JPH06505961A - イオン的に架橋されたポリマーマイクロカプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イオン的に架橋されたポリマーマイクロカプセル発明の背景 本発明は、生物学的物質、特に生きた細胞をカプセル化するためのポリマー組成 物の調整方法に関する。

多くの異なったポリマーが、制御されたドラ・ノブテリバリー用に使用されてき た。合成ポリマーは、その再現性および製造の容易さで天然ポリマーよりも好ま しい。生分解され得るポリマーの例には、ポリ（無水物）、ポリ（オルソエステ ル）、およびポリ（乳酸）が含まれる。「分解され得ない」ポリマーの例には、 エチレン酢酸ビニルおよびポリ（アクリル酸）が含まれる。制御されたドラッグ テリバリーへのポリホスフアゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ）の使用 は、Ｌａｕｒｅｎｅｉｎらによる１９８７年６月ｌＯ日出願の米国特許出願０７ １０６０．７７０．およびＡｌ　１ｃｏｃｋらの米国特許第４．８１１０．６２ ２号に記載されている。Ａ１１ｃｏｃｋらの米国特許第４．８８０．６２２号お よびＬａｕｒｅｎｃｉｎらによる米国特許出願０７１０６０、７７０に記載され ているポリマーは、溶解し、そして形成しポリマーをフィルムあるいはディスク 中に形成する工程、ポリマーを溶解し、そして共有結合あるいは照射により架橋 し、柔軟なゲルを形成する工程、あるいはポリマー粒子をディスク中へ圧縮する 工程を含む、標準的な技法によりドラッグテリバリー用デバイスに形成される。

合成ポリマーは、強度、ヒドロゲルの特性、透過性ある（鳥は生体適合性などの 特定の特性を、化学者が組込む能力により、医療科学での使用が増大している。

特にこのような特性が不可欠である細胞のカプセル化およびドラ・ノグデリノく り−の分野で増大している。しかし、これらのポリマーによるカプセル化には、 例えば熱あるいは有機溶媒などの過酷な条件が常に使用されるので、例えば、タ ン７＜り質、リポソーム、哺乳類細胞などの感受性の物質をカプセル化する際（ こは困難が生じる。

現在のところ、哺乳類細胞のマクロカプセル化に使用されている最も計略的な方 法は、アガロースある（λはアルギン酸エステル類などの天然ポリマーに基づい ていた。アガロースゲルの微粒子は、アガロ−スーツ＜ラフイルムオイル混合物 の乳化あるいはテフロン鋳型の使用により形成され得る。何れの場合も、アガロ ースの熱媒介ゲル化には、細胞（こ有害な過度の温度の使用が要求された。一方 、アルギン酸エステル＋１、水中で二価カチオンとイオン的に架橋され得、室温 でヒドロゲルマトリックスを形成する。この穏和な条件により、アルギン酸エス テルは、ハイブリドーマ細胞のカプセル化用に、最も一般的に使用されてきたポ リマーである。このポリマーは、Ｌｉｍの米国特許第４．３５２．８８３号に記 載されて０るよう（こ、水中でイオン的に架橋され、ヒドロゲルを形成し得る。

この方法では、カプセル化されるべき生物学的物質を含有する水溶液を、水可溶 性ポリマーの溶液中に懸濁させ、その懸濁液を、多価カチオンとの接触により個 別のマイクロカプセルに構成される液滴に形成し、次に、マイクロカプセルの表 面を架橋させて、カプセル化される物質の周りに半透膜を形成する。

しかし、天然のポリマーは、変動し不安定な生体適合性を示し、調整抽出物中の 不純物により、い（つかの特性は、再現するのが困難である。合成ポリマーは、 再現性および特定の必要に応じてその特性を合わせる化学者の能力により、より よく使用される。Ｌｉｏ＋に記載されている様に、組成物全体のより良い制御お よび製造の容易さのために、ポリサ・ツカライド類を用いるよりも合成ポリマー を使用して、生物学的物質をカプセル化する方法を有することが望まれる。この 方法はさらに、生分解性の組成物あるいは分解されない組成物の両者を作り得る という利点がある。現在まで、高い温度ある（Ｘは有機溶媒を使用しないで、合 成ポリマー中に生物学的物質をカプセル化した者はいない。

従って、本発明の目的は、高い温度および有機溶媒を使用しないで、合成ポリマ ー中に生物学的物質をカプセル化するための方法および組成物を提供することで ある。

さらに、本発明の目的は、加水分解的に分解され得る、あるいは加水分解的でな く分解され得る合成ポリマーの何れかの中に生物学的物質をカプセル化するため の方法および組成物を提供することである。

発明の要旨 生物学的に不安定な物質、例えば、タンパク質、リポソーム、細菌細胞、および 真核細胞を、合成ポリマーカプセル内にカプセル化するための方法、およびその 生成物が開示されている。この方法は、反対の電荷の多価イオンと架橋されて、 生物学的物質をカプセル化したしドロゲルを形成し、必要に応じて、任意にさら に、ヒドロゲルを形成するのに使用した多価のイオンと同じ電荷の多価ポリイオ ンとの相互作用により安定化し、荷電側鎖を有する水可溶性ポリマーの使用に基 づく。好ましい実施態様では、加水分解的に安定なポリホスファゼン類が、Ｃａ ”＋あるいはＡ１３＋などの二価あるいは三価カチオンで架橋され、次に、ポリ ーＬ−リシンなどのポリ力チンで安定化されるカルボン酸側鎖基を有するモノマ ーから形成される。イミダゾール、アミノ酸エステルあるいはグリセロール側鎖 基を有するモノマーを組込むことにより、加水分解により分解するポリマーを合 成し得る。

種々の異なった組成物が、架橋されたポリマーから形成され得る。好ましい実施 態様では、ポリホスファゼンとカプセル化されるべき物質との水溶液を塩化カル シウム溶液中にスプレーすることにより、マイクロカプセルが形成される。ポリ （Ｌ−リジン）と表面のカルボキシル化基との複合によって、マイクロカプセル 上に半透膜が形成される。さらに、ポリイオンの性質、濃度および反応条件が、 マイクロカプセルの透核細胞、リポソーム、および生物学的に感受性のタンパク 質のカプセル化を示している。

図面の簡単な説明 図１は、ポリ［ビス（カルボキシレートフェノキシ）（ホスフアゼン）］　（Ｐ ＣＰＰ）の合成の図式である。

図２は、２１．５　ＫｄのＰｉ、Ｌで被覆されたＣａ−ＰＣＰＰ球からのＦＩＴ Ｃ−ＢＳＡ（白四角）およびβ−ガラクトシダーゼ（黒四角）の累積放出＝ｊ（ （％）のグラフである。モル比が１；１の水素化した卵のホスファチジルフリン （１’Ｐｃ）およびフレステロール（Ｃ）りからなるリポソーム（白丸）および ＭＥＬ（黒丸）からのＦＩＴＣ−ＢＳＡの放出率である。

図３は、リン酸緩衝食塩水中での、β−ガラクトシダーゼをカプセル化したＰＣ ＰＰマトリックスから放出されたβ−ガラクトシダーゼの活性率（％）（白丸） および溶液中のβ−ガラクトシダーゼ活性（黒丸）のグラフである。

図４は、分子量が２１．５　ｋＤａと６４　ｋＤａとの間のポリ（し−リシン） 　（ＰＬＬ）と１５から３０分間反応させて形成したマイクロカプセル中にカプ セル化した細胞（黒丸）および、分子量が１０２　ｋＤａのＰＬＬとｚＯ分間反 応させて形成したマイクロカプセル中にカプセル化した細胞（白丸）についての 、時間（日）に対する生細胞／ｍｌポリマーのグラフである。

発明の詳細な説明 架橋されたポリマーヒドロゲルを、細胞、リポソームおよびタンパク質などの不 安定な生物学的物質をカプセル化するために使用する。これらのポリマー組成物 は、抗体あるいは組換えタンパク質を産生ずる細胞用の「バイオリアクター」と して使用され得る。これは、ガスおよび栄養素を周囲の培地と交換し得、一方間 時にカプセル化された物質を保護し、分泌されたタンパク質を保持する。この組 成物はまた、ドラッグデリバリ−用デバイスとして、そして組織の補強用に使用 され得る。

架橋し得るポリマーを製造する方法の利点は、有機溶媒の使用がさけられること 、再現性が高いこと、および、処理工程が少ないことである。合成ポリマーの利 点は、生体適合性であること、加水分解的に分解され得るかあるいは分解され得 ないかいずれか（あるいはその組み合わせ）であり得ること、および、水溶液に 可溶性であることである。ポリマーの加水分解速度は完全な状態に処理すること ができ、所望の期間の間は完全な状態であり得るように設計され得ることである 。

マイクロカプセルが生物学的物質のカプセル化には好ましいが、ポリマーは、使 用する物理学的環境に依存して、実質的に如何なる形状あるいは大きさに形成さ れ得る。ポリマーは、頬側、口、膣、子宮内、眼および肛門の挿入用、あるいは 非経口的挿入あるいは注射用に、成形あるいは大きさが整えられ得る。後者の場 合には、ンリンジのテップを通過するのに適した十分に小さく、一般的には数百 ミクロン以下の粒子の形態に形成されるべきである。

このポリマー物質の好ましい実施態様では、ポリアニオン性ポリ　［ビス（カル ボキンレートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）が合成された。これを室温 あるいはそれ以下の温度で、水性溶媒中に溶解した多価カチオンと、架橋してヒ ドロゲルマトリックスを形成し、次に、ポリカチオンとの相互作用（こより半透 膜を形成した。リポソームおよび）１イブリドーマ細胞を内包しても、ポリマー のカルシウムによる架橋（こ＋１干渉しなかった。

