JPH06506823A

JPH06506823A - ノーワーク及び関連のウィルスを検出し同定するための方法と試薬

Info

Publication number: JPH06506823A
Application number: JP2515696A
Authority: JP
Inventors: エスタス，メアリー　ケイ．; ジャン，ジ; グレイアム，デェイヴィッド　ワイ．
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1989-11-08
Filing date: 1990-10-30
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: AU6643290A; JP3310281B2; WO1991007502A1; JP2002247998A; US6156883A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称　ノーワーク及び関連のウィルスを検出し同定するための方法と試薬この発明は食品薬品局（ＦＤＡ）の助成及び奨励金により一部支援されている。

発明の分野本発明はノーワーク・ウィルスの合成りローン及びノーワークとその関連のウィルスに対するプローブを作ることに関している。またこの発明はノーワーク及び関連のウィルスの検出及び同定法に関している。

発明の背景ノーワーク・ウィルスは米国における二番目に多い病気である急性腸炎をおこす最も重要なウィルス性病原体の−っである（Ｄｉｎｇｌｅら、１９５３年；Ｘａｐｉｋａｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ、　１９８５年）、。

ウィルス性腸炎の４２％以上のケースはノーワークまたはノーワーク様のウィルスによっていると考えられている（Ｋａｐｌａｎら、１９８２年）。ノーワーク・ウィルスが水や食物で伝染することは報告されており、特に、大きな伝染性の病気がハマグｌハ　トリガイ、カキ等を含む汚染された貝類を食べておこることがある（Ｍｕｒｐｈｙら、１９７９年ＨＧｕｎｎら、１９８２年ＨＷｉｌｓｏｎら、１９８２年ＨＧｉｌｌら、１９８３年；　ＤｕＰ’ｏｎｔ、　１９８６年：　ＭＯｒｓｅら、１９８６年；　５Ｂｋｉｎｅら、１９８９年）。魚や貝に関連した食物の毒が最近増えていることは注目されており、魚貝類の消費が増加することとともに医師によるこれらの実体の認識が高まったことにもよっている（Ｅａｓｔａｕｇｈ　ａｎｄ　５ｈｅｐｈｅｒｄ、　１９８９年）、、ノーワーク・ウィルスは１９７３年に発見された。しかし、このウィルスについての知識は細胞培養で増やすことができず、またウィルス培養のための適当な動物モデルがみつかっていないために、ごく限られたものになっている。それ故、発症者あるいはボランティアから得られた糞便試料がウィルスの唯一の源である。糞便中のウィルスの濃度は通常低く、そのためウィルスを通常の電子顕微鏡で検出することはできない（Ｄｏｌｉｎら、１９７２年ＨＫａｐｉｋｉａｎら、１９７２年ＨＴｈｏｒｎｈｉ　ｌ　ｌら、１９７５年）。ノーワーク・ウィルスを検出する現在の方法は免疫電顕やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）やビオチン−アビジン酵素結合イムノアブソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような、ヒトからとった急性期または回復期の血清を使用した方法がある。今日、動物からの抗血清はウィルス性抗原の量が十分でないか性質が異常のために得られていない。ウィルス体の生物物理学的性質を予備的にみると、この粒子は一つのポリペプチドをもっている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８１年）が、ウィルスの染色体を特徴づける努力は成功していない。それ故、これらウィルスは分類もされていないままである。

引用された関連情報１、Ｄｉｎｇｌｅ　Ｊ、、　Ｂａｄｇｅｒ　Ｇ、、　Ｆｅ１ｌｅｒ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９５３年。

「一群のクリーブランド家系における病気の研究＝１．研究研究上概観Ｊ　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｙｇ、　５８．１６〜３０゜２、　Ｄｏｌｉｎ　Ｒ，、Ｂｌａｃｋｌｏｗ　ＮＲ，ＤｕＰｏｎｔ　Ｈ，Ｂｕｓｃｈｏ　ＲＦ　；　ＷｙａｔｔＲＧ、　Ｘａｓｅｌ　ＪＡ、　Ｈｏｒｎｉｃｋ　Ｒ，ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ、、　１９７２年。

「非細菌性の急性感染性腸炎のノーワーク症例の生物学的性質Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ、　１４０．５７８〜５８３゜３、Ｄｏｌｉｎ　Ｒ，Ｂｌａｃｋｌｏｗ　ＮＲ，ＤｕＰｏｎｔ　Ｈ，Ｆｏｒｍａｌ　Ｓ、　Ｂｕｓｃｈ。

