JPH06506584A

JPH06506584A - 種子における脂質生合成の制御に関与する植物プロモーター

Info

Publication number: JPH06506584A
Application number: JP4507189A
Authority: JP
Inventors: ドゥ・シルバ、ジャクリーン; サフォード、リチャード; ヒュージス、スティーブン・グリン
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1992-04-08
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2021-01-05
Also published as: EP0580649B1; WO1992018634A1; JP3730658B2; DE69231875D1; EP0580649A1; ATE202144T1; US5767363A; ES2157202T3; ZA922592B; CA2106960A1; CA2106960C; AU669478B2; DK0580649T3; AU1468092A; DE69231875T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】種子における脂質生合成の制御に関与する植物プロモーター技術分野本発明は、種子に特異的な脂肪酸産生を修飾して種子油の脂肪酸組成の変化を生じさせるための形質転換植物細胞に関する。特に本発明はブラシカ脅ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓｓ脂肪種子セ脂肪種子ブイヨウアブラナる、種子に特異的なアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）遺伝子から単離した新しいプロモーターを提過去１０年の間に、遺伝子を植物に導入し、その遺伝子が発現して、得られる形質転換植物に新規な又は改良された性質を与えることにより、植物を形質転換する方法が開発されてきた。これらの方法の一つは、形質転換されるべき植物の染色体に所望の遺伝子を導入するために、細菌アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）を使用することである。

この技法についての数多くの論文が発表されてきた。一般的な概論としては、Ｊａｍｅｓ　Ｄ、　１ａｔｓｏｎ　５Ｊｈｏｎ　Ｔｏｏｚｅ及びＤａｖｉｄ　Ｔ、　Ｉ［ｕｒｔｚによる、’　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ａ　５ｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅ’　［サイエンティフィック拳アメリカン・ブックス、１９８３年出版１ｆ、　Ｈ，フリーマン・アンド・カンパニー（米国、ニューヨーク）販売コの、１３章（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｃｒｏｗｎ　ＧａｌｌＰｌａｓｍｉｄｓ）　ｐ、１６４− １７５を参照。

欧州特許出願公開０２５５３７８　（ＣＡＬＧＥＮＥ、　ＩＮＣ，，１９８８年２月３日公開、優先権主張日：　１９８６年７月３１日）によれば、ナピン（ｎａｐｉｎ　）遺伝子のいわゆる転写開始領域が同定され、植物細胞から単離され、種子に特異的な転写のため植物細胞内に挿入される発現カセットを調製するために用いられた。その公開明細書には、その方法が種子の組織における脂肪酸産生の修飾と共に適用されることが記載されている。

その欧州特許出願公開０２５５３７８から、以下の一節を引用する。

３頁、６−９行、［特に興味深い転写開始領域はブラシカ・ナプスまたはカンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のナピン遺伝子、アシルキャリヤータンパク質遺伝子と関連しており、それらは種子において、およそ７日から４０日で発現し、特におよそ１０日からおよそ２０日に発現の最大値を有し、そこでは種子では発現産物が豊富に見られるのに対し、葉には発現された遺伝子は見られない。」４頁、１１−１２行、［構築物を用いて（中略）種子における脂肪酸組成を修飾するため、すなわち長さや不飽和などについての種々の脂肪酸の比及び／又は量を変えること。（中略）生来の遺伝子の転写産物に相補的な転写産物の生産により、その転写産物の成熟及び／又は発現を阻害することによって、１つ以上の内在性産物、特に酵素又は補因子の発現の減少を与えるか、または脂肪酸合成に関連した、内在性あるいは外来性の遺伝子の発現を与えることにより、これらの結果は達成される。脂肪酸合成に関連した発現産物には、アシルキャリヤータンパク質、チオエステラーゼ、アシルトランスアシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ［ｍ］、ケトアシルシンテターゼ、マロニルトランスアシラーゼ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及び他のデサチュラーゼ酵素を含む。」５頁、５７−６４行、「特に興味ある発現カセットは、脂質産生、特にアシルキャリヤータンパク質を含む、脂肪酸産生に関連する、ホウレンソウのアシルキャリヤータンパク質、ブラシカのアシルキャリヤータンパク質、ナプス又はカンペストリスのアシルキャリヤータンパク質、クヘア（Ｃｕｐｈｅａ、　ミソハギ科）のアシルキャリヤータンパク質、動植物又は細菌由来のアセチルトランスアシラーゼ、マロニルトランスアシラーゼ、β−ケトアシルシンテターゼＩ及びＩＩ、チオエステラーゼ、特にチオエステラーゼＩＩ、例えばラットのチオエステラーゼエエ、アシルＡＣＰ又はホスホリピドアシルデサチュラーゼのような、ある植物にとって内在性又は外来性の構造遺伝子を制御しているナピン遺伝子の、特にブラシカナピン遺伝子、さらにはブラシカ・ナプス又はブラシカ・カンペストリスの、転写領域を含む。」３頁、６−９行から引用される一節に示され、花成後の日数（ＤＡＦ）として時に記載されている時期は、それが同一の植物に関しても、生育の場所及び条件により変わり得るため、常に正確な単位ではないということに注意しなければならない。従って、ＤＡＦは絶対的なパラメーターとしてではなく、相対的なパラメーターとして用いるべきである。それ故、異なる時間又は異なる場所で行なった実験から、この種の結果を比較する際には、ＤＡＦ値の差に基づいて結論を導くことには特に注意しなければならない。

さらに、タバコの実験では、個々の種子のさやの成育速度は単一の植物であっても変わり得る、すなわち、最も初期のさやが最も速く成育するので、その場合タバコでは、種子の成育段階を正確に決定するためにＤＡＦを用いることはできない。このような情況では形態学的特徴を用いて種子を段階づけすべきである。このことは本明細書において後で詳述する（実施例１．ｃ、５及び実施例３、実験２参照）。

欧州特許出願公開０２５５３７８の実施例Ｉは、Ｂ、ナプス由来のナピンプロモーターの制御下にある、ホウレンソウ葉のアシルキャリヤータンパク質をコードする構造遺伝子を含む構築物を開示している＠タンパク質が形成されたという証拠はない。すなわち、ノザンプロットにより、胚では対応するｍＲＮＡがもっともらしく作られたが、葉では見られず、そのことはホウレンソウの葉のＡＣＰ遺伝子の、種子特異性発現を示唆している。

実施例ＩＩは、Ｂ６カンペストリスのナピンプロモーターカセットの構築を開示している。脂肪酸合成に関与する遺伝子がそのカセット内に挿入されたことのみが示唆される。そのような遺伝子の挿入あるいは発現についての実験上の詳細は何も与えられていない。実施例ＩＩＩによれば、［ブラシカ種子由来のアシルキャリヤータンパク質のような、種子のトリアジルグリセロール合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子から、種子特異性の他のプロモーターが単離されるであろう。ツケナ（ｔｕｒｎｉｐ　ｒａｐｅ）の自家和合性変種、ブラシカ・カンペストリスの品種ｒ　Ｒ−５００Ｊから未熟な種子を集めた。花成後およそ１４日から２８日に相当する段階ですべての種子を集め（中略）ｃＤＮＡバンクの調製（中略）。

ｃＤＮＡバンクをプローブするため、オリゴヌクレオチド（中略）を合成し、（中略）。この合成りＮＡ分子はアミノ酸配列（ａｌａ−ａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ −ｇｌｕ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ｇｌｕ−１ｙｓ−ｖａｌ）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列とあまり厳格でなくハイブリダイズするであろう。このアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス種子から単離されたＡＣＰにつ０て報告されたものである［Ａ、　Ｒ，５ｌａｂａｓら、第７回植物脂質の構造と機能に関する国際シンポジウム、（７ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄｓ）　、カリフォルニア州、ディビス、カリフォルニア大学、１９８６年］　；Ｂ、カンペストリス種子由来のＡＣＰは高度に均一であり（中略）オリゴヌクレオチドプローブに明らかなハイブリダイゼーションを示している２つのＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、１）ＣＧＮＩＢｃｓと称する一方が、ＡＣＰ前駆タンパク質を実際にコードすることを、コードされたアミノ酸配列とブラシカ・ナプスからの記載されているＡＣＰタンパク質とのかなりの相同性により示唆した（Ａ、　Ｒ。

５ｌａｂａｓら、１９８［６］前記）。実施例ＩＩと同様に、ＡＣＰｃＤＮＡクローンをゲノムクローンの単離のために用いることができ、そこからＢ、カンペストリスのナピンカセットと全く類似した方法で、発現カセットを作ることができる。」その次の項、他の実施例の下では、次のように述べられている。

［開花後１４−２８日のＢ、カンペストリス種子のｃＤＮＡライブラリー（前の実施例に記した）から、９６クローンを選択した（中略）種子特異性の他の遺伝子もまたプロモーターの有用な源として役立つであろう。

（中略）それらの特異的な機能を知らなければ、たとえ他のｃＤＮＡクローンが種子組織におけるそれらの発現レベルや発現のタイミング（すなわち、開花後のいつ発現されるか）に関して分類できたとしても（中略）脂肪酸合成又は種子の他の機能に関係する遺伝子を発現させるのに必要な基準に合致するクローンが、発現に必要な５′および３′の調節領域を含んでいるゲノムクローンのための、ゲノムライブラリーの選択に使用することができる。先の実施例の中でナビン遺伝子について記述されている一般的な方法により遺伝暗号のない調節領域を操作して、組織特異性発現カセットを作ることができる。

ｃＤＮＡクローンの一例はＥＡ９である。それはＢ、カンペストリスの、葉ではなく種子で高度に発現される。

（中略）開花後１４日、２１日及び２８日の種子の胚から、ＥＡ９の７００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用いて単離したｍＲＮＡのノザンプロット分析は、ＥＡ９が１４日に高度に発現されており、２１日及び２８日ではより低いレベルで発現されていることを示している。（中略）クローンＥＡ９について本明細書中に提供した部分的な配列（図３）は、ブラシカの種子特異性プロモーターの、唯一の種類を同定するプローブの合成に使用することができる。」関連した欧州特許出願公開０２５５３７７　（ＣＡＬＧＥＮＥ、　Ｉｎｃ、、１９８８年２月３日公開、優先権主張臼：　１９８６年７月３１日）には、ホウレンソウおよびブラシカ・カンペストリスのＡＣＰをコードしている構造遺伝子のＤＮＡ配列が提供されており、それは、最終産物としてのＡＣＰの産生に用いることができ、あるいは植物種子における種子油産生を増加できることが提供された。実質的に種子組織に対するＡＣＰ遺伝子の発現を制御する、Ｂ、ナプスおよびＢ、カンペストリスのナビンプロモーターも記載されており、それらのプロモーターは欧州特許出願公開０２５５３７８に記載されているものと同じである。

しかし、Ｉｆ、Ａ、　Ｐｏ５ｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎ＋＋１ｌｌｅｒらによる、ＴｈｅＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１（１９８９）　８８９−８９９によれば、タバコ・リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターと運搬ペプチド及び、成熟したホウレンソウのＡＣＰ−Ｉをコードする配列から成るキメラ遺伝子を用いてタバコを形質転換した際、葉における脂質合成は、脂質分析によってレベルにおいても組成においても何ら有意な変化が検出されなかった。彼等はさらに、成熟したホウレンソウのＡＣＰ−Ｉ遺伝子が内在性のタバコＡＣＰよりも高いレベルで発現されていることをタンパク質のイムノプロットで示した。この後の仕事は、植物組織におけるＡＣＰ産生の増加は必ずしも脂肪酸の組成の変化に帰着する必要がないことを示した。

この発見は、Ｖ、Ｃ，Ｋｎａｕｆにより、”Ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｔｏｎｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｏ　ｏｉｌｓｅｅｄ　ｃｒｏｐｓ”、ＴＩＢＴＥＣＨ５巻（１９８７年２月）、４０−４７頁において発表された記載と一致し、その中で彼は、なぜセイヨウアブラナ種子の脂肪酸組成を変えるための「典型的なプロジェクト」が、植物組織における脂質生合成の複雑さにより失敗するかについて多くの可能性を記述している。

