JPH06506357A - トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の変異検出方法、および変異特性に対する作用剤または条件の試験方法 - Google Patents

トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の変異検出方法、および変異特性に対する作用剤または条件の試験方法

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JPH06506357A
JPH06506357A JP4508708A JP50870892A JPH06506357A JP H06506357 A JPH06506357 A JP H06506357A JP 4508708 A JP4508708 A JP 4508708A JP 50870892 A JP50870892 A JP 50870892A JP H06506357 A JPH06506357 A JP H06506357A
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ファイク、ヤン
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ミカエル・エヴァーハルドゥス・ティテュス・イグナティウス・ベーリグター
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、該プラスミドが大腸菌でのクローニングに適したプラスミドである請求項 １９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
２１、大腸菌でのクローニングに適した該プラスミドが選択マーカー遺伝子とし てアンピシリン耐性遺伝子を含む請求項２０に記載のトランスジェニック哺乳動 物細胞。
２２、該プラスミドを制限酵素を用いて線状化したのちに、挿入によってバクテ リオファージベクターに結合してバクテリオファージベクター成分として哺乳動 物中に導入する請求項１９〜２１のいずれかに記載のトランスジェニック哺乳動 物細胞。
２３、該プラスミドを挿入によってバクテリオファージスベクターに導入する請 求項２２に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
２４、バクテリオファージスベクターｇｔｌｏの特定のＥｃｏＲＩサイトでクロ ーニングされるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８である請求項２３に記載の トランスジェニック哺乳動物細胞。
２５、請求項１９〜２４のいずれかに記載のトランスジェニックげっ菌類、特に トランスジェニックマウスまたはラット。
２６、トランスジェニック哺乳動物細胞からＤＮＡを単離し、該単離したＤＮＡ をそのＤＮＡのプラスミドを切断しうる制限酵素で処理してフラグメントとし、 そのフラグメント化ＤＮＡを１ａｃＺオペレ一タ結合物質と結合させた固体粒子 と接触させ、１ａｃＺオペレ一タ結合物質とＩａｃＺオペレータとの間の相互作 用によってプラスミドＤＮＡが結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離し、該 固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離させ、該解離したプラスミドＤＮＡを環状 化し、得られたプラスミドで宿主制限陰性、１ａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性の 細菌宿主を形質転換し、次いで、形質転換細菌を、ＩａｃＺ遺伝子の変異に基づ いてβ−ガラクトシダーゼを有しない該細菌のみが生育するラクトース含有培地 にて培養することによって、マーカー遺伝子として機能する１ａｃＺ遺伝子にお ける変異を試穂し、続いて検出するための作用剤または条件下に請求項１２〜１ ８のいずれかに記載の１またはそれ以上のトランスジェニック哺乳動物をお（こ とによって、変異特性にたいする作用剤または条件を試験する方法。
２７、トランスジェニック哺乳動物細胞からＤＮＡを単離し、該単離したＤＮＡ をそのＤＮＡのプラスミドを切断しうる制限酵素で処理してフラグメントとし、 そのフラグメント化ＤＮＡを１　ａｃＺオペレータ結合物質と結合させた固体粒 子と接触させ、１ａｃＺオペレ一タ結合物質とＩａｃＺオペレータとの間の相互 作用によってプラスミドＤＮＡが結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離し、 該固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離させ、該解離したプラスミドＤＮＡを環 状化し、得られたプラスミドで宿主制限陰性、ＩａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性 の細菌宿主を形質転換し、次いで、形質転換細菌を、１ａｃＺ遺伝子の変異に基 づいてβ−ガラクトシダーゼを有しない該細菌のみが生育するラクトース含有培 地にて培養することによって、マーカー遺伝子として機能する１ａｃＺ遺伝子に おける変異を試験し、続いて検出するための作用剤または条件下に請求項１２〜 １８のいずれかに記載の１またはそれ以上のトランスジェニック哺乳動物細胞を お（ことによって、変異特性に対する作用剤または条件を試験する方法。
明細書 トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の変異検出 方法、および変異特性に対する作用剤または条件の試験方法本発明は、トランス ジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞からＤＮＡを単離し 、該単離したＤＮＡからベクターを回収し、該回収されたベクターで適当な細菌 宿主を形質転換し、次いで宿主におけるマーカー遺伝子の発現に基づいて、マー カー遺伝子に起こった変異を測定することを特徴とする、細菌クローニングベク ターに存在するマーカー遺伝子の１またはそれ以上の複製物を含むトランスジェ ニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞のＤＮＡにおける変異を 検出する方法に関する。
特に本発明は、ゲノムに組込まれており、染色体ＤＮＡの単離後、効率良く回収 しうるマーカー遺伝子を提供するトランスジェニック動物モデルに関する。該マ ーカー遺伝子を宿主制限不可能な細菌に導入した後、変異マーカー遺伝子の存在 に基づいて選択が行われ、変異頻度を決定する。