ＲＦ、　Ｋａｓｅｌ　ＪＡ、　Ｃｈａｍｅｓ　ＲＰ、　Ｈｏｒｎｉｃｋ　Ｒ，ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ。

１９７１年、「急性感染性の非細菌性腸炎の糞便濾過液の経口投与されたボランティアへの感染」Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、里。

３０７〜３１２゜４、ＤｕＰｏｎｔ　ＨＬ、　１９８６年、ｒ生の貝類の消費□リスクは受け入れられないか７　Ｊ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３］４．７０７〜７０８゜５、Ｅａｓｔａｕｇｈ　Ｊ、　５ｈｅｐｈｅｒｄ　Ｓ、　１９８９年、　ｒ魚や貝類の消費からの感染性及び毒性症候Ｊ　Ａｒｃｈ、　１ｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、セ１９．１７３５〜＋７４０゜６、Ｇ１１ｌ　ＯＮ、　Ｃｕｂｉｔｔ　ＷＤ、　ＭｃＳａ＋ｉｇｇａｎ　ＤＡ、　Ｗａｔｎｅｙ　ＢＭ　ａｎｄＢａｒｕｌｅｔｔ　ＣＬＲ，１９８３年、　［小さな円に構造をしたウィルスで汚染されたカキで起される腸炎の流行Ｊ　Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、。

２８７、１５３２〜ｌ５３４゜７、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＨＢ、　Ｖａｌｄｅｓｕｓｏ　ＪＲ，Ｋａｌｉｃａ　ＡＲ，Ｗｙａｔｔ　ＲＧ。

ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ　ＶＪ、　Ｋａｐｉｋｉａｎ　ＡＺ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ、、　１９８１年。

Ｆノーワーク・ウィルスの蛋白Ｊ　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　３７．９９４〜９９９゜８、　Ｇｕｎｎ　ＲＡ、Ｊａｎｏｗｓｋｉ　８丁、Ｌｉｅｂ　Ｓ、、Ｐｒａｔｈｅｒ　ＥＣ，ａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ　）（Ｂ、、　１９８２年、　［生カキ消費後のノーワーク・ウィルスによる腸炎Ｊ　Ａｍ、　Ｊ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｎｏｌ、、　１１５．３４８〜９、　Ｊｉａｎｇ　Ｘ、Ｅｓｔｅｒｓ、阿に、ａｎｄ　Ｍｅｔｃａｌｆ　ＴＧ、、１９８９年、「流行性肝炎Ａウィルスの定量分析のためのｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンＪ　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７．８７４〜８７９゜１０、　Ｊｉａｎｇ　Ｘ、　Ｅｓｔｅｒｓ　ＭＫ、　ａｎｄ　Ｍｅｔｃａｌｆ　ＴＧ、　１９８７年、　［流行性肝炎Ａウィルスの単鎖ＲＮＡプローブによるハイブリダイゼーションでの検出Ｊ　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５３゜２４８７〜２４９５゜ＩＩ、　Ｊｉａｎｇ　Ｘ、　Ｅｓｔｅｒｓ　ＭＫ、　Ｍｅｔｃａｌｆ　ＴＧ、　ａｎｄ　Ｍｅｌｎｉｃｋ　ＪＬ。

１９８６年、ｒｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによる種かき試料中のＡ型肝炎ウィルスの検出Ｊ　Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５２．７１１〜７１７゜１２、　Ｋａｐｉｋｉａｎ　ＡＺ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ、、１９９０年、　「ウィルスのノーワーク群Ｊ　ＢＮ　ＦＩｅｌｄ編［ウィルス学Ｊ　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ社。

ニューヨーク市　６７１〜６９３゜１３、　Ｋａｐｉｋｉａｎ　ＡＺ、　Ｗｙａｔｔ　ＲＧ、　Ｄｏｌｊｎ　Ｒ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ　ＴＳ。

Ｋａｉｉｃａ　ＡＲ，ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｈ　ＲＭ、　１９７２年、　「急性感染性非細菌陽炎と関連した２７ｎｍ粒子の免疫電子顕微鏡による観察」Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　ＩＱ、　１０７５〜１０８１゜＋４．　Ｋａｐ）ａｎ　Ｊ、　Ｆｅｌｄｍａｎ　Ｒ，Ｃａｍｂｅｌｌ　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　１９８２年こリーワーク腸炎の伝染性と急性非細菌性腸炎の発症におけるノーワーク・ウィルスの役割Ｊ　Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎａｌ、　Ｍｅｄ。