「ブラシカ拳ナブスのプラスチドに局在する種子アシルキャリャータンパク質は別個の、核の多重遺伝子族によりコードされているＪ　（Ｐｌａｓｔｉｄ−１ｏｃａｌｉｓｅｄ　５ｅｅｄａｃｙｌ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｉｓ　ｅｎｃｏｄｅｄｂｙ　ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ、　ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）という表題の論文の中でＲ，５ａｆｆｏｒｄらはＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７４（１９８８）２８７−２９５頁に、油をもつ種子の脂肪酸生合成を調和的に働かせている遺伝子の、起源、構造及び発現についての最初の洞察を提供している。それは、プラスチド体内に局在し、核ＤＮＡにコードされる種子ＡＣＰが、そのタンパク質の移入をプラスチド内へ向けさせると考えられているＮ末端の延長配列を含んでいる前駆物質として合成されることを示している。いくつかのｃＤＮＡクローンの分析は、配列異質性を示し、それ故にＡＣＰ多重遺伝子族の証明をした。更なる実験が、少なくともこれらの遺伝子の一部が、葉組織では発現されていないことを示した。その刊行物の図８Ａには、ＡＣＰ開始コドンの上流の５′ 非暗号領域の５６より多くないヌクレオチドが記されている。この実験は、プロモーター領域を含む転写調節領域をもっている染色体ＤＮＡの代わりに、転写された配列のみをもつ、出発物質としてのｒｎＲＮＡからのｃＤＮＡを用いて行われたために、プロモーターは決定できなかった。

Ｊ、　ｄｅ　５ｉｌｖａらの次の論文［Ｐｌａｎｔ　ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１４巻（１９９０年）、５３７−５４８頁］の中で、同グループは、種子で発現したアシルキャリャータンノくり質遺伝子をコードする２つのゲノムクローンの、ブラシカ・ナプスからの単離及び配列決定を記載している。後者の論文は、転写開始部位が、構造遺伝子の（ＡＴＧ）開始コドンの６９ｂｐ上流に位置することを開示した。

従って、両輪文において示された５′領域は７０ヌクレオチド長さより短く、転写開始部位の下流のＤＮＡ配列を記載している。ゆえに、それらは種子特異性の遺伝子転写の一時的な調節を与えるプロモーター領域も、調節領域も含んでいない。

先行技術をまとめると、欧州特許出願公開０２５５３７８は、Ｂ、ナプス及びＢ、カンペストリスのナビンプロモーターの単離と使用を記載し、ＡＣＰプロモーターのような、他のプロモーターをどのようにして単離できるかを示唆し、欧州特許出願公開０２５５３７７は、同じナピンのプロモーターについて記載し、Ｒ，５ａｆｆｏｒｄら（１９８８）とＪ、　ｄｅＳｉｌｖａら（１９９０）の刊行物は、Ｂ、ナプスの、種子特異性ＡＣＰをコードする構造遺伝子に先行する５′ 領域の７０ヌクレオチドよりわずかに短いヌクレオチドについて記載しており、これらの刊行物はいずれも、ＡＣＰプロモーターのヌクレオチド配列は開示していない。

発明の概略本発明は、ブラシカ・ナプスから単離した、種子特異性の新規のＡＣＰプロモーターと、植物細胞の操作に用いて種子特異的性の転写を与えることが可能なりＮＡ構築物とを提供する。

本発明の１つの態様によれば、脂肪酸産生のための生合成経路において活性なタンパク質をコードする、所望の遺伝子を、新規なＡＣＰプロモーターの制御下に置き、植物ゲノムに導入し、種子特異性の転写を与え、それにより、その遺伝子は植物ゲノムに相同であるか又は非相同になる。構築物は内在束の産物又はそれらの産生の調節を、異種の産物の産生と同様に供する。−脂肪酸生合成に影響を及ぼすことができるようにするために、産生されるべきタンパク質は細胞の正しい細胞内部位、すなわちプラスチドを標的としなければならない。このことは、所望の遺伝子が、適する運搬配列と連結して、結果として得られるキメラタンパク質がプラスチドを標的とするようにＤＮＡ構築物を作ることを必要とし、これにより所望の遺伝子に対応するタンパク質の成熟型の、プラスチド内での解離が可能になる。脂肪酸生合成経路において活性なタンパク質の例は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アセチルトランスアシラーゼ、ＡＣＰ、デサチュラーゼ）エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅｓ　）　、エノイルレダクターゼ、β−ケトレダクターゼ、ケトアシルシンテターゼ、マロニルトランスアシラーゼ及びチオエステラーゼである。

本発明のもう１つの態様によれば、所望のタンノくり質をコードする遺伝子は、新規なＡＣＰプロモーターの制御下に置かれている。これらの所望のタンパク質は、そのタンパク質の植物における産生、および任意にそれに続く単離が望ましいいかなるタンパク質でもよい。これらのタンパク質の実例は以下のように列挙される。

（１）食物加工に使用される酵素、例えばグアー（ｇｕａｒ　）α−ガラクトシダーゼ、ソーマチン、キモシン（２）抗栄養因子の形成を阻害することのできるタンパク質（３）製薬学的に活性のタンパク質、たとえば血液因子、インターフェロン、ホルモン、ヒト血清アルブミン及び（４）所望のアミノ酸組成により近い、植物タンパク質例えば非形質転換植物内に生成するより高リジン含有のタンパク質所望のタンパク質が、細胞の代謝に及ぼす影響に応じて、そのタンパク質を細胞質に置くこともでき、あるいはプラスチドを標的とすることもできるが、その場合、所望のタンパク質をコードする遺伝子は、前記のように標的配列に連結されていなければならない。代わりに、細胞内の他のオルガネラを標的とすることもでき、そのためには他の標的配列が必要である。他のいくつかの標的配列が先に記載されている。例えば、外来性タンノ（り質の葉緑体へのターゲテイングについてはＧ、　Ｖａｎ　ｄｅｎＢｒｏｅｋらによる、Ｎａｔｕｒｅ　３１３巻（１９８５年１月３１日’）　３５８−３６３頁参照。Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１４巻（１９７８／８）　１−２４頁［アカデミツクブレス社出版（ＩＳＢＮ　０−１２−００５９１４−２］におけるｌ、Ｊ、　Ｅｌｌｉｓ及びＣ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎによる、タンパク質のターゲティングについての総説は植物の葉緑体、ミトコンドリア及び核へのターゲティングを本発明は、ブラシカ・ナプスのような植物の種子における、脂肪酸合成に関与するタンパク質の発現に影響を及ぼし得る因子についての研究の遂行に基づくものである。この研究は、セイヨウアブラナのような種子油の脂肪酸のプロフィルを変えることに向けられたプロジェクトにおいて必要であった。遺伝子工学の手法によって植物の貯蔵脂質の脂肪酸組成を変えるために又は、所望のポリペプチド又はタンパク質の植物の種子における産生を誘導するためには、関連する遺伝子の発現を、以下の様式で制御しなければならない。

ｉ）所望の遺伝子の発現は、種子組織に限られ、成育の適切な段階において、適切なレベルで成されねばならない。

ｉｆ）特に種子の脂質の脂肪酸のプロフィルを修飾する場合には、ａ）生じたタンパク質の、脂肪酸を合成している細胞内小区画（いわゆるプラスチド）への生物学的に活性な形態での運搬及びｂ）合成された脂肪酸のプラスチドの外への運搬及びそれに続くトリアジルグリセリドへの変換。

工程ｉ）を達成するための１つの方法は、脂肪酸生合成に関与する内在性遺伝子から単離した、プロモーター領域を使用することである。そのようなプロモーターは、脂肪酸の生合成が種子で起こる前又は起こる時に、遺伝子の発現を活性化させる。

例えばセイヨウアブラナ種子のような植物において、所望の遺伝子の制御された発現を得るためには、構造遺伝子を、例えばセイヨウアブラナ種子の脂質生合成用の内在性の遺伝子から単離したプロモーター領域の制御下に置かなければならない。前記のようにいくつかの、種子特異性のプロモーターが既に知られているにもかかわらず、植物における種子の脂質生合成に関与するそのような調節遺伝子のＤＮＡ配列の単離及び機能上の特徴を記載した報告はない。

そのような遺伝子の一例が、ＡＣＰをコードする遺伝子であり、ＡＣＰは植物の脂肪酸生合成機構の重要成分で脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の成分として働き、デサチュレーシコン及びアシル転移反応にも関与する［Ｐ、　Ｋ。

Ｓｔｕｍｐｆらによる“Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ”　（Ｆａｔｔｙ　Ａｃ１ｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ＩｔｓＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、アムステルダム、Ｎｕ＋ｏａＳ９編（１９８４年’）　１５５−１７９頁コ。

本発明に至った研究の過程において、Ｊ、　ｄｅ　５ｉｌｖａらにより記載された（１９９０年、前記）染色体遺伝子ＡＣＰＯ５に属するものから、１つのプロモーターを選択したが、ＡＣＰＯ５遺伝子はＲ，５ａｆｆｏｒｄらによッテ、！））早＜記載された（１９８８年、前記）、ＡＣＰをコードする２９ＣＯ８ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに対応する。後者の刊行物は、セイヨウアブラナ胚ＡＣＰをコードしているｃＤＮＡクローンの単離及び特徴づけを示し、さらにＡＣＰがＮ末端の運搬配列を含んでいる前駆物質として合成されることを示した。後者は外来遺伝子の産物を、脂肪酸合成するプラスチドヘ運搬するための「道具ｊとして使うことができる。

ＡＣＰ遺伝子の５′上流に存在するプロモーター要素の機能分析を、β〜グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ−遺伝子及び、タバコの形質転換を用いて行なった。

セイヨウアブラナＡＣＰＯ５遺伝子の１．４ｋｂ　５−上流断片（ＡＰＩプロモーター）をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ−遺伝子と融合し、アグロバクテリウム感染を介してタバコに移入した。形質転換した１５のタバコ植物の葉及び種子組織の分析は、ＧＵＳ発現のレベルが種子成育を通して増加し、平均して、葉で見られる値のおよそ１００倍高い値まで増加することを示した。植物の構成プロモーター（ＣａＭＶ　３５Ｓ）に連結されたＧＵＳ遺伝子を含む構築物で形質転換した、対照植物の分析は、葉と種子成育の全段階において、同様のレベルのＧＵＳ発現を示した。これらの結果は、単離されたＡＰＩプロモーター配列が機能して、遺伝子移入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）タバコにおけるＧＵＳ遺伝子の発現を、所望の種子特異性かつ成育様式で制御することを示している。

Ｃａ１ｉＶ　３５ＳとＡＦＬプロモーターを用いた比較研究では、ＡＰＩプロモーターを用いて、種子の最大脂質合成期に得られるＧＵＳ発現のレベルは、強力な植物プロモーターＣａｌ［Ｖ　３５Ｓを用いて得られるものと等しかった。従って、ＡＰＩプロモーターは「強力な」種子特異的性プロモーターであると考えられる。ＣａＭＶ　３５プロモ一ター自体は、構成プロモーターであり、望ましくない、植物全体でのセイヨウアブラナのＡＣＰＯ５プロモーターの、何らかの特異的かつ成育調節配列（複数）を含んでいる主要部分をさらに厳密に定義するために、欠失分析を行った。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ−遺伝子に融合させた、ＡＣＰＯ５遺伝子の転写開始部位の上流の領域のそれぞれ１．４ｋｂ　、　０．９２ｋｂ１及び０．２９ｋｂを含んでいるキメラ遺伝子構築物を、タバコに移入した。各々の構築物につき１０の形質転換植物を、ＧＵＳ発現の様式について分析した。もともとの１．４ｋｂの構築物に比較して、ＡＣＰプロモーターの欠失した変形体で形質転換した植物におけるＧＵＳ活性には、レベルにおいても、組織分布においても何ら有意差が見られなかった。それ故ｄＡｃＰＯ５遺伝子の、転写レベル及び種子特異性を決定するＤＮＡ配列は、その遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の０．２９ｋｂ領域以内にあることが結論付けられる。転写開始部位についてはＪ、　ｄｅ　５ｉｌｖａらの１９９０年の刊行物（前記）に記載されている。このＤＮＡ断片を配列決定し、そして得られた２９１ｂｐのＤＮＡ配列は以下の通りである。

＾ＣＰＯ５プロモーターの時間的な調節を、他の、種子特異性の植物プロモーターとの関係において比較するため、脂質生合成遺伝子（八ＣＰＯ５）及び２つの貯蔵タンノくり質遺伝子に由来する各々のプロモーター要素が、実際に種子成育の間の特異な遺伝子の発現を与えることができる力１どうかを測定した。これを、キメラ遺伝子ＡＰＩ−ＧＵＳ　、ナピ＞−ＧＵＳ及びクルージフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）　−ＧＵＳのタバコへの移入により、さらに種子成育にわたる種々の段階におけるそれらの発現をモニターすることにより調べた。それに対しこれらの組み合わせを用ｔ）たセイヨウアブラナにおける同様の発現実験は現在進行中でアル。

