JPH04500312A

JPH04500312A - 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子

Info

Publication number: JPH04500312A
Application number: JP2509221A
Authority: JP
Inventors: マザラ，ゲイル・ピー; ロバーツ，ブライアン; パニカリ，デニス・エル
Original assignee: アプライド・バイオテクノロジー・インコーポレーテツド
Priority date: 1989-06-01
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2015-04-17
Also published as: WO1990015141A2; DE69034052T2; EP0431128B1; AU5848390A; WO1990015141A3; CA2033175C; EP0431128A1; ATE235554T1; CA2033175A1; ES2198400T3; EP1288304A2; JP3034025B2; DE69034052D1; EP1288304A3; DK0431128T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチ：ノ接種は過去３０年の間につ・ｆルスの病気の抑制において重大な役割を演じて”きた。７々チ゛／凄種は免疫性の簡単な原理に基づく・感染性因子にいったん暴罪されると、動物は同一因子による感染に対して保護する免疫防ｍを準備する。ワクチン接種の［Ｊ的は、感染の前に防御を準備する、−とを動物に誘発する。−とである。便利には、これは免疫原としてウィルスの弱毒化または殺した形態の使用により達成された。過去においてこれらのアプローチの成功は、一部分、自然の抗原の提示および自然の感染において得らオｊた免疫応答の完全な領域を引き出す弱毒化ウィルスの能力のためであ）た。しか［１，なから、従来のワクチンの方法は、常に、ある数の潜在的制限を受けて来、忙。弱毒化した菌株は突然変異し５てよりビルレトトまたは非免疫原性となることがある。不適切にイ１活性化１７ケ手：／はそ才］らか防止しようと設汁される病気を引き起こす、〜とがある。

組み換ん１）さＩＡ＋５＆術は、免疫原とじて、完全な感染因子よりむしろ、現定された抗原のイ（！用に基′−べ「７′）手ンの開発イ：（」ｆ能とオるす１＝によ、Ｘで、従来のワクチンの制限のいくつかをｔＪｒ−除Ｊ−６可能性を提供する。これＩ遁ま、化′７的（、：：　；！、、　［１，”；、さオ〕。た免疫反応性のエピトープから成る、ペプチドのτノツチ９１組ｉ・換丸Ｗ種細胞中のパクイルスのタンパク質の発現により産Ｉｔ、！（オｔｙ−サブ」−づトのｉ）′ノエ、・９および１つまたはある数の規定された１１１心の↑Ｖ示のためのエヤきているウィルスのベクターの使用を包含する。

ペプチドおよびサブユニットの両者はある数の潜在的制限を受ける。

主要な問題は、操作したタンパク質のコンフォメーションがそれらの自然のエンヴエロープにおいて抗原のそれをまねることを保証することが困難であることである。適当なアジュバントおよび、ペプチドの場合において、担体のタ：／バク質を、免疫反応性を促進するために使用しなくてはならない。さらに、これらのワクチンは主として体液の応答を誘発し、こうして有効な免疫性を引き出すことができない。

ペプチドおよびサブユニットのワクチンの使用に関連する問題のあるものは、生きているウィルスのベクターを使用して異種抗原を提示することによって克服することができる。レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルスおよびポックスウィルスを包含する、ある数のウィルス［セブコ（Ｃｅｐｋｏ）ら、１９８４、細胞（Ｃｅ１１）旦ユニ１０５３−１０６２　；モリン（Ｍｏｒｉｎ）ら、１９８７、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａ、ｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８４：４６２６−４６３０：ロウウニ（Ｌｏｗｅ）ら、１９８７、プロノーディンゲス・オブ・ナショ＋ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８４　：　３８９６＝３９００　：バニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）およびパオレソティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、１９８２、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　）　ＵＳＡ、　７９：４９２７−４９３１　；　マツケラト（Ｍａｅｋｃｔｔ）ら、１９８２、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ４１９］が開発された。最にの努力は、この目的に感染性真核生物０）り［、′Ｉ−ニングベクターとしで、τ７クシニアウイルス、オル゛ノボソクスウーｒルスの開発にｔ中されてきた（バ第１ノツヂイ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）およびバニカリ（Ｐａｎ　ｉｃ＋′ｌｌ　ｉ）　、！ｖ：国特許第４．　６ｏ３：　１．１２号］。

種々の病原体からの抗原を丁゛ノ：ゴードするものを包含する、異種遺伝子（ま、−“アク・、、：−アカ・イル”び；′；に３い１Ｊ」されてきた。すべての場合におい（゛、ｐＨみ換えワクシ―丁−：ｒ−＋’ルスに、１−り発明された外来遺伝子産生物は、自然多件１ζにへ成された遺伝子に類似するか、あるいはそれ５Ｉ：同一であった。、Ｊ）る場合においで、１．′■み換えワクニー、７ウイルスを使用する＝ｉ、１１（処動物（ハ「ノクナン接種は、関西する病原体を使用する対抗に対してこ才ηらの１６物を保護［、、？、ｍ　ｌ＞べ・１１）・子イ＜　’Ｐ　ａ　Ｏし：ｔｔｉ）ら、１９８４、ブ「７シーゲイングー、・オブ・：ｌ”　’）　’ｉ怜し・１゛カデン−・オブ・サイプ：／シズ（Ｐｒｏｅ、Ｎａ　ｔ　！、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、　）ＵＳＡ、、８ｉ：１．９３−１９７：ギエニ’　（Ｋ　ｉ　ｅ　ｒｌＮ・）ら、１，９８４、ネ・１′チヤ＝　（Ｎａｔ＋、＋ｒｅ）、３１２：１６３−１６６：７リゾ：７（Ａｌｉｚｏｎ）ら、１５ｉ　８　＝１、ネ介′：″４．　＜１’ｌａｔ＋ｌｒｅ、）、、３１２ニア５７−７６０；ボイ　１．／　（Ｂａｙ　Ｉ　ｅ）　’二・、　１９８５、　ｊ９伝子　（Ｇｅｎｅ）　、３５　：１６９−．１７　’７　；　４　ＪＬマ（Ｙｉｌｍａ）ら、１９８８、！す”イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、：〕４２　：１０５８−１．０６１）。

ＬＭ；％換えのアブ［Ｊ−子は、そのためのワ７７ヂー゛７・が現在存在ｌ−１なＬｌか、あるいは従平の管ツクチー・のアプローチが望まし６さに劣る、病気に対するワクチンを開発する試みにおいて使用されてきている。例え（ｆ、ヒトの免疫欠損つ・イルス（）（巳、ｉ）は、最初に、後天性免疫欠損病気症候群（ＡＩＤＳ）の病因因子として同定された［）＜レーシノウシ（Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ）ら、１９８３、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）　、２ワクチンの開発にかなりの努力が向けられて来た。これらの努力は、免疫原とし、て小さい合成ペプチドの使用から全体の不活性化ウィルスの範囲の、方法の広いスペクトルに頼ってきた。

ＡＩＤＳの流行の出現は２０世紀の最も重大な公衆の健康の脅威を表す。１９８１−年におけるＡＩＤＳの認識以来、広範な研究はこの病気の理解において実質的な進歩をもたらした。病原性ウィルス（ＨＩＶ）は同定され、そして伝染の主要な道筋は性的接触および血液産生物の交換であることが示された［カラン（Ｃｕｒｒａｎ）ら、１９８５、サイエ：ノス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）、２２９　：　１３５２］　、ＨＩＶの多数の分離物のゲノムのヌクレオチド配列は決定され、そしてウィルスの分子生物学は集中的に研究されている。しかしながら、多くの研究は感染した個体のウィルスの複製およびこの病気の病原性におけるその役割を明らかにすることにおいてなされなくてはならない。

ヒトの免疫欠損ウィルス、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、レトロウィルスのレンチウィルスのサブクラスの構成員である［ボンダ（Ｇｏｎ９］。また、このサブクラスにおいて、関連するサルの免疫欠損ウィルスが存在する［］Ｖ：ダニエル（１）ａｎｉｅｌ）ら、１９８５、サイ疫欠損ウィルスは同様な形態を共有する。ウィルス粒子は、ウィルスＲＮＡゲノム［ラブマン（Ｒａｂｓｏｎ）およびマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、１９８５、細胞（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）　、４０　：　４７７コを包むカプシドのタンパク質（ウィルスのｇａｇ遺伝子によりエンコードされる）から構成された内部のコア本含右する。由来のコアは一ウィルス的にエンコードされるエンヴエロープの糖タンパク質を含有する脂質エンヴエローブにより取り囲まれている。効率よい複製に要求されるウィルスでエンコードされる酵素、例えば、逆ｌ・ランスクリプターゼおよびインテグラーゼ（ｐｏｌ遺伝子によりエンコードされる）は、また、ウィルス粒子中に組み込まれる。

ＨＩＶおよびＳＩＶのゲノムのヌクレオチド配列の分析において、これらのウィルスは、また、明確なゲノムの有機化（第１図）、ならびにかなりのＤＮＡ配列の相同性［チャクラバルチ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｌ）ら、１９８７、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、３λ８：５４３；フランチ＝（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ）ら、１９８７、ネイチ？−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３２８　：　５３９］を共をすることが示された。はぼ１０ｋｂのゲノムは、ウィルスの複製のための調節セグメントならびに、それぞれ、コアタンパク質、逆トランスクリブターゼーブロテアーゼーエンドヌクレアーゼ、およびエンヴエローブ糖タンパク質の遺伝情報を指定するｇａｇ、Ｉ）０１およびｅｎｖ遺伝子を含有する、フランキングの長い末端の反復（ＬＴＰ）配列からなる。これらのウィルスは、また、少なくとも６つの追加の遺伝子を含有し、それらのあるものは既知の調節機能を有する。

最後に、ヒトおよびサルの免疫欠損ウィルスは、共通の生物学的性質、例えば、細胞変性作用、ＣＤ４を有する細胞のための属性、および、最も重要なことには、ヒト（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）またはヒト以外の霊長類（ＳＩＶ）における長期間の持続性の感染および慢性の免疫欠損の病気を誘発する能力を共有する。ＨＩＶとＳＩＶとの間の類似性は、免疫欠損の病気の病原性および防止の研究のためのモデルの系として、アカゲザルのＳＩＶの感染の開発に導いた。

ＨＩＶワクチンのために全ウィルスの使用では明らかな困難が存在する。弱毒化ウィルスがビルレンスに復帰しうろことの懸念、および殺したウィルスの調製物の不完全な不活性化の危険、ならびに血清陰性の個体の中にＨＩＶゲノムを導入することに気が進まないことは、感染の防止について生きている弱毒化または殺したＨＩＶワクチンの使用に対して議論された。

現在考慮されているＡＩＤＳは可能な組み換えアプローチの範囲にまたがる；すべでではないが、多数は免疫原としてエンヴエローブ糖タンパク質のすべてまたは一部分の使用に頼る。しかしながら、今日まで試験した組み換えワクチンの多くは失望した結果を生じた。例えば、エンヴエローブ糖タンパク質から成るサブユニットのワクチンを使用してチンパンジーを免疫化したとき、生体外でウィルスを中和することができるＨ　Ｉ　Ｖに対する特異的体液免疫応答カリ１きだされた：しかしながら、この免疫化はＨＩＶ感染から動物を保護することができなかった「バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、１９８８、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　＋、）ＵＳＡ、８５　：　５２００−５２０４１　、チンパンジーにおいｒＨＩＶの感染のＨＩＶの予防のためのワクチンとして、ＨＩＶ工ンヴ二ローブ糖タンパク質を発現する生きている組み換えワクシニアウィルスの使用は、また、不成功であった。これらの組み換え体により感受性細胞の感染は、エンヴエローブのポリペプチドの通常の合成、グリコジル化、処理、および膜の移送を生ずる［チャクラバルチ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、１９８６、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２０：５３５：フ（Ｈｕ）ら、１９８６、ネイチ＋−（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　、３２０：５３７］。遺伝子産生物はＡＩＤＳの患者からの血清抗体により認識することができ、そしてＣＤ４細胞表面エピトープを発現する細胞とのシンシチウムの形成を仲介することが示されたしリフマン（Ｌｉｆｓｏｎ）ら、１９８６、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３２３ニア２５］。

