、３５ １〜３７２頁（１９８９））および形質転換動物（ジエーニッシュ（Ｊａｅｎｔ ｓｃｈ）、５ｃｔｅｎｅｅ、２４０巻、１４６８〜１４７４頁（１９８８））で ある。 Ｉｌ、インターロイキン−１０の検定および単位の定義ＩＬ−１０は、検定およ び単位の基準を形成することができるいくつかの生物学的活性を示す。特に、Ｉ Ｌ−１，０は、ＩＦＮ−γ、リンホトキシン、ＩＬＩ、！Ｌ−３およびＧＭ−Ｃ ８Ｆから成る群のサイトカインの１種類またはそれ以上を同系の抗原提示細胞（ ＡＰＣ）および抗原に対する暴露によって合成するように誘導されたＴヘルパー 細胞の集団においてこれらのサイトカインの少なくとも１種類の合成を阻害する 性質を有する。この活性において、ＡＰＣは、それらの複製はできなくなるがそ れらの抗原プロセッシング機構は機能的なままであるように処理される。これは ＡＰＣをＴ細胞と混合する前に、例えば、約１５００〜３０００Ｒ（ガンマ線ま たはＸ線）で照射することによって好都合に達成される。 或いは、サイトカイン阻害は一次または、好ましくは二次混合リンパ球反応（Ｍ ＬＲ）で検定することができ、この場合、同系ＡＰＣを用いる必要はない。 ＭＬＲは当該技術分野で周知である。例えば、ブラドリー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、 ミシェル（Ｍｔｓｈｅｌｌ）ら監修、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉ　ｍｕｎｏｌｏ　ｙ　（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、 サン・フランシスコ、１９８０）、１６２〜１６６頁；およびバチスト（Ｂａｔ ｔｉｓｔｏ）　ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５０巻、８３〜９１ 頁（１９８７）。要約すると、同種異系リンパ系細胞の二集団を混合し、その一 方の集団は混合する前に、例えば、照射によって増殖を妨げるように処理する。 好ましくは、細胞集団を補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭｌ　 １３４０中に細胞濃度約２×１０６個／ｍｌで調製する。対照および試験培養物 双方に関して検定用の各集団Ｑ、５ｍｌを混合する。二次ＭＬＲに関して、−次 ＭＬＲの７日後に残っている細胞を、新たに調製された被照射刺激細胞によって 再度刺激する。ＩＬ（０を含むと疑われる試料を試験培養物に対して混合しなが ら加え、対照および試験培養物双方の混合して１〜３日後のサイトカイン生産を 検定することができる。 Ｔ細胞集団および／またはＡＰＣ集団をＩＬ−１０検定用に得るには、デイサバ ト（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監修、Ｍｅｔｈ、ｔｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻 （１９８４）に十分に記載されている当該技術分野で周知の技法を用いる。好ま しいＩＬ−１０検定用のＡＰＣは末梢血液単球である。これらは、例えば、ボイ ウム（Ｂｏｙｕｍ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻、８８〜１ ０２頁（１９８４）、７ジｘ　（Ｍａｇｅ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ 。 、１０８巻、１１８〜１３２頁（１９８４）、リトヴイン（Ｌ　ｉ　ｔ　ｖ　ｉ 　ｎ）ら、Ｍｅｔｈ、ｔｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻、２９８〜３０２頁（ １９８４）、ステイーブンリン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、。 １０８巻、２４２〜２４９頁（１９８９）およびローマン（Ｒｃ）ｍａ　ｉ　ｎ ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｌ、１０８巻、１４８〜１５３頁（１９ ８４）に記載の標準技法を用いて得られ、これらの参考文献は参考として包含さ れる。 好ましくは、ヘルパーＴ細胞をＩＬ−１０検定において用い、これらは末梢血液 から最初にリンパ球を分離した後、例えば、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）または 流動血球計算法により、商業的に入手可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国特許第 ４．３８１．２９５号明細書に記載され且つオルト・ファーマソイテイカル争コ ーポレーション（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）か ら入手可能な０ＫＴ４を用いてヘルパー細胞を選択することによって得られる。 必要な技法は、ボイウムによる５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ。 ｙヱ」上２ｉｎ　ＩシＬＬロ１艷１．．１２１巻、７３７〜７４８頁（１９８６ ）に十分に開示されている。概して、ＰＢＬは新鮮血液からフィコール・／％イ ／くクー密度勾配遠心分離によって得られる。 各種抗原を検定において用いることができ、例えば、カサガイのヘモシアニン（ ＫＬＨ）、ニワトリγ−グロブリン等である。更に好ましくは、抗原の代わりに ヘルパーＴ細胞を検定において抗ＣＤ３単クローン性抗体、例えば、米国特許第 ４．３６１，５４９号明細書で開示された０ＫＴ３で刺激する。 対照および試験試料中のサイトカイン濃度は標準的な生物検定および／または免 疫化学検定によって測定される。特定のサイトカイン用の免疫化学検定の構成は 、精製されたサイトカインが入手可能である場合は当該技術分野で周知であり、 例えば、カンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｄ ｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（ｚルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、 １９８４）；テユ”ｌセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄ　Ｔｈ ｅｏｒ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（ｚルセビア、アムス テルダム、１９８５）；および米国特許第４．４８６．５３０号明細書は論題に ついての広範囲の参考文献の例である。ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−３およびヒト ＧＭ−Ｃ８Ｆ用のエライザキットはジエンザイム・コーポレーション（Ｇｅｎｚ ｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能であり；そして ヒトＩＦＮ−γ用のエライザキットはエンドジエン拳インコーポレーテッド（Ｅ ｎｄｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能である。ヒ ドリンホトキシンに特異的な多クローン性抗体は、ジェンザイム・コーポレーシ ョンから商業的に入手可能であり、ヒドリンホトキシンに関するラジオイムノア ッセイにおいて用いることができる。例えば、チャード（Ｃｈａｒｄ）、Ａｎ　 Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔ。 Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎｉ　ｕ ｅｓ　（ｚルセビア、アムステルダム、１９８２）。 上記に挙げたサイトカインの生物検定を用いてＩＬ−１０活性を測定することも できる。ヒドリンホトキシンの生物検定は、アガワール（Ａｇｇａｒｗａｌ）、 Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１１６巻、４４１〜４４７頁（１９８５） およびマシューズ（Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ）ら、クレメンス（Ｃ１ｅｍｅ　 ｎ　ｓ）ら監修、Ｌｙｍ　ｈｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ： ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬブレス（Ｐｒｅｓｓ）、　ワ シントン、Ｄ、Ｃ，，１９８７）、２２１〜２２５頁に開示されている。