JPH06506583A - ベクターとして修正された植物ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベクターとして修正された植物ウィルス本発明は外来ペプチドの産生又は供与用 のキャリア（ベクター）としてのウィルスの使用に関する。更に詳しくは、本発 明はウィルス粒子（ピリオン）においてペプチドとして発現される外来核酸配列 の組込みによるウィルス核酸の遺伝子操作に関する。この明細書において、ペプ チド又はそれについてコードする核酸に適用されるような“外来”という用語は ベクターとして用いられる植物ウィルスに固有でないペプチド又は核酸配列を意 味する。一方、このような配列は外因性又は異種配列として記載することもでき る。“ペプチド”という用語には小さなペプチド及びポリペプチドを含む。

外来ペプチドのキャリアとしてウィルスの使用は複合ウィルスワクチンの分野で 広範囲に探求されている。このようなワクチンは異なる動物ウィルス成分のハイ ブリッドであるキメラウィルスに基づいている。通常、このようなハイブリッド の主成分は無害であるか又は無害にされたウィルスに由来し、副成分は病原ウィ ルスの選択された抗原成分である。例えば、ワタシニア又は弱毒化ポリオウィル スのようなポックスウィルスはヒトウィルスを含めた他の動物ウィルスの免疫原 成分に関するベクターとして用いてもよい。

しかしながら、上記技術はい（っかの欠点を有する。

このようなワクチンはデザインしてランさせる上で高くつく細胞培養系で増殖さ れたウィルスから産生される。

複合ウィルスアプローチでは生きた動物感染ウィルスの遺伝子操作を行うが、変 異が感染力、抗原力及び／又は病原力の変化した新規形のウィルスを生じるとい うリスクを伴う。ベクターとして用いられる動物ウィルスは動物が既に接触して その動物がそのベクターに対する抗体を既に産生じているかもしれないウィルス であることがよくある。したがって、そのベクターは東二ウィルスの組込み抗原 部位が免疫応答を誘導する前に免疫系により破壊されるであろう。

本発明は外来配列を発現するキメラウィルスのデザインにおいて根本的に異なる タイプのウィルス成分の使用により上記欠点を回避している。更に、本発明はウ ィルスワクチンの産生に際して遭遇する問題の解決に特に関連性を有するが、そ れは下記のような適用の概念及び分野の双方に関してかなり広い。

本発明では外来ヌクレオチド配列、即ちＮＮａｒｅでみられるように植物ウィル ス中に存在せず、結果的にいかなる天然存在植物ウィルスにも正常ではみられな いペプチドについてコードするヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）の発現に 関するベクター系として植物ウィルスを利用している。

本発明は外来ペプチドを含む植物ウィルスの集合粒子に関する。したがって、本 発明の植物ウィルスは天然ウィルスの修正形であり、便宜上修正ウィルスと称さ れる。

本発明による植物ウィルス中に組込まれる外来ペプチドはかなり異なったタイプ であり得、外来ペプチドの性質及びサイズとそれがウィルス粒子中又は上におか れた位置がインビトロ又はインビボで培養された場合に集合する修正ウィルスの 能力を干渉しないという制限のみに付される。広義の概念において、修正ウィル スはいかなる生物学的に有用なペプチド（通常ポリペプチド）から形成してもよ いが、その機能はその活性のために特別な立体配座を要する。これは例えば具体 的な生物系でその安定性又は供与様式を改善するためにそのペプチドとそれより 大きな分子との結び付きにより実現される。このようなペプチドの例はペプチド ホルモン；酵素；増殖因子：原生動物、ウィルス、細菌又は真菌源の抗原；抗イ デイオタイプ抗体を含めた抗体；免疫調節剤及びサイトカイン、例えばインター フェロン及びインターロイキン；レセプター；アトへシン；あらゆる前記タイプ のペプチドの一部又は前駆体である。ペプチドは５以上のアミノ酸を含むことが 好ましい。

本発明による植物ウィルスベクターに結合される広範囲の生物活性ペプチド配列 の中で、特別な重要性はワクチン、特に動物（ヒトを含む）ウィルスワクチンの 基礎である抗原ペプチドにある。ワクチン適用に関して、本発明は特に魅力的な エピトープ供与系を提供する。このような適用で用いられる場合、抗原ペプチド 成分は免疫系により、例えばウィルスのコートタンパク質の露出部分上における 位置決めで容易に認識されるようにウィルス粒子上に適切におかれる。したがっ て、後者に適用されるように、本発明は植物ウィルスのコートタンパク質の露出 表面に組込まれた病原体、例えば動物ウィルスに由来する抗原を含む修正植物ウ ィルスの集合粒子に関する。本発明はワクチンの免疫原成分としてこのような集 合修正植物ウィルス粒子の使用にも関する。

米国特許第４．４０７．９５６号、欧州出願第０６７゜５５３号、第１９４．８ ０９号、第２２１．０４４号、ＰＣＴ出願ＷＯｊｌ１８７１０６２６１１及びＷ Ｏ第９０１００６１１号明細書では、植物自体に新しい性質を付与するか又はあ る貴重な化合物（例えば、植物代謝産物）を回収するために植物中への外因性物 質の導入用ベクターとしである植物ウィルスのＤＮＡ及びＲＮＡを用いることが 既に提案されている。このような従来の提案において、関心は植物ウィルスの修 正ＤＮＡ又はＲＮＡと植物の表現型変換におけるその使用にすっかり向いている 。

これら先行明細書のほとんどは理論的及び推論的な性格であり、いずれも修正コ ートタンパク質を有する植物つイルスの全粒子（ピリオン）の単離又は動物ウィ ルスワクチンの製造もしくはその他いずれかの目的に関するこのような粒子の使 用について開示していない。ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｓ　（１９９Ｇ）　２６９．７ ３−７６において、タカマツらはタバコモザイクウィルスのコートタンパク質の カルボキシ末端に融合された５アミノ酸の外来ペプチドを発現する試みについて 記載している。しかしながら、修正植物ウィルス粒子は記載された実験で産生さ れなかった。

本発明に従い修正植物ウィルス粒子を産生ずるため、植物ウィルス核酸は、外来 ペプチド、例えば動物ウィルス抗原についてコードするヌクレオチド配列をコー トタンパク質の露出部分についてコードする植物ウィルスゲノムのその部分に導 入し、植物又は植物細胞を修正ウィルス核酸で感染させ、修正ウィルスの集合粒 子を収集することにより修正される。この操作は、ＤＮＡウィルスのケースにお いてウィルスのＤＮＡの直接操作、又はＲＮＡウィルスのＲＮＡに対応するｃＤ ＮＡの操作で最良に実施される。ＲＮＡウィルスのケースでは、修正ＤＮＡのＲ ＮＡ転写物は修正ウィルスの集合粒子の収集前に増殖段階を行うため植物細胞又 は好ましくは全植物の接種用に通常製造される。ＤＮＡウィルスのケースにおい ては、ＤＮＡ自体が植物中に導入される。このやり方で、外来ペプチドはキャプ シドタンパク質の一部として最初に発現され、それにより全ウィルス粒子の一部 として産生される。こうして、ペプチドは使用そのものに向けられた接合体分子 として産生される。一方、ウィルスの遺伝的修正もウィルス粒子から開裂を行う 適切な物質の適用により望ましいペプチドを放出させるようにデザインしてよい 。

商業的規模で修正ウィルスを産生ずるためには、各バッチのウィルス産生用に感 染性接種原（ＤＮＡ又はＲＮＡ転写物）を製造する必要はない。代わりに、初期 接種原は植物に感染させるために用いてよく、得られた修正ウィルスは後のバッ チ用の接種原として全ウィルス又はウィルスＲＮＡを産生ずるために植物で継代 してもよい。

本発明の目的にとり、ベクターとしての使用上ウィルスの特に貴重な群は、キャ プシドについてコードする核酸が他の機能性分子についてコードするものとは別 の部分であって、そのコートタンパク質がβ−バレル構造を有するものである。

この構造を有するウィルスの使用の利点はβ−シートの個別鏡開におけるループ が外来ペプチドの挿入用に便利な部位を与えることである。１以上のループの修 正が本発明に従う外来ペプチドの発現にとり好ましい戦略である。この群にはカ ラピーモザイクウィルス及びボッド・モトル（ｐａｄ　ｍｏＮｌｅｌ豆ウィルス のようなコモウィルス（ｃｏｍｏマ１ｔｕｓ）　とトマトリングスポットウィル ス及びストロベリー潜伏リングスポットウィルスのようなネポウィルス（ｎｅｐ ｏｖｉｚ＋）がある。コモウィルスの利点はそれらのキャプシドが個別に操作で きる３つの異なるβ−バレルを各々６０コピー含むことである。

類似した三次元構造だが但し単一タイプのβ−バレルを有する他のウィルス群と してはトンブスウイルス（）ｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）及びソベモウイルス（ｓｏ ｂｅｍｏｗｉｔａｓ）がある。構造類似性を有するが但しコートタンパク質がβ −バレル構造を有しない他の群の植物及び動物ウィルス、例えば植物及び動物ラ ブドウィルスも本発明に従い修正してよい。

外来ＲＮＡ又はＤＮＡは様々な立体配置で植物ウィルスゲノム中に挿入してよい 。例えば、それは現存核酸への付加として又は現存配列の一部の置換として挿入 され、その選択はキャプシドタンパク質の構造と、付加又は置換が植物で集合し うる遺伝的修正ウィルスの能力の干渉なしに行えるという容易性により大部分決 定される。本発明の且的にとり許容できる最も適切なサイズの付加又は欠失の決 定は本開示からみて実験により各具体的ケースで行ってよい。付加インサートの 使用は一部の場合において置換インサートよりも大きな柔軟性を与えるようであ る。