これらの組み換え体を使用するいくつかの種のワクチン接種は、菌株特異的ヒトの免疫応答ならびに細胞仲介応答を誘発したフ［（Ｈｕ）ら、１９８６、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２０：５３７；チャクラバルチ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ　ｉ）ら、１９８６、ネイチ＋−１Ｎａｔｕｒｅ）　、３２０　：　５３５　：キエニイ（Ｋｉｅｎｙ）ら、１９８６、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４ニア９０：ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、１９８６、ネイチャー　（ｉ’ＪＢ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）、９８７、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３２２ニア２８］。それにもかかわらず、これらの免疫応答にかかわらず、これらのワクチンはＨＩＶによる感染からチンパンジーを保護することができなかった［（Ｈｕ）ら、１９８６、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２旦ニア２１］、これらの初期のワクシニアの失敗は種々の因子に帰することができる。ワクシニアの組み換え体の免疫原性は最適ではなかったであろう：事実、組み換え体はチンパンジーにおいて低い抗体力任を誘発した。確かに、これらのワクチンが単一のＨＩＶ−１のポリペプチドのみの発現を誘発するという事実は、それらが保護の免疫応答を刺激する最大の可能性をもたないことがあることを示唆する。

さらに、Ａ、　Ｉ　Ｄ　Ｓのワクチンを評価するためのチンパンジーの使用はそれ自体、チンパンジーとして、問題であり、それらはＨＩＶで感染することができるが、Ａ、ＩＤＳを発生しない［アルタ−（Ａ　１．　ｔ　ｅ　ｒ）ら、１９８４、サイエンス（ＳＣｉｅｎＡＩＤＳのワクチンの開発に対する組み換えのアプローチのいずれかに対する潜在的欠点は、それらは免疫原として単一のＨＩＶ抗原、最も通常にはエンヴエローブ糖タンパク質の使用に頼ってきた。生きている弱毒化したまたは殺した全ウィルスの使用に基づく他の病気（例えば、ポリオ、はしか、おたふくかぜおよび狂犬病）のための伝統的ワクチンのアプローチの過去における成功は、抗原の提示が保護的免疫応答の誘発において極めて重要であること示唆する。

組み換えＤＮＡ技術における進歩は、個々の抗原ばかりでなく、かつまた欠損非自己増殖性ウィルス様粒子の合成のために異種の発現系の使用を可能とすることがある。ある種のウィルスのカプシドのタンパク質は対応するウィルスに形態学的および免疫学的に類似する粒子にアセンブルすることができる。例えば、生体外で合成したいくつかのピコルナウィルスのＰ１前駆体は個々のカプシドのタンパク質に処理することができ、次いでこれらのタンパク質を免疫反応性ピリオン様タンパク質にアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）することができる［二ツタリン（Ｎｉｃｋｌｉｎ）ら、］９８６、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ）４　：　３３　：バルメンバーグ（Ｐａ　１ｍｅｎｂｅ　ｒｇ）ら、１９７９、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏ！ｏｇｖ）、３２ニア７０；シー（Ｓｈ　ｉ　ｈ）ら、１９７８、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイＴ−７シズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、）ＵＳ、Ａ、７−５　：　５８０７　：ハネカフ（Ｈａｎｅｅａｋ）ら、１１）８２、プロシーディンゲス・オブ・ナン、］ナル・アカデミ−・すブ・体の発現系中の生体内で発現されたカプシドのタンパク質の自己アセンブリー（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、また、報告された。例えば、ヒｉ・の■（型肝炎は酵母閑細胞中で発現されるとも、ポリペプチドはヒトチ・）皿苧から分離１．たものに外観が類似する粒子にアセンブルする［・（レンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｓｌａ＞　ら、１９８２、ネイチャー（Ｎａｔｕ　ｒ　ｅ）　、、　２．、−町８．　：　３４７’ｌ　：　、これらのＩ（１子はい←つかの種における抗ｌＢ型肝炎抗体の産４（ミを刺激し、そしてウィルスの対抗からチ′２・バンシーを保ｒａする二１シができる［マクアレーア（Ｍｃ　Ａ　ｉ　ｅ　ｅ　ｒ）ら、１９８４、卒ｒチ＊−−（！′ＸＪａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）　、、　３見−７−：１７８］ｏ池の例においＣ、ウン！７１頭腫ウィルス／（：ｐ＼７組み換えプラスミドで形質転ｔＩ！＆ｔ、たネズミの制］１１１泡中のイヌのパル５１５ウイルス（ＣＰ〜ｒ）カプシドのタ゛／バク質ＶＰ１」５よびｖＰ２の同時発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）は、自己アセンブリーするウィルス様粒子の形成を生ずることが示された［マザラ（Ｍａｚｚａｒａ）ら、１９８６、ワクチンに対する現代のアプローチ（Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏｃｈ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、：＋− ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ）、＝ニーヨーク＋Ｒ，Ｍ、チャノック（Ｃｈａｎｏｃｋ）およびＲ，Ａ、　ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）（１り、ｐＩ）、４１９−４２４；７ザラ（Ｍａｚｚａｒａ）ら、米国特許出願第９０５．２９９号、１９８６年９月８日提出］　；感受性のイヌのワクチン接種に使用するとき、これらの空のカプシドはＣＰＶの対抗に対して保護することができる免疫応答を誘発した。最後に、バキュロの発現ベクターを使用してスボドブテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で発現されたＨＩＶ−１ｐ５５ｇａｇ前駆体のポリペプチドは、細胞の培地中に分泌されるウィルス様粒子にアセンブルすることが示されたしゲイセン（Ｇｈｅｙｓｅｎ）ら、１９８８、新しいワクチンに対する現代のアプローチ（Δ（ｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｎｅｗ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ’ａｔ。

ｒｙ）、ニューヨーク、９月１４〜１８日、アブストラクトＮｏ、１２〕。

発明の要約本発明は、生体内または生体外で欠損非自己増殖性ウィルス粒子に自己アセンブリーすることができる異種ウィルスの少なくとも２つの興なるポリペプチドを発現することができる、組み換えウィルスのベクター、および組み換えウィルスを産生ずる方法に関する。本発明は、また、親つ（／ｌ、スで生体内また１は生体外において組み換えて組み換え「５ｒル人のベクター・Ｓ：　ｔａ　４する中間体のＤＮＡべ・“ｔター、および組み換えウィルスのべ９１−で宿主をワクチン接種して、相関関係のある異種病原性ウィルに１こ文月−て儂護的免疫性を誘発する方法に関する。さらに、本発明は、Ｉｌ［１／Ｐ＋換えつ２イルスのベクターにより産°セされた、欠損非自己増殖性ウィルス粒子、例えば、！（＋■、、Ｓ■■、またはピコルナＩリイルスに関する：これらのつ１ルス粒］月灯）離し、そしＣそれら自体、角取性つ・ｆルスに対１．ｙ　”（、”７クヂン接種するための、あるいは治療の目的、例えば、感染した個体において免疫に・答を増φ するための、あるいは治療剤、例えば、細胞障害性薬物を特異的細胞の型への送岸を夕・−ゲラ戸イングするための、免疫原とし７て使用することができる。

図面の簡単な説明第１−図は、サルの免疫欠損ウィルス（ＳＮ’７）およびヒトの免疫欠損パアイルス（１１１Ｉ″Ｖ）の間挿なゲ／ｌ、の有機イ１″、を示す。

；第：２図は、Ｃ７クシ、７−、、ｆ　、＋７　、、ヒレスφのＳＹＶｍａｃ２５１のｇａｇおよびブ′ｌ−７パ−アー→二望）；中入および発現のためのプラスミドベクター・である、ｐ　Ａ　ｈ　Ｔ　４５　’：）　２　ｔ’）構成を示す、　ｏ　Ａ　’ｏ　Ｔ　４５９２１；！、ｒ７クシ＝７’Ｈｉ１’ｌ　（目１１　ｋｉＷ、ｔｉ域中の奪且ス換えを指令するためのワクシニアＤＮＡに−（：、リノ、；゛２キ゛、１′−゛され７゛１１、ｒ’ｊ＋　７シ＝７４０にブｏモーター＋ｌＩｉ卸下’ｉニーｇ４−しく−ｊ’ｌ　Ｉ・ｏｔ遺伝子を含有する１、ベクターＤＮＡは、ワクシニアの組み換え体の選択のための２９　Ｋの宿主− 領域遺伝子、およびＥ、ｅｏｌｉ中１’ｌ’ｌ増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

第３図は、ワクシニアウィルス中の５ＩＶｒｎａｅ２５１のｅｎｖの挿入および発現のためのプラスミドベクターである、ｐＡｂＴ４５９３の構成を示す。ｐＡｂＴ４５９３は、ワクシニアＨｉｎｄｌｌｌ　Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアＤＮＡによりフランキングされた、ワクシニア４０にプロモーターの制御下にｅｎｖ遺伝子を含有する。ベクターＤＮＡは、ワクシニアの組み換え体の選択のための２９にの宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

第４図は、ワクシニアウィルス中のＳＩＶｍａｃ２５１のｅｎｖおよびｇａｇ− ｐｒｏｔの挿入および発現のためのプラスミドベクターである、ｐ、ＡｂＴ４５９７の構成を示す。ｐＡｂＴ４５９７は、ワクシニア３０にプロモーターの制御下にｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子、およびワクシニア４０にプロモーターの制御下にｅｎｖ遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＴ　Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアＤＮＡによりフランキングされている。ベクターＤＮＡは、ワクシニアの組み換え体の選択のための２９にの宿主− 領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

第５図は、ワクシニア中・イルス中のＨＩＶ−１ｇａｇの挿入および発現のためのプラスミドベクターである、ｐＡｂ７１．６４の構成を示す。

ｐＡｂＴ１６４は、ワクシニア７．５にプロモーターの制御下に）ｆｌＶｇａｇ遺伝子、ＤＮＡ領域はワクシニア中の組み換えを指令するためのワクシニアＴＫ遺伝子をフランキングする、ワクシニアの組み換え体を選択するためのワクシニアＢａｍＦプロモーター、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンビシリン抵抗性遺伝子を含有する。

第６図は、ワクシニアＨｉｎｄｌｌＴ　Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアＤＮＡによりフランキングされた、ワクシニア４０にプロモーターの制御下にＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子の挿入および発現のためのプラスミドベクターである、ｐＡｂＴ４６０３の構成を示す。

ベクターＤＮＡは、ワクシニア組み換え体の選択のための２９に宿主−領域遺伝子、およびＥ、Ｃ０Ｉｉ中の増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を含有する。

第７図は、ワクシニア中のＨＩＶ−１のｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒ。

ｔの挿入および発現のためのプラスミドベクターである、ｐＡｂＴ６２１の構成を示す。ｐＡｂＴ６２１は、ワクシニア４０にプラスミド制御下にＨＩＶのｅｎｖ遺伝子、およびワクシニア３０にプラスミドの制御下にＨＩＶのｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニアＨ４ｎｄｌｌｒ　Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアＤＮＡによりフランキングされている。ベクターＤＮＡは、ワクシニアの組み換え体の選択のための２９に宿主−領域遺伝子、およびＥ。

ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

欠損非自己増殖性ウィルス粒子に自己アセンブリーすることができるウィルスのポリペプチドをエンコードする遺伝子は、ＤＮＡウィルスのゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡウィルスのゲノムのｃＤＮＡからか、あるいは遺伝子を含有する入手可能なサブゲノムのクローンから得ることができる。これらの遺伝子は、ウィルスのカプシドのタンパク質（すなわち、ウィルスのタンパク質の外殻を構成するタンパク質）をエンコードするものおよび、エンヴエローブドウイルス、例えば、レトロウィルスの場合において、ウィルスのエンヴエローブ糖タンパク質をエンコードする遺伝子を包含する。追加のウィルスの遺伝子は、また、カプシドのタンパク質の成熟および粒子の自己アセンブリーのために要求される。