ヒトＩ Ｌ−２およびＧＭ−Ｃ３Ｆは、ＡＴＣＣから受託番号ＴＩＢ　２１４およびＣＣ Ｌ２４６としてそれぞれ入手可能な因子依存細胞系ＣＴＬＬ−２およびＫＧ−１ を用いて検定することができる。ヒトＩＬ−３は、メトターフ（Ｍｅｔｃａｌｆ ）、工堕＝旦訂凹且り堕」土二匹！月迂エーソユユｌ」工υ■−Ｆａｃｔｏｒｓ 　（エルセピア、アムステルダム、１９８４）に記載されたように、軟質寒天培 地中で広範囲の造血細胞コロニーの形成を刺激するその能力によって検定するこ とができる。ＩＮＦ−γは、抗ウイルス検定によって定量することができる。例 えば、ミーガー（ＭｅａｇｅｒＬクレメンスら監修佳記に引用）１２９〜１４７ 頁。 サイトカイン生産はｍＲＮＡ分析によって決定することもできる。サイトカイン ｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２ ５７巻、８５６９〜８５７２頁（１９８２）およびジルスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐ ｉｅ）ら、米国特許第４．４８３．９２０号明細書に記載の細胞質ドットハイブ リダイゼーションによって測定することができる。したがって、これらの参考文 献は参考として包含される。他の方法としては、精製ＲＮＡを用いるドツトブロ ッティングがある。例えば、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）ら監修、ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌΔ２且り旦ｌ立互 （ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，１９８５）第６章。 ＩＬ−１０に関して試験されるある種の試料は、検定の妨げとなるかもしれない 予め決定されたサイトカインを除去するように予め処理する必要がある。例えば 、ＩＬ−２はある種の細胞においてＩＦＮ−γの生産を増大させる。したがって 、検定で用いられるヘルパーＴ細胞に応じて、ＩＬ−２を試験される試料から除 去する必要があることがある。このような除去は、標準的な抗すイトヵインアフ ィニティー力ラムに試料を通過させることによって好都合に達成される。 便宜上、ＩＬ−１０活性の単位は、米国特許第４．５５９．３１０号明細書に記 載され且つＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ　８３０６として入手可能なＭＣ／９細 胞のＩＬ−４に誘導された増殖を増大させるＩＬ−１０の能力によって定義され る。１単位／ｍｌは、下記の検定でのＩＬ〜４濃度を越えるＭＣ／９増殖の最大 刺激の５０％を与えるＩＬ−１０の濃度として定義される。標準微量滴定プレー トの各ウェルの培地５０μｌ中でＩＬ−４およびＩＬ−１０の二倍または二倍希 釈を調製する。培地はＲＰＭｌ　１６４０．１０％ウシ胎児血清、５０μＭ２− メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）および ストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）から成る。ＩＬ−４を加え、１６００Ｕ ／ｍｌの２５ｔｔｌ／ウエルを培地で希釈しく最終的にＩＬ−４は４００Ｕ／ｍ １）、そして−晩中、例えば、２０〜２４時間インキュベートする。３Ｈ−チミ ジン（例えば、培地中５０μｃｉ／ｍｌ）を０．　５〜１．　０μＣｉ／ウエル で加え且つ再度細胞を一晩中インキュベートし；次に、細胞を採取し、そして取 り込まれた放射能を測定する。 １１１、精製、薬剤組成物および投与 本発明のポリペプチドが可溶性形態で、例えば、形質転換された酵母または哺乳 動物細胞の分泌生成物として発現される場合、それらを当該技術分野の標準法に したがって精製することができ、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグ ラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の工程が ある。例えば、「酵素精製および関連技術（ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ＪＭｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、２２：２３：３−５７７　（１９７７）およびスコー プス（Ｓｃｏｐｅｓ）、Ｒ，、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋Ｐｒ １ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　（スプリンガーφフェアラーク（ Ｓｐ　ｒ　ｉ　ｎｇｅ　ｒ　−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２）は、 このような精製の指針を提供する。同様に、本発明のポリペプチドが不溶性形態 で、例えば、凝集体、封入体等として発現される場合、それらを当該技術分野の 標準法によって精製することができ、封入体を遠心分離によって破壊された宿主 細胞から分離し、封入体をカオトロピズム物質および還元剤で可溶化し、可溶化 した混合物を希釈し、そしてポリペプチドが生物活性コンホメーションをとるよ うにカオトロビズム物質および還元剤の濃度を低下させることを含む。後者の方 法は、参考として包含される下記の参考文献に開示されている：ウィンクラー（ Ｗｉ　ｎｋ　ｌ　ｅ　ｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、２５：４０４１〜４ ０４５　（１９８６）；ウィンクラ−ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　、３：９９ ２〜９９８　（１９８５）；コス（Ｋｏｔｈｓ）ら、米国特許第４，５６９，７ ９０号明細書−並びに欧州特許出願第８６３０６９１７．５号明細書および同第 ８６３０６３５３．３号明細書。 好ましくは、ＩＬ−１０をヒトインターロイキン−２（ｈｌＬ−２）と組合わせ て用いる。ＩＬ−２は、タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｊ）ら、米国特許第４，７ ３８．９２７号明細書；ローゼンバーグら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２３巻、１４１ ２〜１４１５頁（１９８４）；ドリノ（Ｄｏ　ｒ　ｉ　ｎ）ら、米国特許第４． 　７４８゜２３４号明細書；コスら、米国特許第４．５６９，７９０号明細書； 等にしたがって製造することができる。したがって、これらの参考文献は参考と して包含される。 概して、ＩＬ−１０は、薬剤担体、有効量のＩＬ−１０およびＩＬ−２を含む薬 剤組成物として投与される。薬剤担体は、本発明の組成物を患者に対して送達す るのに適当な任意の相溶性無毒性物質であることができる。概して、このような 薬剤の非経口投与に有用な組成物は周知である。例えば、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ 　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５版（マッグ・パブ リッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇｃｏｍｐａｎｙ）、 イーストン、ＰＡ　１９８０）、或いは、本発明の組成物は、植え込み可能なま たは注射可能な薬剤デリバリ−システムによって患者の体内に導入することがで きる。例えば、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈａｒ ｍｃｏｌ、Ｔｏｘｆｃｏｌ、、２４巻、１９９〜２３６頁（１９８４）；ルイス （Ｌｅｗｊｓ）監修、ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９ ８１）；米国特許第３．７７３，９１９号明細書；米国特許第３．２７０．９６ ０号明細書；等。 非経口によって投与する場合、ＩＬ−１０は薬剤担体と一緒に注射可能な単位剤 形（水剤、懸濁剤、乳剤）で処方される。