JPH0829093B2 - Ｄｎａをレスキューする方法およびマーカー遺伝子における変異を検出する方法 - Google Patents
Ｄｎａをレスキューする方法およびマーカー遺伝子における変異を検出する方法Info
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- JPH0829093B2 JPH0829093B2 JP1187193A JP18719389A JPH0829093B2 JP H0829093 B2 JPH0829093 B2 JP H0829093B2 JP 1187193 A JP1187193 A JP 1187193A JP 18719389 A JP18719389 A JP 18719389A JP H0829093 B2 JPH0829093 B2 JP H0829093B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、宿主細菌として宿主制限のない（incapabl
e of host restriction）大腸菌Ｃ株を用いることを特
徴とする、DNA配列を含有するベクターを適当な宿主細
菌中で増殖させるDNA配列のレスキュー（rescue）およ
びクローニングの方法に関する。換言すれば、一般にゲ
ノムからのDNA配列の、とくにメチル化されたDNA配列の
効果的なレスキューおよびクローニングの方法に関す
る。さらに本発明は、遺伝子導入した哺乳動物の細胞
（哺乳動物から直接採取したもの）または哺乳類の細胞
（哺乳動物から採取した細胞を組織培養したもの）から
DNAを単離すること、該DNAのベクターを回収（recove
r）すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関し
て欠損している適当な宿主細菌中で、該ベクターを増殖
させること、およびマーカー遺伝子の発現を試験するこ
とからなり、宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
を用いることを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但
し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ
以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方法に関
する。
e of host restriction）大腸菌Ｃ株を用いることを特
徴とする、DNA配列を含有するベクターを適当な宿主細
菌中で増殖させるDNA配列のレスキュー（rescue）およ
びクローニングの方法に関する。換言すれば、一般にゲ
ノムからのDNA配列の、とくにメチル化されたDNA配列の
効果的なレスキューおよびクローニングの方法に関す
る。さらに本発明は、遺伝子導入した哺乳動物の細胞
（哺乳動物から直接採取したもの）または哺乳類の細胞
（哺乳動物から採取した細胞を組織培養したもの）から
DNAを単離すること、該DNAのベクターを回収（recove
r）すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関し
て欠損している適当な宿主細菌中で、該ベクターを増殖
させること、およびマーカー遺伝子の発現を試験するこ
とからなり、宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
を用いることを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但
し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ
以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方法に関
する。
本明細書における「宿主制限のない」の語を説明する
と、次の通りである。「宿主制限」とは、細菌細胞の中
に導入された外来DNAの破壊をいう。細菌細胞は、特定
の修飾パターンによって、導入されたDNAを外来物と認
識する。該破壊能力に欠ける細菌株のことを「宿主制限
のない」または「宿主制限陰性」という。
と、次の通りである。「宿主制限」とは、細菌細胞の中
に導入された外来DNAの破壊をいう。細菌細胞は、特定
の修飾パターンによって、導入されたDNAを外来物と認
識する。該破壊能力に欠ける細菌株のことを「宿主制限
のない」または「宿主制限陰性」という。
「レスキュー」とは、真核ゲノムからDNAフラグメン
トを単離し、原核宿主の中で増殖させることをいう。も
ともと存在したにせよ、後から導入されたにせよ、異質
（大抵は真核）のゲノムの中に存在することによって、
DNAフラグメントは、宿主制限陽性の原核宿主によって
外来物と認識される修飾パターンを獲得する。そのた
め、宿主制限陽性の原核宿主中に導入されたDNAフラグ
メントは、破壊（すなわち、制限）され、増殖せずに検
出される。一方、増殖して発見されるフラグメントを
「レスキューされた」という。
トを単離し、原核宿主の中で増殖させることをいう。も
ともと存在したにせよ、後から導入されたにせよ、異質
（大抵は真核）のゲノムの中に存在することによって、
DNAフラグメントは、宿主制限陽性の原核宿主によって
外来物と認識される修飾パターンを獲得する。そのた
め、宿主制限陽性の原核宿主中に導入されたDNAフラグ
メントは、破壊（すなわち、制限）され、増殖せずに検
出される。一方、増殖して発見されるフラグメントを
「レスキューされた」という。
変異を検出する方法は、とりわけ潜在する発癌性物質
の危険性を評価するための動物実験モデルを開示してい
るローマンら（1987年）(11)（後記参考文献（11）参
照、以下同様）ならびにヘイヒおよびウィッテルリンデ
ン（1987年）(15)の論文から知られている。さらに詳し
くは、彼らは生殖細胞を含む全細胞のトランスジェニッ
クマウスを用いたイン・ビボの変異分析のためのマウス
モデルを提案しており、その全細胞はゲノム中に組込ま
れたバクテリオファージλベクターを含み、そのベクタ
ーは選択マーカーを備えている。物質の発癌性試験をす
ることは、次から次へと新しい合成物質が出現する社会
において、非常に重要である。多くのすでに存在してい
る化学物質と同様にこれらの物質の多くは発癌性の疑い
がある。現今の見識によれば、癌は特定の遺伝子のDNA
塩基配列における変化に基づくとされる。変異原性物質
（すなわち、DNAの塩基配列を変化させる物質）はほと
んど必ず発癌性であり、遺伝子性物質に対して永久的損
傷をもおこしうる（したがって、遺伝性疾患へと導かれ
る）。その結果、遺伝子中に変異を導入する物質の能力
が、遺伝情報における癌および異常（deviation）のよ
うな健康上の有害な影響に関して問題とされる物質の危
険性を評価するための重要な基準であると考えられる。
の危険性を評価するための動物実験モデルを開示してい
るローマンら（1987年）(11)（後記参考文献（11）参
照、以下同様）ならびにヘイヒおよびウィッテルリンデ
ン（1987年）(15)の論文から知られている。さらに詳し
くは、彼らは生殖細胞を含む全細胞のトランスジェニッ
クマウスを用いたイン・ビボの変異分析のためのマウス
モデルを提案しており、その全細胞はゲノム中に組込ま
れたバクテリオファージλベクターを含み、そのベクタ
ーは選択マーカーを備えている。物質の発癌性試験をす
ることは、次から次へと新しい合成物質が出現する社会
において、非常に重要である。多くのすでに存在してい
る化学物質と同様にこれらの物質の多くは発癌性の疑い
がある。現今の見識によれば、癌は特定の遺伝子のDNA
塩基配列における変化に基づくとされる。変異原性物質
（すなわち、DNAの塩基配列を変化させる物質）はほと
んど必ず発癌性であり、遺伝子性物質に対して永久的損
傷をもおこしうる（したがって、遺伝性疾患へと導かれ
る）。その結果、遺伝子中に変異を導入する物質の能力
が、遺伝情報における癌および異常（deviation）のよ
うな健康上の有害な影響に関して問題とされる物質の危
険性を評価するための重要な基準であると考えられる。
最もよく知られている潜在する変異原性物質のテスト
は、細菌における変異を扱ったエイムス・テストである
（エイムスら（1973年））(3)。細菌はヒトとはかなり
異なるため、おそらくこのテストは100％信頼すること
はできない（ゼイガーら（1987年））(16)。この理由か
ら、マウス細胞を用いるテストを含めて、テストを組合
わせて行なうことがしばしば好まれる。すべての哺乳類
の細胞に適用するように、マウス細胞のゲノムは、エイ
ムス・テストのような変異研究に対してはあまりに複雑
である。細菌の大きな利点は、非常に世代時間が短かい
ため、その特徴づけはもちろん特定の変異の選択を可能
にする点である。
は、細菌における変異を扱ったエイムス・テストである
（エイムスら（1973年））(3)。細菌はヒトとはかなり
異なるため、おそらくこのテストは100％信頼すること
はできない（ゼイガーら（1987年））(16)。この理由か
ら、マウス細胞を用いるテストを含めて、テストを組合
わせて行なうことがしばしば好まれる。すべての哺乳類
の細胞に適用するように、マウス細胞のゲノムは、エイ
ムス・テストのような変異研究に対してはあまりに複雑
である。細菌の大きな利点は、非常に世代時間が短かい
ため、その特徴づけはもちろん特定の変異の選択を可能
にする点である。
変異原性試験におけるモデルとして培養した哺乳類の
細胞を用いるばあいの重大な問題点は、誘導変異の性質
および頻度に関して器官および組織における相異点を試
験することが不可能でありイン・ビトロの状態という人
工の状況である点である。
細胞を用いるばあいの重大な問題点は、誘導変異の性質
および頻度に関して器官および組織における相異点を試
験することが不可能でありイン・ビトロの状態という人
工の状況である点である。
たとえば、ある物質が生殖細胞において好んで変異を
誘導するか、またはその逆であるかを知ることは非常に
重要であろう。他方では、血球測定を基準として、特定
の器官における変異を断定する可能性に関する情報は必
要である。たとえば、多量の発癌性物質服用の危険にさ
らされているかもしれない人をスクリーニングするばあ
い、このことは重要である。
誘導するか、またはその逆であるかを知ることは非常に
重要であろう。他方では、血球測定を基準として、特定
の器官における変異を断定する可能性に関する情報は必
要である。たとえば、多量の発癌性物質服用の危険にさ
らされているかもしれない人をスクリーニングするばあ
い、このことは重要である。
このとき、高等動物の細胞におけるイン・ビボでの変
異を調べる可能性はわずかにある。一例としていわゆる
HPRTテストがあり、その中でHPRT遺伝子における変異は
単離および培養した細胞の６−チオグアニン耐性を基準
として選択される（アルバーティーニら（1982年））
(1)。この方法は労働集約的であり、まだ分裂できかつ
容易に培養される細胞での測定を許すのみである。それ
に加えて、HPRT法は人為現象の傾向がある（フェザース
トーン（1987年））(17)。
異を調べる可能性はわずかにある。一例としていわゆる
HPRTテストがあり、その中でHPRT遺伝子における変異は
単離および培養した細胞の６−チオグアニン耐性を基準
として選択される（アルバーティーニら（1982年））
(1)。この方法は労働集約的であり、まだ分裂できかつ
容易に培養される細胞での測定を許すのみである。それ
に加えて、HPRT法は人為現象の傾向がある（フェザース
トーン（1987年））(17)。
ローマンら（1987年）(11)ならびにヘイヒおよびウィ
ッテルリンデン（1987年）(15)による前記の論文中に示
されている方法は、マウスDNAに組込まれた１またはそ
れ以上の選択しうる細菌の遺伝子を含むバクテリオファ
ージλベクターをマウスDNAから囲んでいる（flankin
g）「コス部位」で切断し、かつベクターを内部にとじ
こめる酵素混合物（enzyme cocktail）とこのDNAを混合
することによって、全染色体DNAから回収できることを
含んでいる。そののち、パッケージングされたファージ
を過剰の細菌とともに栄養培地にプレーティングし、数
時間後、結果として多数のいわゆるプラーク、すなわち
細菌が一面に増殖した培地中における円形の澄んだ部分
が生じる。各々のプラークは１つの回収されたベクター
に対応する。ファージ中のマーカー遺伝子が完全であれ
ば、マーカー遺伝子は発現されるだろう。したがって、
発現されないということはマーカー遺伝子における変異
を示す。
ッテルリンデン（1987年）(15)による前記の論文中に示
されている方法は、マウスDNAに組込まれた１またはそ
れ以上の選択しうる細菌の遺伝子を含むバクテリオファ
ージλベクターをマウスDNAから囲んでいる（flankin
g）「コス部位」で切断し、かつベクターを内部にとじ
こめる酵素混合物（enzyme cocktail）とこのDNAを混合
することによって、全染色体DNAから回収できることを
含んでいる。そののち、パッケージングされたファージ
を過剰の細菌とともに栄養培地にプレーティングし、数
時間後、結果として多数のいわゆるプラーク、すなわち
細菌が一面に増殖した培地中における円形の澄んだ部分
が生じる。各々のプラークは１つの回収されたベクター
に対応する。ファージ中のマーカー遺伝子が完全であれ
ば、マーカー遺伝子は発現されるだろう。したがって、
発現されないということはマーカー遺伝子における変異
を示す。
正確には、前記の方法では自然に存在する遺伝子を用
いることができないことをここで言及しておかなければ
いけない。これを効率よく器官のDNAから単離すること
は、組込まれたベクターと比較して容易ではなく、この
ベクターはその両側に２個の不完全（half）なコス部位
が存在するという特性をもつ。ベクターがヘッド−ツー
−テイル・アレンジメント（head−to−tailarrangemen
t）（「同方向」を意味する。複数のDNAフラグメント
が、例えば頭部を左側に尾部を右側に向きをすべて揃え
て、ゲノム中で集合しているとき、それをヘッド−ツー
−テイル・アレンジメントという。）でマウスDNAに組
込まれるならば、中央のベクターは完全なコス部位でマ
ウスDNAから切断されうるであろう。したがって、少な
くとも不完全なコス部位によって囲まれたこのタイプの
ベクターとともに、少なくとも３つのベクターがヘッド
−ツー−テイル・アレンジメントで組込まれることが必
須である。完全なコス部位によって囲まれたベクターの
ばあいは必要ではない。
いることができないことをここで言及しておかなければ
いけない。これを効率よく器官のDNAから単離すること
は、組込まれたベクターと比較して容易ではなく、この
ベクターはその両側に２個の不完全（half）なコス部位
が存在するという特性をもつ。ベクターがヘッド−ツー
−テイル・アレンジメント（head−to−tailarrangemen
t）（「同方向」を意味する。複数のDNAフラグメント
が、例えば頭部を左側に尾部を右側に向きをすべて揃え
て、ゲノム中で集合しているとき、それをヘッド−ツー
−テイル・アレンジメントという。）でマウスDNAに組
込まれるならば、中央のベクターは完全なコス部位でマ
ウスDNAから切断されうるであろう。したがって、少な
くとも不完全なコス部位によって囲まれたこのタイプの
ベクターとともに、少なくとも３つのベクターがヘッド
−ツー−テイル・アレンジメントで組込まれることが必
須である。完全なコス部位によって囲まれたベクターの
ばあいは必要ではない。
マーカー遺伝子の一例として細菌遺伝子lacZがあげら
れる。これ（および他の対応するマーカー遺伝子）を用
いて、細胞におけるまたは遺伝子導入した動物の異なる
器官および組織における変異の頻度および性質は、前記
のベクターの回収および細菌へのベクターの移入を利用
して容易に測定できる。lacZ遺伝子は、Ｘ−gal（基
質）を青色の物質に変えるβ−ガラクトミダーゼをコー
ドする。Ｘ−galは過剰の細菌とともにバクテリオファ
ージをプレーティングする栄養培地に添加されうる。la
cZ遺伝子がなお完全であれば、各々のファージは青色の
プラークを発生させることであろう。lacZ遺伝子の失活
の結果としてプラークが着色しないことによって遺伝子
における変異が明らかになる。着色しない各々プラーク
は変異した遺伝子の小さなレザバー（reservoir）であ
り、必要と思えばさらにたやすく分析することができ
る。多数の異なる変異標的遺伝子（lacZ、lacl、lacZ
α、supF、cI、galK、Lac0、gptなど）および同時にま
たは別々にベクター中に取り込まれうる多数の異なる変
異標的遺伝子が存在する。
れる。これ（および他の対応するマーカー遺伝子）を用
いて、細胞におけるまたは遺伝子導入した動物の異なる
器官および組織における変異の頻度および性質は、前記
のベクターの回収および細菌へのベクターの移入を利用
して容易に測定できる。lacZ遺伝子は、Ｘ−gal（基