これらは、カプシドのタンパク質またはエンヴエローブ糖タンパク質のプロセシングの原因となるウィルスのプロテアーゼをエンコードすることができる。

一例として、ピコルナウィルスのゲノムの構造はよく特性決定されてきており、そしてヴイリオンのアセンブリーに導くタンパク質の合成のパターンは明瞭である［ルエツカート（Ｒ，ｕｅｃｋｅ　ｒ　ｔ）　、Ｒ，、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（１９８５Ｌ　Ｂ、Ｎ、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら綱、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、＝ニーヨーク、１）Ｉ）、７０５−７３８］。ピコルナウィルスにおいて、ウィルスのカプシドのタンパク質は、単一の長いリーディングフレームを含有するＲＮＡゲノムによりエンコードされ、そして細胞のプロテアーゼおよびウィルスのプロテアーゼの組み合わせにより成熟カプシドタンパク質を生ずるようにプロセシングされるポリタンパク質の一部分として合成される。こうして、カプシドの自己アセンブリーに要求されるピコルナウィルスの遺伝子は、カプシドの構造遺伝子およびそれらの成熟に要求されるウィルスのプロテアーゼの両者を包含する。

自己アセンブリー性カプシドのタンパク質をエンコードする遺伝子を分離することができるウィルスの他の例は、レトロウィルスのＨＩＶおよびＳＩＶである。

これらのウィルスのゲノムの構造は、よ（特性決定され、そして第１図に線図的に表されている。２つのウィルスの遺伝子の有機化は顕著に類似し、モしてＨＩＶの構造遺伝子の各々の相同体はＳＩＶ中に存在する。

ＨＩＶおよびＳＩＶのｇａｇ遺伝子はカプシドのタンパク質をエンコードする。

ピコルナウィルスのカプシドのタンパク質のように、ＨＩＶおよびＳＩｖのｇａｇタンパク質は前駆体のポリペプチドとして合成され、このポリペプチドは引き続いて、ウィルスのプロテアーゼにより、成熟カプシドのタンパク質にプロセシングされる。しかしながら、ｇａｇ前駆体のポリペプチドはタンパク質のプロセシングの不存在下にウィルス様粒子に自己アセンプリルすることができる［ゲイセン（Ｇｈｅｙｓｅｎ）ら、１９８８、新しいワクチンに対する現代のアプローチ（Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｎｅｗ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ）、−１，ニーヨーク、９月１４〜１８日、アブストラクトＮｏ、７２］。

ピコルナウィルスのカプシドと異なり、ＨＩＶおよびＳＩＶのカプシドは、ウィルスの糖タンパク質を含有する、ゆるい膜のエンヴエローブにより取り囲まれている。これらはウィルスのｅｎｖ遺伝子によりエンコードされる。

実施例は、本発明の組み換えウィルス中の発現のために選択されたＳＩＶおよびＨＩＶの遺伝子の使用を例示する。これらの遺伝子およびそれらのタンパク質は、表１に概略的に示されている。ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｔの遺伝子からの誘導された３つの主要なヴイリオンは前駆体のポリペプチドとして合成され、これらのポリペプチドは引き続いて切ポックスウィルス中の組み換えのためのＳＩＶおよびＨＩＶ遺伝子　遺伝子産生物５　プロセシングされたペプチドｅｎｖ　ｇｐ１６０　ｇｐ１２０　細胞外膜タンパク質ｇｐ４１　トランスメンブレンのタンパク質ｇａｇ　ｐ５５　ｐ２４ｐ１７　カプシドのタンパク質ｐｏｌ　ｐ１６０”　ｐｌＯプロテアーゼｐ６６／ｐ５１　逆！・ランスクリブターゼａ、記載する大きさはＨＩＶタンパク質についてのものである。］Ｖのポリペプチドの大きさはわずかに異なる。

ｂ、ｇａｇ−ｐｏｌ産生物の一部分。

２、親ウィルスレトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、およびポックスウィルスを包含する、ある数のウィルスは、異種抗原の発現のための生きているウィルスのベクターとして開発された［セブコ（Ｃｅ　ｐ　ｋ　ｏ）ら、１９８４、細胞（Ｃｅｌｌ）、旦ユニ１０５３−１０６２　：モリン（Ｍｏｒｉｎ）ら、１９８７、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｅ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、５−ｊ＋　４６２６　４’６３０　：　Ｉフウウｘ、（Ｌｏｗｅ）ら、１９８７、プロソーディ〉・ゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ティ（Ｐａｏｌｅｆｔｉ）、１９８２、プロー・−ディンゲス・オブ・す２・３ナル・・アカデミ−・オブ・サイエ〉・シズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ｔＪｓＡ、７９　：　４９２７−４９３１　：マクケソト（Ｍ３ｃｋｅ　ｔ　ｔ）ら、１９８２、ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ゛ブ・ザイ′エンンズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、ＳＣｉ、）ＵＳＡ、η９．ニア４１５−”ｉ”４１９Ｌ、実施例はポックスウィルスの族の使用を例示する１、好ましいポックスウィルスはワクノニアウイルス、−４なわち、ｒ］′１さいＨプラスに対するワク千゛とじで数年間使用されてきて１、＼る比較的Ｑ悸のウィルスＣある。ワクノニアウイルスは感染性へね生物のクローニ：７グベクターとして開発され〔バ第１ノヅティ（Ｐ３０１ｅｔｔ：ｉ）およびバニカリ（１″ａｎ　ｉ　ｅａ　ｌ　ｉ）、米国特許第４゜６０３．１１２号］および組み換え！−７／７．／二ｒつ・イルスはいく一つかの実（６系におけるワクチンとして首尾よく使用されてきた。肖イ；Ｌ−スは単腫瘍遺伝亡に考えられ、よく特性決定されたゲノムを何し、そし゛Ｃ喀染性・許損失しないこ（量の外来１）　Ｎ　Ａを宵ｒる二とができる「７クケノト（Ｍａｃｋｅ　ｔ　ｔ）　、〜１　およびＧＩ、　スゞス（Ｓｍｉ　ｔｈｌ）、１９８６、ジ賢−ナル・オブ・ゼネラ？；・・ビｌ−＋ｔｙｌＵ−（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖ　ｉ　ｒ○！、）３、親ウィルスとの生体内組み換えのためのＤＮＡベクタ一本発明の方法に従い、ウィルス粒子にアセンブルすることができるポリペプチドの遺伝情報を指定するウィルスの遺伝子を、親ウィルスのゲノムの中に、親ウィルスのタンパク質の正常の補体の発現と一緒に、そのウィルスによりそれらが発増されうるような方法で、挿入される７これは、まず、親ウィルスとの生体内の組み換えのためのＤＮＡ供与体ベクターを構成することによって達成することができる。

一般に、ＤＮＡ供与体ベクターは、次の要素を含有する：ｉ）ベクター・を原核生物の宿主中で増幅することができるように、複製の原核生物の由来、ｉｌ）ベクターを含有する原核生物の宿主細胞の選択を可能とするマーカーをエンコードする遺伝子（例えば、抗生物質の抵抗性をエンフードする遺伝子）、１ｉｉ）少なくとも２つの異種ウィルス遺伝子（例えば、ＳＩＶ、ＨＩ　Ｖ、またはピコルナウィルスの遺伝子）ＤＮＡ配列、各遺伝子は遺伝子の発現を指令することができる転写プロモーターに隣接して位置する、およびｉｖ）異種遺伝子が挿入され、要素ｉｉ１の構成体をフランキングする、親ウィルスのベクターのゲノムの領域に対して相同性であるＤＮＡ配列。

ボ・γゲスウイルスの中に多数の外来遺伝子を導入するための供与体プラスニドを構成する方法は、米国特許出願第９１．０．５０１、発明の名称「仮性狂犬病のワクチン」、その教示を引用によってここに加える、に記載されている。一般に、供与体ベクターの構成のためのすべてのつ１′ル、１、のｌ）Ｎ△断片は、転写プロ丁〜−ターを含有す５断片およびその中工、７外宋遺伝子を挿入寸ベブ！組・′７１′ルスのノ、”、ツムの＠ｎ域（−９対し−Ｃ相同性の０１、列売含イＴす？〕断片を包合ｔ１、ゲノムのＤ　Ｎ　１＼またはり１コー二、りした１’、）　Ｎ　Ａ断片か（、得Ｓ　：？、ができ・５つ供伴体６１Ｎブースミド（ｔ、１価、３価１：；′−１柔２′価ζ二５；１６７″、とがで）る（ｒなわら、７．または′シ以ｊ−・の師部された外米」餐伝」ト配列を含（’４する二、１テがてき６）１゜イｉ、ｌ　ｊ了、休べう・夕　（、二、好、ｉ：′＋べ１．１１．♀入されｊ−外来Ｄ　Ｎ　Ａを含イｆする組ン・１．゛、ぶえ丙イルスの同定セｂ１能とするマ〜プアーを工〕／：］−ドｔも、追加の遺伝づ−を六ＩＴ　する。いくつゴハの型のマーカー・遺伝子４・使用して、Ｉｌｌ　ｗ’、４換；：、、　＋Ａ）・イ／ｌ・スの同定および′、′）部さ・行う、”−とがで寺る。、燈１．ｌ〕は次のものを包二′炉１−）抗生物質Ａゴ’、−ｉ、、ｉ＋；二学的爪抗什をＬ゛、二１−ドする遺伝ｆ−［例え：、１．′、参昭、２．　 ’ｃ”　）＝　＋１４　ｖ：Ｃ１７’、（Ｓｐｙｒｏｐｏｕ　］　ｓ）ら５．１９８８、ウィル・′りτ１志　（Ｊ、Ｖ’ｉ　ｒｏ　ｌ　（、＋＋ｚｙ）、６２　：　１０４６　；　フ、＝　、、！ｌツク十“−（Ｉ−ａ　］　！＜ｎｅ　ｒ）　ｔ；よび＝：ｚ　（ＭｏＳＳ）、　１，９８８、つ・イルス字詰（Ｊ　〜’ １ｒｏｌｃ　ｇ　ｙ）　、　ｊ５３ＨＩＦＬｉ９：’ノ　ラ　ニ”７’　（Ｆ　ｌ−２ｔ　ｎ　ｋ　ｅ）ｌぞ２、′！（１８５、〜ト；ノキエ、→−・７〕／ド・セルラー・バイオｏ　ｉ５−　（Ｍ　。

１、Ｃ（！ｌ　ｌ　１１３ｉｏＩ　）、Ｓ：：１．９１８ｍ　、ならびに比色アッセーイ）、け、ｉ）祖・アｌ換ぐツイノト”りＣ４Ｙ”°：７−パの同′ボ今［１１９社とする遺伝了、イ３１えば、ビ　（：　Ｏｉ　ｌ　ＯＬｉ　ｉ　ａ　Ｃｌ＋に市沃子し々ニカリ　（Ｆ’ａｎ　ｌ　Ｃａ　ｌ　り　’：１１、■！１８６．１１伝子（Ｇ　ｅ　ｎ　ｃ　＞　、１−、、’７１　：　１９　：３−１　！：）　９　］　（、；（１〕・換えＩ−ノーＦシー了パフィルス、の選択のブチ法は、弔−Ｃ）Ｔ：ｌ　７　；、ニア−エン−７−ドデ・・ノド櫨峠、すなわち、２９　Ｋ宿主−・−領域遺伝子産生物に頼る〔ギラー　ド）Ｇｉｌｌａｒｄ）ら、１９８６、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８３　：　５５７３］　、この方法は米国特許出願第２０５．１８９号、１９８８年６月２０日提出、発明の名称［“組み換えポックスウィルスを選択する方法」、その教示を引用によっｒこ”二に加える、に記載されている。簡単に述べると、ウィルスのゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋ／Ｍ領域に位置する。２９に遺伝子の中に突然変異ヲ含有するワクシニアウィルスを、生体内の組み換えのための宿主として使閤する。２９にの突然変異は、ある種の宿主細胞、例えば、ＲＫｌ、：３（ラットの腎１ｉｌ）細胞上のこのウィルスの増殖を防止する。外来遺伝子の押入のためのプラスミドは、突然変異の遺伝子を収容することがテキるワク２．・ニアのＤＮＡｌＥ列を含有する；これらの配列は、また、１（ｉｎｃｌｌＩＩ　Ｍ領域中の突然変異遺伝子の部位への組み換えを指令する。、′：うして、組み換えワクシニアウィルは、ＲＫ１３細胞中で増殖する能力を取り戻し１、そしてこの基準でこれらの細胞上で増殖できない非組み換え親ウィルスから分離することができる。