この方法は、哺乳類細胞、リポソームおよびタンノくり質などの感受性の物質の カプセル化に、以前の公知の方法ｔｆａを用いた合成ポリマーでは可能ではなか った、非常（こ穏和な条（牛が使用される。６０％以上のＦＩＴＣ−ＢＳＡおよ び８０％以上のβ−力゛ラクトシダーゼが、酵素活性の損失なしに、このシステ ムで効果的にカプセル化された。肝細胞および］＼イフ゛リドーマ細胞もまた、 カプセル化され、長時間にわたり生存した。ポリ（Ｌ−ＩＪンン’）　（ＰＬＬ 、分子量２１．５　ｋＤ）で被覆すると、ゲルマド１ノックスは、リポソームを ５０日以上維持することができた。ｃａ−ｐｃｐｐおよびＰＣＰＰ−ＰＬＬ複合 体は肝細胞およびノ１イブ１ノドーマ摩田胞１こ対して非毒性であった。

六〇　し′。る７ｒ　ポリイオンポリマー架橋されたヒドロゲルの形成に使用さ れ得る多くのポ１７７−が存在する。一般にこれら（ま、水、緩衝塩溶液などの 水溶液、あるいはアルフール水溶液（こ少なくとも一部可溶性であり、荷電側鎖 基もしくはそのｍ個イオン塩を有するボ１ツマ−である。カチオンと反応し得る 酸性側鎖基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン類）、ポリ（アクリル 酸類）、ポリ（メタクリル酸類）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポ リ（ビニル酢酸）およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーであ る。アクリル酸あるいはメタクリル酸とビニルエーテルのモノマーあるいはポリ マーとの反応により形成された酸性側鎖基を有するコポリマーもまた使用され得 る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好まシフは、フ ッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。

アニオンと反応し得る塩基性側鎖基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミ ン類）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）およびいくつか イミノ置換されたポリホスファゼン類である。ポリマーのアンモニウム塩あるい は四級塩もまた、骨格の窒素あるいはペンダントのイミノ基から形成され得る。

塩基性側鎖基の例は、アミ７基あるいはイミノ基である。

ボーマーのム　および ヱユ］ノ二一とも乙版 ポリホスファゼン類は、交互にある一重結合と二重結合とにより分離された窒素 とリンからなる骨格を有するポリマーである。各リン原子は、２つの側鎖（”Ｒ ”）に共有結合により結合している。ポリホスファゼン中の繰り返し単位は、− 膜構造（１）を有する。

ここで、ｎは整数である。

架橋に適したポリホスファゼン類はおもに、酸性で、二価あるいは三価カチオン と塩架橋（ｓａｌｔ　ｂｒｉｄｇｅ）を形成し得る側鎖基を有する。好ましい酸 性側鎖基の例は、カルボン酸基およびスルホン酸基である。

好ましい実施態様では、ポリホスファゼン類は、水性環境では加水分解せず、そ のためこのポリマーは、インビボの条件下では迅速には分解されず、このシステ ムが水性環境に曝すレタ時に、分子は実質的に分散によりこのポリマーを通過す る。この実施態様では、一部分、一般的には１０％未満の側鎖基（式ｌのＲ基） が加水分解を受ける。

第二の実施態様では、ポリマーは、少なくとも２つの異なる型の側鎖基、多価カ チオンと塩架橋を形成し得る酸性基、および例えば、イミダゾール基、アミノ酸 エステル類、グリセロールおよびグリコジルなどのインビボ条件下で加水分解す る側鎖基を有する。本明細書で使用する用語「生体内で侵食され得る（ｂｉｏｅ ｒｏｄｉｂｌｅ）　Ｊあるいは［生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａされると、約 ５年未満、そして最も好ましくは約１年未満の、所望の応用（通常はインビボで の治療）に適した期間内に、溶解あるいは分解するポリマーを意味する。

側鎖の加水分解でポリマーが侵食される。加水分解する側鎖の例は、非置換およ び置換イミダゾール類およびアミノ結合を介してリン原子に結合したアミノ酸エ ステル類である。

（この様式で両方のＲ基が結合したポリホスファゼンポリマー類は、ポリアミノ ホスファゼン類として知られている）。ポリミダゾールホスファゼン類では、ポ リホスファゼン骨格上の°Ｒ”基のいくつかは、環の窒素原子を介して骨格のリ ンに結合されたイミダゾール環である。他の−Ｒ”基は、加水分解に関与しない 、例えば、メチルフェノキシ基あるいはＡｌ　１ｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ ｅｃｕｌｅ　ｌｏ：８２４−８３０　（１９７７）に示されている他の基のよう な、有機残基であり得る。

加水分解され得ないＲ基は、炭素原子が２０以下（より好ましくは炭素原子が１ ２以下）のアルキル、アラルキルあるいはアリール基；もしくは、２０以下の炭 素原子およびヘテロ原子（より好ましくは１２以下の炭素原子あるいはへテロ原 子）を有するヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、あるいはへテロアリール基で あり得る。アルキル鎖が長すぎる場合には、ポリマーは結果的に水には非溶解性 となる。これらの基は例えば、酸素、イオウ、窒素あるいは炭素原子など含分し てリン原子に結合され得る。

好ましいポリホスファゼン類は、ポリ（ジクロロホスファゼン）を、塩素と置換 する適切な側鎖求核剤と反応させることにより製造される。ポリマー中の加水分 解性側鎖と非加水分解性側鎖との所望する比率は、ポリ（ジクロロホスファゼン ）と反応させる、対応する核剤の量を調節することにより達成し得る。好ましい ポリホスファゼンは、１，０００を越える分子量を有する。

ポリマーの合成は、下記に記載されている試薬および機器−を使用した以下の実 施例を参考として記載されている。必要ならば、他の等価物質に置き替え得る。

種々の型のポリホスファゼンの合成および分析法は、Ａ１１ｃｏｃｋ、　Ｈ，Ｒ ぺら、凰虹ＬＣｈｅ＋１．　１１．　２５８４　（１９７２）；　Ａ１１ｃｏｃ ｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１６゜７１５　（１９８３）：　Ａ１１ ｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１９．　１５０８　（１９８６） ；・Ａｌ１ｃｏｃｋ、　Ｈ，Ｒ，；　Ｇｅｂｕｒａ、　Ｍ、：Ｋｖｏｎ、　Ｓ、 ；　Ｎｅｅｎａｎ、　Ｔ、Ｘ、　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９，５００　（ １９８８）ＨＡ１１ｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２１゜１９８ ０　（１９８８）：　Ａ１１ｃｏｃｋら、Ｉｎｏｒ　、Ｃｈｅｗ、２１（２）、 ５１５−５２１　（１９８２）：　Ａ１１ｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ　２２．　７５　（１９８９）ＨＡｌｌｃｏｃｋらの米国特許第４．４４ ０．９２１号、第４．４９５．１７４号および第４．８８０゜６２２号：　Ｍａ ｇｉｌｌらの米国特許第４．９４６．９３８号およびＧｒｏｌｌｅｍａｎら、Ｊ 、　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　３．１４３　（１９８６）に記載 されている。これらの教示は、本明細書では参考文献として特に援用されている 。

。　基を　る　の７ρ　ポリマー 上記の他のポリマーの合成法は、当業者には公知である。

例えば、蝕匹ｉｓｅ　Ｅ＋虱匹艮匹坦１回二医江ｍｅｒ士山狙鯰およびヒｏ１　 ｍｅｒｉｃ　Ａｍ１ｎｅｓ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　５ａｌｔｓ、Ｅ、Ｇｏ ｅｔｈａｌｓｍ（ＰｅｒｇａＩｌｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、　Ｎ Ｙ　１９８０）を参照。ポリ（アクリル酸）などの多くのものが入手可能である 。

カプセル　され′９る　； ホルモンの様に小さな分子から、アルブミンの様なタンパク質の巨大分子、例え ばハイブリドーマ等の原核細胞および真核細胞などの生細胞、およびリポソーム に至る範囲の多くの異なった材料が、ヒドロゲルの形成時にポリマー物質に組み 込み得る。

好ましい実施態様では、細胞、ウィルスおよびリポソームなどの物質が、ヒドロ ゲル微粒子中にカプセル化され、次に、さらに架橋して、コアのヒドロゲルの液 化によりマイクロカ１プセルに変換され得る。溶液あるいは懸濁液中の、生物学 的に活性な合成化合物、タンパク質、核酸、ポリサッカライド、脂質、および、 合成あるいは天然源からの精製物の他の薬剤を含む物質もまたカプセル化され得 る。

実施例は、活性あるいは細胞の生存性を失うことなく、カプセル化するだけでは なく、架橋されたポリホスファゼンが、細胞生存に適した栄養素および呼吸の適 切な交換を行う時にのみ達成され得る期間にわたり細胞が生存することを実証す る。

活性物質に対するポリマーの割合は、例えば、注射するのに十分小さな粒子サイ ズに製造する必要等、カプセル化されるべき物質に依存して決定される。

ヒドロゲルをニ　るためのポリマーと　価イオンとの加荷電側鎖基を有する水溶 性ポリマーを、ポリマーが酸性側鎖基を有する場合には多価カチオン、あるいは ポリマーが塩基性側鎖基を有する場合には多価アニオンのいずれかである、反対 の電荷の多価イオンを含む水溶液と反応させ架橋する。

カチオンによる、　１　基を　るポリマーの酸性側鎖基を有するポリマーを架橋 させヒドロゲルを形成するのに好ましいカチオンは、銅、カルシウム、アルミニ ウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムおよび錫などの、２価および３ 価のカチオンであるが、たとえばＲ３Ｎ”−＼／＼／＼／−“ＮＲ３すどの、ア ルキルアンモニウム塩などの三官能、三官能、または四官能有機カチオンも用い 得る。

これらのカチオンの塩の水溶液を、ポリマーに加え、柔らかく高度に膨潤したヒ ドロゲルおよび膜を形成させる。カチオンの濃度が上がるほど、あるいは価数が 上がるほど、ポリマーの架橋の程度が上がる。０．００５Ｍはどの低濃度からポ リマー架橋が起こることが示された。濃度の上限は塩の溶解度によって制限され る。