＾ＣＰＯ５遺伝子の５−上流の１．４ｋｂ断片、セイヨウアブラナのナピン遺伝子の上流１．　ｌｋｂ断片及び、セイヨウアブラナのクルージフェリン遺伝子の上流２ｋｂ断片をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ−遺伝子（こ融合し、アグロバクテリウム感染を介してタノくコ（こ移入した。

ＧＵＳ活性を、２つの成育段階の種子（中間成熟及び成熟）と葉組織で分析した。これら３つのセイヨウアブラナのプロモーターはすべて、種子特異性の様式でＧＵＳの発現を調節することがわかったが、種子成育の間の時間的な調節の様式は異なっていた。例えば、ＡＰＩ−ＧＵＳ形質転換植物では、ＧＵＳ活性は、中間成熟種子において最大であり、一方、２つの貯蔵タンパク質プロモーター構築物で形質転換した植物では、ＧＵＳ活性は成熟した種子において最大であった（図１２参照）。

ＡＣＰプロモーター及びクルージフェリンのプロモーターをもつタバコの種子において得られるＧＵＳ発現の最大レベルは、カリフラワーモザイクウィルスの強力な構成プロモーターである３５Ｓプロモーターを用いて得られるものと同様であり（１０植物の平均／構築物）、ナピンプロモーターを用いて得られるものの約３倍であった。

種子成育の間に、脂質生合成遺伝子プロモーター（ＡＰＩ）及び貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター（クルジフェリン）によって、ＧＵＳ発現において与えられる時間的な差異の性質を、さらに厳密に決定するために、第二の実験を行なった。最初の研究で最もよく発現しているＡＰＩＧＵＳ及びＣＲＵＧＵＳ植物からの種子を用いて、新しい植物を繁殖させた。開花時の花に標識をつけ、開花後７− ２０日に種子のさやを集め、種子の抽出物のＧＵＳ活性を測定した。ＡＣＰプロモーター−ＧＵＳ融合物で形質転換した植物では、活性は１ｌ−１２Ｄ　Ａ　Ｆでピークを成し、それは種子における脂質合成の最大速度に相当する。クルージフェリンプロモーター−ＧｔｌＳ融合物で形質転換した植物では、活性は１６− １９Ｄ　Ａ　Ｆでピークを成し、それは種子成育において、タンパク質含有量はすみやかに増加しているが、脂質合成が減少している段階に相当する（図１４参照）。

これらの調査の結果は、遺伝子工学によってセイヨウアブラナの油の組成を修飾することを目的とするプログラムに対して、重要な意味をもつ。成功するためには、脂肪酸の生合成を混乱させるタンパク質をコードする、移入された遺伝子が、種子成育の脂質合成相と一致して発現されねばならない。この結果は、その目的を達成するためには、移入された遺伝子の発現が、種子の１生合成遺伝子のプロモーター、たとえばＡＣＰ遺伝子のプロモーターによって調整されるべきであることを明らかに示している。そのような遺伝子を、種子の貯蔵タンノ々り質遺伝子のプロモーター、例えばナピン遺伝子のプロモーターに融合させると、脂質合成の最も活性な相の後に、移入された遺伝子の最大の発現が生じ、従って、脂肪酸プロフィルの意味のある混乱を生じそうもな０゜従って本発明は、種子の脂質生合成遺伝子の新規なプロモーターを提供し、さらにそのプロモーターの、種子成育において、形成されたタンパク質あるいはポリペプチドが、脂肪酸及びそれらの脂質エステルの生合成による形成に影響を及ぼし得る段階における遺伝子発現における使用を提供する。本発明は、特定の種、ブラシカ・ナプスから単離した天然と等しい植物プロモーターに基づいて説明されているが、当業者には、脂肪酸又は脂質の生合成と協奏して遺伝子を発現することのできる、天然と同一の種子特異性の他のプロモーターが、本明細書の教示を用いて単離することができることは明らかであろう。本明細書で用いる「〜と協奏して」という表現は、発現の結果得られるタンパク質が、植物細胞における脂肪酸又は脂質の生合成に役割を果たすことができるような場所及び時間にその遺伝子が発現されることを意味している。特に前記プロモーターは、その制御下に置かれている遺伝子を、脂肪酸又は脂質の生合成の前の段階又は生合成の間に発現させる能力を有する。

さらに、ＤＮＡ修飾のための周知の技術を用いて、他のＤＮＡ配列を調製することが可能であり、それらの、種子特異的なかつ時間的な様式で遺伝子の発現を促進する能力を調べることが可能である。

従って、より広い意味において「種子特異性の植物プロモーターとして作用することのできるプロモーター」という表現は、自然に等しいプロモーターと、種子特異性の植物プロモーターとして活性であるそれらの修飾物との両者を、種子特異性の植物プロモーターとして活性であるように他の方法でデザインされたプロモーターと同様に包含する。

従って、本発明は、種子特異性の植物プロモーターとして作用することのできるプロモーターを含み、前記プロモーターが、植物細胞における脂肪酸又は脂質の生合成と協奏して、前記プロモーターの支配下に置かれた遺伝子の発現を可能にする組換えＤＮＡ構築物に関する。

本明細書では「組換えＤＮＡ構築物」という表現を、それらの自然環境にある類似のＤＮＡ配列を除外するために用いた。それは構築物を調製するためにヒトが介入し、次いで植物に取り込まれ、安定して子孫に遺伝しうろことを示している。例えば、天然と等しいプロモーターを自然界で制御している遺伝子とは異なる構造遺伝子に結合することができる。又は、それをエンハンサ−に結合し、天然の遺伝子の転写レベルを増加させることができる。天然の構造遺伝子によりコードされているタンパク質の産生のレベルは、プロモーターにアンチセンスＤＮＡを結合するか、又は切端型構造遺伝子を結合することにより減少させることができる。これらの方法は先行技術に記載されている。もちろん、これらの方法を非相同の遺伝子に適用することもできる。

あるいは、それをアンチセンスＤＮＡに結合し、天然の構造遺伝子によりコードされているタンパク質の産生レベルを減少させることができる。

さらに明確には、前記ＤＮＡ構築物におけるプロモーターは、先に記したＡＣＰＯ５クローンの、少なくとも２９１ｂｐのポリヌクレオチドを含んでいる。このＤＮＡ配列は、図１に示したセイヨウアブラナＡＣＰＯ５遺伝子の５′上流のｌｋｂ　Ｐｓｔ−ＢｇｌＩＩ断片から決定した。図１に示したセイヨウアブラナのゲノム遺伝子５ＡｃＰＯ５の５′のより大きい１．４ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ＡＰＩプロモーターと呼び、大腸菌ＪＭ１０１／ｐＡＰＩＧＵｓ（ＮＣＩｊ［Ｂ４Ｏ３９６）に存在するプラスミドｐＡＰＩＧＵｓに取り込ませた。

本発明の他の態様は、本発明による種子特異性のプロモーターを含有するＤＮＡ構築物を、植物細胞の形質転換のために、好ましくは、種子特異性の脂肪酸の生合成を修飾するために使用することである。好ましくは、植物細胞は続いて成長して完全な植物体となり、そこでは脂肪酸の修飾された生合成が、種子に特異的に起こる。

かかる用途の実際的な態様は、植物細胞を形質転換させる方法であり、その中で本発明による、種子特異性のプロモーターを含んでいるＤＮＡ構築物を、形質転換可能な植物細胞に以下の工程で導入する。すなわち、結果として得られる形質転換植物細胞が完全な植物に成長した後、種子特異性でかつ時間的に調節する導入された植物プロモーターによって支配されている前記遺伝子の一部を形成する構造遺伝子が、植物種子での脂肪酸又は脂質の生合成と協奏して発現し、それにより前記構造遺伝子に対応するタンパク質を産生ずる工程である。このような方法を行うための好ましい方法においては、前記構造遺伝子は、脂肪酸又は対応する脂質の、種子特異性の生合成に必要なタンパク質をコードする。

このような工程は野菜の種子油生成を修飾するための方法となることができ、その方法は植物細胞を苗木（ｐｌａｎｔｌｅｔ）を経由して種子をつけた植物にまでの育成及び結果としてできた、修飾された組成をもつ植物油を含む種子の収穫を包含し、それにより前記植物細胞、又は植物又は種子の細胞は、本発明によるＤＮＡ構築物を含み、特に、もし前記ＤＮＡ構築物が脂肪酸産生又は脂質形成のための生合成経路において活性のタンパク質をコードする遺伝子を含んでいれば、この方法で導入されたタンパク質又はタンパク質群は、生合成経路を修飾することができる。

もし、あるプロモーターが本質的に種子特異性のＡＣＰプロモーター、好ましくはブラシカ・ナプスに由来するプロモーターから成っており、ＡＣＰをコードする構造遺伝子を用いるとすると、後者は野生型遺伝子とは異なる。この態様は、本発明によるＤＮＡ構築物を含む種子を生じるが、しかしもし前記ＤＮＡ構築物が、その種子と相同な種子特異性の植物プロモーターを含んでいれば、前記ＤＮＡ構築物は、前記種子のゲノム中の、前記プロモーターの天然部位以外の部位に存在するはずである。

本発明の他の態様は種子に関するもので、好ましくはアブラナ科の種子に関しており、その中でＤＮＡ構築物は、外来性のタンパク質をコードする、興味の対象となるＤＮＡ配列も含んでおり、そのことによって、その配列は種子特異性の植物プロモーターの制御下にある。しかしながら、実際的な目的のためには、外来性のタンパク質がＤＮＡ構築物に加えて存在するはずである。従って、後者の態様は主として、所望のタンパク質を植物細胞内で、好ましくは種子の細胞内で産生ずるための工程に向けられており、その種子細胞は前記タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を含み、本発明による組換えＤＮＡ構築物を含む前記植物細胞は、前記構造遺伝子及び、前記タンパク質の産生を含んでいる。いくつかの用途では、例えば動物の飼料原料やヒトによる消費には、種子をそれ自体使うために、もし種子が所望のタンパク質を含んでいれば十分である。他の用途のためには、前記タンパク質の植物細胞からの単離がそのような工程の次に続くことが望ましい。

本発明は以下の実施例により、それに制限されることなく例示される。

主として、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、による、ｌ［ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｕｂｌ、　（１９８２年）に記載されている、標準的な方法を用いた。変法を用いた場合は、それらを以下に記載する。次の制限部位が本明細書に言及されている。

ＢａｍＨＩ　Ｇ↓ＧＡＴＣＣＫｐｎＩ　ＧＧＴＡＣ↓ＣＢｇｌＩＩ　＾↓ＧＡＴＣＴ　ＰｓｔＩ　ＣＴＧＣＡ↓ＧＥｃｏＲＩ　Ｇ↓ＡＡＴＴＣ５ＡＩＩ　Ｇ↓ＴＣＧＡＣＨａｅＩＩＩ　ＧＧ↓ＣＣ５ａｕ３Ａ　↓ＧＡＴＣＢｉｎｄＩＩＩ　Ａ ↓ＡＧＣＴＴ　５ｓｔＩ　ＧＡＧＣＴ↓Ｃ実施例１　ブラシカ・ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）　Ａ　ＣＰブロモ核ＤＮＡを野外で生育した植物ブラシカ・ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）の葉から単離した。葉を０．６Ｍのショ糖、５０ｍＭの　Ｔｒｉｓ−１１１ＣＩ　ｐＨ８，０，１０ｍ１ｉのＭｇＣｌ２．１０１Ｍのβ−メルカプトエタノール中で均質化し、核をペレットにし、１．２駕のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００も含有する同じ均質緩衝液で２回洗浄し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，２ｈＭのＥＤＴＡ及び１％の５ａｒｃｏｓｙｌ中で溶解した。ＤＮＡをフェノール抽出／′Ｃ３ＣＩ遠心分離により精製し、５ａｕ３Ａで部分消化し、ショ糖密度勾配遠心分離により分別した。１５〜２０ｋｂのＤＮＡを、アガロースからの電気的溶出によりあらかじめ精製しておいた、ＢａｍｆｌＩで消化したラムダＥＭＢＬ　４アームに連結した。連結混合物をガイガパックプラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ）抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより）を用いてパッケージングし、大腸菌に８０３の中で増殖させた。得られたライブラリーを、ＡＣＰｃＤＮＡクローン２９ＣＯ８（Ｒ。

