JPH06505960A - 可溶性メラニン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性メラニン 関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、現在係属中の１９９０年５月１８日付出願第０７１５２５，９４４号 の一部継続出願である現在係属中の１９９０年１０月２５日付出願第０７／６０ ３．１１１号の一部継続出願である。

発明の背景 発明の分野 本発明は、可溶性形態のメラニン及びその化合物の合成ならびに、哺乳動物の皮 ふ及び体毛に対し自然に見える日焼は色を提供するため及び日焼は止めを提供す るため、ガラス及びプラスチックを着色するため及び産業資材を紫外線による損 傷から保護するためにこのような化合物を利用する方法に関する。

背景情報 生物学において、メラニンは、Ｌ−ドーパ及びその酵素誘導体から成るヘテロポ リマーである。これらは、生体内に至るところに存在し、動物及び植物の全ての 門において産生される。哺乳動物の皮ふでは、メラニンは「メラニン細胞」と呼 ばれる専門の細胞の中で酵素的プロセスを通して産生される。メラニンは哺乳動 物の皮ふ及び体毛の色素である。哺乳動物のメラニンはきわめて不溶性が高く、 強アルカリ内での煮沸といった非生理学的処理又は過酸化水素などの強い酸化剤 の利用を通してのみ溶解（可溶化）されうる。メラニンの生合成経路内の主要酵 素であるチロシナーゼは、基質としてＬ−チロシン、Ｌ−ドーパ又は５’、６’ 　−ジヒドロインドールを用いた試験管内でのメラニン形成の触媒として作用す ることができるが、生成物は上述のような不可溶性沈殿物である。

Ｉｔｏ著「ニーメラニンの構造の再検討」、旦匹血ｍ１ｃａ　ｅｔ…匹ｍ−５ｉ ｃａ　Ａｃｔａ、８８３．１５５−１６１．１９８６年は、天然メラニンが５． ６−ジヒドロキシインドール及び５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボ キシル酸の重合体でありうることを記している。しかしながら、Ｉｔｏはこれら の化学物質を組合わせてメラニンを形成することを教示も示唆もしていない。

Ｉｔｏ及びＮ１ｃｏｌ共著の［ナマズの目からの５，６ジヒドロキシインドール ー２−カルボキシル酸のオリゴマの分離Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌム肛匣１ 　１４３．２０７−２１７．１９７４年では、５．６−シヒドロキシインドール ー２−カルボキシル酸のオリゴマが自然の中に例えばナマズ（Ａｒｉｕｓ　ｆｅ ｌｔｓ）のタベータム（輝板）の中に存在していることに言及されている。しか しながらＩｔｏ及びＮ１ｃｏｌ　は、これらの構造を可溶性メラニンの一形態と して使用できることを教示も示唆もしいない。

Ｐａｌｕｗ＋ｂｏ、　ｄ’　ｌ５ｃｈｉａ、Ｍｉｓｕｒａｃａ及びＰｒｏｔａ共 著「ドーパクロムの再配置に対する金属イオンの影響Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ 　ｅｔ　Ｂｉｏ　ｈ　５ｉｃａ　Ａｃｔａ。

９２５、２０３−２０９．１９８７年では、金属イオンＣｕ”＋Ｎｉ”及びＣｏ ”が、主として５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボキシル酸の形成へ と導く生理学的ｐＨ値でのドーパクロムの非脱カルボキシル化再配置を誘発する 上で有効であることが言及されている。彼らによると、色素沈着した組織の中の 既知の金属蓄積に照らして考慮した場合彼らの結果はメラニンの生合成に関与す る調節メカニズムへの新たな入口を提供するものであることが示唆されている。

しかしながらＰａ１ｕ＋ｌ１ｂｏ他は、このようなイオンを可溶性メラニンの色 又は形成を影響するのに使用できるということを教示も示唆もしていない。

オンノ機能Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　２７．６１５６−６１５９．１９ ８８年テハ、ドーパクロムからの５，６−シヒドロキシインドールー２−カルボ キシル酸の形成及び金属イオンに関してＰａｌｕｍｂｏ他の結果と類似の結果が 呈示されている。　Ｐａ１ｕ＋ｍｂｏ他と同様に、Ｌｅｏｎａｒｄ他も又、この ようなイオンが可溶性メラニンの形成のため色に影響を及ぼすのに使用できるこ とを教示も示唆もしていない。

メラニン中の赤又は黄色を決定する上でのシスティンやグルタチオンといったス ルフヒドリル化合物の役割を探究している報告書は数多く存在する（Ｐａｗｅｌ ｅｋ及びＫｏｒｎｅｒによる概説「哺乳動物のメラニンの生合成Ｊ劾咀劇工却− ジ違Ｗ頂ユち−刊、　１３６−１４５．１９８２年を参照のこと）しかしながら 、これらの報告書は、可溶性メラニンの色に影響を与えるのに前記スルフヒドリ ル化合物を使用することができるということを教示も示唆もしていない。

゛　生理学的ｐＨ及び温度で溶解可能であるメラニンの形態を得ることは商業的 に価値あることであろう。このようなメラニンは、沈殿したメラニンを可溶化す るために必要とされる過激な試薬から生じる苛性の副作用が全く無く、適切な賦 形剤内で哺乳動物の皮ふ及び体毛に対して均等に塗布することができる。

このような可溶化されたメラニンは、哺乳動物の皮ふ及び体毛に対して自然に見 える日焼は色を与えることができる。メラニンは、紫外線放射を吸収しかくして その有害な効果例えば皮ふの早期老化及び皮ふガンの出現などからの保護を提供 する皮ふ内の化学物質であることから、可溶化されたメラニンは日焼は止めをし ても又効果的であると思われる。

このような可溶化されたメラニンは、湿疹、アクネ、外傷、火傷及び乾廚による 炎症後の色素低下及び色素過剰を処置するのに効果的であろう、同様に、白斑及 びその他の色素低下の障害のための被覆としても、可溶性メラニンはきわめて効 果的である。

メラニンは、紫外線及び可視スペクトル全体にわたり光を吸収するため、可溶化 されたメラニンは、眼鏡レンズ、コンタクトレンズ、カーウィンドウ、住宅の窓 、事務所ビルなどのためのガラス又はプラスチック着色剤としても同様に効果的 である。

同様にして、紫外線範囲内で吸収することによって、可溶化メラニンは、紫外線 放射からの損傷に対して産業資材を保護するのにも有効な製剤である。「産業資 材」又は「工業製品」というのは、例えば、トラック及び車のタイヤ、塗料、積 層材料、プラスチック、合成樹脂及び織物特にナイロンを含む織物ならびに同様 の資材又は製品のことである。塗料、木材、プラスチック及びゴムの劣化速度が 、紫外線放射に対する露出によって劇的に増大することは周知の事実である。