価アニオンによる、塩基　１　基を　するポリマーの加櫃 ポリマーを架橋させヒドロゲルを形成するのに好ましいアニオンは、たとえばテ レフタル酸などの低分子量のジカルボン酸、硫酸イオンおよびカーボネートイオ ンなどの、二価および三価のアニオンである。上記でカチオンについて述べたよ うに、これらのアニオンの塩の水溶液を、ポリマーに加え、柔らか（高度に膨潤 したヒドロゲルおよび膜を形成させる。

をン　るための、のポリイオンを　るポリマ二旦里盪 ある実施態様では、ヒドロゲルポリマー上の別の表面基を、反対の電荷を持つポ リイオンと反応させ、ヒドロゲルの表面に半透膜を形成させる。ヒドロゲルが微 粒子の形態である場合には、核ヒドロゲルは、たとえば透析あるいはキレート化 剤を加えることによって、多価イオンを除去することによって液化し得る。半透 膜は、カプセルに入れられた生物学的物質を維持する。

に　な　ポリカチオン 複合させ、それによりポリマーヒドロゲルを半透性表面膜中に安定化させるため に、様々なポリカチオンを用い得る。

用い得る物質の例としては、ポリエチレンイミンおよびポリリシンなどの、分子 量３．０００から１００，０００の、アミン基またはイミン基などの塩基性反応 基を有するポリマーが挙げられる。

これらは商業的に入手可能である。好ましいポリカチオンはポリ（Ｌ−リジン） である。合成ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミ ン）およびポリ（アリルアミン）が挙げられる。多糖類、キトサンなどの天然ポ リカチオンもある。

ポリカチオンの分子量は、ヒドロゲルの表面に形成される半透性膜の厚さに影響 を与え得る。たとえば、１３−２１．５　ｋＤａはどの低分子量のポリ（し−リ シン）は、より簡単にゲルマトリックス内に浸透し得、小さなＭＷカットオフを 有する（つまり、６８　ｋＤａ以下の分子量を持つ小さなタンパク質のみが、膜 を通って自由に拡散する）膜を生成する。しかし、その開口部では、ハイブリド ーマ細胞などの細胞を成長および増殖させるための栄養分および呼吸気体の交換 が十分に行えないため、これらの膜は真核生物細胞の培養には好ましくない。従 って、細胞をカプセルに入れるためには、ＭＷが１０２　ｋＤａの高分子量のポ リ（Ｌ−リシン）をヒドロゲルの複合に用いる。これらの膜は、抗体などの大き な分子を維持する一方で、細胞を成長させる。

必要な栄養分および呼吸気体の交換に適した膜がヒドロゲル微粒子の周囲に形成 され、次にカプセルに入れられた細胞の周囲のヒドロゲルが溶解され、残りの構 造を、抗体または組替えタンパク質の製造のためのバイオリアクターとして、お よび細胞移植に、用い得る。この時、膜は、カプセルに入れられた細胞を維持お よび支持するだけではなく、宿主免疫細胞および抗体の浸透を妨げる。

を　るポリマーの　に　な　ポリア ニオン ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基との反応によって半透膜を形成するのに用 い得るポリアニオンには、アクリル酸、メタクリル酸、およびアクリル酸のその 他の誘導体（のポリマー）および共重合体、スルホン化ポリスチレンなどの５ｏ ３Ｈペンダント基を有するポリマー、およびカルボン酸基を有するポリスチレン が含まれる。

微粒子およびマイクロカプセルの製造法１１五旦且里： カチオンを　いるゲル 微粒子は、目的物を含有するポリマーの水溶液が、液滴形成装置を用いてスプレ ーすることによって調製される。懸濁液を、たとえば、制御された速度で空気流 を通したチューブの内部に位置する針を通して、プラスチックのシリンジから押 し出す。ポリマーを押し出す速度は、たとえば、シリンジポンプによって制御す る。針先で形成された小滴は、同軸空気流によって吹き出され、ゲル化溶液（つ まり、二価または三価のイオンの水溶液）内で集められる。この時、架橋が行わ れ５、たとえば１５から３０分間で硬化される。

これらの微粒子の形状および大きさは、ポリマーと架橋剤の濃度、およびマイク ロカプセル化工程で用いられる、ポリマーの押し出し速度、空気流速度および針 の直径などのパラメーターに依存する。

微粒子の調製の典型的な例では、濃度２．５％（ｖ／ｖ）のＰＣＰＰポリマーと 濃度７．５％（Ｖ／Ｖ）の塩化カルシウムとを用いる。ポリマーの押し出し速度 が７０ｍ１／ｈｒで、空気流速度が５Ｌ／ｈｒで、そして針の直径が２０ゲージ で１．得られる微粒子は直径４００〜７００マイクロメーターの球状である。

この方法でＰＣＰＰを用いる例示的な範囲：ｌ）最終ポリマー濃度：１．２５〜 ５％（Ｗ／Ｖ）　；２）塩化カルシウム濃度：３〜７．５％（ｖ／ｖ）　；３） ポリマー押し出し速度：　５（１−１００ｍｌ／ｈｒ；４）空気流速度：　５　 Ｌ／ｈｒの範囲内；５）注射可能な微粒子を製造する、１８〜２６ゲージの針直 径。

（パスツールピペ・ノドを通してポリマーを押し出すことによって、ミリメート ル単位の直径の微粒子を製造し得る。）多価ポリイオンとの複合 架橋剤溶液中で硬化させた後、微粒子を集めて、ポ１バＬ−リシン）　（ＰＬＬ ）などの荷電したポリイオンとさらに相互作用させる。複合したポリマーは安定 しており、微粒子で半透膜を形成する。この膜の特定の目的物に対する透過性は 、ポリイオンの分子量に依存する。

（以下余白） ボ誓マーマイクロカプセルの　： ポリイオンで被覆されたヒドロゲル微粒子を集め、さらに緩衝液で処理して、複 合されていない多価イオンを除去する。

たとえば、複合されていない多価カチオンの除去については、ｐＨ８，０に調整 した、二回蒸留水中の０．９％（ｖ／ｖ）　Ｋ　Ｃ１溶液が用いられる。ＫＣＩ は、外側の膜には影響を与えずに、内部のゲルを溶解する。内部のゲルを液化す るには、ＥＤＴＡおよびクエン酸ナトリウムなどのキレート剤を用いることも含 め、その他の方法も用い得る。

上記に説明した方法および組成物は、以下の実施例を参照すると、さらに理解さ れるであろうが、この実施例は限定的なものではない。

・実施例１：酸性側鎖基を有するポリホスファゼンの合成この合成はＡ１１ｃｏ ｃｋら、Ｍａｃ　ｏｍｏｌｅｃｕ　ａｓ　２２．７５　（１９８９年１月）によ って記載されている。

ポリ（オルガノホスファゼン）の特性は、異なる置換基（Ｒ）を導入することに よって、広い範囲で改変し得る。これらの特性変化は、単置換ポリマーのＲ基を 変化させることによっても、そして、同一の鎖に付（２個以上の共置換基を用い ることによっても、非常に良好に行い得る。このように、個々のポリマーは、疎 水性でも、両性（ａｍｐｈｏｐｈｉ　１ｉｅ）でも、親水性でもよく；水に対し て安定性でも、水により侵食性でもよく；結晶でも無定形でもよく；あるいは生 物学的に不活性でも活性でもよい。

カルボン酸を含有する側鎖基の導入のために選択される合成経路は、ｐ−ヒドロ キシ安息香酸エチルのナトリウム塩とポリ（ジクロロホスファゼン）すなわち（ ＮＰＣｌ２）、との反応と、それに続くエステル官能基のカルボン酸への加水分 解とが包含される。より高分子量のポリマーのモデルとして、ホスファゼン環状 トリマー、（ＮＰＣｌ２）２３を使用する、予備研究を行った。

支１旦里豆 装ｊＬユ３ＩＰ　ＮＭＲスペクトルを、ＪＥＯＬ　ＦＸ９０Ｑ　ＮＭＲ分光計を 用いて、フーリエ変換モードで測定した。’ＨＮＭＲスペクトルは、同じ分光計 を９０ＭＨｚで操作測定した。赤外スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　 ５８０分光計を用いて記録した。ゲルノ（−ミエーションクロマトグラフィーは 、）ＩＰ１０３７Ａ屈折率検出器、ＨＰ３３２９ＡインチグレーターおよびＨＰ ９１２１ディスクドライブを有する、ヒューレノトパッカード製ＨＰ１０９Ｇ液 体クロマトグラフを用いて行った。このシステムは、ヒユーレットパラカード製 ＨＰ８３Ｂコンピユータによって制御した。結晶度のチェックには偏光光学顕微 鏡を用いた。ガラス転移温度（Ｔ、）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＤＳＣ７ をＰＥ７ＳＯＯコンピユータと共に用いて記録した。

［テトラヒドロフラン（ＶＷＲ）　、ジオキサン（ＶＷＲ）およびジエチルエー テル（ＶＷＲ）を、窒素雰囲気下で、ナトリウムベンゾフェノンケチルから新た に蒸留した。ヘキサクロロシクロトリホスファゼン（＋ｐ　１１０−１１３℃） をテトラマーとトリマーの混合物（Ｅｔｈｙｌ　Ｃｏｒｐ、）から得た。これは ６０℃７０．５Ｔｏｒｒでの２回の真空昇華分画によって精製し、ヘキサンから ２回再結晶し、さらに２回の真空昇華を行った。ポリ（ジクロロホスファゼン） を、ヘキサクロロシクロトリホスファゼンの２５０℃での熱開環重合によって調 製した。この反応は、Ａ１１ｃｏｃｋら、Ｊ、Ｔ　ｏ　、　Ｃｈｅｎ、　５．１ ７０９　（１９６６）に記載されている。ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル（Ａｌ ｄｒｉｃｈ）は、塩化メチレンおよびヘキサンからの再結晶化によって精製され た。トリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｎ−ブチルアミン（Ｓｉｇｍａ ）を、水酸化カルシウムの存在下で真空蒸留によって精製し、蒸留されたアミン は使用前にモレキュラーシーブでを入れて保存した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキ シド（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ｐ−トルエンスルホン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、塩 酸（Ｆｉｓｈｅｒ）と、ジメチ・ルスルホキシド（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、塩化カ ルシウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、塩化銅（Ａｌｄｒｉｅｈ）と、臭化銅（Ｓｉｇ ＋＋ａ）と、酢酸アルミニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）とは、入手したままの状態で 用いた。

