JPH07502654A - 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈｉｖプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

サンドイッチバイブｉ　イゼーションアッセイにいるための旧Ｖプローブ 技１ｂＦ野 本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には 、本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を検出するための新規な核酸プロ ーブに関する。 １１技■ ＡＩＤＳおよびＡＲＣ（７）病因物質は、ＬＡＹ、　ＨＴＬＶ−１１１、ＡＲＶ 、およびＨＩＶとさまざまに呼ばれている。以下、これを旧Ｖと称する。 このウィルスのＲＮＡまたはＤＮＡの検出は、種々のプローブ配列およびハイブ リダイゼーション形式により可能である。 １９８７年８月１１日に出願されたＰＣＴ　Ｎｏ　８８１０１３０２ニは、ＨＩ ＶのＤＮＡまたはＲＮＡの検出にプローブとして用いられる１３個の旧Ｖオリフ ヌクレオチドが開示されている。１９８７年６月２２日に出願されたＰＣＴ　Ｗ ｏ　８７１０７９０６には、ＨＩＶウィルスの変異株およびそれらのＤＮＡをＡ ＩＤＳ診断に使用することが開示されている。１９８９年１月２７日に出願され たＥＰ　Ｏ３２６３９５Ａ２には、多発性硬化症に関連する配列を検出するため の、ヌクレオチド２４３８〜２４５７位の長さの旧Ｖ　ＤＮＡプローブが開示さ れている。 ポリメラーゼ連鎖反応の出現により、主としてｐａｌ遺伝子およびｇａｇ遺伝子 の領域に由来するプローブを用いるアッセイの範囲が刺激された。５ｐｅｃｔｏ ｒら（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　３５／δ１５８１−１５８７、　１９８９）お よびＫｅｌｌｏｇら（Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ　１８９：２０ ２−２０８゜１９９０）は、ＩＩＩＶ　ｇａｇ遺伝子由来のプライマーでのポリ メラーゼ連鎖反応を用いる、ＨＩＶプロウィルスＤＮＡの定量アッセイを開示し ている。Ｌｏｗｅｌｌら（ＣＩｉｎ、　ＣｈｅＩｌ、３５／９：１８２６−１８ ３１＞は、旧Ｖ　ｐａｌ遺伝子ｍＲＮＡの保存領域に相補的な増幅可能ＲＮＡプ ローブを開示している。Ｃｏｕｔｌｅｅら（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１ ８１：９６−１０５．　１９８９）は、旧Ｖ　ｐｏｌおよびｇａｇｉｉ伝子由来 伝記由来相補的なプライマーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応による旧Ｖ 　ＤＮＡの免疫検出を開示している。１９８７年１２月１５日に出願されたＥＰ 　０２７２０９８には、ヌクレオチド８５３８〜８５４７位および８６５８〜８ ６７７位の長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いる、ｔｌｌＶ　ＲＮＡ配列 のＰＣＲ増幅および検出が開示されている。１９８７年１月９日に出願されたＥ Ｐ　Ｏ２２９７０１には、ＩＩＩＶ　ｇａｇ領域由来のＤＮＡの増幅による旧■ の検出が開示されている。ＰＣＴ　ＷＯ８９／１０９７９には、捕獲プローブお よびリポータ−プローブを用いて固体支持体に固定する、増幅と溶液ハイブリダ イゼーンロンとを組み合わせる核酸プローブアッセイが開示されている。旧■の ｇａｇ　ｐ　１７領域内の領域は、この技法によって増幅された。 他の方法は、「可逆的標的捕獲」と呼ばれる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｃ Ｉｉｎ、Ｃｈｅｍ、３５／９：１７Ｂ−１８８１，１９８９）は、ＩＩＩＶ　Ｒ ＮＡの「可逆的標的捕獲」を開示しており、ここで市販の入手可能なｄＡテイル 化合成オリゴヌクレオチドは、分析される核酸の選択的精製を提供し、そして旧 Ｖｐｏｌ遺伝子に相補的な標識アンチセンスＲＮＡプローブはシグナルを提供し ている。Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ ｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　３ニア３−８６．　１９８９）は、ＨＩＶ　ＲＮＡの可逆的 標的捕獲のためのプローブを開示しており、ここでこのプローブは、ＨＩＶ　ｐ ｏｌ遺伝子のヌクレオチド２０９４〜４６８２位に相補的である。 Ｋｕｍａｒらは、［Ｖ　ＤＮＡの「プローブシフト」アッセイを開示している。 これは、ＨＩＶのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に相補的なりＮＡ配列を用いる。ブ ローブンフトアノセイは、標識オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅セグメントへの 、溶液中でのハイブリダイゼーションに依存する。そこで形成されるヘミニ重鎖 は、非変性ゲル上で分画を行った後検出される。 Ｋｅｌ　ｌｅｒら（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７７：２７−３２．　１９８ ９）は、ｇａｇコーディング領域のＰｓｔ　Ｉ部位に広がる旧Ｖ　ＤＮＡを検出 するための、マイクロタイターペースのサンドイッチアッセイを開示している。 Ｖｉｓｃｉｄｉら（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　２７＋１２０−１２５． １９８９）は、固相抗ビオチン抗体およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的 な酵素標識モノクローナル抗体を用いる、旧Ｖ　ＲＮＡのハイブリダイゼーショ ンアッセイを開示しており、ここでプローブは、ポリメラーゼ遺伝子のほぼ全域 およびｇａｇ遺伝子の３°末端に広がる。 １９８９年１１月１６日に出願された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８９３１１８６ ２号には、核酸を検出するための固体捕獲法を用いる診断キットおよび方法が開 示されており、ＩＩＩＶ　ＤＮＡの検出のために、１１１Ｖ　ｇａｇ遺伝子に相 補的なりＮＡ配列を使用することが記載されている。 同一人に譲渡された米国特許第４．８６８．１０５号には、溶液相核酸づノドイ ノチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分 析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハ イブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次い て、ブローブー分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相 固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブ にハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形管 て分析物をｆ丁することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。 最終的に、標識化プローブのセットの一末鎖セグメントは標識プローブにハイブ リダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じた シグナルによって検出され得る。 同一人に譲７度された欧州特許出願（ＥＰＡ）第８８３０９６９７６号には、米 国特許第４．８６８．１０５号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここ では、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マル チマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分岐ポリヌクレオチドであっ て、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分岐または直鎖状）に特異 的にハイブリクイズするセグメント、ならびに、ＦＡ　ｉａプローブに特異的に ハイブリクイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マ ルチマーヲ用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットお よび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリクイズさせ、そして複合 体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容 器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイ ブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復 にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を 提供するので、シグナルが増幅される。増幅および捕獲プローブ配列は、Ｂ型肝 炎ウィルス、罰■旦ｊ１１１圧薊並且、Ｌユ旧虹」匹Ｂのベニンジンおよびテト ラサイクリンｉ＋生、およびｑ「シ１１３０」−ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについ て開示されている。 １９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願第５５８． ８９７号には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分岐ポリヌク レオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチ マーよりも強くシグナルを増強する。 １９８７年１１月２４日に出願された米国特許第５．０３０．５５７号には、プ ローブの標的への結合を促進するために、分析される核酸に結合して、欅的に異 なる二次および三次構造を与えるように選択された、「ヘルパー」オリコヌクレ オチドが開示されている。　（以下余白） 光朋！日匪示 本発明の１つの局面は、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチ ド配列を含む第一セグメント；および核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位 に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、ＨＩＶに対 するサンドイノチハイプリタイゼーションアノセイにおける増幅プローブとして 有用な合成オリゴヌクレオチドである。 本発明の別の局面は、ＩＩＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチ ド配列を含む第一セグメント；および固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質 的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、１１１ｖに対する サンドイノチハイブリダイゼーションアツセイにおける捕獲プローブとして有用 な合成オリゴヌクレオチドである。 本発明の別の局面は、ＩＩＩＶを検出するためのサントイ、ソチハイブリダイゼ ーションに用いるためのスペーサーオリゴヌクレオチドである。 本発明の別の局面は、試料中の旧■の存在を検出するための溶液サンドイソチハ イブリダイゼーションアノセイであって、このアッセイは以下の工程を包含する ：（ａ）　該試料を、過剰の（ｉ）ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的な ヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌク レオチド単位に実質的（こ相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含 む、増幅ブローブオリコヌクレオチド、および、（ｉ　１）ＨＩＶ核酸のセグメ ントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相 に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二 セグメントを含む、捕獲プローブオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条 件下で接触させる工程； （ｂ）　工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイ ブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）　その後、固相に結合していな い物質を分離する工程；（ｄ）　工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマ ーと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマー が、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少 なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実 質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｆ）　工 程（ｅ）の固相複合体生成物を、該標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズ する条件下で接触させる工程；（ｇ）　非結合標識オリゴヌクレオチドを除去す る工程；および （ｈ）　工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。 本発明の別の局面は、試料中の旧Ｖの検出のためのキットであって、このキット は以下の組み合わせを含む：（ｉ）　増幅ブローブオリコヌクレオチドのセット であって、ここで該増幅ブローブオリコヌクレオチドが、ＩＩＩＶ核酸のセグメ ントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントと、核酸マルチ マーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二 セグメントとを含む、セット； （ｉｉ）　捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセ、、トであって、ここで該捕獲 プローブオリゴヌクレオチドが、ＩＩＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的な ヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレ オチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セ、２ト；（ｉｉｉ）　 核酸マルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第 二セグメントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位 、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌ クレオチド単位を含む、マルチマー；および（ｉｖ）　標識オリゴヌクレオチド 。 