５ａｆｆｏｒｄら、１９８８年、前記）由来の３２ＰラベルしたＲＮＡプローブでスクリーニングし、ＳＰ６ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍより）にクローニングして陽性のプラークを得た。ＡＣＰＯ５と名づけたこれらの１つを精製し、ＤＮＡを単離し、ｐＴＺ１８Ｒ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ、より）にサブクローニングし、制限地図作製およびＤＮＡ配列決定により特性を明らかにした。

ｂ）　ＡＣＰＯ５の構造分析ＡＣＰＯ５Ｄ　Ｎ　Ａを１組の制限酵素で分解し、切断部位の地図を作製した（図１）。制限されたＤＮＡをサザンプロットし、前記のＡＣＰ　ＲＮＡプローブに対する相同性でＤＮＡ断片を同定した。１．１５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片、５ｋｂのＢａｍＢＩ断片及びｌｋｂ　５ａｌＩ断片がハイブリダイズすることが判明した（図１参照）。重複している制限断片を１１１３ベクターにサブクローニングし、修飾したＴ７バクテリオフアージのＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｗ＋１ｃａｌ　Ｃｏｒｐ、より）を用いてＤＮＡの配列を調べた。万能かつ合成のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、およそ２２３３ｂｐの全配列を得た（図３）。ドツトマトリックラス分析法により、ＡＣＰＯ５のＤＮＡ配列とセイヨウアブラナ胚のｃＤＮＡクローン２９ＣＯ８との間に相同性を見出だしく図２参照）、従ってクローニングしたゲノム断片がＡＣＰ遺伝子をコードしていることが確認された。ＡＣＰＯ５のゲノムクローン及びｃＤＮＡクローン２９ＣＯ８のヌクレオチド配列を一直線に並べると、図３に示したゲノム配列のヌクレオチド１０４ｇ−１３１７，１４２６−１５０１及び１６２５−１７２６に相当する３つの介在配列（イントロン）がＡＣＰ遺伝子内に同定された。エクソンと、種子が発現したｃＤＮＡ配列との間には完全な相同性（１００％）がみられ、ＡＣＰＯ５遺伝子が種子で発現されている証拠を与える。

ＡＣＰＯ５の転写開始部位を決定するため、さらには遺伝子の上流の調節配列の開始を明らかにするために、ＲＮアーゼ防御の調査を行なったＵ、　ｄｅ　５ｉｉｌｖａら、１９９０年、前記参照）。遺伝子の予想される転写開始部位にかかる、ゲノムクローンＡＣＰＯ５の、ｌｋｂのＰｓｔ−ＳａｌＩ断片を、５Ｐ６５転写ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍより）に連結し、鋳型として用いて、完全な長さの３２Ｐ−ラベルしたアンチセンスＡＣＰ　ＲＮＡを生成した。アンチセンスプローブ（およそ２００．０ＯＯｄｐｉ）を、Ｒ，５ａｆｆｏｒｄら（１９８８年前記）の方法に従って単離したブラシカ・ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）胚のポリＡ　ＲＮＡ及びＡＣＰ　ｃＤＮＡクローン２９ＣＯ８のＲＮＡ転写物に、５０％のホルムアミド、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ　ｐＨ６，４，０，４ＭのＮａＣ１ｓ　１ｍＭのＥＤＴＡ中で４５℃で一晩ハイブリダイズさせ、続いてＲＮアーゼＡ（４０ｍｇ／　ｌ　）及びＲＮアーゼＴ　Ｉ　Ｃ２ｍｇ　／Ｉ　）で３０℃で３０分処理した（ｄｐｍ＝１分間当りの分解、Ｐ　Ｉ　ＰＥ５＝ピペラジン−Ｎ、Ｎ−ビス［２−エタンスルホン酸コ又は１．４−ピペラジンジエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａから）。ＲＮアーゼ活性を、プロテアーゼＫ（１２５ｍｇ／　ｇ　）及び５ＤＳ（０，５％）で３７℃で３０分間処理して破壊した。防御されたＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱により回収し、６％アクリルアミド／尿素　配列決定用ゲルで分析した。胚のポリ＋Ａ　ＲＮＡにより防御された主要断片は、転写産物に由来するｃＤＮＡにより防御された主要断片より１２塩基長いことがわかった。

従って、この結果は、ＡＣＰＯ５の転写開始点をＡＣＰ　ｃＤＮＡ２９ＣＯ８の５′末端から１２塩基上流で、ＧＧＣＡＴＣＡ配列内の最初のアデニンであると特定し、５′の暗号をもたない配列の長さを６９ヌクレオチドと特定した（図３）。

Ｃ）＾ＣＰＯ５プロモーターの機能分析ＡＣＰＯ５の５−上流領域（プロモーター）の、植物での遺伝子発現の種子特異性でかつ時間的な調節を与える能力を評価するために、ＡＣＰＯ５の１．４ｋｂの５′上流断片とリポータ−遺伝子、β −グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）との間に転写の融合を行なった。キメラ遺伝子（ＡＰＩＧＵＳ）をタバコに移入し、ＧＵＳ活性の発現を、結果として得られた形質転換植物の葉と種子の組織でモニターした。

０．１）八ＰＩＧＵＳの構築遺伝子の転写ユニット約１ｋｂを、その遺伝子の５′上流領域の１゜５ｋｂと共に含んでいる、ゲノムクローンＡＣＰＯ５の２．５ｋｂＢａｍＨＩ−８ｓｔｌ制限断片を、ｐＴ２１８Ｒへクローニングして（実施例１．ａ参照）　ｐＴＺ５Ｂｓを作成した。この組換えプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いる消化により直鎖化し、ＢｇＩＩＩで部分消化して、長さ４．９．３．８．３．５．１．４．１．１及び０．３ｋｂの制限断片を生成した。遺伝子のプロモーター領域を含む１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を回収し、ＢａｍＢＩで直鎖化し、ホスファターゼ処理したｐＴＡＫベクターＤＮＡに連結しく図４）　、ｐＡＰＩＧＵｓを生成した（ｐＴＡＫはＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、　よりの植物の形質転換用のバイナリ−ベクターで、損傷した植物組織のアグロバクテリウム感染に続いて植物染色体に移入することのできるＤＮＡ領域を画定するＴ−ＤＮＡ境界配列の間に、ＧＵＳマーカー遺伝子を含んでおり、ＧＵＳ遺伝子に加えて、Ｔ−ＤＮＡは、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ＮＰＴＩＩ遺伝子を含み、それ故形質転換植物細胞を選択できる）。ｐＡＰＩＧＵｓを含む混合物を用いて、市販されている大腸菌ＪｌｉｌＯ１を形質転換し、組換えクローンをスクリーニングして単一のプロモーター断片が正しい方向に挿入されていることを確かめた。

ｃ、２）　ｐＡＰＩＧＵｓによるアグロバクテリウムの形質転換組換えｐＡＰＩＧＵｓプラスミドを、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３　［Ｈｏ１ｓｔｅｒｓらによる、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６３巻（１９７８年）１８１ −１８７頁コを有し、市販されている大腸菌ＥＩＢＩＯＩを用いて、大腸菌ＪＭＩＯＩからアグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＣＢ５／ｐＬＢＡ４４０４　［Ａ、　Ｈｏｅｋｅｍａらによる、Ｎａｔｕｒｅ　３０３（１９８３年）　１７９−１８１頁参照）へトリパレートメイテイング法（ｔｒｅｐａｒａｔｅ　ｍａｔｉｎｇ）で起動させた。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の受容株を一晩培養した培養物及び、大腸菌の供与株とヘルパー株の対数期培養物を得た。

各々の培養物２ｍｌを遠心分離し、細胞を１０ｍＭの１１ｇＳＯ４１ｍｌに再懸濁した。３種の細胞懸濁液を同量ずつ混合し、Ｌ−寒天板に広げ、２８℃で一晩インキユベーションした。

ァンビシン５ｈｇ／Ａ’とカナマイシン５０＋ｇ／ｌを含んでいるし一寒天上に広げた。リファンピシン耐性、カナマイシン耐性のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、大腸菌にもどして形質転換し、制限分析により特性を明らかにしてｐＡＰＩＧＵｓの完全なコピーが存在することを確かめた。

Ｃ１３）タバコの形質転換および再生本実施例は本質的には、Ｈｏｒｓｃｈらによる、５ｃｉｅｎｃｅ２２７（１９８５年）１２２９−１２３１頁に述べられている様式で行なった。ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｉ＋）の変異株ＳＲＩの直径０．５ｃｍのリーフディスクをｐＬＢＡ４４０４／ｐＡＰＩＧＵｓを含んでいるアグロバクテリウム・チュメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）＾Ｃ１１Ｉ５の一晩培養した培養物と１０分間インキュベートした。吸取紙で吸湿した後、ディスクを、−倍体のニコチアナ・プランバジニフォリア（Ｎｔｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）の懸濁培養物（Ｂａｒｆｉｅｌｄらによる、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　４（１９８５年）１０４−１０７頁）２ｍｌを２０ｍ　ｌのシュート（Ｓｈｏｏｔ　）誘導培地［０，９％寒天、ＭＳ塩類、３％ショ糖、０．０２ｍｇ／インドール酢酸（Ｉ　Ａ　Ａ）　、１ｍｇ／ｍｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）］を含んでいるペトリ皿に広げて調製したニコチアナ・プランバジニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）の支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ）プレート上においた。ＭＳ培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅ、　Ｔ、及びＳｋｏｏｇ、　Ｆ、によりＰｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　１５巻（１９６２年）４７３−４９７頁に記載されている。

３日間の培養の後、ディスクを、セフォタキシム５００ｍｇ／ｌカナマイシン１００ａ＋ｇ／Ａ’を含むシュート誘導培地に移した。選択培地上に再生した苗条を切り取り、セフ十タキシム５００ｍｇ／ｊ！を含むホルモン欠損培地（ＭＳ塩類、３％ショ糖、０．９％寒天）上においた。一旦根が定着しはじめたら、再びシュートを切り取り、カナマイシン１００ｍｇ　／ｌを含んでいるホルモン欠損培地上においた。選択培地上で根づいた植物を土壌に移し、２５℃で１６時間の光周期の下で育てた（＝＾ＰＩＧＵＳ植物）。

０．４）形質転換植物のサザン分析再生したＡＰＩＧＵＳ植物の葉からＤＮＡを単離し［Ｄｏｌｌａｐｏｒｔａ、　Ｐｌａｎｔ　ｌ［ｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｔｅｒ　１（１９８３年）１９ −２１頁コ、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで制限し、ニトロセルロースに移して３２ＰラベルしたＡＣＰ　ＲＮＡプローブにハイブリダイズさせた。３ｋｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩハイブリッド形成断片は、植物ゲノムへの完全なＡＣＰプロモーターＧＵＳカセットの組み込みを示しており、また再生した植物のＤＮＡ消化物がこの断片を示す１５の植物を選びさらに分析した。オートラジオグラフの走査レーザーデンシトメトリーは、形質転換植物内の＾ＰＩＧＵＣ遺伝子のコピー数が１から４まで異なることを示した。

ｃ、５）ＧＵＳ酵素活性についての形質転換植物の分析種々の成育段階における、葉の組織及び種子におけるＧＵＳ活性を検査した。用いた特定の成育条件下では、タバコの単一の植物体の個々の種子のさやの成育速度は異なり、最も初期のさやがしばしば最も速く発育することがわかった。そのためＤＡＦを用いて種子の成育段階を正確に測定することは不可能であった。この理由から形態学的特徴を用いて種子を段階にわけた。種子の大きさ及び着色性に基づき、種子の成育の５つの段階を定めた。

１、長さ０．４−０．５ｍｍで着色性なしく白色）２、長さ０．５−０．６ｍｍで薄茶色３、長さ０．６−０．８ａｖ＋で硬い種皮があり着色している４ｏ長さ０．６− ０．８ｍｍ＋で強度に着色している（茶色）５、乾燥している（成熟した種子と呼ぶ）ＤＡＦと種子成育の種々の段階との関係の特徴を図５に示した。

ＡＰＩＧＵＳで形質転換した１５の植物のＧＵＳ活性を、ｐｃＴＡＫで形質転換した４つの対照植物と共に分析した。

ｐｃＴＡＫは、植物の構成プロモーターであるカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ　［この構築物はＲｉｃｈａｒｄＪｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ケンブリッジ）の好意により提供された］に連結されたＧＵＳ遺伝子を含んでいる構造物である。