このような担体の例は規定食塩水、リ ンガ−溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。非水性担体、例え ば、固定油およびオレイン酸エチルを用いてもよい。好ましい担体は５％デキス トロース／食塩水である。担体は少量の添加斉ｊ１例えば、等張性および化学的 安定性を増大させる物質、例えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。■ Ｌ−１０は、好ましくは、凝集体および他のタンパク質を実質的に含まない精製 された状態においで約５〜２０μｇ／１ｒｉｌの範囲の濃度で処方される。。 本明細書中で用いられるＩＬ−１０の「有効量」とは、養子免疫療法におい１副 作用を減少するまたは防止するのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有 効量は、治療される腫瘍性疾患の状態おｊ：び種類、患者の全身の健康状態、患 者の体重、投与方法、副作用の苛酷さ、同時に用いられる他の薬剤の量および種 類等のような因子に応じて変化することができる。好ま（パは、ＩＩ、−１０は え・ｋｇを静脈内に８時間ごとに与える）。好ましくは、ＩＬ、−２およびＩ　 Ｌ−１０を同時に投与する。 実施例 下記の実施例は本発明を例証するのに役立つ。選択されたベクターおよび宿主、 試薬の濃度、温度および他の変数の値は本発明の適用を単に例証するものであり 、それらの制限と考えるべきではない。 実施例１．細菌宿主におけるヒトＣ３ｌＦの発現合成ヒトＣ３ｌＦ遺伝子は多数 の化学的に合成された二本鎖ＤＮＡフラグメントから組立てられて、ＴＡＣ−Ｒ ＢＳ−ｈｃｓＩＦと称する発現ベクタ・−を生成する。クローニングおよび発現 は、ヴイｊ−ラ（Ｖｉｅｒａ）およびメスイング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）によってＧ ｅｎｅ、Ｊ−９巻、２５９〜２６８頁（１，９８２）に記載された標準的な細菌 システム、例えば、大腸菌に−１２菌株ＪＭＩ０１、ＪＭ１０３等で実施される 。制限エンドヌクレアーゼによる消化およびリガーゼとの反応は、標準的なプロ トコル、例えば、マニアナイスら、ｙ旦１ｅｅｕｌａｒヱ」一旦１り月り必工上 ！ｙ兜ロリ」ユニーＭａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−（Ｃｏ！、ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、二ｐ −ヨーク、１９８２）を用いて行なわれる。 アルカリ性法（マニアナイスら、上記に引用）は小規模のプラスミド調製に用い られる。大規模の調製には、等量のイソプロパツールを用いて清澄化した溶菌液 から核酸を沈澱させるアルカリ性法の変法を用いる。冷２，５Ｍ酢酸アンモニウ ムによる沈澱を用いてＲ，ＮＡを除去した後ｌＪＳ墳化セシウムを用いる平衡密 度遠心分離および臭化エチジウムの検出を行なう。 フィルターハイブリダイセージタンには、ワットマン（Ｗｈ　ａ　ｔ　ｍ、ａ　 ｎ）　５４０フイルターザークルを用いてコロニーを採取り７、次ｇ：、、これ を０．５Ｍ　ＮａＯＨ１１，５Ｍ　Ｎａ１ｌで、続いてＩＭＩ−リスＨＣ１，， ｐＨ８，０，１，５ＭＮａＣ１で処理（それぞれ２分間）１．、た後、８０℃で 加熱（３０分間）する屏こよって溶菌し且つ固定す”る。ハイブリダイセージジ ンは６ｘＳＳＰＥ、２０％ボルムアミド、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）、大腸１１ｉｔＲＮＡ１００ｍｇ／ｍｌ、クーマシー・ブリリアント・ブ ルー（ＣｏｏｍａｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｇ−２５０（バイオ・ ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＬＯＯｒｎｇ、／ｍｌ中において３２Ｐ標識（キナーゼ 処理）合成Ｉ）ＮＡを用いて４２℃で６時間である。（２０ＸＳＳＰＥは、Ｎａ Ｃ１が１７４ｇ。 れる。）フィルターを１ｘｓｓＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄する（室温、１ ５分間）。オ・−トラジオグラフィー（フジ（Ｆｕｊ　ｆ）ＲＸフィルム）の後 、陽性のコロニーは、再増殖］７たコロニーをフィルター上の青色に染色された コロニーと並列するごとによって見出される。ＤＮＡは、ザンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）ら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、、７４巻、５４６３１ｉＩ（ １９７７）のジデオキシ法によって配列決定される。ジデオキシ反応の鋳型は、 Ｍｌ、、３ｍｐベクターに再クローン化された適切な領域の一本鎖ＤＮＡ５　（ 例えば、メスイングら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９巻、３０９ 頁（１９８１，））かまたはミニアルカリ性法によって調製さね、０．２Ｍ　Ｎ ａＯＨで変性され（室温、５分間）、そして２容量のエタノールの添加によって ０．２Ｍ　ＮａＯＨ。 １．４３Ｍ酢酸アンモニウムから沈澱した二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡはアプラ イド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ 合成機を用いてホスホルアミダイト化学によって合成され；合成、脱保護、開裂 および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー ）は３８ＯＡ合成機マニュアルに記載されたように行なわれる。 クローン化される合成りＮＡの相補鎖（それぞれ４００ｎｇ）を混合し且つ反応 容量５０ｍ１中においてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。このＤＮＡ ５を、容量５０ｍ１中において適当な制限酵素で消化されたベクターＤＮＡの１ ｍｇと室温で４〜１２時間連結させる。リン酸り制限酵素による消化、ポリメラ ーゼ反応および連結反応の条件は記載された（マニアナイスら、上記に引用）。 アンピシリン、イソプロピル−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ ０，４ｍＭ）および５−ブロモ−４〜クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク トピラノシド（ｘ−ｇａｌ）（４０ｍｇ／ｍｌ）を補足したＬ寒天上に平板培養 することによってコロニーの１ａｃＺ＋（望まれる場合）を評点する。 ＴＡ（、−ＲＢＳベクターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｔａｅＰ含有プラス ミドｐＤＲ５４０（ファーマシア（Ｐｈａｒｍｃ　ｉ　ａ）の単−ＢａｒｎＨ１ 部位を充填することによって構築される。次に、これを、本明細書中において配 列番号５で与えられ且つＲＢＳと称する共通のリポソーム結合性部位をコードす る二本鎖フラグメントを生成する非リン酸化合成オリゴヌクレオチド（ファーマ シア）に連結させる。連結反応後に、混合物をリン酸化し、５ｓｔｌリンカ−Ａ ＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再度連結させる。次に、この複合体を５ｓｔＩおよびＥｃ ｏＲＩで開裂し、１７３塩基対（ｂ　ｐ）フラグメントをポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離し、そしてＥｃｏＲＩ−８ｓ　ｔ　Ｉで制 限されたｐＵｃｌ９　（ファーマシア）にクローン化された（以下に記載）。最 終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する）のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配 列を図３に示す。 合成ＩＬ−１０遺伝子は８段階でｐＵｃｉ９プラスミドに組立てられる。各工程 において、欠失のないインサートおよび／またはインサートを、工程１で挿入さ れたＡＴＧ開始コドンを有する枠中にｐＵｃｌ９の１ａｃＺ　（α）遺伝子を保 持することによってクローニング後に検出することができる。