本発明によれば、植物宿主における修正ウィルスの増殖及びその重要な産出物の 産生はワクチン用の抗原と他のタイプのペプチドを宵利なやり方で産生ずる本発 明の新規戦略の重要部分である。前記のように、挿入される異種ヌクレオチド配 列としては容易に開裂されるアミノ酸についてコードするものがあり、そのため 増殖段階後に望ましい物質がウィルス粒子から分離される。ペプチドの全開裂の 代替法として、一部のケースにおいてはキャプシドの主要部分内でそのままだが ウィルス核酸から分離された形でペプチドを放出することが可能でかつ望ましい 。

ＣＰＭＶキャプシドの表面上で発現できる多数のエピトープの中には口蹄疫ウィ ルス（ＦＭＤＶ）　、ポリオウィルス、ヒトライノウィルス（ＨＲＶ）及びＡ全 肝炎ウィルス（ＨＡＶ）のようなピコルナウィルスからのもの、ヒト免疫不全ウ ィルス（ＨＩ　Ｖ）のｇｐ４１又はｇｐ１２０いずれかと関連したエピトープと ヒトパピローマウィルス（ＨＰ　Ｖ）の主コートタンパク質に由来するエピトー プが含まれる。

ワクチンの製造に適用されるように、本発明は従来のワクチン、動物ウィルスに 基づ（組換えワクチン及びペプチドワクチンよりも多くの利点を有する１例えば １、非常に高収率の純粋なウィルスが感染植物から入手でき、組織培養産生ステ ップが不要であることによる低い産生コスト ２、従来の組換え動物ウィルスワクチンのケースのように、植物ウィルスが動物 で感染及び複製できず、このためビルレフト形に変異できないことから改善され た安全性 ３、一部の植物ウィルス、特にコモウィルスは例外的に安定であり、精製された 調製物は感染力を失うことなく乾燥させて室温で長年にわたり貯蔵できる。この 性質によれば徐放出ワクチンを開発でき、免疫力を維持する上で要求される注射 回数を減少させることができる。

４、動物は植物ウィルスと接触したことがないようであり、したがってベクター に対する抗体をまだ有さず、このため複合ワクチンの有効性を増加させる。

５、植物ウィルスはベクターとして以前に用いられたほとんどの動物ウィルス、 例えばワクシニアよりも小さく、インビボにおける相同的組換え（トランスフェ クション）と対比されるようにインビトロ操作によりキメラ遺伝子を導入できる 。

この系を実証するため、植物ウィルスのカラビーモザイクコモウィルス（ＣＰＭ ｖ）が選択された。ＣＰ　Ｍ　Ｖの三次元構造は粒子構造の破壊なしに修正に適 した部位の確認を可能にした原子分解で解析された。

本発明の広い適用性を実証するため、３種の異なる動物ウィルスの抗原部位が用 いられた。２種はピコルナウィルス群の動物ウィルスに属するウィルスーロ蹄疫 ウィルス（ＦＭＤＶ）及びヒトライノウィルス（ＨＲＶ）であった。この群には いくつかの重要な病原体、具体的にはＦＭＤＶ、灰白髄炎（ポリオ）及びＡ型肝 炎がある。

選択された東三のウィルスはいかなる既知の植物ウィルスとも類似性を有さず、 成功したワクチンが現在入手できないヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）であっ た。

本発明は下記添付図面を参考にして更にここに記載される： 図１は単純なＴ＝３ウィルス、ピコルナウィルス及びコモウィルスキャプシドの 構造の比較について示す。各ケースにおいて、１つの台形は１つのβ−バレルを 表す。

このため、コモウィルスの大きな（Ｌ又はＶＦ３７）キャプシドタンパク質はＴ ＝３ウィルスのＣ及びＢタイプサブユニット又はピコルナウィルスのＶＦ２及び ＶＦ６に相当する２つの共有結合β−バレルからなる。コモウィルスの小さな（ Ｓ又はＶＦ２３）キャプシドタンパク質はＴ＝３ウィルスのＡタイプサブユニッ ト又はビコル＋ウィルスのＶＰｌに相当する単一のβ−バレルを含む。

図２は標準β−バレルの二次構造及び接合性について示す。β−シートの個別鎖 はＢ−Ｇで標識され、タンパク質のアミノ（ＮＨ２）及びカルボキシ（ＣＯＯＨ ）末端が示されている。

図３はプラスミド（Ａ）ｐ　ＰＭＭ２９０２及び（Ｂ）ｐＢ７７−１２３につい て示す。点模様領域はプラスミドのＣＰＭＶ特異性領域を表すが、そのコード領 域は更に広い部分により示され、その上では様々なウィルスコードタンパク質が マークされている。関連制限酵素部位も示される。プラスミドの組立ての詳細は Ｈｏ１ｎｅｓ＋　ら（１９８９＋とＤｅ＋ｓｅｎ＋及びＬｏｍｏｎｏｓ＋ｏｌｌ 　（１９９１）でみられる。

図４はＶＦ２３のアミノ末端４０アミノ酸についてコードするＣＰＭＶ　Ｍ　Ｒ ＮＡの領域を示す。ヌクレオチド配列下の数値はＭ　ＲＮＡ配列に関するもので 、唯一のＮｈｅ　Ｉ部位の位置が示されている。ＶＦ２３のβＢ及びβＣ！１を 形成する上で関与するアミノ酸は標準１文字コードを用いて示されたタンパク質 のアミノ酸配列上で示される。

図５は（Ａ）トップ（ポジティブ）鎖によりコードされたアミノ酸配列と一緒に ｐＦＭＤＶの組立てに用いられたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と（Ｂ ）　ＦＭＤＶ特異性オリゴヌクレオチドの挿入後におけるＶＦ２３の構造につい て示す。矢印領域は挿入されたＦＭＤＶエピトープの大きさについて示す。クロ ーニング時に復元されないＮｈｅ１部位はｘＮｈｅＩで示される。挿入配列中に 存在する特徴的Ｂ　ｇ　Ｉ　１１部位も示されている。

図６はプラスミドｐＦＭＤＶの組立て方について示す。

様々なＣＰＭＶ特異性領域の表示は図３のとおりである。

ＶＦ２３に挿入されたＦＭＤＶ特異性領域はＣＰＭＶ特異性コード領域中で黒色 セグメントとして示される。

図７はプラスミドｐＭＴ７−６０１について示す。様々なＣＰＭＶ特異性領域の 表示は図３のとおりである。

関連制限部位も示されている。

図８は部位特定変異誘発による“置換”ベクターの組立て方について示す。アス テリスクは部位特定変異誘発でＣに変えられて新しいＡａｔ１１部位を形成する Ｔ残基について示す。

図９は（Ａ）トップ（ポジティブ）鎖によりコードされたアミノ酸配列と一緒に ｐＭＴ７−ＨＩＶの組立てに用いられたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列 と（Ｂ）ＨＩＶ特異性オリゴヌクレオチドの挿入後におけるＶＦ２３の構造につ いて示す。矢印領域は挿入されたＨＩＶエピトープの大きさについて示す。挿入 配列中に存在する特徴的Ｐｖｕ　Ｉ部位も示されている。

図１０は（Ａ）トップ（ポジティブ）鎖によりコードされたアミノ酸配列と一緒 にＩ）ＭＴ７−ＨＲＶの組立てに用いられたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド 配列と（Ｂ）ＨＲＶ特異性オリゴヌクレオチドの挿入後におけるＶＦ２３の構造 について示す。矢印領域は挿入されたＨＲＶエピトープの大きさについて示す。

挿入配列中に存在する特徴的Ｃ１ａＩ部位も示されている。

図１１はブラスミＦｌ）ＭＴ７−　Ｈｒ　Ｖ及びｐＭＴ７−ＨＲＶの組立て方に ついて示す。様々なＣＰＭＶ特異性領域の表示は図３のとおりである。ＶＦ２３ に挿入されたＨＩＶ及びＨＲＶ特異性領域はＣＰＭＶ特異性コード領域中で黒色 セグメントとして示される。

図１２＋！ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−１及びｐＢＴ７−１２３転写物の混合物で接 種されたカラピー植物５例（列Ａ−Ｅ）の葉のタンパク質抽出物の“ウェスタン プロット”について示す。そのプロットはＦＭＤＶエピトープに特異的な血清で プローブ探査された。列“偽”及び“ｗｔ”は各々偽接種又は野生型ＣＰＭＶ　 ＲＮＡで接種された葉の抽出物を含む。“ウィルス”とマークされた列は精製さ れた野生型ＣＰＭＶを含む。マーカータンパク質のサイズはプロットの右側で示 されている。

コモウィルス コモウィルスは主にマメ科植物に感染する少（とも１４種の植物ウィルスの群で ある。それらのゲノムは約２８１１Ｉ１１径の異性粒子で別々に包膜された異な るサイズの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡの２分子からなる。２タイプの核タン パク質粒子は塩化セシウム密度勾配におけるそれらの挙動性からミドル（Ｍ）及 びボトム（Ｂ）成分と称され、粒子内のＲＮＡは各々Ｍ及びＢ　ＲＮＡとして知 られる。双方のタイプの粒子は同一のタンパク質組成を有し、大（ＶＦ３７）及 び小（ＶＦ２３）：＋−トタンバク質各々の６０コピーからなる。核タンパク質 粒子に加えて、コモウィルス調製物はトップ（Ｔ）成分として知られる空の（タ ンパク質のみ）キャプシドを様々な量で含有する。