このような動物モデルは発ガン特性の試験剤にとって、特に重要である。すべて の新規化合物は、原則として発ガン性が疑われる。今日の状況においては、すべ ての細胞コアに存在する遺伝性物質の構造を変化させることができる。このよう な遺伝性物質の変化（変異）によつて、特にガンが起こり得る。変異剤（ＤＮＡ に変異を引き起こす作用剤）は発ガン性があることでも知られており、その上、 生殖細胞に変異を引き起こし、そのために遺伝性遺伝子異常が導かれる。作用剤 の変異原性は、ガンの症状あるいは遺伝性異常が現れる危険性の決定において、 最も重要な基準と考えられている。それゆえに、早い段階で作用剤の変異原性を 決定することが特に重要である。
現在までで最も優れた潜在的変異剤を試験するための公知方法は、細菌で変異を 検出するエームス試験（エームス（Ａｗｅｓ）　、１９７３年）である。この試 験は細菌の世代時間が短いために迅速に行うことができるが、エームス試験の予 測値は１００％ではないことが、さらなる調査で明らかにされている（ヘイ（Ｈ ａｙ）　。
したがって、一般的に、培養された哺乳類細胞を用いる試験（インビトロ）を含 む複数の試験の組み合わせによって、好ましい結果が得られる。
現在のところ、高等動物細胞におけるインビボの変異検出は僅か２．３の可能性 があるのみである。その一つの例が、）（ＰＲＴ試験であり、これは、ヒボキサ ンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子における変異を変 異細胞の６−チオグアニン耐性に基づいて検出するものである（アルベルチ一二 （Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ）　、１９８２年）。しかし、この方法は困難で、まだ分 裂が可能で、培養が単純な細胞での測定ができるだけである。さらに、この方法 の障害は、インビトロ状況という人工的な性状におけるもの、それゆえ、器官や 組織において誘発された変異およびその変異間の可能性のある相違点に関する結 論を引き出すのは難しい。長期間の研究で実験動物（特にげっ書類）を使用する という別法もある。動物に疑わしい作用剤を投与し、待機後、腫瘍が現れるかど うかを観察するのである。しかし、特に、疑わしい作用剤を低濃度で試験すると き、この方法は数年継続もの長時間を要する法であり、多数の動物が必要となる 。このことは試験を非常に費用のかかるものにし、そのため、エームス試験で陽 性である作用剤がしばしばそれ以上試験されず、したがって市販されなくなる。
良好な別法は、ファイグ（Ｖｔｊｇ）およびライツタ−リンデン（Ｕｉｔｔｅｒ ｌｉｎｄｅｎ）（１９８７年）、ローマン（Ｌｏｈｍａｎ）ら（１９８７年）お よびボッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）ら（１９８９年）ならびに欧州特許出願ＥＰ−Ａ −０３５３８１２に記載されているトランスジェニック動物の使用である。それ らに記載されているトランスジェニックマウスモデルは、変異標的遺伝子として 役立つ細菌１ａｃＺ遺伝子がクローンされるバクテリオファージスベクターを、 生殖細胞も含めた各体細胞に含有する。空のファージ粒子にベクターをインビト ロパッケージングすることによって効率的な方法で該ベクターを染色体ＤＮＡか ら回収できる。続いて、ベクター含有ファージを大腸菌Ｃ宿主細胞（これは宿主 制限陰性である）で平板培養すると、ここで変異１ａｃＺベクター（無色）と非 変異１ａｃＺベクター（青色）の間の選択が行われる。無色プラークの数と青色 プラークの数の比率は変異頻度を示す。この効率の良い方法により全染色体哺乳 類ＤＮＡからのマーカー遺伝子の解離（レスキュー）が初めて記載されたのは、 ボッセンおよびファイグ（１９８８年；欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２ も参照）である。
この方法を用いて、原則的には上述のトランスジェニック動物のどの組織や器官 の変異誘発をも研究することができる。しかし、この方法の欠点は、インビトロ パッケージングによるバクテリオファージスベクターの回収法が相対的に高価で あり、困難なことである。これは、回収されるべきベクターの性質ならびに変異 頻度、すなわち無色プラークの数と青色プラークの数の比率の決定の基盤をなす 原則による本質的な問題である。回収されねばならないバクテリオファージスベ クターの性質に関して、パッケージング抽出物の異なるバッチ間で大きな度合の 変動が存在するという具体例が示されている；これは各分離パッチを使用する前 に、まず有効性を決定しなければならないことを意味している。無色の変異プラ ークの数と青色の非変異プラークの数の比率に基づ（変異頻度の決定に関しては 、変異体ベクターが着色され、非変異体ベクターが無色である逆システムが推奨 されるべきであるといえる。種々の組織や器官における自然発生的変異頻度は、 どんな場合においてもｉ　：　１ｏｏｏｏｏのオーダーである。どの組織や器官 においても確実な変異頻度を得るためには、各器官や組織当たり少なくとも１０ ０万〜１５０万のプラークを本発明システムで分析しなければならない。このよ うな数のプラークの分析は、非常に困難であり、大量のパッケージング抽出物、 基質Ｘ−ｇａｌおよび分析に必要なペトリ皿を要求する。
本発明はこれらの欠点を解消する方法および動物モデルを提供する。
本発明は、第１に、トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳 動物細胞からＤＮＡを単離し、該単離したＤＮＡをそのＤＮＡのプラスミドを切 断しつる制限酵素で処理してフラグメントとし、そのフラグメント化ＤＮＡをＩ ａｃＺオペレータ結合物質と結合させた固体粒子と接触させ、ＩａｃＺオペレー タ結合物質と１ａｃＺオペレータとの間の相互作用によってプラスミドＤＮＡが 結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離し、該固体粒子からプラスミドＤＮＡ を解離させ、該解離したプラスミドＤＮＡを環状化し、得られたプラスミドで宿 主制限陰性、］ａｃＺ陰性およびｇａｌＥＭ性の細菌宿主を形質転換し、次いで 、形質転換細菌を、ＩａｃＺ遺伝子の変異に基づいてβ−ガラクトシダーゼを有 しない該細菌のみが生育するラクトース含有培地にて培養することを特徴とする 、トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の、マー カー遺伝子として１ａｃＺオペレ一タ配列を含む１ａｃＺ遺伝子を含有する線状 プラスミドの１またはそれ以上の複製物を含むＤＮＡにおける変異を検出する方 法を提供する。
