JPH06505803A - マルチテスト免疫化学的試薬及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５１、前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロブリンである、請 求項４７に記載の方法。

１つ占　１ マルチテスト免疫化学的試薬及びその使用方法関連出願の相互参照 本出願は、今や米国特許第４．５１７．２８８号である１９８１年１月２３日出 願の”５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌｉｇａｎｄ　Ａｓ５ ａｙ”　と題した米国出願番号２２７．６６４の一部継続である、１９８５年１ 月２２出願の米国出願番号６９３．５６９（７）継続である、１９８９年１月３ 日出願の出願番号０７／２９４．９３１（７）係属中の出願の一部継続である。

発明の背景 発明の分野： 本発明は、方法及び組成物に向けられている。より具体的には、本発明は、それ 自身、種々のイムノアッセイを実施するために使用されるマルチテスト固相又は 支持体（すなわち多孔性媒体）に関する。

先行技術の記述： イムノアッセイに関係した技術及び特許文献にこれまで記述されてきた種々の技 術は、一般に、反応生成物（一般に関心のある分析物を含有する）の単離／検出 のための４つの基本工程を伴う。通常の形のイムノアッセイは、関心のある分析 物のリガンド（抗原又は抗体）との免疫化学的相互作用を伴いそれによって免疫 沈澱物の形成をもたらし、そして免疫沈澱物の存在は分析物の存在を示す。免疫 複合体が溶液中に留まっている場合には、第２の抗体の添加によって（すなわち 、二重抗体沈澱法）それは容易に沈澱させることがこれらのイムノアッセイの一 層洗練されたもの（半定量的及び定量的）は、均質的イムノアッセイ（ｈｏｍｏ ｇｅｎｅｏｕｓ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　；及び、古典的不均質システムを 含むものである固相イムノアッセイ（すなわち、米国特許第３．６５４．０９０ 号）、多数区域固相システム（＋ｎｕ　１ｔｉｐｌｅ　ｚｏｎｅ　５ｏｌｉｄ　 ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ）　（すなわち、米国特許第４．２５８．００１号） 及び固相放射状分割イムノアッセイシステム（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｒａｄｉ ａｌ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ）　（すな わち、米国特許第４゜５１７、２０８号）と一般に呼ばれている。現在使用され ているタイプの均質的イムノアッセイシステムにおいては、アッセイ全体が、単 一の、本質的に液相内で実施される。反応体、サンプル及び指示薬は同じ液体画 分内に含有され、そして指示薬の量のモニタリングは、免疫化学的に結合した材 料と液体中に遊離のまま留まっている材料との間でのいかなる分離もなしに行わ れる。

技術及び特許文献に記述された古典的な不均質イムノアッセイにおいては、免疫 化学的反応の一成分が、しばしば固相又は支持体に固定化される。そのような固 定化がめられるのは、そのようなシステムにおける、免疫化学的に結合した成分 （該固相に結合していると考えられる）を結合していない成分から分離するとい う必要による。このシステムは、結合した材料（固相）と結合していない材料（ 液相）とが２つの相互に排他的な画分へと分離されるべきことを伝統的にめてい る。このシステムにおける固相上への免疫化学的反応体のうちの一つの固定化は 、そのような分離を達成するための最も実際的な手段を提供する。

上に参照された特許に記述された多数区域固相システムは、前述の古典的不均質 アッセイに類似する免疫化学的相互作用を伴うが、しかしながら、より移動性の 成分からの固定化された成分の分離は、−の隣接区域（すなわち隣接層）から他 へのその移転又は溶出によって達成される。

第４のイムノアッセイシステムは、ごく最近に発展したものであるが、古典的不 均質イムノアッセイ及び均質的イムノアッセイの双方の混成であり、しかも上述 の多数区域システムから区別される。

この混成は、「固相、放射状分割イムノアッセイ」として一層記述的に特徴づけ られるが、固相内への免疫試薬（すなわち、抗体）の固定化を最初に伴う。それ に続いて、患者のサンプルの部分量が、該固定化された免疫試薬を含有する固相 の部分に適用される。短いインキュベーション時間の後、第２の免疫試薬（一般 に、指示薬に接合したリガンド）が同様の仕方で該固相に適用され、そして分析 プロトコール（すなわち、競合的又はサンドイッチアッセイ）の性質に応じ、免 疫試薬（これは該固相内に固定化されている）か又は患者のサンプルからの分析 物かのいずれかと相互作用させられる。

固定化された免疫試薬を含有する固相へ種々の材料が適用される仕方は、該固相 内における反応区域を規定する。そのような相互作用に続いて、この反応区域上 に洗浄溶液が加えられることができ、それによって結合していない材料（すなわ ち、該固定化された試薬と直接又は間接的に免疫化学的に反応しなかった材料） が、放射状のパターンで該反応区域から溶出され、それによって結合していない 材料を本質的に含まない領域を該反応区域内に作り出す。このタイプのアッセイ が単一の固相の全く内部において材料のそのような再分配を達成する能力は独特 であり、分析物の量のモニタリング及び定量を妨害し得る材料を、反応区域のそ の部分から、効果的に排除する。

古典的不均質イムノアッセイシステム及び一層最近に開発された固相放射状分割 アッセイについての上の議論から明らかなように、そのようなシステムは双方共 に、その成功のためには、結合した材料と結合していない材料とのきれいな分離 に依存している。放射状分割イムノアッセイにおいては、そのような分離は単一 の固相の全く内部において起こり、これに対し、古典的不均質システムにおいて は、固相及び液相は２つの相互に排他的な画分へと分離される。

そのような固相システムにおいては、固定化された免疫試薬の吸着されている固 相が本質的に不活性であることが、望ましくもあり、また場合によっては必須で もある。この要件は、蛋白質及び他の材料の非特異的結合を回避し、それによっ て免疫化学的反応の結合選択性の妨害又は歪みを防止するために、必須であると 技術的に認識されている。

免疫試薬を固相の表面上に固定化することのできる種々の機序は、吸着、吸収又 は共有結合を含むいずれの機序又はその組合せをも伴うことができる。米国特許 第４．１６８．１４６号（Ｇｒｕｂｂ）を参照のこと。Ｇｒｕｂｂは、異なる種 々の基質（すなわち、セルロース含有材料、酢酸セルロースフィルム又はシリカ を含有する微小多孔性プラスチックシート）に抗体を共有結合的に結合させるた めに、臭化シアノーゲン及びグルタルアルデヒドを含む種々の試薬を使用してい る。

不幸なことに、これらの同じ基質の多くが比較的免疫化学的に反応性であり、サ ンプルから蛋白質を無差別に吸着する傾向がある。ガラスのような比較的不活性 な基質を用いようとするとき、同相イムノアッセイにおいて使用するには（例え ば抗体又は他の免疫試薬の）吸着量が一般的に不満足である。ガラス基質の不十 分性の議論については、米国特許第３．７９０．６６３号（Ｇａｒｒｉｓｏｎ） を参照のこと。