質）を青色の物質に変えるβ−ガラクトミダーゼをコー
ドする。Ｘ−galは過剰の細菌とともにバクテリオファ
ージをプレーティングする栄養培地に添加されうる。la
cZ遺伝子がなお完全であれば、各々のファージは青色の
プラークを発生させることであろう。lacZ遺伝子の失活
の結果としてプラークが着色しないことによって遺伝子
における変異が明らかになる。着色しない各々プラーク
は変異した遺伝子の小さなレザバー（reservoir）であ
り、必要と思えばさらにたやすく分析することができ
る。多数の異なる変異標的遺伝子（lacZ、lacl、lacZ
α、supF、cI、galK、Lac0、gptなど）および同時にま
たは別々にベクター中に取り込まれうる多数の異なる変
異標的遺伝子が存在する。
ベクターが充分に高い効率で回収されうるならば、前
記のシステムは効果的に作用することができる。理論
上、変異がそこで起こっているかどうかを確証するため
に、ある器官の各々の細胞から１つのベクターをレスキ
ューできることが望ましい。実際にある器官から約100,
000のベクターをえることができる。前記のHPRTテスト
（白血球における）の基準として、自然変異の頻度は多
くて約100,000分の１（アルバーティーニら（1985
年））(2)であり、すなわち正常な成人における100,000
の細胞あたり、平均約１またはそれ以下の細胞がある部
位での変異によって、それぞれ遺伝子に対して不活性化
させられる。これはタンパクをコードしている自然に存
在する遺伝子に適合する。
記のシステムは効果的に作用することができる。理論
上、変異がそこで起こっているかどうかを確証するため
に、ある器官の各々の細胞から１つのベクターをレスキ
ューできることが望ましい。実際にある器官から約100,
000のベクターをえることができる。前記のHPRTテスト
（白血球における）の基準として、自然変異の頻度は多
くて約100,000分の１（アルバーティーニら（1985
年））(2)であり、すなわち正常な成人における100,000
の細胞あたり、平均約１またはそれ以下の細胞がある部
位での変異によって、それぞれ遺伝子に対して不活性化
させられる。これはタンパクをコードしている自然に存
在する遺伝子に適合する。
現今、ゲノムDNA1μｇあたり数十以上のバクテリオフ
ァージλベクター（または他の組込まれたベクター）が
回収されうるという指摘は全くない（リンデンマイヤー
ら（1982年）およびグラザーら（1986年））(10)(6)。
数μｇ以上のゲノムDNAから組込まれたベクターをレス
キューするために非常に多量のファージ・パッケージン
グ抽出物（酵素混合物）が必要である。この市販のファ
ージ・パッケージング抽出物が高価である点からより多
くのベクターを回収する目的で操作を単純にスケールア
ップすることは実用的ではない。ファージのパッケージ
ング効率が悪いのは、現今の前記のシステムが、変異モ
デルとして細胞系の形態でもトランスジェニックマウス
の形態でも利用されていないためと思われる。その上に
変異標的遺伝子をもつベクターを拡大する用途に用いる
が、常に組込みが行なわれないことは事実である（レー
マン（1985年）ならびにタブリッジおよびカロス（1988
年）参照）(9)(5)。
ァージλベクター（または他の組込まれたベクター）が
回収されうるという指摘は全くない（リンデンマイヤー
ら（1982年）およびグラザーら（1986年））(10)(6)。
数μｇ以上のゲノムDNAから組込まれたベクターをレス
キューするために非常に多量のファージ・パッケージン
グ抽出物（酵素混合物）が必要である。この市販のファ
ージ・パッケージング抽出物が高価である点からより多
くのベクターを回収する目的で操作を単純にスケールア
ップすることは実用的ではない。ファージのパッケージ
ング効率が悪いのは、現今の前記のシステムが、変異モ
デルとして細胞系の形態でもトランスジェニックマウス
の形態でも利用されていないためと思われる。その上に
変異標的遺伝子をもつベクターを拡大する用途に用いる
が、常に組込みが行なわれないことは事実である（レー
マン（1985年）ならびにタブリッジおよびカロス（1988
年）参照）(9)(5)。
例外として、細菌の変異標的遺伝子を備えたバクテリ
オファージλベクターがトランスフェクションにより細
胞系内にもち込まれたというグラザーら（1986年）(6)
による研究がある。そこで、組込まれた遺伝子を回収
し、変異を分析した。しかしながら、回収効率は低かっ
た。
オファージλベクターがトランスフェクションにより細
胞系内にもち込まれたというグラザーら（1986年）(6)
による研究がある。そこで、組込まれた遺伝子を回収
し、変異を分析した。しかしながら、回収効率は低かっ
た。
本発明は、宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
およびベクターとしてバクテリオファージベクターを用
い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケージン
グの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られたファ
ージ・パッケージング抽出物によって行なわれることを
特徴とする、DNA配列を含有するベクターを宿主細菌中
で増殖させるDNA配列のレスキューおよびクローニング
の方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、および
マーカー遺伝子の発現を試験することからなり、該宿主
細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用いることを特
徴とする、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除
く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカ
ー遺伝子における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株および該ベ
クターとしてバクテリオファージλベクターを用い、フ
ァージ・コートへのイン・ビトロのパッケージングの段
階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られたファージ・
パッケージング抽出物によって行なわれることを特徴と
する、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除く。）の
ゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子
における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株および該ベ
クターとして少なくとも30kbの大きさのバクテリオファ
ージλベクターを用い、ヘッド−ツー−テイル・アレン
ジメントで該ベクターの少なくとも３コピーを哺乳類の
ゲノムに組込ませ、ファージ・コートへのイン・ビトロ
のパッケージングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株か
ら得られたファージ・パッケージング抽出物によって行
なわれること、および遺伝子導入した哺乳動物の細胞ま
たは哺乳類の細胞から単離されたDNAを、ベクター内に
切断部位をもたないが平均サイズが10kb以下の断片を生
成しうるような哺乳類のゲノム内に数多くの切断部位を
もつXbaＩなどの制限酵素を用いて断片化し、得られた
断片をそれらのサイズの違いに基づいて分離し、そして
ベクターを含む大きい断片を収集することにより予備精
製することを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但
し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ
以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺
乳類のゲノムに組込まれたベクターがベクター内にない
制限酵素の切断部位に囲まれているプラスミドベクター
であり、および該制限酵素および閉環（ring closure）
によって遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の
細胞から単離したDNAを断片化することにより該ベクタ
ーを回収することを特徴とする、ベクターにより哺乳類
（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１または
それ以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方
法、および、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺
乳類のゲノムに組込まれたベクターが、平均サイズ20kb
以上の断片を生成しうるような哺乳類のゲノム内に少数
の切断部位をもつNotＩなどの制限酵素のベクター内に
はない切断部位に囲まれている、10kb以下のサイズのプ
ラスミドベクターであり、遺伝子導入した哺乳動物の細
胞または哺乳類の細胞からDNAを、該制限酵素を用いて
断片化し、得られた断片をそれらのサイズの違いに基づ
いて分離し、そしてベクターを含む小さい断片を収集す
ることにより予備精製することを特徴とする、ベクター
により哺乳類（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入さ
れた１またはそれ以上のマーカー遺伝子における変異を
検出する方法に関する。
およびベクターとしてバクテリオファージベクターを用
い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケージン
グの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られたファ
ージ・パッケージング抽出物によって行なわれることを
特徴とする、DNA配列を含有するベクターを宿主細菌中
で増殖させるDNA配列のレスキューおよびクローニング
の方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、および
マーカー遺伝子の発現を試験することからなり、該宿主
細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用いることを特
徴とする、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除
く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカ
ー遺伝子における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株および該ベ
クターとしてバクテリオファージλベクターを用い、フ
ァージ・コートへのイン・ビトロのパッケージングの段
階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られたファージ・
パッケージング抽出物によって行なわれることを特徴と
する、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除く。）の
ゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子
における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株および該ベ
クターとして少なくとも30kbの大きさのバクテリオファ
ージλベクターを用い、ヘッド−ツー−テイル・アレン
ジメントで該ベクターの少なくとも３コピーを哺乳類の
ゲノムに組込ませ、ファージ・コートへのイン・ビトロ
のパッケージングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株か
ら得られたファージ・パッケージング抽出物によって行
なわれること、および遺伝子導入した哺乳動物の細胞ま
たは哺乳類の細胞から単離されたDNAを、ベクター内に
切断部位をもたないが平均サイズが10kb以下の断片を生
成しうるような哺乳類のゲノム内に数多くの切断部位を
もつXbaＩなどの制限酵素を用いて断片化し、得られた
断片をそれらのサイズの違いに基づいて分離し、そして
ベクターを含む大きい断片を収集することにより予備精
製することを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但
し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ
以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方法、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺
乳類のゲノムに組込まれたベクターがベクター内にない
制限酵素の切断部位に囲まれているプラスミドベクター
であり、および該制限酵素および閉環（ring closure）
によって遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の
細胞から単離したDNAを断片化することにより該ベクタ
ーを回収することを特徴とする、ベクターにより哺乳類
（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１または
それ以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方
法、および、 遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞か
らDNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺
乳類のゲノムに組込まれたベクターが、平均サイズ20kb
以上の断片を生成しうるような哺乳類のゲノム内に少数
の切断部位をもつNotＩなどの制限酵素のベクター内に
はない切断部位に囲まれている、10kb以下のサイズのプ
ラスミドベクターであり、遺伝子導入した哺乳動物の細
胞または哺乳類の細胞からDNAを、該制限酵素を用いて
断片化し、得られた断片をそれらのサイズの違いに基づ
いて分離し、そしてベクターを含む小さい断片を収集す
ることにより予備精製することを特徴とする、ベクター
により哺乳類（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入さ
れた１またはそれ以上のマーカー遺伝子における変異を
検出する方法に関する。
最近、本発明者らは、それぞれの細胞中にlacZの変異
標的遺伝子を備えた、１またはそれ以上のコピーのバク
テリオファージλベクターをもつトランスジェニックマ
ウスの作製に成功した。少なくとも３またはそれ以上の
タンデムに組込まれたベクターをもつマウスの全ゲノム
DNAからファージ粒子中へのイン・ビトロのパッケージ
ングは理論上可能である。第一に、しかしながら、ベク
ターが効率よく回収されないことが再び判明した。
標的遺伝子を備えた、１またはそれ以上のコピーのバク
テリオファージλベクターをもつトランスジェニックマ
ウスの作製に成功した。少なくとも３またはそれ以上の
タンデムに組込まれたベクターをもつマウスの全ゲノム
DNAからファージ粒子中へのイン・ビトロのパッケージ
ングは理論上可能である。第一に、しかしながら、ベク
ターが効率よく回収されないことが再び判明した。
本発明は、この問題に対する解決法を提供するもので
あり、そして一般的には、メチル化されたDNAを効率よ
くレスキューし、クローニングする方法を提供するもの
である。さらに詳しくは、組込まれたベクターを、遺伝
子導入した哺乳動物の異なった器官および組織の全染色
体DNAから、または培養された哺乳類の細胞系の全染色
体DNAから効率よくレスキューする方法を提供するもの
である（哺乳類細胞系は、とくにベクターを用いてトラ
ンスフェクションすることによってえられた細胞系、さ
らに詳しくは、その細胞系がえられた方法には関係なく
ベクターを含有するいかなる哺乳類細胞系をも意味す
る）。
あり、そして一般的には、メチル化されたDNAを効率よ
くレスキューし、クローニングする方法を提供するもの
である。さらに詳しくは、組込まれたベクターを、遺伝
子導入した哺乳動物の異なった器官および組織の全染色
体DNAから、または培養された哺乳類の細胞系の全染色
体DNAから効率よくレスキューする方法を提供するもの
である（哺乳類細胞系は、とくにベクターを用いてトラ
ンスフェクションすることによってえられた細胞系、さ
らに詳しくは、その細胞系がえられた方法には関係なく
ベクターを含有するいかなる哺乳類細胞系をも意味す
る）。
本発明は、組込まれたベクターが試験されたマウスす