ＡＰＩＧＵＳ及びｐｃＴＡＫで形質転換した植物の葉と段階１．２．３の種子の抽出物のＧＵＳ活性を、メチルウンベリフェリルグルクロニド（ＭＵＧ）とのインキュベーション及び、放出されたメチルウンベリフエロン（ＭＵ）の蛍光測定により、分析した。植物の組織を氷上で、酸で洗浄した砂の存在下に、ＧＵＳ抽出緩衝液［５０ｍＭ　リン酸ナトリウムｐｆ１７．５．０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１ｏＭ　ＥＤＴＡ、　１ｈＩｌｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１１ＩＩＩフエニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）］中で粉砕することにより、植物抽出物を調製した。不溶性物質をベンチトップ型遠心分離機での５分間の遠心分離により除去した。可溶性抽出物の０．０５＋ｌを１ｍｌの検定用緩衝液　［１ｍＭＭ　Ｕ　Ｇを含んでいるＧＵＳ抽出緩衝液］と３７℃でインキュベートし、０分、５分、１５分及び３０分後に０．２５ｍ１のアリコートを、０．７５ｍ１の０．２１１　Ｎａ２Ｃｏ３に移した。ＭＵの蛍光を、励起光の波長を３６５ｎｉ　、発光波長を４５５ｎｍにセットしたＢａ１ｒｄ　Ｎｏｖａ　１分光蛍光計で測定した。

発現の絶対レベルは植物ごとにかなり異なっていたが、個々の形質転換植物では、組織特異性及び成育調節に関して一致したＧＵＳ活性のパターンが得られた（図６）。遺伝子移入集団内で得られる遺伝子発現の変動するレベルは一般的な現象であり、移されたＤＮＡのランダムな組み込みに起因する位置の影響によるものと考えられる（　Ｊｏｎｅｓらによる、ＥＭＢＯＪ、４（１９８５年）２４１１−２４１８頁）。ＧＵＳ発現のレベルと挿入された遺伝子のコピー数との間には何ら関連性はなかった。

ｐＡＰＩＧＵＳ形質転換植物では、葉組織におけるＧＵＳ活性のレベル（ｐｍｏｌ　ＭＵ　／分／ｍｇ新鮮重）は、種子組織に比べて非常に低く　（平均値７．２）、種子組織では段階１の平均６８．７から段階３の平均３０１まで、成育を通して増加することがわかった。それに対しｐｃＴＡＫで形質転換した植物では、ＧＵＳの発現は種子組織より葉組織の方が高く　（平均２３７　）　、種子組織では段階１の１８８から段階３の５６に平均値が下がった（図６）。

葉と比較した種子組織のＧＵＳ活性の相対レベルを、ＡＰＩＧＵＳ及びｃＴＡＫ形質転換植物の種子の各段階について算定した。このことは、組織特異性及び発現の成育調節について、それがＧＵＳ活性の絶対レベルにおける植物ごとの差とは無関係であるというデータを与えた。１３のＡＰＩＧｔｌＳ植物及び４つのｃＴＡＫ植物から得られた平均値をヒストグラムの形に表わした（図７）。ＡＰＩＧＵＳ形質転換植物では、ＧＵＳ活性のレベルは種子の成育の間増加して最大値に達するが、それは平均して葉組織に見られるものより１００倍高い。対照的にｃＴＡＫ植物では、種子成育の３段階すべてにおいて、ＧＵＳ活性のレベルは葉組織に見られるものと同様であり、従って種子７葉の平均値はほぼ１に等しい。

従ってこのデータは、単離されたＡＰＩプロモーターが機能して、種子特異性かつ成育が調節される様式で、遺伝子の発現を制御していることを示している。

さらにＡＰＩＧＵＳ及びｃＴＡＫ形質転換植物の段階３の種子のＧＵＳ発現の比較では、ＡＰＩＧＵＳ植物における、より高い平均活性レベルを示している。ｃＴＡＫ構築物に存在しているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物の強力な構成プロモーターであることが広く知られているので、単離されたＡＰＩプロモーター自体が、この特定の組織での遺伝子発現のための強力なプロモーターであることになる。

実施例２　ＡＣＰプロモーター断片の削除分析組織特異性及び、遺伝子発現の成育上の制御を与えることのできる配列の位置をより厳密に決定するため、実施例１に述べた１、　４ｋｂのＡＣＰプロモーター断片の欠失分析を行なった。

β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポータ−遺伝子に融合されたアシルキャリア −タンパク質遺伝子ＡＣＰＯ５の５′上流領域の、各々１．４ｋｂ（ｐＡＰＩＧｌｌｓ）、０．９３ｋｂ（＋）ＡＰ３ＧＵＳ）及び０．２９ｋｂ（ｐＡＰ２ＧＵＳ）を含むキメラ遺伝子構築物をタバコに移入し、結果として得られた形質転換植物のＧＵＳ活性の発現を分析した。

ａ）ＡＰＩＧＵＳの構築実施例１参照。

ｂ）　Ｉ）ＡＰ２ＧＵＳの構築（図８参照）ｐＴ２５ＢＳＤＮＡ　（実施例１、ｃ−１項参照）をＢｇｌＩＩで完全に消化し、３．５．１．１及び０．３ｋｂの長さの制限断片を生成した。０．３ｋｂ断片をＢａｍＨＩで直鎖化したｐＴＡＫに連結し、その混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。

組換クローンをＰｓｔＩ−３ｓｔＩ　＋　ＨｉｎｄＩＩＩとで消化してスクリーニングし、単一のプロモーター断片が正しい方向に挿入されていることを確認した。結果として得られたプラスミドＡＰ２ＧＵＳはＧＵＳ遺伝子に連結した０、　２９ｋｂのＡＣＰプロモーターを含んでいた。

ｃ　）　ｐＡＰ３ＧＵＳの構築（図９参照）ｐＴＺ２５ＢＳ　Ｄ　Ｎ　Ａ　８ＰｓｔＩで完全に消化し、自己連結させ、その混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換させた。組換クローンを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化して再び環状化した大きなＰｓｔＩ断片をスクリーニングし、ｐＴＺ５ＰＳと称するプラスミドを得た。後者のプラスミドのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｌｋｂのプロモーター断片を回収し、ＢｉｎｄＩＩＩで消化したＡＰ２ＧＵＳＤ　Ｎ　Ａに連結し、大腸菌［ｉＲＩを形質転換させた。０．２９ｋｂのＡＰ２プロモーター断片の代わりにｌｋｂのプロモーター断片が存在することを調べるため、組換クローンをＰｓｔＩ＋ＢｇｌＩＩで分解してスクリーニングした。結果として得られたプラスミド（ｐＡＰ３ＧＵＳ）は、ＡＣＰ構造遺伝子の転写開始部位のすぐ上流のＡＣＰプロモーターの最初の９２４ｂｐに連結してその制御下にあるＧＵＳ遺伝子を含んでいた。

ｄ）アグロバクテリウムの形質転換ベクターｐＡＰＩＧＵｓ　５ｐＡＰ２ＧＵｓ　５ｐＡＰ３ＧＵｓを、対照ベクターｐｃＴＡＫ及びｐＴＡＫ　（プロモーターのないＧＵＳ遺伝子構築物）とともに、アグロバクテリウム・チュメファシエンスＡＣＨ５／ｐＬＢＡ４４０４へ直接ＤＮＡを取り込ませるプロトコール［Ａｎらによる、Ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ、　ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１ｌａｎｕａ１．　（Ｇａｌｖｉｎ、　５ｃｂｉｌｐｅｒｏｏｒｔ共ｔｊｌ）、Ａ３（１９８８年）１−１９頁コを用いて移入した。形質転換したコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、分析して各々の遺伝子の完全なコピーの存在を確認した。

ｅ）タバコの形質転換実施例１に記載したように行った。

ｆ）形質転換植物のサザン分析再生した植物が完全なキメラ遺伝子の挿入されたコピーを含んでいることを、実施例１に記載したサザン分析により確認した。

ｇ）遺伝子移入植物のＧＵＳ活性の分析遺伝子移入植物の葉及び段階３と５の種子の抽出物について、ＧＵＳ活性を分析した（構築物グループ当り１０植物）。

この実験ではＧＵＳ活性をＤＮＡの関数として表わしたが、それは新鮮型又はタンパク質濃度より、より一定の細胞パラメーターを表わしており、両者はともに胚成育の細胞伸長期の間に劇的に増加する。葉の抽出物の最初のＤＮＡ評価の間に、ＧＵＳ抽出用緩衝液（実施例１参照）中に存在するＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００がＨｏｅｃｈｓｔ法を用いたＤＮＡ濃度の測定を妨げることがわかった。

ＳＤＳは支障なく　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に代わることができ、次の抽出に使用した。

実施例１に記載したように、個々の植物におけるＧＵＳ発現の絶対レベル（ｐＭｏｌ　ｌｉＵ　／分／μｇＤＮＡ）はかなり異なることがわかった。しかしながら、各々の構築物群の個々の植物では、ＧＵＳ発現の一致した組織パターンが得られた。２つの欠失したＡＣＰプロモーター構築物（ＡＰ２ＧＵＳ及びＡＰ３ＧＵＳ）で形質転換した植物におけるＧＵＳ発現の様式は、１．４ｋｂプロモーター（ＡＰＩＧＵＳ）で形質転換した植物で得られるものと差がなかった。従って、３つのＡＣＰプロモーター構築物の各々で形質転換した植物は、葉よりも種子において高い発現レベルを有し、段階３の種子では活性の最大値を有していた。

対照的に、ｐｃＴＡＫで形質転換した植物は、種子及び葉組織で同様の発現レベルを示した。図１０は、個々の構築物群の１０植物のＧＵＳ活性を平均して得た値を示している。ＡＣＰプロモーター構築物で形質転換した３つの群において、ＧＵＳ活性は段階３の種子で最も高く、段階３の種子〉成熟した種子〉葉であり（葉で得られる活性レベルは、プロモーターのないｐＴＡＫ構築物で形質転換した植物で得られるバックグラウンドレベル以上ではなく）、従ってＡＣＰプロモーターを欠失した変形体は両者とも、組織特異性のそして成育調節に携わる要素をまだ含んでいることを示している。ＧＵＳ活性のレベルに関しては、０．２９ｋｂＡ　ＣＰプロモーター構築物（ＡＰ２ＧＵＳ）は実際に１．４ｋｂプロモーターよりもやや高い平均活性レベルを示したが、１．４ｋｂプロモーターの値は、９２４ｂｐＡＰ３プロモーターの値よりも高かった。

結論として、組織特異性で成育の調節の両方及び、＾ＣＰＯ５遺伝子の発現レベルを与える要素が、遺伝子の転写開始部位の０．２９ｋｂ以内に存在することが示された。

実施例３　セイヨウアブラナのＡＣＰプロモーター、ナピンプロモーター及びクルジフェリンプロモーターの比較セイヨウアブラナでは、種子成育の間の種々の貯蔵産物の合成は別々に調節されている。例えば、貯蔵脂質は最初に合成され、続いて二つの貯蔵タンパク質、ナピン及びクルジフェリンが合成される。この調節はおそらく、種子の成育の間に種々の貯蔵産物の合成に係わる遺伝子を特異的に活性化する、種子特異性プロモータ一群に仲介されているのであろう。

本実施例に記載した研究の目的は、脂質生合成遺伝子（ＡＣＰ）及び２つの貯蔵タンパク質遺伝子（ナピン及びクルジフェリンから得たセイヨウアブラナの個々のプロモーター要素が、実際に種子成育の間に遺伝子の特異的な発現を与えることができるか否かを決定することであった。キメラ遺伝子＾ＣＰ−ＧＵＳ　、ナピンーＧＵＳ、クルジフェリン−ＧＵＳをタバコに移入し、種子成育の間の種々の段階における発現をモニターすることによりこのことを研ｐＡＰＩＧＵｓの構築物、すなわちＡＣＰＯ５の１．４ｋｂ　５−上流の領域１．４ｋｂとＧＵＳ遺伝子との間の転写の融合は実施例１に記載した。ＧＵＳ遺伝子に融合したセイヨウアブラナの貯蔵タンパク質のプロモーターを含み、植物形質転換ベクターｐＴＡＫにクローニングした構築物は、ダラム大学のＡ、　Ｒｙａｎ博士より入手した。後者は各々Ｌ　ｌｋｂのナピンの５′上上流片とＧＵＳ遺伝子との間の（Ｊ）ＮＡＰＧＵＳ）　、及び２．　Ｏｋｂのクルジフェリンの５゛上上流片とＧＵＳ遺伝子との間の（ｐｃＲＵＧＵｓ）　、転写の融合物である（図１１）。