免疫化学のためのマトリックスとしては不活性な基質が望ましいということのた め、そのような不活性な材料をイムノアッセイ手順に適合させるために努力が続 けられてきた。そのような試みの一つは、ガラス繊維マトリックス内における抗 体の共沈を伴うものであった。米国特許第３．８８８．６２９号（Ｂａｇｓｈａ ｗｅ）を参照のこと。蛋白質性材料の非特異的吸着の問題を扱っているとき、Ｂ ａｇｓｈａｗｅは、マトリックスへの免疫原の非特異的結合を防止するために、 彼の固相又はマトリックスをアルブミンのような高分子物質で前処理することを 試みた。彼の発明の代わりの具体例の一つにおいて、Ｂａｇｓｈａｗｅはまた、 マトリックスの隙間内に免疫沈澱物を形成することにより彼のマトリックスを免 疫試薬に対して感受性にするための手順をも記述した。こうして、免疫沈澱物の 粒子は、マトリックス内に物理的に閉じ込められた。従って、Ｂａｇｓｈａｗｅ は、彼の免疫試薬の保持のために不活性なマトリックスの吸着特性に依存するこ となく比較的不活性なマトリックス（ガラスが適当な媒体のうちに掲げられてい る、第＊＊、第４１行）を彼が使用できるようになったという点において、彼の 発明を、先行技術のシステムのいくつかの欠点を克服するものと考えた。

直ちに認識できるように、免疫沈澱物中の免疫試薬の単位当たりの結合活性の量 の比較は、同じ免疫試薬が固相に吸着された場合の免疫試薬の単位当たりの活性 より有意に低い。従って、不活性な材料の感受性化に関する問題に対するＢａｇ ｓｈａｗｅのアプローチが有効であるように見えた一方、試薬の利用の観点から は、それは非常に非効率的であり、精々、長年の問題に対する間に合わせの解決 に過ぎなかった。更に明らかなように、（Ｂａｇｓｈａｗｅが用いたタイプの） マトリックスとの免疫試薬の組合せの好ましい形態は、高い表面積特性を完全に 利用するよう、そのような材料を該マトリックスの表面上に吸着させることであ ろう。従ってで、固相との関連における免疫沈澱物のＢａｇｓｈａｗｅによる使 用は、精々、妥協であって免疫試薬及び／又は不活性なマトリックスのいずれを も最も有効に使用するには至っていない。

こうして、不活性な固相支持体又は媒体の表面上に免疫試薬を吸着させるための 方法に対する需要が引続き存在している。理想的には、そのような方法は、この タイプの支持体の高い表面積特性の利用と一致し、しかも免疫試薬の消費を最小 限にするものでなければならない。

上記の及び関連した目的が、本質的に不活性な多孔性媒体に免疫試薬を吸着させ るための、免疫試薬及び該免疫試薬に対する抗血清よりなる本質的に可溶性の免 疫複合体を吸着条件下において前記多孔性媒体に適用することよりなる、改良さ れた方法を提供することによって、達成された（米国特許第４．５１７．２８８ 号）。該多孔性媒体上に吸着される可溶性の免疫複合体の量は、具体的なイムノ アッセイにおいて、関心のある分析物を該多孔性媒体の有限な領域内の該免疫試 薬に選択的に結合させて保持するのに有効であると実験的に決定されたところに 基づいていた。従って、有効量の規定は、イムノアッセイ間で変動し、更に、固 相の物理的幾何学形態とアッセイ結果がモニターされる仕方とに依存し得る。し かしながら、この方法の欠点の一つは、異なるタイプの各イムノアッセイのため には多孔性媒体上に吸着された異なる可溶性の免疫複合体が必要であるというこ とであり、そのようなものとして、種々のイムノアッセイにおいて使用できるマ ルチテスト免疫反応体を開発する必要が存在する。

発明の概要 従って、上述の欠点を解消することが本発明の目的の−っである。特に、本発明 は、不活性な多孔性媒体上に吸着された二次抗体より作られた免疫化学的試薬を 提供する。より具体的には、本発明は、不活性な多孔性媒体上に吸着された、特 定の種に対する抗血清より作られた免疫化学的試薬を提供する。該抗血清は、例 えば、ヤギ抗マウス、ヤギ抗家兎、ヤギ抗ヒツジ、ヒツジ抗ヤギ、家兎抗ヤギ、 ロバ抗ヤギ又はより一般的に、第２の種抗第１の種であってよい。本発明の目的 には、抗血清はここに「二次抗体Ｊと呼ぶことができる。該二次抗体は、精製さ れていても未精製でもよい。加えて、種々の特定の動物種の組合せを固相に適用 することもできる。不活性な固相又は支持体の表面上に吸着されたこれらの免疫 試薬は、非常に多くのイムノアッセイに使用することができる。

特に、本発明は、未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイ を実施するための方法であって、該方法が：　未知の量の分析物について液体サ ンプルの固相イムノアッセイを実施するための方法であって、該固相が本質的に 、固相上に固定化された二次抗体よりなり、該方法が二　分析物−一次抗体複合 体及び複合体形成をしていない一次抗体の液体混合物を形成するために、結合条 件下において該分析物を含有する液体サンプルと該−次抗体とを合わせ：分析物 −−次抗体複合体及び複合体形成をしていない一次抗体を結合させるために、結 合条件下において該液体混合物を該固体支持体に適用し：結合した、複合体形成 をしていない抗体と結合させるために又は結合した分析物と結合させるために、 結合条件下において指示薬を該固相に適用し：酸指示薬が該固体支持体上に存在 する程度を観察し；そして該指示薬が該固体支持体上に存在する該程度を該サン プル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

該指示薬はまた、該液体サンプルに加えてもよく、これは、各成分を同時に加え るか又は該指示薬の添加前に該分析物と抗体とを短時間インキュベートさせるこ とにより、行うことができる。結合条件は更に、Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｌａ ｂｏｒａｔｏ■Ｔｅａｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒ ｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１２３−１４５．　（４版 １９８７）　（参照によりここに導入する）に記述されている。

本発明の文脈において、術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。該接 合体は、アッセイ方式に応じ抗体であるか又は分析物である。該標識は、接合体 と直接的又は間接的に結合した蛍光的、酵素的、比色的又は放射測定的化合物で ある。該標識は、基質との接触に際して蛍光を発生する酵素的化合物よりなるこ とができる。指示薬が固体支持体上に存在する程度は、未知の分析物の量に関係 づけることができる。Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ＢｉＯＣｈｅｍｉＳｔｒｙ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍ ｅ　［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１７３−２１７及び３６８−３７６　（４版１９ ８７）　（参照によりここに導入する）。

本発明はまた、未知量の分析物についての液体サンプルの固相イムノアッセイを 実施するための方法であって、該固相が本質的に、固体の、不活性な多孔性の支 持体の隙間の有限な区域内に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法 が：　分析物−一次抗体複合体及び複合体形成をしていない一次抗体の液体混合 物を形成するために結合条件下において該分析物を含有する液体サンプルと一次 抗体とを合わせ：分析物−−次抗体複合体及び複合体形成をしていない抗体を結 合させるために結合条件下において該液体混合物を該有限な区域の中心に適用し ：複合体形成をしていない抗体と結合させるために結合条件下において該固体支 持体に指示薬を適用し；該反応区域の限定された領域内に該指示薬が存在する程 度を観察し：そして該限定された領域中に該指示薬が存在する該程度を該サンプ ル中の未知の分析物の量と関係付けることを伴うものである方法をも提供する。

加えて、本発明は、未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセ イを実施するための方法であって、該方法が：　未知の量の分析物について液体 サンプルの固相イムノアッセイを実施するための方法であって、該固相が本質的 に、固体支持体上に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法が：　結 合条件下において該固体支持体に一次抗体を適用し；結合条件下において該固体 支持体に該液体サンプルを適用し；結合した、複合体形成をしていない抗体と結 合させるために、結合条件下において該固相に指示薬を適用し；該固体支持体上 に該指示薬が存在する程度を観察し；そして該固体支持体上に該指示薬が存在す る該程度を該サンプル中の未知の分析物の濃度と関係づけることを伴うものであ る方法を提供する。