化”　４ａ（７）−ＪＬエナトリウムの粒子（１，９９ｇ、　０．０８４＋＋ｏ ｌ）を１５０■Ｌの乾燥ジオキサンに加えた。この懸濁液に、ｐ−ヒドロキシ安 息香酸エチル（１８，７ｇ、　０．１１２ｍｏｌ）の乾燥ジオキサン（３ｈＬ） 溶液を加え、この混合液を還流しながら１０時間撹拌した。このナトリウム塩溶 液に、化合物３ａ　（２，５ｇｓ　７．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、続いて 、完全な置換を助けるために臭化テトラ−ｎ−ブチル−アンモニウム（０，４ｇ ）を加えた。この反応混合物を還流しながら７２時間撹拌した。この溶液の”Ｐ 　ＮＭＲスペクトルは、＋７．７ｐｐｍｉこシングレットを示した。この溶液を 、１インチのシリカゲル層を通して濾過し、蒸発によって溶媒を除去した。この 化合物を、塩化メチレンとＴｔ（Ｆとの混合物（９：１）を溶離液としてカラム クロマトグラフィーによって精製した。真空中で乾燥させた後、ｍｐ　７Ｂ−８ ０℃の明るい黄色の固体（４ａ）　（８２％）を得た。

”　５ａＯＩ玉、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４，４３ｇ、　０．０４３ｍ ｏｌ）を１００ｍＬの乾燥エーテル中に懸濁させた。この混合物を０℃まで冷却 し、０．２ｍＬ　（０，ｌｌｍｏｌ）の水をシリンジを通して加えた。０°Ｃで ５分間撹拌した後、化合物４ａ　（０，５ｇ、　０１４４＋＋＋。

ｏｌ）を加えた。水浴を除去し、混合物を室温で反応させた。

薄層クロマトグラフィー試験によって、２０時間後には出発化合物が完全に消滅 したことが示された。大過剰の氷水を加え、水層を分離した。分離された水溶液 を塩酸で酸性にした。エーテル抽出を３回行った後、蒸発によって水を除去し、 最終生成物を、真空中で一晩乾燥させた。白色の固体（５ａ）が得られた（収率 ６２％）。この化合物は２７５℃以下では融解しなかった。

ム　６ａの　塩化チオニル（１０ｍＬ）を化合物５ａ　（２２ｍｇ。

Ｇ、Ｚｌｍｗｉｏｌ）に加えた。この混合物を加熱還流し、１時間後に粉末は完 全に溶解した。さらに１時間後、溶液を冷却し、過剰の塩化チオニルを真空乾燥 によって除去した。乾燥ＴＨＦに溶解した生成物を、窒素雰囲気下で濾過し、真 空中で一晩乾燥させた。

化１１拠ユ鼾２選１ムユ化合物６ａ　（ｌｏｈｇ、０．　ｉｎ＋ａ＋ｏｌ）を乾 燥ＴＩ（Ｆ　（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、過剰のｎ−ブチルアミン（ ５ｍＬ、　０．０６８ｍｏｌ）、続いて、トリエチルアミン（１＋ｓＬ）を塩酸 受容体として加えた。この混合物を室温で２４時間撹拌した。

残留アミンを真空下でエバポレーション除去り、、＋ｍｐＬ９４−１９７℃の７ ａを得た。

ポｉマー４ｂの　ポリ（ジクロロホスファゼン）　（３ｂ）この溶液を、ｐ−ヒ ドロキシ安息香酸エチル（２９，８ｇ、　０．１７９４＋ａｏｌ）のナトリウム 塩にゆっくりと加えた。臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（０，５ｇ）を相 転移触媒として加えた。この反応混合物を還流で４８時間撹拌した。３１ＰＮＭ Ｒスペクトルは、−２０，３ｐｐｍにシングレットを有していた。この溶液を冷 却・し、ポリマーを水中に析出させて単離した。このポリマーをさらにＴＨＦか ら、水中（３回）およびヘキサン中（２回）に再析出させて精製した。収率は８ ５％であった。

ポ１７−５ｂの−ポリマー４ｂ（０，５ｇ、　１．３３ｍｍｏｌ）を乾燥Ｔ　Ｈ Ｆ　（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、乾燥ＴＨＦ（Ｌｏｏｍし）中のカリ ウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４ｇ、　０．０４ｍｏｌ）と０．２ｍＬ（０、Ｏｌ ｌｍｏｌ）の水との混合物にゆっくりと加えた。最初の５分間、混合物を０℃に 冷却し、そして、室温で４０時間撹拌した。大過剰の氷水（３（ｌｏｍＬ）を加 え、蒸発によって溶液を濃縮した。

この溶液を、セルロースチューブを通して脱イオン水で透析した。７２時間の透 析の後、溶液を塩酸で酸性にしてポリマーを単離した。遠心分離および真空乾燥 の後、ベージュ色のポリマーを得た（収率８５％）。

まとめると、環状トリマーのレベルで、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン３ ａをｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルのナトリウム塩と反応させて、エステル型ア リールオキシホスファゼン４ａを形成した。この化合物の構造は、元素分析およ びＮＭＲ分光計並びに赤外分光計によって確認した。たとえば、”Ｐ　ＮＭＲス ペクトルは、＋７．７ｐｐｍにシングレットを示し、ＨＮＭＲスペクトルは、＋ ７．１から十ａ、　ｏｐｐｌ（芳香族プロトン）でのダブレット２つ、＋４．３ ｐｐｍ　（メチレンプロトン）でのカルチット、および＋１．４ｐｐｍ（メチル プロトン）でのトリブレットからなる。赤外スペクトルは、１７１０ｃｍ−１に Ｃ；＋０の伸縮を、１２５０ｃｍ−’にＰ＝＝Ｎ／Ｐ−−０が組み合わされたバ ンドを有していた。

４ａのカルボン酸への加水分解は、塩酸のテトラヒドロフラン溶液またはＩ）− トルエン−スルホン酸による酸性加水分解、あるいは水酸化ナトリウムによる塩 基性加水分解を含む、様々な方法で試みられた。これらの試みでは、骨格を分解 することなくヘキサカルボン酸誘導体を得ることはできなかった。

しかし、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを用いることによって、４ａから５３へ の完全な加水分解が行われた。５ａの構造は、元素分析、ＮＭＲおよび赤外手法 、ならびにカルボン酸単位の誘導体化によって証明された。

化合物５ａを塩化チオニルで処理して、酸塩化物（６ａ）を形成し、これをトリ エチルアミンの存在下でｎ−ブチルアミンと反応させて、ｎ−ブチルアミド誘導 体７ａを得た。この化合物の構造の証明は、以下のデータに基づいたものである 。まず、４ａを５ａおよび６ａへ変換すると、赤外線ＯＨ伸縮のバンドは消失す るが、１２５０ｃｍ−’でのＰ＝＝Ｎ／Ｐ−−０骨格のノぐンドは維持される。

塩化メチレン中の７ａの”Ｐ　ＮＭＲスペクトルは、＋９．４５ｐｐｍにシング レットを有していた。’ＨＮＭＲスペクトルは、２つのダブレットを＋７．０か ら＋８．４５ｐｐｍ　（芳香族プロトン）に、カルチットを＋３．３１）Ｉ）■ （ＮＨ−ＣＨ２）に、マルチブレットを＋１．３から＋１．８１）［）ＩＩ　（ ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）に、トリブレットを＋０、９ｐｐｍ　（ＣＨ３ ）に有していた。このような側鎖基変換を通じてホスファゼン環が維持されるこ とは、より高い分子量のポリマーレベルにおいて同一の反応が可能であるという ことのよ・い証拠である。

ポリ（ジクロロホスファゼン）　（３ｂ）を、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルの ナトリウム塩と反応させて、　（アリールオキシ）ホスファゼンエステル４ｂを 形成する。ポリマー４ｂは、ガラス転位温度が＋７．５℃で、Ｔ、が１２７．４ °Ｃの、微細結晶で柔軟なフィルム形成物質である。４ｂの分子量は、ゲルノイ ーミエーションクロマトグラフイーによって３　Ｘ　１０’の範囲であると推定 された。固体特性および外見では、ポリマー４ｂはポリ（ジフェノキシホスファ ゼン）　［ＮＰ（ＯＣ６Ｈ５）２１ｎに類似してり、Ｎる。

４ｂのカルボン酸誘導体５ｂへの加水分解は、環状トリマーについて確立された ものに類似の反応条件を用いて、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドによって行われ た。酸性または中性の水性溶媒には不溶であるが水性塩基には可溶である、白色 粉末として、ポリマー５ｂを単離した。ポリマー４ｂおよび５ｂの構造は、微量 分析、３１ＰＮＭＲＮ　および赤外データの組み合せから推測された。たとえば 、加水分解後、５ｂの”Ｐ　ＮＭＲスペクトルは完全なシングレットを−１９， ４ｐｐ謹に有していた。５ｂの１ＨＮＭＲスペクトルは、４．３ｐｐｍのカルチ ットと、１−４１）Ｉ）ＩＩ　（Ｃ２Ｈ５基）でのトリプレットが消滅したが、 ６．８−７．７ｐｐｍの芳香族プロトンのスペクトルは残った。エステル（４ｂ ）のカルボン酸（５ｂ）への変換によって％　Ｔ９が−４，７℃にわずかに下が った。