ベクターを、実施例２に記載したようにアグロバクテリウム・チュメファシエンスＡＣＨ５／ｐＬＢＡ４４０４に移入し、これらを対照であるｐＴＡＫ及びｐｃＴＡＫと共に用いて、実施例１に記載したようにタバコを形質転換した。各々の構築物について１０植物を再生した。

サザン分析実施例１に記載したサザン分析により、再生した植物が完全なキメラ遺伝子の挿入されたコピーを含んでいることを確認した。

遺伝子移入植物の葉及び段階３ならびに５の種子におけるＧＵＳ活性を、実施例２に記載したように分析した。

調べた組織においては、各々の構築物群の個々の植物について、ＧＵＳ活性の絶対値は異なっていたが、一致したパターンが得られた。（実施例１及び２に記載した通り）。

ナピン又はクルジフェリン構築物で形質転換した植物では、葉のＧＵＳ活性が低く（図１２）、最大の活性は段階５の種子に見られた。ナピン形質転換体では、段階３の種子のＧＵＳ活性は平均で最大値の７５％であるのに対し、クルジフェリン形質転換体では段階３の種子には最大活性の３０％しか見られなかった。

ＡＰＬＧｔｌＳ形質転換植物では最大ＧＵＳ活性は段階３の種子に見られ、これは段階５の種子より平均２．５倍高かった。

これらの結果は、種子成育を通じて、２つの貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターに比較してＡＣＰプロモーターのより早い活性化を示している。この特異的な活性化の性質をより正確に決定するために、種子の段階を詳しく分けたＧＵＳ活性の分析を用いて第二の実験（下記参照）を行なった。

各々の構築物群から得られるＧＵＳ活性の平均値の比較は、プロモーターの相対的な強さの量的評価を可能にする。へＰＩＧＵＳ形質転換植物では、ＧＵＳ活性の最大値は、段階３の種子にあり、それはｐＣＲＵＧＵＳ形質転換植物の段階５に得られるものと同様であった（　ｐｃＴＡｊ［形質転換植物の葉組織で得られる最大値とも同様である）。この値は、ｐＮＡＰＧＵＳ形質転換植物の段階５の種子に見られる最大のものより約３倍高い。

実験２最も盛んにＧＵＳを発現している、ＡＰＩＧＵＳおよびＣＲＵＧＵＳ遺伝子移入植物の種子を、カナマイシン上で発芽させ、生じたＦ１植物を用いて、種子成育の間のＧＵＳ発現の詳しい分析を行なった。

初期の研究（実施例１参照）では、植物を５インチの鉢で育成し、すべての花を受粉させたが、さやの成育速度には変動が見られたため、種子成育の段階づけには形態学的な性質を用いた。ＡＣＰ及び貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターによって与えられる、観察された遺伝子の特異的活性化の性質をより厳密に決定できるようにするため、花に標識をつけるという別の方法を用い、それによりＤＡＦを種子成育の意味あるマーカーとして使用することが可能になった。このように、開花が始まる時期にタバコ植物を直径７．５インチの直径の、堆肥を入れた鉢に移した。毎日、設定した時間に、朽の開いた新しい花を数え、一つの花に標識をつけ、残りの花を除去した。標識づけを１４日間（０日〜１３日）行ない、２０日間に７−２０Ｄ　Ａ　Ｆを表わす１４鉢を収穫した。種子を回収し、タンパク質含有量および脂質含有量を分析した。種子を０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　ＩＭ　ＮａＣ１、５０ｍＭ　リン酸ナトリウムｐｔ１７．５．１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　１０ｍＭ　ジチオトレイトールテ均質化し、遠心分離し、タンパク質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄより）を用いて上清を検定することにより、タンパク質の見積りを行なった。全脂質含有量は、種子をクロロホルム／メタノール（２：　１）で抽出し、抽出された脂質をメタノール・トルエン・濃硫酸（２０：　１０　：　１）で還流することにより生成される、脂肪酸メチルエステルのＧＬＣ分析により測定した。種子成育の間の脂質およびタンパク質の合成について得られたデータを図１３に示す。脂肪酸含有量は、９日と１３日の間に急激に増加するように見え、一方タンパク質合成の主要相は１７日から２０日の間に起こっている。２つの貯蔵産物に見られるＳ字状曲線での蓄積は、花の標識法が、これらの確立された成育条件下では、意味のある成育マーカーとして使用できることを示している。「標識をつけた」種子を抽出し、ＧＵＳ活性を、実施例１に記載したように分析した。図１４は、ＡＰＩＧｔｌＳ形質転換植物において、ＧＵＳ活性（２植物の平均）が９ＤＡＦで始まり、ｌ０ＤＡＦで最大値の５０％に達し、脂質合成の最も活発な相に相当する１１−１２　Ｄ　Ａ　Ｆにピークを成したことを示している。１４Ｄ　Ａ　Ｆまでに、活性は最大値の２０％に落ち、２０ＤＡＦ（段階５）までこのレベルのまま残る。

ＣＲＵＧＵＳ形質転換植物においては、ＧＵＳ活性は１０Ｄ　Ａ　Ｆで最大値の１．３％であり、最も活発な脂質合成相であるＩＩＤＡＦでは７％にすぎない。

１５ＤＡＦまでに最大活性の５０％に達し、タンパク質合成の最も活発な相に相当する１６Ｄ　Ａ　Ｆと１９ＤＡＦの間に活性のピークがあった。

タバコの種子成育の間の脂肪酸におけるＧＵＳ活性とタンパク質の蓄積の重ね合わせは（図１５）、ＡＣＰプロモーターによって推進されるＧＵＳの発現が、脂質生合成の最も活発な相と一致しており、一方りルシフェリンプロモーターによって推進されるＧＵＳの発現は、数日後に貯蔵タンパク質合成の主要相と協奏して、ピークに達することを示している。

これらの調査結果は、遺伝子工学により貯蔵用脂質組成物の修飾を目的とするいかなるプログラムに対しても極めて重要である。脂質生合成の進行を混乱させるためには、移された遺伝子が種子の脂質生合成のプロモーターの調節下になければならない。移された遺伝子を、貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターに連結すると、種子における貯蔵脂質の大半が合成された後に、その遺伝子が発現することになる。

実施例４　セイヨウアブラナにおける、八Ｐ１に制御されたＭＣＨの産生本実施例はＡＰＩプロモーターの、同一植物すなわち、セイヨウアブラナ脂肪種子における機能性を証明する。

ＡＰＩプロモーターは、セイヨウアブラナの種子成育の間に、外来遺伝子の発現を時間的に調節することが示されている。使用された外来遺伝子は、ラット由来のＳ−アシル脂肪酸シンテターゼチオエステルヒドロラーゼの中間鏡（ＭＣＨ）をコードする。ＭＣＨは、ラット乳腺において、授乳期に誘導される酵素であり、脂肪酸合成の未成熟な鎖の終結を引き起こし、乳産生のための脂肪酸の中間鏡の合成という結果に終わる［　Ｌｉｂｅｒｔｉｎｉ及びＳｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５３．　（１９７８年）１３９３−１４０１頁］。

ラットＭＣＨをコードするｃＤＮＡは単離され配列が決定されている［　ＲｏＳａｆｆｏｒｄらによる、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６（１９８７年）１３５８−１３６４頁］。ＭＣＩ遺伝子産物を、子葉細胞内の脂肪酸合成の正しい細胞内部位、すなわちプラスミドオルガネラヘターゲティングするためには、ＭＣＨｃＤＮＡにプラスミドを標的とする配列に連結する必要があった。この配列はセイヨウアブラナ＾ＣＰｃＤＮ＾から単離された　（Ｒ，５ａｆｆｏｒｄら、１９８８年、前記）。生じた＾ＣＰＭＣ［Ｉキメラ遺伝子を、セイヨウアブラナのＡＰＩプロモーターに融合し、ｐＡＰＩＡ２１１と呼ぶ最終的な構築物をアグロバクテリウム感染により、セイヨウアブラナへ移入した。

ａ）八ＰＩＡ：Ｉｌｌの構築歴史的には、ｐＡＰＩＡ２１１１は非常に遠回りの経路を介して構築され、数多くの探査上の構築物の最終産物である。

その構築物のすべての構成部分は、本明細書の中ですでに記載され、あるいは文献の中に発表されているので、本発明者らは、単純化のため、最終的な構築物とそのＤＮＡ配列の記載のみを提供する（図１６および図１６の説明参照）。

その構築物は、以下の要素からなる。

ｉ）Ａ　ＣＰプロモーター配列決定された９７５ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片（図３のポリヌクレオチド７−９８１　）に、さらに０．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ５−断片（配列決定されていない）を含む、クローンＡＣＰＯ５に由来する１、　４ｋｂのＢａｍｆｌＩ−ＢｇｌＩＩ配列（実施例１　：　ｐＡＰＩＧｔｌｓの構築参照）。

１ｉ）ＡＣＰ運搬配列ＡＣＰゲノムクロー　ン０５ＥＯ１の１８３ｂｐの５ａｕ３Ａ−ＨａｅＩＩＩ断片（Ｒ，５ａｆｆｏｒｄら、１９８８年、前記）。

ＭＣＨ構造遺伝子と融合させるため、断片の３′末端にＢｇｌＩＩ　リンカ−が結合している。

ｉｉｉ）ＭＣＨ構造遺伝子ｋ［ｃｔｌｃＤＮＡクローン４３Ｅ１０９の３２０−１１７９のヌクレオチドを表わす断片（ＡＴＧ開始コドンのすぐ下流のＧＡＧコドンから、翻訳停止コドンの７１ヌクレオチド下流まで）であり、植物ベクターへのクローニンクラ容易にするために、最後の２つのヌクレオチドＡＧをＢｇｌｌＩ　リンカ−へ伸ばした。

ＡＣＰ分子の天然の開裂部位（Ｃ↓＾）を保存するため、ＡＣＰ運搬配列とＭＣＨ構造遺伝子との間の接合を、部位特定の突然変異生成により修飾した。これは、ＢｇｌＩＩ　リンカ−とＭＣＨのＡＴＧ開始コドンに相当する、９塩基配列の欠失を含む。従って最終的な構築物ｐＡＰＩＡ２Ｍは、ＡＣＰ運搬配列に加えて、成熟ＡＣＰタンパク質の最初の２つのアミノ酸（Ａｌａ−Ａｌａ）と、それに続く開始ＡＴＧを欠いたＭＣＨタンパク質から成る融合タンパク質をコードした。

ＤＮＡを直接取り込ませる方法（Ａｎら、１９８８年、前記）を用いて、ｐＡＰ１＾２藍をＡ、チュメファシエンスｐＧＶ３８５０［Ｚａｍｂｒｙｓｋｉらによる、ＥＭＢＯ２（１９８３年）　２１４３−２１５０頁］に移すことによりバイナリ−ベクターを構築した。得られたアグロバクテリウムのコロニーから、ＤＮＡを抽出し、大腸菌を形質転換し、そこから再び単離することにより、遺伝子の正しい挿入を確かめることｎａ　ｕｓ　ｃｖ、　１ｌｅｓｔｅｒ）の形質転換茎（ｓｔｅｍ）の部分を切り取り、バイナリ−ベクターｐＧＶ３８５０：ｐＡＰＩＡ２Ｍ　ヲ含むＡ、チュメファシェンスで形質転換した。用いた方法はＦｒｙ　らによる、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ　６巻（１９８７年’）　３２１−３２５頁の方法で、次のような修正をした。

ｉ、カナマイシンによる選択は２０μｇ／ｍｌととし、感染後２週間まで延期し、１工、カルベニシリンをセフすタキシム５００μｇ／ｍ　ｌに代え、１１１、再生培地からアルギニンを除去し、ｉｖ、　０．８％寒天を１％アガロースに代え、■、感染の前に茎の部分を標準苗条用培地（ｓｔａｎｄａｒｄｓｈｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｄｉａ）で２−３日、前処理し、ｖｌ、支持細胞層としてＮ、プランバギニフォリア細胞系（Ｂａｒｆｉｅｌｄら、１９８５年、前記）を用いた。

２回の移し変えの後、選択培地上に残っている緑色の苗条について、ツバリンの存在を調べた［　０ｔｔｅｎ及び５ｃｈｉ　１ｐｅｒｏｏｒｔによる、Ｂ、　Ｂ、＾、　５２７（１９７８年）４９７−５００頁コ。陽性の苗条を土壌に移し５インチの鉢に入れ、１６時時間切（２２℃）、８時間暗期（１８℃）周期で運転している育成室に移した。