飢（６）、　７５６〜７６１゜１５、　Ｍｏｒｓｅ　ＤＬ、　Ｇｕｚｅｗｉｃｈ　ＪＪ、　Ｈａｎｒａｈｎ　ＪＰ、　５Ｌｒｉｃｏｆ　Ｒ＋Ｓｈａｙｅｇａｎｉ　Ｍ、Ｄｅｉｂｅｌ　Ｒ，Ｇｒａｂａｕ　ＪＣ，Ｎｏｗａｋ　ＮＡ、ＨｅｒｒｍａｎｎＪＥ、　Ｃｕｋｏｒ　Ｇ、　ａｎｄ　Ｂｌａｃｋｌｏｗ　ＮＲ，、１９８６年、　［はまぐり及びカキに関連した腸炎の広汎な発症：ノーワーク・ウィルスの働きＪ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４．６７８〜６８１゜１６＋Ｍｕｒｐｈｙ　ＡＭ、　Ｇｒｏｈｍａｎｎ　ＧＳ、　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　ＰＪ、　Ｌｏｐｅｚ　ＷＡ。

Ｄａｖｅｙ　ＧＲ，ａｎｄ　Ｍｉｌｌｓｏｍ　ＲＨ，、１９７９年、　［ノーワーク・ウィルスによって起されたカキからの腸炎のオーストラリア中の発症」Ｍｅｄ、　Ｊ、Ａｕ５ｔ、　′Ａ、　３２９〜３３３゜１７、５ｅｋｉｎｅ　Ｓ、　０ｋａｄａ　Ｓ、　１（ａｙａｓｈｉ　Ｙ、　Ａｎｄｏ　Ｔ、　Ｔｅｒａｙａｍａ　Ｔ。

Ｙａｂｕｕｃｈｉ　Ｋ、　Ｍｉｋｉ　Ｔ、　ａｎｄ　０ｈａｓｈｉ　Ｍ、、　１９８９年、　「東京における急性腸炎発症における小さな円形をしたウィルスの感染Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３３．２０７〜２１７゜１８、Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ　丁Ｓ、Ｘａｌｉｃａ　ＡＲ，Ｗｙａｔｔ　ＲＧ、Ｋａｐｊｋｉａｎ　ＡＺ。

ａｎｄ　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ、、　１９７５年、［免疫電顕によってきめられたボランティアにおける実験的に起された陽炎中の糞便にみられるノーワーク粒子の外殻のパターンＪ　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　１３２．２８〜３４゜１９、　Ｗｉｌｓｏｎ　Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＬＪ、　Ｈｏｌｍａｎ　ＲＣ，Ｇａｒｙ　ＧＷ、　ａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＨＢ、　１９８２年、　「ノーワーク剤のための水由来腸炎；臨床的及び疫病的調査Ｊ　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　７２゜７２〜７４゜２０、　ｔ（ａｙａｓｈｉ　Ｙ、　Ａｎｄｏ　Ｔ、　Ｕｔａｇａｗａ　Ｅ、　５ｅｋｉｎｅ　Ｓ、　０ｋａｄａ　Ｓ。

Ｙａｂｕｕｃｈ　Ｋ、　Ｍｉｋｉ　Ｔ、　ａｎｄ　０ｈａｓｈｉ　Ｍ、　１９８９年、　［東京における急性腸炎発症と関連した円形をしたウィルスのウエスタンプロット（免疫プロット）測定Ｊ　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２７．１７２８〜１７３３゜２１、アメリカ合衆国特許Ｎ１４，３５８，５３５．１９８２年１１月９日　発明者　Ｆａｈｋｏｗ　Ｓ　ａｎｄ　Ｍｏ５ｅｌｅｙ　ＳＬ　ｒ臨床検査的微生物学における特異的なりＮＡプローブ」２２、アメリカ合衆国特許隘４，７５１，０８０．１９８８年６月１４日発行。

発明者　Ｗｙａｔｔ　ＲＧ、　Ｋａｐｉｋｉａｎ　ＡＺ、　Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ、　Ｍｉｄｔｈｕｍ　Ｋ。