発明の要約 生理学的ｐＨ及び温度でメラニンの可溶化された形態を提供することが本発明の 目的である。

本発明のもう１つの目的は、自然に見える日焼は色を与えるため哺乳動物の皮ふ 及び体毛に対してこのようなメラニンを塗布するための化合物及び方法を提供す ることにある。

本発明のもう１つの目的は、日焼は止めを提供するためこのようなメラニンを哺 乳動物の皮ふ及び体毛に塗布するための化合物及び方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、色素低下又は色素過剰を処置するためこのようなメ ラニンを皮ふに塗布するための化合物及び方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、色合いを与えるべくこのようなメラニンをガラス及 びプラスチックに対して塗布するための化合物及び方法を提供することにある。

紫外線放射に対する保護を提供するべくこのようなメラニンを工業製品に塗布す るための化合物及び方法を提供することも、本発明のもう１つの目的である。

本発明のもう１つの目的は、コーヒー、茶、ソーダ、ウィスキー、アルコール類 などの食料品のための可溶性メラニンをベースとした着色及び／又は着香剤を提 供することにある。

上述の目的及びその他の目的、目標及び利点は、本発明によって満たされる０本 発明は、０６〜１００℃の温度で少なくとも５〜９好ましくは６．５〜７．５の ｐＨで水性緩衝溶液又は水などの水性溶液内で溶解可能であるメラニンに関する 。この可溶性メラニンはさらに、少なくとも０．４５ミクロンサイズのフィルタ を通してろ過できることを特徴としている。このメラニンの可溶性はその大部分 が豊富なカルボキシル基に起因している。

本発明は同様に、色素系を有する生物学的細胞又は組織から誘導された単数又は 複数の酵素とドーパクロムを反応混合物の形に組合わせることを含む、可溶化さ れたメラニンを産生ずる方法にも関する。ドーパクロム及び酵素に対して５．６ −ジヒドロキシインドールを付加することもできるし、或いは又ドーパクロムが 酵素付加以前に５．６−ジヒドロキシインドールを自然発生的に形成できるよう にすることも可能である０代替的には、反応混合物は５．６−シヒドロキシイン ドールー２−カルボキシル酸を単独で又は５．６−ジヒドロキシインドールとの 混合物の形で含むことができ、この場合、酵素は必要でなく反応は酸素が存在す る中で行なわれる。

可溶性メラニンの色は、反応混合物の内容を変えることによって、すなわち例え ばスルフヒドリル含を化合物又はＣｕ”、Ｎｉ”及びＣｏ”など（ただしこれに 制限されるわけではない）のさまざまな金属を付加することによるか又は反応混 合物のｐＨを変えることによって、黒、褐色、赤及び黄色の間で変化しうる。

メラニンの可溶性の根拠は、大力が分子内に存在する高レベルのカルボキシル基 に起因するものであり、このカルボキシル基は、５゜６−シヒドロキシインドー ルー２−カルボキシル酸前駆体の一部として取込まれている。５，６−シヒドロ キシインドールー２−カルボキシル酸に類似の化合物が前記のカルボキシル基を 提供する上で１換することもでき、従って同様に可溶性メラニンに対して前駆体 として作用することができる。

図面の簡単な説明 図１は、本発明に基づく可溶性メラニンの酵素による形成を示す°写真を表わす 、非酵素的に形成された可溶性メラニンは、組成上ｒＤＩ複合体」とラベル付け された管の中に見られるものと類似している。

図２は、３００ｎｍ以上の波長での本発明に従った可溶性メラニンの光学密度（ ０，０，）を示すグラフを描いている。

可溶性メラニンは、５．６−ジヒドロキシインドール（ＯＨＩ）及び５．６−シ ヒドロキシインドールー２−カルボキシル酸（ＤＩ（ＩＯＡ）を混合することに よって非酵素的に合成された。閉じた菱形は、可溶性メラニンが全く存在しない ＤＩ（Ｉ　とＤＨＩＣＡの新鮮なインキュベートされていない混合物を表わす、 開いた正方形は、酸素が存在する中で室温で１８時間インキュベートされその間 に可溶性メラニンが合成された同じ混合物を表わす。

３１０〜３２０ｎ蒙の間の高い吸光度は、メラニン内のＤＨＩＣＡの存在の特徴 である。４００〜６００ｎｍの範囲にわたる広い吸光度は、可溶性メラニンの特 徴である可視色の存在によるものである。ここで示されているのは、「紫外線Ａ 、レンジ以上での吸光度スペクトルである。

示されていないのは、紫外線Ｂ及びＣレンジ内の可溶性メラニンの強い吸光度ス ペクトルである。

図３は、３００ｎ−以上の波長での本発明に従って可溶性メラニンの光学回度（ ０，０，＞を示すグラフを表わす、可溶性メラニンは、好気性（閉じた菱形）又 は嫌気性（開いた正方形）条件の下で図２にあるように非酵素的に合成された。

酸素の４００〜６００ｒｖのレンジでの吸光度の量すなわち可視色の量を増大す ることがわかる。

図４は、３００ｒ＋＋ｗ以上の波長での本発明に従った可溶性メラニンの光学密 度（０，０，）を示すグラフを表わしている。メラニンは、図２及び図３に描か れているように、Ｄ）ＩＩとＤＨＩＣＡを混合することによって非酵素的に（閉 じた菱形）か又は；ドーパクロムイソメラーゼ酵素複合体（ＤＩ）とドーパクロ ム及びＤＨＩを混合することによって（開いた菱形）又はＤＩ＠ＤＨ！のみと混 合させることによって（開いた正方形）又はＤＩをＤＨＩとＤＨＩＣＡと混合す ることによって（閉じた正方形〕酵素的に合成された。結果を見ると、可溶性メ ラニンを合成するための酵素的及び非酵素的方法が比較可能な生成物を生み出す ことが実証されている。結果は又、反応混合物内のＤＩ（ＩＣＡ又はそれに頻す る化合物の必要性をも実証している。

図５は、ｐｔｔ７で非酵素的に合成された可溶性メラニンの光学密度を示すグラ フを表わす。この反応混合物は、ＤＨＩＣＡとＤＨＩの混合物（閉じた菱形）又 はＤＦＩＩＣＡ単独（開いた正方形）から構成されていた。結果は、ｐ）１７に おいてＤＨｒＣＡ羊独の場合よりもＤＨＩとＤ［ＣＡの混合物の場合に、より可 視的なメラニン（４００〜ｂれるごとを実証している。

図６は、ｐＨ８で非酵素的に合成された可溶性メラニンの光学密度を示すグラフ を表わす、その他のことについては、反応混合物は図５のものと同じである。結 果は、ｐＨ８において、ＤＨＩＣＡ単独が可溶性メラニンの形成に対する効果的 な前駆体として役立つことができ、（実際ＤＨＩＣＡとＤＩ（Ｉの混合物よりも 幾分か優れているということを実証している。