コモウィルス群のタイプメンバー、カラピーモザイクウィルス（ＣＰＭＶ）のケ ースにおいて、Ｍ及びＢ双方のＲＮＡはポリアデニル化され、小さなタンパク質 （ＶＰｇ）をそれらの５′末端に共有結合させていることが知られている。他の コモウィルスに関して更に限定された研究ではこれらの特徴がその群のすべての メンバーのＲＮＡにより共有されることを示唆している。ＣＰＭＹからの双方の ＲＮＡが配列決定され、ポＩＪ（Ａ）尾部を除いて３４８１（Ｍ）及び５８８９ （Ｂ）ヌクレオチドからなることが示された（ｙａｎ　Ｗｅｘｅｎｂｅｅｋら、 １９１１３；Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｌ及び５ｈｘｎｋｓ、　１９８３）。双方の ＲＮＡは単一の長いオープン読取り枠を含み、ウィルス遺伝子産物の発現は大き な前駆ポリペプチドの合成とその後で開裂から生じる。双方のＲＮＡは全植物の 感染に要求されるが、大きな方のＢ　ＲＮＡは原形質体で独立して複製でき、ウ ィルス粒子はこのケースで産生されない（Ｇｏｌｄｂｘｃｈら。

１９８０）。この観察は、初期の遺伝子研究と合わせれば、コートタンパク質が Ｍ　ＲＮＡによりコードされることを立証した。

ＣＰＭＶの３．５入電子育度地図ではＣＰＭＶとトンブスウイルス、特にトマト ブッシースタント（Ｔ　Ｂ　Ｓ　Ｖ）及びソベモウイルス、特にサザンビーンモ ザイク（ＳＢＭ　Ｖ　）のようなＴ−３植物ウイ／ｌスとの間で明確な関係があ ることを示す。これら後者のウィルスのキャプシドは１８０の同一コートタンパ ク質サブユニットから構成され、各々が単一のβ−バレルドメインからなる。こ れらはピリオン内で３つの異なる位置Ａ、Ｂ及びＣを占めることができる（図１ ）。ＣＰＭＶの２つのコートタンパク質は３つの別個のβ−バレルドメインから なることが示されたが、２つはＶＦ３７に由来し、１つはＶＦ２３に由来する。

このため、Ｔ；３ウイルスと共通して、各ＣＰＭＶ粒子は１８０のβ−バレル構 造から構成される。ＶＦ２３からの単一ドメインはＴＢＳＶ及びＳＢＭＶのＡタ イプサブユニットの場合に類似した位置を占め、一方ＶＰ３７のＮ及びＣ末端ド メインは各々Ｃ及びＢタイプサブユニットの位置を占める（図１）。

ＣＰＭＶとその群のもう１つのメンバー、ボッド・モトル豆ウィルス（ＢＰＭＶ ）の結晶のＸ線回折分析ではＢＰＭＶ及びＣＰＭＶの３−Ｄ構造が非常に類似し ており、一般にコモウィルス群に典型的であることを示している。

ＣＰＭＶ及びＢＰＭＶの構造において、各β−バレルは様々な長さのループによ り接合された逆平行β−シートの８つの鎖から主になる。その鎖の接合性及び名 称は図２で示される。平坦なβ−シートはＢ、Ｃ５ＤＳＥ。

Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩシートと呼ばれ、接合ループはβローβＣ１βＤ−βＥ１βＦ −βＧ及びβＨ−βＩループと称される。

コモウィルスは動物ピコルナウィルスとも構造的に関連している。ピコルナウィ ルスのキャプシドは３種の異なるコートタンパク質ＶＰＩ、ＶＦ６及びＶＰ３Ｐ ２Ｏ６０コピーからなり、各々は単一のβ−バレルドメインからなる。コモウィ ルスのケースのように、これらのコートタンパク質は前駆ポリタンパク質の開裂 により放出され、ＶＦ６−ＶＦ６−ＶＰＩの順序で合成される。

ＣＰＭＶの三次元構造とピコルナウィルスの場合との比較ではＶＦ３７のＮ及び Ｃ末端ドメインがＶＦ２及びＶＦ３に各々相当し、ＶＦ２３がｖＰｌに相当する ことを示した（図１）。構造的位置と遺伝子順序との間における相同性はＶＦ３ ７が２種のピコルナウィルスキャプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＦ６の未開裂形 に相当することを示唆している。

コモウィルスとピコルナウィルスとの主要な差異の１つは、粒子の基本的構造が 非常に類似しているにもかかわらず、コモウィルスのタンパク質サブユニットが ピコルナウィルスでみられるβ−バレルの鑓の間で大きな挿入を欠くことである 。β−シート間における４つのループ（βローβＣ１βＤ−βＥ１βＦ−βＧ及 びβＨ−β■−図２参照）はピリオンの構造一体性を維持する上で重要でないが 、但し本発明によれば動物ウィルスからの抗原部位のような外来ペプチド配列の 発現部位として用いられる。

ＣＰＭＶウィルスの修正 ＣＰＭＶのコートタンパク質中に挿入を行うためには、ウィルスのゲノムを操作 する手段を有することが必要である。転写ベクターｐＰＭＩにおけるＣＰＭＶ　 ＭＲＮＡの全鎖長ｃＤＮＡクローン（ｐ　ＰＭＭ２９０２）は入手可能であった （図３Ａ参照）　（Ａｈｌｑｕｉｓｔ及びＩａｎｄａ。

１９１１４、　ｔ（ａｌｎｅｓ＋ら（１９８９）とＨｏ１ｎｅｓｓ　（１９８９ ））。我々はｐＰＭＭ２９０２からの転写物が高度精製ピリオンＢ　ＲＮＡの存 在下でカラビー葉肉原形質体で電気穿孔された場合に増殖でき、したがってウィ ルスの増殖及び集合に影響を与えることなくウィルスコートタンパク質に修正を 施せることを示した。

ｐＰＭＭ２９０２でのウィルス複製に要求されるタンパク質を提供する上でピリ オンから精製されたＢＲＮＡが野生型Ｍ　ＲＮＡで交差汚染されているという生 じつる危険性からみて、我々はＢ　ＲＮＡの全鎖長ｃＤＮＡクローン、ｐＢＴ７ ４２３を組み立てた（図３Ｂ参照）。Ｂ　ＲＮＡの全鎖長コピーは修正Ｔ７プロ モーターのすぐ下流である。制限酵素Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉでの直鎖化後に、天然Ｂ　 ＲＮＡとサイズが同一の転写物がＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成できる。ｐ ＰＭＭ２９０２及びｐＢＴ７−１２３からの転写物の混合物はカラピー原形質体 中に電気穿孔された場合に全ウィルス感染を生じ、したがって天然Ｂ　ＲＮＡの 使用に置き換わる。

我々は外来ペプチドの挿入用にＶＦ２３でβＢ−βＣループを選択した。このル ープはウィルス粒子の表面上で明らかに露出しており、コンピューターモデリン グではこの部位で挿入された大きなループさえもキャプシド構造及び安定性に関 与する隣接サブユニット間の相互作用に干渉しそうにないことを示した。このル ープは外来配列が挿入されるＭ　ＲＮＡ特異性配列の２７０８位で唯一のＮｈｅ １部位を有する（図４参照）。

ピコルナウィルスの口蹄疫（ＦＭＤＶ）及びヒトライノウィルス（ＨＲＶ）とレ ンチレトロウィルスのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）の主要抗原部位は動物 ウィルスに対するワクチンの産生において本発明の用法を実証するために用いた 。

ＦＭＤＶループタンパク質のセグメントについてコードＣＰＭＶのＶＦ６３（Ｄ １３Ｂ−１３ｃループ中に″ＦＭＤ■ループ”を挿入するため、双方とも長さ８ １残基の２つの相補的オリゴヌクレオチドを化学的に合成した。それらの配列は 図５Ａで示される。ポジティブセンスオリゴヌクレオチドはＦＭＤｖ血清型０１ 株ＢＦＳ１８６０のＶＰＩからのアミノ酸残基１３６−１６０についてコードす る配列を含む。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はＣＰＭｖでみられるコ ドン使用優先性について考慮するためにデザインしたが、スクリーニングを容易 にするため配列の中間にＢ　ｇ　ｌ　１１部位を含む。アニーリングした場合、 オリゴヌクレオチドはＮ　ｈ　ｅ　Ｉ適合末端のある二本鎖ＤＮＡ配列を与える 。このため、そのオリゴヌクレオチドはｐＰＭＭ２９０２の唯一のＮｈｅ１部位 中に挿入できる。ＶＦ２３の配列におけるこのような挿入の効果は図５Ｂで示さ れている。ＦＭＤＶループの挿入を容易にするため、ＦＭＤＶ特異性オリゴヌク レオチドはＶＦ２３についてコードする配列を含むｐｐＭＭ２９０２のＭ１３サ ブクローン中に最初に結合させた。

これはＦＭＤＶ特異性配列を保有するクローンを配列分析で容易に確認できるよ うに行った。すべての標準ＤＮＡ操作はＭｘｎｉａｔｉｓら（１９８２）に従い 実施した。ｐ　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖの組立ての詳細は以下で示され、図６で図示され ている。