ｄ）形質転換植物の組織の分析葉組織からＤＮＡを抽出し、制限し、消化し、ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ　ＭＣｆｌ断片を用いて、サザンプロット分析をし、挿入されたＭＣＨ遺伝子の存在を確認した。

サザン陽性植物から、特定した成育上の５段階での種子を回収し、ＭＣＨタンパク質の発現を、ウェスターン法を用いて分析した。ＤＡＦに対する５つの段階の関係は次の通りである。

段階１　＜１５ＤＡＦ　段階４　２５−３０ＤＡＦ段階２　１５−２０ＤＡＦ　段階５　３Ｏ−３５ＤＡＦ段階３　２Ｏ−２５ＤＡＦ種子をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　［（１９７０年）　８０−６８５頁コ（１：１ｖ／ｖ）で、砂を研磨剤として用いて均質化した。抽出液を５分間沸騰させ、マイクロ遠心機を用いて遠心しくｍｉｃｒｏｆｕｇｅｄ）　、上溝を取り分析した。新鮮型１０ｍｇに相当する抽出物を、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ニトロセルロース上にプロットし、ブＯットをＲ，５ａｆｆｏｒｄらによる（１９８７年）前記の方法でラット抗ＭＣＨ抗体と反応させた。

得られたオートラジオグラフ（図１７）において、種子抽出物は、精製したＭＣＨタンパク質と移動度が等しく単一の交差反応をするバンドを示した。このことは、ＡＣＰ−ＭＣＨキメラタンパク質のＡＣＰ運搬配列が、おそら（ＭＣＩのプラスチド内への取り込みに際してプロセッシングされたことを示している。オートラジオグラフはＭＣＨ発現がセイヨウアブラナの種子成育の間に、時間的様式において調節されていることを示している。

ＭＣＨ発現は、段階１及び２では、わずかに検出されるが、段階３では劇的な増加が見られ、それは脂肪種子セイヨウアブラナにおける、貯蔵脂質の堆積開始直前にあたる（図１８参照）。従ってこの結果は、脂肪種子セイヨウアブラナにおいて、ＡＰＩプロモーターが種子成育の貯蔵脂質合成相と一致して機能し、特異的に遺伝子を発現させていることを示している。

大腸菌ＪＭＩＯＩ／ｐＡＰＩＧＵｓはブダペスト条約の下、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド−７リンａバクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｖａｃｔｅｒｉａ　）　［アノくディージ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）に１９９１年３月２日に寄託され、受託番号ＮＣＩ　ＭＢ　４０３９６を得た。

ＲＰＣ規則２８（４）に従って、第三者の試料の入手は指名された専門家への試料の配給によってのみ達成される。

図面の説明図１ＡＣＰＯ５Ｄ　Ｎ　Ａを、制限酵素ＢａｍＨＩ　ｓ　ＰｓｔＩ、　ＢｇｌＩＩ　５ＨｉｎｄＩＩＩ　、５ａｌＩ及び５ｓｔＩで消化することにより得られたＡＣＰＯ５ゲノムクローンの制限地図と制限部位のマツピング。

図２ＤＮＡ　５ｔａｒ　Ｄｏｔｐｌｏｔソフトウェアを用いた、ＡＣＰＯ５（Ｘ軸）とＡＣＰ　ｃＤＮＡ　２９ＣＯ８（ｙ紬）との間の相同関係のドツトマトリックス分析。１０ヌクレオチド配列のかたまりを比較し、１００％の相同性を共有している領域を点で特定した。

図３　（１／３−３／３）本図はＡＣＰＯ５ゲノムクローンの決定されたヌクレオチド配列（２２３３ｂｐ）を示しており、対応するＤＮＡ配列の上に、導き出されるアミノ酸を配し、図１に示した制限酵素部位を太字でＤＮＡ配列の下に示したものである。

ヌクレオチド１−６（ＳａｌＩ部位）は、実施例１．ｂに記載した１１１３クローニングベクターの残部であり、それに対しポリヌクレオチド７−２２３３はＡＣＰＯ５クローンに由来する。

ヌクレオチド７−１２は、ＰｓｔＩ制限部位ＣＴＧＣＡＧである。ＡＰ２プロモーター（０゜２９ｋｂ）は、ポリヌクレオチド６４０−９３０であり、従ってＢｇｌＩＩ制限部位ＡＧＡＴＣＴから始まり、転写開始部位の直前の、ＧＧＧＣＡＴＣＡＣＧの最初のＡに終わる。

イントロンは、ポリヌクレオチド１０４８−１３１７．１４２６−１５０１および１６２５−１７２６である。

ポリヌクレオチド１０００−１０４７と１３１８−１４２２は−５１から−１までの運搬用ペプチド（ＭｅｔＳｅｒＴｈｒ・・・ｖａｌＳＣｒＣｙｓ）をコードする。ヌクレオチド１４２３−１４２５．１５０２−１６２４及び１’７２７− ４８４９は成熟したＡＣＰＩから８３（Ａｌａ　ＡｌａＬｙｓ・・・Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ）をコードする。ヌクレオチド１８５０４８５２は停止コドンＴＧＡを成す。

図４植物の形質転換ベクターｐＡＰＩＧｔｌｓの構築。

図５タバコの種子の成育。花成後の日数（ＤＡＦ）＝開花後の日数（ｄｐａ）とタバコ種子の形態学的段階との関係。

図６ＡＰＩＧｔｌＳの遺伝子移入のタバコの個々の植物におけるＧＵＳ　（β−グルクロニダーゼ）活性。ＧＵＳ活性（ｐｍｏｌ　ＭＵ／分／ｍｇ新鮮重）を、ｐＡＰＩＧＵｓ又はｐｃＴＡＫ　（対照）ベクターで形質転換した植物の、段階１．２及び３の種子及び葉について測定した。

図７ＡＰＩＧＩＪＳ遺伝子移入のタバコ植物におけるＧＵＳ活性。

１３のＡＰＩＧＵＳ形質転換植物と４つのｃＴＡＫ　（対照）遺伝子移入の植物から得た個々の植物について、種子７葉の値を決定し、得られた数値を平均し、段階１．２及び３についてのＧＵＳ活性の相対値（種子７葉）を計算した。

図８植物形質転換ベクターｐＡＰ２ＧＵＳの構築。

図９植物形質転換ベクターｐＡＰ３ＧＵＳの構築。

図１０遺伝子移入タバコ植物ＡＰＩＧＵＳＳＡＰ２ＧＵＳ及びＡＰ３ＧＵＳにおけるＧＵＳ活性。＾ＰＩＧＵＳＳＡＰ２ＧＵＳ、　ＡＰ３ＧＵＳ植物及び対照であるＴＡＮならびにｃＴＡＫ植物からの葉、段階３の種子及び成熟した種子のＧＵＳ活性（ｐｍｏｌ　ＭＵ　／分／μｇＤＮＡ）の平均値（１０植物より）。

図１１ナピン及びクルジフェリンのプロモーター配列とＧＵＳ構造遺伝子との、各々プラスミドｐＮＡＰＧＵＳ及びｐｃｉ？ＵＧＵｓを生ずる転写の融合。両側の三角形は、左右のＴ−ＤＮＡ境界配列を示す。

図１２遺伝子移入タバコ植物、＾ＰＩＧＵＳＳＮＡＰＧＵＳＳＣＲＵＧＵＳ。

ｃＴＡＫ及びＴＡＮにおけるＧＵＳ活性。葉、段階３の種子及び成熟した種子のＧＵＳ活性（ｐａｐａｌ　ＭＵ　／分／μｇＤＮＡ）の平均値（１０植物から）。

図１３タバコ種子の成育の間の脂質及びタンパク質の蓄積。

数値を（新鮮型％としての）を、最大測定値の百分率としてプクットしである。

図１４ＡＰＩＧＵＳ及びＣＲＵＧＵＳ遺伝子移入タバコ植物の種子成育の間のＧＵＳ活性（ｐｍｏｌ　ＭＵ　／分／ｍｇ新鮮重）。

図１５種子成育の間の脂質及びタンパク質の蓄積（すなわち図１３と図１４を合わせたもの）と重ね合わせた、ＡＰＩＧＵＳ及びＣＲＵＧＵＳ遺伝子移入タバコ植物の種子成育を通してのＧＵＳ活性の測定。

図１６　（１／４−４／４）本図は、１．４ｋｂ　ＡＰＩプロモーターを含むキメラ構築物のヌクレオチド配列で、配列が決定されている部分だけを示したものである。すなわち、約９７０ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片、ＡＣＰ運搬配列、はぼ完全なＭＣＨ遺伝子及びＭＣＨ遺伝子の３′の遺伝暗号のない配列部分である。ヌクレオチド配列には、導き出されるアミノ酸配列を、対応するＤＮＡ配列の上に与え、関連のある制限酵素部位をＤＮＡ配列の下に太字で示した。従って、ポリヌクレオチド１−９８７は図３のＡＣＰＯ５遺伝子のＤＮＡ配列の７−９９３のポリヌクレオチドと同一である。

ポリヌクレオチド９８８−１１４９は、種々のキメラ構築物に由来し、運搬配列であるＡＣＰ　ｃＤＮＡクローン０５ＥＯ１に加えてＡＣＰ構造遺伝子の最初のコドン（ＡｌａをコードするＧＣＧ　）を含む。このＡＣＰ開始部分を、ＭＣＨ構造遺伝子に結合し、ＡＴＧ開始コドンをＡｌａをコードするＧＣＡに置換した。従ってポリヌクレオチド１１５３−１９３８は図１６のポリペプチド３−２６４をコードし、ＭＣＨタンパク質のポリペプチド２−２６３と同一である。コドン１９３９−１９４１はＭＣＨ構造遺伝子の停止コドンである。ポリヌクレオチド１９４２−２０１０は、ＭＣＩ遺伝子の３−の遺伝暗号のない領域である。ヌクレオチド２０１１−２０１５は、ＤＮＡ配列のクローニングを容易にするために加えられたＢｇｌＩＩ部位に由来する。

図１７本オートラジオグラフは、ＭＣＨ発現を、ｐＡＰＩＡ２Ｍプラスミドで形質転換したセイヨウアブラナの段階１−５の種子の抽出物のウェスターン法により示している。

ＭＣＨ発現は段階１及び２ではわずかであるが、段階３、すなわち、セイヨウアブラナにおいて脂質の貯蔵が開始される直前には劇的に増加する（図１８参照）。オートラジオグラフの左側部は、分子量マーカー、精製ＭＣＨ，対照としてｐＴＡＫで形質転換した植物の抽出物及びｐＡＰＩＡ２Ｍプラスミドで形質転換したタバコの種子を示している。

図１８セイヨウアブラナの種子成育の間の、脂質の蓄積。脂肪種子セイヨウアブラナにおいては、貯蔵脂質蓄積の開始は１４ＤＡＦごろ始まり、段階３に相当する１９Ｄ　Ａ　Ｆと２７ＤＡＦの８間に相当な値に達し、２９ＤＡＦ以降に劇的に増加する。

明細書中に記載した文献欧州特許出願公開第０２５５３７７号［（ＣＡＬＧＥＮＥ、　ＩＮＣ，）、優先権主張日１９８６年７月３１日、１９８８年２月３日公開欧州特許出願公開第０２５５３７８号［（ＣＡＬＧＥＮＥ、　ＩＮＣ，）、優先権主張日１９８６年７月３１日、１９８８年２月３日公開Ａｎらによる、Ｐｌａｎｔ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１ｌａｎｕａｌ（Ｇａ１ｖｉｎ及び５ｃｈｉ　１ｐｅｒｏｏｒｔ編）におけるＢｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓ、　Ａ　３　（１９８８年）１−１９頁Ｂａｒｆｉｅｌｄらによる、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、　４巻（１９８５年）１０４−１０７頁Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａによる、Ｐｌａｎｔ　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　、　１巻（１９８３年）　１９−２１頁Ｒ，Ｊ、Ｅｌｌｉｓ及びＣ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　；　Ｉｎ　；　Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＢｏｔａｎｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４巻（１９８７／８年）、１−２４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、により出版（Ｉ　Ｓ　ＢＮ　０−１２−Ｆｒｙ　らによる、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、５巻（１９８７年）、３２１−３２５頁Ａ、　Ｈｏｅｋｅｍａらによる、Ｎａｔｕｒｅ１３０３巻＜　１９８３年）　、１７９−１８１頁［１ｏ１ｓｔｅｒｓらによる、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１６３巻Ｃ１９７８年）　、１８１−１８７頁Ｈｏｒｓｃｈらによる、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２７巻（１９８５年）　、１２２９−１２３１頁Ｊｏｎｅｓ　らによる、ＥＭＢＯＪ、、４巻＜　１９８５年）、２４１１−２４１８頁Ｖ、Ｃ，Ｋｎａｕｆによる、Ｔ　Ｉ　ＢＴＥＣＨ，５巻（１９８７年２月）　、４０−４７頁、Ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔＯｏｉｌｓｅｅｄ　Ｃｒ０ｐＳＬａｅｅ＋＋ａｌｉによる、Ｎａｔｕｒｅ１２２７巻＜　１９７０年）　、６８０−６８５頁Ｌｉｂｅｒｔｉｎｉ及びＳｍ１ｔｈによる、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｇ＋、、２５３巻（１９７８年）　、１３９３１４０１Ｔ、　ｌ１ａｎｉａｔｉｓ　、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋによる、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｕｂｌ、（１９８２年）Ｔ、　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＦ、Ｓｋｏｏｇ、　Ｐｈｙｓｉｃａｌ、　Ｐｌａｎｔ　ｓ　１５巻（１９６２年）　、４７３〜４９７頁０ｔｔｅｎ及び５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔによる、Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　５２７巻（１９８７年）　、４９７−５００頁１［、Ａ、　Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒらによる、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ。