図７は、増大する量の酢酸が２ａＭの可溶性メラニンの溶液に付加されるにつれ てのｐＨ滴定曲線を示すグラフである。

図８は、図７に示されているｐＨ滴定の間の可溶性メラニンの沈殿を示すグラフ である。各々の点について、酢酸が加えられ、溶液は室温で放置されているから ０．４５ミクロンのフィルタを通してろ過された。ろ液の光学密度は次に５００ ｒ＋ｎ＋で決定された。可溶性メラニンはｐＨ４以下ですなわちカルボキシル基 のｐＫに達するにつれて沈殿し始める。結果は、分子内に存在する陽子の付加さ れていないカルボキシル基の数によって決定されているメラニンの可溶性と一貫 性あるものである。

発明の詳細な説明 本発明の可溶性メラニンは、例えば室温といった０°Ｃ−１００’Ｃの温度で長 い時間例えば無限に中性ｐＨ（例えば５〜９、好ましくは６．５〜７．５）で水 性溶液の中にとどまっている。本発明に従った可溶性メラニンは、凍結／解凍時 点で可溶状態にとどまることをさらなる特徴とする。本発明の可溶性メラニンは 同様に、少なくとも０．４５ミクロンサイズのフィルタを通してろ過されうろこ とをもその特徴とする０本発明に基づく可溶性メラニンは、ｐＨ４以下で沈殿で きる。

合成の後、可溶性メラニンは、約１００００未満の分子量をもつ分子の通過を可 能にする半透膜を通して透析できない、従って、本発明に従った可溶性メラニン はｔｏｏｏｏ以上の分子量のものであるが、これはその有益性にとって不可欠な 特徴ではない、可溶性メラニンは、乾燥粉末形状に凍結乾燥させることができ、 その後例えばリン酸ナトリウム０．１Ｍ又は塩化ナトリウム０．１Ｍといった適 切な水性溶剤又は精製水でその可溶形態に戻すことができる。同様に、ブタノー ル又は２−ブトキシェタノールといった有機溶剤の中で再構成することも可能で ある。

本発明に従った可溶性メラニンは、非酵素的（合成による）にでも又酵素的にで も調製可能である。

本発明に従った酵素的調製には、反応混合物の形で、ドーパクロムといった基質 を、色素系を含みさらに特定的にはメラニンを産生ずる能力を有する生物学的細 胞又は組織から誘導された単数又は複数の酵素と組合せることが含まれている。

本発明に従った非酵素的調製においては、反応混合物は基質とし・て５，６−シ ヒドロキシインドールー２−カルボキシル酸（ＤＩ（ＩＣＡ）を単独で含むか又 はＤＨＩＣＡと５，６−ジヒドロキシインドールの混合物を含む。Ｄ）ＩＩｃＡ の適切な類偵体すなわちカルボキシル基を含む類似構造を反応中で置換させるこ ともできる。酵素的又は非酵素的反応混合物はさらに又基質としてインドール− ５，６−キノン及び／又はメラノクロームを含むことができる。金属イオン及び スルフヒドリル含有化合物が含まれ°ていてもよい。

基質の個々の構成成分は、それが酵素的調製におけるようにドーパクロムといっ た１つの成分であれ、又非酵素的調製におけるように複数の成分であれ、好まし くは０．ｌＯ〜５．０　ミリモルの量となるが、必然的にこの濃度範囲に制限さ れるわけではない。換言すると、複数の成分が用いられる場合、成分すなわち５ ．６−ジヒドロキシインドールと５，６−シヒドロキシインドールー２−カルボ キシル酸の混合は、好ましくは等しい割合又はほぼ等しい割合となる。

反応混合物内で基質と酵素又は複数の基質を組合わせる作業は、好ましくは１５ °Ｃ〜３７゛Ｃの温度で行なわれる。

酵素的調製及び非酵素的調製の両方において、酸素例えば空気又は純粋酸素が存 在することが好ましい、このことは、非酵素的調製において特に言えることであ る。

上述の化合物のいくつかの間の関係及び構造式は、以下のように描かれる： 図式■ 図式■ チロシン 上述のことから、ドーパキノン、ロイコドーノぐロム、ドーノイクロム、ＤＨＩ ＣＡ　、５．　６−ジヒドロキシインドール、インドール−５゜６−キノン及び メラノクロムは全てドーパの誘導体であることがわかる。ドーパ自体はチロシン の誘導体であることから、上述の化合物も同様にチロシンの誘導体である（図式 ■参照）。図式Ｉは、ドーパクロムが自然発生的非酵素反応において５．６−ジ ヒドロキシインドールを発生させることができる、或いは又酵素触媒反応におい てＤＨＩＣＡを発生させうることを示している。ドーパクロムは同様に金属触媒 反応（図示せず）においてＤＨＩＣＡを発生させることができる。ドーパクロム をＤＨＩＣＡへと触媒する酵素はドーパクロムイソメラーゼと呼ばれ、実際に可 溶性メラニン形成の原因酵素でありうる。

酵素は同様に、チロシナーゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、垢タンパク［７５， ＭＳＨ受容体及びその他の未知のタンパク譬を含む複合体の一部を成していても よい。

上述の酵素は以下の論文において記述されている：チロシナーゼ：＾ｎｎ　Ｋｏ ｒｎｅｒ及びＪｏｈｎ　Ｐａｗｅｌｅｋ共著「哺乳動物のチ・ロシナーゼはメラ ニン生合成における３つの反応を触媒する」、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１７：１１ ６３−１１６５．１９８２年；ドーパクロム　イソメラーゼ：Ｊｏｈｎ　Ｐａｗ ａｌｅｋ、ｒドーパクロム変換因子はイソメラーゼとして機能するＪ　、Ｂｊｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　−５ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ＋　１６６：３２８−１３３３．１９９０年；糖タ ンパク質７５　：　Ｔｉａ＋ｏｔｈｙ　Ｍ、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｍ、Ｊｕｌｅｓ　 Ｍａｔｔｅｓ、Ｌｉｎｄａ　Ｒｏｕｘ。

Ｌｌｏｙｄ　Ｏｌｄ及びＫｅｎｎｅｔｈ　Ｏ，Ｌｌｏｙｄ　、ｒヒト黒色腫及び メラニン形成細胞の色素沈着関連糖タンパク質：マウスモノクローナル抗体での 定義」、Ｌ旦胆■工厘■、　８５：１６９−１７４．１９８５　；ＭＳＨ受容体 ：　５ｅｔｈ　Ｊ、Ｏｒｌｏｗ、５ａｒａ　１（ｏｔｃｈｋｉｓｓ　、及びＪｏ ｈｎ　Ｍ、Ｐａｗｅｌｅｋ。