べてにおいて完全にメチル化されたという、さらなる研
究からえられた洞察に基づいている。言い換えれば、試
験されたトランスジェニックマウスの系統の器官および
組織において、調べられたベクター中のシトシン残基が
すべて５−メチル基と共有結合していることがわかっ
た。特定の形態のメチル化が、細菌にいわゆる宿主制限
を行なわせる（ラレイら（1986年））(14)。つまり、取
り込まれるDNA（たとえば、バクテリオファージλベク
ターなど）が宿主をコントロールし、最終的には死滅さ
せる（これによって溶菌プラークが生じる）機会をえる
前に、それを防御するためにDNAは断片に切断される。
この現象は、実際にえられたプラークの数の少なさによ
って説明がつくと考えられた。従来の市販されているフ
ァージ・パッケージング抽出物は細菌からえられ、細菌
はまた宿主としてファージをプレーティングするために
も必要なので、両方の目的のために宿主制限のない細菌
株を用いて操作することを決めた。このために、ファー
ジ・パッケージング抽出物はストラタジーン（Stratage
ne）（ストラタジーン・クローニング・システムズ（St
ratagene Cloning Systems）、アメリカ合衆国、92037
カリフォルニア州、ラジョラ、ノース トレイ ピネス
ロード11099（11099 North Torrey Pines Road,LaJol
la,CA 92037 USA））よりえられた。ストラタジーンは
他の会社と異なり、我々の実験に応じた、おそらく宿主
制限のない大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケー
ジング抽出物を供給している。後者はこの会社のパンフ
レットや手引書に明示的に記載されたことはなかった。
しかしながら、プレートティング用には、宿主制限陰性
株、たとえば大腸菌Ｃ株をその抽出物とともに供給せ
ず、たまたま宿主制限のできる他の株を供給している。
宿主制限陰性の大腸菌株からえられたパッケージング抽
出物を同一かもしくは類似点のあるプレーティング用の
宿主制限陰性株と組合わせて用いることの必要性は、メ
チル化されたDNAをレスキューするために必要なことと
して報告されたことはなかった。このことは、メチル化
された哺乳類のDNAをクローニングするシステムが現在
ないことから明らかである。本発明をもたらした研究で
用いられた大腸菌Ｃ株は、それ自体公知であり、たとえ
ばファバゲン・コレクション（Phabagen collection）
（ユトレヒト（Utrecht）大学、デパートメント・オブ
・モレキュラー・セル・バイオロジー（Department of
Molecular Cell Biology）、ティビー ユトレヒト350
8、ピー オー ボックス80.056、パデゥラン８（Padua
laan 8,P.O.Box 80.056,3508 TB Utrecht））よりえら
える。ガンマ線によって変異株がえられ、それには完全
なlacZ遺伝子は欠損していた。これは本願明細書に記載
されている実験の目的のために必要であった。なぜな
ら、パッケージングされるベクター中のlacZを不活性に
するためには他の選択は不可能だからである。
べてにおいて完全にメチル化されたという、さらなる研
究からえられた洞察に基づいている。言い換えれば、試
験されたトランスジェニックマウスの系統の器官および
組織において、調べられたベクター中のシトシン残基が
すべて５−メチル基と共有結合していることがわかっ
た。特定の形態のメチル化が、細菌にいわゆる宿主制限
を行なわせる（ラレイら（1986年））(14)。つまり、取
り込まれるDNA（たとえば、バクテリオファージλベク
ターなど）が宿主をコントロールし、最終的には死滅さ
せる（これによって溶菌プラークが生じる）機会をえる
前に、それを防御するためにDNAは断片に切断される。
この現象は、実際にえられたプラークの数の少なさによ
って説明がつくと考えられた。従来の市販されているフ
ァージ・パッケージング抽出物は細菌からえられ、細菌
はまた宿主としてファージをプレーティングするために
も必要なので、両方の目的のために宿主制限のない細菌
株を用いて操作することを決めた。このために、ファー
ジ・パッケージング抽出物はストラタジーン（Stratage
ne）（ストラタジーン・クローニング・システムズ（St
ratagene Cloning Systems）、アメリカ合衆国、92037
カリフォルニア州、ラジョラ、ノース トレイ ピネス
ロード11099（11099 North Torrey Pines Road,LaJol
la,CA 92037 USA））よりえられた。ストラタジーンは
他の会社と異なり、我々の実験に応じた、おそらく宿主
制限のない大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケー
ジング抽出物を供給している。後者はこの会社のパンフ
レットや手引書に明示的に記載されたことはなかった。
しかしながら、プレートティング用には、宿主制限陰性
株、たとえば大腸菌Ｃ株をその抽出物とともに供給せ
ず、たまたま宿主制限のできる他の株を供給している。
宿主制限陰性の大腸菌株からえられたパッケージング抽
出物を同一かもしくは類似点のあるプレーティング用の
宿主制限陰性株と組合わせて用いることの必要性は、メ
チル化されたDNAをレスキューするために必要なことと
して報告されたことはなかった。このことは、メチル化
された哺乳類のDNAをクローニングするシステムが現在
ないことから明らかである。本発明をもたらした研究で
用いられた大腸菌Ｃ株は、それ自体公知であり、たとえ
ばファバゲン・コレクション（Phabagen collection）
（ユトレヒト（Utrecht）大学、デパートメント・オブ
・モレキュラー・セル・バイオロジー（Department of
Molecular Cell Biology）、ティビー ユトレヒト350
8、ピー オー ボックス80.056、パデゥラン８（Padua
laan 8,P.O.Box 80.056,3508 TB Utrecht））よりえら
える。ガンマ線によって変異株がえられ、それには完全
なlacZ遺伝子は欠損していた。これは本願明細書に記載
されている実験の目的のために必要であった。なぜな
ら、パッケージングされるベクター中のlacZを不活性に
するためには他の選択は不可能だからである。
えられた大腸菌lacZ-株を使って、約9000のベクター
がトランスジェニックマウスの系統の約１μｇの全ゲノ
ムDNAから回収された。プラークが青色をしていること
は、これらのすべてのばあいにおいてlacZ遺伝子は変異
していないことを示していた。
がトランスジェニックマウスの系統の約１μｇの全ゲノ
ムDNAから回収された。プラークが青色をしていること
は、これらのすべてのばあいにおいてlacZ遺伝子は変異
していないことを示していた。
このファージ・パッケージング効率は、全染色体DNA
からこれまでにえられたものよりはるかにすぐれてお
り、原則として誘導変異の研究に充分である。
からこれまでにえられたものよりはるかにすぐれてお
り、原則として誘導変異の研究に充分である。
本発明の本質は、宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用いる
ことにあると同時に、多数のベクターのコピーが哺乳類
のゲノム中にヘッド−ツー−テイル・アレンジメントで
組込まれるということが高頻度のファージ・パッケージ
ングの助けとなることがさらにわかっている。前記の結
果を可能にするトランスジェニックマウスの系統（20.
2）において、このコピー数は約80であることがわかっ
た。このことは問題のマウスのゲノムが、アディショナ
ル（additional）な400万のDNA塩基対を含有することを
意味している。また、他の系統を用いてベクターが多数
のコピーに組込まれていることが証明された。たとえ
ば、系統40.6は約40コピーのベクターをもつ。かなりア
ディショナルなDNAの安定な遺伝性はこれまでに報告さ
れていない。
ことにあると同時に、多数のベクターのコピーが哺乳類
のゲノム中にヘッド−ツー−テイル・アレンジメントで
組込まれるということが高頻度のファージ・パッケージ
ングの助けとなることがさらにわかっている。前記の結
果を可能にするトランスジェニックマウスの系統（20.
2）において、このコピー数は約80であることがわかっ
た。このことは問題のマウスのゲノムが、アディショナ
ル（additional）な400万のDNA塩基対を含有することを
意味している。また、他の系統を用いてベクターが多数
のコピーに組込まれていることが証明された。たとえ
ば、系統40.6は約40コピーのベクターをもつ。かなりア
ディショナルなDNAの安定な遺伝性はこれまでに報告さ
れていない。
しかしながら、疑いのある物質を少量投与した異なる
器官および組織における変異頻度の信頼できる結果をえ
るためには、9000プラークをこえるテストを行なう必要
がある。前述のごとく、より多くのDNAを用いるファー
ジ・パッケージング反応のスケールアップは高価であ
る。例をとると、たとえばある疑いのある物質は変異頻
度を1:100,000（自然変異の頻度）から1:50,000に増加
させる。理論上はえられた効率を基準にすると、ファー
ジ・パッケージング実験は５μｇのマウスの全ゲノムDN
Aを用いて行なわねばならないだろう。このことから１
つの変異体（１つの着色されないプラーク）をえるだろ
う。これでは実際には不充分であることは明白であろ
う。このような低い変異頻度の厳密な決定には少なくと
も500,000から1,000,000のプラークが観察されるべきで
あろう。
器官および組織における変異頻度の信頼できる結果をえ
るためには、9000プラークをこえるテストを行なう必要
がある。前述のごとく、より多くのDNAを用いるファー
ジ・パッケージング反応のスケールアップは高価であ
る。例をとると、たとえばある疑いのある物質は変異頻
度を1:100,000（自然変異の頻度）から1:50,000に増加
させる。理論上はえられた効率を基準にすると、ファー
ジ・パッケージング実験は５μｇのマウスの全ゲノムDN
Aを用いて行なわねばならないだろう。このことから１
つの変異体（１つの着色されないプラーク）をえるだろ
う。これでは実際には不充分であることは明白であろ
う。このような低い変異頻度の厳密な決定には少なくと
も500,000から1,000,000のプラークが観察されるべきで
あろう。
本発明の好ましい実施態様によれば、この問題は、も
しそれ以外の染色体DNAから分離されうるならば、それ
以外のゲノムに対するベクターの比率はずっと好ましい
値となる、という考えに基づいた予備精製を行なうこと
で解決された。このことは、はるかに多くのベクターが
同量のファージ・パッケージング抽出物を用いて回収さ
れうることを意味している。しかし問題は、組込まれた
ベクターをそれ以外の染色体DNAからどのようにして分
離するかということであった。
しそれ以外の染色体DNAから分離されうるならば、それ
以外のゲノムに対するベクターの比率はずっと好ましい
値となる、という考えに基づいた予備精製を行なうこと
で解決された。このことは、はるかに多くのベクターが
同量のファージ・パッケージング抽出物を用いて回収さ
れうることを意味している。しかし問題は、組込まれた
ベクターをそれ以外の染色体DNAからどのようにして分
離するかということであった。
もし約50,000の塩基対の長さを有するベクターが、哺
乳類の全ゲノムDNAをしばしば切断するある制限酵素に
対して認識部位をもたないならば、たとえば30コピーの
タンデムな組込み後、約150万の塩基対の断片がえられ
ると考えられた。しばしば哺乳類DNAを切断する制限酵
素は平均サイズが約5000である塩基対を有する断片を生
ずるのでそのような大きなフラグメントは簡単な分離方
法で迅速に精製されうる。
乳類の全ゲノムDNAをしばしば切断するある制限酵素に
対して認識部位をもたないならば、たとえば30コピーの
タンデムな組込み後、約150万の塩基対の断片がえられ
ると考えられた。しばしば哺乳類DNAを切断する制限酵
素は平均サイズが約5000である塩基対を有する断片を生
ずるのでそのような大きなフラグメントは簡単な分離方
法で迅速に精製されうる。
発明者らによって用いられたベクターは酵素XbaＩに
対する認識部位を持っていなかった。多数の入手可能な
トランスジェニックマウスにおいて、ベクターはヘッド
−ツー−テイルで40〜80コピー組込まれることがわかっ
た。実際に、XbaＩで切断後100万以上の塩基対の断片
は、それ以外の（断片化した）ゲノムDNAから容易に分
離できることがわかった。同様な原理は他の方法などに
も使用できると考えられた。ゲノム（たとえば約5000以
下の塩基対を有する）中に組込まれたプラスミドは、そ
れらがプラスミド固有の制限酵素の認識部位によって囲
まれているとすれば簡単に全ゲノムDNAからレスキュー
されうる。制限酵素（たとえば、NotＩ）のまれな認識
部位がベクターの左右に適用されれば、今回のばあい、
DNA断片を含有するプラスミドのサイズが正確に小さい
ことに基づいて、予備精製が可能である。
対する認識部位を持っていなかった。多数の入手可能な
トランスジェニックマウスにおいて、ベクターはヘッド
−ツー−テイルで40〜80コピー組込まれることがわかっ
た。実際に、XbaＩで切断後100万以上の塩基対の断片
は、それ以外の（断片化した）ゲノムDNAから容易に分
離できることがわかった。同様な原理は他の方法などに
も使用できると考えられた。ゲノム（たとえば約5000以
下の塩基対を有する）中に組込まれたプラスミドは、そ
れらがプラスミド固有の制限酵素の認識部位によって囲
まれているとすれば簡単に全ゲノムDNAからレスキュー
されうる。制限酵素（たとえば、NotＩ）のまれな認識
部位がベクターの左右に適用されれば、今回のばあい、
DNA断片を含有するプラスミドのサイズが正確に小さい
ことに基づいて、予備精製が可能である。
ベクターの予備精製の別法としては、それぞれベクタ
ー−クラスター（vector−cluster）をそのゲノムの異
なった部位に含む異なったマウスの系統を交配させるこ
とである。後者はチェックされなかったが、マウスゲノ
ムに注入されたDNAの組込みは不規則であり、それゆえ
に同じ染色体上同じ部位にベクター−クラスターをもつ
２つの異なったトランスジェニックマウスがえられると
いうことはほとんど起こりそうにない。その交配の結
果、ゲノム中の異なった部位に多数のベクター−クラス
ターをもつ１つのマウスの系統がえられるであろう。そ
のような「マルチ−ローカス（multi−locus）」の系統
のにおいてはるかに多くのベクターをそれぞれのマウス
細胞からレスキューすることができ、したがって、レス
キューの頻度はより高くなる。大腸菌Ｃ株のような宿主
制限陰性の大腸菌株の使用に完全に左右されるレスキュ
ーの効率はこの方法では変化しない。
ー−クラスター（vector−cluster）をそのゲノムの異
なった部位に含む異なったマウスの系統を交配させるこ
とである。後者はチェックされなかったが、マウスゲノ
ムに注入されたDNAの組込みは不規則であり、それゆえ
に同じ染色体上同じ部位にベクター−クラスターをもつ
２つの異なったトランスジェニックマウスがえられると
いうことはほとんど起こりそうにない。その交配の結
果、ゲノム中の異なった部位に多数のベクター−クラス
ターをもつ１つのマウスの系統がえられるであろう。そ
のような「マルチ−ローカス（multi−locus）」の系統
のにおいてはるかに多くのベクターをそれぞれのマウス
細胞からレスキューすることができ、したがって、レス
キューの頻度はより高くなる。大腸菌Ｃ株のような宿主
制限陰性の大腸菌株の使用に完全に左右されるレスキュ
ーの効率はこの方法では変化しない。
未処理およびENU処理のトランスジェニックマウス
（系統20.2）の予備精製されたベクター含有ゲノムDNA
を用いたファージ・パッケージングの実験は、DNAのサ
ンプルあたり（約100μｇのマウスの全ゲノムDNA）約1,
400,000プラークが１回の実験でえられることを示した
（ENUはエチルニトロソウレアを示す）。
（系統20.2）の予備精製されたベクター含有ゲノムDNA
を用いたファージ・パッケージングの実験は、DNAのサ
ンプルあたり（約100μｇのマウスの全ゲノムDNA）約1,
400,000プラークが１回の実験でえられることを示した
（ENUはエチルニトロソウレアを示す）。
本発明は、メチル化されたベクターおよびその中に含
まれるマーカー遺伝子のレスキューおよびクローニング
に宿主制限陰性の宿主の使用が必要とされる、ベクター
により哺乳動物のゲノム中に導入されている１またはそ
れ以上のマーカー遺伝子中の変異を検出する方法として
述べられてきた。しかしながら、本発明はメチル化され
ているかもしれないDNAのレスキューおよびクローニン
グのいかなる方法にも一般的に適用可能である。ゲノム
DNAの断片のクローニングの常法では、全く宿主制限の