ここで変異の検出が意味することは、どのようにおよびどれだけ頻繁に変異が起 こったかの立証である。トランスジェニック実験動物の場合、変異頻度はその実 験動物全体、あるいは特定の器官の細胞または特定の身体部分の細胞などの該実 験動物の細胞の限定されたコレクションと関連づけて考えることができる。
本発明では、プラスミドは大腸菌の形質転換に適したプラスミドであり、宿主制 限陰性、１ａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性大腸菌株を細菌宿主として使用するこ とが特に好ましい。しかし本発明は大腸菌の使用に限られるものではない。もし 適当なベクタープラスミドや宿主制限陰性菌株が入手できるなら、他のタイプの 細菌でも細菌宿主として適していると考えられる。
形質転換細菌と非形質転換Ｉ／ＥＷ１を分離するために、プラスミドは選択マー カー遺伝子を含有しなければならない。この目的のための多くのオプションが当 業者にとって公知である。通常、特定の抗生物質に対する耐性を有する形質転換 細菌を提供する抗生物質耐性遺伝子がこの目的に用いられる。大腸菌でのクロー ニングに適したプラスミドが選択マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子 を含み、アンピシリン感受性の宿主制限陰性、１ａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性 の大腸菌株を細菌宿主として用いる。
線状プラスミドを直接哺乳ｇｌＤＮＡに結合することができるが、本発明では、 プラスミドを制限酵素を用いて線状化した後に、挿入によってバクテリオファー ジベクターに結合してバクテリオファージベクター成分として哺乳動物ＤＮＡ中 に導入することが非常に好ましい。プラスミドを挿入によってバクテリオファー ジスベクターに結合することが好ましい。このような構成によって、本発明を現 今使用されている“ミュータマウス（Ｍｕｔａｍｏｕｓｅ）　”　（すなわち、 欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２に本発明者によって記載されたシステム に基づくトランスジェニックマウス）と比較することが可能になる。後者のシス テムは、染色体ＤＮＡから、組込まれたバクテリオファージスベクターを市販の パッケージング抽出物を用いて回収するという原理によって行われる。前述の本 発明の好ましい具体例を用い、プラスミド解離とバクテリオファージλ解離の両 方によって、同じ１ａｃＺ遺伝子での変異を決定することができる。ここで、得 られる結果の確認ができる。
本発明の好ましい具体例は、プラスミドがバクテリオファージスベクターｇｔ１ ０の特定のＥｃｏＲＩサイトでクローニングされるプラスミドｐＵＲ２８８であ り、この制限酵素ＥｃｏＲＩを単離ＤＮＡのフラグメント化に用いるものである 。
哺乳類ＤＮＡは、インビトロで培養された哺乳類細胞のＤＮＡとトランスジェニ ック哺乳類のＤＮＡの両方が使用できる。後者の場合、これは通常ラットやマウ スなどの（小さな）げっ菌類が含まれる。トランスジェニックマウスまたはラッ トのＤＮＡにプラスミドを導入するのが好ましい。
特に好ましい具体例は、固体粒子として磁性粒子を用いることである。磁性粒子 を用いることにより、粒子に結合したＤＮＡと非結合ＤＮＡとの分離が非常に簡 単かつ効率のよい操作で遂行できる。磁性粒子を磁石を用いて簡単な操作で混合 物から取り出すことができる。しかし、非磁性粒子もまた用いることができる。
この場合、濾過および／または遠心分離および洗浄によって、混合物からの分離 を行うことができる。プラスミドＤＮＡの選択的取り出しのために、固体粒子を １ａｃＺオペレ一タ結合物質で被覆する。ここで“物質”として好ましいのは、 実質的にタンパク質性の物質またはタンパク質である。このような１ａｃＺオペ レ一タ結合物質はたとえば１　ａｃＺオペレータに特異的な親和性をもつ抗体（ ポリクローナルまたはモノクローナル）である。好ましい具体例において、１ａ ｃＺオペレ一タ結合物質は、Ｌａｃｌリプレッサータンパク質またはＬａｃＩリ プレッサー融合タンパク質などのＬａｃｌリプレッサーを含むタンパク質である 。
この物質は固体粒子に直接結合することができるが、間接的に結合するのが好ま しい。プラスミドＤＮＡを単離するために、固体粒子は、抗β−ガラクトシダー ゼおよびＬａｃＩ−リプレッサー／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質が連続 的に結合しているものが好ましい。
プラスミドＤＮＡが結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離した後、粒子に結 合したプラスミドＤＮＡを粒子から再び解離しな番ノればならない。たとえば１ ａｃＺオペレ一タ結合物質としてＬａｃＩリプレッサータンパク質物質を含むタ ンパク質が固体粒子に結合している場合、ＬａｃＩリプレッサーと１ａｃＺオペ レータが互いに持っている親和力よりもＬａｃＩリプレッサーまたは１　ａｃＺ オペレータに対してより大きい親和力を有する作用剤を用いることができる。固 体粒子からのプラスミドＤＮＡの解離のために、Ｌａｃｌリプレッサーと１ａｃ Ｚオペレ一タ間の結合を解除するイソプロピルβ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ ）を用いるのが好ましい。
さらに本発明は、１ａｃＺオペレ一タ配列を含むＩａｃＺ遺伝子を含有するプラ スミドの１またはそれ以上の複製物を含む哺乳動物ＤＮＡを有するトランスジェ ニック哺乳動物に関する。該プラスミドは、好ましくは大腸菌でのクローニング に適したプラスミドであり、好ましくは選択マーカー遺伝子としてアンピシリン 耐性遺伝子を含んでおり、好ましくは制限酵素を用いて線状化したのちに、挿入 によってバクテリオファージベクターに結合してバクテリオファージベクター成 分として哺乳動物中に導入されるものである。本発明の好ましい具体例は、ノく クテリオファージλベクターｇｔｌｏの特定のＥｃｏＲＩサイトでクローニング されるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８であるトランスジェニック哺乳動物 である。トランスジェニック哺乳類は、トランスジェニックげっ菌類が好ましく 、トランスジェニックマウスまたはラットが好ましい。