日を　るためのン熊 定礒 「溶液相核酸ノ・イブリダイゼーンヨンアンセイ」と（よ、同一人に譲渡された 米国特許第４．８６８．１０５号、ＥＰＡ第１１８３０９６９７６号、および米 国特許出願第５５８．８９７号に記載およびクレームされているアッセイ法を意 味する。 「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、付加 的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。好ましくは、改変ヌクレ オチドは、そのＮ′位が機能的ヒドロキシ基を提供するように改変されている５ ゜−シチジンである。 「増幅マルチマー」とは、分析される核酸と、多数のポリヌクレオチド反復（す なわち、他のマルチマーの反復または標識プローブの反復のいずれか）とに、同 時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する 。マルチマーの分枝は共有結合によりっ（られ、マルチマーは、２つの型のオリ ゴヌクレオチド単位から構成されている。これらのオリゴヌクレオチド単位は、 それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズした核酸に、 および多数の標識プローブにハイブリダイズし得る。このようなマルチマーの組 成物および調製は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号、および１９９０年７月２７ 日に出願された米国特許出願第５５８，８９７号に記載されており、その開示内 容は、本明細書中に参考として援用されている。 「スペーサーオリゴヌクレオチド」は、分析されるＲＮＡに結合するが、固相に 付着するためのいかなる配列をも含まず、そして増幅プローブによるいかなる検 出手段をも含まないオリゴヌクレオチドとして意図される。 用語「増幅プローブ」は、分析される核酸に特異的にハイブリダイズするセグメ ントと、増幅マルチマーに特異的に）＼イブリダイズするセグメントまたはセグ メントの反復とヲ有するように構築された、分枝または直鎖状のポリヌクレオチ ドとして意図される。 用語「捕獲プローブ」は、分析される核酸のヌクレオチド配列に実質的に相捕的 なセグメントと、固相固定化プローブのヌクレオチド配列に実質的に相捕的なセ グメントとを有するオリゴヌクレオチドとして意図される。 本明細書中で本発明のコーム型分岐ポリヌクレオチドを記載するのに用いられる ［大きな（Ｌａｒｇｅ）Ｊとは、少なくとも約１５個の分岐部位と、標識プロー ブ結合配列の少なくとも約２０個の反？Ｗとを有する分子を意味する。 本明細書中で本発明の分枝ポリヌクレオチドの構造を記載するのに用いられる「 コーム型」とは、バックボーンから伸長している多数の側鎖を有する直鎖状のバ ックボーンを有するポリヌクレオチドを意味する。 「切断可能なリンカ−分子」とは、ポリヌクレオチド鎖に安定して取り込まれ得 て、化学的処理または物理的処理（例えば、放射線照射）により破壊または切断 され得る共有結合を含む分子を意味する。 本明細書中に開示された全ての核酸配列は、５°から３°への方向に記載されて いる。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−’ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨さ れたヌクレオチド記号に従って示す。 （以下余白） ｒＬ１ｆＬｆｌハイブリダイゼーションアッセイ溶液相サントイ、チハイブリダ イゼーン９ンの一般的なプロトフルを以下に示す。分析される核酸を、過剰量の 以下に示す２つの一末鎖核酸ブローブセットを入れたマイクロタイターウェル中 に入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に実質的に相捕的な 第一結合配列、および、固体支持体（例えばウェル表面またはビーズ）に結合し た核酸に実質的に相捕的な第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（ 分岐または直鎖状）の七ノド、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合 配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有 する。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイ ズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。 プローブの第二結合配列は、分析物と実質的に相捕的ではないので、一本鎖セグ メントのままで残っている。この複合体は、固体表面上の固定化プローブに、捕 獲プローブの第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、固 体表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより 形成された二重鎖によって、固体表面に結合した複合体を含む。次いて、非結合 物質を、例えば洗浄により表面から除去する。 次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーシコン条件下で結合複合体に加え 、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイ ズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーか らも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの実質的に相捕 的なオリゴヌクレオチド７４１位にハイブリダイズさせるような条件下で加える 。次いで、得られた固定化は撒積酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレ オチドを除去し、読み取る。 分析される核酸は、種々の供給ｇ（例えば、生物学的液体または固体）由来てあ り得、種々の手段（例えば、ブロティナーゼに、／ＳＤＳ、カオトロピＩり塩な ど）によりハイブリダイゼー／−Ｉン分析のために調製され得る。また、酵素的 、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば 、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすること が有利であり得る。フラグメントは、０．１ｋｂ程に小さくあり得、通常少なく とも約０．５ｋｂであり、そしてｌｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される 配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在す る場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、 配列を変性すべきである。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約 ００５〜０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、酵素、またはそれらの 組合せ）により行われ得る。 分析される配列に実質的に相捕的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第 一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌク レオチド、そして約５ｋｂ以下、通常約１ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレ オチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチド である。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第 一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、 コンセンサス配列、冬型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定 の株などに関連し得る。 用いられる種々の増幅プローブおよび捕獲プローブの数は、アッセイの感度に影 響する。なぜなら、これは用いられるプローブ配列が多いほど、アッセイ系で提 供されるシグナルが強くなるからである。さらに、プローブ配列を多く用いるほ ど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられるようにな り、それによって偽陽性結果の発生率が減少する。従って、セット中のプローブ 数は、少なくとも１つの捕獲プローブおよび少なくとも１つの増幅プローブ、よ り好ましくは２つの捕獲プローブおよび２つの増幅プローブ、そして最も好まし くは５〜１００個の捕獲プローブおよび５〜１００個の増幅プローブである。 ）１１Ｖのオリゴヌクレオチドプローブ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ由来の１８個の １７株のＤＮＡ配列を並べることにより設計した。ｐｏｌ遺伝子内の相同性が最 も高い領域を捕獲プローブとして選択し、一方、より相同性の低い領域を増幅プ ローブとして選択した。 非常に異質の領域をスペーサープローブとして選択した。従って、１（１■のよ り多くの株が同定され配列決定されるのに伴って、さらなるプローブが設計され 得るか、または現存の好ましいセクトのプローブが改変され得る。これは、新規 の株または単離株の配列と、上記で用いられた１８株の配列とを並べ、同様に相 同性の最も高い領域およびより低い領域を同定することによって行われ得る。 スペーサーオリゴヌクレオチドは、起こり得る分解からＲＮＡを保護するために 、ハイブリダイゼーション反応混液に加えられるように設計した。捕獲プローブ 配列および標識プローブ配列は、捕獲プローブ配列に標識プローブ配列が散在す るように、または捕獲プローブ配列が、標識プローブ配列に関して共にクラスタ ー形成されるように設計した。 旧■核酸に特異的にハイブリダイズする、現存の好ましいセットのプローブおよ びそれらの捕獲領域または増幅領域を、実施例２に挙げる。 捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、固体表面に結合 したオリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、実質的に相補的 であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選 択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補 的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望で あれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合 を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。 捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニ ングにより調製され得るが、前者が好ましい。 結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。、多く の場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％ 未満の塩基がミスマツチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中 で用いられる用語「相補的」とは、結合領域内の各塩基が正確に対応するような 正確な相補性を意味し、「実質的に相補的」とは、９０％またはそれ以上の相同 性を有することを意味する。 標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に実 質的に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の 分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供 する。標識は、実質的に相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、また は複数の標識を有する末端メンバーまたは末端ティルとして存在し得る。オリゴ ヌクレオチド配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告さ れている。例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　（１９８３）　８０：４０４５；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ、　 Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　１２：３４３５；　Ｒｉｃｈ ａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ、　Ｎｕ劇、ａｉｄｓ　Ｒｅｓ。 （１９８３）　１１：６１６７；　Ｓ＋ａｉｔｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒ ｅｓ、（１９８５）　１３：２３９９；　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａ旧、Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８４）　１３８：２６７を参照のこと。標識は、 実質的に相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ 得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、 酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含され る。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ロークミン、テキサスレッド（Ｔ ｅｘａｓ　ｒｅｄ）、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡ ＤＰＨ，α−β−ガラクトンダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ スファターゼなとが包含される。 