ない宿主を用いない。その結果としてクローン化された
断片のライブラリーは完全ではない、すなわち哺乳類の
ゲノムの高度にメチル化された部分を含まないだろう。
本発明は、結果としてゲノムDNAの断片のより完全な収
集がえられるような哺乳類のDNAのレスキューおよびク
ローニングに宿主制限陰性の宿主を用いることによって
この問題を解決するものである。
まれるマーカー遺伝子のレスキューおよびクローニング
に宿主制限陰性の宿主の使用が必要とされる、ベクター
により哺乳動物のゲノム中に導入されている１またはそ
れ以上のマーカー遺伝子中の変異を検出する方法として
述べられてきた。しかしながら、本発明はメチル化され
ているかもしれないDNAのレスキューおよびクローニン
グのいかなる方法にも一般的に適用可能である。ゲノム
DNAの断片のクローニングの常法では、全く宿主制限の
ない宿主を用いない。その結果としてクローン化された
断片のライブラリーは完全ではない、すなわち哺乳類の
ゲノムの高度にメチル化された部分を含まないだろう。
本発明は、結果としてゲノムDNAの断片のより完全な収
集がえられるような哺乳類のDNAのレスキューおよびク
ローニングに宿主制限陰性の宿主を用いることによって
この問題を解決するものである。
したがって広い意味では、本発明は、前記DNA配列を
含有するベクターが適当な宿主細菌中で増殖するよう
な、DNA配列のレスキューおよびクローニングの方法を
提供するものであり、宿主細菌として宿主制限のない大
腸菌Ｃ株を使用することを特徴とする。
含有するベクターが適当な宿主細菌中で増殖するよう
な、DNA配列のレスキューおよびクローニングの方法を
提供するものであり、宿主細菌として宿主制限のない大
腸菌Ｃ株を使用することを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様は、ベクターとして関係す
る宿主細菌に適したクローニング・ビークルであるバク
テリオファージベクターを用い、ファージ・コートへの
イン・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のない
大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケージング抽出
物によって行なわれることで特徴づけられる。
る宿主細菌に適したクローニング・ビークルであるバク
テリオファージベクターを用い、ファージ・コートへの
イン・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のない
大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケージング抽出
物によって行なわれることで特徴づけられる。
このほかの、つぎに好ましい実施態様は、ベクターと
して、関係する宿主細菌に適したクローニング・ビーク
ルであるプラスミドベクターを用いることを特徴として
いる。
して、関係する宿主細菌に適したクローニング・ビーク
ルであるプラスミドベクターを用いることを特徴として
いる。
DNA配列を含有するベクターを適当な宿主細菌中で増
殖させるDNA配列のレスキューおよびクローニングの好
ましい方法は、宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ
株およびベクターとしてバクテリオファージλベクター
を用い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケー
ジングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえられた
ファージ・パッケージング抽出物によって行なわれるこ
とを特徴としている。さらに、宿主細菌として宿主制限
のないおよびファージ・パッケージング抽出物の起源と
して大腸菌Ｃ株を使う。
殖させるDNA配列のレスキューおよびクローニングの好
ましい方法は、宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ
株およびベクターとしてバクテリオファージλベクター
を用い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケー
ジングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえられた
ファージ・パッケージング抽出物によって行なわれるこ
とを特徴としている。さらに、宿主細菌として宿主制限
のないおよびファージ・パッケージング抽出物の起源と
して大腸菌Ｃ株を使う。
本発明はさらにベクターによって哺乳類のゲノムに導
入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子における変
異を検出する方法を提供する。この方法は、遺伝子導入
した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離
すること、そのDNAからベクターを回収すること、少な
くとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当
な宿主細菌中でベクターを増殖させること、およびマー
カー遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌と
して宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用いることを特徴とす
る。
入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子における変
異を検出する方法を提供する。この方法は、遺伝子導入
した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離
すること、そのDNAからベクターを回収すること、少な
くとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当
な宿主細菌中でベクターを増殖させること、およびマー
カー遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌と
して宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用いることを特徴とす
る。
本発明の好ましい実施態様は、ベクターとして、関係
する宿主細菌に適したクローニング・ビークルであるバ
クテリオファージベクターを用い、ファージ・コートへ
のイン・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のな
い大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケージング抽
出物によって行なわれる。
する宿主細菌に適したクローニング・ビークルであるバ
クテリオファージベクターを用い、ファージ・コートへ
のイン・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のな
い大腸菌Ｃ株からえられたファージ・パッケージング抽
出物によって行なわれる。
本発明の他の方法は、ベクターとして宿主細菌に適し
たクローニング・ビークルであるプラスミドベクターを
用いることで特徴づけられる。
たクローニング・ビークルであるプラスミドベクターを
用いることで特徴づけられる。
さらに、本発明はベクターによって哺乳類のゲノムに
導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子における
変異を検出する方法を提供する。その方法は、遺伝子導
入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から該DNAを
単離すること、ベクターを前記DNAから回収すること、
少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している
適当な宿主細菌中でその該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株およびベクタ
ーとしてバクテリオファージλベクターを用い、ファー
ジ・コートへのイン・ビトロのパッケージングの段階が
宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえたファージ・パッケー
ジング抽出物によって行われることを特徴とする。
導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子における
変異を検出する方法を提供する。その方法は、遺伝子導
入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から該DNAを
単離すること、ベクターを前記DNAから回収すること、
少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している
適当な宿主細菌中でその該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株およびベクタ
ーとしてバクテリオファージλベクターを用い、ファー
ジ・コートへのイン・ビトロのパッケージングの段階が
宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえたファージ・パッケー
ジング抽出物によって行われることを特徴とする。
本発明のきわめて好ましい実施態様は、遺伝子導入し
た哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDN
Aを、ベクター内に切断部位をもたない制限酵素を用い
て該DNAを断片化し、サイズにおけるちがいなどの適当
な基準をもとにえられた断片を分離し、およびベクター
を含有する断片を収集することにより予備精製し、その
のちそのベクターを予備精製されたDNAから回収するこ
とで特徴づけられる。
た哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDN
Aを、ベクター内に切断部位をもたない制限酵素を用い
て該DNAを断片化し、サイズにおけるちがいなどの適当
な基準をもとにえられた断片を分離し、およびベクター
を含有する断片を収集することにより予備精製し、その
のちそのベクターを予備精製されたDNAから回収するこ
とで特徴づけられる。
本発明のベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除
く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカ
ー遺伝子の変異を検出する好ましい方法は、遺伝子導入
した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離
すること、該DNAからベクターを回収すること、少なく
とも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当な
宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、およびマー
カー遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌と
して宿主制限のない大腸菌Ｃ株およびベクターとして少
なくとも30kbの大きさのバクテリオファージλベクター
を用い、ヘッド−ツー−テイル・アレンジメントで該ベ
クターの少なくとも３コピーを哺乳類のゲノムに組込ま
せ、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケージン
グの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえられたファ
ージ・パッケージング抽出物によって行なわれること、
および遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細
胞から単離されたDNAを、ベクター内に切断部位をもた
ないがそれが平均サイズが10kb以下の断片を生成しうる
ような哺乳類のゲノム内に数多くの切断部位をもつXba
Ｉなどの制限酵素を用いて該DNAを断片化し、えられた
断片をそれらのサイズのちがいに基づいて分離し、そし
てベクターを含む大きい断片を収集することにより予備
精製することを特徴とする。バクテリオファージλベク
ターの少なくとも10コピーが哺乳類のゲノム中にヘッド
−ツー−テイル・アレンジメントで組込まれることがよ
り好ましい。
く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカ
ー遺伝子の変異を検出する好ましい方法は、遺伝子導入
した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離
すること、該DNAからベクターを回収すること、少なく
とも１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当な
宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、およびマー
カー遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌と
して宿主制限のない大腸菌Ｃ株およびベクターとして少
なくとも30kbの大きさのバクテリオファージλベクター
を用い、ヘッド−ツー−テイル・アレンジメントで該ベ
クターの少なくとも３コピーを哺乳類のゲノムに組込ま
せ、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケージン
グの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株からえられたファ
ージ・パッケージング抽出物によって行なわれること、
および遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細
胞から単離されたDNAを、ベクター内に切断部位をもた
ないがそれが平均サイズが10kb以下の断片を生成しうる
ような哺乳類のゲノム内に数多くの切断部位をもつXba
Ｉなどの制限酵素を用いて該DNAを断片化し、えられた
断片をそれらのサイズのちがいに基づいて分離し、そし
てベクターを含む大きい断片を収集することにより予備
精製することを特徴とする。バクテリオファージλベク
ターの少なくとも10コピーが哺乳類のゲノム中にヘッド
−ツー−テイル・アレンジメントで組込まれることがよ
り好ましい。
ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除く。）のゲノ
ムに導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子にお
ける変異を検出する別の方法としては、遺伝子導入した
哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離する
こと、該DNAからベクターを回収すること、少なくとも
１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当な宿主
細菌中で該ベクターを増殖させること、およびマーカー
遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌として
宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺乳類のゲノムに組
込まれたベクターがベクター内にない制限酵素の切断部
位に囲まれているプラスミドベクターであり、および該
制限酵素および閉環によって遺伝子導入した哺乳動物の
細胞または哺乳類の細胞から単離したDNAを断片化する
ことにより該ベクターを回収することを特徴とする。そ
の例として、本発明はベクターにより哺乳類（但し、ヒ
トを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上の
マーカー遺伝子における変異を検出する方法、すなわち
遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から
DNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺乳
類（但し、ヒトを除く。）に組込まれたベクターが、平
均サイズ20kb以上の断片を生成しうるような哺乳類のゲ
ノム内に少数の切断部位をもつNotＩなどの制限酵素の
ベクター内にはない切断部位に囲まれている、10kb以下
のサイズのプラスミドベクターであり、遺伝子導入した
哺乳類動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDN
Aを、該制限酵素を用いて該DNAを断片化し、えられた断
片をそれらのサイズのちがいに基づいて分離し、そして