欠失および／また は挿入変化を含むクローンは、ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むＬ−アンピシリ ンプレート上の青色コロニーを評点することによって除外することができる。或 いは、各工程において、インサートの配列は、例えば、ベーリンガー・マンハイ ム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手可能な小規模プラスミ ド−ＤＮＡ製品に普遍的配列決定プライマーを用いて容易に確認することができ る。 工程１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターを５ｓｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリ メラーゼ（その３′−エキソヌクレアーゼ活性は５ｓｔＩカツトの３′−突出鎖 を消化してプラント末端付きフラグメントを生成する）で処理した後、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼを失活させ、ＥｃｏＲＩで処理して、ＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み 且つＡＴＧ開始コドンにプラント末端および反対の末端にＥｃｏＲＩカットを有 する１７３ｂｐの７ラグメントを生成する。最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢ Ｓフラグメントを単離する。 工程２において、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを、Ｅｃ。 Ｒ１／Ｋｐｎｌで消化したプラミドｐＵｃ１９および、本明細書中において配列 番号６で示されへ以下に示したように、上流末端にプラント末端および下流末端 にＸｐｎｌカットに対応するスタッガー末端を有する合成フラグメントＩＡ／Ｂ と混合する。このＫｐｎｌ末端はＢｓｔＥＩＩ部位に隣接し且つ下流にある。フ ラグメントを連結して工程２のｐＵｃｌ９を生成する。 工程３では、本明細書中において配列番号７で示された合成フラグメント２Ａ／ Ｂおよび本明細書中において配列番号８で示された３Ａ／Ｂを工程２のＢｓｔＥ ＩＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵｃｌ９と混合しく増幅および精製釦且つ連結し て工程３のｐＵｃｌ９を生成する。フラグメント３Ａ／Ｂの下流末端が、Ｓｍａ ｌプラント末端を生成する特別の塩基を含むことに注目されたい。これらの特別 の塩基は工程４で開裂する。更に、フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは、混 合によってアニールする相補的な９残基の一本鎖末端を有し、２Ａ／Ｂの上流の ＢｓｔＥＩＩカットおよび３Ａ／Ｂの下流のプラント末端をｐＵｃｌ９に連結す るように残す。 工程４において、工程３のｐＵｃｌ９をＡｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／ＸｂａＩで消化し、 増幅し、精製し、再精製し、本明細書中において配列番号９で示された合成フラ グメント４Ａ／Ｂと混合し、そして連結して工程４のｐＵｃｌ９を生成する。 工程５において、工程４のｐＵｃｌ、９をＸｂａＩ／５ａｌＩで消化し、増幅し 且つ精製し、そして本明細書中において配列番号１０で示された合成フラグメン ）５Ａ／Ｂと混合し且つ連結して、工程５のｐＵｃ１９を生成する。フラグメン ト５Ａ／Ｂの５ａｉｌ−スタッガー末端が工程６のＨｐａｌでの消化によって除 去されることに注目されたい。 工程６において、工程５のｐＵｃ１９をＨｐａｌ／Ｐｓｔｌで消化し、増幅し且 つ精製し、そして本明細書中において配列番号１１で示された合成フラグメン） ６Ａ／Ｂと混合し且つ連結して、工程６のｐＵｃ１９を生成する。 工程７において、工程６のｐＵｃ１９をＣ１ａＩ／５ｐｈＩで消化し、増幅し且 つ精製し、そして本明細書中において配列番号１２で示された合成フラグメント ７Ａ／Ｂと混合し、そして連結して工程７のｐＵｃ１９を生成する。 工程８において、工程７のｐＵｃ１９をＭｌｕｌ／Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで消化し 、増幅し且つ精製し、そして本明細書中において配列番号１３で示された合成フ ラグメント８Ａ／Ｂおよび本明細書中において配列番号１４で示された合成フラ グメント９Ａ／Ｂと混合し且つ連結して最終構築物を精製し、次に、これを、例 えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌に一１２菌株Ｊ Ｍ１０１中に標準技法によって挿入する。培養後、タンパク質をＪＭＩＯＩ細胞 から抽出し、抽出物の希釈度の生物活性を検査する。 実施例２．Ｃ０８７サル細胞におけるｖｌＬ−１０の発現ｖＩＬ−１０の読み取 り枠をコードする遺伝子は、ＥｃｏＲＩで消化されたｐｃＤ（ＳＲα）ベクター （図１）中への増幅されたフラグメントの後での挿入を可能にするプライマーを 用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。挿入されたフラグメントのコ ーディング鎖を本明細書中において配列番号１５で示す。 適当な配向でインサートを有するクローンは、ｖｌＬ−１０の発現および／また は制限消化の電気泳動パターンによって定義された。ｖｌＬ−１０遺伝子を有す る一つのこのようなベクターをｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）と称し、ＡＴＣＣに受 託番号６８１９３として寄託した。ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）を大腸菌ＭＣ１０ ６１において増幅し、標準法によって単離し、そして下記のようにＣＯ３７サル 細胞をトランスフェクトするのに用いた。トランスフェクションの前日に、Ｃ０ ８７サル細胞約１．５Ｘ１０６個をそれぞれ１００ｍ１のプレート上の５％ウシ 胎児血清（Ｆ　ＣＳ）および２ｍＭグルタミンを含むダルベツコの修飾イーグル 培地（ＤＭＥ）中に播種した。トランスフェクションを実施するのに、Ｃ０８７ サル細胞をトリプシンと一緒にインキュベーションすることによって皿から取り 出し、血清不含ＤＭＥで２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中に細胞１０７個／ ｍｌに懸濁させた。アリコート０．７５ｍ１をＤＮＡ２０μｇと混合し且つ滅菌 ０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベツトに移した。１０分後に、細胞をバ イオラド９ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）装置中 において２００ボルト、９６０μＦで処理した。更に１０分後に、細胞をキュベ ツトから取り出し且つ５％ＦＣ８，２ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプト マイシンおよびゲンタマイシンを含むＤＭＥ２０ｍｌに加えた。その混合物を１ ００ｍｍ組織培養皿４個に分別した。３７℃、５％Ｃ０２で１２〜２４時間後に 、培地を１％ＦＣ３のみを含む同様の培地と取り替え、インキュベーションを３ ７℃、５％Ｃ０２で７２時間続けた後、その培地を集め、そしてＩＦＮ−γ合成 を阻害するその能力について検定した。 新たに単離したＰＢＬのアリコート１０ｍ１（細胞約２×１０６個／ｍｌ）を、 （ｉ）５％ＦＣ８および２ｍＭグルタミンを補足したＤＭＥ９０％と、（ｉｔ） ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）で予めトランスフェクトしたＣＯ３７細胞からの上澄 み１０％とから成る培地中においてＰＨＡ　（１００ｎｇ／ｍｌ）と−緒に３７ ℃でインキュベートした。２４時間後に、細胞および上澄みを採取して、それぞ れＩＦＮ−７ｍＲＮＡかまたはＩＦＮ−γタンパク質の存在について検定した。 対照は、１０％上澄みが、無関係のｃＤＮＡインサートを有するプラスミドで予 めトランスフェクトされたＣ０８７培養物によるものであったことを除き、同一 に処理された。ｖｌＬ−１０で処理された試料は、対照に相対してＩＦＮ−７合 成を約５０％阻害した。 実施例３．大腸菌におけるｖｌＬ−１０の発現本明細書中において配列番号４で 示した成熟ｖｌＬ−１０をコードする遺伝子は大腸菌において発現することがで きる。 ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）のｃＤＮＡインサートをＭ１３プラミドに再クローン 化し、そこにおいてそれは特定部位の突然変位誘発によって２回変更されており 、最初は、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の５′末端のＣｌ ａｌ部位を生成し、次に、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の ３′末端のＢａｍＨ１部位を生成する。次に、突然変位配列は下記に記載したＴ ＲＰＣＩＩ発現ベクター中に容易に挿入される。 ＴＲＰＣＩＩベクターは、合成の共通ＲＢＳフラグメントをＣ１ａｌリンカ−（ ＡＴＧＣＡＴ）に連結し且つ得られたフラグメントをＣ１ａｌに制限されたｐＭ Ｔｌｌｈｃ　（ＣｌａＩ部位を含むように予め修飾された）にクローン化するこ とによって構築された。ｐＭＴｌｌｈｅは、πＶＸプラスミドＥｃｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄ１１１ポリリンカー領域を有するｐＢＲ３２２の小さい（２，３キロベース ）、高コピーの、ＡＭＰＲＳＴＥＴＳ誘導体である。（πｖＸはマニアティスら 、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２に記載されティる 。）これを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでｐＭＴｌｌｈｃを制限し、得られた ステイッキー末端を充填し且つＣ１ａｌリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と連結し 、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を復元し且つＳｍａ！部位をＣ ｌａｌ部位と置き換えることによってＣｌａｌ部位を含むように修飾した。ＴＲ ＰＣＩＩ構築物からの一つの形質転換細胞は、Ｃｌａｌ部位が両側にある縦列Ｒ ＢＳ配列を有した。Ｃｌａｌ部位の一つおよびＲＢＳ配列の二次コピーの一部分 は、このプラスミドをＰｓｔｌで消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理し、Ｅ ｃｏＲＩで制限し、そして４種類全部のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下 においてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって除去された。得られた ３０〜４０ｂｐフラグメントは、ＰＡＧＥによって回収され且つＳｍａＩに制限 されたｐＵｃ１２にクローン化された。次に、ｐＫｃ１０１由来の２４８ｂｐの 大腸菌ｔ　ｒｐＰ含有ＥｃｏＲＩフラグメントにコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）らよ りＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、１０１巻、１５５頁（アカデミ ツク会プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ。 Ｙ、１９８３）に記載をＥｃｏＲ１部位にクローン化して、図２に図示されてい るＴＲＰＣＩＩ構築物を完成した。ＴＲＰＣＩＩは、それを最初にＣ１ａｌおよ びＢａｍＨＩで消化し、それを精製した後、標準的な連結用溶液中において成熟 ＢＣＲＦＩをコードするヌクレオチド配列を含むＭ１３のＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩ フラグメントと混合することによってｖｌＬ−１０のベクターとして用いられる 。ＴＲＰＣＩＩ−ＢＣＲＦＩと称するインサート含有ＴＲＰＣＩＩは、例えば、 ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌に１２菌株ＪＭ１０１ 中で増殖することができる。 実施例４．ヒトＮＫ細胞におけるＩＬ−２誘導インターフェロン−合成および細 胞毒性に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の特異的効果この実施例は、ｒＬ−４ 、ｈ　Ｉ　Ｌ、−１０およびｖｌＬ−１０が、ＩＬ−２に刺激された末梢血液単 核細胞（ＰＢＭＣ）によってインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）および腫瘍壊 死因子−α（ＴＮＦ−α）の合成を阻害するが、ＩＬ−４だけは精製ＮＫ細胞に よるＩＮＦγ合成を阻害するということを示している。補助細胞としてＴ細胞で はない単球を加えることは、ＮＫ細胞によるＩＮＦγ合成に対するｈ　Ｉ　Ｌ− １０／ｖ　Ｉ　Ｌ−１０の阻害作用を復元する。ＩＬ−４とは異なり、ｈ　Ｉ　 Ｌ−１０およびｖｌＬ−１０は、ＩＬ−２よってＰＢＭＣにおいてリンホカイン で活性化されるキラー（ＬＡＫ）活性の誘導を阻害しない。したがって、ＩＬ− ４およびＩＬ−１０は異なる機序によってＮＫ細胞に作用する。 組換え体ｈ　Ｉ　Ｌ−１０、ｖＩＬ−１０およびｈ　Ｉ　Ｌ−４の、ＰＢＭＣに おいてＩＬ−２によって誘導されるＩＮＦγおよびＴＮＦαの合成並びにＬＡＫ 活性に対する効果を試験した。細胞をｒｌＬ−２の２００ｕ／ｍｌ中においてＩ Ｌ−４（２００単位／ｍｌ）かまたは、ｈｌＬ−１０、ｖｌＬ−１０含有若しく はサイトカイン不含（模擬）のＣ０８７上澄みと一緒に５分間培養した後、サイ トカイン合成を測定した。更に、ＬＡＫ活性は、ＬＡＫ細胞によって効率よく死 滅するが新しいＮＫ細胞によっては死滅しないバーキットリンパ腫細胞系ダウデ ィ（Ｄａｕｄｉ）に対して評価された。ｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０またはＩＬ −４を含む培養物中のＩＬ−２に誘導されるＩＮＦγおよびＴＮＦαの合成は実 質的に阻害された（図３）。これに対して、ダウディ細胞に対するＩＬ−２誘導 ＬＡＫ活性はＩＬ−４を含む培養物でのみ阻害さｔＬＳｈｌＬ−１０およびｖｌ Ｌ−１０培養物においては未変化または僅かではあるが増加した（図４ａ）。Ｉ Ｌ−２誘導ＬＡＫ活性は主としてＣＤ５６”　（Ｌｅｕ１９”）ＮＫ細胞によっ て媒介される。フィリップス（ｆ’ｈｉ１口ｐｓ）ら、−ムー互五」工ｙぷ４工 、１６４ｅ、８１．４＝８２５頁（１９８６）およびオータルト（Ｏｒｔａｌｄ ）ら、Ｊ。 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６４巻、１１９３〜１２０５頁（１９８６）を参照された ５６−集団をＦＡＣＳで分類し、そしてダウディ細胞に対する細胞毒性に関して 検査した。図Ａは、Ｉ　！、−２単独の場合と同様に、有意のＬＡＫ活性がＣＤ ５６１集団においてのみ観察されたことを示している。したがって、ＩＮ、−４ およびＩＬ−１０は双方ともＩＮＦγおよびＴＮＦαのＩＬ−２に誘導された合 成を阻害するが、ＩＬ−４だけがＰＢＭＣでのＩＬ−２誘導細胞毒性を阻害する 。 ＰＢＭＣでのＩＬ−２誘導ＩＮＦγ合成の大部分はＴ細胞よりもむしろＮＫ細胞 に由来する。例えば、トリンチーリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）ら、Ｊ２工１ヱエ Ｍｅｄ、、１６０巻、１１４７〜１１６７頁（１９８４）。したがって、ＩＬ− ２誘導ＩＮＦ７合成に対するｈＩＬ−１０，ｖｌＬ−１０および１Ｌ−４の効果 は、ＦＡＣＳで精製されたＮＫ細胞（純度＞９９．５％）によって検査された。 ＩＬ−４は、これらの細胞によるＩＬ−２誘導ＩＮＦγ分泌を阻害し；これに対 して、ｈＩＬ−１０も、ｖＩＬ−１０も、精製された新しいＮＫ細胞によるＩＮ Ｆγ合成を抑制しな力じた（図５ａ）。 純粋なＮＫ細胞ではなくＰＭＢＣの培養物においてＩＮＦγ合成がＩＬ−１０に よって阻害されたということは、ＩＬ−１０のこの効果が補助細胞集団によって 媒介されたことを示唆した。ＮＫ細胞は、パーフル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配遠＋ 心分離によって得られた低密度細胞画分からＣＤ５６　細胞を分類することによ って精製さね、そしてプラスチック付着性細胞または高密度細胞集団（Ｔ細胞９ ８％）と混合された。ＮＫ細胞に対する付着性細胞の添加は、ＮＫ細胞によるＩ Ｌ〜２誘導ＩＮＦγ生産を大きく増加させた。