ｒ　ＭＳ）ｌの内部結合部位：野生型及び突然変異体のタラウドマン黒色腫細胞 における分析Ｊ　、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　ｕｌａｒ　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　、１４２：１ ２９−１３６．１９９０゜酵素は、同様にドーパクロムイソメラーゼ及び、垢タ ンパク質７５゜ＭＳＨ受容体及びチロシナーゼのうちの１つ又は複数のものを含 むこともできる。

酵素は、チロシナーゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、垢タンパク質７５、ＭＳＨ 受容体及びこれら４つの前述の酵素とは全く別であるが可溶性メラニンの合成を 触媒することのできる単数又は複数の付加的酵素を含む酵素の複合体又は単数又 は複数の個々の酵素の形をとることができる。

本発明に従った可溶性メラニンは、前述の用途をもつ化合物を形成するため生理 学的に受諾可能な担体と混合することができる。

本発明の実施において役立つ生理学的に受諾可能な担体は当該技術分野において 既知のものであり、このような担体の制限的意味の無い例としては、制御された 放出のためにはカルボキシメチレン共重合体を含むマイクロカプセル、皮ふ経由 の放出のためにはアクリルアミド、そして局所的塗布のためには化粧ベースがあ る。

・　さらに、望ましい場合には、本発明に従った化合物は、溶剤、香気、日焼は 止め剤、防腐剤及びキレート北側から成るグループの中から選択された少なくと も１つの添加側を含んでいる。

本発明の実施に役立つ化粧ベースは周知のものであり、ローション、クリーム、 軟こう、口紅、ブラシ、カバーランプ、ファンデーション及びフリーパウダーな どが含まれる。その例は、例えば米国特許第４２２８１５１号；　４２８２２０ ６号及び２９４９４０３号の中に見られる。

本発明の化合物がガラス及びプラスチック用着色剤又は例えば紫外線劣化に対す る保護のための工業製品保護剤として用いられる場合、本発明の化合物はガラス 又はプラスチック又は工業製品の中に取り込まれることになる。単にその可溶性 のみにより、本発明の化合物はガラス又はプラスチック又は工業製品の中に容易 に取り込まれる。このような用途のためには、担体、希釈剤などは生理学的に受 諾可能なものである必要はない。このような用途のためのその他の従来の製剤を それと共に処方することも可能である。

本発明に従った用途のための溶剤としては、例えばエタノール、イソプロピルア ルコール、ベンジルアルコール、オイル例えば落花生油、精製水及び／又は脱イ オン水、生理食塩水などがある。選択される特定の溶剤は塗布方法によって左右 される。

局所的塗布のために使用する場合、本発明の化合物に対して防腐剤を付加するこ とも望ましい可能性がある。本発明に基づく化合物の好ましい投与方法は、局所 的投与である。さらに又、本発明の可溶性メラニンは、低レベルの紫外線の条件 下で色素系を刺激する物質と組合わせることができる。

防腐剤は周知のものであり、−例としてはメチルパラベン、ｒ　ＤＯＷＡＣＬ２ ０００　Ｊ及びプロピルパラベンなどを挙げることができる。

望ましい場合、本発明の化合物には、その酸性度又は塩基性度を減少させるため 、塩基、酸又は緩衝液を当該技術分野の知識に従って付加することもできる。

エーロゾル、クリーム、ローション又はその他の化合物内の可溶性メラニンの濃 度は、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ　〜１．０　ｍｇ／ｍ＋であるが、この濃 度範囲に制約されるわけではない。

溶液は、中に溶解した「発色団」の濃度に応じて異なる色をもつ。

例えば、より多くの溶剤を用いてただし付加的な発色団無しに希釈されたとき、 深赤色溶液はオレンジ色又はピンク色に見えることになる。可溶性メラニンの場 合、水中でかなり高い濃度例えば０．５　ｍｇ／蒙１で溶解させられると、褐黒 色に見える。可溶性メラニンの濃度が例えば０．１　ｍｇ／ｍ＋まで減少される ようさらに多くの水が付加されると、？８液は金色に見える。材料を希釈するこ とによって吸収スペクトル内のシフトに何らの変化も起きないと考えられており 、むしろそれは視覚的認知であると考えられている。

非酵素的調製については、５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボキシル 酸及び５．６−ジヒドロキシインドールを、哺乳動物例えば人間の皮ふ上で混ぜ 合わされるまで例えば小球又は別々のチューブ又は容器内に個別に維持すること が可能である。

可溶性メラニンは、例えばランコムのＣｏｎｑｕｅ　Ｉｅ　ｄｕ　Ｓｏｌ　ｏｉ ｌ＠などの市販のあらゆるジヒドロキシアセトン調製物と可溶性メラニンを単に 混合することによって、数日間皮ふに付着させることができ、水及び石けんに対 する耐性をもつことができる。ＤＨＡは、見かけ上、皮ふ内で例えばタンパク譬 といったさまざまな因子とメラニンを共有結合させるべく、架橋剤として作用す る。その他の架橋剤が、同等か又はこれ以上の結果を達成する可能性も高い。

本発明についてここで以下の制限的意味の無い例を参考にして記述していく。

゛　±上二前１４８月１隊 可溶性メラニン合成のための酵素調製物は、例えば以下のもののような、メラニ ンを産生ずる能力をもつあらゆる生物学的細胞又は組織から得ることができる。

（１）ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ又はこのようなその他のあらゆる哺乳動物源か らのを椎動物皮ふ抽出物；魚類、両生類、は土類、鳥類又はこのようなその他の あらゆるを推動物源の皮ふ抽出物；（２）キノコ、ジャガイモ、バナナ又はその 他のあらゆる植物源といった、メラニンを産生ずる能力をもつあらゆる植物源の 抽出物；（３）畑土、節足動物又はメラニン産生能力をもつこのようなあらゆる 無を推動物源といった無を推動物生体の抽出物；（４）メラニン産生能力をもつ ものの、細菌及びプロトシェアといったように動物学的又は植物学的カテゴリの 中には必ずしも入らないあらゆる単細胞生体の抽出物； （５）可溶性メラニンを産生ずる酵素のための遺伝子が遺伝子学的にクローニン グされているようなあらゆる生体の抽出物；及び（６）可溶性メラニンを産生ず るための酵素を分泌するあらゆる生体又は細胞の培地−二のような生体又は細胞 は、酵素に対するクローニングされた遺伝子を発現する場合としない場合がある 。

さらに、可溶性メラニンを産生ずるための酵素の分離用の生物学的材料の供給源 が、生生血でメラニンを活発に合成する必要は必ずしも無い０色素系というのは 、自らの基質としてメラニン生合成経路内で前駆体及び／又は中間体を認識する ことのできる一群の酵素の全て又は一部分として定義づけされる。生物学的供給 源の中には、１つの色素系を含むもののメラニンを合成しないものもあるが、こ れらの供給源から誘導された抽出物は可溶性メラニンを産生ずることができる。