１巻（１９８９年）　、８８９−８９９頁Ｒ，５ａｆｆｏｒｄらによる、Ｂｉｏｃｈｅｉ＋、、２６巻（１９８７年）、１３５ｇ−１３６４頁Ｒ，５ａｆｆｏｒｄらによる、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、、１７４巻（１９８８年）　、２８７−２９５頁、Ｐｌａｓｔｉｄ−１ｏｃａｌｉｓｅｄ　５ｅｅｄａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｉｓ　ｅｎｃｏｄｅｄｂｙ　ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ、ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙＪ、　ｄｅ　５ｉｌｖａ　らによる、Ｐｌａｎｔ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　。

１４巻（１９９０年）　、５３７−５４８頁、Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　５ｅｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｃｙｌｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓＡ、Ｒ，５ｌａｂａｓらによる、７ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　１ｉｐｉｄｓ　、カリフォルニア大学（カリフォルニア州、デービス）（１９８６年）Ｐ、に、　Ｓｔｕｍｐｆ　らによる、Ｆａｔｔｙ　Ａｃ１ｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄｉｔｓ　ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎにおけるＦａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓＳＥｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ　（アムステルダム）、Ｎｕｍａ　Ｓ、編Ｃ１９８４年）　、１５５−１７９頁Ｇ、　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｋらによる、Ｎａｔｕｒｅ、　３１３巻（１９８５年）、３５８−３６３頁Ｊ、Ｄ、　１ｌａｔｓｏｎ　ＳＪ、　Ｔｏｏｚｅ及びり、Ｔ、　Ｋｕｒｔｓによる、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　、　Ａ　５ｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅにおける１３章（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　Ｕｓｉｎｇ　ＣｒｏｗｎＧａｌｌ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ）　、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ（１９８３年）発行、ｆ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（米国１ニユーヨーク）販売Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　らによる、ＥＭＢｏ、２巻（１９８３年）、２１４３−２１５０頁ＧＥＮ５．配列（９００−２２３３”）ＧＧＴＴＣＡ？ＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡ　ＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧ　ＧＣＡＣＧＴＧＡＴＡ　％ＴＴＴＡＣＣＴ”　８０６ＣＡＣＡＣ（、入ＡＣＡ　ＴＴＡＧＴＡＡＴＧＡ　ＴＧＧＧＣＴλＡτＴＴ λＡＧＡＣτＴＡＡ　ＣＡＧＣＣτＡＧλＡ　３５６Ｓｅｒ　Ｌａｕ　ユ０４ＢＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＡＴＴＡＧＡＴ　ＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴ　ＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴ　ＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴ　１０８６ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴ　ＴＴＧＴＴｒＣＧＡＧ　Ａ’ＩＴＴＣＴＴＡＡＧ　ＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡ　ＴＴＴＴＧＧＴ” Ｔ−’　１４９６Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ工６２５ＴＣＴ　ＣＴＣＧＡＣＡＣＴ　ＧＴ　ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＡ　ＡＴＧＡＡＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＡＴＧＴＧＡ　１６５６ＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡ　ＡＡＧＧＣＴ？ｒＧＴ　ＴＧＴＴＴＴＣＡＴＡ　ＡＴＣＴＴ’ＴＣＴＧＴ　ＣＡＴＴ”τＣＴττ　１９１６ＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧ　ＴＣＡＡＧＴＣＡＡＧ　ＣＧＡＣＴＣＴＴｒＧ　ＣＴＡＧＴ入ＡＴＣＴ　ＧＴＡＴＧＣＣＡＴＧ　ユ９６６Ｔ入ＡＧＴＧＡＡＡＧ　ＡＧＴＡＧＴＣＣＣＴ　ＭＧＡＴＧＡＣＡＣＴＡＧＣＴＴＣＡ）Ｔ　ＴＡτＡ入λＣ入λＴ　２１工に：τ入τ：六〇ＡＴ　”Ｃ；ＴＡＴＡＴ入Ｃ入　ＧＧτＴＡＴＧＡτ τ　τＡττＣＣＣλ、１．Ｔ　ｃｘｓ：：二Ｓ、貴、褌久　２二６６Ｓ；−一、Ｔ０こＡＳごン、：ＳτＴτＣ入τＣフ　ＣＴＧλλＴ入Ｇτン、Ｇ入ＣＡＴ τＣτＣ０λλ二：ττ人Ｓ二ご　：２二６ＣＴＴＣＣＴここＴＣＧＡＴＣ入λ ＡＦｉｇ、４Ｕ）ＡＰＩＧＵＳ　葉　種子段階１　種子段階２　種子段階３５　３．４　１０．０　１８７．２　５５１．２６　５．０　６δ、５　９９．２　２４９．６ＩＱ　２Ａ　８．６　５．６　３８．７１２　０．６　０．２　０．５　１．３］Ｌ　１４．３　１，２　２．０　１６５．６１６　２Ｓ、４２０９．２　４２４．０　２６＆、０１８　１８．４　３２０．０　３４ら、０　２１！、８．０１９　８．８　１μ、０　２００．０　２８４，０２５　７．８　７９．２　１３６．４　５１６．０２６　２．１　４１．２　Ｂ７．６　４２６．０２７　１．８　０．３　１３８．４　４４Ｂ、０２Ｂ　０．６　０．＋　５２．４３０００２９　３．３　１０．９　２２．０　４１６．０平均　７．２２　６８．７２　ｉ３４．８７３００．６５（ＴＡＫ　葉　種子段階１　種子段階２種子段階３３Ａ　１４．８　１５．１　３２．２　５．１３Ｂ　９．６　２．６　７．０　２ｆ、、４２１　２４．１３　１２．Ｌ　５．１　１８．４２３　９００．０　７２０．０　１７６．０平均　２３７．３　１８７．５　５６．０開花後日数開花後日数開花後日数Ｃ１’ＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧ　ＡＪＩＡＴｒＴｒＧＧＡ　ＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡ　ＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴ　５０１（ｉｓ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ工１＠Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＬａｕＣＡＴ　ＴＴＴ　ＧＣＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＧＣＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＣＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　１３０Ｂ〜、７６（２／４〕Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　入１ａ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　工１ａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　工１ａ　ＡｌａＣＴ’Ｔ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＴｒＣＧＣλ入Ａτ　ＧＡＣ入ＴＣＴＡＣＣＡＧ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　１３８６Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　ＴｙｒＡＡ入　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ｆｆ！’　ＧＧＣＣＡＣＡＧＴ　’Ｉ’ｌＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＡＣ１４６４１２０１２５Ｌ：１ＯＬｙｓ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　ｐｒＯＬｇｕ　Ｈｉｓ　Ｚｌｅ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　５ａｒＡ入Ａ　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＣＧＧＴ　ＧＣＡ　ＴＣＣ１５４２Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ工１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＧｉｎＧＡＴ　ＴＴＣＧＧＡ　ＧＧＣＡＣＧ　ＣＣＣＡＡＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＡＧ　１６５９Ｆｉｇ、７６　（３／４）Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＣＴＡ　ＡＣＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＴＴｒ　ＧＡＴ　ＧＴＣＣＡＣＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣ１８５４Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＰｈｅＧＡＣＣＡＣＴＴ’Ｔ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧ　ＡＡＣＴＴＩ’　１Ｂ９３工ｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　？ｙｒ工１ａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　５ａｒＡＴＣＡＡＧ　ＭＣＴＡＣＡＴＡ　ＧＣＣＭＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＣＡ　１９３２Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　＊會★ ＣＴＣＡＣＴ　ＴＧＡ　ＣＴＡＣＴＴＴＴＡ　ＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴ　ＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴ　１９７０ＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＡ　ＡＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＣ２０１５Ｂｇｌｘ工脂質（％）開花後日数平成５年１０月　８日

Claims

【特許請求の範囲】１　種子特異性植物プロモーターとして作用でき、植物細胞において脂肪酸又は脂質の生合成と協奏して前記プロモーターの制御下におかれた遺伝子の発現をすることもできるプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物。２　前記プロモーターが、明細書に記載した、すなわち、【配列があります】の、クローンＡＣＰ０５の少なくとも２９１ｂｐのポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。３　図１に記載したセイヨウアブラナのＡＣＰ０５遺伝子の少なくとも１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ５′上流断片を含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。４　図１に記載のセイヨウアブラナのＡＣＰ０５遺伝子の少なくとも１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ５′上流断片を含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。５　大腸菌ＪＭ１０１／ｐＡＰＩＧＵＳ（ＮＣ　Ｉ　ＭＢ４０３９６）に存在するプラスミドｐＡＰｌＧＵＳに存在する種子特異性植物プロモーターを含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。６　植物細胞を形質転換するための、好ましくは脂肪酸の種子特異性の生合成を修飾するための、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の種子特異性プロモーターを含むＤＮＡ構築物の使用。７　その使用によって続いて植物細胞が、種子において特異的に脂肪酸の修飾された生合成が起こる完全な植物に生長する、請求項６に記載の使用。８　請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の種子特異性プロモーターを含むＤＮＡ構築物を、形質転換できる植物細胞に導入し、生じた形質転換された植物細胞を完全な植物に成育した後に、導入された種子特異性で時間的に調節する植物プロモーターにより制御された前記遺伝子の一部を生成する構造遺伝子が、植物の種子において脂肪酸又は脂質の生合成と協奏して発現され、それにより前記構造遺伝子に対応するタンパク質を生成する、植物細胞を形質転換する方法。９　前記構造遺伝子が、脂肪酸又はそれに対応する脂質の種子特異性生合成に必要なタンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。１０　苗木（ｐｉａｎｔｌｅｔ）を経由して、種子を有する植物にまで植物細胞を成育させ、生じる、修飾された組成を有する植物油を含有する種子を回収し、それにより前記植物細胞の又は植物の細胞又は、種子が、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載のＤＮＡ構築物を含有することを含む、植物種子油の生成を修飾する方法。１１　前記ＤＮＡ構築物が、前記プロモーターの制御下で、脂肪酸生成又は脂質生成のための生合成経路において活性なタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。１２　前記ＤＮＡ構築物が、種子特異性アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）プロモーター、好ましくはブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）由来の種子特異性アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）プロモーター及び、野生型遺伝子と異なる、ＡＣＰをコードする構造遺伝子から本質的に成るプロモーターを含む、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。１３　前記ＤＮＡ構築物が種子と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である種子特異性植物プロモーターを含有する場合には、前記ＤＮＡ構築物は前記種子のゲノムにおいて前記プロモーターに関して天然部位でない部位に存在する、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載のＤＮＡ構築物を含む種子。１４　前記ＤＮＡ構築物が、外来性のタンパク質をコードする、興味を有するＤＮＡ配列も含み、それによって興味を有するＤＮＡ配列が種子特異性植物プロモーターの制御下にある、請求項１３に記載の種子。１５　前記種子がブラシカ科に属する植物である、請求項１３に記載の種子。１６　所望のタンパク質をコードする構造遺伝子を発現し、植物細胞が、前記構造遺伝子を含む、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の組換えＤＮＡ構築物を含有し、前記タンパク質の生成の後に任意に植物細胞から前記タンパク質を単離することを含む、植物細胞、好ましくは種子細胞において所望のタンパク質を生成する方法。