ステップ１．プラスミドｐＰＭＭ２９０２はＣＰＭＶＭ　ＲＮＡ特異性配列内に おいて２２９６及び３４２３位で２回切るが、但しプラスミドｐ　Ｐ　Ｍ　ｌの 配列内では切らない制限酵素５ｓｔｉで切断した。アガロースゲル電気泳動後に 、大（６、０ｋｂ）及び小（１，１ｋｂ）双方の断片をゲルから電気溶出により 精製した。１．１ｋｂＳｓｔＩ断片をバクテリオファージＭｌ　３ｍｐ　１８か らの５ｓｔＩ切断ホスフアターゼ処理複製形ＤＮＡ中に結合させた。結合混合物 は塩化カルシウム操作を用いて大腸菌株ＪＭ１０１を形質転換するために用いた 。ＭＲＮＡからの１．　１ｋｂＳ　ｓ　ｔ　Ｉ断片を含むプラークはＬａｃ相補 性アッセイ及びＤＮＡ配列分析により確認し、１つのＭ１３−ＪＲＩを次の研究 用に選択した。

ステップ２．Ｍ１３−ＪＲＩの二本鎖復製形ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｅ １７　（＋９７９）の方法により感染大腸菌株ＪＭ１０１細胞から単離した。精 製ＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩでの切断により直鎖化し、直鎖化プラスミドを子牛 腸ホスファターゼで処理した。ＦＭＤＶからのＶＰＩのアミノ酸残基１３６−１ ６０についてコードするＮｈｅｌ適合末端のある２つのオリゴヌクレオチドはポ リヌクレオチドキナーゼを用いてＡＴＰでリン酸化し、煮沸及び徐冷却で互いに アニーリングさせた。アニーリングされたオリゴヌクレオチドをＮｈｅＩ切断Ｍ １３−ＪＲＩ中に結合させ、結合混合物を用いて大腸菌株ＪＭＩＯＩを形質転換 させ、形質転換混合物をＪＭＩＯＩ地に塗った。

多数のプラークをプレート上で見出したが、そのうちの２０は配列分析用に選択 した。バクテリオファージをＪ　Ｍ　１０１で増殖させ、一本鎖ＤＮＡを正確に ５ｘＢｃｔら（１９８ｉ１）で記載されたように単離した。ＮｈｅＩ部位周囲に おけるバクテリオファージＤＮＡの領域のヌクレオチド配列はプライマーとして Ｍ　ＲＮＡ配列のヌクレオチド２７３５−２７５２に相補的な１８マーのＳ’　 ＡＧＴ−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＴＧ丁−ＡＡＣ−Ｇ丁Ｃ３’　を用いてＢｉｇｇＩら （１９８３）ｌこより修正されたようなジデオキシ法で決定した。分析されたプ ラークの中で、１つの名称Ｍ１３−ｕｓｈａｌは正確な向きで望ましい配列の単 一コピーを有していた。

ステップ３．Ｍ１３−ｕｓｈａＩを大腸菌株ＪＭＩＱ１で増殖させ、複製形ＤＮ ＡをＢｉｒｎｂａｉｍ及びＤｅｌｒ　（１９７９１の方法により感染細胞から単 離した。そのＤＮＡを５ｓｔＩで切断し、１．１ｋｂ断片をアガロースゲル電気 泳動で精製した。この断片を子牛腸ホスファターゼで処理されたｐＰＭＭ２９０ ２（前記参照）からの大きな（６，０ｋｂ）　Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉ断片に結合させた 。結合混合物は塩化カルシウム法を用いて大腸菌株ＪＭ８３を形質転換させるた めに用いた。形質転換混合物を１００μｓ／ｍｌカルベニシリン含有し寒天プレ ート上に塗り、そのプレートを３７℃で一夜インキユベートした。１２のカルベ ニシリン耐性コロニーを次の研究用に選択した。クローンをＬブロス中で１１培 養物として増殖させ、プラスミド“ミニプレツブ“（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を調製 し、制限酵素切断により分析した。酵素ｓｓ　ｔ　ＩＳＢｇｌｌｌ及びＥＣ０Ｒ ｖでの切断により得られたパターンから、４コロニーが正確な向きでＦＭＤＶ特 異性オリゴヌクレオチドの配列を含むＣＰＭＶの全鎖長クローンからなることを 導き出すことができた。次いで、これらのうちの１つｐＦＭＤＶを大規模に増殖 させ、プラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂａｉｍ及びＤｏ１７　（１９７９）の方法 により単離し、塩化セシウム／臭化エチジウム勾配（Ｍｘｎｉｚｔ目ら、　１９ ｇ２）を用いて遠心により更に精製した。

ｐＦＭＤＶ転写物の性質 １、精製ｐＦＭＤＶ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断により直鎖化し、正確にＨｏｔｎ ｅｓｓら（１９Ｎ＋によりｐＰＭＭ２９０２に関して記載されたように大腸菌Ｒ ＮＡポリメラーゼを用いて転写した。ホルムアルデヒド含有アガロースゲルの産 物の電気泳動（Ｌ！ｈ「ｘｃｈら、　１９７７）では標準ウィルスＭ　ＲＮＡと 同時移動する転写物の存在について現した。

２、鋳型ＤＮＡを除去するためＤＮＡ５ｅｌでの処理と塩化リチウム沈降の後に 、転写物を３５８−メチオニンの存在下においてメツセージ依存性ウサギ網状赤 血球系（Ｐｅｌｈｘｍ及びＩｘｃｋ＋ｏｎ、　１９７６）でインビトロ翻訳した 。その産物をＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により試験しくｌ ａｅａｍｌｉ、　１９７０）、乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより視覚化 した。オートラジオグラフでは天然Ｍ　ＲＮＡの翻訳産物と同時移動する１０５ 及び９５　ｋＤｚの２つのタンパク質の存在について現した。

３、植物細胞で複製されるｐ　ＦＭＤＶの転写物の能力を下記のように試験した ：カラピー葉肉原形質体をｄｅＶｘｔｅｎｎｅｓら（１９８５）により記載され たように調製した。ｐＦＭＤｖからの転写物をｐＢＴ７−１２３　Ｃ全鎖長コピ ーＢ　ＲＮＡを含むプラスミド）からの転写物とミックスし、Ｈａｌｎｕ＋ら（ １９８９）により記載されたように原形質体中に電気穿孔した。コントロールと して、原形質体の同調製物のサンプルをｐ　ＢＴ７−１２３及びｐＰＭＭ２９０ ２からの転写物の混合物で電気穿孔した。電気穿孔後７２時間目に原形質体を収 集し、核酸をｄｅ　Ｖａｒｅｎｎｅｓら（１９８５）により記載されたように抽 出した。ＲＮＡのサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で電気泳動 しくＬｅｈｔａｃｈら、１９７７）、核酸をハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ膜〔 アマ−ジャム・インターナショナル（入ｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅ！ｎａｔｉｏｎ ａｌ））上にプロットした。核酸をＵＶ光照射で膜に架橋させた。その膜はＦｅ １ｎｂｅＢ及びＶｏｇｅｌｓｊｅｉａ（１９８３）により記載されたように３２ Ｐで標識されたＭＲＮＡのヌクレオチド４８２−２２１１に相当するＨ　ｉ　ｎ 　ｄ　ＩＩＩ断片形ｐ　Ｐ　Ｍ　Ｍ　２９０２を用いてＭＲＮＡ配列についてプ ローブ探査した。ｐＢＴ７−１２３とｐＰＭＭ２９０２又１ｔｐＦＭＤＶ　−１ のいずれかで電気穿孔された原形質体からのサンプルはＭＲＮＡ特異性配列の存 在について現し、ＦＭＤＶループについてコードする配列の存在が転写物の複製 を妨げないことを確かめた。ｐ　ＦＭＤＶ復製の子孫がＦＭＤＶループについて コードする配列を保有していることを確認するため、複製膜を“オリゴ標識”さ れたポジティブセンスＦＭＤＶオリゴヌクレオチドでプローブ探査しくＦｅ１ｎ ｂｅＢｇ及びｖａｇｅｌ＋＋ｅｉｎ、　１９８３）、（＋）センス特異性プロー ブを得た。ｐＢＴ７−１２３及びｐＦＭＤＶ転写物の混合物で電気穿孔された原 形質体からのサンプルはＭ　ＲＮＡに関して予想される位置で明らかなシグナル を示したが、そのシグナルはｐＰＭＭ２９０２コントロールに存在しなかった。

４、ＦＭＤＶループを含むタンパク質サブユニットがピリオンに集合することを 立証するため、感染原形質体からの抽出物を免疫吸着電子顕微鏡観察によりウィ ルス粒子の存在に関して試験した。ｐＢＴ７−１２３及びｐＦＭＤＶからの転写 物の混合物で電気穿孔された原形質体のサンプルを２３ゲージ針で反復通過によ り溶解させた。抽出物をエッベンドルフ小遠心管で遠心し、上澄を試験用に保留 した。１０μｌサンプルの上澄を抗ＣＰＭＹ抗血清でコートされた全電子顕微鏡 （ｅｍ）グリッドと共にインキュベートした。洗浄と酢酸ウラニル染色の後に、 そのグリッドをＪ　ＥＯＬ　１２００電子顕微鏡を用いて試験した。ＣＰＭＶピ リオンの特徴的外観を有する２８ｎｍ径の粒子がみられた。これはＶＰ２３にお けるＦＭＤＶループの存在がウィルス集合を妨げないことを証明している。

前記は本発明に従い修正された植物ウィルスが植物原形質体中に電気穿孔された 場合に増殖してウィルス粒子に集合することを立証している。修正された植物ウ ィルスを大規模に産生ずるためには、全植物に直接接種できて前記原形質体系の ように複製してウィルス粒子に集合する組立て物を製造することが必要である。