ベクターを含む小さい断片を収集することにより予備精
製することを特徴とする方法を提供する。
ムに導入された１またはそれ以上のマーカー遺伝子にお
ける変異を検出する別の方法としては、遺伝子導入した
哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞からDNAを単離する
こと、該DNAからベクターを回収すること、少なくとも
１つのマーカー遺伝子に関して欠損している適当な宿主
細菌中で該ベクターを増殖させること、およびマーカー
遺伝子の発現を試験することからなり、宿主細菌として
宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺乳類のゲノムに組
込まれたベクターがベクター内にない制限酵素の切断部
位に囲まれているプラスミドベクターであり、および該
制限酵素および閉環によって遺伝子導入した哺乳動物の
細胞または哺乳類の細胞から単離したDNAを断片化する
ことにより該ベクターを回収することを特徴とする。そ
の例として、本発明はベクターにより哺乳類（但し、ヒ
トを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上の
マーカー遺伝子における変異を検出する方法、すなわち
遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から
DNAを単離すること、該DNAからベクターを回収するこ
と、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関して欠損して
いる適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖させること、
およびマーカー遺伝子の発現を試験することからなり、
宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い、哺乳
類（但し、ヒトを除く。）に組込まれたベクターが、平
均サイズ20kb以上の断片を生成しうるような哺乳類のゲ
ノム内に少数の切断部位をもつNotＩなどの制限酵素の
ベクター内にはない切断部位に囲まれている、10kb以下
のサイズのプラスミドベクターであり、遺伝子導入した
哺乳類動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDN
Aを、該制限酵素を用いて該DNAを断片化し、えられた断
片をそれらのサイズのちがいに基づいて分離し、そして
ベクターを含む小さい断片を収集することにより予備精
製することを特徴とする方法を提供する。
この発明はクローニング・ビークルとしてバクテリオ
ファージλベクター、大腸菌Ｃ株などの宿主制限陰性の
大腸菌株から誘導されたパッケージ抽出物およびプレー
ティング用にそれと同一または同等の大腸菌を用いるこ
とによってメチル化されたDNAの効率のよいクローニン
グに直接適用されうる。自動的に続いておこる２番目の
主要な応用とは発癌性の疑いのある物質の試験を含むも
のである。疑いのある物質の効果は、処理後すぐ（たと
えば２〜３時間または数日後）に変異の頻度によって、
処理をした遺伝子導入した動物、たとえばマウスの異な
る器官および組織からえたDNAについて直接検討するこ
とができる。このためには高度な資質を備えたスタッフ
を必要としない。また、変異の性質は比較的簡単な方法
で決定することができる。なぜなら本システムでは変異
したlacZ遺伝子はすでにクローン化されているからであ
る。HPRTなどの内因性の遺伝子を研究するときは、変異
した遺伝子を純粋な状態でえることが第１に必要なこと
である。このばあいは各プラークはlacZ遺伝子の小さな
レザバーであり、そのlacZ遺伝子はさらに容易に培養で
きる。lacZ遺伝子のヌクレオチド配列は現在では古典的
な方法を使って直接決定されうる。
ファージλベクター、大腸菌Ｃ株などの宿主制限陰性の
大腸菌株から誘導されたパッケージ抽出物およびプレー
ティング用にそれと同一または同等の大腸菌を用いるこ
とによってメチル化されたDNAの効率のよいクローニン
グに直接適用されうる。自動的に続いておこる２番目の
主要な応用とは発癌性の疑いのある物質の試験を含むも
のである。疑いのある物質の効果は、処理後すぐ（たと
えば２〜３時間または数日後）に変異の頻度によって、
処理をした遺伝子導入した動物、たとえばマウスの異な
る器官および組織からえたDNAについて直接検討するこ
とができる。このためには高度な資質を備えたスタッフ
を必要としない。また、変異の性質は比較的簡単な方法
で決定することができる。なぜなら本システムでは変異
したlacZ遺伝子はすでにクローン化されているからであ
る。HPRTなどの内因性の遺伝子を研究するときは、変異
した遺伝子を純粋な状態でえることが第１に必要なこと
である。このばあいは各プラークはlacZ遺伝子の小さな
レザバーであり、そのlacZ遺伝子はさらに容易に培養で
きる。lacZ遺伝子のヌクレオチド配列は現在では古典的
な方法を使って直接決定されうる。
疑いのある物質のエイムス・テストおよび化学構造に
加えて、前記のトランスジェニックマウスモデルは非常
にすぐれた第３次（イン・ビボ）テストたりえた（この
問題の議論についてはアシュバイおよびテナント（1988
年）の文献(4)ならびにハイ（1988年）の文献(7)を参照
されたい）。第３次テストとして本発明の導入は長期に
わたる動物テストおよび費用のかかる家畜病治療の病理
学者を利用する必要を減少させるので、出費の節約とな
る。また、本発明の導入は動物数を大巾に削減できると
同時に、使用する動物について不便さの減少を伴う。こ
れらの要因のすべては、本発明を発癌性の疑いのある化
学物質に対する第３次の短期テストの好ましい候補とす
る。
加えて、前記のトランスジェニックマウスモデルは非常
にすぐれた第３次（イン・ビボ）テストたりえた（この
問題の議論についてはアシュバイおよびテナント（1988
年）の文献(4)ならびにハイ（1988年）の文献(7)を参照
されたい）。第３次テストとして本発明の導入は長期に
わたる動物テストおよび費用のかかる家畜病治療の病理
学者を利用する必要を減少させるので、出費の節約とな
る。また、本発明の導入は動物数を大巾に削減できると
同時に、使用する動物について不便さの減少を伴う。こ
れらの要因のすべては、本発明を発癌性の疑いのある化
学物質に対する第３次の短期テストの好ましい候補とす
る。
第２に関連する重要な第３分野の応用は、前記のトラ
ンスジェニックマウスモデルを、ある種の物質の潜在的
な保護効果のテストに使用することである。潜在的な発
癌性物質に不必要に暴露されることを予防することはも
ちろん常に保護の段階より好ましいが、環境が避けられ
ない暴露をつくることは事実想像できる。単純な例の１
つとして、工業上の事故のばあいにおけるようにきわめ
て高い量の発癌性物質（または放射能、たとえば原子力
プラントなどでの事故における）を処理する人々が故意
に暴露されることがある。
ンスジェニックマウスモデルを、ある種の物質の潜在的
な保護効果のテストに使用することである。潜在的な発
癌性物質に不必要に暴露されることを予防することはも
ちろん常に保護の段階より好ましいが、環境が避けられ
ない暴露をつくることは事実想像できる。単純な例の１
つとして、工業上の事故のばあいにおけるようにきわめ
て高い量の発癌性物質（または放射能、たとえば原子力
プラントなどでの事故における）を処理する人々が故意
に暴露されることがある。
遺伝性物質の損傷に対する保護効果がある医薬の入手
可能性はここに救済をもたらしえた。しかしながら、こ
のような極端な状態は別として、遺伝性物質の損傷は常
に避けられるものではない。たとえば、多くの家屋にお
いてバックグラウンドの放射線量が極めて高いという指
標があれば保護が望まれる。一方ある緯度の地方では紫
外線量が大きいので、皮膚癌の危険性がかなり高くなっ
ている。より一般的には、（適度に）高い量のDNAを損
傷する要因に暴露されることがますます日常生活におい
て避けられない現実になっていくであろう。
可能性はここに救済をもたらしえた。しかしながら、こ
のような極端な状態は別として、遺伝性物質の損傷は常
に避けられるものではない。たとえば、多くの家屋にお
いてバックグラウンドの放射線量が極めて高いという指
標があれば保護が望まれる。一方ある緯度の地方では紫
外線量が大きいので、皮膚癌の危険性がかなり高くなっ
ている。より一般的には、（適度に）高い量のDNAを損
傷する要因に暴露されることがますます日常生活におい
て避けられない現実になっていくであろう。
この点についてはたとえば食品に保護する物質を加え
ることで保護をめざすのは適切である。ビタミンＣ、SO
D（過酸化ディスマターゼ）およびカロチンなどのある
種の食品の成分はたしかにDNAを損傷する物質に対して
およびその結果として癌に対しても保護するであろう、
という示唆はあるが、いまだかつて説得力をもって具体
的に示されたことはない。本発明によって、ある種の医
薬は、個体の遺伝性物質への損傷に対するその個体を保
護する能力のテストをされうる。これは実際に前述のト
ランスジェニックマウスを被検物質の存在および非存在
下にDNAを損傷する物質で処理することでができる。変
異の頻度を低下させるかたちでその有用な効果を問題の
動物の異なる器官および組織から多数のベクターを回収
することによってすばやく検出することができる。
ることで保護をめざすのは適切である。ビタミンＣ、SO
D（過酸化ディスマターゼ）およびカロチンなどのある
種の食品の成分はたしかにDNAを損傷する物質に対して
およびその結果として癌に対しても保護するであろう、
という示唆はあるが、いまだかつて説得力をもって具体
的に示されたことはない。本発明によって、ある種の医
薬は、個体の遺伝性物質への損傷に対するその個体を保
護する能力のテストをされうる。これは実際に前述のト
ランスジェニックマウスを被検物質の存在および非存在
下にDNAを損傷する物質で処理することでができる。変
異の頻度を低下させるかたちでその有用な効果を問題の
動物の異なる器官および組織から多数のベクターを回収
することによってすばやく検出することができる。
使用したバクテリオファージλベクターを第１図に示
す。このベクター、すなわちλ gt10 lacZは市販のバク
テリオファージλベクターgt10（プロメガ・ビー・ヴィ
（Promega B.V.）社製、エージェー・ライデン2300、ピ
ー・オー・ビー391（P.O.B.391,2300 AJ Leiden））のE
coRI部位でlacZ遺伝子をクローニングすることによって
えられた。第１図はEcoRI部位、BamHI部位およびXboＩ
部位のみを示す。そのベクターはXbaＩ酵素に対する認
識部位を持っていなかった。これは重要な特徴である。
なぜなら、この酵素は哺乳動物の全ゲノムDNA（total g
enomic mammal DNA）において平均5000塩基対に１個の
間隔で認識部位をもっているからである。この特性につ
いてはのちに論ずることにする。
す。このベクター、すなわちλ gt10 lacZは市販のバク
テリオファージλベクターgt10（プロメガ・ビー・ヴィ
（Promega B.V.）社製、エージェー・ライデン2300、ピ
ー・オー・ビー391（P.O.B.391,2300 AJ Leiden））のE
coRI部位でlacZ遺伝子をクローニングすることによって
えられた。第１図はEcoRI部位、BamHI部位およびXboＩ
部位のみを示す。そのベクターはXbaＩ酵素に対する認
識部位を持っていなかった。これは重要な特徴である。
なぜなら、この酵素は哺乳動物の全ゲノムDNA（total g
enomic mammal DNA）において平均5000塩基対に１個の
間隔で認識部位をもっているからである。この特性につ
いてはのちに論ずることにする。
前記のベクターを微注入により、BALB/CとDBA/2の雑種
第一代であるマウスCD2系統の生殖細胞系に移入した。
これら２つの系統は、インスティテュート・フォア・エ
クスペリメンタル・ジェロントロジー・ティ・エヌ・オ
ー（the Institute for Experimental Gerontology TN
O）のげっ歯類の群れの１部を形成する。ベクターの約1
50コピーを、CD2マウスの受精卵の２つの前核のうちの
１つに注入した。模範とするのに適切なプロトコールの
詳細な説明はホーガンら（1986年）(8)に記載されてい
る。
第一代であるマウスCD2系統の生殖細胞系に移入した。
これら２つの系統は、インスティテュート・フォア・エ
クスペリメンタル・ジェロントロジー・ティ・エヌ・オ
ー（the Institute for Experimental Gerontology TN
O）のげっ歯類の群れの１部を形成する。ベクターの約1
50コピーを、CD2マウスの受精卵の２つの前核のうちの
１つに注入した。模範とするのに適切なプロトコールの
詳細な説明はホーガンら（1986年）(8)に記載されてい
る。
第２図は、マウスのゲノムにおける組込み後のベクタ
ーの予期されるヘッド−ツー−テイル・アレンジメント
を示している。DNA断片のマウスの受精卵の核への微注
入ののち、これらは、通常、任意の場所でのヘッド−ツ
ー−テイル・アレンジメントで組込まれることが文献に
より知られている。第２図が示すように、ヘッド−ツー
−テイル組込みののち、必ず２つの不完全なコス部位が
１つの完全なコス部位を形成する。これは、きわめて重
要なことである。なぜなら、１つのベクターを回収する
ためには、必ず２つの完全なコス部位がベクターの両側
で認識され、パッケージング抽出物中の終末酵素により
切断されなければならないからである。そして、２つの
コス部位の間のファージDNAがファージ・コートにパッ
ケージングされた。したがって、ヘッド−ツー−テイル
・アレンジメントで組込まれた少なくとも３つのベクタ
ーが全ゲノムDNAから１つのベクターを回収するために
必要とされる。第２図に示されるように２またはそれ以
上のコピーにおけるヘッド−ツー−テイルの組込みのば
あい、マウスの全ゲノムDNAの切断ののち、１つの完全
なコス部位を含有する12.6kbのBamHI断片が形成されな
ければならない。さらに、それ以外に５つのBamHI断片
が形成される。EcoRIで切断することによって、３つの
断片がえられ、そのうちのひとつがlacZを示す。
ーの予期されるヘッド−ツー−テイル・アレンジメント
を示している。DNA断片のマウスの受精卵の核への微注
入ののち、これらは、通常、任意の場所でのヘッド−ツ
ー−テイル・アレンジメントで組込まれることが文献に
より知られている。第２図が示すように、ヘッド−ツー
−テイル組込みののち、必ず２つの不完全なコス部位が
１つの完全なコス部位を形成する。これは、きわめて重
要なことである。なぜなら、１つのベクターを回収する
ためには、必ず２つの完全なコス部位がベクターの両側
で認識され、パッケージング抽出物中の終末酵素により
切断されなければならないからである。そして、２つの
コス部位の間のファージDNAがファージ・コートにパッ
ケージングされた。したがって、ヘッド−ツー−テイル
・アレンジメントで組込まれた少なくとも３つのベクタ
ーが全ゲノムDNAから１つのベクターを回収するために
必要とされる。第２図に示されるように２またはそれ以
上のコピーにおけるヘッド−ツー−テイルの組込みのば
あい、マウスの全ゲノムDNAの切断ののち、１つの完全
なコス部位を含有する12.6kbのBamHI断片が形成されな
ければならない。さらに、それ以外に５つのBamHI断片
が形成される。EcoRIで切断することによって、３つの
断片がえられ、そのうちのひとつがlacZを示す。
第３図は、予想されたように、ベクターがヘッド−ツ
ー−テイル・アレンジメントで、複数のコピーとして組
込まれていることを示している。７ケースのうち２ケー
スにのみ、１つのコピーが存在していた。このことは生
まれたばかりのトランスジェニックマウスの尾からDNA
を単離し、サザン法を用いて分析することにより証明さ
れえた。DNAを常にBamHIおよび（それとは別に）EcoRI
で切断した。第３図のオートラジオグラムは、マウスの
系統33.4、34.1、35.2、35.3および35.5において、６番
目のBamHIバンドが明らかに存在することを示してい
る。その強度の差は（ヘッド−ツー−テイル）ベクター
が組込まれているコピーの数が大いに変化することを示
している。トランスジェニックマウス35.5においては、
コピーの数は３であった。
ー−テイル・アレンジメントで、複数のコピーとして組
込まれていることを示している。７ケースのうち２ケー
スにのみ、１つのコピーが存在していた。このことは生
まれたばかりのトランスジェニックマウスの尾からDNA
を単離し、サザン法を用いて分析することにより証明さ
れえた。DNAを常にBamHIおよび（それとは別に）EcoRI
で切断した。第３図のオートラジオグラムは、マウスの
系統33.4、34.1、35.2、35.3および35.5において、６番