Ｆｌｏｒｅｓ　Ｊ、　）（ｏｓｈｉｎｏ　Ｙ、ｒロタウィルス病（こ対するワクチン」。

２３、アメリカ合衆国特許１１ｈ４，８１４，２６８．１９８９年３月２１日発行。

発明者　Ｋｒｅｉｄｅｒ　ＪＷ　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｔｔ　Ｍ、に、、ｒ培養しくこくし）ヒトウィルスの増殖法とそれによる精製された懸濁液を作る方法」。

且里豊斐豊本発明の目的にｃＤＮＡライブラリーを合成しクローニングすることによってノーワーク・ウィルス及びその関連のウイＪレスを特徴づけることである。

ｃＤＮＡのアミノ酸配列を推定することがこの発明の関連した目的である。

この発明のもう一つの目的はノーワーク及び関連のウィルスに対するポリクロナール及びモノクロナール抗体を調製する方法を開発することである。

この発明のさらにもう一つの目的はノーワーク及び関連のウィルスを検出するためのプローブを作る方法を開発することである。

この発明のさらなる目的はウィルスを含むと思われる試料中のノーワーク及び関連のウィルスを検出するための方法においてｃＤＮＡまたはその断片または誘導体を使うことである。

目的を完成しようとするために、ここに示す実施例によればノーワーク・ウィルスのｃＤＮＡクローンの断片の染色体センス鎖のヌクレオチド配列は以下のものが含まれる。

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このオリゴペプチドやこのｃＤＮＡと一緒に見つけられる全体の染色体を表わす他のｃＤＮＡ　、あるいはその他のオリゴヌクレオチドあるいは全ｃＤＮＡの断片などが診断用の製造物やワクチンを作るのに用いられる。

本発明のその他の目的、特徴あるいは利点などはここに以下に示す選択された発明の実施例の記述から明らかであろう。

皿糞五交皇皇盈里図Ｉ　Ｃ５ＣＱ密度勾配精製後のノーワーク・ウィルスの電顕像。

ａｌｐで標識したプラスミドＤＮＡによる糞便試料のバイブ１ノダイゼーシヨン。２人のボランティアから採って対にした糞便［ノーワーク・ウィルスで感染する前（ｂ）と感染後（ａ）］力＼らの核酸をゼータバインド濾紙に滴下した。レプリカした濾紙を用意して５０℃と６５℃で各テストクローン（ｐＵＣ−２７，ｐＵＣ−５９３、ｐＵＣ−１３，ｐＵＣＮＶ−９５３）とハイブリダイズさせた。ノーワークに感染後の糞便検体にのみ反応した（感染前には反応しない）一つのクローン（ｐＵＣＮＶ−９５３）が潜在的に陽性のクローンと考えられ、さらにキャラクタリゼーションに選抜された。

図２ｂ　３人のボランティアの感染後違った時（Ｂ＝病気の急性期前、Ａ＝急性期、Ｐ＝急性期をすぎた後）の糞便試料を別々に３セツトの゛′Ｐ−標識したｐＵＣＮＶ−９５３クローンのドツトプロットハイブリダイゼーション。核酸が直接、あるいはＲＮＡアーゼで処理した後、または滴下前にＤＮＡアーゼで処理した後濾紙に滴下した。二重鎖の同質のｃＤＮＡ　（ｐＵＣＮＶ−９５３）を糞便検体と同じ処理後にスポットした。

図３　ａ　ｐＧＥＭＮＶ−９５３から作られた５ｓＲＮＡプローブとのＣ５ＣＱ密度勾配中のノーワーク・ウィルスのドツトプロットハイブリダイゼーション。

Ｃ５ＣＱ密度勾配での各フラクションから５０μＱとってゼータバインド濾紙にスポットした。同じ濾紙を２つ作って夫々を２つの５ｓＲＮＡプローブでハイブリダイズさせた。２つの鎖はｃＲＮＡ　（ウィルスの核酸と明らかにハイブリダイズする）とｖＲＮＡ　（データは示さないがウィルスの核酸とハイブリダイズしない）と呼ばれた。このグラフはドツトプロットハイブリダイゼーションで同じＣ３ＣＱ密度勾配の各両分からのノーワーク・ウィルスの四カウントを示している。各区画から５区画をカウントし区画当りのウィルスの数の平均を計算した。