これらの生物学系統は、その生きた状態で、「メラニ・ン欠乏性」又は「非色素 性」と呼ばれる。多くの白子生体がこのカテゴリーの中に入る。すなわち、これ らの生体は、不完全な又は阻害された色素系を有し、ｍメラニンを作らないが、 いくつかの白子生体からの抽出物は、可溶性メラニンを産生しうる酵素を含んで いる、このような生体は同様に、可溶性メラニンの産生のための酵素の潜在的供 給源でもある。

斑ｌ：健寒勿且製 可溶性メラニンの産生のための酵素は、生物学的供給源の抽出物から又は、酵素 が供給源により培地内に分泌される場合には培地から、分離することができる（ 例１参照）。抽出物は、例えば水といった低張性溶液内での凍結−解凍といった ように；均質化（例えば一般的厨房用「混合器」内、適切なガラス、金属又はプ ラスチック組織ホモジナイザ内で）といった手順を通して生物学的供給源の細胞 を溶菌させることによって；又は生物学的供給源の細胞壁又は血漿膜を分断する あらゆる手段によって、調製される。メラニンを産生ずるための酵素がそれ自体 不可溶性である（例えば細胞内の微粒子形状）場合、ｒＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１０ ０Ｊ、ｒｃｎＡｐｓ　Ｊ又はｒＴＷＥＥＮ　８０Ｊといった非イオン性表面活性 剤又はアセトン又はエタノールといった有機溶剤又は、酵素を可溶化させるその 他のあらゆる溶剤の存在下で、可溶性メラニン産生能力を破壊することなく細胞 を溶菌させることが必要であるかもしれない。

以下の手順は、を益であるものの調製のために絶対不可欠なものではない； 可溶性形態の酵素を含む抽出物を、ガーゼやろ紙といった材料を通してろ過によ って；又は遠心分離によって；又は自然の重力を用いた「沈降」によって清澄す ることができる。

さらに抽出物を、それ自体不溶性であるものの細胞中の数多くの分子構造に付着 するが可溶性メラニンの調製のための酵素には付着しないリン酸カルシウム（ヒ ドロキシルリン灰石としても知られている）との混合によっても清澄することが できる。リン酸カルシウム及びその付着した分子は、ろ過、遠心分離又は上述の ような重力沈降によって抽出物から除去することができる。リン酸カルシウムは この点で有益なものであるが、手順はこの作用物質の使用のみに制限されている わけではない。問題の酵素以外の分子構造に付着し酵素の活性を破壊しないあら ゆる不溶性化合物が利用可能である。

さらに、ジエチルアミノエチルセルロースといった陰イオン交換剤との混合によ って、抽出物を清澄することも可能である。中性ｐＨ（例えばｐＨ６，５〜７． ５）及び低い緩衝液濃度（例えば５〜ｌＯミリモルのリン酸ナトリウム）といっ た条件で、可溶性メラニンの生産のための酵素は、他の多くの分子構造が付着し ないのに対し、このような陰イオン交換剤に付着する。このとき問題の酵素は、 塩の濃度を増大させることにより（例えば０．４モルの塩化ナトリウムを付加す ることによって又は０モルから０．４モルまでの塩化ナトリウム勾配を用いるこ とによって）、陰イオン交換剤から溶出されうる。ジエチルアミノエチルセルロ ース、リン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムがこの点で有利であるが、手順はこ れらの作用物質の使用のみに制限されているわけではない。問題の酵素の活性を 破壊しないあらゆる陰イオン交換樹脂、緩衝液又は塩を利用することができる。

原理は同じである。

抽出物はさらに、コムギ胚芽レクチンーセファ０−スといったような垢タンパク 質に付着する作用物質との混合によっても清澄できる。哺乳動物の細胞において は、問題の酵素は糖タンパク譬であり、従って、他の多くの分子構造が付着しな いのに対し、このようなレクチンに対し付着する。問題の酵素、次に、レクチン からの酵素の移動をひき起こすＮ−アセチルグルコースアミンといった適切な垢 との混合によってレクチンから溶出させることができる。この点においてコムギ 胚芽レクチンーセファロース及びＮ−アセチルグルコースアミンが有益であるも のの、手順はこれらの作用物質の使用のみに制限されているわけではない。問題 の酵素の活性を破壊しないあらゆる適切なレクチン又は垢を利用することが可能 である。原理は同じである。

さらに抽出物は、５ｅｐｈａｄｅｘカラムといった分子ふるいを含むカラム又は 分子ふるいを含む高速液体クロマトグラフィカラムに通用することによって清澄 することができる。問題の酵素は、その分子量に応じて非破壊的緩衝液でこのよ うなカラムから溶出させることができ、かくして異なる分子量をもつその他の分 子構造から分離させることかできる。５ｅｐｈａｄｅｘカラム及びさまざまなＨ ＰＬＣ樹脂が有益な分子ふるいであるが、手順はこれらの作用物質の使用のみに 制限されるわけではない。問題の酵素の活性を破壊しないその分子量に応した分 子分離の通切なあらゆる方法を利用することができる。上述の手順の各々が列挙 された順序で行なわれた場合、チロシーナゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、カタ ラーゼ活性を示す「糖タンパク質７５」又は’　ｇｐ７ｓ　Ｊと呼ばれるタンパ ク質及びｒ　ＭＳＩ（受容体」と呼ばれるタンパク質を含む調製物が得られる。

すなわち、これら４つの既知のタンパク質は、上述の手順を通して同時精製する 。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、合計で１０個以上のタンパク 質が存在しうろことを示している。どのタンパク質又はそれらのどの組合せが可 溶性メラニン合成を触媒するかは今のところわかっていないが、合成はチオシナ ーゼの潜在的阻害因子であるフェニルチオ尿素の存在下で起こることができ、チ オシナーゼが必要でない可能性があることを示唆している。

□■主：可゛７　メラニンの　、・ム 酵素を混合することにより酵素的に可溶性メラニンを調製し、上述のとおり、ド ーパクロム及び５．６−シヒドロキシインドールを含む溶液を用いて分離及び精 製する。可溶性メラニンが現われるまで（３〜６時間）、周囲温度又は反応が起 こりうるようにする適当なあらゆる非破壊温度（例えば１５〜３７°Ｃ）で、非 破壊性緩衝液（例えば０．１モルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５〜７．５）内 で、酵素及び基質をインキュベートさせる。この反応は、目視で又は可視スペク トル内に（例えば４００　ミリミクロン）設定された分光光度計を使用して監視 することができる。反応が完了に達した時点で、緩衝液からの塩を透析により除 去することができ、可溶性メラニンは、自然蒸発又は凍結乾燥といった手順を通 して得られた結晶又は粉末とじて又は凍結状態で室温に保存することが可能であ る０時折酵素調製物内に存在するチロシナーゼが不溶性メラニンの形成をひきお こす可能性があるため、フェニルチオ尿素といったチロシナーゼ阻害因子の存在 下で可溶性メラニンを酵素的に合成することが有害であるが、これは絶対不可欠 なことではない、フェニルチオ尿素は問題の酵素を阻害したり破壊したりしない ことから有効なチロシナーゼ阻害物質であるが、手順はフェニルチオ尿素に制限 されているわけではなく、このようなあらゆるチロシナーゼ阻害因子を利用する ことが可能である。