好ましいｒ７クシニアウイルスとの組み換えのための好ましいベクターは、次のものからなる：３、ワクシニアウィルス中で隣接する遺伝子の発現を指令することができる、１まｆ、二は２１以上の転写プロモーター（例えば、ワクシニア７゜５に、３０Ｋ、４０に、］、ＩＫまたはＢａｍＦプロモーターまたはこれらのプロモーターの修飾された変異型、各は次のものに連鎖している。

ｂ１問題のウィルスの抗原をエンコードする１才たけ２以上の構造遺伝子、各々は転写プロモーターの制御下にある：Ｃ１組み換え親ウィルスの選択のためのマーカー、これは次のものからなることができる：（１）選択可能なマーカーをエンコードする遺伝子（例えば、Ｅ、Ｃｏ１１の１ａｃＺ遺伝子）に連鎖した転写プロモーター（例えば、ワクシニアウィルスのＢａｍＦプロモーター）：または（２）ウィルスの宿主−領域または他のウィルスの増殖促進機能を回復する親ウィルスの構造遺伝子（例えば、ワクシニアの２９にポリペプチド）　：ｄ１要素ａ　−Ｃの構成体をフランキングする親ウィルスのある領域と相同性のＤＮＡ配列（例えば、ワクシニアＴＫまたはＨｉｎｄｌＩＩＭ配列）；ｅ、プラスミドと形質転換したバクテリア細胞の選択のためのマーカーを包含する原核生物の宿主中の複製のためのベクターのバックボーン（例えば、抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子）。

感染した細胞中の供与体プラスミドＤＮＡとウィルスのＤＮＡとの間の相同性組み換えは、所望の要素を組み込んだ組み換えウィルスを形成する。生体内の組み換えのために適当な宿主細胞は、一般に、ウィルスにより感染しそしてプラスミドベクターによりトランスフェクションすることができる、真核生物の細胞である。ポックスウィルスとともに使用するために適当な細胞の例は、ニワトリの胚の線維芽細胞、Ｈｕ　Ｔ　Ｋ１４３（ヒト）細胞、およびＣＶ−１およびＢ５Ｃ −４０（両者はサルの腎臓）細胞である。ポックスウィルスによる細胞の感染およびプラスミドベクターによるこれらの細胞のトランスフェクションは、この分野において標準の技術により［バニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）およびパオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、米国特許第４．６０３．１１２号］。

生体内の組み換え後、組み換え組み換えウィルスの子孫をいくつかの技術の１つにより同定することができる。例えば、ＤＮＡ供与体ベクターが外来遺伝子を親ウィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の中に挿入するために設計された場合、組み込才れたＤＮＡを含有するウィルスはＴＫ−であり、そしてこの基準に基づいて選択することかで垂る［マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、１９８２、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、ヱ９ニア４１５］、あるいは、マーカーまたはインジケーター遺伝子をエンコードする遺伝子と問題の外来遺伝子との同時組み込みを、前述したように、使用して組み換えの子孫を同定することができる。１つの好ましいインジケーター遺伝子はＥ、ｃ。

＋ｉの１ａｃＺ遺伝子である：ベーターガラクトシダーゼを発現する組み換えウィルスは、その酵素のための発色性基質を使用して選択することができる［パニカリ（Ｐａｎ　ｉｃａ　Ｉ　ｉ）ら、１９８６、遺伝子（Ｇｅｎｅ）４７　：１９３］。組み換えワクシニアウィルスとともに使用す　。

るための第２の好ましくはインジケーター遺伝子はワクシニア２９に遺伝子である：野生型２９に遺伝子−エンコーデッド機能を発現する組み換えウィルスはＲＫ１３細胞上の増殖により選択することができる。

実施例においてより詳細に記載するように、ＨＩＶまたはＳｒ■遺伝子を含有する１価または２価の供与体プラスミドを、ワクシニアのＴＫ遺伝子またはＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域中に組み換え、そして組み換えウィルスを前述したように選択した。

いったん組み換えウィルスが同定されると、種々の方法を使用して挿入された遺伝子によりエンコードされるポリペプチドの発現をアッセイすることができる。

これらの方法は、次のものを包含する：黒色プラークアッセイ（ウィルスのプラーク上で実施するその場の酵素のイムノアッセイ）、ウェスタン・プロット分析、放射線免疫沈澱（ＲＩＰＡ）、および酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）。ウィルスの病原体により発現された抗原に対する抗体は、容易に入手可能であるか、あるいはこの分野において知られている方法に従いつくることができる。例えば、ヒトまたはサルの免疫欠損ウィルスについて、抗体は（ａ）親つィルス／ＳＴＶ組み換え体について、ＳＩｖで感染したアカゲザルからの血清であるすることができ；そして（ｂ）親ウィルス／ＨＩ　Ｖ組み換え体について、ＨＩＶで感染Ｃたヒトの患者からの血清、または特異的Ｈ１Ｖポリペプチドに対して向けられた商業的に入手可能モノクローナル抗体であるこ前の節に記載した発現の分析を使用して、挿入された異種ウィルスの遺伝子によりエンコードされたポリペプチドの合成を確証することができるが、これらのポリペプチドが、生体内または生体外で、欠損ウィルス粒子に自己アセンプリルするかどうかという問題を処理しない。２つの実験のアプローチを使用してこの問題を検査することができる。

第１のアプローチは、１または２以上のウィルスのポリペプチドを発現する組み換えウィルスで感染した細胞のリゼイトの電子顕微鏡検査により視的に検査することである。下に報告する実験において、例えば、ＳＩＶおよび／またはＨＩＶのｇａ’ｇ、ｅｎＶ十ｇａｇ、またはｅｎｖ＋ｇａｇ＋ｐｏｌの遺伝子を発現するワクシニアの組み換え体は、欠損のレトロウィルスの粒子を形成した：ｇａｇおよびｅｎｖのポリペプチドを同時発現する組み換え体で感染した細胞において、粒子のエンヴエロープは、粒子の表面上の糖タンパク質の「スパイク」の存在により示されるように、エンヴエロープの糖タンパク質を含有した。粒子の表面上のレトロウィルスのエンヴエローブ糖タンパク質の存在は、免疫金の電子顕微鏡検査により、エンヴエローブ糖タンパク質の１つに対して向けられたモノクローナル抗体を使用して実証することができる。

ウィルスのポリペプチドを発現する組み換えウィルスにより産生された欠損ウィルス粒子をさらに特性決定するために、これらの粒子は、高い速度遠心により、［３ｓＳ］−メチオニンの存在下に組み換えウィルスで感染した細胞の培地から分離することができる。培地の遠心から生ずる沈澱を再懸濁し、そして沈澱および上澄み液の両者を適当な抗血清で免疫沈澱させて、各分画の中に存在するウィルスのポリペプチドを分析することができる。例えば、ＨＩＶまたはＳＮＶのポリペプチドを発現する組み換え体の場合において、ヒト抗ｈｊｃ抗血清（ワクシニア／ＨＩＶ組み換え体について）またはアカゲザル抗ＳＩＶ抗血清（ワクシニア／ＳＩＶ組み換え体について）をこれらの分析に使用することができる。

ＨＩＶまたはＳＩＶのｅｎｖおよびｇａｇポリペプチドを同時発現する組み換えウィルスの場合において、沈澱はレトロウィルスの粒子が形成する場合エンヴエローブおよびコアの両者のポリペプチドを含有するであろう。実施例に記載するように、この実験をＨＩＶまたはＳＩＶのｅｎｖおよびｇａｇのポリペプチドを同時発現するワクシニアの組み換え体を使用して実施したとさ、沈澱は、これらのポリペプチドが欠損しドロウ丁′ルス粒子にγ−：：゛・ブｌＩングした場合、ｅｎｖおよびｇａｇの雨音のポリペプチドを含りし忙。対照的に、」二澄み液はエンヴエローブ糖タンパク質ｇｐｉ２０のみを含有した。

培地の欅心から生ずる沈澱中の物質をさらに特性決定するために、（２澱を再懸濁し、そしてスフ［］−スの勾配で分析した。次いで、勾配を分画（７、そシ、１て分画を適当な抗血清で免疫沈澱させた。これらの実験は、沈澱が欠損ウィルス粒子１′″・ついて期待する密変においてバンドを含有すＳかど・５かをを示す。

、＝れらの方法を１．ｔだ、使用して、同一の感染した細胞の中４こ存在す６２一つの異なるウィルスにより指令されたウィルスのポリペプチドの発現が、欠損ウィルス粉Ｆを産生するがどうかイー決定′よろ、二とができる。

例ズば、これらの実験は、ｇａ＋２４を発現する１−ンの組み換え体およびｅｌｌ　Ｖ−を発現する第２の組み換え体で生体外で同時感染した細＃ｊ２・と使用り、２−で、実施することブバできる。ｅｎＸ″ｌ□〕よびｇａｇの両名のポリペプチド１）ｔＩＩ−の細胞中の同時の発現は、単一・の２価の組み換えウィルス１こよるか、あるいはｆ）−）の異なるｌ　（Ｉｌｌｉのつ１ルス１、より指令さ寸するかにかかわら４″、・す１ルスで１′、・−ン・−ドされた工：・ヴ工ｔ：ｊ−−−−７’糖）７：、・バク質４々杓するエンヴ、。［ｌ−９に、：　！、）　Ｉｔｉ！’）囲まれた、ｇａｇボ１１ベブ千トメ′１１・”１．；　、５ツバ−・バーン質のコア侘含％−′４−るへ：拝ｊしｉ−［：ｌ　ｒ：ｔ　４ルス粒子をＪＦ４＋戊づ５ことが期待されるである・）。

７、ワクｆ−：／大損ル自己増殖性つイルス粒４に自己アセンブリｌｉ・することができる異種ウィルスの抗原を発聯する生きているｔＩＩみ換えウィルスのベニ７ターは、異種の欠損ウィルス粒子を発現するために使用するウィルスのベクターがワクチンした宿主をｇ染するが、その宿主中で有意の病気を引き起こない場合、感染に感受性のヒトまたは動物をワクチン接種するために使用することができる。このような温和なベクターの例は、ある種のボックスウィル７１、アデノウィルスまたはヘルペスウィルスを包含する。

例えば、生きている組み換え体ワクＳ／ニアウィルスでワクチン接種した後、宿主内でウィルスの複製が起こる。複製の間、ウィルスの遺伝子は組み換えウィルスの遺伝子の補体と一緒に発現される。こうして、免疫化後の２週の間、生きている組み換えウィルスが復製されているとき［フエンナー（Ｆｅｎｎｅｒ）　、Ｆ、　ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇ３’）、フイールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）曙、レイブン・プレス、ニューヨーク、１９８５、ｐｐ、６６１−６８４］　、ウィルスの抗原は宿主の免疫系に、真性カウイルスの感染における抗原の提示を密接にまねる方法で、すなわち、自然フィルスｌ：極め”Ｃ類似する欠損非自己増殖性ウィルス粒子として、提示することができる。遊離の粒子としておよび組み換えウィルスで感染し７た細胞に関連して反復して提示されたウィルスの抗原は、免疫系をプライミングし、てウィルスの感染の初期の事象の間、ウィルスを認識しぞしてそれを排除する潜在的能力を有することができる。

あるいは、これらの組西換えベクターのウィルスにより産生された欠損ウィルス粒子は、組み換えベクターのウィルスで生体外で感染した細胞から、およびこれらの感染した細胞の培地から分離し、そしてウィルスの感染に対して感受性の個体のワクチン接種のためにそれら自体使用することができる。これらの粒子は、自然のウィルスに類似するが、感染性つ・ｒルスの遺伝子物質を含有しないであろう。結局、それらは普通の殺したつ１ルスのワクチ〉調製物の利ぐ久を扉供する　リタ千、・・接種宿主の免疫系（こ免疫歴性抗壓を確実シ：提示４−６能力っ同時ｌご、このような粒ｊ′・は感染の防止のためのワクチンとして殺し、たウィルスの使ｌＩ］に討Ｖる一Ｌ慄な“′入点を回避し、こ、１１らのへ点ｆｌ、子哩−たウィルよの調製物の不完鬼な不活性化の危険性および、４もを種のウィルス、例えば、１ノドロウ、イル人の場合ＩＪついてのよフ（ご、血清陰性の個体の中への完全へｒリイル、−のゲノム（例えば、ＨＩ　Ｖ　ゲノム）を導入ｊ゛る−とに気が進ｊ、ない、−とを包含する。