したがって、我々は得られる転写物がそれらの５′末端で“キャップ”構造をと り、ＲＮＡ合成がより効率的なプロモーターにより駆動されるようにｐ　Ｐ　Ｍ 　Ｍ　２９０２を修正した。

ｐＭＴ７−６０１　（図７）を産生ずる上でｐＰＭＭ２９０２の修正に関するス テップは以下で詳細に記載されて１、精製ＣＰＭＶ　Ｍ　ＲＮＡに対する１番鎖 ｃＤＮＡはプライマーとしてｐｄＴ　を用いて正確に＋２−１８ ２−１８Ｌｏ＋＋ｏｌ！　ら（１９Ｂ２）により記載されたように合成した。

２番鎖合成は下記オリゴヌクレオチドを用いてプライミングした。

Ｐ＋ｔｌ　Ｔ７　プロモーター　↓５′　末　ｌ　Ｍ　ＲＮＡ５’　ＣＣＣＴＧ ＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＴＴＡＡＴ ＡＧ合成条件はＬｏｍｏｎｏｓｔｏｆｆら（１９８２）及び５ｈａｎｋｓら（１ ９８６）で記載されたとおりであった。

２、二本鎖ｃＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩ　（１５０４位でＭ　Ｒ ＮＡ配列を開裂する）で切断し、１、　５ｋｂＰ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｂ　ａｍＨＩ断 片をＰｓｔＩ／ＢａｍＨ１切断Ｍｌ　３ｍｐ　１８に結合させた。結合ミックス を用いて大腸菌株ＪＭＩＯＩを形質転換させた。インサート保有組換えファージ をｌａｃ相補性アッセイにより確認し、ｌ１１ｇｇ１ｎら（１９１１３１により 修正されたように“Ｔ−トラック”分析（Ｓ！Ｂｅ＋ら、１９８０）で正確なイ ンサートの存在に関して調べた。１つのクローンＭ１３−ＭＴ７−６を次の分析 用に選択し、Ｍ　ＲＮＡ特異性配列の５−末端２００ヌクレオチドの配列をＢｉ ｇｇｉｎら（１９８３）により記載されたように決定したところ、ｐＰＭＭ２９ ０２における相当配列と同一であることを示した。

３、二本鎖複製ＤＮＡをＢｉ＋ｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ　（１９７９１の方法に よりＭ１３−ＭＴ７−６で感染された大腸菌ＪＭＩ０１細胞から単離した。二本 鎖ＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢｇｌｌｌ（１８９位でＭ　ＲＮＡ配列を切断する）で 切断し、放出された２００ｂｐ断片をアガロースゲル上での電気泳動とそれから の電気溶出により精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。

４、プラスミドｐ　Ｐ　Ｍ　Ｍ　２９０２　（Ｈｏｌｎｅｓ＋ら、　１９８９） をＰｓｔＩ及びＢｇｌｌｌで切断して１，１及び６．Ｏｋｂの２つのＤＮＡ断片 を産生じた。小さい方（１，１ｋｂ）の断片はＣＰＭＶ　Ｍ　ＲＮＡの配列の最 初の１８９ヌクレオチドに結合された大腸菌プロモーターの配列を含み、一方大 きい方（６、Ｏｋｂ）の断片はｐＵＣ９に結合されたＭ　ＲＮＡの配列の残りを 含む。切断物を子牛腸ホスファターゼで処理し、２つの断片をアガロースゲル電 気泳動で分離し、６．Ｏｋｂ断片を電気溶出により回収した。

５、Ｍ１３−ＭＴ７−６からの２００ｂｐＰ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｂｇ１］１とｐ　Ｐ 　Ｍ　Ｍ　２９０２からの６．０ｋｂ断片を一緒に結合させ（ＭＢｉａｔｉ＋ら 、　１９８２）、混合物を用いて大腸菌株ＪＭ８３を形質転換させた。カルベニ シリン耐性コロニーの数を確認したところ、１つのｐＭＴ７−６０１は望ましい 構造を有することが示された。したがって、大規模量のプラスミドｐＭＴ７−６ ０１はｐＦＭＤＶに関して記載されたように製造した。

６、ＥｃｏＲＩで直鎖化後、プラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　７−６０１はＴ７ＲＮＡポ リメラーゼを用いて転写してＲＮＡを得たが、これはホルムアルデヒド含有アガ ロースゲル上で分析した場合に天然ピリオンＭ　ＲＮＡとサイズが同一であった （Ｌｅｈｔａｃｈら、１９７７）。転写物の収率は直鎖化鋳型ＤＮＡのμｇ当た り約１μｇの全鎖長Ｍ転写物であった。

７、ｐＭＴ７−６０１及びｐＢＴ７−１２３からのＴ７転写物の混合物をカラピ ー葉肉原形質体中に電気穿孔した場合、子孫ＲＮＡのノザンプロット分析ではｐ ＭＴ７−６０１からの転写物が生物学的に活性であることを示した。原形質体単 離及び核酸分析のために用いられた方法はｐ　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖの生物学的性質を 分析するために用いられた場合と同一であった。

カラビー植物におけるキャップ化ｐＢ７７−１２３及びｐＢＴ７−１２３及びｐ Ｍ７７−６０１のサンプルを各々Ｍｌｕｌ及びＥｃｏＲＩで直鎖化した。直鎖化 された鋳型の一部は本質的にＸ１Ｂｌｅ＋−Ｇｔｘａｆら（１９８１１）により 記載されたようにＧｐｐｐＧの存在下で７７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し た。転写反応液は０　、　１　ｍｇ／ｍｌ直鎖化ＤＮＡ鋳型、ｐＨ８，０の４０ ｍＭｈリスＨＣ１゜２５ｍＭＮａＣＬ、８ｍＭＭｇＣ１２ｍＭ塩酸塩酸スペルク ジ２ ″−各０．５ｍＭのＵＴＰ、ＡＴＦ’及びＣＴＰ。

０．０２５ｍＭＧＴＰ、０．５ｍＭＧｐｐｐＧ、０．０５ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　 Ａ、　１０ｍＭＤＴＴ、　２００単位／ｍ１ＲＮＡガードを含有していたが、転 写を１４００単位／ｍｌの最終濃度までＴ７ＲＮＡポリメラーゼの添加により開 始させた。

インキュベートは３７℃で２時間であった。３０．６０及び９０分間目にＧＴＰ の５ｍＭ溶液の一部（転写反応液１ｍｌ当たり５μりを加えた。転写後、ＥＤＴ Ａを１５１ｎＭ最終濃度まで加え、転写物の一体性をホルムアルデヒド含有アガ ロースゲル上で電気泳動により調べた。転写混合物を２倍容量のフェノール／ク ロロホルム（１，１マ／ｙ）で抽出し、核酸をエタノールで２回沈降させた。核 酸を遠心により収集し、エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。核酸を植物 への接種のためｐＨ８，０の５０ｍＭトリスリン酸に溶解させた口 １０日齢カウピー〔ビグナ・ウンギクラタ変種カリフ中ルニアササゲ（Ｖｉｇｎ ｉ　ｕｎｇｕｉｃｕｌｕｔ　マａｒ、　Ｃｘ１ｉｆｏｒｎｉａｂｌｘｃｋｅ７ｅ ）　〕の−次葉をカーボランダムでダスト化し、ｐＭＴ７−６０１及びｐＢＴ７ −１２３に由来する転写物の１　＋　１　（Ｗ／ｖ）混合物を穏やかにこすり合 わせながら葉に適用した。様々な転写物濃度を用いたが、但しすべてのケースに おいて最終接種原容量は５０μ！であった。

得られた結果は、全量５μｇの各転写物を一次葉当たりで適用した場合に、接種 された植物の１００％がＣＰＭＶ感染に特徴的な症状を日常的に現すことを示し た。このような植物の接種及び上部双方の葉におけるＣＰＭＶ特異性配列の存在 は“ドツトプロット”分析により確認した。接種葉及び三葉のサンプルは１０号 コルク穿孔器を用いて採取し、１１０１ＩＩリン酸ナトリウム０．４ｍｌに漫° 　して抽出した。そのサンプルを遠心し、上澄５μ！を２０ＸＳＳＣで前湿潤さ れたニトロセルロースフィルターに適用した。核酸をＵＶ光照射で膜に架橋させ 、ＭＲＮＡ配列のヌクレオチド４８２−２２１１からなる３２Ｐ　“オリゴ標識 ”　（ＦｅｉｎｂｅＢ及びＶｏｇｅｌ＋ｔｅｉｎ、　１９８３）プローブを用い てＭ　ＲＮＡ特異性配列についてプローブ探査した。ハイブリッド形成及びフィ ルター洗浄に関する条件は１ｌｘｎｉａｔ目ら（１９８２）により記載されたと おりであった。乾燥後、フィルターをオートラジオグラフィーに付した。強いハ イブリッド形成シグナルはＣＰ　Ｍ　Ｖ特異性配列の存在を示した。

ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ、ｐＭＴ７−ＨＩＶ及びｐＭＴ７−ＨＲＶの組立て ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−Ｉを組立テルタメ、ｐＭＴ７−６０１及びｐＦＭＤＶを 双方とも制限酵素５ｓｔＩで切断し、しかる後ｐＭＴ７−６０１からの切断物を 子牛腸ホスファターゼで処理した。５ｓｔＩはＭ　ＲＮＡ特異性領域の２２９６ 及び３４２３位で各プラスミドを２回切断して１．１ｋｂ断片を放出する。既に 記載されたように、この５ｓｔＩ断片はＦＭＤＶループ挿入が行われたβＢ−β Ｃループを有するＶＰ２３の領域を含んでいる。