上述の手順によって調製された可溶性メラニンは、色が全褐色であり、紫外線及 び可視スペクトル（例えば２２０乃至７００　ミクロン）全体にわたって広く吸 収する０色は、非常に濃縮した溶液中での褐黒色から比較的薄い溶液における金 色まで変化しうる。システィン又はグルタチオンといったスルフヒドリル含有化 合物を付加すると可溶性メラニンに対し赤味ある色を付与することができる。

・　図１は、可溶性メラニンの酵素的形成を描いている。右側の３本の管の中味 は０．４５ミクロンのフィルタを通してろ過されたが、その他の点では左側の管 の中味と組成的に同一であった。左側の３本の管を見ると： １）最も左側の管は、ドーパクロム、ドーパ及び５，６−ジヒドロキシインドー ルの混合物を含んでいた。これは又、酵素を熔解するのに用いられる緩衝液も含 んでいた（２０％のグリコール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むｐＨ６，８，５ｗ＋Ｈ のリン酸ナトリウム）が、酵素自体は付加されなかった。

２）左から２番目の管は、左側の管と同じ混合物を含んでいたが、それに加えて 酵素をその緩衝液中に溶解した状態で含んでいた。酵素は、ｒＤＴ複合体」と呼 ばれている。

３）左から３番目の管は、中央の管と同一であったが、潜在的なタンパク質分解 酵素であるトリプシンも０．５　ｍｇ／＋ｗｌの濃度で含んでいた。

左側の３本の管は、その中味の半分が上述のように３つの右側の管内へと除去さ れろ過される前に６時間室温においてインキュベートされた。

緩衝液のみで、形成された黒色メラニンの全てがフィルタ上に捕獲されたすなわ ち不溶性であることがわかる。ＤＩ複合体を付加したとき、全褐色メラニンは完 全にろ過可能すなわち可溶であった。トリプシンが存在した場合、可溶性メラニ ンは全く形成されず、可溶性メラニンの産生がタンパク質（酵素）によって触媒 されることを表していた。非酵素的に調製されたメラニンは、見かけ上ｒＤＩ複 合体」とラベル付けされた管内に見られるものと類似している。

例３で提供された可溶性メラニンは次のような特性を有する：（１）分子蓋１０ ０００よりも大きい。

・（２）煮沸に対する安定性をもつ。

（３）凍結に対する安定性をもつ。

（４）少なくとも０．４５ミクロンの細かいフィルタを通してろ過されうる。

（５）０〜１００°Ｃの温度で少なくとも６．５〜７．５のｐＨ範囲で水中に溶 解可能である。

（６）ｐｔ（４以下で沈殿しうる。

（７）結晶／粉末形態に凍結乾燥でき、これを再度水中に溶解させることもでき る。

（８）濃度に応じて色が褐黒色から金色へと変化する。

（９）紫外線及び可視スペクトル全体にわたり吸収する。及び（１０）スルフヒ ドリル含有化合物及びさまざまな金属イオンの付加により、赤及び黄色の形態で 調製できる。

ＭＡ−：ｌ　メーニンの　−２、・ム 可溶性メラニンは、非破壊性緩衝液（例えば０．１モルのリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６，５〜７．５）中酸素の存在下で５，６−シヒドロキシインドールー２−カ ルボキシル酸（ＤＨＩＣＡ）及び５．６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）を 混合することによって、又は、可溶性メラニンが現われるまで（例えば３〜６時 間）反応を起こすことのできるようなあらゆる非破壊的温度（例えば１５〜３７ °Ｃ）の周囲温度でＤＨＩＣＡを単独でインキュベートすることによって、非酵 素的反応において調製されうる。かくして形成された可溶性メラニンは、例３に 記載されているように酵素的に形成されるものとは区別できない。

可溶性メラニンの酵素的合成と非酵素的合成の違いは、酵素的合成においては５ ．６−シヒドロキシインドールー２−カルボキシル酸が酵素ドーパクロムイソメ ラーゼによりドーパクロムから産生され、５．６−ジヒドロキシインドールがド ーパクロムから自然発生的に産生されるのに対して、一方非酵素的合成において は、５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボキシル酸（ＤＨＩＣＡ）及び ５゜６−ジヒドロキシインドールが直接混合されて可溶性メラニンを形成するか 又はＤ）ＩＩＣＡが単独でインキュベートされるという点にある。

酵素釣手１＋ｌｉと非酵素的手順の両方において、反応は酵素の存在によって大 幅に強化される。

しかしながら、Ｄ）Ｉ　ＩＣＡは、ひとたび溶解すると自然発生的に可溶性メラ ニンに変換し始める。皮ふ上に使用する場合には、これは酸素の無い賦形剤の中 になくてはならない。従って、使用しない場合にはＤＨＩＣＡを冷凍庫の中に保 存し使用時点で少量を秤量すること。

Ｄ）ＩｒＣＡはｐＨ８よりもｐｉ（６においてはるかに安定性あるものである。

■ｉ：可ｒ　メーニンの＼　による′１０、Ｉ　Ｍ、　ｐＨ６，８のリン酸ナト リウム中に溶解させられた約０．４　ｓａｇ／ｍｌの濃度のＬ−ドーパ、ドーパ クロム、ジヒドロキシインドール及びジヒドロキシインドール−２−カルボキシ ル酸の混合物を用いて、メラニンを合成した。０．５グラムのマウス黒色腫細胞 から約２０００倍精製されたｒＤＩ複合複合体例３参照）を、緩衝液（リン酸ナ トリウム、５１１ＩＭ、ｐＨ６，８）内で溶解し、５時間室温で上述の基質との ４１の反応混合液中でインキュベートした。対照反応は緩衝液のみを有し、いか なる酵素も付加しなかった。両方の反応において、メラニン形成が起こったが、 酵素が存在した場合、メラニンを０．４５ミクロンのフィルタを通してろ過させ ることができたのに対し、緩衝液のみの存在下ではメラニンは不溶でろ過するこ とができなかった。

溶液を、光学濃度を測定する前に５０倍希釈した。この実験の写真は図１に示さ れている。

図２乃至図４は、本発明に従った可溶性メラニンの光学スペクトルを示している 。図２から図４まででは、メラニンは３１０〜３２０ｎｍの波長でピーク光学密 度（０，０，）を示した。スペクトルと０．Ｄ、は、室温（２０℃）で２０月間 滅菌状態でメラニンをインキュベートした後、メラニンが透析されたか又は０１ ４５ミクロンのフィルタを通してろ過されたかに関わらず同じであった。

