JPH08509064A

JPH08509064A - 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化

Info

Publication number: JPH08509064A
Application number: JP7509791A
Authority: JP
Inventors: リン，スペンサー，エイチ; シン，プラタップ; ダイアモンド，スチーブン，イー
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1996-09-24
Also published as: EP0670040A1; AU7721094A; CA2150029A1; WO1995008771A1

Abstract

(57)【要約】特異的結合試薬が固相支持体上に結合されるものである、特異的結合アッセイのための方法及び組成物が提供される。固定化は、２官能性の試薬を特異的結合性アッセイタンパク質に結合させてそれによって化学的に該特異的結合試薬を架橋することによって効率化される。そのような架橋された特異的結合試薬は、二次的試薬の使用なしにアッセイを実施するという利点を提供する。これは、固相支持体と又は標的サンプルとの非特異的なバックグラウンド妨害を最小限にすることを通じて、感度の向上を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化本発明の分野本発明は、一般には特異性結合アッセイ試薬の固相支持体への固定化方法の分野に関する。特に、本発明は架橋した試薬を固相支持体上へ固定化する方法に関する。本発明はまた、診断テストにおいて有用な固定化架橋試薬を有する固相支持体に関する。本発明の背景液体サンプルまたは組織サンプル中に発見される検体の量を測定するためにインビトロ診断アッセイを使用することができる。検体はサンプル中に発見される他の成分から区別されなければならない。検体は他のサンプル成分から、その検体に対する特異性受容体と検体を反応させることによって区別することができる。検体を区別しそして定量化するため特異性受容体を利用するアッセイは、しばしば特異結合アッセイと呼ばれる。最も普通の受容体は抗体、抗体のフラグメントおよび固有因子または葉酸結合タンパクのような特異結合タンパクである。受容体は検体またはその検体の類縁体に対して可逆的特異性結合親和性を有することによって特徴づけられる。類縁体は一般に、検体と大体同じ特異性と親和性をもって受容体へ結合する酵素、蛍光分子または他の既知のラベルのような検出可能なマーカーを持っている検体誘導体である。技術および特許文献に記載された不均質特異性結合アッセイにおいては、特異性結合反応の受容体または他のアッセイ試薬はしばしば固相へ固定化される。これら受容体の固定は結合した成分を結合しなかった成分から分離するために必要である。受容体または他の試薬を固相へ固定化する種々の方法は、吸着、吸収および共有結合を含んでいる。受容体と該受容体に対する抗血清の実質上可溶性免疫複合体を不活性ガラス繊維固相支持体へ固定化するための操作が記載されている。これらの操作はここに参照として取入れる米国特許第４，５１７，２８８号に開示されている。一般に、可溶性免疫複合体は少なくとも２種の免疫化学的に反応性の物質を溶液中で相互に結合することによってつくられる。そのような免疫化学的に反応性材料の少なくとも一つが関心ある検体のための免疫化学的特異性のために選定される。例えば、もし可溶性免疫複合体を甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の検出のためのイムノアッセイにおいて使用すべきであれば、その時免疫複合体の一成分はＴＳＨに対するその免疫化学的特異性のために選択される。典型的な実例はＴＳＨに対する特異性を有する抗体、すなわち抗ＴＳＨ抗体であろう。免疫複合体の第２の成分は抗ＴＳＨ抗体に対して向けられた抗体調製物よりなることができよう。抗検体抗体に対する抗血清、例えばマウス抗ＴＳＨ抗体は、精製したマウス抗体を宿主動物（例えばヤギ）へ注射し、その後マウス抗体に対する抗血清を収穫することによってつくることができる。マウス抗ＴＳＨ抗体およびマウス抗体に対するヤギ抗血清はその後標準ヒトック溶液へ処理される。放射状ハーティションイムノアッセイ（ＲＰＩＡ）は、不活性ガラス繊維固相支持体を典型的に利用する特異性結合アッセイの一タイプである。ガラス繊維支持体は低い非特異性結合を有する。通常のＲＰＩＡ操作においては、一次抗体のストック溶液の一部分が緩衝化媒体中の第２成分のストック溶液と結合される。緩衝液の適量中の生成した免疫複合体はその後ガラス繊維フィルターの限られた面積上へスポットされる。代わりに、免疫複合体の二成分を別々の緩衝溶液としてフィルターへ適用し、その場で反応することを許容することができる。