分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ 少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは 少なくとも約１．５＝１であり、より好ましくは少なくとも２：　１である。通 例、２：　ｌから１０，０００：　１の範囲内である。各プローブの濃度は、一 般的に約１Ｏ−５〜１０”９Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１０−２１〜 １０−１２Ｍまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程 は、一般的に約１０分から２０時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハ イブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約２０”Ｃから８０’ Ｃの範囲で、より通常には約３５℃から７０℃までで、特に６５℃で行われ得る 。 ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常 行われる。媒体は種々の添加剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度 のデタージェント（０，１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０， ０１７〜０．１７Ｍ））、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体 タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは 、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホ ルムアミドである。 これらの他の溶媒は、一般的に２〜５０％の範囲内の量で存在する。 ハイブリダイゼーション媒体のストリンジエンシーは、温度、塩濃度、溶媒系な どにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、 ストリンジエンシーを変化させる。 標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ 得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物 質に対しては、ルミノメータ−またはフィルムが有用である。酵素を用いる場合 は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計 、ルミノメータ−１分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノア ッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本 アッセイに用いられ得る。 以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのよ うにも限定することを意図しない。 支施亘 爽血且↓ コームリ　ポリヌクレオチドのム 本実施例は、１５個の分枝部位と、３つの標識プローブ結合部位を有する側鎖伸 長とを有する、コーム型分枝ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌク レオチドは、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号に記載の溶液相ハイブリダイゼーシ ョンに用いられるように設計した。 オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ）で行った。β ンアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、Ｐｈｏｓｔｅｌ ｒ″試薬（ＡＢＮ）を用いる５°リン酸化が包含される。 示したこと以外は、標準的なＡＢＩプロトコルを用いた。複数のサイクルを用い た（例えば、１．２サイクル）と示されている場合、Ａ旧により推奨された複数 の樟準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられたｏ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０ＢＤＮＡ合成機で行われる、サイクル １．２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。 以下の構造のコーム体を最初に調製した：３　’　Ｔ、、　（ＴｒＸ’　＋　１ ５ＧＴＴｒＧＴＧＧ−５’！ （ＲＧＴＣＡＧＴｐ　−５’　Ｉ　、５ここで、Ｘｏは分枝モノマーであり、そ してＲは過ヨウ素酸切断可能リンカ−である。 １５個の（ＴＴＸ゛）繰り返しによるコーム体の部分を、３３．８ｍｇのアミノ プロピル誘導体化チミジノの調整孔ガラス（ＣＰＧ）　（２０００１２サイクル プロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった： コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイ トモノマーの濃度は、ＡＳＣ，Ｇ、およびＴが０．ＩＭ、分枝部位モノマーＥが ０．ＩＳＭ、およびＰｈｏｓｔｅｌ”試薬が０．２Ｍであった。脱トリチル化は 、脱保護期間中に階段フロースルー（ｓｔｅｐｐｅｄ　ｆｌｏｖｔｈｒｏｕｇｈ ）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５’Ｄ ＭＴをアセチル基で置換した。 切断可能リンカ−Ｒおよび式３’　−ＲＧＴＣＡＧＴｐ　（配列番号　１）の６ 塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位て合成した。塩基保護 基（上式のＲ２）の除去は、コーム体の合成に用いたのと同しカラム中にＣＰＧ 支持体を保持している開に、手動的に行った。Ｒ２がレブリニルである場合、０ ，５Ｍヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（ｌ・ｌ　ｖ／ｖ）溶液を加え、１ ５分ごとに液体を取り替えながら９０分間ＣＰＧ支持体と接触させておき、続い てピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄 した。脱保護を行った後、切断可能リンカ−Ｒおよび６塩基側鎖伸長を、６４サ イクルを用いて加えた。 これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、０゜１Ｍであった（０． ２ＭのＲおよびＰｈｏｓｔｅｌ”試薬を除く；Ｒは、２−（４−＜４−（２−ジ メトキ／トリチルオキシ）エチル−）フェノキシ２゜３−ジ（ヘンゾイルオキシ ）−ブチルオキ／）フェニル）エチル−２−／アノエチルーＮ、　Ｎ−ジイソプ ロピルホスホルアミダイトでアった）。 脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン？ｔｊ　ｉ＆で連続フロー スルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（１：１　ｖ／ｖ）の溶液 でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクルｒｃＥＮ ＩｈＪを用いて３８０Ｂで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を４ｍｌ のスクリューキャップＩＶｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０°Ｃで１２時間加 熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒を５ｐｅｅｄ− Ｖａｃエバポレーターで除去し、残渣を１００μｍの水に溶解した。 以下の構造の３°ハツクホーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸長、および連結反 応テンプレート／リンカ−もまた、自動合成機を用いて作成した。 ａ　ｌ、ぐ１７手゛−／ （ｆ、ｉ　３’−ＴＣＣＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣｐ−５’ 　ｔｔｅｌｙ悟”ｒ　：２）３　’−訓ｗ川用ＧＣＡＣＣＴｐ−５冒ｈｕ１ｒ＋ ＠　：４）粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、７Ｍ尿素お よびＩＸ　ＴＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。 ３゛バ、クボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した 。コーム体（４ｐｍｏｌ／μｌ）、３゛バ、クボーン伸長（６，２５ｐｍｏｌ／ 　ｕ　ｌ）、側鎖伸長（９３，７５ｐｍｏｌ／　Ｉｔ　ｌ）、および連結テンプ レート（５ｐｍｏｌ／　ｕ　ｌ）を、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ／　５　ｍＭ　ＤＴＴ／ 　５０ｍＭ　ト　リスＩＩｃＩ、ｐＨ８，０／　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　２　ｍ Ｍススペルミジン中、０．５単位、′μＩのＴ４ボワヌクレオチドキナーゼと合 わせた。この混合物を３７°Ｃて２時間インキュベートし、次いて水浴中で９５ °Ｃに加熱し、次いて約１時間かけて３５°Ｃ未満まで冷却した。２ｍＭ　ＡＴ Ｐ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、および０．２１単位／ μＩ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３°Ｃで１６〜２４時間インキュ ベートした。ＤＮＡをＮａＣ１／エタノール中で沈澱させ、水中に再墾濁し、そ して以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ　ＡＴ Ｐ、　５ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、５０１１ＭトリスＨ ＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｏＭＭｇＣＩ２．２ｍＭスペルミジン、０．５単位／ μＩ　７４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μｌ　Ｔ４リガー ゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで 、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。 連結反応および精製を行った後、生成物の一部を３２ｐで標識し、Ｒ部位での切 断を行い、これは、水性Ｎａ１Ｏａで１時間酸化することにより達成された。次 いで、試料をＰＡＧＥにより分析して、取り込まれた側鎖伸長数を、ゲル上のバ ンドの放射性標識を定量することにより測定した。生成物は、全部で４５個の標 識プローブ結合部位を有していることが分かった。 支皇且ｌ マルチマーを　いる旧Ｖ　ＤＮＡのサントイ・チノ＼イブｊ　イゼーンヨンアソ セイ 本実施例は、旧Ｖ　ＤＮＡアッセイに本発明を使用することを例示する。 ｒ１５Ｘ３Ｊ増幅溶液相核酸サンドイッチ／％イブリダイゼーンヨンアッセイ形 式を、本実施例で用いた。ｒ１５Ｘ３Ｊの呼称は、この形式が２つのマルチマー を用いることに由来する：〈ｌ）増幅プローブは、旧■核酸に結合する第一セグ メント（Ａ）と、（２）増幅マルチマーにハイブリダイズする第二セグメント（ Ｂ）とを有し、（２）増幅マルチマーは、セグメント（Ｂ）にバイブＩＪ　タイ ズする第一セグメント（Ｂ中）と、セグメント（Ｃ）の１５個の反復とを有し、 ここでセグメントＣは、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。 本アッセイで用いた増幅プローブおよび捕獲プローブの旧Ｖ特異的セグメント、 およびそれらの個々の名称は以下の通りであった。 Ｈｒｖ−１ｏｓ　＜　就１１％　：６）ＣＴＣＣＡＡ’ＩＴＣＣＹＣＣＴＡＴＣ Ａ′ｒｒＴＴＩＩＧＧＹＴｒＣＣＡＴＹＨ工Ｖ−１０６（Ｐｔ１蚤もニア） ＫｌｏＡＴＹＴＧＡＴＣＲＴＡＹＴＧＴＣＹＹＡｎＡＴＭＭＣＩ（ｒＶ、１０８ 　（配列１１ｒＦ’ｙ　：８）ＧｍＣＡＧＧＹＧＴＡＧＧＴＣＣＴＡＣＹＡＡＴ ＡＹＴＧＴＡＣＣｇｒｖ、１１ｏ　（Ｉ！１２７ツ醤’ａ　：９）ＹＴＣＡＡＴ ＡＧＧＲＣＴＡＡＴＫＧＧＲＡＡＡＴＴｒＡＡＡＧＴＲＣＡｕｒｖ、ｘ１２（駅 Ｊ’ｌＩ’８　＝１０＞ＹＴｃｒＧＴＣＡＡＴＧＧＣ口Ｔ刀ＹＴＩ’ＲＡ５ＣＣ Ｈｒｖ、１１３（Ｋケ’Ｉｉ＃ｖ！Ｊ：ｌｌ）ＴｒｒＡＣＡｗＡＴＴｒＣｒＲＹ ＴｐＡＴＧｃｒｒ胃ＡＴＩＴｒＹＴＣＨ１ｒＶ、１１４　（ｉｌり己列−６４３ 　：１２）各増幅プローブは、１１１ｖ配列に対して実質的に相捕的な配列に加 工て、増幅マルチマーのセグメントに相捕的な以下の５゛伸長を含んでいた： ＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣ’ＣＧ冗ＴＣＴＴ　（配列１号：５５）。 各捕獲プローブは、ＩＩＩＶ　ＤＮＡに対して実質的に相捕的な配列に加えて、 固相に結合したＤＮＡに対して相捕的な以下の下流配列（ＸＴｌ中）を含んでい た： ロπτπ刀石品届πン貿（配列番号：５６）。 増幅プローブおよび捕獲プローブに加えて、以下の旧Ｖスペーサーオリゴヌクレ オチドのセ・ノドをハイブリダイゼ一シヨン混合物中に含有した。 た０−−′　１　し　′　彎 Ｈｘｖ、Ｎｏｘ１ｏ７＜　ｒＤ１１番’Ｉｖ　：５７）ＴＡＴＡＧロアπコＴＣ ＣＲＣＡＧＡＴｒＴＣｒＡＹＲＲ。 ＨＷ−ＮＯＸＬＯ９＜　ｆ）ｆＪｌノド％　：５８１ＶＣＣＡＡＫＣＴＧＲＧＴ ＣＡＡＣＡＤＡＴＴｒＣＫＴＣＣＲＡＴＴＡＴ　。 １（ｒＶ、Ｎ０Ｘ１２４　（Ｅｖ’１番％＝５９）ＴＧＧＴＧＴＧＧＴＡ７頃Ｙ ＣＣＣユα買品ＹＡＧＡπ買Ｓ。 Ｈｒｖ、Ｎｏｘｌ：ｚ９（′１ｔＰ１番４：６ｏ）ＴＣＣＴＧＣＴｆｆＬ”ＣＣ ＹＷＤＴＹＴＡＧＴＹＴＣＹＣＴＲＹ　。 ＨｒＶ、Ｎ０Ｘ１３１　（１ｕＩＩｔ＠　：６１）ＹＴＣＡＧＴＹＴｒｃｒＧＡ ＴｒＴＧＴＹＧＴＤ’ｒｌ１３）（ＫＴＮＡＤＨＧＤ　。 Ｈｒｖ、Ｎｏｘ１４ｏ　＜　Ｅ列４Ｊ４＝６２）ＡＡＴＴＲＹＴＧＴＧＡＴＡＴ ｒＴＹＴＣＡＴＧＤＴＣＴｒＣ’ＩＴＧＲＧＣＣＴｒ　。 ａｒｖ、Ｎｏｘ１４８＜＃ＬＩ゛）＄８　：６３）ＧＣＣＡＴＣＴＫＣＣＴＧＣ ＴＡＡ’ＩＴＴｒＡＲＤＡＫＲＡＡＲＴＡＴＧＣＴＧＴＴｒ。 Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ポリ スチレンマイクロタイタープレート、９６ウエル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅ ｃｈ　Ｉｎｃから購入した。各ウェルに２００μｌのｌＮｌｌＣｌを満たし、室 温で１５〜２０分間インキュベートした。次いて、このプレートをＩＸ　ＰＢＳ で４回Ｒｉ’？し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いてウェルに２ ００ｔｌｌのｌ　Ｎ　ＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベート した。