図４　ノーワーク・ウィルスＲＮＡのａｌｐ標識クロりンｐＵＣＮＶ−９５３とのハイブリダイゼーション。部分精製されたウイルスから抽出した核酸を既に報告された（Ｊｉａｎｇら、１９８９年）ようにネイティブゲル電気泳動にかけた。それからゲルを８０℃で１＃間乾燥し、゛Ｐ標１！ｐＵｃＮＶ−９５３挿入体でハイブリダイズした。レーン１はＥ、　ｃｏｌｉからとった２３Ｓと＋６　Ｓ　ｒＲＮＡ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｃｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　イリノイ州６０５６６）、レーン２と４はノーワーク・ウィルスを含んだ部分精製された糞便検体からの全核酸、レーン３はＨＡＶのＲＮＡ。

図５　第一のノーワーク・ウィルスｃＤＮＡクローンの染色体センス配列のヌクレオチド配列。このｃＤＮＡ中の長いオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列も示されている。

図６　ｐＵＣ−１３ライブラリーから分離したノーワーク・ウィルス特異的なりローンの物理的地図。この地図はノーワーク・ウィルスの染色体が８ｋｂで１００までの特徴づけられたクローンからなるサブセット（最も大きい４つ）だけを示している。

少くとも７ｋｂの核酸を示すｃＤＮＡが予め感染された糞便試料とあとで感染させた試料とハイブリダイズすることによって同定された。また、元のｐＵＣＮＶ −９５３とその後の陽性クローンの５７−末端プローブでライブラリーを再検索することによっても同定されている。クローンｐＵｃＮＶ−４１４５の３７−末端にポリ（Ａ）尾部（〜８０塩基）が存在する。クローンｐＵＣＮＶ−］　０１１もボランティアの事後感染試料で特異的にハイブリダイズした（事前感染試料ではしない）。（図７をみよ）。

図７　ノーワーク・ウィルスの染色体の３７−及び５′−末端を示す°’Ｐ標識したプローブでの糞便試料のドツトプロットハイブリダイゼーション。糞便試料をノーワーク・ウィルスに感染してから異なる時期（ａ　−ｅ　）に５人のボランティアから採取した。（ａ）列の試料は、はじめの感染２４時間後のまだ症状の現われない時に採取した。残りの検体は感染後２がら５日日に採取した。核酸を抽出し、ゼータバインド濾紙にスポットして固定化した。３′−及び５′−末端プローブを各々ｐＵＣＮＶ−９５３クローン、及びｐＵＣＮＶ−１０１１クローンから得た（クローンについての記載は図６をみよ）。

図８　ノーワーク・ウィルスはＲＮＡ指向性ポリメラーゼ配列模様をコードしている。ノーワーク・ウィルスｐＵＣＮＶ−４０９５（ＮＶ）の部分の推定アミノ酸配列がＥ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）　、　Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）　、日本脳炎ウィルス（ＪＥ）　、ポリオウィルス（ｐｏｌｉｏ）　、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤ）　、脳を髄炎ウィルス（ＥＭＣ）　、シンドビス・ウィルス（ＳＮＢＶ）　、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）　、アルファルファモザイクウィルス（ＡＭＶ）　、スズメノチャヒキモザイクウィルス（ＢＭＶ）　、ササゲモザイクウィルス（ＣｐＭＶ）の推定されているＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼをコードしていると思われる部分のアミノ酸残基の一致を比べている。ＮＶ基以外ウィルスの配列はＲｅｙｅｓら、ｒｓｃｉｅｎｃｅ、　２４７．１３３５〜＋３３９４の図３からとった。

図９　ノーワーク・ウィルス染色体を増幅させるのに用いた３セツトのプライマー。

Ｕ久１農ＩＬ避この発明の目的や精神からはなれることなく、ここに開示された発明に対しているいろな置きかえや修正ができることは、この技術分野に通じた者にとってはあきらかである。

ここに用いられる「断片」という言葉はポリクロナールあるいはモノクロナール抗体を作らせることのできるペプチド断片を産生ずるために発現されることを必要とする染色体またはそれから得られるクローンの断片と定義する。免疫原となりつるには５アミノ酸からなるペプチドでよいが通常１５アミノ酸またはそれ以上のペプチドを要する。これには、ペプチドの性質に左右され、予め予測することはできない。