図４において、ＤＨＩにＤＩを加えたものをその他のいかなる付加的基質も存在 しない状態で混合した場合比較的わずかな可溶性メラニンしか作られないことに 留意されたい。同様に又、Ｄ旧にＤＨＩＣＡを加えたものを混合した場合、Ｄｒ とさらに混合された場合と同し程の可溶性メラニンが作られる、すなわちこの場 合ＤＩが必要でないということにも留意されたい。最後に、ＤＩの無い状態での ドーパクロムと［ｌ［の混合が不溶性沈殿物という結果をもたらす（ここでは図 示せず）が、Ｄｒの存在下では可溶性メラニンの合成という結果をもたらすとい うことにも留意されたい。これは、ＤＩがドーパクロムをＤ旧ＣＡに変換しこの ＤＩ（ＩＣＡが次に酸素の存在下でＤＨＩ　と組合わさり可溶性メラニンを形成 するからである。　ＤＩが存在しない場合、ドーパクロムは自然発生的にＤＨＩ へと変換し、沈殿物（不溶性メラニン）が形成する（以下の図式■参照）。

図５から８までについては以上で説明されている。

ｌ工：Ｂｌｊ　メーニンの　による。

′３２０ｎＩＩでの　庁 ムー１ノＪ 緩衝液のみ　１．２２　０．０２４ （酵素付加無し） 酵素付加有り　０．９８２　０．９６６６　：　、　ヒム 以下のものを含む混合材が調製される：重量百分率 アクリルアミド共重合体　２０ （例、ｒｐｏｌｙｔｒａｐ　ＦＬＭＥ２０３Ｊ　）例３又は４に従って調製され た可溶性メラニン　５アルコール　７４．９ び　・　０．１ 上述の混合物を、２〜４週間−日一回好ましくは朝、皮ふに塗布する。

ｆＬＬ：旦１誌し仁りと Ａ、指示された順序で付加することによって、混合材を調製する：デシルオルケ ート（オレイン酸デシル）　２５．０ミリスチン酸イソプロピル　１５．０ 及びシカプリル酸プロピレン グリコール／シカプリン酸　５．０ 鉱油　５４．８５ Ｂ、　０．０１　ｐｂ−のｒｓＯＬＥＲＴＡＮ　ＰＢ−Ｉ　Ｊ　（ポリ（プロピ レングリコール）ラノリンエーテル）に対して例えば例３又は例４に記されてい るとおり調製された可溶性メラニンをｏ、ｏｉ　ｐｂ−に付加することにより、 混合材を調製する。

Ｃ０部部分の混合材を部分Ａの混合材に付加し、結果として得られた混合材を均 質になるまで混合する。

Ｄ３部部分の化合物を毎日１〜２回２〜４週間皮ふに塗布する。

１：旦諒埜三二之工ｌ 以下のものを含む混合材を調製した： ミリスチン酸イソプロピル　１０．０ 防腐剤　０．１ ステアリルアルコール　２．０ ブチル化水酸化アニソール　０．０５ 前述の混合物を、７０°Ｃまで加熱し、７０℃まで予め加熱した６０重量パーセ ントの水をそれに加える。結果として得られた混合物を撹拌し、室温まで冷却さ せる。

次に上記混合物に１％のクエン酸溶液ＱＳを加えて５．０のｐＨを達成し、その 後例えば例３又は例４に従って調製された可溶性メラニンを０．０１重量パーセ ントならびにローション１００重量パーセントを生成するのに充分な脱イオン水 を付加する。

太陽に露出する半時間前に皮ふに上述のローションを塗布する。

泳いだ後、発汗した後又はタオルで拭った後ならびに露出一時間毎にローシラン を再度塗布する。

本発明の可溶性メラニンは同様に、例えばコーヒー、茶、ソーダ、ビール、アル コール飲料、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、バーベキュー味ポテトチ ップスなどの中へ着色剤及び／又は香味剤として食料品に取り込むこともできる 。当然のことながら添加される量は、望まれる効果の程度によって異なるが、液 体（飲料）については１リツトルあたり１〜１０００ｍｇの範囲内、又固体（食 料品）については１ｋｇにつき１〜１０００ｍｇの範囲内となる。添加量はこれ らの範囲に制限されない。

該明細書は制限としてではなく一例として記されているものであり、本発明の精 神及び範囲から逸脱することなくさまざまな修正及び変更を加えることが可能で あることがわかるだろう。

国際調査報告 ＰｃＴ／ＬＪＳ９Ｉ１０３４６４ Ｖ−Ｃｌａｉｍ　３３−３６．　ａｒａｗｎ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｃ１ ’ｉａｎ＠Ｌｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　（・ｆ　ｉｌｕｂ戟■ ｍｅ１ａｎ１ｎ Ｖｌ、　Ｃ１ａｕｎｓ　３７．　ｄｒａｗｎ　ｒ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｌ　ｐ ｒｏｖｉｄｉｎｇ　ａ　ｔａｎｎｕ＞ｇ　ｃｏｍｐｏｓｉｔ奄盾■ Ｏｒ　ａ　５ｌｌｎＳＣｒＨｎ　ｃｏｍｐｏｓｔｔＩｏｎ　ｔｏ　ｍａｍｍａｈ ａｎ　５ｋｌｆｌ　ａｎｄ　ｈａｉｒＶ比Ｃ１ａｉｆＩｉ３６．　ｄｒａｗｎ　 ｔｂ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ｔｍｔｍｇ　ｇｌａｓｓ　ｏｒ　ｐｌａｓｔ＋・： ＸＩ−、ＣｌａｊｍＳ　４２−４３．　ｄｒａｗＱωａ　ｃｏｌｏｒｅｄ　ｆｏ ｏｄｓｔｕｆｆ