目のBamHIバンドが明らかに存在することを示してい
る。その強度の差は（ヘッド−ツー−テイル）ベクター
が組込まれているコピーの数が大いに変化することを示
している。トランスジェニックマウス35.5においては、
コピーの数は３であった。
理論的には、純粋なベクター１μｇあたり109のパッ
ケージング効率から始めたばあい、１μｇの全ゲノムDN
Aから約17000のベクターをレスキューすることが可能と
なる（このばあいの純粋なベクターとは、本願で使用し
ている市販のパッケージング抽出物を用い、純粋なベク
ター１μｇに対して約109のパッケージング効率で増殖
された哺乳類の全ゲノム（約３×109）の長さで分割さ
れた、約５×104の長さのベクターである）。この計算
はまた、細胞ゲノム中に組込まれたベクターが３つのば
あいから始めることもできる（その結果、そのうちのひ
とつのみレスキューできる）。
ケージング効率から始めたばあい、１μｇの全ゲノムDN
Aから約17000のベクターをレスキューすることが可能と
なる（このばあいの純粋なベクターとは、本願で使用し
ている市販のパッケージング抽出物を用い、純粋なベク
ター１μｇに対して約109のパッケージング効率で増殖
された哺乳類の全ゲノム（約３×109）の長さで分割さ
れた、約５×104の長さのベクターである）。この計算
はまた、細胞ゲノム中に組込まれたベクターが３つのば
あいから始めることもできる（その結果、そのうちのひ
とつのみレスキューできる）。
しかしながら、理論的に予想されたこととは反対に、
細胞系のゲノムDNAに組込まれたλベクターについての
他の人々の結果から、パッケージング効率が全ゲノムDN
A1μｇ中２、３のプラークほどもないことがわかる。こ
の理由は明らかにされていない。組込まれたプラスミド
ベクターのレスキュー効率についても同じである。
細胞系のゲノムDNAに組込まれたλベクターについての
他の人々の結果から、パッケージング効率が全ゲノムDN
A1μｇ中２、３のプラークほどもないことがわかる。こ
の理由は明らかにされていない。組込まれたプラスミド
ベクターのレスキュー効率についても同じである。
異なった器官および組織の染色体DNAから直接マウス
ゲノムへ組込まれたベクターを回収する試みは、DNA1μ
ｇ中わずか２、３プラークという最初の例となった。し
たがって、我々がえた結果は、前記の他の人々による結
果と異なることはなかった。異った器官および組織から
えられた全染色体DNAを単離するためには、まずダウン
スホモジナイザー（Dounce homogenizer）で均質化し、
５倍容量のEDTA 100mM、Tris−Cl（pH7.5）50mM、NaCl
100mM、SDS 1％およびプロテイナーゼK 200μg/mlの液
中、65℃で一晩インキュベートした。そののち、その溶
液を1/5倍容量の8M酢酸カリウムと混合し、30分間氷上
で貯蔵した。クロロホルムで１回抽出したのち、１倍容
量の氷冷したエタノールでDNAを沈殿させた。えられたD
NAを70％エタノールですすぎ、そしてTE緩衝液（pH7.5
のTris−Cl10mM、EDTA 0.1mM）に溶解した。以下に述べ
るすべての実験例において、前記の単離方法にしたがっ
た。
ゲノムへ組込まれたベクターを回収する試みは、DNA1μ
ｇ中わずか２、３プラークという最初の例となった。し
たがって、我々がえた結果は、前記の他の人々による結
果と異なることはなかった。異った器官および組織から
えられた全染色体DNAを単離するためには、まずダウン
スホモジナイザー（Dounce homogenizer）で均質化し、
５倍容量のEDTA 100mM、Tris−Cl（pH7.5）50mM、NaCl
100mM、SDS 1％およびプロテイナーゼK 200μg/mlの液
中、65℃で一晩インキュベートした。そののち、その溶
液を1/5倍容量の8M酢酸カリウムと混合し、30分間氷上
で貯蔵した。クロロホルムで１回抽出したのち、１倍容
量の氷冷したエタノールでDNAを沈殿させた。えられたD
NAを70％エタノールですすぎ、そしてTE緩衝液（pH7.5
のTris−Cl10mM、EDTA 0.1mM）に溶解した。以下に述べ
るすべての実験例において、前記の単離方法にしたがっ
た。
イン・ビトロのパッケージングは、多くの研究室にお
ける標準的な方法で行なわれた（マニアティスら（1982
年））(12)。その方法はまず基本としてλベクター（本
願では、マウスの全ゲノムDNAに含まれるλベクターを
いう）をパッケージング抽出物と混合することにより、
ベクターはファージ・コートにパッケージングされる。
これを過剰量の細菌（宿主）と混合したのち、栄養培地
上で成長させる。当初、成長を許されていた細菌がすべ
てゆっくりと、しかし確実にファージに感染する。この
ことは、細菌が、一面にぎっしりと成長したところに多
くの透明な部分ができることで明らかになる。それぞれ
の透明な部分（最初は非常に小さいが、絶えず増え続
け、ついには全面に生えている細菌がすべて透明にな
る）が、１つのλベクターに相当する。本願のベクター
は細菌性遺伝子lacZを含んでいるので、透明な部分は青
色になるはずである。
ける標準的な方法で行なわれた（マニアティスら（1982
年））(12)。その方法はまず基本としてλベクター（本
願では、マウスの全ゲノムDNAに含まれるλベクターを
いう）をパッケージング抽出物と混合することにより、
ベクターはファージ・コートにパッケージングされる。
これを過剰量の細菌（宿主）と混合したのち、栄養培地
上で成長させる。当初、成長を許されていた細菌がすべ
てゆっくりと、しかし確実にファージに感染する。この
ことは、細菌が、一面にぎっしりと成長したところに多
くの透明な部分ができることで明らかになる。それぞれ
の透明な部分（最初は非常に小さいが、絶えず増え続
け、ついには全面に生えている細菌がすべて透明にな
る）が、１つのλベクターに相当する。本願のベクター
は細菌性遺伝子lacZを含んでいるので、透明な部分は青
色になるはずである。
しかしながら、ゲノムに組込まれたλベクターをパッ
ケージするために、このプロトコールによって試みがな
されるのは全く珍しいことである。ほとんどすべてのば
あいにおいて、ゲノムDNA断片が純粋なベクター中でク
ローニングされるときに、パッケージングが適用され
る。これらは市販されており、製造業者によって細菌上
で成長させ、そして比較的簡単な方法により純粋な形で
それから単離される。本願では、ベクターはマウスゲノ
ム中、１つ以上の箇所に組込まれるので、簡単な方法で
それから単離することはできない。
ケージするために、このプロトコールによって試みがな
されるのは全く珍しいことである。ほとんどすべてのば
あいにおいて、ゲノムDNA断片が純粋なベクター中でク
ローニングされるときに、パッケージングが適用され
る。これらは市販されており、製造業者によって細菌上
で成長させ、そして比較的簡単な方法により純粋な形で
それから単離される。本願では、ベクターはマウスゲノ
ム中、１つ以上の箇所に組込まれるので、簡単な方法で
それから単離することはできない。
マウスゲノムに組込まれたλベクターをいわゆるアイ
ソシゾマーな（isoschizomeric）制限酵素（両方とも同
じ部位を認識する２つの異った制限酵素、ただし、メチ
ル化されているばあいは除く）でさらに分析したとこ
ろ、テストされたそれぞれのマウスにおいて、λベクタ
ーは充分にメチル化されていることがわかった。第４図
のオートラジオグラムはトランスジェニックマウス35.3
からえられたDNAが、HpaIIではなく、MspＩで切断され
ていることを示している。MspＩと同じように、HpaIIも
またCCGG部位を認識する。ところが、もし中央のＣがメ
チル基を持っているなら、切断できるのはHpaIIでな
く、MspＩである。したがって、マウスゲノムに組込ま
れたλベクターは高度に（おそらく、まったく完全に）
メチル化されていることが結論とされる。この結論はメ
チル化感受性（methylation−sensitive）制限酵素Xho
Ｉを用いての結果により確認された。第４図で示される
ように、この酵素はHindIIIにより生成した約10kbのバ
ンドを完全に切断することはできない。第４図において
は、ＭはMspＩを、HpはHpaIIを、ＨはHindIIIをそして
ＸはXhoＩをあらわす。ほとんどの細菌株が、断片に切
断することにより無害な「外来性」DNAを挿入されうる
ということが文献により知られている。したがって、こ
れに関与する酵素は、ある決まったメチル化のパターン
による。このいわゆる宿主制限が、マウスDNAに組込ま
れた（および完全にメチル化されている）λベクターの
非常に低いパッケージング効率に因るものではないか、
と仮定されるが、この仮定は、異った大腸菌宿主、ひと
つは、まったく宿主制限のないもの（大腸菌Ｃ株）、そ
の他は、部分的にのみ宿主制限のあるもの（大腸菌K12
Y1090（MCR−A-、MCR−B+）および大腸菌K12 KA802（MC
R−A-、MCR−B-））を用いた実験により確かめた。大腸
菌Ｃ株は通常は、パッケージングの実験には使用されな
い。知られる限りでは、lacZ-変異株もまた知られてい
ない。我々の意図としては、変異体を着色されないプラ
ークとして認識することができるように、用いられる株
には完全なlacZ遺伝子が欠損していなければならない。
なぜなら、もし宿主細菌自体がlacZ+であるなら、すべ
てのプラークが変異体をも含めて、着色してしまうから
である。
ソシゾマーな（isoschizomeric）制限酵素（両方とも同
じ部位を認識する２つの異った制限酵素、ただし、メチ
ル化されているばあいは除く）でさらに分析したとこ
ろ、テストされたそれぞれのマウスにおいて、λベクタ
ーは充分にメチル化されていることがわかった。第４図
のオートラジオグラムはトランスジェニックマウス35.3
からえられたDNAが、HpaIIではなく、MspＩで切断され
ていることを示している。MspＩと同じように、HpaIIも
またCCGG部位を認識する。ところが、もし中央のＣがメ
チル基を持っているなら、切断できるのはHpaIIでな
く、MspＩである。したがって、マウスゲノムに組込ま
れたλベクターは高度に（おそらく、まったく完全に）
メチル化されていることが結論とされる。この結論はメ
チル化感受性（methylation−sensitive）制限酵素Xho
Ｉを用いての結果により確認された。第４図で示される
ように、この酵素はHindIIIにより生成した約10kbのバ
ンドを完全に切断することはできない。第４図において
は、ＭはMspＩを、HpはHpaIIを、ＨはHindIIIをそして
ＸはXhoＩをあらわす。ほとんどの細菌株が、断片に切
断することにより無害な「外来性」DNAを挿入されうる
ということが文献により知られている。したがって、こ
れに関与する酵素は、ある決まったメチル化のパターン
による。このいわゆる宿主制限が、マウスDNAに組込ま
れた（および完全にメチル化されている）λベクターの
非常に低いパッケージング効率に因るものではないか、
と仮定されるが、この仮定は、異った大腸菌宿主、ひと
つは、まったく宿主制限のないもの（大腸菌Ｃ株）、そ
の他は、部分的にのみ宿主制限のあるもの（大腸菌K12
Y1090（MCR−A-、MCR−B+）および大腸菌K12 KA802（MC
R−A-、MCR−B-））を用いた実験により確かめた。大腸
菌Ｃ株は通常は、パッケージングの実験には使用されな
い。知られる限りでは、lacZ-変異株もまた知られてい
ない。我々の意図としては、変異体を着色されないプラ
ークとして認識することができるように、用いられる株
には完全なlacZ遺伝子が欠損していなければならない。
なぜなら、もし宿主細菌自体がlacZ+であるなら、すべ
てのプラークが変異体をも含めて、着色してしまうから
である。
以下の方法はlacZ-である大腸菌Ｃ変異株をえるため
に行なった。すなわち、大腸菌Ｃ細菌をプレーティング
した栄養培地に変異原性があることで知られている25Gy
ガンマ放射線を照射した。栄養培地にはＸ−galを含有
させておいた。通常の細菌（「野生型」）は青色のコロ
ニーをつくるであろう。なぜなら、一般的に、細菌は活
性なlacZ遺伝子をもっているからである。ところが、la
cZの変異体は、もしあれば、無色になるだろう。この判
断基準に基づいて、２つの無色コロニーが、ガンマ線を
照射した細菌を用いたばあいに見つかった。そのコロニ
ーは、lacZを含有するλベクターの宿主として用いられ
たときに、青色のプラークを呈した。lacZを含まないλ
ベクターをプレーティングしたばあいには、無色のプラ
ークのみを呈し、それによって新たに発生した菌株の変
異体の存在を確認した。
に行なった。すなわち、大腸菌Ｃ細菌をプレーティング
した栄養培地に変異原性があることで知られている25Gy
ガンマ放射線を照射した。栄養培地にはＸ−galを含有
させておいた。通常の細菌（「野生型」）は青色のコロ
ニーをつくるであろう。なぜなら、一般的に、細菌は活
性なlacZ遺伝子をもっているからである。ところが、la
cZの変異体は、もしあれば、無色になるだろう。この判
断基準に基づいて、２つの無色コロニーが、ガンマ線を
照射した細菌を用いたばあいに見つかった。そのコロニ
ーは、lacZを含有するλベクターの宿主として用いられ
たときに、青色のプラークを呈した。lacZを含まないλ
ベクターをプレーティングしたばあいには、無色のプラ
ークのみを呈し、それによって新たに発生した菌株の変
異体の存在を確認した。
マウスDNAに組込まれたλベクターをパッケージング
したのち、多くの青色のプラークが大腸菌Ｃ株のばあい
にのみ見出された。トランスジェニックマウス系統20.2
の全ゲノムDNA1μｇからのλ gt10 lacZシャトルベクタ
ーのレスキュー効率を第１表に示す。
したのち、多くの青色のプラークが大腸菌Ｃ株のばあい
にのみ見出された。トランスジェニックマウス系統20.2
の全ゲノムDNA1μｇからのλ gt10 lacZシャトルベクタ
ーのレスキュー効率を第１表に示す。
最も高い効率、すなわちマウスの全ゲノムDNA1μｇ
中、約9000プラークという効率が、トランスジェニック
マウス20.2株のばあいにえられ、ベクターは約80コピー
に組込まれた。しかしこの値は、依然として理論上実現
可能なパッケージング効率よりも低い。しかしながら、
組織から単離された全ゲノムDNAの質はあらゆる計算の
もとになる精製されたDNAより何倍も低いと考えられ
る。それにもかかわらず、この一連の実験からえられる
結論は、全ゲノムDNAに組込まれたλベクターの効率の
よいパッケージングは確かに可能であるが、ただし、用
いられる宿主が宿主制限のない大腸菌株であるばあいの
みである、ということである。パッケージング抽出物自
体もまた、細菌からつくられるので、宿主制限陰性の大
腸菌株、たとえば大腸菌Ｃ株からできているパッケージ
ング抽出物のみ使用することが絶対に必要である。同じ
ことがメチル化されたDNAの遺伝子クローニングにもあ
てはまる。すなわち、宿主制限陰性の大腸菌株のみ、た
とえば大腸菌Ｃ株が、パッケージング抽出物の原料およ
びプレーティング用のいずれとしても用いることができ
る。
中、約9000プラークという効率が、トランスジェニック
マウス20.2株のばあいにえられ、ベクターは約80コピー
に組込まれた。しかしこの値は、依然として理論上実現
可能なパッケージング効率よりも低い。しかしながら、
組織から単離された全ゲノムDNAの質はあらゆる計算の
もとになる精製されたDNAより何倍も低いと考えられ
る。それにもかかわらず、この一連の実験からえられる
結論は、全ゲノムDNAに組込まれたλベクターの効率の
よいパッケージングは確かに可能であるが、ただし、用
いられる宿主が宿主制限のない大腸菌株であるばあいの
みである、ということである。パッケージング抽出物自
体もまた、細菌からつくられるので、宿主制限陰性の大
腸菌株、たとえば大腸菌Ｃ株からできているパッケージ
ング抽出物のみ使用することが絶対に必要である。同じ
ことがメチル化されたDNAの遺伝子クローニングにもあ
てはまる。すなわち、宿主制限陰性の大腸菌株のみ、た
とえば大腸菌Ｃ株が、パッケージング抽出物の原料およ
びプレーティング用のいずれとしても用いることができ
る。
前記のλを含有するトランスジェニックマウス株、な
らびに大腸菌Ｃ抽出物および株によりえられたパッケー
ジング効率をもとにして、回収されるベクターの総数を
できるだけ多く増加させるために試みがなされた。これ
に関して、限定する要因は、えられるゲノムDNAの量（2
mgのDNAがたとえばマウスの全肝臓から容易に単離でき
る）ではなく、ある特定の量のパッケージング抽出物に
加えることのできるDNAの量である。この市販の抽出物
の価格を考慮すると、スケール・アップは非常に費用の
かかることであり、本願のマウスモデルによる変異分析
におけるイン・ビトロのパッケージングの応用を商業的
に魅力のないものにしてしまう。
らびに大腸菌Ｃ抽出物および株によりえられたパッケー
ジング効率をもとにして、回収されるベクターの総数を