両方の場合、免疫複合体の適用点が固相内の反応ゾーンを形成する。適用された免疫複合体は吸着され、そしてガラス繊維フィルター内の繊維ベッドの隙間中に捕捉される。適用方法は、免疫複合体溶液を入力または自動ピペットで、またはアッセイ分析機械器を含む他の自動機器により分配することを含む。固相へ免疫複合体を適用し、免疫複合体を適当なインキュベーション時間インキュベートした後、固相は制御された条件下で乾燥される。このプロセスは多数の固相特異性結合アッセイプロトコールのどれにも使用できる安定な反応試薬を得る。少なくとも一方を標識したサンプルおよび他の反応剤は、それらが反応ゾーン中の固定化受容体と反応するように固相へ適用される。結合検体および／または類縁体からの遊離検体および／または検体類縁体の分離は、固相支持体上の結合および非結合試薬のクロマトグラフィー分離を結果する、洗浄液の適用によって達成される。これは反応ゾーンが未結合物質を実質上含まないようにし、そして反応ゾーン中の標識試薬の量のモニタリングを許容する。伝統的ＲＰＩＡにおいては、米国特許第４，５１７，２８８号記載のように、モノクローナルであれポリクローナルであれ一次抗体を二次ポリクローナル抗体と混合することによって可溶性の二重免疫複合体が生成する。温度、塩、ｐＨおよびタンパク濃度を含む多くのファクターが二重免疫複合体の生成に影響する。これらの条件は二重免疫複合体を効率的に形成するため最適化するのが困難にあり得る。加えて、このアプローチは二次抗体、例えば非特異性の存在によって主として発生する本来的な制限を有する。非特異性結合は、関心ある検体に対して非特異性である二次抗体のようなタンパクの存在によって悪化される。このため非特異性結合を最小化するため、興味ある検体に対して非特異性のタンパクが実質上存在しない固相試薬を持つのが望まれる。伝統的ＲＰＩＡの他の欠点は、これらアッセイに抗体フラグメントを効果的に使用できないことである。完全なモノマー免疫グロブリン分子はペプシンによってＦ（ａｂ’）₂フラグメントと、Ｆｃフラグメントと、そして他のサブフラグメントへ酵素的に消化されることができる。Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは抗体の特異性抗原結合活性を含む。Ｆｃフラグメントは抗原結合能力を持たないが、それにも拘らずインタクトな分子の重要な生物学的特徴を決定する。Ｆ（ａｂ’ ）₂が何故放射状パーティションイムノアッセイに効果的に使用されなかったかの一つの可能性ある理由は、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントはマトリックス中に埋蔵され続けるのに十分な寸法でないことである。代わりに、そのような抗体フラグメントは、それらがＦｃ領域の炭水化物部分を持っていないためアッセイにおいて有効でないかも知れない。その結果、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを使用する時は免疫複合体が生成することが期待されない。本発明の概要本発明においては、架橋試薬が抗体、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントまたは他の受容体タンパクのような特異性結合受容体を他の同じまたは関連する分子へ連結するために使用される。架橋剤は好ましくは二官能試薬、好ましくはビス（スルホスクシンイミジル）スベレート，グルタルアルデヒド、または１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルであるがしかしこれらに限定されない。特異性受容体は完全な抗体分子か、抗体の使用可能なフラグメントか、または葉酸結合タンパクまたは固有因子のような非免疫学的受容体であることができる。架橋された受容体タンパク複合体は、ガラス繊維マトリックスもしくはポリスチレンプレートのような固相支持体上に限られた面積上に固定化することができる。本発明は、固相表面上へ架橋した受容体タンパク複合体を固定化する方法よりなる。本発明はさらに、その上に固定化された架橋したタンパク複合体を有する固相試薬と、そしてそのような固相試薬を使用する特異性結合アッセイ方法を含んでいる。図面の簡単な説明図１は、ＢＳ³架橋Ｄ７０抗体の増加する濃度の関数としてＳｔｒａｔｕｓＡ，ＢおよびＦ率を図示する。図２は、Ｓｔｒａｔｕｓ上の二次ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体によって結合したＣＡ２抗体と比較した、グルタルアルデヒド架橋ＣＡ２を用いたＳｔｒａｔｕｓＴＳＨアッセイを図示する。