アガロースゲル上で電気泳動後、ｐＦＭＤｖからの１゜ｌｋｂ断片とベクター配 列及びＭ　ＲＮＡ特異性配列の残り全部を含むｐ　Ｍ　Ｔ　７−６０１からの５ ．１ｋｂ断片を電気溶出により回収した。２つの５ｓｔＩ断片を一緒に結合させ 、その混合物で大腸菌株ＪＭ８３を形質転換させた。いくつかのカルベニシリン 耐性コロニーを選定し、“ミニプレツブ”を造り、プラスミドＤＮＡを制限酵素 切断により試験して、ＦＭＤＶループを含む組換え体を確認した。１つのこのよ うなりローンを確認してｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉと命名し、大規模で増殖させた 。すべてのＤＮＡ操作はｐＦＭＤＶ及びｐＭＴ７−６０１の組立てに関して記載 されたとおりであった。

ｐＦＭＤｖとその誘導体ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−１では双方ともＶＰ２３のβＢ −βＣルーβＣループ中に挿入している。外来配列の挿入に際してループのサイ ズ増加を制限するために置換ベクターをデザインしたが、その場合に外来配列は 天然βＢ−βＣループに加えられるよりもむしろＶＰ２３においてそれと置き換 わる。ＶＰ２３についてコードするＣＦ’ＭＶゲノムの領域のヌクレオチド配列 において、２７４０位における単一のサイレント塩基変化（ＵからＣへ）はアミ ノ酸バリン２７において唯一のＡａｔ１１部位を形成する。Ｍ　ＲＮＡの配列に おける変化は図８で示されている。Ａａｔ１１部位の形成によればＣＰＭＶにお いて天然βＢ−βＣループからの６アミノ酸についてコードするヌクレオチド配 列をＮｈｅＩ及びＡａｔｌｌ切断で除去することができる。その後に、その配列 はＮｈｅＩ及びＡａｔｌｌ適合末端で何らかの配列により置き換えることができ る。

２つの異なる配列を変異Ｍ　ＲＮＡ配列のＮｈｅＩ及びＡ　ａ　ｔ　Ｉｆ！位間 の配列に置き換わるようにデザインした。ＶＰ２３中に置換される第一の配列は ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）の経膜糖タンパク質ｇｐ４１からの残基７ ３５−７５２についてコードするオリゴヌクレオチドからなっていた。この配列 はこの領域に関する合成ペプチドが血清陽性エイズ患者の抗血清による酵素結合 免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で認識され、ある範囲のＨＩＶ−１単離物を中 和する抗体を誘導できることから選択された（にｅｎｎｅｄ７ら、　１９８６； Ｃｈａｎｈら、　１９８６；Ｄｘｇｌｅｉ＋ｈら、１９８８］。第二の配列はヒ トライノウィルス１４　（ＨＲＶ１４）　のＶＰ　１からの残基８５−９９＋＝ ついてコードするヌクレオチド配列からなる。双方のケースにおいて、オリゴヌ クレオチドはスクリーニングを容易にするため制限酵素部位を含むようにデザイ ンした。

オリゴヌクレオチドの配列とＶＰ２３のアミノ酸配列における置換の効果は図９ 及び１０で示されている。ｐＭＴ７−ＨＩＶ及びｐＭＴ７−　ＨＲＶ（７）組立 テニ関すルステップは以下で示され、図１１で図示されている。

ステップ１．Ｍ１３−ＪＲ−１（図６参照）を大腸菌株ＣＪ２３６で増殖させ、 ｄＵ金含有本鎖ＤＮＡをＫｕｎｋｅｌ　（１９１１５）により記載されたように 単離した。ＭＲＮＡ配列の２７４０位におけるＴからＣへの変異はＫｕｎｋｅｌ 　（１９８５）により記載されたようにプライｖ　−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＴＧＡ− ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＡＡＡ−人を用いてｄＵ金含有本１１Ｍ１３−ＪＲＩＤＮＡの オリゴヌクレオチド特定変異誘発により行った。これによりクローンＭ１３−Ｊ ＲＡａｔｌｌを組み立てた。変異は一本鎖ＤＮＡのジデオキシ配列分析（Ｂｉｇ ｇｉｎら、１９８３）と二本鎖複製形ＤＮＡの制限酵素切断により確認した。

ステップ２．Ｍ１３−　ＪＲＡａ　ｔｌｌの復製形ＤＮＡを単離し、ＮｈｅＩ及 びＡａｔｌｌで切断し、子牛腸ホスファターゼで処理した。図９及び１０で示さ れたオリゴヌクレオチドの対をポリヌクレオチドキナーゼを用いでＡＴＰでリン 酸化し、蕉沸及び徐冷却で一緒にアニーリングさせ、ＮｈｅＩ／Ａａｔ［Ｉ切断 Ｍｌ　３−　ＪＲＡａ　ｔｌｌ中に結合させた。挿入配列を保有する組換えＭ１ ３クローンは正確にｐＦＭＤＶに関して前記されたように一本鎖バクテリオファ ージＤＮＡの配列分析により確認した。

２つのクローン、必要配列を含むＭ１３−ＨＩＶ及びＭ１３−ＨＲＶを確認し、 二本鎖複製形ＤＮＡを単離したところ、これは制限酵素切断で予想されるパター ンの断片を与えることを示した。

ステップ３．Ｍ１３−ＨＩＶ及びＭ１３−ＨＲＶからの複製形ＤＮＡを５ｓｔＩ で切断し、１．２ｋｂＭＲＮＡ特異性断片をアガロースゲル上で切断物の電気泳 動後に電気溶出により回収した。１．２ｋｂ断片をｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−１の産 主に関して前記されたようにｐＭＴ７−６０１からの大きな５ｓｔＩ断片中に結 合させた。

結合混合物を用いて大腸菌株ＪＭ８３を形質転換させ、カルベニシリン耐性コロ ニーを選択した。２つのクローン、名称ｐＭＴ７−ＨＩＶ及びｐＭＴ７−ＨＲＶ ＋！制限酵素地図作製及びヌクレオチド配列分析により望ましい構造を含むこと が示された。

転写のために、ｐＭＴ７−ＨＩＶ及びｐＭＴ７−ＨＲＶをＥｃｏＲＩ切断により 直鎖化した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写はｐＭＴ７−６０１及びｐＭ Ｔ７−１２３に関して記載されたように正確に実施した。得られた転写物は天然 ピリオンＲＮＡとサイズが同一であった。

カラビー原形質体で複製しうるｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−Ｉ及びｐＭＴ７−ＨＩＶ 転写物の能力の証明ｐＭＴ７−６０１、ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ又はｐＭＴ７− ＨＩＶいずれかのインビトロ転写物の１０μｇサンプルをｐＢＴ７−１２３から の転写物の１５μｇサンプルとミックスし、その混合物を用いて１０６カウピー 葉肉原形質体を電気穿孔した。サンプルを直ちに（０時間）又は２５℃光下で７ ２時間にわたる原形質体のインキュベート後に採取した。核酸を各サンプルの１ ７４から抽出し、前記のように１％ホルムアミド含有アガロースゲル上で電気泳 動した。核酸をハイボンドＮ上にプロットし、ＵＶ照射で膜に架橋させ、前記の ようにＣＰＭＶ　Ｍ　ＲＮＡ特異性配列に関してプローブ探査した。各ケースに おいて、位置がＭ　ＲＮＡに相当する強いハイブリッド形成シグナルは０時間で はなく７２時間のインキュベートサンプルで検出できたが、これは４種すべての 組立て物からの転写物がカラピー原形質体で増殖できることを証明している。

各原形質体サンプルの残り３／４を前記のように溶解させ、抗ＣＰＭＶ血清でコ ートされた電子顕微鏡グリッドに塗布した。次いでそのグリッドはＪＥＯＬ１２ ００電子顕微鏡を用いて試験した。多数の粒子がｐＭＴ７−６０１、ｐＭＴ７− ＦＭＤＶ−１及びｐＭＴ７−ＨＩＶ転写物で電気穿孔された原形質体の７２時間 サンプルでみられた。これらの結果はｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−Ｉ及びｐＭＴ７− ＨＩＶでコードされた修正コートタンパク質がピリオンに集合できることを示し ている。

全カラピー植物で複製しうるｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ及びｐＭＴ７−ＨＩＶ転写 物の能力 ｐＢ７７４２３に由来する転写物の存在下において全カラビー植物で複製しうる ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ　−Ｉ及びｐＭＴ７−ＨＩＶからの転写物の能力を証明す るため、ＧｐｐｐＧでキャップされた転写物を前記のように製造した。各々５． １０日齢からなる６群のカラピーを前記方法により転写物で接種した。各ケース において、転写物の量は個々の葉に適用された量に関する。

群１：ｐＨ８，０の５０ｍＭ）リスリン酸で偽接種群２：１．５μｇの天然ＣＰ ＭｖピリオンＲＮＡで接種群３：各５μｇのｐＭＴ７−６０１＋　ｐＢ７７−１ ２３転写物で接種群４：各５　ｔｔ　ｇ　ノｐＭＴ７−ＦＭＤＹ−１＋　ｐＢ７ ７−１２３転写物で接種群５：各５１１　ｇ　（７）　ｐＭＴ７−ＨＩＶ＋　ｐ ＢＴ７−１２３転写物で接種症状を日ベースで評価し、各植物からの葉組織のサ ンプルを“ドツトプロット”分析のため接種後１１日目に採取し、前記のように 実施した。群４及び５において全植物から葉組織の残りを収集し、将来の使用の ために凍結した。