実施例２：放射および共有結合を用いたポリマーの架橋従来では、化学的にある いは放射によって、ポリマーを架橋していた。酸性側鎖基を有するポリホスフア ゼンを用いた方法およびそれによって得られる結果は、Ａ１１ｃｏｅｋら、ｙａ ｃｒ。

賎ムμｔｉｅｓ　（１９８９）によって以下のように報告されている。これらの 架橋方法は、本発明の方法においては有用ではないが、本明細書に記載の方法と 従来方法との差異を明示するために、ここで説明する。

腹肚拉主玉ｌ膚 以前に研究されていた、ホスファゼン環にメチルアミノ（Ａｌｌｅｏｃｋら、Ｍ ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２１．１９８０　（１９８Ｂ＞）　；　メトキシ エトキシエトキシ（Ａｌｌｅｏｃｋら、旺組１肛口ｎ（１９９０））あるいは保 護されたグリセリル（■肛姐吐匹ｕｌｅｓ　（１９８８））の側鎖基が付与され た、水溶性ポリマーとは異なり、ポリマー５ｂはガンマ線放射に晒しても架橋し なかった。この差異は、最初の３個のポリマーにおいては脂肪族炭素−水素結合 があるのに対し、５ｂにおいてはそれが存在しないためである。ジアミンまたは グリセロールなど三官能または三官能試薬によるカルボン酸基の化学的縮合によ って５ｂを架橋しよう試みられたが、実験上の困難のため果たせなかった。ジア ミンで処理した後の、共有結合で架橋した系を単離する時の困難さは、適切な溶 媒の選択肢が限定されており、ジメチルスルホキシドなどの溶媒においては、塩 形成が共有結合に優先するという事実による。ジクロロへキシルカルボジイミド の存在下での、ジオールまたはトリオールとの縮合架橋は、反応物に微量の水が 常に存在するため、行いにくい。

実施例３：ヒドロゲルを形成するためのポリマーのイオン架橋 二価または三価のイオンによる、酸性側鎖基を有するポリホスファゼンの架橋は 、Ａ１１ｃｏｃｋら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　（１９８９）に記載され ており、この教示は本明細書に援用される。

ポリ？−５ｂ　（２０＋ａｇ、　０．０６３ｍｍｏｌ）を、０．２１１Ｌの炭酸 ナトリウム溶液（６ｍｇ）に溶解した。別々のポリマー溶液に、様々な濃度の４ つの異なる金属塩（ＣａＣ１２、ＣＬＩＣＬ２、ＣｕＢｒ２および酢酸アルミニ ウム）の水溶液（０，ＱＯ６−０，０９Ｉ１ｗｌｏｌ）を加えた。これらの溶液 を１分間撹拌して、架橋ゲルを生成した。可溶部分を集めて、塩酸で酸性とする ことによって析出させた。そして、架橋していないポリマーを、遠心分離し、洗 浄し、真空中で乾燥させて単離した。架橋部分の重量は、未反応ポリマーの重量 から算定した。十分に膨潤したゲルの重量を計測し、その後真空中で３６時間乾 燥させ、そして乾燥したゲルの重量を再度測定することによって、ゲルの水膨潤 度を計算した。

ポリマー５ｂは、カルシウム、銅、またはアルミニウムなどの二価または三価の カチオンの塩で処理すると、水性媒体中で容易に架橋する、ということがわかっ た。形成される、水で膨潤した架橋ポリマーの量は、塩化カルシウム、塩化銅、 硫酸銅、または酢酸アルミニウムの濃度が上がるにつれて増加した。アルミニウ ムイオンが非常に有効であることは、その三価であるという特性による。このよ うな研究におｔ）で、Ｃｕ”はＣａ”よりも有用な架橋剤であると思われたが、 これ＋１、おそらく、銅イオンがＣａ”イオンよりも八面体配位にとっては好ま しいため、あるいはＣｕ２“は半径が小さいためにルイス酸性度が大きいためで ある。その結果、この架橋工程は、鏡開の「塩架橋（ｓａｌｔ　ｂｒｉｄｇｅｓ ）Ｊという点で理解し得る。

この工程で形成されるヒドロゲルおよび膜は、柔らかく、高度に膨潤した物質で ある。アルミニウムイオンで架橋した例では、ポリマー１ｇにつき９．５ｇの水 を含有していること力（わかった。

この架橋工程は、ポリマー５ｂの固体フィルムを、たとえｉｆ硫酸銅などの水溶 液に浸漬することによって行い得た。このポリマーフィルムは、溶解するかわり に、水がマトリ・ノクスに浸透するにつれて膨潤したが、このＷ潤はポリマーへ の銅イオンの拡散によって制限されていた。ポリマー５ｂ　（１００ｍｇ、０、 ３１＋ｕ＋ｏｌ）をジメチルスルホキシド（５ｍＬ）に溶解した。均一で薄いフ ィルムを形成するために、乾燥キャストチャンバーにおいて蒸発によってゆっ（ りと溶媒を除去した。そして、乾燥したポリマーを、硫酸銅（５ｇ）の水１００ ａＬの溶液に浸漬し、この架橋工程で可能な最大にまで膨潤させた。このフィル ムを硫酸銅溶液から除去し、真空中で一晩乾燥させた。

２つの工程によって形成されるイオン架橋したゲルは、酸性および中性の媒体に おいて安定であった。しかし、１価のカチオンの塩基性溶液で処理すると、イオ ン架橋は開裂し、ポリマーは分解した。これは、Ｃａ２’またはＣｕ”イオンに よって架橋された系ではｐＨ７，５で起こったが、ＡＩ”架橋系ではポリマーが 分解するまでに、ｐＨ９を越える塩基強度が必要であった。

Ｃａ”とＣｕ”とＡＩ”とによる架橋ポリマーを、ｐＨ７，５で過剰の塩化カリ ウム水溶液で処理すると、イオン架橋は開裂した。

（上ンＴ−４に白　） 実施例４：細胞またはタンパクを組み込んだ高分子ハイドロゲル微粒子 ここに記載した方法の好ましい実施態様で、生物学的物質を組み込んだカチオン 架橋ポリホスファゼンハイドロゲル微粒子を調製した。これらを次にポリ（Ｌ− リシン）で処理し、半透性表面膜を持つマイクロカプセルを形成した。

図１に示すように、ポリ［ビス（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］ 　（ＰＣｐｐ）４を、まずヘキサクロロシクロトリホスファゼン１の熱バルク重 合によりポリ（ジクロロホスファゼン）２を合成することにより調製した。次に ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルと２を反応し、ポリ（アリールオキシ）ホスフ ァゼンエステル３を形成することにより・塩素原子をカルボキシレートエステル 含有側鎖で置換し、続いてエステル基を加水分解してカルボキシル酸４にした。

はじめに記載したポリホスファゼンのエチルエステルを用いることもできるが、 ポリホスファゼンのプロピルエステルの方がより速やかに加水分解してカルボキ シル酸になりやすいのでより好ましい。

ＰＣＰＰは酸性または中性溶媒には不溶であるが、塩基性溶媒、たとえば炭酸ナ トリウムには可溶であった。１０％（マ／Ｖ）のＰＣＰＰが３０　ｍｇ／ｍｌの 炭酸ナトリウムに溶解するとポリマーが脱プロトン化して溶液のｐＨが７．　５ −７．　８に減少し、おだやかなカプセル化を可能にする。Ｃａ２４をＰＣＰＰ に加えると速やかにゲル化する。

微粒子はＰＣＰＰ水溶液（２６５％ｖ／ｖ）とＦＩＴＣ−ＢＳＡ　（２０ａ＋ｇ ；　Ｓｉｇｍａ）か、β−ｇａ　１　（１ｍｇ：　Ｓｉｇｍａ　＃Ｇ−５６３５ ）かまたはハイブリドーマ細胞（５Ｘ１０ｓ　ｃｅｌｌ　ｓ；　ＡＴＣＣＨｅ　 １２３）を、７．５％ｗ／ｖ　ＣａＣ１２中に液滴形成装置を用いて噴霧して調 製する。エアが５Ｌ／時でその中を流れるような管の内部に位置した２０Ｇの注 射針を通して懸濁液を押・し出す（７０＋ｍｌ／時）。注射針チップに形成した 液滴は、同軸のエア流により強制的に取り除かれ、７．５％（ｖ／ｖ）ＣａＣ１ ２中に集められ、そこで３０分間架橋され硬化される。生成した微粒子の形状と 大きさはポリマーとカルシウムイオンの濃度、ポリマー押し出し速度、エア流、 注射針直径に依存する。

実施例５：肝細胞を蒔いた架橋ポリホスファゼンフィル細胞毒性を試験するため に、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）系雄うッ　ト　（Ｓｅｌｇｅｎ、Ｐ、Ｏ，Ｉ ｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｉｏ　、Ｐｒｅｓｃ。

ｔｔ、Ｅ、編、　ｐ、１３　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　１９７ ６））の肝細胞を分離し、ＰＬＬで被覆したＣａ−ＰＣＰＰフィルムに蒔いた。

フィルムは、２．５％（ｗ／Ｖ）　Ｐ　ＣＰ　Ｐの１ｍｌを３５ｍｍの細菌学用 コアルコンペトリ皿上に広げ、３１１１の１０％（ｗ／ｖ）　（Ｂ　Ｃ１２で覆 い、１５分間硬化し、液を捨て、３ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）　Ｐ　Ｌ　Ｌ　 （ＭＷ、　２１．５　Ｋｄ）で１５分間被覆し、バッファーで３回洗浄（全１５ ０＋ｅｌ）Ｌ、Ｕ、Ｖ、光線下で一夜滅菌してＲＨした。フィルムに、ディツシ ュ一枚あたり２．５Ｘ１０６の肝細胞を蒔いた。