図３は、ＳｔｒａｔｕｓII上の二次ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体によって結合したＣＡ２抗体と比較した、グルタルアルデヒド架橋ＣＡ２を用いたＳｔｒａｔｕｓＴＳＨアッセイを図示する。本発明の詳細な説明出願人は、化学的に架橋したタンパク複合体を特異性結合アッセイに使用するための固相上の免疫試薬のために使用できることを発見した。ここで使用する「タンパク」なる術語は、全長さのタンパクのみならず、特異性結合アッセイ試薬としての有用性を有する任意のポリペプチド、例えば全長さタンパクのフラグメントを含むものと定義される。化学的に架橋したタンパク複合体はイムノアッセイおよび他のアッセイにおいて種々の固相試薬の製造に有用であるが、出願人は放射状パーティションイムノアッセイにおけるガラス繊維フィルター基質についてそのような複合体の特に有用な用途を発見した。Ｇｉｅｇｅｌｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２８：１８９４−９８（１９８２）および米国特許第４，５１７，２８８号に開示された放射状パーティションイムノアッセイは、すべてのステップが固相上で実施されるアッセイ操作である。一般に抗体または他の試薬はガラス繊維フィルター紙上の小面積上に固定化される。検出すべき検体の既知量の含んでいる種々の較正標準またはそのような検体を潜在的に含んでいる種々の未知サンプルが次にこの固定化受容体と反応することが許容される。標識した類縁体または他の標識試薬の適切な添加の後、過剰な試薬は洗浄液の適用によってフィルター紙の中心区域から除去される。酵素イムノアッセイの場合には、洗浄液は酵素のための基質を含むことができ、そのため洗浄ステップと同時に酵素反応を開始するたとができる。好ましくは、基質上の酵素の作用は蛍光信号を発生する。中心区域の一部分の酵素活性はフロント表面フルオロメトリーによって定量化できる。アッセイフォーマット、すなわち直接結合アッセイが競合アッセイかによって、蛍光率はサンプル中の検体濃度に正比例または反比例する。上記したように、固相は比較的不活性の表面を提供することが好ましい。すなわち、表面は生物学的材料、特にタンパク性材料の無差別の吸着に関して比較的非反応性でなければならない。本発明の好ましい具体例においては、固相の物理的形状は、固相中の隙間もしくはポアが十分に小さく、そのため反応液は毛管作用によって保持され、輸送されるようなものである。固相は有利には、ガラスまたは合成繊維または比較的不活性のセルロース材料のような、圧縮繊維のマットで構成される。固相は、焼結したガラス、セラミックスおよび合成ポリマー材料のような他の多孔質成分から構成されてもよい。ガラス繊維フィルター紙は、その特性のためおよびアッセイ試薬保持の定量的評価に十分な量で本発明の架橋複合体を吸着するその能力のため、本発明の好ましい固相支持体である。本発明の化学的に架橋したタンパク複合体は、一旦適当な固相へ吸着されれば、種々の生物学的材料の分析のための広範囲の分析プロトコールにおいて使用することができる。例えば、化学的に架橋したタンパク複合体は、尿、血液、または血清、血漿のような血液成分のイムノアッセイに有用であり得る。そのようなイムノアッセイは、治療剤、天然または合成ステロイド、ホルモン、酵素、抗生物質または他の関心ある検体の検出または定量化に向けられることができる。そのようなプロトコールにおいて分析することができる治療剤は、限定するものではないが、ジゴキシン、ジランチン、フェノバルビタール、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジン等を含む。以上のようなやり方でつくった固相はまた、限定するものでないが、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、およびエストリオールのようなステロイド、およびフェリチンのような血清タンパクの検出のためのイムノアッセイに使用することができる。ホルモンレベルも本発明の固相複合体の使用によって測定することができる。これらホルモンは、限定でなく、テトラヨードーおよびトリヨードチロニンおよび甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、コルチコトロピン、ガストリン、アンギオテンシン、およびプロアンギオテンシンのようなペプチドホルモン、およびインスリン、サイロトロピン、レブテオトロピン、ソマトトロピンおよびヒトゴナドトロピンホルモン（ＨＣＧ）のようなポリペプチドホルモンを含む。本発明の複合体の他の用途は、代謝に関与する比較的小分子例えば葉酸のアッセイ、感染病に関連するポリペプチド抗原および抗体例えばＨＩＶ、肝炎、ＣＭＶ、梅毒、ライム病作因、および多数の他の感染作因のアッセイを含む。本発明の化学的に架橋したタンパク複合体／固相調製物は種々の特異性結合アッセイフォーマットへ適用可能である。