プレートを再びＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体 を除去した。 ポリ（ｐｈｅ−１ｙｓ＞をＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから購入し た。このポリペプチドは、ｐｈｅ：　ｌｙｓをｌ：ｌのモル比で有しており、平 均分子量は４７．９００ｇｍ／ｍｏｌである。平均長さは３０９アミノ酸であり 、１５５アミン／ｍｏｌを含む。ポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、２Ｍ　Ｎ ａＣｌ／ＩＸ　ＰＢＳと混合し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍ１（ｐｌ＋６．０）に した。 各ウェルに、この溶液を２００μＩ、ずつ加えた。プレートをプラスチ、りで包 んで乾燥を防ぎ、３０°Ｃで一晩インキュベートした。次いて、プレートをＩＸ 　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。 プレートにオリコヌクレオチドＸＴ１＊を力、ブリングするのに、以下の手順を 用いた。ＸＴｌ中の合成は、ＥＰＡ第８８３０９６９７６号１こご８載された。 ２０ｍｇのジスクシンイミジルスベレートを、３００＋１ｌ（７）ジメチルホル ムアミド（ＤｌＩｌＦ）ニ溶解した。ＸＴｌ中の２６０Ｄ２８ｎ単位を、１００ μｍカップリング緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ）１７．８）　ニｍえ た。次いで、カップリング混合物をＤＳＳ−ＤＭＦ溶液に加え、マグ不チノクス ターラーで３０分間攪拌した。 ＮＡＰ−２５カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐｌ＋６．５で平衡化した。 カップリング混合物ＤＳＳ−ＤＭＦ溶液を２ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、 ｐＨ６，５に４°Ｃて加えた。この混合物をポルテックスにかけて混合し、平衡 化したＮＡＰ−２５カラムにかけた。ＤＳＳ活性化ＸＴＩ＊　ＤＮＡを、３．５ ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ＋＋ａ、ｓでカラムから溶出した。溶出し たＤＳＳ活性化ＸＴ１傘ＤＮＡ（７）５．６０Ｄ２６９単位を、１５００ｍｌの ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐｌ＋７．ｌｌに加えた。各ウェルに、この溶液を ５０μｌずつ加え、プレートを一晩インキユイートシた。次いて、プレートをＬ Ｘ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。 プレートの最終的なストリッピングは、以下のようにして行った。０，５％（ｗ ／ｖ）ＳＤＳを含有する２００μｍ、の０．２Ｎ　ＮａＯＨを各ウェルに加えた 。プレートをプラスチックで包み、６５℃で６０分間インキュベートした。次い て、プレートをＩＸ　ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去 した。ストリ・ノピングしたプレートを、２〜８°Ｃで乾燥剤ビーズと共に貯蔵 した。 １（ＩＶ　ＤＮＡの襟準曲線は、１（ＩＶ陰性ヒト血清でクローン化旧■ＤＮＡ を希釈し、１（１−２００ｔｍｏｌ　（ｌｔｍｏｌ　＝　６［１２分子または１ ０−”ｍｏｌ）の範囲に相当する希釈液のアリコートを、上記のように調製した マイクロタイター皿のウェルに配付することによりｇｌした。 試料の調製は、１２５μｌのＰ−に緩ｉ１ｉ液（１０ｍＭ　トリス１１Ｃ１、ｐ ）１８、０中ノ２ｍｇ／ｍｌノブロティナーゼに／　０．１５Ｍ　ＮａＣ１／　 １０ｍＭ　ＥＤＴＡ。 ｐＨＲ，Ｇ／　１％ＳＤＳ／　４０Ｍｇ／ｍｌの音波処理サケ精子ＤＮＡ）を各 ウェルに配付することから成り立った。プレートを覆い、攪拌して試料を混合し 、６５℃でインキュベートし、核酸を遊離させ、次いでベンチトップで５分間冷 却した。 上記に挙げた旧Ｖ特異的増幅プローブおよび捕獲プローブの反応混液を各ウェル に加えた（ウェル当り捕獲プローブ５０ｆｗ＋０１、増幅プローブ５０ｆｍｏｌ ）。プレートを覆い、穏やかに攪拌して試薬を混合し、次いで６５°Ｃで３０分 間インキュベートした。 次いで、中和緩衝液を各ウェルに加えた（０．７７Ｍ　３−（Ｎ−モルホリノ） プロパンスルホン酸／　１．８４５Ｍ　ＮａＣ１／　０．１８５Ｍクエン酸ナト リウム）。プレートを覆い、６５℃で１２〜１８時間インキュベートした。 各ウェルの内容物をアスピレートして、全ての流体を除去し、そしてウェルを洗 浄緩衝液（０，１％ＳＤＳ／　０．０１５Ｍ　ＮａＣ１／　０．００１５Ｍクエ ン酸ナトリウム）で２回洗浄した。 次いて、増幅マルチマーを各ウェルに加えた（５０％ウマ血清中２５ｒｍｏｌ／ μＩの溶液４０ｐ　１１０．０６Ｍ　ＮａＣ１１０，０６Ｍクエン酸ナトリ’７ ム／４ＸＳＳＣと１＝１テ混合した０、１％５ＤＳ１０．１％５ＤＳ１０．５％ 「ブロッキング試薬Ｊ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カタログ 番号＋ｏ９６１７６））。プレートを覆い、攪拌してウェル中の内容物を混合し た後、５５°Ｃて１５分間インキュベートした。 室温でさらに５分間おいた後、ウェルを上記のように洗浄した。 次いで、アルカリホスファターゼ標識プローブ（ＥＰ第８８３０９６９７６号に 開示されている）を、各ウェルに加えた（　２．５ｆｍｏｌ／μｌを４０μｍ／ ウェル）。５５℃で１５分間インキュベートした後、室温で５分間おき、ウェル を、上記のように２回洗浄し、次いて０．０１５Ｍ　ＮａＣ１１０，００１５Ｍ クエン酸ナトリウムで３回洗浄した。 酵素のトリガーとなるジオキセタン（５ｃｈａａｐら、Ｔｅｔ、　ＬｅＬｔ、（ １９８７，）　２８：１１５９−１１６２およびＥＰＡ公開第０２５４０５１号 ）をｌｕｎｉｇｅｎ、Ｉｎｃ、から得、これを用いた。ＺｏｕｌのＬｕｍ１ｐｈ ｏｓ　５３０　（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を各ウェルに加えた。ウェルを軽く叩いて試 薬を底まで落し、緩やかに回転させて試薬を底まで均等に分散させた。 ウェルを覆い、３７℃で４０分間インキュベートした。 次いで、プレートをＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＬ　１０００ルミノメータ−で読み取 った。出力を、反応の間に生じた光の総積分として示した。 結果を以下の表に示す。各１ｍ試料に対する結果は、陰性コントロールの平均値 プラス２倍の標準偏差値と、試料の平均値マイナス２倍の標準偏差値との差（デ ルタ）として表す。 デルタが０より大きい場合、試料は陽性であるとみなされる。 １１１Ｖプローブの標準曲線から得られる結果を表

【に示す。これらの結果より 、これらのプローブの能力は、５０ｔ＋ｎｏｌの旧ＶＤＮＡ標準から検出し始め ることが分かった。 （以下余白） ヒｍｏｌ　／　＋’ｏ、＃ １０　−０．５６ 実ｍ Ｉｔ　Ｉ　ＶウィルスＲＮＡの− １１１Ｖ　ＲＮＡを、」−記と本質的に同じ手１ｔｌｆｉを用いて、以下の改変 を行って検出した。 ）１１Ｖ　ＲＮＡの標準曲線を、１（ＩＶウィルス貯蔵品を正常ヒト血清で１２ ５〜５０００ＴＣＩＤ５ｔ＋／ｍｌの間の範囲に連続的に希釈することにより調 製した（ＴＣＩＤ５［１は、５０％の組織培養物が感染する用量の終点である） 。ｌｏｍｇのプロテイナーゼＫを、−２０°Ｃて貯蔵したポルムアミド中で７％ にした５ｍｌの旧Ｖ１７ＭＩ希釈剤（５３ｍＭ）リス）ＩＣＩ、ｐＨ８／　１０ ．６ｍＭ　ＥＤＴＡ／　１．３％ＳＤＳ／　１６　ｕ　ｇ／ｍ＋音波処理サケ精 すＤＮＡ／’５．３Ｘ　ＳＳＣ／　１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に加えるこ とにより、プロテイナーセに溶液を調製した。捕獲プローブ、標識プローブ、お よびスペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を、各プローブの最終濃度か １６７０ｆｍｏｌ／ｍｌとなるようなブロテイナーセに溶液に加えた。上記のよ うに調製したマイーゼに溶液を３０μｍずっ加えた後、各ウェルに適当なウィル ス希釈物を１０μｍずっ加えた。プレートを覆い、振盪して混合し、次いで６５ ℃で１６時間インキコベートした。 プレートをインキュベーターから取り出し、ベンチトップで１ｏ分間冷却した。 ウェルを、上記実施例２に記載のようにして２回洗浄した。１５×３マルチマー をＡｍｐ／Ｌａｂｅｌ希釈剤テ１ｆｍｏｌ／μＩに希釈した（　２．２２＋ｇｌ 　ＤＥＰＣ処理Ｈ２０（ＤＥＰＣはジエチルピロカルボネート）、１．３５ｍ１ １７）　１０％ＳＤＳ、　２４０μｌの１ＭトリスｐＨ８゜０．２０μｌのウマ 血清を混合することにより調製し、プロティナーゼに中２ｍｇ／ｍｌに調整して ６５”Ｃで２時間加熱し、次いでこれを２４０μｍの０．１Ｍ　ＰＭＳＦに加え て３７℃で１時間加熱し、この後、４ｍｌのＤＥＰＣ処理１１２０．４ｍｌのｌ Ｏ％ＳＤＳ、および８ｍｌの２０Ｘ　ＳＳＣを加えた）。希釈した１５×３マル チマーを４０μｌ／ウエルで加え、プレートを封じ、振盪し、５５℃で３０分間 インキュベートした。 次いでプレートを室温で１０分間冷却し、上記のように洗浄した。アルカリホス ファターゼ標識プローブをＡｍｐ／Ｌａｂｅｌ希釈剤で２．５ｆｍｏｌ／μｍに 希釈し、各ウェルに４０μｍを加えた。プレートを覆い、振盪し、５５°Ｃで１ ５分間インキュベートシタ。 プレートを室温で１０分間冷却し、上記のように２回洗浄し、次いて０．１５Ｍ 　ＮａＣ１１０，０１５Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄した。基質を加え、発 光を上記のようにして測定した。アッセイの感度は、以下の表に示したように約 １．２５丁ＣＩＤｃｏであった。 −に−一＝ １０．００　１４．１０ ５０．００　９０．７０ 尖淘Ｉ【± クラス　−５プローブセットと　プローブセ　ト友！υし較 Ｈ１’／　ＲＮＡを、以下の改変を行ったこと以外は、実施例３と本質的に同じ 手順を用いて検出した。ＲＮＡ標準は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて、プ ラスミドｐＢＨＢＫ１０ｓ　（Ｃｈａｎｇ、　Ｐ、Ｓ、ら、山ｎ、　Ｂｉｏｔｅ ｃｈ、　２：２３．１９９０）からの９．０ＫＢの旧■転写物の転写により調製 した。この旧Ｖ　ＲＮＡを、ＨＡＰクロマトグラフィーにより捕獲されたｇａｇ プローブおよびｐａｌプローブとのハイブリダイゼーションにより定量した。Ｒ ＮＡ＋Ｍｔ＝を、上記のプロテイナーゼに希釈剤で１ｍｌ当り２５〜ＩＱＯａｔ ｏｍｏｌＯ間の範囲に連続的に希釈し、捕獲プローブ、標識プローブ、およびス ペーサーオリゴヌクレオチドの等モル混合物を加え、各プローブの最終濃度が１ ６７０ｆｍｏｌ／ｍｌとなるようにした。捕獲プローブと標識プローブとの２つ の配置をテストした：分散（ｓｃａｔ　Ｌｅｒｅｄ）捕獲プローブ（捕獲プロー ブには４Ｍ識プローブが散在している）およびクラスター形成捕獲プローブ（捕 獲プローブは４Ｍ識プローブに関して連続したクラスターの形で配置されている ）。 クラスター形成プローブのセットを、以下に示す。 Ｈ工ｖ、１１７　ｔ　ｈニジ２す’／ｂ’ｙ　：　１ｓ）−ＡＴＴＡＡＧＹＴＣ ＹＣＴＧＡＡＡＴＣｒＡＣｒＡＲＴＴＴｌ（ｒＶ、１１．８　（を己タ゛１４’ ＋：４７＋ＴＡＴＴＣＣＴ′鳩テ田仏ロアｃｃαｕ減ＴαπＡＧＴＨｒｖ、１１ ９＜　１ｋＪ１４％　：４８）ＡＣＷＹＴＧＧＡＡＴＡＴＹＧＣＹＧＧＴＧＡＴ ＣＣＴｒＴＣＣＡＹＣＣＨ工Ｖ、１２０　（智オ場も＝１６） ＴＫＴＴＹＴＭＡＲＧＧＹＴＣＹＡＡＧＡＴＴｒＴｒＧＴＣＡＴＲＣＴ肘ｖ、１ ｓ５　（忙〃油も：４１） Ｈｘｖ、１ｓ７＜　１例＃ｇ　：４３）Ｈｒｖ、１ｓｓ　ｔ　ｌｒｕ’１４’＋ 　：４４）Ｈ工ｖ、１ｓ９＜　５ｊ１’ａ％＝ｓ４＞ｇｒｖ、１ｏｑ　＜　ｕｌ 酢’＋　＝５１ＴｒＣＣＴＧＧＣＡＭＹＹＹＡＴＫＴσｒ’ＹＣＴＡＭＴＡσｍ ＴＡ？Ｈ工Ｖ、１４５　（卯Ｊ１重も、３３）ＤＧＡＴＷＡＹＴＴＴＴＣＣＴＴ ＣＹＡＲＡ爬ＴＧＴＡＣＭＴＣＴＡＨ工Ｖ、１４６　（牝列−１ｉも＝３４）Ｃ ＴＡＴＲＴＡＸ：ＣＣＡＣＴＲＧＣＹＡＣＡＴＧＲＡＣＴ’ＧＣＴＡＣＹＡａｒ ｖ−１４７（ｄオｉ４Ｌり　：３５１ＣＹＴＧＹＣＣＴＧＴＹＴＣＴＧ（コ刀ｕ πＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＨ工Ｖ、１４９　（卯か１伶も：３６）ＴＧＳ　ＫＧＣ ’ＣＡＴＴＧＴＣＴＧＴＡＴＧＴＡｎ玉別了胃八σ℃Ｈ工ｖ、１ｓｏ　（ｒ＃博 ”＋　：へ３）ＡＡＣＡＧＧＯ）ＧＣＹＴｒＡＡＣＹＧＹＡＧＹＡＣＴＧＧＴＧ ＡＡＡＴＨ工Ｖ、１５１　（配９）悉も：３７）ＧＡＡＴＫＣＣＡＡＡＴＴＣＣ ＴＧＹＴＴＲＡＴＩ（ＣＣＨＧＣαＵＣＣＨＩＶ、１５２　（ｕｕｉｉ！５：３ ｅ＋ＡＴＴＣＹＡＹＴＡＣＹＣＣＴＴＧＡＣｖｖｒＧＧＧＧＲＴＴＧＴＡＧＧＨ 工ｖ、１ｓ３［＠Ｌｌ）＠”ｙ　：３９）ＧＢＣＣＴＡＴＲＡＴＴＴＫＣＴＴＴ ＡＡＴｒＣＨＴＴＡＴＴＣＡＴＡＧＨ工Ｖ、１５４　（訴１’１ｆＮｙ　：４０ ）σｒＳＴＣＴＴＡＡＧＲＴＧＹＴＣＡＧＣＹＴＧＭＴＣＴＣＴＴＡ○Ｔ３０μ ｌの分析物／′プローブ／プロテイナーゼに溶液を各ウェルに加えた後、１０μ ｍの正常ヒト１ｍ／ｌＩＩを加え、実施例３に記載のようにアッセイを行った。 表ＩＩ＋に示すように、分散捕獲配置に対するクラスター形成捕獲配置を用いる アッセイの感度は、類似していた。クラスター形成捕獲伸長物を用いると、感度 は５０〜ｌｏｏｔｍｏｌであるか、分散捕穫伸長物を用いると、感度は１００〜 ５００ｔｍｏｌてあった。 上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリタイセーン ヨンアノセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の 範囲の範囲内に含まれることが意図される。 （以下余白） 配列表 （１）一般的ｔｎ報・ （ｉｌ出願人：アーウ゛イン、　ブルースディー。 （１１、発明の名１：ｒ　：溶液…サノドイノチハイプリダイゼ−７ｇンア、セ イ１．ＪｌいるためのＩＩＩＶプローブ （ｉｉｉ）配列数・６３ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）住所人：モリノンアンドフォースター（Ｒ）番地　ページ　ミルロード７ ５５（Ｃ）市：パロアルト （Ｄン州：力言ノフォルニア （Ｅ）国　アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４３０４−１０１８（ｖ）フッピユータ−読み出し形管： （Ａ）媒体型：フロノビ−ディスク （Ｂ）　）　７ピユーター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用ＩＣ）を引１／：ｌチムニＰ Ｃ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア。パテノドイノリリース！１．Ｏ ，バージョン＃１２５（ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願＃号：　０７７Ｂ１３．