さらに、本発明は１ａｃＺオペレ一タ配列を含む１ａｃＺ遺伝子を含有するプラ スミドの１またはそれ以上の複製物を含む哺乳動物ＤＮＡを有するトランスジェ ニック哺乳動物に関する。該プラスミドは、大腸菌でのクローニングに適したプ ラスミドが好ましい。このプラスミドは、選択マーカー遺伝子としてアンピシリ ン耐性遺伝子を含むものが好ましい。該プラスミドは、制限酵素を用いて線状化 したのちに、挿入によってバクテリオファージベクターに結合してバクテリオフ ァージベクター成分として哺乳動物中に導入されるものが好ましい。本発明の好 ましい具体例は、バクテリオファージスベクターｇｔｌＯの特定のＥｃｏＲＩサ イトでクローニングされるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８であるトランス ジェニック哺乳動物細胞である。トランスジェニック哺乳類細胞は、トランスジ ェニックげっ書類細胞が好ましく、トランスジェニックマウス細胞またはラット 細胞が好ましい。
本発明は、マーカー遺伝子として機能する１ａｃＺ遺伝子における変異を試験し 、続いて前述の操作で検出するための作用剤または条件下に、１またはそれ以上 のトランスジェニック哺乳動物細胞をおくことによって、変異特性に対する作用 剤または条件を試験するためのインビボ方法を提供する。種々の細胞または器官 に対する被験作用剤または条件の変異原性の差異を決定するため、細胞または器 官特定操作で作業することも可能である。
本発明は、マーカー遺伝子として機能する１ａｃＺ遺伝子における変異を試験し 、続いて前述の操作で検出するための作用剤または条件下に、１またはそれ以上 のトランスジェニック哺乳動物細胞をおくことによって、変異特性に対する作用 剤または条件を試験するためのインビトロ方法をも提供する。
新規トランスジェニックマウスに係る好ましい具体例に関し、さらに以下に説明 する。
たとえば、染色体上の幾らかの複製物に組込まれるバクテリオファージスベクタ ー内のプラスミドにマーカー遺伝子が存在するトランスジェニックマウスに係る 本発明は、ＤＮＡにおける変異を決定する公知の方法における上述の制限を有し ない。細菌クローニングベクターとしてプラスミドを用い、マーカー遺伝子とし て１ａｃＺオペレ一タ配列を含む１ａｃＺ遺伝子を用いることによって、該プラ スミドにおいて細菌１ａｃＺ遺伝子との結合よりも優先される、Ｌａｃｌリプレ ッサータンパク質と該オペレータ配列との間の強力かつ特異的な結合をベクター の回収のために採用しつるので、本発明の動物モデルでは、マーカー遺伝子の回 収を特に効率よ（行うことができる。さらに、β−ガラクトシダーゼ／ＬａｃＩ −リプレッサー融合タンパク質（ＬａｃＩ／Ｚ）に連続的に連結する抗β−ガラ クトシダーゼ抗体が直接結合する磁性ビーズを用いることにより、ＬａｃＩリプ レッサータンパク質と結合した後、磁石を用いて染色体ＤＮＡから該１ａｃＺマ ーカー遺伝子を容易に単離することができる。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ− チオガラクトシド）を加えることにより、マーカー遺伝子のオペレータ配列とリ プレッサータンパク質問の結合を解除することができる。ＩＰＴＧのＬａｃｌリ プレッサーに対する親和性がより大なるため、マーカー遺伝子含有プラスミドＤ −は溶液中に解離する。次いで、得られるプラスミドを環化し、変異マーカー遺 伝子が結合するときのみ（ラクトース含有またはラクトース類縁体含有培地上で ）生育しうる細菌宿主に導入する（アンピシリン耐性、宿主制限陰性、１ａｃ２ Ｊ性およびｇａｌＥ陰性の大腸菌）。したがって、コロニーの数を単離マーカー 遺伝子の数と関連づけることによって、トランスジェニックマウスのすべての組 織や器官における自然発生変異または誘発変異の頻度を正確かつ迅速に単純な操 作で決定することができる。高価で時間のかかる膨大な数のプラークの測定がこ れによって回避される。理論上に約１０％のバクテリオファージλ分子の回収が 可能であるパッケージング抽出物と対比して、磁性ビーズに連結するリブレ・ソ サータンパク質を用い、電気穿孔法などで大腸菌宿主細胞にプラスミドを導入す る、全ゲノムＤＮＡからのプラスミドの回収には変動性の問題はない。同様に約 １０％の効率（精製工程なしの約０．０１％に相当する）である後者の方法でよ 、有効大腸菌細胞数のみが起こりつる庄物学上の変数であるが、実験によってこ の因子がかなり一定であることが分かっている。
Ｌａｃｌリプレッサータンパク質とオペレータ配列間の強い結合を利用する全染 色体ＤＮＡからマーカー遺伝子を単離する上記方法は、これまでに文献に記載さ れてはいない。ＤＮＡ−結合タンパク質を単離するための類似の方法が記載され ており（レーベンス（Ｌｅｖｅｎｓ）およびハウリー（ｆｌａｔｌｙ）　、１９ ８５年）、これは同様にＬａｃ！リプレッサータンパク質のオペレータ配列に対 する大きな親和性に基づ（方法である。しかし、変異分析の目的で、ＬａｃＩリ プレッサー−オペレータ結合を利用して染色体ＤＮＡからマーカー遺伝子１ａｃ Ｚを迅速に精製することは、すでに述べたようにこれ以前に提案されたものでは ない。染色体ＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列の精製において、磁性ビーズ技術お よび公知のＬａｅＩリプレッサータンパク質と１ａｃＺオペレ一タ配列間の結合 の予備的な使用により、独自の利用分野、すなわち変異分析の分野への利用をも たらす。この技術分野においては、直接的な選択が普通であるが、本発明ではま ず多くのマーカー遺伝子の複製物が単離される。
本発明の重要な一面は高等生物のゲノムに組込まれたプラスミドを回収しうる効 率である。種々の大腸菌宿主菌株を用いたトランスジェニックマウスの全染色体 ＤＮＡからのバクテリオファージスベクターの回収効率を決定するための、特に 本発明の発明者による以前の研究では、宿主制限できない大腸菌宿主菌株のみが 使用可能であることが実証されている（ボッセンおよびファイク、１９８８年： 欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２）。バクテリオファージスベクターは動 物のゲノムに導入された後に修飾されるので、宿主制限不可能な大腸菌菌株が必 要なのである。修飾ＤＮＡはそれ自体細菌細胞内へ導入後に認識され、宿主制限 システムによって速やかに破壊される。プラスミドベクターの回収でも同じ事が 言える。
ゲノムＤＮＡからのバクテリオファージスベクターの回収はプラスミド回収より も効率が高いことが知られているので、プラスミドの組込みに基づく変異モデル はそれ自体自明ではない。非常に低濃度、すなわち大容量で線状プラスミドを環 化する必要があるため、ゲノムＤＮＡからのプラスミドの解離は不経済である。
このことから今日までプラスミドの組込みに基づく変異モデルについては好適な ものができていない。