付着細胞のこの刺激作用はＩＬ− １０によって阻止された（図５ｂ）。Ｔ細胞含有画分は、ＮＫ細胞によるＩＬ− ２誘導ＩＮＦγ生産に対して作用しなかったし、しかも１−１０によるＩＮＦγ 生産の阻害を媒介しなかった（図５ｂ）。プラスチック付着性細胞の大部分は単 球であるが、単球はＩＬ−２誘導ＩＮＦγ生産を増大させるし、しかもＩＬ−１ ０によるその阻害も媒介するということが確証されており：ＮＫ細胞およびＣ０ １４＋単球は分類することによって精製されし月っＩＬ−２およびＸｉ、−１０ の存在下で培養された。図３０は４、ＮＫ細胞に対して精製された単球を加える ことがＩＬ−２誘導ＩＮＦγ生産を増大さぜるということを示している。更に、 ＩＬ−１０は単球の存在下においてのみＩＬ−２誘導ＩＮＦγ生産を阻害し、た 。 これらの結果は、ＩＬｉおよびＩＬ−１０（ヒトまたはウィルス）は、ＩＩ、・ −２に刺激されたＰＢＭＣによるＩＮＦγおよびＴＮＦαの合成を抑制［、たが 、ＩＬ−４だけはＸＬ−２誘導ＬＡＫ活性を阻害したことを示している。これら の観察は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導サイトカイン生産および細胞毒性が異な る経路によって調節されていることを示している。更に、ＮＫ細胞によるＩＮＦ γ合成に対するＩＬ−１０の阻害作用は間接的であり且つ単球によって媒介され るＭＣによってＩＮＦγ合成を阻害する（図３）。ヒトＰＢＭＣは、フィコール ・ハイパクーでの遠心分離によって健康な提供者からのバフィーコートから単離 され且ツｒ　Ｉ　Ｌ−２（２００単位／ｍｌ）中１０６／ｍｌで、ｒＩＬ−４（ ２００単位／ｍ１）かまたは、１％ヒトＡＢ十血清含有イセル（Ｙｓｓｅｌ’　 ｓ）培地（イセル（Ｙｓｓｅｌ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、７２巻、２ １９〜２２７頁（１９８４）を参照されたい）中１０％Ｃ０８−ｈＩＬ−１０， １，０％Ｃ０８−ｖｌＬ−１０若しくは１０％ＣＯ５−模擬と一緒に培養した。 培養は、２４ウエルプレート中で行なって、上澄みを、例えば、シューら、５ｃ ｉｅｎｃｅ。 ２５０巻、８３０〜８３２頁（１９９０）に記載されたように、エライザによっ てＩＮＦγを測定するために採取した。更に、ＴＮＦαをエライザによって測定 した（エンドジエン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ボストン、ＭＡ）。ＩＬ−２不存在で のサイトカイン生産は、それぞれ０．３ｎｇ／ｍｌおよび１０ｐｇ／ｍｌであっ たＩＮＦγおよびＴＮＦαエライザの感受性の限界未満であった。エラーパーは 二重反復試料の範囲を示す。異なる提供者からのＰＢＭＣは、ＩＬ−２によって 刺激された場合のＩＮＦγおよびＴＮＦαを生産するそれらの能力が異なったが ；しかしながら、これらの実験は、（ＩＮＦγに関しては）１２回および（ＴＮ Ｆに関しては）３回を上回って繰返さね、定性的に同様の結果であった。 ｈＩＬ−１０またはｖｌＬ−１０ではな（ＩＬ−４が、ＰＢＭＣにおいてＩＬ− ２によって誘導された細胞毒性を阻害する（図４ａ）。図１の場合と同様の実験 によるＰＢＭＣを上澄みと一緒に採取し、５１０ｒ標識ダウデイ細胞に対する細 胞毒性に関して検査した。ＬＡＫ活性は、ＩＬ−２およびＩＬ−１０と一緒に培 養されたＰＢＭＣ中のＣＤ５６＋細胞によって発現される（図４ｂ）。ＰＢＭＣ を、ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ５６抗体で染色し、ファクスター・プラス５６− （純度９９．７％）画分の細胞毒性活性を、スピッツら、Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４１巻、２９〜３６　（１９８８）に記載されたように検 査した。 精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＮＦ７合成は、ｈｌＬ−１０またはｖｌＬ− １０によってではなくＩＬ−４によって直接的に阻害される（図５８）。ＦＡＣ Ｓで精製したＮＫ細胞（純度＞９９．５％）をｒＩＬ−２が２００単位／ｍｌの 細胞１０６個／ｍ！で、ｒＩＬ−４が５００単位／ｍｌかまたは、イセル培地中 のＣ０３−ｈｌＬ−１０、Ｃ０３−ｖ　Ｉ　Ｌ−１０若しくはＣＯ３−模擬上澄 み（１０％）と−緒に４〜５日間培養した後、二重反復培養からの上澄みを集め 且つエライザによるＩＮＦγの測定用に混合した。Ｔ細胞ではない付着性細胞の 添加は、精製されたＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＮＦγ合成のＩＬ−１０に媒 介された阻害を復元した（図５ｂ）。精製された単球の添加は、精製されたＮＫ 細胞によるＩＬ−２誘導ＩＮＦγ合成のＩＬ−１０に媒介された阻害を復元した 。 単球単独ではＩＮＦγを生産しなかった（図５ｃ）。ＰＢＭＣを洗浄し且つ組織 培養血中において３７℃で４０分間インキュベートした。付着性細胞をラバーポ リスマンで掻取ることによって集めた。非付着性細胞を除去し、ペレットにし、 そしてナイロンウールカラムに適用し且つ３７℃で４０分間インキュベートした 。 カラムからの溶離後、細胞をペレットにし且つ１０％Ｆ　ＣＳ／Ｐ　Ｂ　Ｓ含有 ３０％バーコル中に再懸濁させ、そして４０％パーコルに重層した。室温で３０ 分間遠心分離後、界面にある多量の顆粒リンパ球を回収し且つ２回洗浄した。こ れらの細胞を抗ＣＤ５６抗体（ベクトン・ディキンソン、サン・ホセ、ＣＡ）と −緒に４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ （ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃ ｂ）、ニーボンゾール、ＰＡ）で染色した後にＦＡＣＳで分類した。ＣＤ５６＋ 細胞はで前記のようにＩ　Ｌ−２＋ｈ　Ｉ　Ｌ−１０、ｖｌＬ−１０日または模 擬上澄みと一所に培養した。上澄みを採取し且つＩＮＦγ生産に関して検査した 。エラーパーは二重反復試料の範囲を示す。同一の提供者からのＮＫ細胞および 単球は以下のように得られた。すなわち、ＰＢＭＣをヒツジ赤血球と一緒に一晩 中インキュベートし；ロゼツト形成（ＣＤ２＋）およびロゼツト非形成細胞を、 フィコール・ハイパクー勾配での遠心分離によって分離した。Ｅ子細胞に、ＰＭ ＢＣに関して記載したのと同じ精製法佳記を参照されたい）を施して、精製され たＮＫ細胞を得た。Ｅ−細胞を引き続き抗ＣＤ１４ｍＡｂ　（ＬｅｕＭ３）およ びＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、ＣＤ１４＋ 細胞をファクまたは前記に記載したようにＩＬ−２＋ｈｌＬ１０、ｖｌＬ−１０ 若しくは模擬上澄みと一緒に培養した。上澄みを採取し且つＩＮＦγ生産に関し て検査した。 ＩＬ−２不存在でのＩＮＦγ生産は現出限界未満であった。エラーパーは二重反 復試料の範囲を示す。異なる提供者からのＮＫ細胞はＩＮＦを生産するそれらの 能力が異なった。 本発明の前述の実施態様の記載は例示および説明の目的で提示された。それらは 本発明を開示された明確な形式に徹底しまたは制限するためのものではなく、前 記の内容に照らして多数の修正および変更が可能であることは明らかである。 本発明の原理を最もよく説明し、それによって当業者が考えられる特定の使用に 適当であるような様々な実施態様でおよび種々の変法を用いて最もよく用いるこ とが可能であるように実施態様を選択し且つ記載した。それは、本発明の範囲が 請求の範囲によって定義されることを意味する。 １９８９年１２月２０日に、本出願人は、ｐＨＣ３Ｃ，ｐＨｃ１５ＧおよびｐＢ ＣＲＦＩ　（ＳＲα）を有する大腸菌ＭＣ１０６１の個別の培養物をアメリカン Φタイプ・カルチャー慟コレクション、ロックビル、ＭＤ、ｔＪｓＡ　（ＡＴＣ Ｃ）にそれぞれ受託番号６８１９１，６８１９２および６８１９３として寄託し た。 これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託に関するＡＴＣＣの承認に基いて 与えられる条件に基づいて行なったものであり、これは、その寄託が米国成文法 ３５条１２２および米国規制基準３７条１．１４に従って米国特許商標局長に対 して利用可能にさせるものであることおよび寄託が維持されることを必要とする 米国特許証の発行によって国民に対して利用可能にさせるものであることを保証 する。