本発明はまた、未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを 実施するための方法であって、該固相が本質的に、固体の、不活性な多孔性支持 体の隙間の有限な区域内に固定化された二次抗体よりなり、該方法が：　結合条 件下において該固体支持体の有限の区域の中心に一次抗体を適用し；複合体形成 をしていない抗体と結合させるために結合条件下において該固体支持体に指示薬 を適用し：結合条件下において咳固体支持体の有限の区域の中心に該液体サンプ ルを適用し；該反応区域の限定された領域内に該指示薬が存在する程度を観察し ；該限定された領域中に該指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知の分析 物の量と関係づけることを伴うものである方法をも提供する。

図面の簡単な説明 図１は、不活性な多孔性マトリックス上に吸着されたパーセント（％）ヤギ抗マ ウスイムノグロブリンに対する、較正標準の応答を示す。

図２は、正常家兎血清中におけるパーセント（％）ヤギ抗家兎に対する応答を示 す。

図３は、家兎抗エストラジオールの滴定を示す。

図４は、５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎ ｃ、）エストラジオールとマルチテスト較正曲線との比較を示す。

図５は、５ＴＲＡＴｔＪＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉ ｎｃ、）性能とマルチテスト法とによる、エストラジオール濃度に対する応答の 比較を示す好ましい具体例を含む発明の詳細な説明本発明によって意図されるマ ルチテスト免疫試薬は、種特異的抗血清又は相同種からの抗血清がそれに吸着さ れている、多孔性の不活性な媒体である。これらの試薬は、特異的抗体を含まず 、いかなる−次抗体をも結合可能である。特に、該多孔性の不活性な媒体に吸着 される抗血清としては、ヤギ抗家兎及びヤギ抗マウス抗血清が良好に機能する。

抗血清は、第１の種からのイムノグロブリンを第２の種に注射することによって 調製される。第２の種は、第１の種のイムノグロブリンに対する抗血清（すなわ ち、より一般的には第２の種抗第１の種）を作り出す。本発明の目的のためには 、抗血清は、ここに二次抗体と呼ことかできる。該二次抗体は、精製されていて も未精製でもよい。

一次抗体とは、−の分析物に対して特異的である抗体であり、例えば、抗ｈＣＧ 抗体はｈＣＧに対して特異的である。−次抗体は、標準的技術を使用して様々な 種より作ることができるが、最も普通に使用される種は、家兎及びマウスである 。−の種において産生されたいかなる一次抗体も、その種に対する抗血清によっ て認識される。例えば、マウス中で産生された一次抗体は、ヤギ抗マウス又は家 兎抗マウスのような抗血清によって認識される。家兎及びマウスは、−次抗体を 作るのに使用される最も普通の種であることから、最も普通の抗血清は、第２０ 種抗マウス又は抗家兎である。

ある系統の一次抗体間に存する相同性のため、−の種に対して作られた二次抗体 はまた、他の密接に関係した種とも反応するであろう。例えば、ヤギ抗マウスは 、ラットより調製された一次抗体としばしば反応する。本発明の目的のため、こ れらの種はここに「相同種」と呼ぶ。

ここに用いられている「−次抗体Ｊとは、適当な抗血清と免疫学的に反応する分 析物に対する特異的な抗体を意味し、特定の種又はいかなる相同種からの一次抗 体をも含む。この利点は、それが抗体の一層幅広い選択を提供することである。

本発明の前述の目的に適合する固相は、「不活性」であってよい。より具体的に は、（本発明の文脈における）「不活性」としての固相の特徴づけは、蛋白質性 の材料を無差別に吸着する能力に関して、該固相の表面の相対的な非反応性の特 徴をいうことを意図したものである。ここに本開示の背景の部でおいて先に述べ たように、ガラス及び他の化学的組成の近似の材料は、蛋白質を吸着する能力に ついて測定したとき、他の一層反応性の材料との比較において相対的に不活性で あると一般的に考えられている。

本発明の好ましい具体例においては、該固相の物理的形態は、そのような固相内 の隙間又はボアが、毛管作用によって反応液がそれらの間に保持され及び輸送さ れるよう、十分に小さいようなものである。該固相は有利的には、ガラス又は合 成繊維のような圧縮された繊維のマットより組成される。この固相はまた、焼成 ガラス、セラミックス及び合成ポリマー性材料のような他の多孔性構成成分で構 成してもよい。ガラス繊維濾紙は、その不活性な特徴のため、及びイムノアッセ イに適したものとするよう該ガラス繊維の感受性化に十分な量に本発明の可溶性 の免疫複合体を吸着するその能力のために、本発明の好ましい固体支持体である 。

該マルチテスト免疫化学的試薬は、種々の生物的及び産業的分野の分析物につい て、広汎な種々の分析プロトコールにおいて使用することができる。単一のガラ ス繊維濾紙が、いかなるアッセイに対しても使用することができ、且つ、非常に 多数の種に対する抗血清を含むことができるということに注意しなければならな い。例えば、治療薬、天然又は合成のステロイド、ホルモン、抗体及び他の関心 ある分析物の存在について、血液又は尿のイムノアッセイのためそのような液体 の迅速且つ定量的な分析において、有利に使用することができる。

そのようなプロトコールで分析することのできる治療薬の例としては、ジゴキシ ン、シランチン（ｄｉｌａｎｔｉｎ）　、フエノバルビタール、テオフィリン、 ゲンタマイシン、キニジンその他が含まれる。前述の仕方で調製されるマルチテ スト免疫化学的試薬はまた、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、 プロゲステロン、及びエストリオールのようなステロイド、又はフェリチンのよ うな血清蛋白質の検出のためのイムノアッセイにおいても利用できる。適当な固 相上に上述のようにして固定化された適当な免疫化学的試薬の使用により、ホル モンレベルもまた定量可能である。これらのホルモンとしては、甲状腺ホルモン 、すなわちトリヨードサイロニン又は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；ペプチド ホルモン、すなわちインスリン、コルチコトロピン、ガストリン、アンジオテン シン、及びプロアンジオテンシン；ポリペプチドホルモン、すなわちサイロトロ ピン、レブテオトロピン（ｌｅｖｔｅｏｔｒｏｐｉｎ）　、及びソマトトロピン 、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）が含まれる。

アッセイ方式は、競合的アッセイ及びサンドイッチアッセイの双方を含む。競合 的アッセイにおいては、分析物を含有するサンプル及び特異的抗体と共に、接合 体が同時に加えられる。

実施例１　エストラジオールのアッセイにおいて使用されるヤギ抗マウスマルチ テスト免疫化学的試薬 以下は、エストラジオールのアッセイにおいて使用すべき、該マルチテスト免疫 化学的材料、及びヤギ抗マウス抗体及びラット抗エストラジオール抗体の至適濃 度を決定するための選択手段を記述する。

材料 エストラジオール接合体：　エストラジオール（Ｅ２）及びアルカリ性ホスファ ターゼ（ＡＬＰ）よりなるエストラジオール接合体が、標準の混合無水物法を用 いて調製された（Ｂ、に、　Ｖａｎ　Ｗｅｅｍａｎ、　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ ３Ｖｏｌ、２４．　Ｎｏ、１．　Ｊｕｌｙ　１９７２）。得られたＥ２−ＡＬＰ 接合体は、保存剤として０．１％アジドを加えた０、１％蛋白質を含有する５０ ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）　、５０ｍＭＮａＣ１中に、０．０４μｇ　／　ｍ　 Ｌに希釈した。