、’″′、：１１．）５の！（損つイｒ１ス粒子）−利用４゛乙ワクチン組成物は、一般４こ、製剤学的に許容されつるベヒクル中の免疫化１のウィルス粒子からなり「１サ−１，：、　、）３う。ｊ’７　パ’ｊ〉・は揚与記ρう物と適へ性の方法゛、Ｔｈ　、かつ治療学的に１効でありか′、）免疫原性である。ような懺’？：”１３．、　’ｉ　；リ−１、Ｓ′ｅあてど）。

最り帽、−１精製！２．た粒子は、生きている組み換えウィルスとの組ろ合わ１シ゛にむいて、ｅ？ンシト゛ワクチン接種のプロト」ルの　へ仏分、として、土中な免役化／１１ｊとし２−使用し、次いでｒｔきている組み換え＋７．１ル２Ｚ、でワク−ｆ−。

接種−（１”　＜′、か、あるいは生きていＳ組みＶ！え「゛）・１゛ルスて゛１ニ安なワ゛ン千ン接＊、ｎ　ｉ、ｕに合訂の免吟尾・答を促ユｉ１；ずＳたと）ｌこ使用場−る。−とカニできイ・。、５Ｂ、’、に、　ｔｉ　’）イルス粒ｔにｒセンプリンク′オニ・ことが、−きるつ１′ルスの抗１１；（を発仰セ・ユ）祖み換え白、イル人の市療学的ｆ・８二用；ｌら区）組み換えウィルスに９ｊり産生された欠損ウィルス粒子の治療学的使用免疫イ１、が感染に対１丁イ゛イ護する、−とができない場合、前に感染した個体の免疫化は個体内のそり）ウィルスの潜伏期間を延長することかでさろう長い潜伏期間により特性決定さｆ＋だ・ノイルスの感染、例えば、Ｆ目Ｖの感染の場合においてとくに重要でありことがある。ＨＩＶウィルスの感染と臨床的ＡＩＤＳの発生の間の長いインキュベーション時間は、健康お、ノ゛び病気Ｊこよる衰退期とともに持続する初期の感染に対する応答のためであることであろう。そうである場合、レトロウィルス様粒子を産生するＨ　Ｉ　Ｖ抗原／親つイルス組み換え体で免疫化するか、あるいは精製された粒子それら自体で免疫化することによって免疫応答を促進することは、病気の発生を防止し、そして感染性を減少することができる［ソーク（Ｓａ　Ｉｋ）　、１９８７、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２７：Ａ７３］。

９、ター９チーノド（ｔ　ａ　ｒｇｅ　ｔ　ｔ　ｅｃｉ）薬物の送達のための欠損ウィルス粒子の治療学的使用欠損非自己増殖性ウィルス粒子は、また、ある種の薬物（例えば、細胞障害性薬物１、抗ウィルス剤）をウィルス受容体を有する細胞に送達す５ノ・めに使用することができる。このような薬物は、この分野において知らオ（ｔ、′いる技術により、ウィルス粒子の外側にカップリングするか、あるいは標的細胞内に組み込み、そして標的細胞に高い特異性で送達する二とかで人る。例えば、細胞障害性薬物を欠損ＨＩ　Ｖ粒子にカッブリジグ！５１、ぞして高度の特異性をもってＣＤ　４°Ｔ細胞に送達することができる。なぜなら、これらの粒子上に存在するＨＴＶエンヴエローブ糖夕゛、バク負′は特異的にかつ高い親和性でＣｎ４分子に結合４゛るからである３、同様に、ポリオウィルスは、例えば、咽頭および腸の細胞に優先的に結合し１２．二うしてこれらの細胞に対する特異的因子の送達を指令するために使用することができる。

］０、ウィルス様粒子の診断的使用免疫原性のウィルス様粒子を使用してウィルスの感染を診断することができる。

粒子を使用して、ヴイリオン上の種々のエピトープを認識するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗血清のパネルをレイズ（ｒａｉｓｅ）することができる。これらのモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体は、イムノアッセイのために、個々にまたは一緒に捕捉抗体として使用して、尿、血液または糞便中のウィルスの存在を検出することができる。

あるいは、粒子それら自体はイムノアッセイのための抗原として使用して、尿、血液または糞便中の抗体の存在を検出することができる。と（に好ましいイムノアッセイは固相の免疫測定アッセイ（酵素の放射能の測定）である。このようなアッセイにおいて、ウィルス様粒子を固相上に固定化して免疫吸着性を提供する。固相の免疫吸着の使用のための技術はこの分野において知られている。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１［カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）およびコラヘン（Ｃｏｈｅｎ）　、１９８０、ジャーナル・オブ・モレキ。

シー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１゜Ｂｉｏｌ、）、工３８：１７９３を、すべてのプラスミドの増殖のための宿主として使用した。サルの腎臓の細胞系Ｂ５Ｃ− ４０［ブロックマン（Ｂｒｏｃｋｍａｎ）およびナサンス（Ｎａ　ｔｈａｎｓ）　、１９７４、プロ／−デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ−）ヒト細胞系Ｈｕ１４３ＴＫ−”［バチＪ−／ティ（Ｂａｃｃｈｅ　ｔ　ｔ　ｉ）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）　、１９７７、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ町オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、ヱ４：１５９０］およびウサギ腎臓の細胞系ＲＫ１３　［ＡＴＣ（ｌｔｃｃＬ３７　：ベーラ（Ｂｅａｌｅ）ら、１９６３、ランセット（Ｌａｎｃｅ　ｔ）　、２　：　６４０］をワクシニアノ感染およびトランスフェクションに使用した。

ワクシニアウィ／ｌｚス菌株ＮＹＣＢＨ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−３２５）　および２９に一１ａｃＺ＋菌株ｖＡＢＴ３３　（参照、米国特許出願第２０５゜１８９号、１９８８年６月１０日提出、その教示を引用によってここに加える）を、生体内の組み換えのための親ウィルスとして使用した。

懸制限酵素は、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）またはベーリンガーー？ンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手した。ＤＮＡポリメラーゼの大きい断片（クレノー）はユナイテッド・スティッ・バイオケミカル・コーポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）から入手し、Ｔ４ポリメラーゼはニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手し、モしてＴ４　ＤＮＡリガーゼはベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から人手した。

分子クローニングの手順制限酵素の消化、ＤＮＡ断片およびプラスミドの精製、クレノーによるＤＮＡの処理、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、またはリンカ−およびＥ、ｃｏｌｉの形質転換は、本質的に記載したように実施した［マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド−ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、）−ルド・スプリングＴハーバ−（Ｃｏ　Ｉ　ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８２、ここに引用によって加えるコ。

ポリヌクレオチドの突然変異誘発は、ブランディス大学（Ｂｒａｎｄ６ｉｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の生物学部からから入手した合成オリゴヌクレオチドを使用して、アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）により供給した試薬して実施し、そしてそれらの試薬を製造業者の指示に従い使用した。

ワクシニアウィルスの組み換え体の調製ウィルスの感染、トランスフェクション、プラークの精製およびウィルスの増幅は本質的に記載したように実施した［スピロポウロス（Ｓｐｙｒｏｐｏｕ　１ｏｓ）ら、１９８８、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

ｇｙ）、旦２：１０４６］。２９に十組み換え体を選択し、モしてＲＫ１３細胞上で精製した（参照、米国特許出願第２０５．１８９号、１９８８年６月１０日提出、その教示を引用によってここに加える）。ＴＫ−組み換え体を選択し、そして５０ミリモルのブロモデオキシウリジンの存在下に精製した。

ワクシニアのウィルスのゲノムの分析ＤＮＡを記載したようにワクシニアウィルスで感染した細胞から抽出し［ニスポンド（Ｅｓｐｏｓ　ｉ　ｔｏ）ら、１９８１、ジャーナル・オブ・ビｏロジカル・メソッズ（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）２：１７５〕そして記載されているように制限酵素の消化およびサザン・ハイブリダイゼーションにより分析した［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ。

ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スブリン′ グ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、＝７−ルド嶺スプリング＋ハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、−ニーヨーク、１９８２］。

冬とゲ２！盆折黒色プラークのアッセイおよび免疫沈澱の分析は、本質的に記載されているようにしで実施した［スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８３、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８０：　７１５５およびウィッテク（Ｗｉｔｔｅｋ）ら、１９８４、ウィルス字詰（Ｊ。

Ｌｏ、５０１号、１９８６年９月２３日提出、その教示を引用によってここに加える。黒色プラークおよび免疫沈澱のアッセイのために、全ＳＩＶに対するアカゲザルのモノクローナル抗体、または全ＨｒＶに対するヒトの抗血清を使用した。免疫沈澱の分析のために、ワクシニアで感染した細胞を［３Ｈ］−グルコサミンまたは［３ｓＳ］−メチオニンで標識した。

組み換え体のワクシニアに対して向けられたレトロウィルスの粒子の形成の生物学的分析野生型または組み換えワクシニアウィルスで感染したＢ５Ｃ−４０細胞を、免疫沈澱分析に使用したのと同一の標識手順を使用して、［３５Ｓｌ＝メチオニンで標識した。１６〜１８時間後、感染した細胞からの培地を集め、そして１１０００ｒｐにおいて５分間清浄化した。生ずる上澄み液を２４Ｋにおいて９０分間５Ｗ２８０−ターで遠心した。上澄み液を除去し、そして生ずる沈澱を３ｍｌのＰＢＳ　（１３６ミリモルのＮａＣｌ２．７ミリモルのＫＣＩ、８．１ミリモルのＮａ、ＨＰＯ，，１゜５ミリモルのＫＨ２ＰＯ，）中に再懸濁じた。上澄み液および沈澱からの試料を、前の節に記載するようにアカゲザル抗ＳＩＶ抗血清またはヒト抗ＨＩＶ抗血清を使用して、免疫沈澱分析にかけた。

Ｂ５Ｃ−４０細胞を、前述したように、野生型または組み換えワクシニアウィルスで１０の多重度で１６〜１．８時間感染した。次いで、培地を除去し、そして感染した細胞をＰＢＳＢａｍＦ中の０．２％のゼラチン中で２回洗浄した。

免疫金の着色のために、試料をＰＢＳ、７’ゼラチン中の１０％のヤギ血清中の４℃において３０分間インキュベージジンし、次いでＰＢＳ／ゼラチン中で希釈した適当なモノクローナル抗体中で６０分間インキュベージジンした。次いで、試料をＰＢＳ／ゼラチン中で２回洗浄し、そして１％の胎児仔つ７血清、０．１％のアジ化ナトリウムおよび５％のヒト抗体血清とともにＰＢＳ中で金（５部ｍ）と接合したヤギ抗マウス■ｇＧの１：２０の希釈物と６０分間インキュベーションした。細胞を再びＰＢＳ／ゼラチン中で洗浄し、た。

未処理または免疫全着色した細胞を０．　１モルのソジウム力コジレート（ｓｏｄｉｕｍ　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）緩衝液（ｐＨ７，２）中の２．５％のグルタルアルデヒド中で一夜固定し、次いで０．　１モルのソジウム力コジレート緩衝液（ｐＨ７，２）中で２回洗浄した。次いで、試料を１％の０ｓ０４１０．１モルのカコジレート緩衝液（ｐＨ７，２）中で１．５時間固定し、次いでＱ、１モルのカコジレート緩衝液（ｐＨ７，２）中で２回洗浄した。次いで、試料を次の等級のアルコール中で各々１０分間脱水した：５０゜７０．８０．９５．１００　（３Ｘ）。次いで、試料をポリプロブレンオキシドで各５分間処理し、次いでキャップをしないバイアル内のポリプロブレンオキシド（４部）／ｅｐｏｘ８１２（６部）中で一夜処理した。次いで、試料をｅｐｏｘ８１２の中に埋め込み、そして３６時間硬化した。