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．０〜１００℃の温度で少なくとも５〜９のｐＨで水性溶液中で溶解できるメ ラニン。
2. ２．ｐＨが６．５〜７．５である、請求の範囲第１項に記載のメラニン。
3. ３．少なくとも０．４５ミクロンサイズのフィルタを通してろ過されうる、請求 の範囲第１項に記載のメラニン。
4. ４．沸とう時点で可溶性でありつづける、請求の範囲第１項に記載のメラニン。
5. ５．凍結／解凍時点で可溶性であり続ける、請求の範囲第１項記載のメラニン。
6. ６．ｐＨ４以下で沈殿されうる、請求の範囲第１項に記載のメラニン。
7. ７．１００００キロダルトン以上の分子量をもつ請求の範囲第１項に記載のメラ ニン。
8. ８．水性溶液が水である、請求の範囲第１項に記載のメラニン。
9. ９．３１０〜３２０ｎｍでピーク光学密度を示し、可視及び紫外線スペクトルを 通して幅広く吸収する、請求の範囲第１項に記載のメラニン。
10. １０．反応混合物の形でドーパクロム及び色素系を含む生物学的細胞又は組織か ら誘導された単数又は複数の酵素を組合せることを含む、可溶性メラニンの生産 方法。
11. １１．反応混合物がさらに、５，６−ジヒドロキシインドールを含む、請求の範 囲第１０項に記載の方法。
12. １２．反応混合物がさらにインドール−５，６−キノンを含む、請求の範囲第１ ０項に記載の方法。
13. １３．さらにメラノクロムを含む、請求の範囲第１０項に記載の方法。
14. １４．反応混合物がインドール−５，６−キノン及びメラノクロムをさらに含む 、請求の範囲第１０項に記載の方法。
15. １５．酵素が、メラニンを産生する能力のある生物学的細胞又は組織から誘導さ れ、この生物学的細胞又は組織が、酵素以外の分子構造に付着し酵素の活性を破 壊しない不溶性化合物と接触させられる、請求の範囲第１０項に記載の方法。
16. １６．不溶性化合物がリン酸カルシウムである、請求の範囲第１５項に記載の方 法。
17. １７．酵素がドーパクロムイソメラーゼである、請求の範囲第１０項に記載の方 法。
18. １８．酵素がドーパクロムイソメラーゼ及び単数又は複数の糖タンパク質７５及 びＭＳＨ受容体を含む、請求の範囲第１０項に記載の方法。
19. １９．酵素がチロシナーゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、糖タンパク質７５及び ＭＳＨ受容体の複合体を含む請求の範囲第１０項に記載の方法。
20. ２０．酵素が単数又は複数の個々の酵素又はその複合体を含み、これらの個々の 酵素は、チロシナーゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、糖タンパク質７５、ＭＳＨ 受容体ならびにチロシナーゼ、ドーパクロムイソメラーゼ、糖タンパク質７５及 びＭＳＨ受容体とは全く別の単数又は複数の付加的酵素から成るグループの中か ら選択されており、この酵素が可溶性メラニンの合成を触媒することができるも のである、訴求の範囲第１０項に記載の方法。
21. ２１．さらに酸素が存在する中で該方法を実施することを含む、請求の範囲第１ ０項に記載の方法。
22. ２２．水性緩衝液中で５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボキシル酸を 溶解させることを含む可溶性メラニンの産生方法。
23. ２３．反応混合物がさらに５，６−ジヒドロキシインドールを含む、請求の範囲 第２２項に記載の可溶性メラニンの産生方法。
24. ２４．反応混合物がさらにインドール−５，６−キノンを含む、請求の範囲第２ ２項に記載の方法。
25. ２５．反応混合物がさらにメラノクロムを含む、請求の範囲第２２項に記載の方 法。
26. ２６．反応混合物がさらにインドール−５，６−キノン及びメラノクロムを含む 、請求の範囲第２２項に記載の方法。
27. ２７．酸素が存在する中で該方法を実施することを更に含む、請求の範囲第２２ 項に記載の方法。
28. ２８．生理学的に受容可能な担体との混合材の形で請求の範囲第１項に記載の可 溶性メラニンを含む哺乳動物の皮ふ又は体毛に対する自然に見える日焼け色を与 えるため又は日焼け止めのための化合物。
29. ２９．単独で又は生理学的に受容可能な担体との混合材の形で請求の範囲第１項 に記載の可溶性メラニンを日焼け色を生成する有効量だけ哺乳動物に投与するこ とを含む、哺乳動物の皮ふ及び体毛に自然に見える日焼け色を与える方法。
30. ３０．前記投与は局所的投与によるものである、請求の範囲第２８項に記載の方 法。
31. ３１．単独で又は生理学的に受容可能な担体との混合材の形で請求の範囲第１項 に記載の可溶性メラニンを日焼け色を生成する有効量だけ哺乳動物に投与するこ とを含む、哺乳動物の皮ふ及び体毛に日焼け止めを提供する方法。
32. ３２．投与は局所的投与によるものである、請求の範囲第３０項に記載の方法。
33. ３３．請求の範囲第１０項に記載の前記反応混合物に対し金属イオン及びスルフ ヒドリル含有化合物のうち少なくとも１つを付加することを含む、０〜１００℃ の温度で少なくとも５〜９のｐＨで水性溶液内で溶解可溶なメラニンの色を変え る方法。
34. ３４．反応混合物の中に５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボキシル酸 を含む、０〜１００℃の温度で少なくとも５〜９のｐＨで水性溶液内で溶解可能 なメラニンの色を変える方法。
35. ３５．請求の範囲第１０項に記載の反応混合物のｐＨを少なくともｐＨ５〜ｐＨ ９までに変えることを含む、０〜１００℃の温度で少なくとも５〜９のｐＨで水 性溶液内で溶解可能なメラニンの色を変える方法。
36. ３６．請求の範囲第２２項に記載の反応混合物のｐＨを少なくともｐＨ５〜ｐＨ ９までに変えることを含む、０〜１００℃の温度で少なくとも５〜９のｐＨで水 性溶液内で溶解可能なメラニンの色を変える方法。
37. ３７．哺乳動物の皮ふ又は体毛に対して５，６−ジヒドロキシインドール−２− カルボキシル酸及び５，６−ジヒドロキシインドールを局所的に個別に投与する ことを含む、哺乳動物の皮ふ又は体毛に対して自然に見える日焼け色を提供する か又は日焼け止めを与えるための方法。
38. ３８．ガラス又はプラスチックの中に、請求の範囲第１項に記載の可溶性メラニ ンを色合いを生成する有効量だけ取り込むことを含む、ガラス又はプラスチック の着色方法。
39. ３９．工業資材の中に請求の範囲第１項に記載の可溶性メラニンを対損傷保護に 有効な量だけ取り込むことを含む、紫外線放射に対する露呈による損傷に対し工 業資材を保護する方法。
40. ４０．請求の範囲第１項に記載の可溶性メラニンを炎症後の色素低下又は色素過 剰を処置するのに有効な量だけ皮ふに塗布することを含む、炎症後の色素低下又 は色素過剰の処置方法。
41. ４１．別々の容器又は複数の別々の小球の形で５，６−ジヒドロキシインドール −２−カルボキシル酸及び５，６−ジヒドロキシインドールを含む、哺乳動物の 皮ふ又は体毛に対し自然に見える日焼け色を提供するため又は日焼け止めを提供 するためのキット。
42. ４２．請求の範囲第１項に記載の可溶性メラニンで着色された食料品。
43. ４３．コーヒー、茶、ソーダ、ビール、アルコール飲料、アイスクリーム、フロ ーズンヨーグルト又はバーベキュー味のポテトチップスを含む、請求の範囲第４ ２項に記載の着色された食料品。