できるだけ多く増加させるために試みがなされた。これ
に関して、限定する要因は、えられるゲノムDNAの量（2
mgのDNAがたとえばマウスの全肝臓から容易に単離でき
る）ではなく、ある特定の量のパッケージング抽出物に
加えることのできるDNAの量である。この市販の抽出物
の価格を考慮すると、スケール・アップは非常に費用の
かかることであり、本願のマウスモデルによる変異分析
におけるイン・ビトロのパッケージングの応用を商業的
に魅力のないものにしてしまう。
前記の諸問題を避けるために、組込まれた１またはそ
れ以上のベクターを予備精製し、過多のマウスDNAに対
するベクターの比がより一層望ましいものとなるように
することが必要だと思われる。一般に、ベクターは哺乳
類のDNAから事前に分離されうる特別な性質がないの
で、このことは容易ではない。前記したように、本願で
作製したトランスジェニックマウスにはベクターはヘッ
ド−ツー−テイル・アレンジメントで多数のコピーにお
いて組込まれている。この現象は組込まれたベクターの
回収効率を増加させるために利用することができると考
えた。もし注入されたベクターがある制限酵素に対する
認識部位を欠いていることが確実であるならば、関係す
る制限部位なしにトランスジェニックマウスおよび／ま
たは細胞系に非常に長いDNA断片ができるだろう。
れ以上のベクターを予備精製し、過多のマウスDNAに対
するベクターの比がより一層望ましいものとなるように
することが必要だと思われる。一般に、ベクターは哺乳
類のDNAから事前に分離されうる特別な性質がないの
で、このことは容易ではない。前記したように、本願で
作製したトランスジェニックマウスにはベクターはヘッ
ド−ツー−テイル・アレンジメントで多数のコピーにお
いて組込まれている。この現象は組込まれたベクターの
回収効率を増加させるために利用することができると考
えた。もし注入されたベクターがある制限酵素に対する
認識部位を欠いていることが確実であるならば、関係す
る制限部位なしにトランスジェニックマウスおよび／ま
たは細胞系に非常に長いDNA断片ができるだろう。
もし、たとえば30コピーのベクターがヘッド−ツー−
テイル・アレンジメントでタンデムに組込まれるなら
ば、この断片は50,000×30＝1,500,000の塩基対の長さ
を有するだろう。もし、哺乳類の全ゲノムDNAについ
て、関係する制限酵素が約5000塩基対の平均サイズを有
する断片をつくるならば、150万の塩基対の断片が容易
にそこから分離されうる。
テイル・アレンジメントでタンデムに組込まれるなら
ば、この断片は50,000×30＝1,500,000の塩基対の長さ
を有するだろう。もし、哺乳類の全ゲノムDNAについ
て、関係する制限酵素が約5000塩基対の平均サイズを有
する断片をつくるならば、150万の塩基対の断片が容易
にそこから分離されうる。
前記の予備精製計画をテストし、マウスの全染色体DN
AをXbaＩで切断することにより平均サイズ約5000塩基対
を有する多くの断片とともに１つの非常に大きな断片が
確かに生じるかどうかを決定するために、フィールド・
インバージョン・ゲル電気泳動（Field Inversion Gel
Electrophoresis、FIGE）が利用された。この技術によ
り、塩基対が約百万に達する長さのDNA断片を適切に分
離することが可能である。
AをXbaＩで切断することにより平均サイズ約5000塩基対
を有する多くの断片とともに１つの非常に大きな断片が
確かに生じるかどうかを決定するために、フィールド・
インバージョン・ゲル電気泳動（Field Inversion Gel
Electrophoresis、FIGE）が利用された。この技術によ
り、塩基対が約百万に達する長さのDNA断片を適切に分
離することが可能である。
このようにして、脳から（およびのちにはまた他の器
官から）えられた約100μｇの全染色体DNAが、製造業者
（BRL）によって記述された条件下で400単位のXbaＩで
切断された。そしてその消化物は、４時間250ボルト
（正（forward）:0.6秒、逆（reverse）:0.2秒、傾斜:
0.0）、14℃で１×TBEバッファー（TBE＝89mM Tris−C
l、89mM ホウ酸、2mM EDTA）中でフィールド・インバ
ージョン・ゲル電気泳動（装置：ホーファー・サイエン
ティフィック・インスツルメンツ（Hoefer Scientific
Instruments）社製）に供した。電気泳動後、ゲルを臭
化エチジウム中で着色し、そのあと低分子量の分画が5k
bの平均長さを有するスミアとして現われた（第５図、
Ａレーン参照）。放射能標識されたベクターそのものを
プローブとして、このゲルパターンのハイブリダイゼー
ション分析によって、50万塩基対をこえる長さの断片を
有する選択的なバンドが示された（第５図、Ｂレーン参
照）。ゆえに、このバンドはバクテリオファージλベク
ターを示す。
官から）えられた約100μｇの全染色体DNAが、製造業者
（BRL）によって記述された条件下で400単位のXbaＩで
切断された。そしてその消化物は、４時間250ボルト
（正（forward）:0.6秒、逆（reverse）:0.2秒、傾斜:
0.0）、14℃で１×TBEバッファー（TBE＝89mM Tris−C
l、89mM ホウ酸、2mM EDTA）中でフィールド・インバ
ージョン・ゲル電気泳動（装置：ホーファー・サイエン
ティフィック・インスツルメンツ（Hoefer Scientific
Instruments）社製）に供した。電気泳動後、ゲルを臭
化エチジウム中で着色し、そのあと低分子量の分画が5k
bの平均長さを有するスミアとして現われた（第５図、
Ａレーン参照）。放射能標識されたベクターそのものを
プローブとして、このゲルパターンのハイブリダイゼー
ション分析によって、50万塩基対をこえる長さの断片を
有する選択的なバンドが示された（第５図、Ｂレーン参
照）。ゆえに、このバンドはバクテリオファージλベク
ターを示す。
高分子量のベクターを含有している断片をエレクトロ
エリュージョンによってゲルより単離し、エタノールで
沈殿させ、TEバッファーに溶解し、大腸菌Ｃパッケージ
ング抽出物を加え、ついで大腸菌Ｃを宿主としてプレー
ティングした。最初は10μｌのパッケージング抽出物
（値：約NLG.100.−）によりトランスジェニックマウス
20.2の全染色体DNA約１μｇから約9000のプラークを回
収することができたが、今や同量のパッケージング抽出
物により同じトランスジェニックマウス系統の全染色体
DNA約100μｇから約140万のプラークがえられた。これ
はたいへんな節約を意味する。
エリュージョンによってゲルより単離し、エタノールで
沈殿させ、TEバッファーに溶解し、大腸菌Ｃパッケージ
ング抽出物を加え、ついで大腸菌Ｃを宿主としてプレー
ティングした。最初は10μｌのパッケージング抽出物
（値：約NLG.100.−）によりトランスジェニックマウス
20.2の全染色体DNA約１μｇから約9000のプラークを回
収することができたが、今や同量のパッケージング抽出
物により同じトランスジェニックマウス系統の全染色体
DNA約100μｇから約140万のプラークがえられた。これ
はたいへんな節約を意味する。
最後に、作製したトランスジェニックマウス系統の潜
在的な発癌物質を試験するための変異モデルとしての有
用性の試験を行なった。まず、バックグラウンドの変異
頻度を本発明に記載されたプロトコールにしたがって、
トランスジェニックマウス（系統20.2）の脳、肝臓およ
び骨髄のゲノムDNAから予備精製およびパッケージンジ
したベクターについて測定した。えられた結果はバック
グラウンドの変異頻度が10-5より低いことを示した。比
較しうる結果は40.6系統でえられた。
在的な発癌物質を試験するための変異モデルとしての有
用性の試験を行なった。まず、バックグラウンドの変異
頻度を本発明に記載されたプロトコールにしたがって、
トランスジェニックマウス（系統20.2）の脳、肝臓およ
び骨髄のゲノムDNAから予備精製およびパッケージンジ
したベクターについて測定した。えられた結果はバック
グラウンドの変異頻度が10-5より低いことを示した。比
較しうる結果は40.6系統でえられた。
化学薬品のイン・ビボでの変異原性の試験へのこのシ
ステムの適応性を証明するために成熟雌性トランスジェ
ニックマウスをＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（EN
U）で処理した。対照およびENU処理されたトランスジェ
ニックマウスの異なった器官および組織からレスキュー
されたλ gt10 lacZシャトルベクターにおける変異頻度
は、青色のプラークに対する無色のプラークの比として
測定された。対照およびENU処理されたトランスジェニ
ックマウスの脳および肝臓からレスキューされたλ gt1
0 lacZシャトルベクターにおける変異頻度を第２表に示
す。なお、第２表においてそれぞれの項目は一匹の動物
についてのデータを示す。
ステムの適応性を証明するために成熟雌性トランスジェ
ニックマウスをＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（EN
U）で処理した。対照およびENU処理されたトランスジェ
ニックマウスの異なった器官および組織からレスキュー
されたλ gt10 lacZシャトルベクターにおける変異頻度
は、青色のプラークに対する無色のプラークの比として
測定された。対照およびENU処理されたトランスジェニ
ックマウスの脳および肝臓からレスキューされたλ gt1
0 lacZシャトルベクターにおける変異頻度を第２表に示
す。なお、第２表においてそれぞれの項目は一匹の動物
についてのデータを示す。
マウスに生じた突然変異と細菌中にパッケージングし
たのちに理論的に形成されうる変異とを区別するために
体重1kgにつきENU 100mgで処理した２匹の動物を処理後
１日たったところで屠殺した。これらのマウスの器官か
ら単離されたベクターは、処理のすぐあとにもかかわら
ずENUが誘因であるDNA損傷を含有しているはずであり、
細菌中に変異をひきおこすだろう。しかしながら、第２
表で示されるように、これらの動物の脳および肝臓には
変異頻度の増加は観察されなかった。このことは、この
システムにおいて検出された誘発変異はその原因が主に
マウスにあることが暗示される。
たのちに理論的に形成されうる変異とを区別するために
体重1kgにつきENU 100mgで処理した２匹の動物を処理後
１日たったところで屠殺した。これらのマウスの器官か
ら単離されたベクターは、処理のすぐあとにもかかわら
ずENUが誘因であるDNA損傷を含有しているはずであり、
細菌中に変異をひきおこすだろう。しかしながら、第２
表で示されるように、これらの動物の脳および肝臓には
変異頻度の増加は観察されなかった。このことは、この
システムにおいて検出された誘発変異はその原因が主に
マウスにあることが暗示される。
他の動物はすべて処理後７日目に屠殺した。えられた
結果より、器官に特異な方法で変異頻度が増加すること
が明らかである。つまり第２表で示されるように、最高
投与量における変異頻度は脳におけるものの方が肝臓に
おけるものよりもかなり高い。
結果より、器官に特異な方法で変異頻度が増加すること
が明らかである。つまり第２表で示されるように、最高
投与量における変異頻度は脳におけるものの方が肝臓に
おけるものよりもかなり高い。
変異の頻度は用量依存性であることがわかった。つま
り、体重1kgあたりENU 10mgという低い投与量のときに
バックグラウンドと比較して変異頻度の増加が明らかに
認められた（第６図に示される脳における平均変異頻度
参照）。
り、体重1kgあたりENU 10mgという低い投与量のときに
バックグラウンドと比較して変異頻度の増加が明らかに
認められた（第６図に示される脳における平均変異頻度
参照）。
（参考文献） （１）アルバーティーニ・アール・ジェイ（Albertini,
R.J.）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、79巻、6617頁（1982年） （２）アルバーティーニ・アール・ジェイ（Albertini,
R.J.）ら、ネイチャー（Nature）、316巻、369頁（1985
年） （３）エイムス・ビー・エヌ（Ames,B.N.）ら，プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、70巻、2281頁（1973年） （４）アシュバイ・ジェイ（Ashby,J）およびテナント
・アールダブリュ（Tennant,RW），ミューテーション・
リサーチ（Mutation Res.）、204巻、17〜115頁（1988
年） （５）ダブリッジ・アール・ビー（Dubridge,R.B.）お
よびカロス・エム・ピー（Calos,M.P.）ミュータジェネ
シス（Mutagenesis）、３巻、１〜９頁（1988年） （６）グラザー・ピー・エム（Glazer,P.M.）ら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sc.
USA）、83巻、1041〜1044頁（1986年） （７）ハイ・エー（Hay A）、ネイチャー（Nature）、3
32巻、782〜783頁（1988年） （８）ホーガン・ビー（Hogan,B.）ら、マニピュレイテ
ィング・ザ・マウス・エンブリオー、アー・ラボラトリ
ー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York）（1986年） （９）レーマン・エー・アール（Lehman,A.R.）、ミュ
ーテーション・リサーチ（Mutation Research）、150
巻、61〜67頁（1985年） （10）リンデンマイヤー・ダブリュ（Lindenmaier,W.）
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Res.）、10巻、1243頁（1982年） （11）ローマン・ピー・エイチ・エム（Lohman,P.H.
M.）ら、ミューテーション・リサーチ（Mutation Re
s.）、181巻、227〜234頁（1987年） （12）マニアティス・ティー（Maniatis,T.）ら、モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,New York）（1982
年） （13）パルミター・アール・ディ（Palmiter,R.D.）お
よびブリンスター・アール・エル（Brinster R.L.）、
アニュ・レブ・ジェネト（Annu.Rev.Genet.）、20巻、4
65頁（1987年） （14）ラレイ・イー・エー（Raleigh,E.A.）およびウィ
ルソン・ジー（Wilson,G.），プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、83巻、9070
頁（1986年） （15）ヘイヒ・ジェイ（Vijg,J.）およびウイッテルリ
ンデン・エー・ジー（Uitterlinden,A.G.）、メク・エ
イジング・ディブ（Mech.Ageing Dev.）、41巻、47〜63
頁（1987年） （16）ゼイガー・イー（Zeiger E）ら、キャンサー・リ
サーチ（Cancer Res.）、47巻、1287頁（1987年） （17）フェザーストーン・ティー（Featherstone,T.）
ら、ミューテーション・リサーチ（Mutation Res.）、1
79巻、215頁（1987年） 〔発明の効果〕 本発明によれば、効率的にDNA配列をレスキューおよ
びクローニングすることができ、ベクターにより哺乳類
（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１または
それ以上のマーカー遺伝子における変異を検出すること
ができる。
R.J.）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、79巻、6617頁（1982年） （２）アルバーティーニ・アール・ジェイ（Albertini,
R.J.）ら、ネイチャー（Nature）、316巻、369頁（1985
年） （３）エイムス・ビー・エヌ（Ames,B.N.）ら，プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、70巻、2281頁（1973年） （４）アシュバイ・ジェイ（Ashby,J）およびテナント
・アールダブリュ（Tennant,RW），ミューテーション・
リサーチ（Mutation Res.）、204巻、17〜115頁（1988
年） （５）ダブリッジ・アール・ビー（Dubridge,R.B.）お
よびカロス・エム・ピー（Calos,M.P.）ミュータジェネ
シス（Mutagenesis）、３巻、１〜９頁（1988年） （６）グラザー・ピー・エム（Glazer,P.M.）ら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sc.