本発明は、迅速な精製段階、すなわち前述の１ａｃＺ遺伝子のオペレータ配列に 磁性ビーズに連結したＬａｃＩリプレッサータンパク質にを結合させることによ る、染色体ＤＮＡからのプラスミド含有マーカー遺伝子の効率の良い分離を利用 するため、上記の制限がない。この精製段階のため、本質的にすべての過剰の染 色体ＤＮＡが除去され、それ以後は環化を小容量で効率良く行うことができる。
上述の原理を用いて、本発明は、容易に回収され、変異の存在を分析しうるマー カー遺伝子を各体細胞に含んでいる、変異原性の疑われる作用剤を試験するのに 非常に適したトランスジェニック動物モデルを提供する。変異頻度を決定するた めに、組込みプラスミドはＬａｃＩリプレッサー複合体と結合した後、非常に効 率良（回収することができ、大腸菌に導入することができる。
変異体１　ａｃＺ遺伝子を容易に検出できるようにするために、変異体コロニー に有益なように非変異体コロニーが生存しないような選択システムの利用が望ま しい。これは本発明のもう一つの面にしたがってｇａｌＥ−随性大腸菌株を用い ることによって実現できる。もしもＩａｃＺ含有プラスミドを精製後に宿主制限 陰性、ＩａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性の大腸菌宿主細胞に導入するなら、変異 プラスミドに結合する細胞のみが、平板植え付は後にラクトース含有またはラク トース類縁体培地上で生育できることになる；非変異プラスミドに結合する大腸 菌細胞はβ−ガラクトシダーゼの存在の結果としてラクトースまたは類縁体をガ ラクｉ・−スに変換することになる。しかし、ｇａｌＥ遺伝子の変異のため、さ らなるガラクトースの変換は不可能である。これは、毒性副産物であるＵＤＰ− ガラクトースの蓄積をもたらし、それによって細胞は死滅する（マラミー（Ｍａ ｌａｉｙ）、１９６６年）。高等動物の変異分析にｇａｌＥ陰性菌株を使用する ことが新規事項である。バタテリオファージウィルスに感染した大腸菌細胞は短 時間後に死滅するので、この選択形態はバクテリオファージスベクターにも起こ り得る。ＵＤＰ−ガラクトースの蓄積による毒性の影響はそのときに消失する。
したがって、本発明は２つの構成要素、すなわち（１）全染色体哺乳類ＤＮＡか らの組込みプラスミドの迅速な精製と変異マーカー遺伝子の容易な検出を確実に する技術的構成要素、および（２）新型のトランスジェニック哺乳類と変異マー カー遺伝子の検出のための特殊型の細菌宿主という形態での生物学的構成要素か らなり、上記技術的構成要素を用いて得られるトランスジェニック動物モデルは 新規インビボ変異モデルとして使用することができる。
全染色体哺乳類ＤＮＡからマーカー遺伝子を精製するための磁性ビーズ技術、お よび簡単な操作での変異頻度の決定のためのｇａｌＥ−１１ａｃＺ−および宿主 制限陰性大腸菌株の使用を包含する本発明で用いられる方法により、ここで記載 のトランスジェニックマウスモデルは、インビボ変異モデルに非常に適したもの になる。本発明のトランスジェニックマウスモデルの重要な一面は、潜在的に発 ガン性の作用剤の試験に必要なコストが相対的に低いということである。比較し てみると、発ガン性の疑わしい作用剤をげっ書類で長期間実験して試験を行った 場合のコストは約２百万ギルダーであり（ゴールドバーブ（Ｇｏｌ、ｄｂｅｒｇ ）およびフラツィア（Ｆｒａｚｉｅｒ）、　１９８９年）、バクテリオファージ スベクターの回収に基づく欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２に記載のトラ ンスジェニックマウスモデルで試験を行った場合のコストは１２００００ギルダ ーである。後者のコストは４０匹の動物を用い、ひとつの器官の変異頻度の決定 を行ったものであり、したがってそれ以上の器官を試験するとその倍数となる。
これらと対比して、本発明トランスジェニックマウスモデルを用いた場合のコス トは、ひとつの器官を試験するとおよそ２００００ギルダーとなる。この相当額 のコストの減少は、主として磁性ビーズ技術およびｇａｌＥ陰性、ＩａｃＺ陰性 および宿主制限陰性の大腸菌宿主の使用により得られ、インビボでの変異分析に トランスジェニック動物モデルを使用するということの重要な一部分をなすもの である。
実施例１ニドランスジ工ニツクマウス株インゲニイ（Ｉｎｇｅｎｙ）　Ｍｌの製 造使用するベクターは、バクテリオファージλ−ｇｔｌｏベクター（レーデン（ Ｌｅｉｄｅｎ）のプロメガ・ベスローテン・フェンノートジャツブ（Ｐ　ｒｏｍ ｅｇａ　Ｂ、　Ｖ、　）製）であり、プラスミドｐＵＲ２８８はその特定のＥｃ ｏＲＩサイト（図１参照）でクローニングされる。ｐＵＲ２８８プラスミドには 複製開始点ｐ　ＢＨ３２２、アンピシリン遺伝子、ＩａｃＺオペレータ配列およ び全１ａｃＺ遺伝子が存在する（ルター（Ｒｕｔｈｅｒ）およびミューターーヒ ル（Ｍｔｌｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ）、　１９８６年）。該ベクターを受精卵細胞マ イクロインジェクション手段を用いてＣＤ２　（Ｂａ　Ｉ　ｂ／　ｃ　ｘＤＢＡ ／２）マウスの生殖系に導入する（ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、１９８６年）。
Ｂａ１ｂ／ＣおよびＤＢＡ／２は、ライスヮイク（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ）のＴＮＯ インスティテユート・フォア・エイジング・アンド・ヴアスキュター・リサーチ （ＴＮＯ−ＩＶＶＯ）のげっ書類コロニー由来の２種類のマウス株である。受精 卵の前核への線状ＤＮＡのマイクロインジェクション後、注入されたＤＮＡはゲ ノム中のランダムな場所にヘッドトウテイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配置 で組込まれる（バルミテール（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）およびプリンスター（Ｂｒｉ ｎｓｔｅｒ）　、　１９８６年）。図２Ａは、マウスのゲノムにおけるプラスミ ド含有バクテリオファージλベクターのへッドトウテイル組込みの模式図である 。この操作によるλベクターの組込みは、インビトロパッケージングを用いる染 色体ＤＮＡからの回収にとって必須である。組込みプロセスの間、２つの１２塩 基対相補末端は、インビトロパッケージング抽出物中のターミナーゼ酵素によっ て認識されるひとつの完全な（ＣＯ３）コスサイトを形成する。２つの完全なニ スサイト間のλＤＮＡは空のファージ粒子にパッケージされる。このことは欧州 特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２に詳しく記載されている。図２Ｂは、プラス ミド含有λベクターがインゲニイＭｌ　（ＩＮＧ３）株のマウスのゲノムにおい て本当にヘッドトウテイルで組込まれることを示している。これは肝臓ＤＮＡの サザーン分析によって証明された。染色体ＤＮＡは、プラスミド含有ベクターを 切断する制限酵素ＤｒａＩで切断されて、ひとつのフラグメントが１．２ｋｂで ある多数のフラグメントになる。この完全なコスサイトを含むフラグメントは、 λベクターのへッドトウテイル組込み後に存在する。