蒔いてから１時間後には、培地を洗浄しても細胞は取り除かれず、細胞はフィル ムに付着していた。顕微鏡検査と生存率アッセイ（トリパンブルー色素排除およ びテトラゾリウム塩アッセイ、Ｍｏｓ＋ｎａｎｎ、　Ｔ、　Ｊ、、１ｍｍｕｎｏ １．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５．５５　（１９８３））で生存細胞が明らかになっ た。５日後も、生存細胞がフィルム上に観察された。この結果から、架橋ポリマ ーは細胞に無毒でかつ細胞の成長や増殖を助けることがわかる。

実施例６：捕捉タンパクを含有する架橋ポリホスファゼン微粒子 Ｃａ−ＰＣＰＰマトリックスは、フルオレセンインチオシアネートでラベルした それぞれのＭＷが６８Ｋｄおよび５４０Ｋｄのウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ− ＢＳＡ）とβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａ　Ｉ）を効率的に捕捉し；ＦＩＴＣ −ＢＳＡとβ−ｇａｌのそれぞれ６０％および８０％をＣａ−ＰＣＰＰ粒子中に 回収した。この工程はβ−ｇａｌ活性の高い保持を可能にしたが、それはβ−ｇ ａｌの水溶液の活性に相当する。

Ｃａ−ＰＣＰＰ粒子は凝集してガラスに接着するがこのことは表面荷電効果を示 唆する。電荷（たとえばカルボキシル基）を中和するために、微粒子を正に荷電 したポリイオンである（Ｌ−リジン’）（ＰＬＬ）と反応させる。ビーズを３０ 分間硬化し、３０ｍ１の０．２５％（ｗ／ｖ）　Ｐ　Ｌ　Ｌ　（ＭＷ　２１．５ 　Ｋｄ；　ｓｔｇ■ａ）で３０分間被覆した。このことは凝集を減少するばかり ではなく、Ｆ　ＩＴＣ−ＢＳＡ　（２０％）とβ−ｇａｌ（８０％で）の放出率 を、図２に示すように維持した。放出の検討は、３７°Ｃで、０．０１％硫酸ゲ ンタマイシンを防腐剤として加えた１０ｓｌのｐＨ７，４リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）の入ったバイアル中で静かにかきまぜながら行った。ＦＩＴＣ−ＢＳ Ａおよびβ−ｇａｌの放出はそれぞれ４９５ｎｍの吸収とＢＣＡプロティンアッ セイ（Ｐｉｅｒｃｅ　＃２３２３５）で追跡した。カプセル化β−ｇａｌ酵素の 活性を溶液中での活性と比較し、図３に示す。結果は酵素活性が同等であること を表す。

実施例７：　リポソームを含有する架橋ポリホスファゼン微粒子 ＦＩＴＣ−ＢＳＡの放出は、まずリポソーム中にＦＩＴＣ−ＢＳＡをカプセル化 し、ついでＰＣＰＰ−ＰＬＬに取り込んでマイクロカプセル化リポソーム（ＭＥ ＬＳ）を生成することによりさらに長く持続した。水素化ホスファチジルコリン （Ｐ　Ｐ　Ｃ）　（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｓ）およびコレステロー ル（ＣＨ）　（Ｓｉｇｍａ）のモル比ｌ：１からなるリポソームを、逆相蒸発（ ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により　５ｚｏｋａお よびｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓが述べたようにして調製した；　ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５．４１９４　（１９７８）。ＭＥＬｓを調製するには、 １ｍｌの（Ｆ　Ｉ　ＴＣ−ＢＳＡ）含有リポソーム（６６−６８μＭ脂質）を１ ｍｌの５％（Ｗ／Ｖ）　ｐ　ｃ　Ｐ　Ｐと混合し、混合物をＣａＣｌ２溶液中に 液滴形成装置を用いて噴霧して微小液滴に調製する。

リポソーム封入はイオン架橋を妨げず、２１．５ＫｄＰＬして被覆すればＣａ− ＰＣＰＰはそれらを５０日以上保存した。Ｆ　Ｉ　ＴＣ−ＢＳＡの放出は、図３ に示すように著しく減少し、それは同じ脂質組成のカプセル未封入リポソームの 場合と同様であった。脂質二重層はＭＥＬｓに対する律速因子であると推定され る。

実施例８：ハイブリドーマを含有する架橋ポリホスファゼン微粒子 細ＪＬＦ−エ ２株のマウスハイブリドーマ細胞、ヒトフィブロネクチンに対するモノクローナ ル抗体（ＩｇＧ＋）を産生すルＨＦＮ　７゜１　（ＡＴＣＣＣＲＬ）およびイン シュリンに結合するモノクローナル抗体（ＩｇＧ　＋　ｋ　）を分泌するＣＣ９ Ｃ１０（ＡＴＣＣＨＢ　１２３）を用いた。連続的に増殖したノーイプリドーマ 細胞の保存培養物は、１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇ＋ａａ、　Ｃ。

０．）および１００　ｕｎｉｔｓ／■ｌのペニシリン−ストレプトマイシンＧｌ ｂｃｏ、　ＮＹ）を補った９０％のＤｕｌｂｅｃｃｏ改質Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭ ＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、　ＮＹ）で維持した。

ポ１７−゛の ポリ［ビス（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）は上述 のように合成した。ＰＣＰＰを炭酸ナトリウム（３０■ｇ／ｌ）に溶解して最終 ポリマー濃度を１０％（Ｗ／ｖ）とした。ポリマーの脱プロトンにより溶液のｐ Ｈが７゜５−７．８に減少し、このｐＨ条件をマイクロカプセル化の開用いた。

のマイクロカプセル 約Ｉ　Ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで生存率９０％　（トリパンブルー排除法に より測定）を含有した培養培地３１を、遠心分離（３０００ｒｐｉ＋Ｘ　５分） してベレット化した。細胞ペレットを１ｍｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　 Ｂ　Ｓ　）　（Ｇｉｂｃｏ、　ＮＹ）に再懸濁し、１ｍｌの５％（ｖ／ｖ）　Ｐ 　ＣＰ　Ｐと混合した。この細胞／ＰＣＰＰ懸濁液を、２２Ｇの注射針を有する エアジェツト−ヘッド液滴発生器を用いて噴霧し、微小液滴とした。この液体の 小滴を７．５％（ｖ／ｖ）Ｃａ　Ｃ１２か、または５％（ｖ／ｖ）Ａ　Ｉ　（Ａ ｃ）３の滅菌溶液中に集め、そこでカチオンにより架橋し、ゲル化した。ゲルビ ーズを１５分間硬化させた後、新鮮な５％（Ｖ／Ｖ）の架橋他剤溶液で洗浄した 。生じたゲルビーズから液“　を排出し、３０ｍ１のｏ、ｉ％（ｖ／ｖ）ポリ（ Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏ、）含有生理食塩水と、静かに攪拌 しながら２０分間接触させて被覆した。未反応のＰＬＬは３０ａ＋ｌのＰＢＳで 洗浄して除去した。いくつかの場合には、ＰＬＬ被覆後、滅菌したｐＨ８の等張 ＫＣｌ３０ｍ１に３０分間さらすことにより微粒子の内部を液化させた。生じた マイクロカプセルはＫＣＩを希釈するためＰＢＳで３回（全量９ｏ１）洗浄した 。

すべての試薬は分析用の等級を用いた。

Ｃａ−ＰＣＰＰゲルビーズの形状と大きさは、ＰＣＰＰおよびＣａ”の初期濃度 、およびマイクロカプセル化工程で用いたエア流や注射針直径のような因子に依 存した。２．５％（ｗ／ｖ）のＰＣＰＰ濃度において、エア流５１／分で２２Ｇ の注射針を用いるとき、カプセルは球状で直径は０．　９ｍｍの範囲にあった。

ハイブリドーマ細胞のマイクロカプセル化は架橋ハイドロゲルマトリックス生成 を妨げなかった。しかしながら、ポリマーのゲル化が培養培地の存在下で行われ るときは、架橋は不完全で破損したカプセルを生じる。これはポリマーの架橋が 血清タンパクによって妨げられることによるものと思われる。これらの障害はリ ン酸緩衝生理食塩水中で１１イブリドーマ細胞をカプセル化することにより避け られた。

他の検討はＣａ−ＰＣＰＰゲルビーズがＰＢＳ中に置かれると時間と共に崩壊す ることを示した。この問題は細胞がポリ（Ｌ−リシン）で被覆されて特徴的な形 状を持つと発現しなかった。また、Ｃａ−ＰＣＰＰマイクロカプセルを培地とと もにインキュベートし、血清タンパクが補足されるとそれらの形状と大きさを獲 得することも、わかった。おそらくは、金属カチオンと血清タンパクが連続的に 存在するとポリアニオンポリマーと相互作用することができ、ポリマーが架橋型 を維持するのを助けるものと思われる。

培養物は８ｍｌのＤＭＥＭ中で５％ＣＯＰ下３７℃でインキュベートした。細胞 には毎２日ごとに、マイクロカプセルを２．３分安定させてから、消費した培地 を吸引し、当量の新鮮な培地を追加して生育させる。ゲルビーズの大きさの検定 はグラティキュールレンズ（Ｎｌｋｏｎ　ＴＭＳ）を装備した位相差顕微鏡試験 により行われた。

細１１支検】ムエ ト１パンブルーによる： ビーズの一部を培養物から取り出して、ゲルビーズをフラスコ底に静置した後上 澄を捨てた。ビーズは２＋ａＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢ Ｓと１０分間インキコベートした。このキレート剤はポリマーマトリックスの内 部を溶かすのでビーズはＰＣＰＰ−ＰＬＬ外層を通して透けて見えるようになる 。ビーズを洗浄して金属と結合したＥＤＴＡおよびＥＤＴＡを取り除き、１００ ｍ１の０．２％　トリパンブルー色素（Ｇｉｂｃｏ、　ＮＹ）を加えた。生存細 胞数は血球計数装置で直接計数して検定した。