５８３（Ｂ）出願日　１９９１年１２月２３ 日（Ｃ）分類： （ν１１１）代理人２事務所情報 （Ａ）氏名　トーツス　イー　／オノティ（Ｂ＋合合量番号２１．０１３ ｆｃ）Ｍ会　Ｍ己録＃号：　２２３００−２０１５０．００（ｉｘ）Ｔ１話回線 ｔ、’ｙ報： （＾）電話：　４１５−８１３−５６００（Ｒ）　ｆ　し７　ｙ　ノ’）　７． 　：　４１５−４９４−０７９２（Ｃ１ｆ　Ｌ＝　）’）　ス：　７０６１４１ （２）配りク番号・１の情報： （］）配列の特色： （Ａ）長さ＝２４塩基λ１ （８１梨：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列、配列番号Ｉ： （２）配列番号２のｆｎ報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ　６ｏ塩基λノ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−水路 （Ｘｌ）配列：配列番号２： 鎧−コＴＣＧ’ＴＡ−−τ富＝ｃ　ＧＴＡｍ−ＴＣ宿−７ＡＣＴＴＧＣＧＴｈＧ 　Ｇ。 （２）配列＃号３の情報。 （ｉ）配ツリの特色 （Ａｌ長さ　１６塩基χ１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （買１）配列・配列番号３： （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 〈Ｄ）トヂロノー、直鎖状 （ｘｌ）配列・配列番号４ （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）梨：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｘｌ）配列・配列番号５： ＴＴ；σＴＧＧＣＡＡ　ＡＹＹＹＡτｍ　ＹＣＴＡｌｆｒＡ（ｍｌｉ　ＴＡ丁（ ２）配列番号６の情報。 （ｉ）配列の特色・ （＾）長さ：３３塩基′ｉ、１ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トボロノー　直鎖状 １Ｇ　’　（ｘｉ）配列：配列番号６：（２）配列番号７の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トヂロジー°直鎖状 １２　（ｘｉ）配列：配列番号７・ に−’ＡＴ／ＴＧＡＴＣＲ丁ＡＹＴσＴｃＹＹ　ＡＣＴＴ丁ＣＡＴＡＡ　ＡＡＣ ］３（２）配列番号８の情報・ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｂ）型＝核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二面鎖状 Ｄ　（ｘｉ）配列：配列番号８： Ｇ’ＴＴＧＡＣＡＧＧＹ　（ｒＡＧＧＴｃｃＴＡ　（ＹＡＡＴＡＹＴＧＴ　ＡＣ Ｃ３３（２）配列番号９の情報： （１）配列の特色・ （Ａ）長さ　３３塩基対 （１３）型＝核酸 （Ｃ）鎖の数、−水路 （Ｄ日ｆロノー・直鎖状 （ｘｌ）配列・配列番号９： ＴＴＣＡＡＴＡＯＧＲＣＴＡＡＴＫＧＧＲＡ　ＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴ　ＲＣＡ　 ３３（２）配列番号１０の情ｔｉｉ： （ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂ１間、核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ日ポロノー・直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号１０： ＹＴＣＴＧＴＣＡＡτＧＧＣＣＡＴＴＧＴｒ　ＴＲＡＣｎ’ＴＴＧＧ　ＧＣＣＢ （２）配列番号１１の情報・ （１）配列の特色・ （Ａｌ長さ・３３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｘｌ）配列　配列番号１１゜ ７にＴＡＣＡＷＡＴＹ　ＴＣＴ’ＲＹＴＡＡＴＧ　ＣＴＴＴＴＡＴＴＴτ　ＹＴ Ｃコ３（２）配列番号１２の情報： （１）配列の特色。 （Ａ）長さ＝３３塩基χｊ （Ｂｌ型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｙｉ）配列：配列番号１２・ ＡＡＹＴＴｒＴＧＡＡ　ＡＴＴｒＴＹＣｃ＋？Ｔ　ＣＣＴＴＴｒＣＣＡＴ　ｌ「 ｒＣコ】〈２）配列番号１３の情報： （１）配列の特色： （Ａ）Ｌｅ　：　３３Ｉｓ基χ１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ〉トポロジー二直鎖状 （ｘｌ）配列・配列番号１３： ＡＡＡＴＡＹＸＧ’ＸＡ　Ｇ’ＴＡＴＴ’ＲＴＡＴＧ　ＧＡＴＴ’ＹＴＣＡＧＧ 　ＣＣＣコ３（２）配列番号１４の情報： （Ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ：３３塩ｔＡスｊ （Ｂｊ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号１４： （２）配列番号１５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基列 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （［１）　）　ｆロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列・配列番号１５、 （２）配列番号１６の情報・ （ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ１配列：配列番号１６： （２）配列番号Ｉ７の情報： （ｉ）配列の特色。 （Ａ）長さ　３３塩基対 ＦＢ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数＝一本水 路Ｄ）トポロジー：直鎖状 ３３（買！）配列：配列番号１７： こＡＴＧＴＡＴＴＧＡ　ＴＡｆ）ＡＴＲＡＹＹＡ　ＴＫＴＣＴＧＧＡＴＴ　ｍ（ ２）配ツ１１番号１８の情報・ （ｉ）配列の特色： （＾）長さ：３３塩拭λ１ （Ｂ巳！Ｉ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー−１１！鎖状 、、　（ｘｉ）配列　配列番号１δ： （２４配列番号１ｇの情報； （ｉ）配列の特色＝ （Ａ）長さ、３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー。直鎖状 １３（ｘｉ）配列：配列番号１９： ＴＣＴＹＡＲＹＴＣＣＴＣＴＡｆｌ　ＹＴＣ’ｒＡＴＧＣ’ＴＯＹＹＣ（２）配 列番号−２０の情報： （１）配列の特色。 （Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ＞鎖の数・−水路 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列、配列番号２０： に（吋頃π石ＲＧＧｉ買α７０ω冗ロ買πにτＣＨり２）配列番号２＋の情報： （１）配列の特色 （Ａ）長さ　３３塩基スＪ （Ｒ１型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｋ１）配フリ：配列計号２１： ＴＲＧＣＴＧＣＹＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＡＧ　ＡＡＶＧＴＩＴＣＴＧ　ｙＣ１３ （２）配列番号ｚ２の情報 （１）配列の特色・ （Ａ）長さ、３３塩基ス１ （Ｂｊ型：核酸 （Ｃ＞鎖の数ニー水路 （Ｄ）トボロノー、直鎖状 （×１）配列　配ソリ番号２２・ ＣＡＣＡＡＣＴｒＴＹ　ＴＧ″ｒＣｒ１＋ＣＣＡＹ　ＴＧＴＹＡＧＴＷＡＪ　Ａ τＡ　１３（２）配列番号２３の情報・ （１）配列の特色・ 儲）長さ：３３塩基対 （Ｒ）型；核酸 （Ｃ）鎖のＶニー水路 （Ｄ）トポロジー二直鎖伏 （ｘｌ）配列：配り■１番号２３・ ＹＧＡＡＴＣＣＴＧＹ　ＡＡＶＧＣＴＡＲＲＴ　ＤＡＡＴＴＯＣＴＴＣτｋｋ　 ３３（２）配列番号２４の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ・３３塩基χ１ （Ｂｌ型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー。直鎖状 （Ｘｌ）配列：配列番号２４： ＣτＹＡＣＴＡＴｆｌＴ　ＴＴＡＣＴＴＣＩ’ｌｔＲＴＣＣ，３（２）配列番号 、２５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−水路 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５　：τＡＴＴＡＴＴＴ’：孤ロ詰う Ａν石石−宵ひσロ　３３（２）配列番号２６の情報。 りＩ）配列の特色・ （Ａ）長さ・３３塩基ズ１ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号２６・ ＣＡｒＪＲＴ朋λコＴＴＴＴＣＣＴｔＴＴ　’ｒｔＡＴｒＡＲｒｒＧ　ｒｒｃ　 ３］（２）配列番号２７の情報・ （１）配ツ１ｊの特色： （Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂｌを：ｔＳ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号２７− ＴＣＣＴＣＣＡＡＴＹ　Ｃ口−テ■にＣＴＧＧＴＡＣＣＣＡ　’ｒＧ４　３３（ ２）配列番号・２８の情報： （ｉ＞配列の特色： （Ａ＞長さ・３３塩基対 （Ｂ）型・ｔＳ酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トポロジー二面鎖状 （×１）配列　配列番号２８・ ’ＭＯ１ｌＢＩｕＣＴＧ　ＡＣＴＡＡＴＴｒＡＴ　ＣＴＡＣＴＴＧ’ＴＴＣＡＴ Ｔ　コ〕＜２）配列番号２ｇの情報； （ｉ）配列の特色： （＾）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号２９゜ ＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡ　Ｔｌ’ＹＡＡＡＡＡＴＡ　ＧＹＡＹｆｆｒＹＣＴ　ＧＡ Ｔ　３３（２）配列番号３０の情報： （ｉ）配列の特色； （Ａ）長さ：３３塩基スＩ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （！１）配列：配列番号３０： ＧＴＧＧＹＡＧＲＴｒ　ＡＡＡＲＴＣＡＹＴＡ　ＧＣＣｋＴ’ＴＣＣτＹ　丁Ｃ Ｃ３１（２）配列番号３１のｔＦ１報： （＋）配列の特色； （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄトポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号３１： ＣＡＣＡＧＣＴｍ、ＧＣＴＡＣＴＡπｒｌ賀ＧＣＴＡＣＹＡ　ＹＲＧ　１３〈２ ）配列番号３２の情報＝ （ｉ）配列の特色。 （Ａ）長さ＝３３場基り１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ＞鎖の数ニー木箱 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配フ１１・配フｊ１番号３２：Ｒ”ｎ’ＣＣＣＡＴＡＴ　ＹＣＣＫＧＧ ＲＣＴＡ　ＣＡＲＴ（ゴＡＣＴＴ　ＧＴＣ１１（２）配列番号３３の情報： （１）配列の特色； （Ａ）長さ＝３３塩基対 （［１）型：し酸 ＦＣ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ＞　ｌ−イロノー　直鎖状 〈χ１）配列、配列＠号３３゜ ＷＴ’ｔＬＭ”ｒＴＴ　ＴＣＣ’ｒＴＣＹＡＲＡ　ＴＧＴＧＴＡＣＡＡＴσＡ３ １（２）配列番号３４の情報： （１）配列の特色・ （、Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）ν　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号３４ ＣＴＡ丁’ＲＴＡＸＣＣＡＣＴ’ＲＧＣＹＡＣＡ　ＴＧＲＡＣＴＧＣＴＡ　ＣＹ Ａ　３３（２）配列番号３Ｓの情報。 ＜ｉ）配列の特色： （八）長さ　：　３３塩ｒ＆文１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号３５： ａ↑茸ＣＣＫ；Ｔ　ＹＴＣＴＧＣＴＧＧＲＡＴＤＡＣＴＴＣＩ℃０了　３３（２ ）配列番号３６の情報： り１）配列の特色： （Ａ）長さ２３３塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号３６： 丁’５ＳＫＧＣＣＡＴＴ　σ蓋コｆｒＡ′ｒＹ７ｒＡＹＴＲＹＴｆｒＴＡ　Ｃ’ １℃　１］（２）配列番号３７の情報： （１）配列の特色； ＜Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂｌ型、核酸 ｔｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号３７： ＧＡＡＴＫＣＣＡＡＡ　ＴＴＣＣＴＧＴｒＴＲＡＴＨＣＯＩＧＣＣＣＡＣＣ（２ ）配列番号３８のｆ＾報： （！〉配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ＞配ツ；１：配列番号３８： （２）配列番号３９の情報。 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ１間：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列　配列番号３９： ０狂工τＡＴＰ、Ａτ丁コαコゴτＡＡＴ　ＴｌコｄτＡτ■スＴＡＧ（２）配 列番号４０の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基ス１ ＣＢ）型：核酸 （Ｃ＞鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 〕３（ｘｉ）配列：配列番号４０： ＣＴＳτＣＴＴＡＡＧ　Ｒ１’ｌ□コて：ＴｒＡ　ＣＹ’ｒ（２）配列番号−４ １の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 ＜Ｃ）鎖の数−一本鎖 ＣＤ＋　）　ｆｆ１ロノー・直鎖状 ３３　（ｘｉ）配列：配列番号４１゜ ＴＡ）ＡＡＴＴ’Ｇ’ｒ’Ｇ　ＲＡｆＲＡＡＹＡＣＴ　ＧＣＣＡＴＴｒ’ＧＴＡ 　ＣＷＧ（２）配列番号４２の情報二 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）梨：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）　ト＋ロジー：直鎖状 １３　（ｘｉｌ配列：配列番号、４２：Ｃ’ｒＧＣＡｃｒ′ＧＴＡ　ＹＣＣＣＣ ＣＡＡπｃｃｃｃｒｒｒｒｒｃ　’ｒｒｒ（２）配列番号４３の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ、３３塩基χ１ 〈８）型　核酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トイロジー：ｆ■鎖１人 （１１）配列・配列番号へ３・ ’ｒａ”ｙ工１ＴＷＧｃ　ＴＡτＹＡＴＲＹＣＴ　ＡＹＴＮττσｌｌＴ’ｒ　 ＣＣＣ３１（２）配列番号４４の情報： （１）配列の特色８ （Ａ）長さ°３３塩基対 （１’ｌ）’！！