図２Ｂのオートラジオグラムは、１．２ｋｂフラグメントがマウス株インゲニイ Ｍ１の染色体ＤＮＡに本当に存在することを示している。会合したコンピテント はメンデルの様式で遺伝することが内部繁殖実験から分かつている。
実施例２：マウスｌＮＧ３の染色体ＤＮＡから組込まれたプラスミドの精製図３ に、インゲニイＭ１トランスジェニックマウス（ＩＮＧ３）の染色体ＤＮＡから の線状ｐＵＲ２８８プラスミドの精製および環化を示す。染色体ＤＮＡからの１ ａｃＺ含有プラスミドの精製のために、染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩであ らかじめ切断した（レーンＡ）。およそ１０物磁性ビーズ（たとえば、ウイスー ン（Ｕｉｔｈｏｏｒｎ）のＩＴＫジアグノスティックスＢ、　Ｖ、製、ダイナ− ビーズＭ−４５０シープ−アンチ−マウスＩｇＧ）を約１０μｇの染色体ＤＮＡ に連続的に加え、ビーズを抗β−ガラクトシダーゼ抗体（プロメガＢ、　Ｖ、製 ）およびＬａｃｌ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（プロメガＢ、　Ｖ、 製）に連続的に結合させる。抗β−ガラクトシダーゼ抗体の磁性ビーズへの結合 およびＬａｃｌ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の抗β−ガラクトシダー ゼへの結合は標準プロトコールにしたがって行った（それぞれ、ＩＴＫシアグツ ステ什ソクスＢ、　Ｖ、製およびプロメガＢ、　Ｖ、製）。１時間後、１ａｃＺ 含有プラスミドと結合したビーズを、磁石（ＩＴＫジアグノステイ・マウスＢ、 　Ｖ、製）を用Ｌ１て残りの染色体ＤＮＡから室温にて分離し、２５０μｌの５ ０ｍＭ）リスＨＣＩ。
１００ｍＭＮａＣ１で少なくとも２回洗浄した。ＬａｃｌリプレッサータンＩく り賀とオペレータ配列間の結合を磁性ビーズを１０μｌの５０ｍＭトリスＨＣＬ １００ｍＭＮａＣ１，０，２％ＩＰＴＧに加えて解除する（レーンＢ）。標準プ ロトコール（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年）に従って、プ ラスミドの環化を行い、精製プラスミド２０ｎｇを合計量２５μｌの０．０２Ｕ Ｔ４−リガーゼ酵素（ギブコＢＲＬ製）を用いて連結した。線状プラスミドと比 較して、環化プラスミドは寒天ゲル電気泳動における移動速度が遅いので、回収 されたｐＵＲ２８８プラスミドの環化は簡単な操作で分析できる（レーンＣ）。
実施例３：マウスｌＮＧ３の染色体ＤＮＡからの組込みプラスミドの回収効率の 決定 環化ｐＵＲ２８８プラスミドの小部分をコンピテント細胞に形質転換を用いて導 入することにより、Ｉ　ａｃＺ含有プラスミドの回収効率を決定する。宿主制限 陰性および１ａｃＺ陰性のアンピシリン感受性大腸菌株で形質転換を行うことが できる。たとえば、大腸菌Ｃ（ボッセンおよび７７４２．１９８８年）、大腸菌 ５ｕｒｅ　（ストラタジーン、リュースデン（Ｌｅｕｓｄｅｎ）のウェストバー ブＢ、　Ｖ。
製）またはＤＨ５αＭＣＲ（ブレイタ（Ｂｒｅｄａ）のライフ・チクノロシーズ Ｂ。
■、製）など。形質転換はダウロー（Ｄｏｗｅｒ）らの１９８８年に記載の電気 穿孔法を用いて行った。続いて、ｐＵＲ２８８含有大腸菌細胞をアンピシリン含 有（５０μｇ／ｍ１）ＬＢ寒天培地（ギブコＢＲＬ製）平板に植え付けた。該平 板を３７℃で一夜インキユベートした後のコロニーの数（Ａ）が解離（レスキュ ー）効率の基準である。この実験では、制限酵素ＥｃｏＲＩで予切断された約５ μｇの染色体ＤＮＡから、およそ５００００プラスミドが回収された。次いで、 残りの環化プラスミドをガラクトース感受性（ｇａｌＥ陰性）である大腸菌宿主 （アンピシリン陰性、１ａｃＺ陰性および宿主制限陰性）に導入することができ る。形質転換後、大腸菌細胞をフェニルガラクトシド（０，０５％：シグマ製） 、ＩＰＴＧ　（２０μｇ／ｍｌ　；ギブ：）ＢＲＬ製）およびアンピシリン（５ ０μｌ／ｍｌ；メルク製）を含有するＭＭ／ＬＢ　（４：　１ｖ／ｖ）培地に植 え付ける。ＩａｃＺ遺伝子での変異の結果としてβ−ガラクトシダーゼを持たず 、フェニルガラクトシドを変換できない細胞のみがこの培地で生育しつる。３７ ℃で一夜インキユベートシた後のコロニーの数（Ｂ）が変換の数の基準である。
続いて、変異頻度がＢ／Ａ比から決定される。
実施例４ニドランスジエニツク動物の染色体ＤＮＡからの組込まれたバタテリオ ファージλベクターの回収 比較の目的で、プラスミド解離の代わりにバタテリオファージλによるインゲニ イＭ１マウス株における１ａｃＺ回収実験を行った。最大１０μｇの染色体ＤＮ Ａをインビトロパッケージング抽出物（ストラタジーン、リュースデンのウェス トバーブ製）に加えることによって、プラスミド含有ノくクテリオファージλベ クターの解離を行った。抽出物を２２℃で２時間インキュベートした後、該抽出 物を５００μｌの３Ｍ緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１，８ｍＭＭｇＳＯ４・Ｈｔｏ 。
５ＱｍＭ）リスＣ１，ｐＨ７，５）で希釈し、およそ５μＩのファージ溶液を大 腸菌Ｃ（ｌａｃＺＭ性および宿主制限陰性）宿主細胞で平板培養して回収効率を 決定した（マニアテイスら、１９８２年）。この操作で、約１０μｇのインゲニ イＭｌ　（ＩＮＧ３）のトランスジェニックマウスの肝臓ＤＮＡから、およそ５ ０００００ベクターが回収できた。変異頻度は無色プラーク（ｌ　ａｃＺ遺伝子 変異）の数と青色プラーク（］　ａｃＺ遺伝子非変異）の数の頻度から、決定さ れる。
図面の説明 図１は、実施例１に記載したｐＵＲ２７７ブラスミド含有ノ（クテリオファージ λベクターｇｔ−１０の模式図である。
図２８は、マウスのゲノムにおけるベクターのへッドトウテイル組込みの模式図 ２ｂは、制限酵素ＤｒａＩで切断された、種々のトランスジェニックマウスの肝 臓ＤＮＡのサザーンブロツテイング後に得られたオートラジオグラムである。
図３は、インゲニイＭ１トランスジエニ・ツクマウスの全染色体ＤＮＡから（７ ）Ｉ）ＵＲ２８８プラスミドの回収を表す。オートラジオグラムは、制限酵素Ｅ ｃｏ　１で切断されたトランスジェニックマウスＩＮＧ−３の肝臓ＤＮＡ　（レ ーンａ）、磁性ビーズで精製されたｐＵＲ２８８プラスミド（レーンｂ）、環化 されたｐＵＲ２８８プラスミド（レーンＣ）のサザーンブロ・ソテイングにより 得られたものである。プローブとしで！Ｐ標識ｐＵＲ２８８プラスミドを用いた 。