ソーパル・ポーター・プラム（Ｓｏｒｖａｌ　ｐｏｒｔｅｒ　Ｂｌｕｍ）ＭＴ− ２超ミクロトームで１００ＯＡで切片を切断し、アルコール性酢酸ウラニルおよびサトウ（Ｓ　ａ　ｔ　ｏ）船着色［サトウ（Ｓ　ａ　ｔ　ｏ）、Ｊ、Ｅｌｅｃｔ、Ｍｉｃ、（日本）１ヱ：１５８−１５９１で着色し、そしてＪＥＯＬ電子顕微鏡で見た。

実施例１　：　Ｓ　ＩＶ遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構成この実施例は、ワクシニアウィルスと生体内組み換えのためのＳＩＶ遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構成を例示する（生体内組み換え（ＩＶＲ）ベクター）。プラスミドｐＡｂＴ４５３２Ｂ％ｐＡｂＴ４５３３、ｐＡｂＴ４５３６、ｐＡｂＴ４５３７、ｐＡｂＴ４５７４、ｐＡｂＴ４５７８、ｐＡｂＴ４５８２ＢＳｐＡｂＴ４５８３およびｐＡｂＴ４５８９の構成および構造は、米国特許出願第２０５． ’４５４号、１９８８年６月１０日提出、に記載されている。プラスミドｐＡｂＴ４０２７の構成および構造は、米国特許出願第９１０．５０１号、１９８６年９月２３日提出、に記載されている。プラスミド４５８７の構成および構造は、米国特許出願第２２９．３４３号、１９８８年８月５日提出、に記載されている。前述の特許出願の教示を引用によってここに加える。

ｐＡｂＴ４５９２　（第２図）：ｐＡｂＴ４５７８　（参照、米国特許出願第２０５．４５４号、１９８８年６月１０日提出）をＫｐｎ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして２２２１塩基対（ｂｐ）の断片を分離した。

この断片をＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＡｂＴ４５８７に結合して、ｐＡｂ７４５９２を得た。ｐＡｂＴ４５９２はワクシニアウィルス中のＳＩＶｍ、ａｃ２５１ｇａｇおよびｐｒｏｔｅａｓｅの挿入および発現のためのベクターである。ｐ、６．ｂＴ４５９２は、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域によりフランキングされた、ｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子をワクシニア４０にプロモーターの制御下に含有する。ベクターＤＮＡは、ワクシニア組み換え体の選択のための２９に宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

λΔ旦工Ａ擾、９３．（第３図）：　ｐＡｂＴ４５７４　（参照、米国特許出願第２０５．４５４号、１９８８年６月１０日提出）をｉ＜ｐｎｌおよびＢａｍＨＩで消化し、そして２５８９ｂｐの断片を分離した。この断片をＢａｍＨＩで処理しそして仔ウシアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）で処理したｐＡｂＴ４５８７に結合して、１）ＡｂＴ４５９３を得た。ｐＡｂＴ４５９３はワクシニアウィルス中のＳＩＶｍａ、ｃ２５１ｅｎｖの挿入および発現のためのベクターである。ｐＡｂＴ４５９３は、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域中の組み換えを指令するワクシニアＤＮＡによりフランキングされた、ｅｎｖ遺伝子をワクシニア４０にプロモーターの制御下に含有する。ベクターＤＮＡは、ワクシニア組み換え体の選択のための２９に宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

ｐＡｂＴ４５９７　（第４図）：　ｐＡｂＴ４５７４　Ｃ参照、米国特許出願第２０５．４５４号、１９８８年６月１０日提出）を５ａｃｌで消化し、そして消化したＤＮＡをまずＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで、次いでＣＩＰで処理した。ｐＡｂＴ４５８９をｓｐｈ　Ｉで消化し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして最後にＳｍａＩで消化した。２７５０ｂｐの断片を消化したｐＡｂＴ４５８９から分離した：この断片をＳａｃ　Ｉで消化したｐＡｂＴ４５８９に結合してｐＡｂＴ４５９７を産生した。ｐＡｂＴ４５９７をワクシニアウィルス中のＳＩＶｍａｃ２５１ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔの挿入および発現のためのベクターである。ｐＡｂＴ４５７３は、ワクシニア３０にプロモーターの制御下にｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子、およびワクシニア４０にプロモーターの制御下にｅｎｖ遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニアＨｊｎｄＩＩＩ　Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアＤＮＡによりフランキングされている。

ベクターＤＮＡは、ワクシニア組み換え体の選択のための２９　Ｋ宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

実施例２　：　ＨＩ　Ｖ遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構成ｐＳＶＨｅｎｖおよびｐＢＦ１２８は、ＨＩＶ−１菌株ＢＩＯゲノムの一部分を含有するプラスミドである：これらはイー・アイ・デュポン社から得た。ｐＨＸＢｃ２はＨＩＶ−１菌株Ｈ３Ｂ２ゲノムの一部分を含有するプラスミドであり、バーバード・メディカル・スクールのジョセフ・ソドロスキー（Ｊｏｓｅｐｈ　５ｏｄｒｏｓｋｉ）博士から入手した。プラスミドｐＡｂ７４５３２ＢおよびｐＡｂＴ４５５４の構成および構造は、米国特許出願第２０５，４５４号、１９８８年６月１０日提出、に記載されている。プラスミドｐＡｂＴ４００７の構成および構造は、米国特許出願第９１０，５０１号、１９８６年９月２３日提出、に記載されている。前述の特許出願の教示を引用によってここに加える。

ｐＡｂＴ１６４　（第５図）ニブラスミドｐＢＦ１２８をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理した；ＨＩＶ− １ｇａｇ遺伝子を含有する１７００ｂｐの断片をこの消化から分離した。この断片を、Ｓａｍｌで消化しモしてＣＩＰで処理したプラスミドｐＡｂＴ４５３２Ｂに結合して、ｐＡｂＴ１６４を産生した。

ｐＡｂＴ１６４はワクシニア中のＨ［Ｖ−１ｇａｇの挿入および発　現のためのベクターである。ｐＡｂＴ１６４は、ワクシニア７．５にプロモーターの制御下にＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子、ＤＮＡ領域はワクシニア中の組み換えを指令するワタシニアＴＫ遺伝子をフランキングする、ワクシニア組み換え体の選択のためのワクシニアＢａｍＦプロモーターの制御下にＩ　ａｃＺ遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

ｐＡｂＴ４６０３　（第り殴とプラスミドｐＳＶＨｅｎｖをＸｂａｌおよびＸｈｏｌで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理した・ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を含有する２７００ｂｐの断片をこの消化物から分離した。この断片をＳ　ａ　ｍ　Ｔで消化しそしてＣＩＰで処理したプラスミドｐＡｂＴ４００７に結合して、プラスミドｐＡｂＴ１６７を産生した。

ブラスミＩ″ｐ　Ａ　ｈ　７　ｌ　５７をＫｐｎｌおよびＸｂａｒで消化し、そし。

てＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の５°末端を含有する２２５ｂｐの断片をこの消化物から分離した。この断片を、ＸｂａｒおよびＫｐｎｌで消化しモしてＣＩＰで処理したｍ１３ｍｐ１８バタテリオファージＤＮＡ　［二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ。

１ａｂｓ）］に結合して、ｐＡｂＴ２２０を産生した。ｅｎｖ遺伝子の５゛末端を、材料および方法に記載するように、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により５′非解読配列の大部分を修飾して除去した。

このオリゴヌクレオチド５’　−ＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＧ− ３°　（パンディス大学生物学部）を使用して、Ａｃｃ！部位をｅｎｖ解読配列のＡＴＧ開始コドンからほぼ１０ｂｐ上流に挿入して、ｐＡｂＴ２２１をつくった。ｐＡｂＴ２２１をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてほぼ２３０ｂｐの断片を分離した。これをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しそしてＣＩＰで処理したプラスミドｐＥＭＢＬ１８＋　［デンテ（Ｄｅｎｔｅ）ら、１９８３、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１１：１６４５）に結合して、プラスミドｐＡｂＴ８５３６をつくった。

ｐＡｂＴ８５３６をＡｃｃ　Ｔで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理し、次いでＫｐｎＩで消化した。ｅｎｖ遺伝子の突然変異誘発した５゛非解読領域を含有する１３８ｂｌ）の断片をこの消化物から分離した。プラスミドｐＡｂＴ１６７をＫｐｎｌおよび５ａｃｌで消化し、モしてｅｎｖ遺伝子の大部分を含有する２４６１ｂｐの断片を分離した。ｐΔｂＴ８５３６からの１３８ｂｐの断片およびｐＡｂＴ１６７からの２４６１ｂｐの断片を、Ｓｍａ　Ｔおよび５ａｃｌで消化しそしてＣＩＰで処理したｐＡｂＴ４５５４に結合して、プラスミドｐＡｂＴ８５３９をつくった。

ｐＡｂＴ８５３９をＥｃｏＲＩで消化し、モしてｅｎｖ遺伝子を含有する２６８２ｂｐの断片を分離した。これをＥｃｏＲＩで処理しそしてＣＩＰで処理したｐＡｂ７４５８７に結合して、ｐＡｂＴ４６０３をつくった。

ｐＡｂＴ４６０３はワクシニアウィルス中のＨＩＶ−１ｅｎｖの挿入および発現のためのベクターである。ｐＡｂＴ４６０３は、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ領域中の組み換えを指令するワクシニアＤＮＡによりフランキングされた、ｅｎｖ遺伝子をワクシニア４０にプロモーターの制御下に含有する。ベクターＤＮＡは、ワクシニア組み換え体の選択のための２９．に宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

ｐＡｂＴ６２１　（第７図）７Δ、プラスミドｐＡｂＴ５９８　（第７ａ図）の構成。ｐＨＸＢｃ２Ｊソドロスキー（Ｓｏｄ　ｒｏｓｋ　Ｄ　ら、ネイチャー（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）、よび５ａｃＩで消化して、ヌクレオチド位置７１５−６００２に相当する断片を解放した。次いで、このＤＮＡを７４　ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ＨＩＶ− １ｇａｇおよびｐｏｔを含有する５２８７ｂｐの断片をこの消化物から分離し、そしてＳｍａ　Ｔで消化しそしてＣＩＰで処理したｐＡｂＴ５３６に結合して、プラスミドｐＡｂＴ５９９をつくった。

ｐＡｂＴ５９９をＮｄｅｌで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでさらにＢｇｌＩＩで処理し、そして３０２７ｂｐの断片をこの消化物から分離した。この断片をＫｐｎ　ＩでｐＡｂＴ１６４を消化した後分離した８８６４ｂｐの断片に結合し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてさらにＢｇｌＩＩで消化して、プラスミドｐＡｂＴ５９８をつくった。

Ｂ、、ｐＡｂＴ６２１　（第７ｂ図）の構成。

ｐＡｂＴ４６０３をｐｓｔｒで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてさらに５ａｌＩで消化し、そしてこの消化から生ずる６３２６ｂｐの断片を分離した。ｐＡｂＴ５９８をＢａｍＨＩおよびＢａＩＩで消化し、そして１８３８ｂｐの断片を分離した。ｐＡｂＴ４５５４を５ａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして４２０ｂｐの断片を分離した。これらの３つの断片を一緒に結合してｐＡｂＴ６２１をつくった。

ｐＡｂＴ６２１はワクシニア中のＨＩＶ−１ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔの挿入および発現のためのベクターである。ｐＡｂＴ６２１は、ワクシニア４０にプロモーターの制御下にＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子、ワクシニア３０にブＯモーターの制御下にＳＩＶ　ｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニアＨｉｎｄＩＩ’ｌ　Ｍ領域中の組み換えを指令するワクシニアＤＮＡによりフランキングされている。

ベクターＤＮＡは、ワク／ニア組み換え体の選択のための２９に宿主−領域遺伝子、およびＥ、ｃｏｌｉ中の増殖および選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。

生体内の組み換えは、組み換えワクシニアウィルスをつくる方法である［ナンカノ（Ｎａｎｋ、ａｎｏ）ら、１９８２、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、７９　：　１５９３　：パオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）およびパニカリ（Ｐａｎ　ｉ　ｃａ　Ｉ　ｉ）　、米国特許第４゜６０３．１１２号〕。これらの組み換えウィルスは、ワクシニアウィルスで感染した細胞の中に問題の遺伝子を含有するＤＮＡをトランスフェクションすることによって形成する。小さい百分率の子孫のウィルスは、ワクシニアのゲノム上の特定の部位に組み込まれた問題の遺伝子を含有するであろう。これらの組み換えウィルスは外来遺伝子を発現することができる［バニカリ（Ｐａｎ　ｉ　ｃａ　Ｉ　ｉ）およびパオレッテイ（Ｐａ。