例えば、種々の直接結合アッセイがこれら試薬を採用し得る。そのようなアッセイにおいて、抗体または結合タンパクのような受容体は架橋したタンパク複合体をつくるように化学的に連結され、そして複合体は固相上に固定化される。固定化した化学的に架橋したタンパク複合体は、関心ある検体を含んでいるサンプルと接触させられる。固定化した複合体によって検体を結合した後、固相は洗浄され、次に指示薬を接触させられる。本発明の環境において「指示薬」なる術語は、標識された接合体を意味する。接合体はアッセイフォーマットにより、抗体、抗体フラグメント、結合タンパクまたは検体を含み、標識は接合体に直接または間接に関連した蛍光、酵素、色、ラジオメトリーまたは他の標識分子である。標識は基質と接触する時蛍光を発生する酵素化合物よりなってもよい。固相上に存在する指示薬の程度は、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｐｐ．１７３− ２１９（Ｃｈａｐｔｅｒ１０），ｐｐ．３２９−３８４（Ｃｈａｐｔｅｒ１４），ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，オランダ、アムステルダム（１９８５）に開示されているように、未知検体の量に相関する。本発明の複合体はまた、競合アッセイフォーマットにも使用することができる。そのようなフォーマットにおいては、選定した検体に対する特異性を有する、固定化した化学的に架橋したタンパク複合体を含んでいる固相は、そのような検体を含んでいると予想されるサンプルと、そして特異性競合試薬と接触させられる。この特異性競合試薬は、標識した検体類縁体でよい。この具体例において、標識した類縁体は固相上に固定された受容体に対してサンプル検体と競合する。代替具体例においては、検体を固相へ連結し、サンプルと、そして特異性競合架橋タンパク試薬、例えば検体に対する標識した受容体と接触させることができる。このフォーマットにおいては、サンプル検体は可溶性の標識架橋受容体に対し固相検体と競合する。両方の具体例において、洗浄後固相へ結合した標識の量はサンプル中の検体のレベルの指示を提供する。すなわち、可溶相へ結合した標識の量はサンプル中の検体の量へ反比例する。種々の機器が、化学的に架橋されたタンパク接合体および他の結合アッセイ試薬を固相へ、洗浄、および固相へ結合した指示薬の量の読取りへ適用するために利用可能である。好ましい具体例においては、固相はバクスター、ダイアグノスチックス、インコーポレイテッドから提供されるＳｔｒａｔｕｓイムノアッセイシステムを使用して分析されるガラス繊維フィルタータブよりなる。この機器は、ここに参照として取り入れる。Ｇｉｅｇｅｌｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２８：１８９４−９８（１９８２）に記載されているバッチ処理ペンチトップ機器である。この機器は放射状パーティションイムノアッセイフォーマットにおいてフィルタータブを処理するのに適応している。このフォーマットもＧｉｅｇｅｌｅｔａｌ．に記載されている。この機器はサンプル、接合体および基質洗浄液のための液体分配器を含んでいる。マイクロプロセッサー制御ステッピングモータが試薬の適当分量を吸引し、分配する。分配器のすべてのタイミングおよび作業面は分析機内のプログラムルーチンによってあらかじめ決められている。この機器はまた、タブ輸送システム、温度モニターを備えた加熱プレート、サンプルおよび試薬流体ポンプ、読取りステーション、データ処理、およびタブ処理手段を含んでいる。品質管理のため、機器マイクロプロセッサー制御プログラムは、参照電圧、温度、および分配セッティングおよび限界外値のためのフラッグのような重要な作業条件を定期的に検証する。本発明は、以下の例証具体例を参照してさらに理解されるであろう。それらは純粋に例示であり、請求の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと解してはならない。実施例１固相支持体の調製（表）タブ」を含む。両機器ともに、Baxter Diagnostics Inc．によってめには患者サンプルの全ての希釈及び／又は混合がオフラインで行先立つ１つ又は２つ以上の溶液による患者サンプルのオンライン希釈のためのプログラミングの柔軟性を有するということを除き、St タブは、Giegel et al.，Radial Partition Immunoassay，Clin.Chem．28：18 94-98（1982）に開示されているようにして、ＧＦ／Ｆガラス繊維紙（Whatman I nc.）１インチ（２．５ｃｍ）幅のロール及びスナップ嵌合のプラスチックのタブ部品から組み立てることができる。架橋剤溶液又は対照溶液の適当な濃度が、スポット緩衝液中に作られる。