参考文献 アルペルチー二Ｒ，Ｊ、らのｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳ＾Ｊ７９．６６１７頁（１９８２年） エームス、Ｂ、Ｎ、らのｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ Ｊ　７０．２２８１頁（１９７３年） アシュビ−ｊ、およびテナント、Ｉｌ、Ｗ、のｒＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓ、Ｊ　 ２０４．１７〜１１５頁（１９８８年） ダウワ＋、　ｆ、　Ｊ、らのｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、Ｊ　１６，６ １２７〜５１４５頁（１９８８年） 欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３５３８１２ゴールドバーグ、＾」、およびフラツイ ア、Ｊ」、のｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｗ＋ｅｒｉｃａｎＪ　２６１．１６〜 ２２頁（１９８９年） ボッセン、　Ｊ、　Ａ、およびファイグ、Ｊ、のｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　Ｊ　１６　、９３４３頁（１９８８年） ボッセン、　Ｊ、　Ａ、らのｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｊ 　８６．７９７１〜７９４５頁（１９８９年） ヘイ、＾、のｒＮａｔｕｒｅＪ　２３２．７８２〜７８３頁（１９８５年）ホー ガン、Ｂ、らのｒＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅ＋ｅｂｒ ｉｏ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリンルノへ−ノ（−、ニューヨーク（１ ９８６年） リーベンス、Ｄ、およびハウリー、Ｐ」、のｒＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｏｉｌ 、　Ｊ　５．２３０７頁（１９８５年） ローマン、　Ｐ、　Ｈ，Ｍ、のｒＭｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１８１．２ ２７〜２３４頁（１９８７年）マラミー」」、のｒｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙＪ、　：P −ルド・スブリンルハーバー・ラボラトリ−、コールド・スプリング・／　％　 −ｔ　＜−、ニューヨーク、３１．１８９〜２０１頁（１９８６年）マニアティ ス、Ｔ、らのｒ）Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コー ルド・スプリング・／　ｓ　−／　（−、ニューヨーク（１９８２年） ハルミテール、Ｒ１Ｄ、オヨヒプリンスター、Ｒ，Ｌ、の「＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ 、　Ｇｅｎｅｔｌ　２０．４６５頁（１９８７年） ルター、Ｕ、およびミューターーヒル、Ｂ、のｒＥＭＢＯＪ　２．１７９１〜１ ７９３頁（１９８３年） ７フイク、Ｊ、およびライツタ−リンデン、　Ａ、　Ｇ、らのｒＭｅｃｈ、　Ａ ｇｅｉｎｇ　Ｄｅｖ、　Ｊ　４１　。
４７〜６３頁（１９８７年） ＵＲ２８８ 株 ｂｃ １−−１＾−Ｎ・ＰＣＴ／ＮＬ９２１０００６２

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. １．トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞からＤ ＮＡを単離し、該単離したＤＮＡをそのＤＮＡのプラスミドを切断しうる制限酸 素で処理してフラグメントとし、そのフラグメント化ＤＮＡをｌａｃＺオペレー タ結合物質と結合させた固体粒子と接触させ、ｌａｃＺオペレータ結合物質とｌ ａｃＺオペレータとの間の相互作用によってプラスミドＤＮＡが結合した固体粒 子を非結合ＤＮＡから分離し、該固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離させ、該 解離したプラスミドＤＮＡを環状化し、得られたプラスミドで宿主制限陰性、ｌ ａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性の細菌宿主を形質転換し、次いで、形質転換細菌 を、かつｌａｃＺ遺伝子の変異に基づいてβ−ガラクトシダーゼを有しない該細 菌のみが生育するラクトース含有培地にて培養することを特徴とする、トランス ジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の、マーカー遺伝子 としてｌａｃＺオペレータ配列を含むｌａｃＺ遺伝子を含有する線状プラスミド の１またはそれ以上の複製物を含むＤＮＡにおける変異を検出する方法。
  2. ２．該プラスミドが大腸菌でのクローニングに適したプラスミドであり、宿主制 限陰性、ｌａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性大腹菌株を細菌宿主として用いる請求 項Ｉに記載の方法。
  3. ３．該大腸菌でのクローニングに適したプラスミドが選択マーカー遺伝子として アンピシリン耐性遺伝子を含み、アンピシリン感受性の宿主制限陰性、ｌａｃＺ 陰性およびｇａｌＥ陰性の大腸菌株を細菌宿主として用いる請求項２に記載の方 法。
  4. ４．該プラスミドを制限酸素を用いて線状化した後に、挿入によってバクテリオ ファージベクターに結合してバクテリオファージベクター成分として哺乳動物Ｄ ＮＡ中に導入する請求項Ｉ〜３のいずれかに記載の方法。
  5. ５．該プラスミドを挿入によってバクテリオファージλベクターに結合する請求 項４に記載の方法。
  6. ６．バクテリオファージλベクターｇｔ１０の特定のＥｃｏＲＩサイトでクロー ニングされるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８であり、この制限酵素Ｅｃｏ ＲＩを用いて単離ＤＮＡをフラグメント化する請求項５に記載の方法。
  7. ７．該プラスミドをトランスジェニックマウスまたはラットに導入する請求項１ 〜６のいずれかに記載の方法。