Ｉｅｔｔｉ）、１９８２、プロノーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、７９　：　４９２７　；パニカリ（Ｐａｎｉｃａ　Ｉ　ｉ）ら、１９８４、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｍ領域におけるワクシニアウィルスのゲノムの中に域に位置する２９に宿主−領域遺伝子に基づく選択の方法［ギシード（Ｇｉｌｌａｒｄ）ら、１９８６、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８３　：　５５７３］を使用した。組み換えワクシニアウィルスＶＡ））Ｔ３３は、２９に遺伝子の一部分の代わりに！ａＩ？Ｚ遺午子を含有する。このＩａｃＺの挿入は２９に遺伝子の機能を破壊する；したがって、ｖＡｂＴ３３は２９に遺伝子産生物を必要とするＲＫ１３細胞上で増殖することができない。さらに、ｖＡｂＴ３３は、１ａｃＺ遺伝子の存在のために、ベーターガラクトシダーゼ、ブロウガル（Ｂｌｕｏｇａ　１）　、のための発色性基質の存在下に許容性細胞上で青色のプラークを形成する。

参照、米国特許出願第２０５．１８９号、１９８８年６月１０日提出。

ＩＶＲベクターｐＡｂＴ４５９２、ｐＡｂＴ４５９３、ｐＡｂＴ４５９７、ｐＡｂＴ４６０３、およびｐＡｂＴ６２１を、ワクシニアウィルスｖＡｂＴ３３で感染したしたＢ２Ｏ−４０細胞の中にトランスフェクションした（参照、材料および方法）。組み換えウィルスをＲＫ１３細胞上でブロウガルの存在下に白色プラークとして選択した。プラークを取り上げそして精製し、そして、サザン分析により、適当なＳＩＶｍａｃ２５１またはＨＩＶ−１遺伝子を含有することが示された・ｖＡｂＴ２５２はＳＩＶ　ｇａｇ−ｐｒｏＬを含有する；ｖＡｂＴ２７１はＨ［Ｖ−１ｅｎｖを含有する：　ｖＡｂＴは２５３ＳＩＶ　ｅｎｖを含有する；　ｖＡｂＴ２６４はＳＩＶ　ｅｎｖおよびＳＩＶ　ｇａｇ−ｐｒｏｔの両者を含有する：そしてｖＡｂＴ３４４はＨＩＶ−１ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔを含有する。

Ｈｊｎｄｌｌｌ　Ｊ領域に位置する、ＴＫ位置においてワクシニアウィルスのゲノムの中にＳＩＶｍａｃ２５１またはＨｒＶ−１遺伝子を挿入するために、ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）に対するＴＫ’ウィルスの感受性に基づく選択方法を使用した。ブロモデオキシウリジンはＴＫ″″に対する致死的であるが、組み換え体、ＴＫ−を増殖させる。したがって、生体内組み換えのためのプラスミドは、ＴＫ’ワクシニアウィルスで感染したＨｕ１４ＴＫ−の中にトランスフェクションされる（参照、材料および方法）。

さらに、ＴＫにおける挿入のためのプラスミドベクターは、ワクシニアＢ　ａ　ｍ　Ｆプロモーターの制御下にＥ、ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子を含有する：所望の外来遺伝子を含有する組み換えウィルスは、また、１ａｅＺ遺伝子を含有し、したがワてベーターガラクトシダーゼ、ブロウガル、の存在下に増殖させるとき、青色のプラークを産生ずる。こうして、右下に青色のプラークとして同定することができる。

ＴＫ位置に挿入されたＨ　Ｉ　■−，１遺伝子を含有する組み換えワク／ニア組・イルスを構成するために、野生型ＮＹＣＢＨウィルスをベクターｐ、Ａ、　ｂ　Ｔ　１６４との生体内組み換えのための親ウィルスとして使用して、組み換えウィルスｖＡｂｒ１．４１を産生し、た。

ＳｒＶｍａｅ２５］、ｅｒ＋ｖ、、ｇａｇ−ｐｒｏｔおよびｐｏ＋を含有する組み換えワクシニアウィルスを構成するために、ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２６４をｐＡｂＴ４５８３との生体内組み換えのための親ウィルスとして使用し、ｐＡｂＴ４５８３は、ワクシニアＴＫ遺伝子に対して相同性のＤＮＡによりフランキングされた、ワクシニア４０にプロモーターの制御下にＳＩＶｍａｃ２５１　ｐｏｌ遺伝子を含有するＩＶＲベクターである。

このベクターは、米国特許出願第２０５．４５４号、１９８８年６月１０日提出、に記載されている。これは組み換えウィルスｖＡｂＴ２７７を生じ、このｖＡｂＴ２７７は、ワクシニア４０にプロモーターの制御下にＴＫ位置に挿入されたＳＩＶｍａｃ２５１　ｐａｌ遺伝子、および、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ位置に挿入された、それぞれ、４０におよび３０　Ｋのワクシニアプロモーターの制御下に、ＳＩＶｍａｃ２５１　ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔ遺伝子を含有する。

実施例４：組み換えワクシニアウィルス中のＳＩＶまたはＨＩＶ−１抗原についての黒色プラークのアッセイ材料および方法に記載されている黒色プラークのアッセイは、ワクシニア感染細胞により発現されたタンパク質を検出することができる、その場の酵素に基づくイムノアッセイである。このアッセイはワクシニア組み換え体ｖＡｂＴ２５２、ｖＡｂＴ２５３、ｖＡｂＴ２６４およびＶＡｂＴ２７７について、ロナルドＣ，デスロシアース（Ｒｏｎａ、ＩｄＣ，Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ）　［ニュー・イングランド・リージョナル・プライメイト・リサーチ・センター（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）、マサチュセッツ州すウスボロウ］から入手したＳＩ■感染アカゲザルを使用して実施し、そしてｖＡｂＴ１４１およびｖＡｂＴ３４４について、ジョン・スリパン（Ｊｏｈｎ　５ｕｌｌｉｖａｎ）［ユニ）（−シティ・オブ・マサチュセッツ・メディカル・スクール（Ｕｎｉｖｅｒｓｔｔｙｏｆ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）、マサチュセッツ州つォルセスター］から入手した、ＨＩＶ−１感染したヒトの患者からの血清を使用して実施した。

陰性の対照ウィルスＮＹＣＢＨまたはｖＡｂＴ３３により形成したプラークは、細胞の単層それ自体上のバックグラウンドと一致するバックグラウンドの色のみを示した。ワクシニア組み換え体ｖＡｂＴ２５２、・、・、へｂＴ２５３、　％＝　、Ａ、ｂ　Ｔ　２６　４、　ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２　７　７　、　ｖ、Ａｂ” 、１４１　、ｖＡｂＴ２７１およびｖＡｂＴ３４４により形成したプラークは明確な暗い紫色に着色し、これは細胞の単層上のバックグラウンドより非常に暗く、これらの組み換え体がＳＩＶｍａｃ２５１またはＨＩＶ−１抗原を強く発現することを示す。

実施例５：組み換えワクシニアウィルスからのＳＩＶｍａｃ２５１またはＨＩＶ −１抗原の免疫沈澱免疫沈澱の分析は、組み換えワクシニアウィルスｖＡｂＴ２５２、ＶＡｂＴ２５３、ｖＡｂＴ２２３、ｖＡｂＴ２６４、ｖＡｂＴ２７７、ＶＡｂＴ１４１、ｖＡｂＴ２７１およびｖＡｂＴ３４４で感染した細胞について、材料および方法に記載するように、実施した。表１に要約する結果が示すように、これらのワクシニア組み換え体の各々はエンコードされたポリペプチドを発現する。

表１組み換えワクシニアウィルスからのＳＩＶｍａｃ２５１またはＨＩＶ−１ポリペプチドの免疫沈澱ｐ５５．　ｐ４０．　ｐ２４．　ｐ１５ｐ６４．　ｐ５３．　ｐｌＯｐ５５．　ｐ４０．　ｐ２４．　ｐ１７実施例５に記載する発現の分析は、挿入されたＨ　Ｉ　ＶまたはＳＩＶ遺伝子によりエンコードされるポリペプチドの合成を確証するために使用できるが、これらのポリペプチドが欠損ウィルス粒子に生体内で自己アセンプリルするかどうかという問題を取り扱わない。ｅｎｖ、ｇａｇ−ｐｒｏｔまたはｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔの両者を発現するワクシニア組み換え体が感染した細胞の培地の中に解放されるレトロウィルス様粒子を産生ずるかどうかを決定する１つの手段として、遠心により沈澱させることができるｅｎｖおよび／またはｇａｇポリペプチドを含有、する構造体の存在について培地を検査した。Ｂ２Ｏ−４０細胞をＳＩＶ／ワクシニア組み換え体ｖＡｂＴ２５３　（ｅｎｖ）　、ｖＡｂＴ２５２（ｇａｇ−ｐｒｏｔ）またはｖＡｂＴ２６４　（ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔ）で感染するか、あるいはＨＩ　Ｖ／ワクシニア組み換え体ｖＡｂＴ１４１　（ｇａｇ）　、ｖＡｂＴ２７１　（ｅｎｖ）またはｖＡｂＴ３４４（ｅｎ’ｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔ）で感染した。感染した細胞を材料および方法に記載するように［３５８］−メチオニンで標識した。

感染の１６〜１８時間後、培地を集め、そして１１０００ｒｐにおいて５分間遠心することによって清浄化した。生ずる上澄み液を取り出し、そして８Ｗ２８０ −ター内で２４Ｋにおいて９０分間遠心した。次いで、上澄み液を取り出し、そして生ずる沈澱を１ｍｌのＰＢＳ緩衝液（１３ミリモルのＮａＣ１，２，７ミリモルのＫＣＬ８．１ミリモルのＮａｚＨＰＯ６，１，５ミリモルのＫＨ２ＰＯ４）の中に再懸濁した。上澄み液およ　。

び沈澱からの試料を、材料および方法に記載するように、ＳＩＶ／ワクシニア組み換え体についてアカゲザル抗ＳＩＶ抗血清を使用するか、あるいはＨＩＶ／ワクシニア組み換え体についてヒト抗ＨＩＶ抗血清を使用して、免疫沈澱分析した。結果が示すように、ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｒｏｔ組み換え体ｖＡｂＴ２６４およびｖＡｂＴ３４４について、上澄み液はＳＩＶ／ワタシニア組み換え体の増殖の間に多分培地の中に落ちたｇｐ１２０にのみを含有する゛［キエ−（Ｋｉｅｎｙ）ら、１９８０］が、沈澱はｇｐ１２０ばかりでなく、かつまたｅｎｖ遺伝子エンコードされたｇｐ３２　（ｖＡｂＴ２６４について）またはｇｐ４１　（ｖＡｂＴ３４４について）ならびにｇａｇＬン’：Ｊ−ドされたｐ５５、ｐ４０、ｐ２４およびｐ１５を含有した。これらの結果が強く示唆するように、組み換え体ワクシニアが産生したｅｎｖおよびｇａｇタンパク質は粒子または複合体に自己アセンプリルする。

それぞれ、ＨＩ　Ｖ　ｇ　ａ　ｇまたはＳＩＶ　ｇａｇ−ｐｒｏｔタンパク質にのみを発現するｖＡｂＴｌ　４１またはｖＡｂＴ２５２について、沈澱した物質はｇａｇタンパク質を含有し、これはｇａｇポリペプチドの自己アセンブリーによる未成熟のウィルス粒子の形成と一致した。対照的に、それぞれ、ＳＩＶまたはＨＩＶ　ｅｎｖ糖タンパク質にのみを発現するｖＡｂＴ２５３およびｖＡｂＴ２７１について、免疫沈澱可能なポリペプチドは沈澱の中に存在しなかったが、実質的な量のＩ）ｇ１２０は上澄み液の中に存在した。これらの結果は次の予測と一致した。すなわち、ｇａｇポリペプチドが、単独であるいは他のウィルスの構造タンパク質、例えば、ｅｎｖ糖タンパク質と組み合わせて発現されるときにのみ、欠損ウィルス粒子の形成は起こる。