エストラジオール較正標準＝　８０％エタノール中の１００μｇ／ｍＬのエスト ラジオールよりなるエストラジオール原液を調製した。０　（Ａ）　、２０　（ Ｂ）、５０　（Ｃ）　、２００　（Ｄ）、５００（Ｅ）、２０００　（Ｆ）ｐｇ ／ｍＬの一組のエストラジオール較正標準を作成するために、該エストラジオー ル原液の部分量を、活性炭処理ヒト血清に加えた。較正標準は、特定量の分析物 を含有する標準である。

基質／洗浄液：　保存剤としての０．１％アジ化ナトリウムと共に、安定化剤、 界面活性剤及び青色染料を含有するジェタノールアミン緩衝液中（ｐＨ９，０） 中に１ｍＭの４−メチルウンベリフェリルホスフェートを含有する溶液。

ラット抗エストラジオールモノクローナル抗体（ラット抗Ｅ２）は、ＯＥＭ　Ｃ ｏｎｃｅｐｔｓ、Ｉｎｃ、より入手した。

ヤギ抗マウスモノクローナル抗体（ＣＡＭ）は、慣用の手順を使用して調製した 。

ヤギ抗マウスマルチテスト試薬の調製及び最適化０．５％ＺＯＮＬＹ　ＦＳＮ　 （ＤｕＰｏｎｔ製界面活性剤）を含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０ ）に希釈した、０．５％ずつ増大するゼロ乃至８％のヤギ抗マウス（ＣＡＭ）溶 液を調製した。該溶液を、次いで、粒子を除去するために０．８μｍフィルター で濾過した。ガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｆ）の多数のタブに、各 溶液の７６μＬ以内をスポットし、タブ上に抗体を固定化するために乾燥したＣ ＡＭの該増大する溶液をスポットされたタブを、次のようにして評価した。すな わち、ラット抗Ｅ２の１／１００希釈液の１００μＬを、１００μＬのゼロ（Ａ ）較正標準に加えた。混合物の１５０μＬの部分量を、タブのＣＡＭを含有する 区域（反応区域）中に加えた。短い（２分）インキュベーションの後、該ラット 抗Ｅ２はＣＡＭに結合する。次に、５ｏμＬのＥ２−ＡＬＰ接合体を、該反応区 域の中心付近に加えた。該Ｅ２−ＡＬＰは、ラット抗Ｅ２に結合する。次に、約 ７５μＬの基質／洗浄液を、該反応区域の中心付近に適用した。該基質／洗浄液 は、結合していない如何なる材料をも該反応区域から溶出し去り、同時に、結合 したＡＬＰと基質との間の反応が開始されて蛍光性の生成物を形成する。反応区 域の有限の部分からのこの蛍光応答は、前面蛍光光度計を使用して測定された。

最高の応答を与えた溶液が、単位ＣＡＭ当たりに最大量の抗体が捕捉されている ものであることから、至適なものとして選択された。ここにその溶液は、２．５ ％ＣＡＭである。図１及び表１を参照のこと。上述の方法により、ガラス繊維濾 紙の多数のタブをこの２．５％ＣＡＭ溶液を用いてスポットした。

表１ ％ＧＡＭと較正標準への応答 この技術は、単純結合又はアフィニティー試験を実施することによって、同じ種 又は相同種からの抗体と共に使用することができるｏ　Ａ、　Ｃａｂａｔ、　５ ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ 　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　（２版１９７６）　：８０−９４゜ここ に、エストラジオールに対する該抗体はラットモノクローナルであるにも拘わら ず、ヤギ抗マウスイムノグロブリンが、タブ上に固定化された。これは、種間相 同性を利用し、免疫反応体固相（「タブ」）を一層真に「汎用性」あるものとす る。種間相同性の他の例は、ヒツジ／ヤギ間又はウマ／ロバ間である。これは、 最良の抗体を選択できるよう、利用し得る抗体の範囲を拡大する。また、直ちに 認識できるように、タブ上にスポットされたイムノグロブリンがラットからのも ので、エストラジオール特異抗体がマウスからのものであることができ（上述の 方法の逆）、これもまた、利用可能な抗体の選択肢を増加させる。

ラット抗エストラジオール１度の最適化最適なラット抗エストラジオール抗体（ ラット抗Ｅ２）は、上述のようにして調製された２、５％ＣＡＭタブを用いて決 定された。

ラット抗Ｅ２は、０．　１％牛血清アルブミンを含有する５０ｍＭ）リス（ｐＨ ８，０）に、種々の濃度に希釈した。希釈は、次の通りとした。すなわち、ｌ： ５０、ｌ：６０及び１ニア５゜評価される抗体及びその抗体の性質に応じて、一 層広い又は一層狭い希釈物（すなわちそれぞれ、１：１０、ｉ　：　１００．１ 　：　１０００及び１：１００００又は！＝２、ｌ：３、ｌ：５）を評価してよ いことが直ちに明らかである。これらの濃度は、次のようにして評価した＝１０ ０μＬのＡ（ゼロ）較正標準を含有するカップ及び１００μＬのＢ　（２０ｐｇ ／ｍＬ）較正標準を含有するカップに、各希釈のラット抗Ｅ２の１００μＬを加 えた。混合物を、室温にて１５分間インキュベートした。インキュベーションの 時間及び温度は、アッセイの要件に応じて変化させることができる。好ましい範 囲は、０乃至４時間及び１８乃至３７°Ｃである。インキュベーションの後、混 合液の１５０μＬの部分量を、タブのＣＡＭを含む区域（反応区域）に加えた。

短い（２分）インキュベーションの間に、ラットの抗Ｅ２はＣＡＭに結合する。

次に、該反応区域の中心付近に５０μＬのＥ２−ＡＬＰ接合体を加えた。該Ｅ２ −ＡＬＰは、ラット抗Ｅ２に結合する。次に、約７５μＬの基質／洗浄液を、該 反応区域の中心付近に適用した。基質／洗浄液は、結合していない如何なる材料 をも反応区域から溶出し去り、同時に、結合したＡＬＰ及び基質の間の反応が開 始されて、蛍光性の生成物を形成する。反応区域の有限な部分からのこの蛍光応 答は、前面蛍光光度計を用いて測定された。

ラット抗Ｅ２の最適の希釈は、２つのパラメーターを測定することにより選択し た。第１のパラメーターは、各希釈のラット抗Ｅ２によってＡ（ゼロ）較正標準 をアッセイしたときに生じる蛍光応答である。この蛍光応答は、ＣＡＭによって 捕捉されたラット抗Ｅ２の量に直接に比例する。従って、これらの応答は、サン プル中のＥ２の量に間接的に比例する（競合的アッセイの特徴）。測定した第２ のパラメーターは、Ａ（ゼロ）較正標準からの蛍光応答に対するＢ較正標準（２ ０ｐｇ／ｍＬ）からの蛍光応答の比率である（Ｂ／Ａ比）。低いＢ／Ａ比は、こ れらの較正標準のレベル間に測定可能な差があることを示す。最も小さいＢ／Ａ 比を有する、Ａ（ゼロ）較正標準を用いて最も高い蛍光応答を与えるラット抗Ｅ ２希釈を、最適として選択した。