  8. ８．固体粒子が磁性粒子である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. ９．ｌａｃＺオペレータ結合物質としてＬａｃＩリプレッサーを含むタンパク質 物質を用いる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. １０．プラスミドＤＮＡを単離するために、抗β−ガラクトシダーゼおよびＬａ ｃＩ−リプレッサ−／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質が連続的に結合する 固体粒子を用いる請求項９に記載の方法。
  11. １１．固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離するために、ＬａｃＩリプレッサー とｌａｃＺオペレータ間の結合を解除するイソプロピルβ−ガラクトシド（ＩＰ ＴＧ）を用いる請求項９または１０に記載の方法。
  12. １２．ｌａｃＺオペレータ配列を含むｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドの１ またはそれ以上の複製物を含む哺乳動物ＤＮＡを有する、ヒト以外のトランスジ ェニック哺乳動物。
  13. １３．該プラスミドが大腸菌でのクローニングに適したプラスミドである請求項 １２に記載のトランスジェニック哺乳動物。
  14. １４．大腸菌でのクローニングに適した該プラスミドが選択マーカー遺伝子とし てアンピシリン耐性遺伝子を含む請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動 物。
  15. １５．該プラスミドを制限酵素を用いて線状化したのちに、挿入によってバクテ リオファージベクターに結合してバクテリオファージベクター成分として哺乳動 物中に導入する請求項１２〜１４のいずれかに記載のトランスジェニック哺乳動 物。
  16. １６．該プラスミドを挿入によってバクテリオファージλベクターに導入する請 求項１５に記載のトランスジェニック哺乳動物。
  17. １７．バクテリオファージλベクタ−ｇｔ１０の特定のＥｃｏＲＩサイトでクロ ーニングされるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８である請求項１６に記載の トランスジェニック哺乳動物。
  18. １８．請求項１２〜１７のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類、特に トランスジェニックマウスまたはラット。
  19. １９．ｌａｃＺオペレータ配列を含むｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドの１ またはそれ以上の複製物を含む哺乳動物ＤＮＡを有するトランスジェニック哺乳 動物細胞。
  20. ２０．該プラスミドが大腸菌でのクローニングに適したプラスミドである請求項 １９に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
  21. ２１．大腸菌でのクローニングに適した該プラスミドが選択マーカー遺伝子とし てアンピシリン耐性遺伝子を含む請求項２０に記載のトランスジェニック哺乳動 物細胞。
  22. ２２．該プラスミドを制限酵素を用いて線状化したのちに、挿入によってバクテ リオファージベクターに結合してバクテリオファージベクター成分として哺乳動 物中に導入する請求項１９〜２１のいずれかに記載のトランスジェニック哺乳動 物細胞。
  23. ２３．該プラスミドを挿入によってバクテリオファージλベクターに導入する請 求項２２に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
  24. ２４．バクテリオファージλベクターｇｔ１０の特定のＥｃｏＲＩサイトでクロ ーニングされるプラスミドがプラスミドｐＵＲ２８８である請求項２３に記載の トランスジェニック哺乳動物細胞。
  25. ２５．請求項１９〜２４のいずれかに記載のトランスジェニックげっ歯類、特に トランスジェニックマウスまたはラット。
  26. ２６．トランスジェニック哺乳動物細胞からＤＮＡを単離し、該単離したＤＮＡ をそのＤＮＡのプラスミドを切断しうる制限酵素で処理してフラグメントとし、 そのフラグメント化ＤＮＡをｌａｃＺオペレータ結合物質と結合させた固体粒子 と接触させ、ｌａｃＺオペレータ結合物質とｌａｃＺオペレータとの間の相互作 用によってプラスミドＤＮＡが結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離し、該 固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離させ、該解離したプラスミドＤＮＡを環状 化し、得られたプラスミドで宿主制限陰性、ｌａｃＺ陰性およびｇａｌＥ陰性の 細菌宿主を形質転換し、次いで、形質転換細菌を、ｌａｃＺ遺伝子の変異に基づ いてβ−ガラクトシダーゼを有しない該細菌のみが生育するラクトース含有培地 にて培養することによって、マーカー遺伝子として機能するｌａｃＺ遺伝子にお ける変異を試験し、続いて検出するための作用剤または条件下に請求項１２〜１ ８のいずれかに記載の１またはそれ以上のトランスジェニック哺乳動物をおくこ とによって、変異特性にたいする作用剤または条件を試験する方法。
  27. ２７．トランスジェニック哺乳動物細胞からＤＮＡを単離し、該単離したＤＮＡ をそのＤＮＡのプラスミドを切断しうる制限酵素で処理してフラグメントとし、 そのフラグメント化ＤＮＡをｌａｃＺオペレータ結合物質と結合させた固体粒子 と接触させ、ｌａｃＺオペレータ結合物質とｌａｃＺオペレータとの間の相互作 用によってプラスミドＤＮＡが結合した固体粒子を非結合ＤＮＡから分離し、該 固体粒子からプラスミドＤＮＡを解離させ、該解離したプラスミドＤＮＡを環状 化し、得られたプラスミドで宿主制限陰性、ｌａｃＺ陰性およびｇａＩＥ陰性の 細菌宿主を形質転換し、次いで、形質転換細菌を、ｌａｃＺ遺伝子の変異に基づ いてβ−ガラクトシダーゼを有しない該細菌のみが生育するラクトース含有培地 にて培養することによって、マーカー遺伝子として機能するｌａｃＺ遺伝子にお ける変異を試験し、続いて検出するための作用剤または条件下に請求項１２〜１ ８のいずれかに記載の１またはそれ以上のトランスジェニック哺乳動物細胞をお くことによって、変異特性に対する作用剤または条件を試験する方法。
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