結果 群１（偽接種）の植物はいずれも感染後（Ｐ、　１．）　１１日以内でどんな症 状も呈さず、ＣＰＭＶ特異性核酸は“ドツトプロット”分析による葉組織で検出 できなかった。

これはＣＰＭＶによるカラピー植物の偶発的感染が実験中に生じなかったことを 示している。群２及び３（ピリオンＲＮＡ又はｐＭＴ７−６０１及びｐＭＴ７− １２３転写物の混合物のいずれかで接種）におけるすべての植物は７日［’、　 １．までに接種及び全身双方の葉で強い症状を現した。葉組織の“ドツトプロッ ト”分析では全植物の接種及び全身双方の葉で多量のウィルス特異性ＲＮＡの存 在を示した。これは実験で用いられた植物がピリオンＲＮＡ又は野生型転写物の 混合物いずれかを用いたＣＰＭＶ感染に十分に感受性であったことを認めている 。

１１日Ｐ、　１．までに群４　（ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ転写物で接種）におい て全植物の接種葉は野生型ウィルス感染に通常伴う場合とは異なる斑点外観を呈 した。この結果はｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉからの転写物が全カラビー植物で増殖 して細胞対細胞により伝搬できることを示す。

群５　（ｐＭＴ７−ＨＩＶ転写物で接種）において５例中４例の植物は１１日Ｐ 、Ｉ、までにそれらの全青葉で症状を呈した。“ドツトプロット”分析では症状 を示す植物が接種及び全身双方の葉で実質量のウィルス特異性配列を有すること を示した。この結果はｐＭＴ７−ＨＩＶからの転写物が全カラピー植物内で増殖 して伝搬できることを示す。

ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ−Ｉ及びｐＭＴ７−ＨＩＶで得うレバク質が群４植物の接 種葉で合成されたことを証明するため、凍結葉組織のサンプルを微粉砕し、ｌ× レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝液で抽出した。抽出物を１５％ポリアク リルアミド−５ＤＳゲルで電気泳動し、タンパク質をバイオラッド（Ｂ　ｉ　ａ 　ｒ　ａ　ｄ）セミトライトランスファー細胞を用いてニトロセルロース膜に移 した。その膜を全ＣＰＭＶウィルス粒子に対する血清又はＦＭＤＶａＯｌのＶＰ Ｉの残基１４１−１６０に相当する合成オリゴペプチドＶＰＮＬ［１ＧＤＬＱＶ ＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ　（ＣＧ）　ｌ：対する血清のいずれかでプローブ探査し た。この配列はｐＭＴ７−ＦＭＤＶにおいてＶＰ２３中に挿入されたエピトープ に相当する。

双方の抗血清ともウサギで得た。ウェスタンプロット分析は二次抗体としてアル カリホスファターゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて実施した。５例すべての 群４植物のタンパク質抽出物は抗ＣＰＭＶ血清と反応することがわかったが、こ れはウィルスコートタンパク質が群４植物の接種葉で合成されたことを示す。類 似のプロットを抗ＦＭＤＶオリゴペプチド血清でプローブ探査した場合、単一バ ンドが群４植物の各々からの抽出物で現れた（図１１）。このバンドは見掛は分 子量２４　ｋＤｘで移動したが、これはＦＭＤＶループを有するＶＰ２３に関し て予想されたサイズそのものである。類似サイズの産物は偽接種又は野生型ＣＰ ＭＶ接種葉からの抽出物を分析した場合にみられなかった（図１１）。同様に、 精製された野生型ＣＰＭＶコートタンパク質もＦＭＤＶ特異性抗血清と反応した 。更に、抗ＣＰＭＶ血清を得るために用いられたペプチドによるその血清の前処 理は群４植物からの抽出物との反応を消失させたが、これは免疫反応の特異性を 証明している。これらの結果は群４植物の接種葉がＦＭＤＶループ保有ＣＰＭＶ コートタンパク質を含有していたことを証明している。

ｐＭＴ７−ＨＩＶ：前記のように、群５植物からの接種及び全身双方の葉の“ド ツトプロット”分析ではｐＭＴ７−ＨＩＶからの転写物が全植物で増殖して伝搬 できることを示した。得られたシグナルのレベルと感染が全身に及ぶという事実 は子孫ＲＮＡが包膜されることを示す。

ＨＩＶ特異性インサートが子孫ＲＮＡで保留されたことを立証するため、群５植 物からの抽出物の“ドツトプロット“をＨＩＶインサート特異性プローブでプロ ーブ探査した。これはＩ）ＭＴ７−ＨＩＶの組立てで用いられたポジティブセン スオリゴヌクレオチドを“オリゴ標識する”ことにより行った（図９参照）。得 られた結果は症状を示す４植物の接種葉の抽出物でＨｉ　Ｖ配列の存在を示した 。

ＦＭＤＶエピトープ保有ＣＰＭＶによる結果の拡張ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ　−Ｉ に由来する転写物で得られた既発見を拡張するため、５カウビー植物の５群を前 記のように製造されたキャップ化転写物で下記のように接種した・ 群１：ｐＨ８，０の５０ｍ１Ｉｌトリスリン酸で偽接種群２：　０５μｇの天然 ＣＰ１ＭＶピリオンＲＮＡで接種群３・ＧｐｐｐＧキャップ化ｐＭＴ７−６０１ ＋　ｐＢＴ７−１２３転写物５μｇで接種 群４　：　ＧｐｐｐＧ　−＊　ヤｙｙブ化ｐＭＴ７−ＦＭＤＬＩ　＋　ｐＢＴ７ −１２３転写物５μｇで接種 症状を日ベースで評価した。接種後１３日目に三葉ディスクサンプルを各植物の １枚の接種葉及び１枚の三葉から採取した。サンプルを下記のように処理した： サンプル１（粗製ホモゲネート）：ｐＨ７，０の１０１リン酸ナトリウム緩衝！ ０．４ｍｌ中でホモゲナイズし、遠心し、上澄を回収した。

サンプル２　（ＲＮＡ抽出物）：液体窒素で凍結し、微粉砕し、核酸をフェノー ル／クロロホルムで抽出した。

エタノール沈降後、核酸を最終的に水０．１０１１に再懸濁した。

サンプル３（タンパク質抽出物）：液体窒素で凍結し、微粉砕し、粉末を１×レ ムリサンプル緩衝液０．１ｍｌに溶解した。

“ドツトプロット“を５μ！ずつのサンプル１及び２から調製し、前記のように 製造されたＣＰＭＶ　Ｍ　ＲＮＡのヌクレオチド４８２−２２１１に特異的なプ ローブ（ＣＰＭＶ特異性プローブ）又はＦＭＤＶ特異性インサートに特異的なプ ローブのいずれかでプローブ探査した。後者は図５で示されたポジティブセンス オリゴヌクレオチドを１オリゴ標議する”ことにより製造した。ウェスタンプロ ットをサンプル３の一部から調製し、前記のようにＦＭＤＶ特異性エピトープに 関してプローブ探査した。ＩＳＥＭはサンプル１の一部で実施した。

結果 症状は群１（偽接種）植物のいずれでも現れなかった。

粗製ホモゲネート又はＲＮＡ抽出物のドツトプロットではＣＰ　Ｍ　Ｖ特異性又 はＦＭＤＶ特異性配列が接種葉又は三葉いずれの抽出物にも存在しないことを示 した。抗ＣＰＭＶ血清でコートされた電子顕微鏡グリッドを用いた粗製ホモゲネ ートのＩＳＥＭではウィルス粒子が存在しないことを示した。ＦＭＤＶ特異性血 清を用いたタンパク質抽出物のウェスタンプロット分析ではあらゆるＦＭＤＶエ ピトープの不存在を示した。これらの結果は残りの実験に関するネガティブコン トロールを与える。

症状は群２（ピリオンＲＮＡ接種）及び群３　（ｐＭＴ７−６０１＋ｐＢＴ７− １２３）接種植物すべての接種葉及び三葉双方で７日Ｐ、　１．までに現れた。

１１日Ｐ、１．までに一次葉における病変部が２〜３■の径に広がった。

粗製ホモゲネート及びＲＮＡ抽出物双方のドツトプロットではＦＭＤｖ特異性配 列ではなくＣＰＭＶ特異性配列の存在について現した。抗ＣＰＭＶ血清でコート されたグリッドを用いたＩＳＥＭでは接種葉及び三葉双方からの粗製ホモゲネー トで多数のＣＰＭＶ粒子の存在を示した。タンパク質抽出物のウェスタンプロッ ト分析ではあらゆるＦＭＤＶエピトープの不存在を示した。

小さな病変部（径約１　ｍａ＋）が１１日Ｐ、　１．までに群４（ｐＭＴ７−　 ＦＭＤＶ−Ｉ＋ｐＢＴ７−１２３）接種植物の接種葉で現れた。葉（サンプル２ ）から抽出されたＲＮＡのドツトプロットでは群４植物５例中３例の接種葉でＣ ＰＭＶ及びＦＭＤＶ双方の特異性配列の存在を示した。抗ＣＰＭＶ血清でコート されたグリッドを用いたＩＳＥＭでは群４植物５例中４例の接種葉からの粗製ホ モゲネートでＣＰＭＶ様ウィルス粒子の存在を示した。