結果を下記の表２に示す。

表２ ラット抗Ｅ２の希釈　１：５０　１：６０　１ニア５蛍光応答　９０１２　６８ ９８　６０２４Ａ（ゼロ）較正標準から 蛍光応答　８３５１　７０９７　６２３４Ｂ　（２０ｐｇ／ｍＬ）較正標準から Ｂ／Ａ比　０．９３　１．０２　１．０３上の表２より直ちに明らかなように、 最低のＢ／Ａ比を存する最高の較正標準Ａ比率は、ｌ：５０希釈のラット抗Ｅ２ を使用したときに見られる。他の希釈は、これら２つのレベルの較正標準の間で なんら差異を示さず、従って、エストラジオールの診断的アッセイにおいて有用 でない。上のデータを用いて、ｌ：５０希釈を、エストラジオールのアッセイを 実施するために選択した。

上の材料の部に記述した較正標準を使用して、標準曲線を作成した。

アッセイ方式 このアッセイ方式においては、抗体−抗原複合体は、５ＴＲＡＴＵＳ■（Ｂａｘ ｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）カップに、１００μＬの溶液中の １＝５０希釈ラツト工ストラジオールモノクローナル抗体及び１００μＬの血清 サンプル又は較正標準を加えることによって形成される。

この混合物は、今や抗原−抗体複合体並びに複合体形成をしていない抗体を含む が、次いでマルチテストヤギ抗マウス試薬マトリックスの中心に直接加えられ、 該マトリックスは、遊離のエストラジオール抗体並びに５ＴＲＡＴＬＩＳ　＠（ Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）カップ中に形成されたエス トラジオール−抗体複合体を捕捉する。試薬マトリックスは、次いで、第２の作 業ステーションへ移され、そこで５０μＬのＥ２接合体が該マトリックスの中心 に加えられる。接合したＥ２は、固定化されたエストラジオール抗体の、いかな る未占有の結合部位とも結合する。次いで、結合した及び遊離の材料が７８μＬ の基質／洗浄溶液■の添加によって分割されると同時に酵素作用が開始される。

上記の試薬添加の全ては、試薬の添加がまた、結合していない如何なる材料をも タブの中心から分離するためにも役立つよう、マルチデス１〜ヤギ抗マウス試薬 マトリックスの中心に直接行われる。最後に、結合した酵素の比率を測定するた めに、前面蛍光光度法が使用される。観察された比率は、サンプルＥ２の濃度に 逆比例しており、記憶されている標準曲線と比較することによって、臨床的単位 に変換される。

上述のように、感受性を制限する要因の一つは、サンプルが抗エストラジオール 抗体との相互作用のために有する時間である。抗エストラジオール抗体がサンプ ルと混合された後、それは、インキュベーションなしにタブに直接適用しても、 又は、もし感受性を高めなければならないならば、ある時間インキュベートして もよい。この具体例は、１５分のインキュベーションを使用している。

実施例１１　エストラジオールのアッセイにおいて使用されるヤギ抗家兎マルチ テスト試薬 以下は、正常家兎血清及び家兎抗エストラジオール抗体と共にヤギ抗家兎抗体を 使用する、マルチテスト試薬材料及びアッセイ方式の記述である。それに続くの は、現行の５ＴＲＡＴＬＩＳ■（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎ。

５ｔｉｅｓ　［ｎｃ、）較正曲線とマルチテストエストラジオール較正曲線との 比較である。

材料 Ｅ２接合体：　Ｅ２−ＡＬＰ接合体は、標準の混合無水物法を用いて調製した。

それを次いで、ｐＨ７，０のトリス緩衝液に１．２μｇ　／　ｍ　Ｌの濃度に希 釈した。

Ｅ２較正標準＝　８０％エタノール中約１００μｇ　／　ｍ　ＬのＥ２のＥ２原 液を調製した。該Ｅ２原液の部分量を活性炭処理ヒト血清に加え、ゼｏ　（Ａ） 、５０　（Ｂ）、１００（Ｃ）、５００（Ｄ）、１０００（Ｅ）及び２５００　 （Ｆ）ｐｇ／ｍＬの一組のＥ２較正標準を製造した。

Ｅ２アッセイ希釈液二〇、１％のＣＨＡＰＳＯ及び３５０μｇ／ｍＬの８−アニ リノ−１−ナフタリンスルホン酸を含有する１００ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４，５） 。

基質／洗浄液：　ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，０）中に１ｍＭの４−メ チルウンベリフェリルホスフェートを含有する溶液Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙ ｓｔｅｍｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　（ｎｃ、から入手した家兎抗Ｅ２抗 体。

タブの最適化 溶液Ａは、正常家兎血清を、０．５％のＺｏｎｙｉ　ＦＳＮを含有する５０ｍＭ のトリス緩衝液（ｐＨ８）に１％に希釈することによって調製した。溶液Ｂは、 ヤギ抗家兎イムノグロブリンを上記の緩衝液に１．２％に希釈することによって 調製した。溶液ＡのＩｍＬを、ｌから１３まで表示した１３本の試験管の各々に 加えた。次いで、管１の０．５ｍＬから始めて、溶液Ｂを管２から１３（滴定管 ）まで０、ＩｍＬずつ増大させて加えた。ヤギ抗家兎／正常家兎血清複合体の形 成を行わせるために２５°Ｃにて終夜インキュベーションした後、粒子を除去す るために０．８μｍフィルターを通して溶液を濾過した。１３本の管の各々から の約７５μＬの部分量を、ガラス繊維紙タブに適用し、乾燥させた。ここに乾燥 は、８０℃にて達成された。最適の複合体を決定するために、ゼロ較正標準を患 者サンプルとして用いて下記のようにアッセイした。最適のヤギ抗家兎／正常家 兎血清複合体は、家兎抗エストラジオール抗体の固定化に十分な結合容量を含ん でいる。滴定例を図２に示す。最高の応答を与えたことから、管５　（８０，９ 部／Ａ１部）に用いられた条件が、タブの製造用に選択された。

家兎抗エストラジオールの最適化 家兎抗エストラジオール抗体を、上述の最適ヤギ抗家兎／正常家兎血清タブを用 いて滴定した。滴定は、０．　１％の牛血清アルブミンと０１１％の（３−〔ク ロアミドプロピル）−ジメチルアンモニオツー２−ヒドロキシ−１−プロパンス ルホネート）とを含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）に家兎抗エストラ ジオール抗体を順次希釈することによって達成した。家兎抗エストラジオールの 最適希釈は、２つのパラメーターを測定することによって選択した。第１のパラ メーターは、各希釈の家兎抗エストラジオールによってＡ（ゼロ）較正標準をア ッセイしたときに生じる蛍光応答である。この蛍光応答は、ＧＡＲによって捕捉 された家兎抗エストラジオールの量に直接に比例する。従って、これらの応答は 、サンプル中のエストラジオールの量に間接的に比例する（競合的アッセイの特 徴）。測定した第２のパラメーターは、Ｂ（５０ｐｇ／ｍＬ）較正標準の蛍光応 答からＦ　（２５００ｐ　ｇ／ｍＬ）較正標準の蛍光応答を引いて得られる結果 である（Ｃａｌ　Ｂ　−Ｃａｌ　Ｆ）。最大の差を与える希釈を感度の尺度とし た。最大の較正標準Ａ応答及び最大の「較正標準Ｂ応答−較正標準Ｆ応答」を与 える希釈を決定し、この希釈を家兎抗エストラジオールについての最適希釈とし て選択した。滴定例を図３に示す。ｌニア５００希釈を、最適として選択した。