実施例７：電子顕微鏡検査を使用する、ＳＩＶまたはＨＩＶ−１ポリペプチドを発現する組み換えワクシニアウィルスによるレトロウィルス粒子の形成の実証ｇａｇ、ｇａｇ＋ｅｎｖ、またはｇａｇ＋ｅｎｖ＋ｐｏ　Ｉポリペプチドを発現する組み換えワクシニアウィルスはレトロウィルス様粒子にアセンブリングすることができるという追加の確証として、これらの組み換えワクシニアウィルスで感染し７た細胞のリゼイトを上の材料および方法の節１１．詳細に袋間した方法により電子顕微鏡で視的に検査した。

これらの実験において次のことが示された・ｇａｇ（＼ＦＡｂＴ１．４１またはｖＡｂＴ２５２）　、ｃｎｖ＋ｇａｇ　（ｖＡｂＴ２２３、］、ｒ　Ａ　））　Ｔ２６４またはｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　３４４　）またはｅｎｖ＋ｇａｇ＋ｐｏｌ　（ｖＡｂ丁”２７７）を発現する；ノクンニｒ組み換入体は１．′１−ンヴエローブト（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）レトロウィルス粒子の形成を生ずる；ｇａｇおよびｅ　１１　Ｖポリペプチドを同時発現する組み換え体（ｖＡｂＴ２２３、ｖＡｂＴ２６４、ｖ　、Ａ　ｂ　Ｔ　３４４およびｖＡｂＴ２７７）において、粒子のエンヴエローブは、粒子の表面上の糖タンパク質の「スパイク」の存在により示されるように、エンヴエローブ糖タンパク質を含有する。ＳＩＶ組み換え体ｖ　Ａ　ｂ　Ｔ　２２３について、粒子の表面上のＳＴｖエンヴ工ローブ糖タンパク質の存在は、また、エンヴエローブ糖タンパク質の１つに対して向けられたモノクローナル抗体ｕｓｂ、免疫金の電子顕微鏡検査で実証された。

プラスミドの受託プラスミドＥ、ｃｏｌｉ　＼４Ｃ１０６１ｐ、ＡｂＴ４５９７およびＥ。

ｃｏｌ　ｉ　ＭＣＩ（）６１　ｐＡｂ丁６２１は、グダベスト条杓の規定に従い、アメリカン・ダイブ・カルチャー・コし／クション（ｔｈｅ　Ａｍｃｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ日ｏｎ）米国マリ・ｒランド州ロア・クビレ、に１．９８９年５月３１日に受託された。

これらのプラスミドは、モわぞれ、受は入れ番号５７９９８および６７９９０を割り当てられた。

同等の実施態様当業者は、ここに記載オろ本発明の特定の実施態様に対して多数の同等の実施で様を認識するか、あるいはＥｌ常の実験を越えない実験庄使用して確証することができるであろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲に包含される。

、ＦＩＧ、　５ＦＩＧ、　６Ｃｏ、゛。

ＦＩＧ、　７Ｂ国際調査報告、−１−ｌ−Ｉｌ−−１−−−＝、、１．−、−、？ＣＴ／υＳ　９０１０３Ｉ３４国際調査報告ＵＳ　９００３１３４ＳＡ　３８１０７

Claims

【特許請求の範囲】１、真核生物の細胞において、欠損非自己増殖性ウイルス粒子に自己アセンブリーすることができる異種ウイルスのポリペプチドをエンコードする少なくとも２つの遺伝子を同時発現する組み換えウイルスのベクター。２、組み換えウイルスはボックスウイルスである、上記第１項記載の組み換えウイルスのベクター。３、組み換えポックスウイルスはワクシニアウイルスである、上記第２項記載の阻み換えウイルスのベクター。４、異種ポリペプチドをエンコードする遺伝子はレトロウイルスの遺伝子である、上記第１項記載の組み換えウイルスのベクター。５、レトロウイルスの遺伝子はレンチウイルスの遺伝子である、上記第４項記載の組み換えウイルスのベクター。６、レンチウイルスはヒトの免疫欠損ウイルスである、上記第５項記載の組み換えウイルスのベクター。７、遺伝子はＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子またはその修飾変異型である、上記第６項記載の組み換えウイルスのベクター。３、レンチウイルスはサルの免疫欠損ウイルスである、上記第５項記載の阻み換えウイルスのベクター。９、遺伝子はＳＩＶｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子またはその修飾変異型である、上記第６項記載の組み換えウイルスのベクター。１０、真核生物の細胞において、ヒトの免疫欠損ウイルスのｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子を同時発現する組み換えウイルスのベクター。１１、ＨＩＶｐｏｌ遺伝子またはその修飾変異型をさらに発現する、上記第１０項記載の組み換えウイルスのベクター。１２、欠損非自己増殖性ウイルス粒子に自己アセンブリーすることができる異種ウイルスのポリペプチドをエンコードする少なくとも２つの異なる遺伝子を同時発現する組み換えウイルスのベクターにより感染された真核生物の細胞により発現された、自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子。１３、組み換えウイルスのベクターはポックスウイルスである、上記第１２項記載のウイルス粒子。１４、ポックスウイルスはワクシニアウイルスである、上記第１３項記載のウイルス粒子。１５、異種ウイルスのポリペプチドをエンコードする遺伝子はレトロウイルスの遺伝子である、上記第１２項記載のウイルス粒子。１６、レトロウイルスの遺伝子はレンチウイルスの遺伝子である、上記第１５項記載のウイルス粒子。１７、レンチウイルスの遺伝子はＨＩＶ増殖培地またはその修飾変異型である、上記第１６項記載のウイルス粒子。１８、レンチウイルスの遺伝子はＳＩＶ遺伝子またはその修飾変異型である、上記第１６項記載のウイルス粒子。１９、異種ウイルスのポリペプチドをエンコードする遺伝子はピコルナウイルスである、上記第１２項記載のウイルス粒子。２０、ピコルナウイルスはポリオウイルスである、上記第１９項記載のウイルス粒子。２１、レトロウイルスのエンヴェロープのポリペプチドおよびレトロウイルスのコアのポリペプチドからなる、自己アセンブルド欠損非自己増殖性レトロウイルス粒子。２２、レトロウイルスはヒトの免疫欠損ウイルスである、上記第２１項記載のレトロウイルスの粒子。２３、レトロウイルスはサルの免疫欠損ウイルスである、、上記第２１項記載のレトロウイルスの粒子。２４、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含有する組み換えワクシニアウイルスで感染した真核生物の細胞中で発現された、自己アセンブルド欠損非自己増磁性レトロウイルスの粒子。２５、また、ＨＩＶｐｏｌ遺伝子でエンコードされたポリペプチドまたはその修飾変異型を含有する、上記第２１項記載のレトロウイルスの粒子。２６、製剤学的に許容されうるベヒクル中の免疫化量の上記第１項記載の組み換えウイルスのベクターからなる、ワクチン接種組成物。２７、ウイルスのベクターはヒトの免疫欠損ウイルスのｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子を同時発現する組み換えワクシニアウイルスからなる、上記第２６項記載のワクチン組成物。２８、製剤学的に許容されうるベヒクル中の上記第１２項記載の自己アセンブルド欠損非自己増植性ウイルス粒子からなる、ワクチン組成物。２９、ウイルス粒子はレトロウイルスのエンヴェロープおよびコアのポリペプチドからなるレトロウイルスの粒子である、上記第２８頂記載のワクチン組成物。３０、製剤学的に許容されうるベヒクル中のヒトの免疫欠損ウイルスの自己アセンブリー性レトロウイルス粒子を産生する組み換えワクシニアウイルスからなり、前記ワクシニアウイルスはＨＩＶのｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子を含有する、ワクチン組成物。３１、免疫化すべき宿主を製剤学的に許容されうるベヒクル中の組み換えウイルスのベクターを接種することからなり、前記組み換えウイルスのベクターは欠損非自己増殖性ウイルス粒子に自己アセンブリーすることができる、少なくとも２つの異なる異種ウイルスのポリペプチドを同時発現する、ウイルスに対して免疫化する方法。３２、宿主はヒトである、上記第３１項記載の方法。６３、ウイルスはヒトのレトロウイルスであり、そして組み換えウイルスのベクターはレトロウイルスのエンヴェロープの糖タンパク質およびコアのポリペプチドを同時発現するワタシニアウイルスである、上記第３２項記載の方法。３４、レトロウイルスはＨＩＶである、上記第３３項記載の方法。３５、製剤学的に許容さ机うるベヒクル中の免疫化量の上記代１２項記載の自己アせンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子を宿主に投与することからなる、ウイルスに対して免疫化する方法。３６、ウイルスはヒトの免疫欠損ウイルスであり、そしてウイルス粒子はＨＩＶのコアおよびエンヴエローブのポリペプチドからなる、上記第３５項記載の方法。３７、ヒトの免疫欠損ウイルスのエンヴェロープおよびコアのポリペプチドからなる自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子を発現する組み換えワクシニアウイルスを固体に接種することからなる、ヒトの免疫欠損ウイルスに対して免疫化する方法。３８、生体内の組み換えによりウイルスのベクター中に異種ウイルスのＤＮＡを挿入するためのＤＮＡベクターであって、ａ、ベクターを原核生物の宿主中で増幅することができるように、複製の原核生物の由来、ｂ、ベクターを含有する原核生物の宿主細胞の選択を可能とするマーカーをエンコードする遺伝子、ｃ、ウイルス粒子に自己アセンブリーすることができる異なる異種ウイルスのポリペプチドをエンコードする、少なくとも２つのＤＮＡ配列、各ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の発現を指令することができる転写プロモーターに隣接して位置する、およびｄ、異種ＤＮＡ配列が挿入され、要素ｃの構成体をフランキングする、ウイルスのベクターのゲノムの領域に対して相同性であるＤＮＡ配列、からなるＤＮＡベクター。３９、異種ＤＮＡ配列はレトロウイルス遺伝子である、上記第３８項記載のＤＮＡベクター。４０、レトロウイルスはヒトの免疫欠損ウイルスである、上記第３９項記載のＤＮＡウイルス。４１、レトロウイルスはサルの免疫欠損ウイルスである、上記第３９項記載のＤＮＡウイルス。４２、ウイルスのベクターはポックスウイルスであり、そしてフランキングＤＮＡ配列はポックスウイルスの配列に対して相同性である、上記第３８項記載のＤＮＡ配列ベクター。４３、ポックスウイルスはワクシニアウイルスである、上記第４２項記載のＤＮＡベクター。４４、上記第１２項記載のウイルス粒子に連鎖されているか、あるいはその中に組み込まれている治療剤からなる、ターゲテッド（ｔａｒｇｅｔｅｄ）治療剤。４５、治療剤は抗ウイルス剤または細胞障害性剤である、上記第４４項記載のターゲテッド治療剤。４６、ウイルス粒子はＨＩＶのコアおよびエンヴェロープのポリペプチドからなる、上記第４４項記載の治療剤。４７、製剤学的に許容されうるベヒクル中の、上記第１２項記載のウイルス粒子に連鎖されているか、あるいはその中に組み込まれている治療剤からなるターゲチッド治療剤を投与することからなる、ウィルスが感染した細胞への治療剤の送達をターゲッティングする方法。４８、ウイルスが感染した細胞はＨＩＶ感染ＣＤ４レセプターを有する細胞であり、そしてウイルス粒子はＨＩＶのコアおよびエンヴェロープのポリペプチドからなる、上記第４７項記載の方法。４９、ｐＡｂＴ４５９２、ｐＡｂＴ４５９３、ｐＡｂＴ４５９７、ｐＡｂＴ４６０３およびｐＡｂＴ６２１から成る群より選択されるプラスミドＤＮＡベクター。５０、ｖＡｂＴ１４１、ｖＡｂＴ２５２、ｖＡｂＴ２２３、ｖＡｂＴ２６４、ｖＡｂＴ３４４およびｖＡｂＴ２７７から成る群より選択される組み換えワクシニアウイルス。