Ｌ　Ｄ　Ｈ７−一竺イＥ　、ｋ　６　：乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を Ｓ　ｉ　ｇｍａ社のキ・　ット（ＬＤＨ／ＬＤ　Ｎ００ＤＧ１３４０−Ｕｖ）で 検定した。ＬＤＨ活性は細胞生存数を測定するために、細胞数と同様にして用い ることができる。細胞数は界面活性剤（０，２％ｖ／ｖサポニン（Ｓｉｇｍａ、 　Ｃｏ、））含有ＰＢＳ　（溶血バッフ７−）で細胞を溶解した後の酵素活性を 測定することにより検定する。生存数百分率は細胞を界面活性剤で処理せずに細 胞外のＬＤＨを測定することにより検定した。標準検量線を保存細胞培養物の種 々の希釈液を用いて作成した。試料細胞に界面活性剤を加えて溶解し可溶のＬＤ Ｈを検定した。細胞数とＬＤＨ活性の間にはＯから８ｘ　１０５ｃｅｌｌ／＋１ の細胞濃度範囲で直線の相関関係が観察された。

Ｃａ−ＰＣＰＰマイクロカプセル中にカプセル化された細胞の数は以下のように して概算された二分取したビーズを集め・新鮮なＰＢＳで数回洗浄した。ビーズ を１１の溶血バ・ソファ−中で粉砕（乳ばちと乳棒を用いて）し、室温で３０分 間インキュベートして細胞を確実に溶解した。試料を遠心分離して細胞およびマ イクロカプセルの破片を取り除き、上澄を集めた。ＬＤＨ活性はピルベートを基 質として用いて３４０ｎ■で測定した。

励生定ｌ： 培養培地中のモノクローナル抗体濃度は標準抗体溶液に対してＥＬＩＳＡにより 測定した。Ｉ＋ｎ＋１ｕｌｏｎ　ＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、 Ｉｎｃ、、）を、インシユリンと３７℃かまたはヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇ ｍａ、　Ｃｏ、より購入した）と４℃で、３℃１ｇ・／ｗｅｌｌのタンパク濃度 で一夜被覆した。ウェルをウシ血清アルブミンで更に遮断し、余剰の未反応タン パクを洗浄して除去した。培養培地の系列希釈液を各ウェルに加え、プレートを ３７℃で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回すすい だ。アッセイをウサギ抗マウスＩｇＧ　（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｔｋａ）の ペルオキシダーゼ複合体を用いて分析した。

Ｅ　Ｌ　１．Ｓ　Ａプレートは４９０　ｒｖｉこ対して４０５ｎ＋＋で５ＬＴＥ 　Ａ　Ｒ４００Ｆ　Ｗ（ＳＬＴ　Ｌａｂ　Ｉｎ５ｔｒｕａ＋ｅｎｔｓ、　Ａｕ５ ｔｒｉａ）により読み取った。

カプセル内抗体濃度は次のように測定した：細胞と共に培養したビーズをＰＢＳ で数回洗浄し、ＰＢＳ中で粉砕し、遠沈して細胞およびカプセルの破片からタン パク生成物を分離した。集めた上澄の系列希釈液を上述のＥＬＩＳＡにより分析 した。抗体濃度をポリマーｍｌあたりのＩｇの単位で算出するには、ビーズの一 部をを取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ティッシュペーパーで液を吸い取って注意深 く乾燥した。ポリマーの容量は試料中ビーズ数にビーズ−個あたりの平均容量（ 顕微鏡で測定した半径から概算する）を乗じて算出した。

細胞のトリパンブルー染色、およびＬＤＨ活性の検討で、細胞の２５％以上が７ ０％以上の生存率でＣａＰＣＰＰゲル内にカプセル化されていることがわかった 。ゲルに捕捉されてすぐ、およびＣａ−ＰＣＰＰゲルビーズ内にカプセル化され てから１０日後のハイブリドーマ細胞の顕微鏡写真は、細胞がマイクロカプセル 全体に分散していることを示す。

Ｃａ−ＰＣＰＰゲルに捕捉されたハイブリドーマ細胞によるモノクローナル抗体 産生率は対照の懸濁培養物に等しかった。最大抗体濃度はカプセル化の１日後の ＣａＰＣＰＰゲルで捕捉された細胞の増殖培地中で測定された。生存数の検討は ７０％以上の細胞が生存することを示した。カプセル化１８日後、カプセル内の 抗体濃度を測定し、放出された抗体の７５％がビーズの内部に蓄積されることが わかった。

２１、　５−６４　ｋＤａの範囲のＭＷのＰＬＬによる被覆、および１５−３０ 分間の反応時間により、細胞の成長および増殖を阻害する膜が生成されることが わかった；カプセル化の４日後には、捕捉された細胞の９０％以上が死んでいた 。Ｃａ−ＰＣＰＰゲルビーズと分子量１０２ＫＤａのＰＬＬを反応時間２０分で 相互作用させ、細胞を成長および増殖させ得る膜を生成した。結果は図４（白丸 ）で表すように、カプセル化の３日後この膜の中で細胞密度が３倍増加していた 。

更に、１０２ｋＤａのＰＬＬで被覆した結果、マイクロカプセル内部の抗体が保 持された。マイクロカプセル調製１日後、増殖培地中で検出された抗体量は無視 できる程度であった。

２日目までには、培養培地中には抗体は検出されなくなった。

カフセル内抗体の測定でタンパクがゲルマイクロカプセル内部に蓄積されたこと がわかった。このように、ＰＣＰＰおよびＭｗが１０２ｋＤａのＰＬＬの膜は抗 体の濃縮液産生に有効である。

実施例９：細胞のカプセル化の際のポリマーゲル化条件の効果 実施例７に記載した方法による細胞カプセル化の百分率を増加させる努力におい て、種々のポリマーゲル化溶液を試みた：　ｐＨ７に調製した７、５％（ｖ／ｖ ）のＣａＣｌ２を含む二回蒸留（Ｄ、Ｄ、）水、ｐＨ４，５に調製した７、５％ （Ｗ／Ｖ）のＣａＣｌ２を含むり、Ｄ、　水、およびｐＨ４，５の５％（ｗ／ｖ ）ＡＩ（Ａｃ）３溶液。マイクロカプセル調製の他の条件はすべて一定に保たれ た。

細胞カプセル化の最高値は百分率で３１％で、Ａ　Ｉ　”、ｐＨ４，５のポリマ ーゲル化条件により達成した。　ｃ　ａ　２４□ｐＨ４，５では値はやや低く２ ５％であり、ポリマーがＣａ２ゝ′ｐＨ７，０でゲルされたときは、細胞のたっ た１０％しかＣａ−ＰＰマトリックス中に捕捉されなかった。ｐＨの低下（たと えば、より多くのプロトン）により残存の遊離の未架橋カルボキシル基がプロト ン化され、ポリマーのゲル化が高まった。

細胞産生力（すなわち、１０’　ｃｅｌｌｓ／日で産生ずるモノクローナル抗体 の量）は、ポリマーのゲル化条件により影響を受けた。この結果、カルシウムイ オンによるポリマーのゲル化は細胞産生力を変化させなかったが、アルミニウム イオンによるゲル化は細胞産生力を変化させることを証明した；細胞の抗体産生 の６０％以上がＡｌ−ＰＰゲル中に捕捉されることにより失われた。しかしなが ら、ＬＤＨアッセイおよびトリパンブルー色素排除による細胞生存率測定より、 ５０°％のハイブリドーマ細胞がまだ生存することがわかった。おそら（は、Ａ Ｉイオンが細胞の抗体産生能力に変化をもたらしたものと思われる。

実施例１０：細胞含有マイクロカプセルのハイドロゲル中心の液化の効果 細胞の成長、増殖および抗体産生における）〜イドロゲル内部の液化の効果を、 実施例８に述べたように、ＰＬＬ被覆したＣａ−ＰＣＰＰビーズを０．　９％　 （ｖ／ｖ）、ｐＨ８，０のＫＣ１溶液で処理して試験した。これらの条件下では 、Ｃａ−ＰＣＰＰ内部のゲルマトリックスは溶解し、外側のＰＣＰＰ−ＰＬＬ膜 は損なわれていない。この処理はカプセル化の損傷からのハイブリドーマ細胞の 速やかな回収を可能にした。さらにその上に、カプセル内部の細胞濃度は４つの 因子により増加した。期待したように、ＰＰ−ＰＬＬカプセル内部の細胞濃度の 増加は抗体産生力の随伴した増加をもたらした。

要約すれば、ＰＣＰＰ−ＰＬＬマトリックスは細胞生成物濃度を増加させるのに 有効な、従ってタンパク回収方法を補助する膜バイオリアクターを提供した。他 に、インシュリン依存性糖尿病治療において移植された場合の小島異種移植片に 対する免疫隔離薄膜としての使用が潜在的に可能である。