アッセイ方式 本アッセイにおいては、２５μＬの患者サンプル、対照又は較正標準に、５０μ ＬのＥ２アッセイ希釈液を加えることにより、血清エストラジオールが内因性結 合蛋白質から抽出される。次いで、その抽出されたサンプルに家兎抗エストラジ オールの１ニア５００希釈液の２５μＬを加え、続いて２５°Ｃにてサンプルを １５分間インキュベートすることによって、結合反応が開始される。インキュベ ーションの後、最高の応答を与えたヤギ抗家兎／正常家兎血清複合体によって調 製したガラス繊維紙タブに、サンプルの約７６μＬを直接に適用する。サンプル の適用は、乾燥した複合体の中心に向けられる。タブは第２の作業ステーション へ移され、そこで中心付近に約６０μＬのエストラジオール接合体が加えられる 。該接合体は、固定化されたエストラジオール抗体の未占有の結合部位と結合す る。次に、タブは第３の作業ステーションへ移され、中心への約７０μＬの基質 ／洗浄溶液■の添加によって、酵素作用が開始されそして同時に遊離の及び結合 した材料が放射状に分割される。最後に、蛍光率を測定するために前面蛍光光度 法が使用される。応答は、サンプルＥ２の濃度に逆比例しており、記憶されてい る標準曲線との比較によって臨床的単位に変換される。

実施例３　比較タブ性能 図４において、現行の５ＴＲＡＴＵＳ■（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓ　Ｉｎｃ、）及びマルチテストタブ較正曲線が比較されている。マルチテスト タブについて５００ｐｇ／ｍＬ未満のエストラジオール値の曲線の勾配（感度） において有意な改善がある。しかしながら、現行の５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａ ｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）タブの性能は、ｌｏｏｏｐｇ／ ｍＬより大きいエストラジオール値については優れている（勾配が一層大きい） 。図５は、１１００ｐ／ｍＬ未満の値についてのエストラジオールの単位当たり の応答を比較している。変化が大きい程アッセイの　度が高い。ここにおいて、 マルチテストタブは、５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ　Ｉｎｃ、）に対して改善された性能を実証している。

実施例４　ｈＣＧのアッセイにおいて使用されるヤギ抗マウスマルチテスト試薬 以下は、マルチテスト試薬材料、及びｈＣＧのアッセイにおいて使用されるヤギ 抗マウス抗体及びマウス抗ｈＣＧ抗体の最適濃度を決定するための手段の記述で ある。

材料：　抗ｈＣＧ接合体：　アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）及びｈＣＧに 対する抗体よりなる抗ｈＣＧ抗体接合体は、スルホ−５ＩＡＢ（スルホースクシ ンイイミジル（４−イオドアセチル）−アミノベンゾエートナトリウム塩）を使 用する標準法を用いて調製し、還元された抗ｈＣＧ　Ｆａｂ’抗体に結合させた 。得られた接合体は、保存剤として０．　１％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液 に約１８０ｎｇ／ｍＬに希釈された。

ｈＣＧ較正標準：　蒸留水中の１２００００００ｍ　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　ＬのｈＣ Ｇ原液を調製した。ゼロ（Ａ）、５　（Ｂ）、１５　（ＣＬ　５０　（Ｄ）、１ ５０（Ｅ）及び５００　（Ｆ）ｍＩＵ／ｍＬの一組の較正標準を作るため、ｈＣ Ｇ原液の部分量を正常ｈＣＧ不含人血清に加えた。

ヤギ抗マウス多種試薬の調製及び最適化＝０．５％のＺＯＮＹＬ　ＦＳＮ　（［ １ｕＰｏｎｔ製の界面活性剤）を含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０ ）中に、１％ずつ増大する希釈したｌ乃至１０％のヤギ抗マウス（ＣＡＭ）の溶 液を調製する。該溶液を、次いで、粒子を除去するため０．８５μｍのフィルタ ーで濾過する。ガラス繊維フィルターの多数のタブ（Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｆ ）を、各溶液の約７６μしてスポットし、そして乾燥する。

ＣＡＭの増大する溶液でスポットしたガラス繊維フィルターを、次のようにして 評価した。すなわち、マウス抗ｈＣＧ抗体の約ｌ：１００希釈の部分量的１００ μＬを、約１００μＬの（Ｆ）較正標準に加える。短いインキュベーションにお いて、Ｆ較正標準中のｈＣＧは、抗ｈＣＧ抗体に結合する。約１００μＬのイン キュベーション混合物をタブのＣＡＭを含んだ区域（反応区域）に加える。短い （約２分）インキュベーションの間、該マウス抗ｈＣＧはＣＡＭに結合する。次 いで、約５０μＬの抗ｈＣＧ抗体接合体を反応区域の中心付近に加える。接合体 は、抗ｈＣＧ抗体に結合したｈＣＧに結合し、該抗体は、今度は、ガラス繊維濾 紙のタブ上のＣＡＭに結合している。次に、反応区域の中心付近に約７５μＬの 基質−洗浄液を適用する。該基質−洗浄液は、結合していない如何なる材料をも 反応区域から溶出し去り、同時に、結合したＡＬＰと基質との間の反応が開始さ れて蛍光性の生成物を形成する。反応区域の有限な部分からの蛍光応答は、前面 蛍光光度計を使用して測定される。

最大較正標準Ｆ応答の溶液は、単位ＣＡＭ当たり最大の抗体が捕捉されているこ とから、最適であるとして選択した。上述の方法において最大の応答を与える溶 液を用いて、ガラス繊維濾紙の多数タブをスポットする。

マウス抗ｈＣＧ抗体濃度の最適化：　最適のマウス抗ｈＣＧ抗体は、上述のよう にして調製したＣＡＭタブを用いて決定する。０゜１％の牛血清アルブミンを含 有する５０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）に、マウス抗ｈＣＧ抗体を種々の濃度に 希釈する。評価した濃度は次の通りである。すなわち、１：１００．１　：　２ ００及びｌ：５００゜評価される抗体及びその抗体の性質に応じて、一層広い又 は一層狭い濃度（すなわちそれぞれ、１：１Ｏ１１：　１００．１：１０００及 び１：１００００又はｌ：２、ｌ：３及びｌ：５）を評価してもよいことは直ち に明らかである。希釈は次の通りにして評価される。すなわち、マウス抗ｈＣＧ 抗体の各希釈液の約１００μＬを、１００μＬのＦ　（５００ｍ　Ｉ　Ｕ／ｍＬ ）較正標準を含有するカップ、１００μＬのＢ　（５ｍＩＵ／ｍＬ）較正標準、 及び１００ｍＬのＡ（ゼロ）較正標準を含有するカップに加える。混合物を室温 にて１５分間インキュベートする。インキュベーションの時間及び温度は、アッ セイの要件に応じて変化させてよい。好ましい範囲は、０乃至４時間及び１８乃 至３７℃である。インキュベーションの後、混合物の１００μＬの部分量をタブ の反応区域に加える。短いインキュベーションの間に、（結合した又は結合して いない）マウス抗ｈＣＧ抗体は、ＣＡＭに結合する。次に、反応区域の中心付近 に５０μＬの抗ｈＣＧ接合体を加える。接合体は、反応区域内のいかなるｈＣＧ とも結合する。次に、約７５μＬの基質−洗浄液を反応区域の中心付近に適用す る。基質−洗浄液は、結合していない如何なる材料をも反応区域から溶出し去り 、同時に、結合したＡＬＰと基質との間の反応が開始され、蛍光性の生成物を形 成する。反応区域の有限な部分からの蛍光応答は、前面蛍光光度計を用いて測定 される。

マウス抗ｈＣＧ抗体の最適濃度は、２つのパラメーターを測定することによって 選択される。第１のパラメーターは、各濃度のマウス抗ｈＣＧ抗体によってＦ　 （５００ｍＩＵ／ｍＬ）較正標準をアッセイするときに生ずる蛍光応答である。