ここに用いられている「誘導体」という言葉はノーワーク染色体を表わすＤＮＡのより大きな部分または付加的なｃＤＮＡのことで、元のｃＤＮＡ及びそれから推定されるアミノ酸配列を直接あるいはそれを使うことによって検出されるＤＮＡを指す。

従ってクローンｐＵｃＮＶ−１０１１は誘導体であるが、元のクローンと重複していないし、同じ配列をもっていない。誘導体の定義の中にはＤＮＡ断片のＲＮＡカウンターパートや１つあるいはそれ以上の塩基が置換している開ＡあるいはｃＤＮＡ断片やあるいは標識や末端構造がＤＮＡやｃＤＮＡの読み取りや発現に影響することなく付加されたＤＮＡまたはｃＤＮＡも含まれる。

クローニングのためのノーワーク・ウィルスのノーワーク・ウィルスは成人ボランティアに安全をテストされたノーワーク・ウィルス（８ＦＩ［ａ）を投与することによって作られた。ボランティア研究に用いられたウィルス株はＡｌｂｅｒｔ　Ｋａｐｉｋｉａｎ博士（メリーランド州ベセスダ市、国立衛生研究所、アレルギー・感染病研究室）によって供与された。このウィルスはオハイオ州ノーワークで急性腸炎の発症からとったものであった（Ｄｏｌｉｎら、１９７１年）　、　ＴＢＳで８ＦＩＩａを１７１００に希釈した液２−を８０ｄｌのミリＱ水（ミリポア社、マサチュセッッ州ベトフォード０１７３０）と共に１人ずつ経口投与された。各人ともウィルス投与２分前と５分後に炭酸水素ナトリウム液を投与された。ボランティアによる試験はベイラー医科大学、メソシスト病院及びジェネラル医学研究センターにおいてヒト臨床試験研究審査委員会によって承認された。ジェネラル医学研究センターにおいてボランティアはウィルスを投与され、そこでボランティアは入院して４日間厳密な医師監視下におかれた。全ての糞便は集められ、あとで使うために一７０℃に保存された。

からのノーワーク・ウィルスの糞便試料の丁Ｂ５１０％液を３０００ｒｐｍ、　１５分間低速度での遠心分離して清澄にした。得られた上清液を０．５％のツヴイッタージェント３−１４界面活性剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐ社、カリフォルニア州Ｌａ　Ｊｏｌｌａ市）の存在下でジェネトロンで２〜３回抽出した。水相中のウィルスを５０．２Ｔｉローター（ベックマン°インストルメント社、カリフォルニア州バロアルト市９４３０４　）を用いて４０％ショＭクッションを通して３６．　ＯＯＯｒｐｍ、９０分間遠沈させることによって濃縮した。沈澱をＴＢＳに懸濁し、Ｃ５ＣＱ液（屈折率で１，３６８）と混合し、そしｒｓＷ５０．１０−ター（ベックマン）で約３５．ＯＯＯｒｐｍ、２４時間遠沈した。Ｃ５ＣＱ密度勾配を底部から孔をあけて分画し、各画分をＥＭ検査によりウィルスを追跡した。ノーワーク・ウィルスを含むビーブ画分を集め、試料中のＣ３ＣＱをＴＢＳで希釈し、約３５．　ＯＯＯｒｐｍで１時間ウィルスを遠沈して取り出した。精製したウィルスは約−７０℃で保存した。

１したウィルスからの　の一つの抽出法はＣ５ＣＱ密度勾配から得られた精製ノーワーク・ウィルスをプロティナ・−ゼにバッファー（０，１Ｍトリス塩酸、ｐｉ−１７，５，１，２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０，１５Ｍ　ＮａＣ（１，１％ｗ／ｖ　５ＤＳ）中でプロティナーゼＫ　（４００μｇ／ｄ）と約３７℃、約３０分間処理することを含んでいる。それからその試料をフェノール・クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽呂した。水層中の核酸を０．２Ｍ酢酸ナトリウムの存在下で２．５容量のエタノールで沈澱すること、次いで１５分間マイクロ遠心分離で沈澱させることによって濃縮した。

ｃＤＮＡム　と　されたｃＤＮＡのクローニング合成とクローニング法は精製されたノーワーク・ウィルスから抽出された核酸を１０ｍＭ　ＣＨ，ＨｇＯＨで変性させることを含む。