Ｉ　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （×１）配列、配ツリ番号４４： ππ畝π司■７フ１鯨Ｔπτ７ＡＩｆｆゴ石Ａ　］］（２）配列番号４５の情報 ・ （１）配列の特色・ （Ａ）長さ・３３塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トヂロノー：ｆＪ鎖状 （Ｘｌ）配列：配列番号４５： Ｃ２τ■πＣππ＝閣Ｔ疹ごコニ＝Ａ〕３（２）配列番号４６の情報・ （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ・３３塩基ス１ （Ｒ）’！！！：該酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー。直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号４６： ＡＴＣＣＡＴＹＣＣＴ　ＧＧＣＴＴＴＡＡＴ’ｒ　ＴＴＡＣＴＧＧ丁ＡＣＡσＴ 　３３（２）配列番号４７の（ＦＪ報： （Ｉ）配列の特色： ＋Ａｌ長さ：３３塩基ンｌ ＣＢ＋型：核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （Ｘｌ）配列：配列番号４７ τＡＴＴＣＣＴＡＡＹ　ＴＧＲＡＣＴＴＣＣＣＡＲＡＡＲＴ！コ１℃入π〕３（ ２）配列番号４８の情報： （１）配列の特色・ （１へ）長さ：３３塩基対 ｆＢ）型、核酸 （ＣａＦＩｉの数ニ一本漬 （Ｄ）トヂロジー、直鎖状 （Ｘｌ）配列・配列番号４８・ Ｍ？１’ＴＧＧＡＡＴ　ＡＴＹＧＣＹＧＧ’ｌｎ　ＡＴＣＣ’１ＴＴＣＣＩ　Ｙ ＣＣコＪ（２）配列番号４９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｂ）型、１１３酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （ｘｌ）配列・配列番号４ｇ・ αｍＡ’ｍ”ＲＴＣＡ　ＧＧ！　ＣｋＴＭＣＣＣＡＴαス　３〕（２）配列番号 ５０の情報・ 〈１）配列の特色： （八）長さ　：　３３＃！基対 （Ｂ）型・核酸 ｔｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トヂロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号５０・ ＣＴＪＬＴＴＡＴＧＧＧ　［ＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＹＡ　３コ（２）配列番号 ５１の情報： （ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ＝３３塩基対 ＋８）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 〈ｘｌ）配列：配列番号５１： （２）配列番号５２のｆ＾報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ；３３塩基スｊ （Ｂ）梨：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トヂロノー：ｌｌｉ！ｊ鎖状 （ｘｉ）配列−配列番号５２： Ｃｌ１ｔＴＯＣＡＴＧＧＣ丁ＴＣＹＣＣＴＴＴＴ　ＡＧＴｒＧＲＣＡＴＴ　丁Ａ Ｔ　３３（２）配列番号５３の情報・ 〈１）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ１鎖の数−一本鎖 （ｐ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号５３： ＡＡＣＡＧＧｃＤＧＣＹＴ？ＡＡ（ＹＧＹＡ　ＧＹＡＣＴＧＧＴＣＡ　ＡＩＬＴ 　コ３（２）配列番号５４の情報： （＋）配列の特色； （Ａ）長さ：３３塩基月 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数・一本漬 （Ｄ）トｆロノー６直鎖状 （ｘｉ）配列　配列番号５４： （２）配列番号５５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本漬 （Ｄ）トヂロノー：直鎖状 （買ｌ）配り＋ｌ：配フ＋１番号５５：ＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡ　ＣＣ！　２０ （２）配列番号５６の情報： （１）配列の特色＝ （Ａ）長さ・２０塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 〈ｐ））ゾロノー、直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号５６： （２）配列番号５７の情報・ （ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ・２９塩基対 （Ｒ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 〈ｘｌ）配列：配列番号５７： （２）配列番号５８の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：　３３＃Ａ基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列；配り１１番号５Ｂ： Ｖ亡ＣＡＡＫＣＴＧＲＧＴＣＡＡＣＡＤＡ丁　Ｔｒ’ＣｆＴＣＣＲＡ丁　ＴＡＴ 　３３（２）配列番号５９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｒ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 （ｘｌ）配列：配列番号５９： πヶＶカπＡ顛ＹＣＣαスσ宵荷ＹＡＱＡＴＧ　ＹＹＳ　３３（２）配列番号６ ０の情報： （ｉ）配列の特色・ （Ａ）長さ：Ｚｇ塩基ス１ ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本漬 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号も０・ ＴＣσ１’ＧＣｉゴＴＴ　ＣＣＹＷ！７ｒＴｒＡＧ　ＴＩＴＣＹＣＴ’ＲＹ（２ ）配列番号６１の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基２１ （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−末鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （×１）配列：配列番号６１： 丁αＡ’ｒＴｒＧＴＹＧ　ＴＤ’１ｍＫＫＴＩＷＩ　ＲＧｔｌ（２）配列番号６ ２の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：　３７＃１基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本漬 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （×１）配列２配列番号６Ｚ・ ＡＡＴｎ’１ＹＴＧＴＧ　ＡＴＡＴＴＴＹＴＣＡ　ＴＧＤＴＯ（ＴＣＴτＧＲＧ ＣＣＴｒ（２）配フ１１番号６３の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ＝３９塩基λ１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ１鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （貰１）配列：配列番号６３： 〕１ −−ｇ−ｂ穎五」尚　・　丑１．７＋　、３ｊ知財旦失フ？４ルのフイ７゛　、 合成　ワククル　一ノフイＩしの？４ｆ　：　本□［ｔ　炙−＆ｙ・１−、ン卜 不いフイフ′　：　今冬、ゴ　）”ｌメ１７＋−イし〜Ｊイ１：　川へ給纜１・ ・代ＳＴＯＰＰＥＰ　ｆ１９　２７．１９９＋　９８　２７．１９９１　ｏｈｅ ｓｌｌ＠３　ａ７ｅ＋、１９８１；　ｉ１７　Ｇ＋、　！８６〃ヂＬノ７フイフ ’：ｉｐ”ｈｊＨ’ｌ−や仲、ｌ５Ｎ−２８Ｂ　２７．１９９１　９８　２７． １９９１　−　＋ｓｘ−＋　ａｓ　２７．　ｌ！！’Ｉｔ　ｅｅ　２７．１９９ １（〕（句、１８痰り２１ （次亀Ｉ；条Σり、） （災訂、を杖（，１ （ン’ｉ＠、＋：　ノ５１に二＜、） （７で丸くもと＜、　１ （７屡り、襠久、） ＋　、−、Ｔ−Ｇｔｌ−粂しく２　） （工久丁光白） （仄（１２硬く、） ０ん下余白） （トムエ余白） （ｙ大王牟、色） （」人壬、４≧白） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５６６ 　９０１５−２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ （７２）発明者　アーデア、マイケル　ニス。 アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５０７゜アラモ、バンス　メドウ　ロー ド　１００Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅 プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 該オリゴヌクレオチドは、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列 を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からな る群から選択される、 合成オリゴヌクレオチド： 【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：５） 【配列があります】（配列番号：６） 【配列があります】（配列番号：７） 【配列があります】（配列番号：８） 【配列があります】（配列番号：９） 【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：１０） 【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２） 【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１７） 【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９） 【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：４９） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：２１） 【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３） 【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：５１） 【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６） 【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８） 【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０） 【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：５２） 【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３） 【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５） 【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：５３） 【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８） 【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４０） ２．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）を含む、請 求項１に記載の合成オリゴヌクレオチド。 ３．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕獲 プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 核合成オリゴヌクレオチドは、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む 第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群か ら選択される、 合成オリゴヌクレオチド： 【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５） 【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８） 【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：４１） 【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３） 【配列があります】（配列番号：４４）【配列があります】（配列番号：５４） ４．前記第二セグメントが、（配列 番号：５６）を含む、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチド。 ５．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増幅 プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 該オリゴヌクレオチドは、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 核酸マルチマーのオリヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド列を含 む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群 から選択される、 合成オリゴヌクレオチド： 【配列があります】（配列番号：５） 【配列があります】（配列番号：６） 【配列があります】（配列番号：７） 【配列があります】（配列番号：８） 【配列があります】（配列番号：９） 【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１） 【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３） 【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５） 【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７） 【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９） 【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１） 【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３） 【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５） 【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７） 【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９） 【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１） 【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３） 【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５） 【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７） 【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９） 【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１） 【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３） 【配列があります】（配列番号：４４）６．