このスポット緩衝液の組成は、特定の実験的または製造のパラメータに適するよう変化させることができる。一般に、このスポット緩衝液は、例えば、２０ｍＭ〜２００ｍＭのトリス、ｐＨ7.0〜9.0、0.1％〜1 .0％（重量／重量）の濃度範囲のZo のような非イオン性界面活性剤、0.5％〜4.0％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び0.1％のアジ化ナトリウムを含むが、これに限定されない。好ましくは、該スポット緩衝液は、30〜100ｍＭのト 3.0％のＢＳＡ及び0.1％のアジ化ナトリウムを含む。最も好ましくは、該スポット緩衝液は、50ｍＭのトリス、ｐＨ8.0、0.1％のむ。フッ素化された界面活性剤（例えば３Ｍカタログ番号FC 171及びFC 170C）及び他の当業者に知られた適当な界面活性剤を、Zony 部分量、典型的には76μＬの選択された溶液をブランクタブの中央にスポットし、それを次いで80〜90℃にて終夜オーブン乾燥させる。冷却後、タブを２〜８ ℃にて使用時まで貯蔵する。タブ上への溶液のスポットは、ピペット装置を用いて手で行っても、又は自動化された製造手順を用いて行ってもよい。代わりとしては、タブは、タブの中央に貯蔵溶液の選択された部分量を適用するために機器それ自体によってスポットされ処理されてもよい。実施例２アッセイ手順以下の全ての実験において、Giegel et al.，Clin．Chem．28：1894-98（1982 ）に記述されている放射状分配アッセイ方式を使用した。較正溶液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＦを、ＢＳＡ、安定化剤及び0.1％のアジ化ナトリウムを含有するトリス緩衝液（ｐＨ7.5）中に調製した。較正溶液及び選択された架橋剤は、分析対象物に応じて変えた。、選択された較正標準（又はサンブル）の60μＬを吸引しそして至適量の架橋された抗体複合体を含んだタブ上に放出することによって実施する。Stratus機器の基質プローブが次いで４−メチルウンベリフェリルホスフェート（1.0ｍＭ）、Brij 35のような界面活性剤（0.1〜1.0％）及び特定のアルカリ性ホスファターゼ阻害剤をｐＨ9.0のジエタノールアミンに基づく緩衝液（0.6〜1.0Ｍ）系に含む70μＬの基質洗浄液を吸引する。この基質洗浄溶液を、タブに20μＬ及び50 μＬの部分量で加える。選ばれたアッセイに応じて、種々の試薬の添加量は異なる。第２の基質洗浄液部分量が放出されるや否や、最初の蛍光率が読み取られそして機器のメモリーに記録される。例えばメチルウンベリフェリルホスフェート基質に対するアルカリ性ホスファターゼ酵素の作用によって生じる蛍光量が、Stratus に変換される。それらは表及び図にｍＶ／分（「Stratus率」）として与えられている。このStratus率は、蛍光の強さの尺度であり、それは今度は、タブの反応性部分に結合された分析対象物その他の反応性物質の量の尺度である。 Stratus機器の運転の間、個々の較正標準の蛍光率が測定され、そしてそれらの値はマイクロプロセッサのメモリーの記憶位置へと導かれる。全ての較正標準が測定されおわると、プログラムは、次の方程式に示された形における測定されたデータ点に対して数学的関係を当てはめる、マルチパス線形回帰ルーチンを用いて「Rodbard」パラメーター、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ（Davis，S.E．et al.，J.Im munoassay 1：15-25（1980））を計算する。Ｒ＝｛（Ａ−Ｄ）／〔１＋Ｂ（Ｘ／Ｃ）〕＋Ｄ｝ここにＲは蛍光率であり、Ｘは対応する濃度である。この方程式は、種々のイムノアッセイ系において卓越した適合を与えることの報告されている一般化されたシグモイド曲線をつくり出す。メモリーに記憶されている得られたＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤに基づいて、機器は、アッセイされたサンプルについての濃度読み取りを与える。実施例３架橋された抗ＣＥＡ抗体精製された抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体（クローン＃ＣＥＬ００７，カタログ＃２０００８８、Hybrltech，Inc.）を0.1Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ7.0）中へ緩衝液交換し、そして標的抗体濃度が約6.5±0.5ｍｇ／ｍＬとなるように、液量を減少させた。抗体濃度は、280ｎｍにおける消光係数1.48 ｍｇ（ｃｍ^-1Ｌ^-1）を用いて分光光度法により推定した。スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）〔bis（sulfosuccinimidyl）suberate〕（ＢＳ³）（Pierc e Chemical Co.，カタログ＃21579G）を水に溶解して最終濃度20ｍｇ／ｍＬとした。この抗体溶液を、モルチャレンジ比ＢＳ³：抗ＣＥＡ＝150で２時間室温（24 ±2℃）にてＢＳ³溶液と反応させるか、又は２〜８℃にて終夜（16〜24時間）反応させた。この反応混合物を次いで、混合物全体に対し１／９の量に等しい0.1 Ｍの塩酸エタノールアミンを加えることによって反応停止させた。タンパク質成分は、0.1％のアジ化ナトリウム（即ち、0.1ｇＮａＮ₃／100ｍＬＰＢＳ）を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で平行化させておいたSephadex G-25カラム（Pharmacia，カタログ＃17-0033- 02）を通すことによって、小さい分子種から分離された。代わりとしては、タンパク質成分はＰ−６ＤＧカラム（Bio-Rad，カタログ＃150−0738）を用いて精製された。架橋された抗体の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce，カタログ＃23225G）によって測定された。抗体溶液は、100乃至600μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に調節された。精製の後、架橋された抗体は、ＣＥＡスポット緩衝液（50ｍｇのリン酸ナトリウム、0.3Ｍの塩化ナトリウム、0.1％のTween 20、１％のＢＳＡ、２％のグルコン酸カリウム（ｐＨ6.90））中に入れられた。約76μＬの種々の濃度のタンパク質溶液が、ブランクタブ上にスポットされ、オーブン中約80℃にて乾燥された。対照タブは伝統的な二重免疫複合体アッセイ方式を用いて調製した。二重免疫複合体は、約190μｇ／ｍＬの一次モノクローナル抗体を至適量の二次抗体、即ちヤギ抗マウスポリクローナル（ＧＡＭ）抗体と混合することによって形成し、そしてガラス繊維タブ上へスポットした。較正標準であるＣａｌＡ乃至ＣａｌＦは、0.0、0.25、0.75、3.0、12.0及び50.0ｎｇ／ｍＬのＣＥＡをそれぞれ含んだ。表１は、架橋タブについて及び二重免疫複合体対照タブについて得られた結果の比較である。該表に示されたデータの外挿は、約500μｇ抗体／ｍＬの濃度のにおいて、架橋されたタンパク質を用いたタブは、二重免疫複合体を利用した伝統的タブに匹敵するということを示している。実施例４架橋された抗ｈＴＳＨＤ70抗体精製された抗ヒト甲状腺剌激ホルモン（ｈＴＳＨ）タブ抗体（クローンＤ70： Seronoによって製造）を、0.1Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ7.0）中へ緩衝液交換した。抗体濃度が約5.5±0.5ｍｇ／ｍＬとなるように、液量を減少させた。ＢＳ³ を水に溶解させて最終濃度20ｍｇ／ｍＬとした。この抗体溶液をＢＳ³溶液と、モルチャレンジ比ＢＳ３：抗ｈ−ＴＳＨ＝137で反応させた。この反応混合物を終夜２〜８℃にてインキュベートした。架橋された抗ｈ−ＴＳＨを、該反応混合物をSephadex G-25又はBio-Rad P-6 DGカラムに通すことによって精製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって測定した。このタンパク質を、次いで、ＴＦＳＳＢ（50ｍＭのトリス、２％のＢＳＡ、0.1％のゼラチン、0 .15ｍの塩化ナトリウム、0.1％のＦＳＮ（Zonylフッ素化界面活性剤）（ｐＨ8.0 ））中に入れた。数種の濃度の架橋されたタンパク質複合体のを調製し、Stratus に用いた較正標準Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｃ，Ｅ及びＦは、0.0、0.5、1.5、15.0及び150μ Ｕ／ｍＬのｈＴＳＨを含有した。図１は、Stratu として描く。表２は、架橋されたＤ70（150μｇ／ｍＬ）を有するタブ及びＤ70 ：ＧＡＭ複合体（伝統的な二重免疫複合体）を有するタブを用いたＴＳＨアッセイの比較である。ＣａｌＢは、分析対象物の第１の測定可能な量を表す。ＣａｌＡ（ゼロ分析物）は非特異的結合を、ＣａｌＦは検出すべき分析対照の最も高濃度を表す。比ＣａｌＢ／ＣａｌＡは、低感度側の端の尺度であり、比ＣａｌＦ／ＣａｌＡは全体的感度を表す。架橋されたタブについての一層高い較正曲線比は、二重免疫複合体タブも用いたアッセイに比して、架橋したタブを用いたアッセイの感度が上昇していることを示している。表３は、架橋されたＤ70タブ及び二重免疫複合体タブの双方を用ターの直接比較である。