戊　１ ＦＩＧＵＲＥ　７ ＦＩＧＵＲＥ　２ 帳Ｉ…　（日） ＦＩＧＵＥＥ　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．架橋以前には水性溶媒に可溶性であり、そして反対の電荷の多価イオンとの 反応により架橋される荷電側鎖基を有する、イオン的に架橋し得る合成ポリマー から調製され、架橋後には水溶液に不溶性であるゲルを含むマイクロカプセル中 にカプセル化された、リポソーム、ウイルス、原核細胞および真核細胞からなる 群より選択される生物学的物質；および 該ゲルを、該多価イオンと同じ電荷の多価イオンと架橋することにより形成され た外膜； を含む、組成物。
2. ２．前記側鎖基が、酸性であり、そして前記イオンがカチオンである、請求項１ に記載の組成物。
3. ３．前記ポリマーが、ポリ（ホスファゼン類）、ポリ（アクリル酸類）、ポリ（ メタクリル酸類）、アクリル酸あるいはメタクリル酸とポリビニルエーテルある いはポリ（ビニル酢酸）とのコポリマー類、スルホン化ポリスチレンからなる群 より選択されるポリイオンであり、そして、該ポリマーが、水、アルコール水溶 液および緩衝塩水溶液からなる群より選択される水溶液に可溶性である、請求項 ２に記載の組成物。
4. ４．前記多価カチオンが、カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、スト ロンチウム、バリウム、スズ、および有機カチオンからなる群より選択される、 請求項２に記載の組成物。
5. ５．前記酸性側鎖が、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化アルコール基、 フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基からなる群より選択される部分を含む、 請求項２に記載の組成物。
6. ６．加水分解し得る側鎖基を有する、請求項１に記載の架橋されたポリマー。
7. ７．前記加水分解し得る側鎖基が、イミダゾール、アミノ酸エステル、グリセロ ールおよびグリコシルからなる群より選択される部分を含む、請求項５に記載の 架橋されたポリマー。
8. ８．前記組成物が、酸性側鎖基を有するポリマーを多価カチオンと反応させてゲ ルを形成し、そして次に、表面上の酸性基を多価ポリカチオンと複合させ半透膜 を形成することにより調製される、請求項２に記載の組成物。
9. ９．前記ポリカチオンが、ポリ（アミノ酸類）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ （ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリサッカライド類からなる群 より選択きれる、請求項７に記載の組成物。
10. １０．前記側鎖基が塩基性であり、前記イオンがアニオンである、請求項１に記 載の組成物。
11. １１．前記ポリマーが、ポリ（ビニルアミン類）、ポリ（ビニルピリジン）、ポ リ（ビニルイミダゾール）、イミノ置換ポリホスファゼン類、およびそのアンモ ニウムあるいは四級塩からなる群より選択されるポリイオンであり、そして該ポ リマーが、水、アルコール水溶液、および緩衝塩水溶液からなる群より選択され る水溶液に可溶性である、請求項９に記載の組成物。
12. １２．前記アニオンが、ジカルボン酸、硫酸イオンおよび炭酸イオンからなる群 より選択される、請求項９に記載の組成物。
13. １３．前記組成物が、塩基性基を有するポリマーを多価アニオンと反応させてゲ ルを形成し、そして次に、表面上の該塩基性基を多価ポリアニオンと複合させて 半透過膜を形成することにより調製される、請求項９に記載の組成物。
14. １４．前記ポリアニオンが、ポリ（アクリル酸類）、ポリ（メタクリル酸類）、 アクリル酸あるいはメタクリル酸のコポリマー類、スルホン化ポリ（スチレン） およびカルボン酸基を有するポリ（スチレン）からなる群より選択される、請求 項１２に記載の組成物。
15. １５．前記ゲルが、マイクロカプセルに形成される、請求項１に記載の組成物。
16. １６．架橋以前には水溶液に可溶性であり、そして反対の電荷の多価のイオンと の反応により架橋されてゲルを形成し、次に、ゲルの表面上の側鎖基を反対の電 荷の多価ポリイオンと反応させて半透過膜を形成する、荷電側鎖基を有する、イ オン的に架橋し得る合成ポリマーから調製される組成物。
17. １７．前記ゲルが、微粒子の形態である、請求項１５に記載の組成物。
18. １８．前記半透過膜が、マイクロカプセルを形成し、そして、前記ゲルが、多価 イオンの除去によりマイクロカプセル内で液化される、請求項１５に記載の組成 物。
19. １９．前記側鎖基が酸性であり、そして前記イオンがカチオンである、請求項１ ５に記載の組成物。
20. ２０．前記ポリマーが、ポリ（ホスファゼン類）、ポリ（アクリル酸類）、ポリ （メタクリル酸類）、アクリル酸あるいはメタクリル酸とポリビニルエーテルあ るいはポリ（ビニル酢酸）とのコポリマー類、スルホン化ポリスチレンからなる 群より選択されるポリイオンであり、そして該ポリマーが、水、アルコール水溶 液および緩衝塩水溶液からなる群より選択される水溶液に可溶性である、請求項 １８に記載の組成物。
21. ２１．前記多価カチオンが、カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ス トロンチウム、バリウム、スズ、および有機カチオンからなる群より選択される 、請求項１８に記載の組成物。
22. ２２．前記ポリカチオンが、ポリ（アミノ酸類）、ポリ（エチレンイミン）、ポ リ（ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリサッカライドからなる群 より選択される、請求項１８に記載の組成物。
23. ２３．前記側鎖基が塩基性であり、そして前記イオンがアニオンである、請求項 １５に記載の組成物。
24. ２４．前記ポリマーが、ポリ（ビニルアミン酸酸）、ポリ（ビニルピリジン）、 ポリ（ビニルイミダゾール）、イミノ置換ポリホスファゼン類、およびそのアン モニウムあるいは四級塩からなる群より選択されるポリイオンであり、そして該 ポリマーが、水、アルコール水溶液、および緩衝塩水溶液からなる群より選択さ れる水溶液に可溶性である、請求項２２に記載の組成物。
25. ２５．前記アニオンが、ジカルボン酸、硫酸イオンおよび炭酸イオンからなる群 より選択される、請求項２２に記載の組成物。
26. ２６．生物学的に活性な合成化合物、タンパク質、核酸、ポリサッカライド、脂 質、ウイルス、原核細胞、真核細胞およびリポソームからなる群より選択される 物質をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
27. ２７．架橋した合成ポリマー性物質を合成する方法であって； 水溶液に溶解性であり、そして荷電側鎖基を有するイオン的に架橋し得る合成ポ リマーを、多価イオンと反応させてゲルを形成する工程；そして、次に、 該ゲル表面上の荷電基を多価ポリイオンと複合させて半透膜を形成する工程； を包含する、方法。
28. ２８．前記荷電側鎖基が酸性であり、そして前記イオンがカチオンである、請求 項２６に記載の方法。
29. ２９．前記ポリマーが、ポリホスファゼン類、ポリアクリル酸類、ポリメタクリ ル酸類、アクリル酸とポリビニル酢酸とのコポリマー類、ポリビニルエーテル類 、ポリスルホン酸誘導体類およびスルホン酸化ポリスチレンからなる群より選択 されるポリイオンであり、そして、水、アルコール水溶液および緩衝塩水溶液か らなる群より選択される水溶液に可溶性である、請求項２７に記載の方法。
30. ３０．前記多価カチオンが、カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ス トロンチウム、バリウム、スズ、および有機カチオンからなる群より選択される 、請求項２７に記載の方法。
31. ３１．前記ポリカチオンが、ポリ（アミノ酸類）、ポリエチレンイミン、ポリ（ ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリサッカライド類からなる群よ り選択される、請求項２７に記載の方法。
32. ３２．前記酸性側鎖が、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化アルコール基 、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基からなる群より選択される部分を含む 、請求項２７に記載の方法。
33. ３３．前記組成物が、酸性側鎖基を有するポリホスファゼンを多価カチオンと反 応させてゲルを形成し、そして次に、表面上の該酸性基を多価ポリカチオンと複 合させて半透過膜を形成することにより調製される、請求項２７に記載の方法。
34. ３４．前記側鎖基が、塩基性であり、そして前記イオンがアニオンである、請求 項２６に記載の方法。
35. ３５．前記ポリマーが、ポリ（ビニルアミン類）、ポリ（ビニルピリジン）、ポ リ（ビニルイミダゾール）、イミノ置換ポリホスファゼン類、およびそのアンモ ニウムあるいは四級塩からなる群より選択されるポリイオンであり、そして該ポ リマーが、水、アルコール水溶液、および緩衝塩水溶液からなる群より選択され る水溶液に可溶性である、請求項３３に記載の方法。
36. ３６．前記アニオンが、ジカルボン酸、硫酸イオンおよび炭酸イオンからなる群 より選択される、請求項３３に記載の方法。
37. ３７．前記ポリアニオンが、ポリ（アクリル酸類）、ポリ（メタクリル酸類）、 アクリル酸あるいはメタクリル酸類のコポリマー類、スルホン化ポリ（スチレン ）およびカルボン酸基を有するポリ（スチレン）からなる群より選択される、請 求項３３に記載の方法。
38. ３８．前記ポリマーが、加水分解し得る側鎖基をさらに有する、請求項２６に記 載の方法。
39. ３９．前記加水分解し得る側鎖基が、イミダゾール、アミノ酸エステル、グリセ ロール、およびグリコシルからなる群より選択される部分を含む、請求項３３に 記載の方法。
40. ４０．生物学的に活性な合成化合物、タンパク質、核酸、ポリサッカライド、脂 質、ウイルス、原核細胞、真核細胞およびリポソームからなる群より選択される 生物学的物質をゲル内にカプセル化する工程をさらに包含する、請求項２６に記 載の方法。
41. ４１．前記ゲルを、微粒子の形状に形成する工程をさらに包含する、請求項２６ に記載の方法。
42. ４２．半透過膜の形成後に、前記ゲルを液化してマイクロカプセルを形成する工 程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
43. ４３．リポソーム、ウイルス、原核細胞および真核細胞からなる群より選択され る物質をカプセル化する方法であって、水溶性合成ポリマーの荷電側鎖基を多価 イオンと架橋することにより、該物質の周りにゲルを形成する工程を包含する、 方法。
44. ４４．前記側鎖基が酸性であり、そして前記イオンがカチオンである、請求項４ ２に記載の方法。
45. ４５．前記側鎖基が塩基性であり、そして前記イオンがカチオンである、請求項 ４２に記載の方法。
46. ４６．前記細胞が、抗体を発現するハイブリドーマである、請求項４２に記載の 方法。
47. ４７．前記細胞が、真核組織由来である、請求項４２に記載の方法。