寄託された菌株の入手可能性は、いかなる政府の特許法によるその代理権 の下でも、付与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈されるべ きではない。 寄託はブダペスト条約の要件を満たすように修正された。 配列表 配列番号：１ 配列の種類二アミノ酸 配列の長さ：１７８アミノ酸残基 ストランドニー重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：タンパク質 超厚生物：ヒト 性状：ヒトＩＬ−１０（ヒトサイトカイン合成阻害因子、ヒトＣ３ｌＦ）Ａｓｐ 　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ 　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎ配列番号＝２ 配列の種類・アミノ酸 配列の長さ：１７０アミノ酸残基 ストランドニー重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：タンパク質 性状：ウィルスＩＬ−１０（ＢＣＲＦＩ）配列番号・３ 配列の種類二アミノ酸 配列の長さ・１６０アミノ酸残基 ストランドニー重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：タンパク質 超厚生物：ヒト 性状：成熟ヒトＩＬ−１０（成熟ヒトＣ３ｌＦ）Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｈｉｓ　ＰｈｅＳ　１０　１５ 配列番号：４ 配列の種類、アミノ酸 配列の長さ：１４７アミノ酸残基 ストランドニー重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：タンパク質 性状：ウィルスＩＬ−１０（ＢＣＲＦＩ）Ｌｅｕ　ら１．ｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｉ　 Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　八ｌａ　Ｇ１．＋】　八３ｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒ ｏ　Ｇ１１ｌ　八１δ６５　’７０　’７５ 配列番号：５ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ：１５塩基 ストランドニー重 トポロジー・直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源：合成（市販、ファーマシア）特徴・共通のリポソーム結合性部位 をコードする二本鎖フラグメントＧＴＭＧＧＡＧＧＴ　ＴＴＡＡＣ１ｓ 配列番号二６ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ：４塩基ステイッキー末端を有する５６塩基対ストランド二二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源１合成 特徴　小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状・合成Ｃ３ｌＦのフラグメン１−ＩＡ／ＢＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡにＧＧＣ ＡＣＣＣＡ　ＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣ八ＧＧ 　へ。 配列番号二“１ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ＝５および９塩基のスティッキー末端を有する４８塩基対ストランド 　二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴：小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状二合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメント２Ａ／ＢＧｔＭＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣ ＡＴＧＣＴＴ　ＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴ　ＣＡＧＣＡＧＡＧ ＴＧ　５０ＧＡＣＧＧ　ＡＴＴＧＴＡＣＧＭ　ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧ　ＣＴＣＴ ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴ　ＴＴ　６２ 配列番号＝８ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ：９塩基のスティッキー末端を有する３５塩基対ストランド二二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：　ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴：小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状１合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメント３Ａ／２３配列番号：９ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ：４塩基ステイッキー末端を有する６９塩基対ストランド：二重 ｌ・ボロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源二合成 特徴　小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状：合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の７ラグメント４　Ａ／Ｂ配列番号：１０ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ′４塩基ステイツキー末端を自する６１塩基対スト・う：／ド・二重 トポロジー・直鎖状 分子の種類　ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴　小文字は、塩基か同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状　合成Ｃ３ｉＦ遺伝子のフラグメント５Ａ／Ｂ配列番号＝１１ 配列の種類　ヌクレオチド 配列の長さ：４塩基スティッキー末端を有する６１塩基対ストランド：二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：　ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴、小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示ｔ、。 性状・合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメント６Ａ／ＢＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧ　ＧＧ ＧＡＧＡＡＣＣＴ　ＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧ ＣＴＧ　’、、〕０ＴＴＧ八ＧＧＧＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＡ　ＣＴＴＣＴＧ ＧＧ八Ｇ　ＴＣＣへＡＣＴＣＣＧ　ＡＴＧＣＣ（−ＣＧＡＣ配列番号・１２ 配列の種類、ヌクレオチド 配列の長さ。 