USA）、83巻、1041〜1044頁（1986年） （７）ハイ・エー（Hay A）、ネイチャー（Nature）、3
32巻、782〜783頁（1988年） （８）ホーガン・ビー（Hogan,B.）ら、マニピュレイテ
ィング・ザ・マウス・エンブリオー、アー・ラボラトリ
ー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York）（1986年） （９）レーマン・エー・アール（Lehman,A.R.）、ミュ
ーテーション・リサーチ（Mutation Research）、150
巻、61〜67頁（1985年） （10）リンデンマイヤー・ダブリュ（Lindenmaier,W.）
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Res.）、10巻、1243頁（1982年） （11）ローマン・ピー・エイチ・エム（Lohman,P.H.
M.）ら、ミューテーション・リサーチ（Mutation Re
s.）、181巻、227〜234頁（1987年） （12）マニアティス・ティー（Maniatis,T.）ら、モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,New York）（1982
年） （13）パルミター・アール・ディ（Palmiter,R.D.）お
よびブリンスター・アール・エル（Brinster R.L.）、
アニュ・レブ・ジェネト（Annu.Rev.Genet.）、20巻、4
65頁（1987年） （14）ラレイ・イー・エー（Raleigh,E.A.）およびウィ
ルソン・ジー（Wilson,G.），プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、83巻、9070
頁（1986年） （15）ヘイヒ・ジェイ（Vijg,J.）およびウイッテルリ
ンデン・エー・ジー（Uitterlinden,A.G.）、メク・エ
イジング・ディブ（Mech.Ageing Dev.）、41巻、47〜63
頁（1987年） （16）ゼイガー・イー（Zeiger E）ら、キャンサー・リ
サーチ（Cancer Res.）、47巻、1287頁（1987年） （17）フェザーストーン・ティー（Featherstone,T.）
ら、ミューテーション・リサーチ（Mutation Res.）、1
79巻、215頁（1987年） 〔発明の効果〕 本発明によれば、効率的にDNA配列をレスキューおよ
びクローニングすることができ、ベクターにより哺乳類
（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１または
それ以上のマーカー遺伝子における変異を検出すること
ができる。
第１図は実施例で記載されているバクテリオファージλ
ベクターgt10 lacZを示す図であり、付着末端はコス部
位を示す。 第２図はトランスジェニックマウスのゲノムにおけるベ
クターのコピーのヘッド−ツー−テイル・アレンジメン
トを示す図である。 第３図はBamHIまたはEcoRIで切断された異なるトランス
ジェニックマウスよりえられたDNAのサザンブロッティ
ング後のオートラジオグラムを示すスケッチ図である。 第４図はHindIII（Ｈ）、HindIII/XhoＩ（H/X）、HpaII
（Hp）またはMspＩ（Ｍ）で切断されたトランスジェニ
ックマウス35.5の肝臓からえられたDNAのサザンブロッ
ティング後のオートラジオグラムを示すスケッチ図であ
り、32Pで標識されたλ gt10 lacZがプローブとして使
用されている。 第５図はXbaＩで切断されたトランスジェニックマウス
のDNAのプレパラティブなFIGEの結果を示している。 第６図はエチルニトロソウレア（ethyl nitrosourea、E
NU）の投与量による効用として、無色のプラークの数
（変異頻度）を示している。
ベクターgt10 lacZを示す図であり、付着末端はコス部
位を示す。 第２図はトランスジェニックマウスのゲノムにおけるベ
クターのコピーのヘッド−ツー−テイル・アレンジメン
トを示す図である。 第３図はBamHIまたはEcoRIで切断された異なるトランス
ジェニックマウスよりえられたDNAのサザンブロッティ
ング後のオートラジオグラムを示すスケッチ図である。 第４図はHindIII（Ｈ）、HindIII/XhoＩ（H/X）、HpaII
（Hp）またはMspＩ（Ｍ）で切断されたトランスジェニ
ックマウス35.5の肝臓からえられたDNAのサザンブロッ
ティング後のオートラジオグラムを示すスケッチ図であ
り、32Pで標識されたλ gt10 lacZがプローブとして使
用されている。 第５図はXbaＩで切断されたトランスジェニックマウス
のDNAのプレパラティブなFIGEの結果を示している。 第６図はエチルニトロソウレア（ethyl nitrosourea、E
NU）の投与量による効用として、無色のプラークの数
（変異頻度）を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (13)
- 【請求項１】宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
を用いることを特徴とする、DNA配列を含有するベクタ
ーを宿主細菌中で増殖させるDNA配列のレスキューおよ
びクローニングの方法。 - 【請求項２】上記ベクターとして、宿主制限のない大腸
菌Ｃ株に適したクローニング・ビークルであるバクテリ
オファージベクターを用い、ファージ・コートへのイン
・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のない大腸
菌Ｃ株から得られたファージ・パッケージング抽出物に
よって行なわれることを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】上記ベクターとして、宿主制限のない大腸
菌Ｃ株に適したクローニング・ビークルであるプラスミ
ドベクターを用いることを特徴とする請求項１に記載の
方法。 - 【請求項４】宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
およびベクターとしてバクテリオファージλベクターを
用い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケージ
ングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られたフ
ァージ・パッケージング抽出物によって行なわれること
を特徴とする、DNA配列を含有するベクターを適当な宿
主細菌中で増殖させるDNA配列のレスキューおよびクロ
ーニングの方法。 - 【請求項５】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳
類の細胞からDNAを単離すること、該DNAからベクターを
回収すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関し
て欠損している宿主細菌中で該ベクターを増殖させるこ
と、およびマーカー遺伝子の発現を試験することからな
り、該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株を用い
ることを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但し、ヒ
トを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上の
マーカー遺伝子における変異を検出する方法。 - 【請求項６】上記ベクターとして、大腸菌Ｃ株に適した
クローニング・ビークルであるバクテリオファージベク
ターを用い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッ
ケージングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得ら
れたファージ・パッケージング抽出物によって行なわれ
ることを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】上記ベクターとして、大腸菌Ｃ株に適した
クローニング・ビークルであるプラスミドベクターを用
いることを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳
類の細胞からDNAを単離すること、該DNAからベクターを
回収すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関し
て欠損している適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖さ
せること、およびマーカー遺伝子の発現を試験すること
からなり、該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ株
および該ベクターとしてバクテリオファージλベクター
を用い、ファージ・コートへのイン・ビトロのパッケー
ジングの段階が宿主制限のない大腸菌Ｃ株から得られた
ファージ・パッケージング抽出物によって行なわれるこ
とを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを
除く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマー
カー遺伝子における変異を検出する方法。 - 【請求項９】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳
類の細胞から単離されたDNAを、ベクター内に切断部位
をもたない制限酵素を用いて断片化し、得られた断片を
サイズの違いなどの適当な基準に基づいて分離し、そし
てベクターを含む断片を収集することにより予備精製
し、そののち該予備精製されたDNAからベクターを回収
することを特徴とする請求項５〜請求項８のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１０】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺
乳類の細胞からDNAを単離すること、該DNAからベクター
を回収すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関
して欠損している適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖
させること、およびマーカー遺伝子の発現を試験するこ
とからなり、該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ
株および該ベクターとして少なくとも30kbの大きさのバ
クテリオファージλベクターを用い、ヘッド−ツー−テ
イル・アレンジメントで該ベクターの少なくとも３コピ
ーを哺乳類のゲノムに組込ませ、ファージ・コートへの
イン・ビトロのパッケージングの段階が宿主制限のない
大腸菌Ｃ株から得られたファージ・パッケージング抽出
物によって行なわれること、および遺伝子導入した哺乳
動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDNAを、
ベクター内に切断部位をもたないが平均サイズが10kb以
下の断片を生成しうるような哺乳類のゲノム内に数多く
の切断部位をもつXbaＩなどの制限酵素を用いて断片化
し、得られた断片をそれらのサイズの違いに基づいて分
離し、そしてベクターを含む大きい断片を収集すること
により予備精製することを特徴とする、ベクターにより
哺乳類（但し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１
またはそれ以上のマーカー遺伝子における変異を検出す
る方法。 - 【請求項１１】バクテリオファージλベクターの少なく
とも10コピーがヘッド−ツー−テイル・アレンジメント
で哺乳類（但し、ヒトを除く。）のゲノムに組込まれる
請求項10に記載の方法。 - 【請求項１２】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺
乳類の細胞からDNAを単離すること、該DNAからベクター
を回収すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関
して欠損している適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖
させること、およびマーカー遺伝子の発現を試験するこ
とからなり、該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ
株を用い、哺乳類のゲノムに組込まれたベクターがベク
ター内にない制限酵素の切断部位に囲まれているプラス
ミドベクターであり、および該制限酵素および閉環によ
って遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞
から単離したDNAを断片化することにより該ベクターを
回収することを特徴とする、ベクターにより哺乳類（但
し、ヒトを除く。）のゲノムに導入された１またはそれ
以上のマーカー遺伝子における変異を検出する方法。 - 【請求項１３】遺伝子導入した哺乳動物の細胞または哺
乳類の細胞からDNAを単離すること、該DNAからベクター
を回収すること、少なくとも１つのマーカー遺伝子に関
して欠損している適当な宿主細菌中で該ベクターを増殖
させること、およびマーカー遺伝子の発現を試験するこ
とからなり、該宿主細菌として宿主制限のない大腸菌Ｃ
株を用い、哺乳類のゲノムに組込まれたベクターが、平
均サイズ20kb以上の断片を生成しうるような哺乳類のゲ
ノム内に少数の切断部位をもつNotＩなどの制限酵素の
ベクター内にはない切断部位に囲まれている、10kb以下
のサイズのプラスミドベクターであり、遺伝子導入した
哺乳動物の細胞または哺乳類の細胞から単離されたDNA
を、該制限酵素を用いて断片化し、得られた断片をそれ
らのサイズの違いに基づいて分離し、そしてベクターを
含む小さい断片を収集することにより予備精製すること
を特徴とする、ベクターにより哺乳類（但し、ヒトを除
く。）のゲノムに導入された１またはそれ以上のマーカ
ー遺伝子における変異を検出する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8801826A NL8801826A (nl) | 1988-07-19 | 1988-07-19 | Werkwijze voor het detecteren van mutaties in markergenen. |
| NL8801826 | 1988-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02142471A JPH02142471A (ja) | 1990-05-31 |
| JPH0829093B2 true JPH0829093B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=19852648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1187193A Expired - Lifetime JPH0829093B2 (ja) | 1988-07-19 | 1989-07-18 | Ｄｎａをレスキューする方法およびマーカー遺伝子における変異を検出する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5470706A (ja) |
| EP (3) | EP0548056B2 (ja) |
| JP (1) | JPH0829093B2 (ja) |
| AT (2) | ATE132529T1 (ja) |
| DE (2) | DE68912228T2 (ja) |
| ES (2) | ES2081679T3 (ja) |
| GR (1) | GR3018927T3 (ja) |
| NL (1) | NL8801826A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9100567A (nl) * | 1991-04-02 | 1992-11-02 | Ingeny Bv | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. |
| EP0671955A4 (en) * | 1992-02-14 | 1997-04-09 | Stratagene Inc | MUTAGENESE TEST USING NON-HUMAN BEINGS CONTAINING TEST DNA SEQUENCES. |
| AU4220093A (en) * | 1992-04-27 | 1993-11-29 | Indiana University Foundation | Live animal mutagenesis systems for testing mutagenic agents in vivo |
| WO1994017208A1 (en) * | 1993-01-21 | 1994-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and diagnostic kits utilizing mammalian stress promoters to determine toxicity of a compound |
| WO2000024246A2 (en) | 1998-10-26 | 2000-05-04 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Transgenic fish carrying plasmid for mutation detection and methods |
| GB9924973D0 (en) * | 1999-10-21 | 1999-12-22 | Cobra Therapeutics Ltd | Preparation of cellular components that are substantially free of chromosomal DNA |
| CZ20033143A3 (en) * | 2001-05-21 | 2004-04-14 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4753874A (en) * | 1985-07-08 | 1988-06-28 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Rapid mutation testing system for human cells |
| EP0289121B1 (en) * | 1987-05-01 | 1995-12-27 | Stratagene | Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences |
-
1988
- 1988-07-19 NL NL8801826A patent/NL8801826A/nl not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-07-18 JP JP1187193A patent/JPH0829093B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 EP EP93200367A patent/EP0548056B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 ES ES93200367T patent/ES2081679T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 AT AT93200367T patent/ATE132529T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-18 AT AT89201895T patent/ATE100151T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-18 EP EP89201895A patent/EP0353812B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 ES ES89201895T patent/ES2061943T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 EP EP95201753A patent/EP0683238A3/en not_active Withdrawn
- 1989-07-18 DE DE68912228T patent/DE68912228T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-18 DE DE68925369T patent/DE68925369T3/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-29 US US08/013,198 patent/US5470706A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-07 GR GR960400333T patent/GR3018927T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MECHANISMS OF AGEING AND DEVELOPMENT=1987 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68925369D1 (de) | 1996-02-15 |
| ATE132529T1 (de) | 1996-01-15 |
| US5470706A (en) | 1995-11-28 |
| EP0353812A2 (en) | 1990-02-07 |
| DE68912228D1 (de) | 1994-02-24 |
| DE68912228T2 (de) | 1994-08-04 |
| ES2081679T3 (es) | 1996-03-16 |
| GR3018927T3 (en) | 1996-05-31 |
| EP0548056B2 (en) | 2001-04-04 |
| EP0353812B1 (en) | 1994-01-12 |
| ES2061943T3 (es) | 1994-12-16 |
| EP0548056A1 (en) | 1993-06-23 |
| ATE100151T1 (de) | 1994-01-15 |
| NL8801826A (nl) | 1990-02-16 |
| EP0683238A3 (en) | 1995-12-20 |
| EP0353812A3 (en) | 1990-03-07 |
| EP0683238A2 (en) | 1995-11-22 |
| DE68925369T3 (de) | 2001-08-09 |
| EP0548056B1 (en) | 1996-01-03 |
| JPH02142471A (ja) | 1990-05-31 |
| DE68925369T2 (de) | 1996-05-15 |
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