この蛍光応答は、ＣＡＭに捕捉された抗ｈＣＧ抗体の量に直接比例している。従 って、これらの応答はまた、サンプル中のｈＣＧの量にも直接比例している（サ ンドイッチアッセイの特徴）。測定される第２のパラメーターは、Ａ（ゼロ）較 正標準からの蛍光応答に対するＢ較正標準（５ｍｌＵ／　ｍ　Ｌ　）からの蛍光 応答の比率（Ｂ／Ａ比）である。高いＢ／Ａ比は、これら２つの較正標準レベル の間に測定可能な差があることを示す。最高のＢ／Ａ比と共に、Ｆ　（５００ｍ ＩＵ／ｍＬ）較正標準を用いて最高の蛍光応答を与える抗ｈＣＧ抗体濃度を、最 適として選択する。

代わりとして、抗ｈＣＧ抗体は、７６μＬの過剰量のＣＡＭ　（すなわち、最大 の較正標準Ａ応答を与えるＣＡＭの％より大きいＣＡＭの％）で調製したガラス 繊維濾紙のタブを使用することによって、最初に最適化することができる。抗ｈ ＣＧが最適化された後、ＧＡＭは上述の手順にて最適化することができる。

アッセイ方式：　このアッセイ方式においては、抗体−抗原複合体は、溶液中の 最適の抗ｈＣＧ抗体１００μＬ及び１００μＬの血清サンプル、較正標準又は対 照を５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ、　 ）カップに加えることによって形成される。今や抗原−抗体複合体並びに複合体 形成をしていない抗体を含むこの混合物の部分量１００μＬを、次いで、形成さ れた抗原−抗体複合体並びに複合体形成をしていない抗体を捕捉するマルチテス トヤギ抗マウス試薬マトリックスの中心付近に直接に加える。試薬マトリックス は、次いで、第２の作業ステーションへ移され、そこで該マトリックスの中心付 近に５０μＬの接合体が加えられる。接合体は、結合したｈｃＧと結合する。次 に、結合した及び遊離の材料が７６μＬの基質／洗浄溶液の添加によって分割さ れると同時に、酵素作用が開始される。上記の全ての試薬添加は、試薬の添加が 、結合されていない如何なる材料をも反応区域の中心から分離するためにも役立 つよう、マルチテストヤギ抗マウス試薬マトリックスの中心付近に行われる。最 後に、結合した酵素比率を測定するために前面蛍光光度法が使用される。観察さ れた比率は、サンプルのｈＣＧの濃度に比例しており、標準曲線との比較によっ て臨床的単位へと変換される。

実施例５ ガラス繊維濾紙上の抗体が実施例２のＧＡＲ及び実施例４のＣＡＭの適当な最終 濃度の部分量的７６μＬよりなるものであることを除き、実施例２を繰り返す。

ガラス繊維濾紙に適用されるＧＡＲ及びＧＡＭの濃度の最適化は、（ＧＡＲにつ いては）実施例２及び（ＣＡＭについては）実施例４に提示した手順によって決 定される。

ラット抗エストラジオール抗体濃度の最適化は、実施例２により決定される。血 清サンプル、較正標準及び対照の濃度は、実施例２のアッセイ方式により決定さ れる。

実施例６ ガラス繊維濾紙上の抗体が実施例２のＧＡＲ及び実施例４のＧ　Ａ。

Ｍよりなることを除き、実施例４を繰り返す。ガラス繊維濾紙に適用されるＧＡ Ｒ及びＧＡＭの濃度の最適化は、（ＧＡＲについては）実施例２及び（ＣＡＭに ついては）実施例４に提示した手順によって決定される。マウス抗ｈＣＧ抗体濃 度の最適化は、実施例４により決定される。血清サンプル、較正標準、又は対照 の濃度は、実施例４のアッセイ方式ににより決定される。

実施例７〜１１ 分析物を含有するサンプルの添加の前に特異抗体（すなわち、抗ｈＣＧ抗体、抗 Ｅ２抗体等）をマルチテスト試薬に加えることを除き、実施例２及び４〜６をそ れぞれ繰り返す。

本発明は、主として、特別の且つ好ましい具体例との関連において記述されたが 、本発明の範囲から外れることなく修正が可能であることは理解されるであろう 。以下の請求の範囲は、一般的にその原理に従う、そして、本発明の関連する分 野における既知の又は慣用の手段の内に入り又は当該分野の等業者に明らかであ るような本発明からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、用途、又は適合を包 含することが意図されている。

Ｆｉｇ、　１ ０　１　２　３　４　５　６　’７　８パーセントヤギ抗マウス Ｆｉｇ、　２ 正常家兎血清中のヤギ抗家兎 １　２　３　４　１　ＩＩ　７　１　ＩＩ　１０管番号 Ｆｉｇ、　３ 家兎抗エストラジオールの滴定 ２　３４　Ｓ＠　７１１　９１０１１１２１３希釈（Ｘ　１０００） ＋試験ｌ−−試験２ ＯＢｏｏ　１０００　１５００　２０００　２１５Ｇ０　３０００　３８００エ ストラジオール（Ｐｇ／ａ＋Ｌ） −◆−５ＴＲＡＴＵＳ　＠＋タブ＋マルチテストタブ１０　２０　３０　４０　 ！ｔｏ　Ｈ７Ｇ　８０　１０エストラジオール（Ｐｇ／ＩＩＩＬ） −φ−８ＴＲＡＴＵＳ　＠タブ−←マルチテストタブ国際調査報告　！ＩＭ／ｌ ｌｅ。つ／１１２２、フロントページの続き （７２）発明者　レーガン、ジエフリーアメリカ合衆国３３１４０フロリダ、マ イアミビーチ、ノースメリディアンアベニュー（７２）発明者　スミス、デニス アメリカ合衆国９５１４８カリフオルニア、サンホセ、フィンビーロード　３７ ３９ （７２）発明者　ティモンズ、リチャードアメリカ合衆国３３１５６フロリダ、 マイアミ、サウスウエスト・エイティーフォース・コート　１０２２１