ストランド・二重 トポロジー・直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴：小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示４３、性 状・合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメンｌ−７Ａ／Ｂ配列番号：１３ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ　４５塩基対並びに４および９塩基のステイツキー末端ストランド： 二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源：合成 特徴：小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状：合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメント８Ａ／Ｂ配列番号：１４ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ＝９および４塩基のスティッキー末端を有する５１塩基対ストランド 二二重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 直接の実験源二合成 特徴：小文字は、塩基が同一部位の天然配列のそれとは異なることを示す。 性状：合成Ｃ３ｌＦ遺伝子のフラグメント９Ａ／ＢＡＣＧＡＭＣＴＧＡ　６０ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴ　ｔｃｇａ 配列番号：１５ 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ・４９９塩基 ストランドーー重 トポロジー：直鎖状 分子の種類：ＤＮＡ 性状：エンコードウイルスＩＬ−１０ ＡＡＴ丁ＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＣＴ　 ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＴＧ　４４ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＴＡＣＣＴＧ　 ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＣＭ　ＴＧ Ｔ　８６ＧＡＣＭＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣ鮎ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣＣＴ Ａ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＴＴＣ１２εＡＧＴ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＭＡ　ＡＣ ＣＴＴＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＡＣＡ　ＭＧ　ＧＡＣＧＡＧ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　１７ Ｃ入ＡＣＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　Ｇ ＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＡＡＧ　ＧＧＣ２］２ＴＡＣＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＧＣＣＡ Ｇ　ＧＣＣＣＴＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＡＡ　ＴＴＣＴＡＣ２５ ４ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＭ　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　Ｍ ＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＧ　ＧＡＧ　２９６ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＡＴ　ＧＴ ＣＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＡＣＣ ３３８ＣＴＡ　ＣＧＧ　ＣＴＣＣＧＣＣＴＧ　ＣＧＣＡＧＧ　ＴＧＣＣＡＣＡＧ Ｇ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　３８０ＧＡＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＧＴ　Ａ ＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＡＴＡ〜購触Ｔ　ＧＣＣＴＴＴ　４２ ２ＡＡＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＴＡＣＡ ＡＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　４６４ＴＴＴ　ＧＡＣＡＴＴ　ＴＴＴ　 ＡＴＴ　ＡＡＣＴＡＣＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＴＡＣＡＴＧ　八ＣＡ　ＡＴＴ 　５０６人入Ａ　ＧＣＣＡＧＧ　ＴＧＡ　Ｇ　５１９ａＩ ＩＦＮＹ、　ｎｇ／ｍ１ ＴＮＦα、　ｐｇ／ｍｌ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒｅ　４Ａ ３０：１　１０：１　３：１　１：１　（Ｅ：Ｔ）国際調査報告 Ｆヴｍベゴｎす／１１０１−寝一酌ｍ　＄２１１１ηト咋剖謹鼾石電、、−６゜ １４ｃｍ−！−０ＰＣＴ八ｌ５９２１０００６７国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＳ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。 ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、５Ｄ （７２）発明者　スピッツ、ハーケン アメリカ合衆国カリフォルニア州９４３０３゜パロ・アルド、マレ−・ウェイ　 ３２７１

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．癌患者を治療する方法であって、 インターロイキン−２およびインターロイキン−１０の存在下において腫瘍浸潤 性リンパ球が増殖するように腫瘍浸潤性リンパ球を培養し；培養された腫瘍浸潤 性リンパ球を該患者に対して投与し；そして培養された腫瘍浸潤性リンパ球の投 与後に、有効量のインターロイキン−２および有効量のインターロイキン−１０ を該患者に対して投与する工程を含む上記の方法。
2. ２．前記の患者から切除された腫瘍から腫瘍浸潤性腫瘍リンパ球を提供する工程 を更に含む請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の培養された腫瘍浸潤性リンパ球を投与する前記の工程が、腫瘍浸潤性 リンパ球約１×１０１０〜約２×１０１１個を静脈内注入によって投与すること を含む請求項１に記載の方法。
4. ４．インターロイキン−２およびインターロイキン−１０の存在下において腫瘍 浸潤性リンパ球が増殖するように腫瘍浸潤性リンパ球を培養し；培養された腫瘍 浸潤性リンパ球を患者に対して投与し；そして培養された腫瘍浸潤性リンパ球の 投与後に、有効量のインターロイキン−２および有効量のインターロイキン−１ ０を患者に対して投与する工程を含む、患者の癌の治療のためのインターロイキ ン−２およびインターロイキン−１０の使用。
5. ５．培養された腫瘍浸潤性リンパ球の投与後に、有効量のインターロイキン−２ および有効量のインターロイキン−１０を患者に対して投与する工種を含み、 該腫瘍浸潤性リンパ球がインターロイキン−２およびインターロイキン−１０の 存在下において腫瘍浸潤性リンパ球が増殖するように培養されたものである患者 の癌の治療において有用な薬剤の製造に対するインターロイキン−２およびイン ターロイキン−１０の使用。
6. ６．腫瘍浸潤性リンパ球の培養のためのおよび癌の治療において前記の培養され た腫瘍浸潤性リンパ球の投与後にヒト患者に対して投与するためのインターロイ キン−２およびインターロイキン−１０の使用。
7. ７．インターロイキン−２およびインターロイキン−１０の存在下において腫瘍 浸潤性リンパ球が増殖するように腫瘍浸潤性リンパ球を培養する工程を含む、癌 を治療するのに用いるための腫瘍浸潤性リンパ球を培養する方法。
8. ８．増養された腫瘍浸潤性リンパ球を癌に苦しむ患者に対して投与する工程を含 む、請求項７に記載の方法。
9. ９．培養された腫瘍浸潤性リンパ球の投与後に、有効量のインターロイキン−２ および有効量のインターロイキン−１０を患者に対して投与する工程を食む請求 項７または請求項８に記載の方法。