使用したタブ：架橋されたＤ70タブ：150μｇ／ｍＬの架橋されたタンパク質複合体から作られた。現行タブ：ＴＸＳＨ−３０８表３に示されたデータは、架橋された抗ｈＴＳＨを用いたStratu Ａ率についての８つの複製の感度測定は、感度が、二重免疫複合体タブについての値0.1μＩＵ／ｍＬに匹敵するものである0.09μＩＵ／ｍＬであることを明らかにした。感度は、平均のＣａｌＡ率＋される。主として該システムが二次抗体を用いないことによって、著明に非特異的結合の著明な低さが達成された。表４は、架橋されたＣＡ２を用いて製造されたｈＴＳＨタブと二架橋されたタブを用いた種々の較正標準について得られた信号読み取りは、第３欄及び第５欄にそれぞれ示されている。二重免疫複合体についての対応するデータは、それぞれ第２欄及び第４欄に示されている。二重免疫複合体タブについての低感度側の端（比ＣａｌＢ／ＣａｌＡ）は、架橋されたタブについてのそれに比して僅かに良好であり、架橋されたタブについての高感度側の端（比ＣａｌＦ／ＣａｌＤ）及び全体的感度（比ＣａｌＦ／ＣａｌＡ）は、免疫複：ＧＡＭ（二重免疫複合体）タブの置き換えができることを明瞭に示している。実施例６架橋された抗ＴＡＴＦ（ａｂ’）₂ トロンビン：抗トロンビン複合体に対する抗体（抗ＴＡＴＦ（ａｂ’）₂）のＦ（ａｂ’）₂フラグメントよりなる捕捉試薬を、0.1Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）中へ緩衝液交換し、そして最終のＦ（ａｂ’）₂濃度が約5.00±0.25ｍｇ／ｍＬとなるように液量を減少させた。計算量の、水中の100ｍｇ／ｍＬのＢＳ³を、モルチャレンジ比ＢＳ³：Ｆ（ａｂ’）²＝100で該タンパク質溶液に加えた。この溶液を室温（23±2℃）にて２時間インキュベートした。架橋されたＦ（ａｂ’）₂は、Sephadex G-25カラムを通すことによって精製した。架橋されたＦ（ａｂ’）₂の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、又は1.48ｍｇ／（ｍＬ）（ｃｍ）の消光係数を用いて分光光度法によって、測定した。ＥＬＩＳＡは、架橋されたＦ（ａｂ’）₂を用いて実施した。プレートを先ず、該架橋されたＦ（ａｂ’）₂によって終夜２〜８℃にて被覆した。ＴＡＴ較正標準（0〜50ｎＭ）を加え、そしてプレートを室温にて0.5時間インキュベートした。抗ＴＡＴ抗体−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）接合体を加え、室温にて15分間インキュベートし、続いて基質を加えた。次いで室温にて更に15分間インキュベートした。プレートは、各新たな試薬を加える前に洗浄緩衝液で二回洗浄した。比色読み値を測定するために、プレートリーダーを用いてプレートを 405ｎｍにてモニターした。表５は、架橋されたＦ（ａｂ’）₂プレートと非架橋Ｆ（ａｂ’）₂プレートとの間におけるＥＬＩＳＡ性能の比較である。クローン４Ｃ72及び５Ｂ46（いずれもBaxter Diagnostics，Inc.によって製造されている）から作られた２つのモノクローナル抗体−ＨＲＰ接合体を、該架橋Ｆ（ａｂ’）₂アッセイにおいて使用した。この表は、無処理のＦ（ａｂ’）₂及び架橋されたＦ（ａｂ’）₂を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおける405ｎｍでの吸光度によって測定されたものとしての、較正標準Ｆ（50ｎＭ）及びＡ（0.0ｎＭ）の存在下において発生した信号を示す。試験したこれら２つの接合体の全ての組み合わせについて、架橋された抗体から製造されたプレートの全体的な感度（比ＣａｌＦ／ＣａｌＡ）が、無処理の抗体から製造されたものよりも高かった。架橋された抗体プレートについてのこの感度増大は、非特異的結合の低下（ＣａｌＡの信号の低下）のみによるものではなく、プレート上の架橋された抗体の一層効率的な固定化からくるＣａｌＦについての高い応答にもよるものであった。上記の詳細な記述は本発明のよりよい理解のためにのみ示されたものであり、添付の請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することのない修正が当業者には明らかであるから、そこから不必要な限定を読み取ってはならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダイアモンド，スチーブン，イーアメリカ合衆国46530インジアナ、グレインジャー、クエイルバレイドライブ 51868

Claims