タンパク質抽出物（サンプル３）のウェスタンブロッティングでは群４植物すべ てからの抽出物において小さなコートタンパク質上でＦ　Ｍ　Ｄ　Ｖエピトープ の存在を示した。これらの結果はｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ　−Ｉからの転写物が全 カラピー植物で増殖できることを確認し、ウィルス粒子がこのような植物で産生 されることを示す。

転写物接種植物からウィルスの製造 ｐＭＴ７−　ＦＭＤＶ　−Ｉ感染葉組織からウィルス粒子を単離するため、下記 方法を開発した：各５μｇのｐＢＴ７−１２３及びｐＭＴ７−ＦＭＤｖ転写物で 接種された一次カウビー葉２２ｇを接種後１６日目に収集した。葉を２倍容量（ 約５０１）の０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０中４℃でホモゲナイズした 。液汁を２層のモスリンで濾過し、１’５．０００ｇで１５分間遠心し、上澄を 保留した。ペレットを数ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０で 再抽出し、再遠心した。上澄を合わせ、ベックマンタイプ３０ローター中２７． ０００＋ｐｍ、４℃で４時間遠心した。

得られたペレットをｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム３．５１に４℃で一 夜再懸濁し、しかる後エッペンドルフ遠心管で１０分間遠心した。上澄を採取し 、ｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウムで４．Ｏａ＋ｌに調製し、ＬＭ　Ｎａ Ｃ１，２０％ＰＥＧ６０００含有溶液１ｍｌを加え、混合液を室温で２時間イン キュベートした。得られた沈降物をエッペンドルフ遠心管で１０分間の遠心によ り集め、ｐＨ７，０の１０ｍＭリン酸ナトリウム０．２５ｍ１に再懸濁し、溶液 をエツペンドルフ遠心管で１０分間の再遠心により清澄化させた。次いでウィル ス粒子を含む上澄を除去し、４℃で貯蔵した。最終懸濁液中におけるウィルス濃 度は約１．　５　ｍｇ／ｌであることが分光測定で評価された。Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖ 特異性抗血清を用いたウィルスのウェスタンプロット分析ではキメラウィルス粒 子の小コートタンパク質サブユニットと結び付いたＦＭＤＶ抗原の存在について 現した。

継代修正ＲＮＡ 多量のキメラウィルスをできるだけ効率的に産生ずるため、転写物接種葉から抽 出されたＲＮＡを植物で継代した。ｐＭＴ７−ＦＭＤＶ−Ｉ接種葉からのＲＮＡ 抽出物のサンプル５μｌをｐＨ８，０のトリスリン酸で５０μ！に希釈し、一群 ５例のカラピー植物の一次葉に接種した。すべての植物はＣＰ　Ｍ　Ｖ感染に典 型的な症状を呈し、２３日Ｐ、１．で一次葉を植物から収集した。その葉を０． １Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でホモゲナイズし、ウィルスを前記のように抽出 したが、但し初期の高速ペレット化ステップを省略した。ｐＨ７，０の１０ｍＭ リン酸ナトジナトリウム中　５　ｍｇ／ｍｌの最終濃度で全量３．Ｏａ＋Ｈのウ ィルスをこうして単離した。この調製物をセントリプレツブ（Ｃ！ｎ＋＋１ｐｒ ｅｐ）濃縮機〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））で１　、　４　ｍｇ／ｍｌの最終濃 度まで最終的に遠心し、Ｐｌと命名した。

ＰｌのサンプルはＳＤＳゲル電気泳動及びクマシーブルー染色により試験したと ころ、予想されたパターンのコートタンパク質を含むことを示した。抗ＦＭＤＶ 血清を用いたウェスタンプロット分析では小コートタンｄり質がＦＭＤＶループ を含むことを示した。ウィルス粒子から抽出されたＲＮＡはＣＰＭＶのＭ及びＢ 　ＲＮＡに関して予想されたサイズであった。これはキメラウィルスが転写物接 種葉に由来するＲＮＡを継代することで産生できることを証明している。

実験ワクチンを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で無菌リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）への 分散によりウィルス調製物Ｐ１から製造した。モルモットを０及び２８日目にＰ １ワクチン４０μｇで注射した。予備結果ではその動物がＦＭＤＶループに対す る抗体を産生ずることを示すが、これは野生型ウィルスが注射されたときにみら れない応答である。

Ｔ−３ ＦＩＧｔｌＲＥ　１ Ｈ２ 旦ｑＪ延】 旦σＪ正１ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／４０　ＺＮ Ａ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ Ｉ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｃ （７２）発明者　ラモノソフ、ジョージ　ピータ−イギリス国ノーウィッチ、コ ルニー、レイン（番地なし）、ヨーシ、インズ、センター、フォー、プラント、 サイエンス、リサーチ内 （７２）発明者　ジョンソン、ジョン　イーミルアメリカ合衆国インディアナ用 、ウェスト、ラフアイエツト（番地なし）、パーデユー、ユニバージティー、デ パートメント、オブ、バイオロジカル、サイエンシス内

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルスのコートタンパク質の一部として既定外来ペプチドを含む植物ウイ ルスの集合粒子。
2. ２．外来ペプチドが生物学的機能性ペプチドであり、その生物学的適用がそれよ り大きな分子もしくは粒子と組合されたそのペプチドの供与を要求するか又はそ れにより高められる、請求項１に記載のウイルス粒子。
3. ３．ペプチドが抗原である、請求項１又は２に記載のウイルス粒子。
4. ４．抗原がウイルス抗原である、請求項３に記載のウイルス粒子。
5. ５．抗原が動物（ヒトを含む）ウイルス抗原である、請求項４に記載のウイルス 粒子。
6. ６．外来ペプチドが植物ウイルスのコートタンパク質の露出表面に組み込まれた 、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
7. ７．植物ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載 のウイルス粒子。
8. ８．ウイルスコートタンパク質がβ−バレル構造を有する、請求項１〜７のいず れか一項に記載のウイルス粒子。
9. ９．外来ペプチドが植物ウイルスのループ接合βシートに挿入された、請求項８ に記載のウイルス粒子。
10. １０．植物ウイルスがコモウイルスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載 のウイルス粒子。
11. １１．コモウイルスがカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）である、請求項１ ０に記載のウイルス粒子。
12. １２．外来ペプチドが植物ウイルスのβＢ−βＣループに挿入された、請求項９ 、１０又は１１に記載のウイルス粒子。
13. １３．挿入された外来ペプチドが現存ループヘの付加である、請求項９〜１２の いずれか一項に記載のウイルス粒子。
14. １４．挿入された外来ペプチドが現存ループの一部の置換である、請求項９〜１ ２のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
15. １５．外来ペプチドが口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する動物ウイルス抗原 である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
16. １６．外来ペプチドがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する動物ウイルス 抗原である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
17. １７．外来ペプチドがヒトライノウイルス（ＨＲＶ）に由来する動物ウイルス抗 原である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
18. １８．免疫原成分として請求項３〜１７のいずれか一項に記載された集合植物ウ イルス粒子を含むヒト又は動物病原体に対する保護用ワクチン。
19. １９．免疫原成分として請求項５に記載されたウイルス粒子を含む動物ウイルス ワクチン。
20. ２０．コートタンパク質についてコードする植物ウイルス核酸を修正するために 外来ペプチドについてコードするヌクレオチド配列を導入し、植物、植物組織、 植物細胞又は原形質体を修正ウイルス核酸で感染させ、修正ウイルスの集合粒子 を収集することからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載された植物ウイ ルス粒子の産生方法。
21. ２１．導入されるヌクレオチド配列がコートタンパク質の露出部分についてコー ドする植物ウイルス核酸のその部分で押入される、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．外来ペプチドについてコードするＤＮＡ配列をコートタンパク質の露出部 分についてコードする植物ウイルスのＲＮＡに相当するｃＤＮＡ中に導入し、こ うして修正されたｃＤＮＡからそのＲＮＡ転写物を産生させ、必要であれば植物 体で全ウイルス粒子の増殖及び集合に要求されるいずれか他のＲＮＡと一緒に植 物、植物組織、植物細胞又は原形質体を転写物で接種し、修正ウイルスの集合粒 子を収集することからなる、ＲＮＡ植物ウイルスに適用される、請求項２０に記 載の方法。
23. ２３．外来ペプチドについてコードするＤＮＡを植物ウイルスｃＤＮＡから切出 されたＤＮＡ断片中に導入し、修正形で植物ウイルスｃＤＮＡを再構成するよう に修正断片を組換える、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．塵生された修正ウイルス又はそれから抽出されたＲＮＡが追加収量の修正 ウイルスを産生するために植物で継代される、請求項２２又は２３に記載の方法 。
25. ２５．コートタンパク質の露出表面に相当する部位で外来ペプチドについてコー ドするＤＮＡ配列を含むＣＰＭＶコートタンパク質ｃＤＮＡの断片。
26. ２６．ＳｓｔＩ断片である、請求項２５に記載の断片。
27. ２７．請求項２５又は２６に記載された断片を含むベクター。
28. ２８．コートタンパク質の露出表面に相当する部位で外来ペプチドについてコー ドするＤＮＡインサートを有するＣＰＭＶ　Ｍ　ＲＮＡの全鎖長ｃＤＮＡを含む ベクター。
29. ２９．請求項２５〜２８のいずれか一項に記載された断片又はベクターのＲＮＡ 転写物。
30. ３０．請求項２９に記載されたキャップ化ＲＮＡ転写物。
31. ３１．請求項１８又は１９に記載されたワクチンを投与することからなる病原体 に対する動物（ヒトを含む）の保護方法。