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．不活性な多孔性媒体上に吸着された二次抗体よりなる、免疫化学的試薬。
2. ２．前記二次抗体がヤギ抗マウスイムノグロブリンである、請求項１に記載の組 成物。
3. ３．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請求 項１に記載の組成物。
4. ４．不活性な多孔性媒体上に吸着された特定の動物種に対する抗血清よりなる、 ヒト免疫化学的試薬。
5. ５．前記抗血清がヤギ抗マウスイムノグロブリンである、請求項４に記載の組成 物。
6. ６．前記抗血清がヤギ抗家兎イムノグロブリンである、請求項４に記載の組成物 。
7. ７．不活性な多孔性媒体上に約３％のヤギ抗マウスイムノグロプリンが吸着され ているものである、請求項５に記載の組成物。
8. ８．前記抗血清がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロブリンよりなるもので ある、請求項４に記載の試薬。
9. ９．前記抗血清が正常動物血清と複合体を形成しているものである、請求項４に 記載の試薬。
10. １０．前記ヤギ抗血清が正常家兎血清と複合体を形成しているものである、請求 項６に記載の試薬。
11. １１．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体支持体上に固定化された二次抗 体よりなるものであり、該方法が：ａ．分祈物−一次抗体複合体及び複合体形成 をしていない一次抗体の液体混合物を形成するために、結合条件下において前記 分析物を含有する液体サンプルと一次抗体と合わせ、ｂ．分析物−一次抗体複合 体及び複合体形成をしていない一次抗体を結合させるために、結合条件下におい て前記固体支持体に前記液体混合物を適用し、 ｃ．結合した、複合体形成をしていない抗体と結合させるために、結合条件下に おいて前記固体支持体に指示薬を適用し、ｄ．前記固体支持体上に該指示薬が存 在する程度を観察し、そして ｅ．前記固体支持体上に該指示薬が存在する該程度を、前記サンプル中の未知の 分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
12. １２．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項１１に記載の方法。
14. １４．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項１１に記載の方法。
15. １５．前記指示薬が本質的に、酵素標識された分析物及び基質洗浄溶液よりなる ものである、請求項１１に記載の方法。
16. １６．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体の、不活性な多孔性支持体の隙 間の有限の区域内に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法が： ａ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成をしていない一次抗体の液体混合物 を形成するために、結合条件下において前記分析物を含有する液体サンプルと一 次抗体とを合わせ、ｂ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成をしていない抗 体を結合させるために、結合条件下において前記有限な区域の中心に前記液体混 合物を適用し、 ｃ．複合体形成をしていない抗体と結合させるために、結合条件下において前記 固体支持体に指示薬を適用し、ｄ．前記反応区域の限定された領域内に該指示薬 が存在する程度を観察し、そして ｅ．前記限定された領域内に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未 知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
17. １７．前記指示薬が本質的に、酵素標識された分析物及び基質洗浄溶液よりなる ものである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項１６に記載の方法。
19. １９．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項１６に記載の方法。
21. ２１．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体支持体上に固定化された二次抗 体よりなるものであり、該方法が：ａ．結合条件下において前記固体支持体に一 次抗体を適用し、ｂ．結合条件下において前記固体支持体に前記液体サンプルを 適用し、 ｃ．結合した、複合体形成をしていない抗体と結合させるために、結合条件下に おいて前記固相に指示薬を適用し、ｄ．前記固体支持体上に該指示薬が存在する 程度を観察し、そして ｅ．前記固体支持体上に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の 分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
22. ２２．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項２１に記載の方法。
24. ２４．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項２１に記載の方法。
25. ２５．前記指示薬が本質的に、酵素標識された分析物及び基質洗浄溶液よりなる ものである、請求項２１に記載の方法。
26. ２６．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体の、不活性な多孔性支持体の隙 間の有限な区域内に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法が： ａ．結合条件下において前記固体支持体の前記有限な区域の中心に一次抗体を適 用し、 ｂ．結合条件下において前記固体支持体の前記有限な区域の中心に前記液体サン プルを適用し、 ｃ．複合体形成をしていない抗体と結合させるために、結合条件下において前記 固体支持体に指示薬を適用し、ｄ．前記反応区域の限定された領域内に前記指示 薬が存在する程度を観察し、そして ｅ．前記限定された領域内に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未 知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
27. ２７．前記指示薬が本質的に、酵素標識された分析物及び基質洗浄溶液よりなる ものである、請求項２６に記載の方法。
28. ２８．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項２６に記載の方法。
29. ２９．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項２６に記載の方法。
30. ３０．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項２６に記載の方法。
31. ３１．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体支持体上に固定化された二次抗 体よりなるものであり、該方法が：ａ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成 をしていない一次抗体の液体混合物を形成するために、結合条件下において前記 分析物を含有する液体サンプルと、前記一次抗体とそして抗体と結合させるため の指示薬とを合わせ、 ｂ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成をしていない一次抗体を結合させる ために、結合条件下において前記固体支持体に前記液体混合物を適用し、 ｃ．前記固体支持体上に該指示薬が存在する程度を観察し、そして ｄ．前記固体支持体上に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の 分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
32. ３２．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、該固相が本質的に、固体支持体上に固定化された二次抗体 よりなるものであり、該方法が：ａ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成を していない一次抗体の液体混合物を形成するために、結合条件下において前記分 析物を含有する液体サンプルと一次抗体とを合わせ、ｂ．分析物−一次抗体複合 体及び複合体形成をしていない一次抗体を結合させるために、結合条件下におい て前記固体支持体に前記液体混合物を適用し、 ｃ．結合した分析物を結合させるために、結合条件下において前記固体支持体に 指示薬を適用し、 ｄ．前記固体支持体上に該指示薬が存在する程度を観察し、そして ｅ．前記固体支持体上に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の 分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
33. ３３．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項３２に記載の方法。
35. ３５．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項３２に記載の方法。
36. ３６．前記指示薬が本質的に、前記分析物に対する酵素標識された抗体及び基質 洗浄溶液よりなるものである、請求項３２に記載の方法。
37. ３７．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体の、不活性な支持体の隙間の有 限な区域内に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法が： ａ．分析物−一次抗体復合体及び複合体形成をしていない一次抗体の液体混合物 を形成するために、結合条件下において前記分析物を含有する液体サンプルと一 次抗体とを合わせ、ｂ．分析物−一次抗体複合体及び複合体形成をしていない抗 体を結合させるために、結合条件下において前記有限な区域の中心に前記液体混 合物を適用し、 ｃ．結合した分析物と結合させるために、結合条件下において前記固体支持体に 指示薬を適用し、 ｄ．前記反応区域の限定された領域内に該指示薬が存在する程度を観察し、そし て ｅ．前記限定された領域内に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未 知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
38. ３８．前記指示薬が本質的に、前記分析物に対する酵素標識された抗体及び基質 洗浄溶液よりなるものである、請求項３７に記載の方法。
39. ３９．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項３７に記載の方法。
40. ４０．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項３７に記載の方法。
41. ４１．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項３７に記載の方法。
42. ４２．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体支持体上に固定化された二次抗 体よりなるものであり、該方法が：ａ．結合条件下において前記固体支持体に一 次抗体を適用し、ｂ．結合条件下において前記固体支持体に前記液体サンプルを 適用し、 ｃ．結合した分析物と結合させるために、結合条件下において前記固相に指示薬 を適用し、 ｄ．前記固体支持体上に該指示薬が存在する程度を観察し、そして ｅ．前記固体支持体上に前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の 分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
43. ４３．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項４２に記載の方法。
44. ４４．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項４２に記載の方法。
45. ４５．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項４２に記載の方法。
46. ４６．前記指示薬が本質的に、前記分析物に対する酵素標識された抗体及び基質 洗浄溶液よりなるものである、請求項４２に記載の方法。
47. ４７．未知の量の分析物について液体サンプルの固相イムノアッセイを実施する ための方法であって、前記固相が本質的に、固体の、不活性な多孔性支持体の隙 間の有限な区域内に固定化された二次抗体よりなるものであり、該方法が： ａ．結合条件下において前記固体支持体の前記有限な区域の中心に一次抗体を適 用し、 ｂ．結合条件下において前記固体支持体の前記有限な区域の中心に前記液体サン プルを適用し、 ｃ．結合した分析物と結合させるために、結合条件下において前記固体支持体に 指示薬を適用し、 ｄ．前記反応区域の限定された領城内に該指示薬が存在する程度を観察し、そし て ｅ．前記限定された領域に前記指示薬が存在する該程度を前記液体サンプル中の 未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
48. ４８．前記指示薬が本質的に、前記分析物に対する酵素標識された抗体及び基質 洗浄溶液よりなるものである、請求項４７に記載の方法。
49. ４９．前記二次抗体がヤギ抗家兎である、請求項４７に記載の方法。
50. ５０．前記二次抗体がヤギ抗マウスである、請求項４７に記載の方法。
51. ５１．前記二次抗体がヤギ抗家兎及びヤギ抗マウスイムノグロプリンである、請 求項４７に記載の方法。