前記第二セグメントが、【配列があ ります】（配列番号：５５）を含む請求項５に記載の合成オリゴヌクレオチド。 ７．ＨＩＶに対するサンドイッチハイ ブリダイゼーションアッ セイにおける捕獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 該合成オリゴヌクレオチドは、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む 第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群か ら選択される、 合成オリゴヌクレオチド： 【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６） 【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８） 【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０） 【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２） 【配列があります】（配列番号：５３）【配列があります】（配列番号：５４） ８．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５６）を含む、請 求項７に記載の合成オリゴヌクレオチド。 ９．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペ ーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 該合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグ メントを含み、 ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下からなる群から選択される、 合成オリゴヌクレオチド： 【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０） 【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２） 【配列があります】（配列番号：６３）１０．ＨＩＶに対するサンドイッチハイ ブリダイゼーシヨンアッセイにおける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌク レオチドのセットであって、該セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、 ここで、該セットの各メンバーが、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列 を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列 である、合成オリゴヌクレオチドのセット 【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：５） 【配列があります】（配列番号：６） 【配列があります】（配列番号：７） 【配列があります】（配列番号：８） 【配列があります】（配列番号：９） 【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：１０） 【配列があります】（配列番号：１１）【配列があります】（配列番号：１２） 【配列があります】（配列番号：１３）【配列があります】（配列番号：１７） 【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９） 【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：４９） 【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：２１） 【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３） 【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：５１） 【配列があります】（配列番号：２５）【配列があります】（配列番号：２６） 【配列があります】（配列番号：２７）【配列があります】（配列番号：２８） 【配列があります】（配列番号：２９）【配列があります】（配列番号：３０） 【配列があります】（配列番号：３１）【配列があります】（配列番号：５２） 【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３） 【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５） 【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：５３） 【配列があります】（配列番号：３７）【配列があります】（配列番号：３８） 【配列があります】（配列番号：３９）【配列があります】（配列番号：４９） １１．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５５）を含む、 請求項１０に記載の合成オリゴヌクレオチドのセット。 １２．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける捕 獲プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットは ２つのオリゴヌクレオチドを含み、 ここで、該セットの各メンバーが、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む 第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である 、合成オリゴヌクレオチドのセット： 【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５） 【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８） 【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：４１） 【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３） 【配列があります】（配列番号：４４）【配列があります】（配列番号：５４） １３．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５６）を含む、 請求項１２に記載の合成オリゴヌクレオチドのセット。 １４．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおける増 幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットは ２つのオリゴヌクレオチドを含み、 ここで、該セットの各メンバーが、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列 を含む第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列 である、合成オリゴヌクレオチドのセット： 【配列があります】（配列番号：５） 【配列があります】（配列番号：６） 【配列があります】（配列番号：７） 【配列があります】（配列番号：８） 【配列があります】（配列番号：９） 【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１） 【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３） 【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５） 【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７） 【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９） 【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１） 【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３） 【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５） 【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７） 【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９） 【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１） 【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３） 【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５） 【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７） 【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９） 【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１） 【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３） 【配列があります】（配列番号：４４）１５．前記第二セグメントが、【配列が あります】（配列番号：５５）を含む、請求項１４に記載の合成オリゴヌクレオ チドのセット。 １６．ＨＩＶ対するサンドイッチハイブリダイゼーシヨンアッセイにおける捕獲 プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであって、該セットは２ つのオリゴヌクレオチドを含み、 ここで、該セットの各メンバーが、 ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメ ント、および、 固相に結合したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む 第二セグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である 、合成オリゴヌクレオチドのセット： 【配列があります】（配列番号：４５）【配列があります】（配列番号：４６） 【配列があります】（配列番号：４７）【配列があります】（配列番号：４８） 【配列があります】（配列番号：４９）【配列があります】（配列番号：５０） 【配列があります】（配列番号：５１）【配列があります】（配列番号：５２） 【配列があります】（配列番号：５３）【配列があります】（配列番号：５４） １７．前記第二セグメントが、【配列があります】（配列番号：５６）を含む、 請求項１６に記載の合成オリゴヌクレオオチドのセット。 １８．ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるス ペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットであ って、該セットは２つのオリゴヌクレオチドを含み、 ここで、該合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補 的なセグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である 、合成オリゴヌクレオチドのセット： 【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０） 【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２） 【配列があります】（配列番号：６３）１９．試料中のＨＩＶの存在を検出する ための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアツセイであって、以下の工程 を包含する、アッセイ： （ａ）該試料を、過剰の（ｉ）請求項１０に記載の合成オリゴヌクレオチドのセ ットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドの セットと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該捕 獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ−１核酸のセグメントに実質的に相補 的であるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリ ゴヌクレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程； （ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブ リダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物 質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、 ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増 幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくと も１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的な 相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）非結合マル チマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌ クレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識 オリゴヌクレオチドを除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。 ２０．試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼ ーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ： （ａ）核試料を、過剰の（ｉ）請求項１４に記載の合成オリゴヌクレオチドのセ ットを含む増幅プローブ、および、（ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドの セットと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該捕 獲プローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的で あるヌクレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌ クレオチドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、工程； （ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイブ リダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない物 質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマーと、 ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが、増 幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少なくと も１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質的に 相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）非結合マル チマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリゴヌ クレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合標識 オリゴヌクレオチドを除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。 ２１．請求項１９に記載の溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで あって、 ここで、工程（ａ）が、前記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイ ゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オ リゴヌクレオチドのセットと接触させる工程をさらに包含し、該セットが、２つ のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、核合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核 酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セ グメントが、以下の配列である、アッセイ： 【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０） 【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２） 【配列があります】（配列番号：６３）２２．請求項２０に記載の溶液サンドイ ッチハイブリダイゼーションアシセイであって、 ここで、工程（ａ）が、前記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイブリダイ ゼーシコンアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用な合成オ リゴヌクレオチドのセットと接触させる工程をさらに包含し、核セットが、２つ のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核 酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで、該ＨＩＶ核酸セ グメントが、以下の配列である、アッセイ： 【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０） 【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２） 【配列があります】（配列番号：６３）２３．試料中のＨＩＶの存在を検出する ための溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程 を包含する、アッセイ： （ａ）該試料を、過剰の（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットおよび （ｉ）請求項１２に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プローブ と、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該増幅プロ ーブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレ オチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチ ド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工程 ；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハイ ブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｃ）その後、固相に結合していない 物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、該核酸マルチマー と、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが 、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少な くとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質 的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程； （ｅ）非結合マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物 を、標識オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程； （ｇ）非結合標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。 ２４．試料中のＨＩＶの存在を検出するための溶液サンドイッチハイブリダイゼ ーションアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ： （ａ）該試料を、過剰の（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセツトおよび （ｉｉ）請求項１６に記載の合成オリゴヌクレオチドのセットを含む捕獲プロー ブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、ここで、該増幅プ ローブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌク レオチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオ チド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、工 程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、固相に結合した該オリゴヌクレオチドと、ハ イブリダイズする条件下で接触させる工程：（ｃ）その後、固相に結合していな い物質を分離する工程；（ｄ）工程（ｃ）の結合した生成物を、核酸マルチマー と、ハイブリダイゼーシヨン条件下で接触させる工程であって、該マルチマーが 、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグメントに実質的に相補的である少な くとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および、標識オリゴヌクレオチドに実質 的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオチド単位を含む、工程（ｅ）非結合 マルチマーを除去する工程；（ｆ）工程（ｅ）の固相複合体生成物を、標識オリ ゴヌクレオチドと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｇ）非結合 標識オリゴヌクレオチドを除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体生成物中の標識の存在を検出する工程。 ２５．請求項２３に記載の溶液サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで あって、ここで、工程（ａ）が、前記試料を、ＨＩＶに対するサンドイッチハイ ブリダイゼーシヨンアッセイにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドとして有用 な合成オリゴヌクレオチドのセットのセットと接触させる工程をさらに包含し、 該セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該合成オリゴヌクレオ チドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグメントを含み、ここで 、該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイ：【配列があります 】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８）【配列があります 】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０）【配列があります 】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２）【配列があります 】（配列番号：６３）２６．請求項２４に記載の溶液サンドイッチハイブリダイ ゼーションアッセイであって、ここで、工程（ａ）が、前記試料を、ＨＩＶに対 するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけるスペーサーオリゴヌ クレオチドとして有用な合成オリゴヌクレオチドのセットのセットと接触させる 工程をさらに包含し、該セットが、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、 核合成オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なセグ メントを含み、ここで該ＨＩＶ核酸セグメントが、以下の配列である、アッセイ ：【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８ ）【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０ ）【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２ ）【配列があります】（配列番号：６３）２７．試料中のＨＩＶの検出のための キットであって、以下の組み合わせを含む、キット： （ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットであって、ここで、該増幅プロ ーブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的なヌクレ オチド配列を含む第一セグメント、および、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチ ド単位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第二セグメントを含む、セッ ト： （ｉｉ）捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセツトであって、ここで、捕獲プロ ーブオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ核酸のセグメントに実質的に相補的であるヌ クレオチド配列を含む第一セグメント、および、固相に結合したオリゴヌクレオ チドに実質的に相補的である第二セグメントを含む、セツト；（ｉｉｉ）核酸マ ルチマーであって、該マルチマーが、増幅プローブポリヌクレオチドの第二セグ メントに実質的に相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、およ び、標識オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である多数の第二オリゴヌクレオ チド単位を含む、核酸マルチマー；および（ｉｖ）標識オリゴヌクレオチド。 ２８．スペーサーオリゴヌクレオチドのセットをさらに含む、請求項２７に記載 のキットであって、ここで、該スペーサーオリゴヌクレオチドが、以下を含む群 から選択される、キット： 【配列があります】（配列番号：５７）【配列があります】（配列番号：５８） 【配列があります】（配列番号：５９）【配列があります】（配列番号：６０） 【配列があります】（配列番号：６１）【配列があります】（配列番号：６２） 【配列があります】（配列番号：６３）２９．前記増幅プローブオリゴヌクレオ チドのセットが、請求項１０に記載のセットである、請求項２７に記載のキット 。 ３０．前記増幅プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項１４に記載のセ ットである、請求項２７に記載のキット。 ３１．前記捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項１２に記載のセ ットである、請求項２７に記載のキット。 ３２．前記捕獲プローブオリゴヌクレオチドのセットが、請求項１６に記載のセ ットである、請求項２７に記載のキット。 ３３．それらの使用のための指示書をさらに含む、請求項２７に記載のキット。