【特許請求の範囲】１．試薬を固相支持体に固定化させるための方法であって、タンパク質組成物を架橋剤と反応させて架橋されたタンパク質複合体を形成するステップであって、該タンパク質複合体が特異的結合レセプターを含み且つ非特異的タンパク質を実質的に含まないものであるステップと、そして該架橋されたタンパク質複合体を固相支持体に、該架橋されたタンパク質複合体を当該固相支持体上に固定化するに有効な条件下に適用するステップとを含む方法。２．該架橋剤が２官能性の試薬である、請求項１の方法。３．該２官能性の試薬がスベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）である、請求項２の方法。４．該２官能性の試薬がグルタルアルデヒドである、請求項２の方法。５．該２官能性の試薬が１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである、請求項２の方法。６．該タンパク質が、抗体、抗体フラグメント及び特異的結合タンパク質よりなる群より選ばれるものである、請求項１の方法。７．該特異的結合タンパク質が内因子である、請求項６の方法。８．該抗体が抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体である、請求項６の方法。９．該抗体が、抗ヒト甲状腺剌激ホルモンモノクローナル抗体である、請求項６の方法。 10．該抗体フラグメントが、抗ＴＡＴＦ（ａｂ’）₂である、請求項６の方法。 11．該固相支持体がポリスチレンプレートである、請求項１の方法。 12．該固相支持体がガラス繊維フィルターである、請求項１の方法。 13．２官能性の試薬によって架橋された架橋タンパク質複合体を含む特異的結合アッセイ固相試薬であって、該複合体が少なくとも２つの特異的結合レセプター及び該架橋されたタンパク質複合体をその上に固定化してある固相支持体を含み、該固相支持体が非特異的タンパク質を実質的に含まないものである、特異的結合アッセイ固相試薬。 14．該特異的結合レセプターが抗体、抗体フラグメント及び特異的結合タンパク質よりなる群より選ばれるものである、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 15．該特異的結合レセプターが抗癌胎児性抗原モノクローナル抗体である、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 16．該特異的結合レセブターが抗ヒト甲状腺刺激ホルモンモノクローナル抗体である、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 17．該特異的結合レセプタータンパク質が抗ＴＡＴＦ（ａｂ’）₂である、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 18．該２官能性の試薬がスベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）である、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 19．該２官能性の試薬がグルタルアルデヒドである、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 20．該２官能性の試薬が１，４−ブタンジオールエーテルである、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 21．該固相支持体がポリスチレンプレートである、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 22．該固相支持体がガラス繊維フィルターである、請求項13の特異的結合アッセイ固相試薬。 23．サンプル中の分析対象物の濃度又は存在を測定するための特異的結合アッセイを実施するための方法であって、（ａ）該サンプルを、結合条件下に、請求項13又は14の特異的結合アッセイ固相試薬に適用し、（ｂ）該サンプル中の該分析対象物を検出し又は定量するために、該分析対象物の該固相試薬との特異的結合反応性を測定することを含む方法。 24．該測定が、（ａ）選ばれた量の指示薬を結合条件下に該固相支持体に適用し、（ｂ）該固相支持体に結合した該指示薬の量を測定し、そして（ｃ）該指示薬の量を該サンプル中の該分析対象物の濃度又は存在と相関づけることを含むものである、請求項23の方法。 25．該サンプル及び該指示薬が、該固相に同時に適用されるものである、請求項24の方法。 26．該測定が、（ａ）標識された特異的な競合的試薬を結合条件下に該固相に適用し（ｂ）該固相に結合した標識の量を測定し、そして（ｃ）該標識の量を該サンプル中の該分析対象物の濃度又は存在と相関づけることを含むものである、請求項23の方法。 27．該特異的な競合的試薬が、該分析対象物の標識された類縁体である、請求項26の方法。 28．該特異的な競合的試薬が、該分析対象物の標識されたレセプターである、請求項27の方法。