それからｃＤＮＡは準備されたランダムヘキサヌクレオチドプライマーを含むｃＤＮＡ合成キット（アマジャム社、イリノイ州アーリントンハイッ市６０００５　）を用いて合成した。２回目の鎖合成の後、反応混液をフェノール・クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽呂し、次いでエタノール沈澱した。ＤＮＡの増幅はＤＮＡ標識のためのランダムプライムキット（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン市５３７１１−５３０５）を使って行われた。変性（１００℃、２分間）再縫合（室温に冷して２分間）そして伸長（室温３０分間）をＫｌｅｎｏｗ断片（プロメガ社）を添加後８サイクル行った。ＤＮＡライブラリーはＳｍａ　Ｉ部位に対合２本鎖末端連絡をもったｐＵｃ−１３の中に構築された。

ライブラリーの　クローン　、検索の一方法として、形質転換したＤＨ５アルファ細菌細胞（ＢＲＬ）からの白色のコロニーを拾い上げ、各々のクローンについてマスタープレートとプラスミドＤＮＡのミニブレツブ両方を調製した。挿入部を含むクローンをアガロースゲルでプラスミドＤＮＡの電気泳動して同定した。挿入されたＤＮＡはアガロースゲルから切り出してランダムプライマーとＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼを使って、例えばプライム・ア・ジーン■標識システム（プロメガ社）のような系を使って°″Ｐで標識した。酵素や蛍光剤、化学発光や生物発光基質のようなアイソトープや生化学標識体も使われる。２人のボランティア（５４３と５４４）から得て対にした糞便試料（ノーワーク感染の前後）から抽出した核酸をゼータバインド濾紙（ＡＦＭ、　Ｃｕｎｏ。

コネティカット州メリデン市）上にスポットした。レプリカした濾紙片を作り、夫々６５℃でフォルムアミドを使わずに個々の標識プラスミドプローブとハイブリダイズした。陽性と思われるクローンは感染前後の糞便で異なる反応によって判定された。感染後の糞便で反応した（感染前には反応しない）クローンを陽性と考え、マスタープレート上のこれらクローンをさらにキャラクタリゼーションに付した。一度ノーワーク・クローンが同定されれば、それは付加的に重複しているクローンを同定するためにｃＤＮＡライブラリーを再検査するのに使われた。これら付加的なりローンをもったｃＤＮＡライブラリーの再検査によって最終的に全ノーワーク・ウィルス染色体を表わすクローンを同定できる。

次のような実施例を説明のために提供するが、これがいかなることによってもこの発明を限定するものではない。

実施例１１土監監互１崖ノーワーク・ウィルスのより良い診断と分子的特徴づけのために、ｃＤＮＡライブラリーを糞便試料から分離したウィルス体から抽出した核酸から作製した。ノーワーク・ウィルスは糞便からＡ型肝炎やロタウィルスに対して先に使われた方法で分離された（Ｊｉａｎｇら、１９８６年）。基本的にノーワーク・ウィルスを投与されたボランティアから採取した糞便試料を脂質と水不溶性物質を除くためジェネトロンで処理した。水相中のウィルスを４０％ショ糖クッションを通して沈澱させた。

得られたペレットを再懸濁し、超音波をかけ、等密度遠心分離のためのＣ５ＣＱ密度勾配にかけた。図工はＣ５ＣＱ密度勾配遠心分離後の分離したノーワーク・ウィルスの電子顕微鏡像を示している。約１０”個の粒子がはじめのｃＤＮＡライブラリーを作ったときに糞便５００　ｇから得られた。

実施例２　めのｃＤＮＡム　クローニング　びスクリーニンｃＤＮＡライブラリーは、これら分離されたウィルスがらプロティナーゼに処理した後フェノール・グロロボルム抽出、そしてエタノール沈澱をすることによって抽出された核酸から作られた（Ｊｉａｎｇら、１９８６年、１９８７年）。ウィルスの染色体の性質がわかっていないので、抽出された核酸をｃＤＮＡ合成の前にメチル水銀ヒドロオキシドで変性させた。ランダムプライムｃＤＮＡをグブラー・ホフマン法（ｃＤＮＡ合成システムプラス、アマジャム社製）で合成し、ｃＤＮＡの少量を得た。この少量のｃＤＮＡの直接クローニングは成功しなかった。それ故、ＤＮＡの増幅ステップをクローニングの前にＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏＷ断片とランダムプライマーとでＤＮＡのコピーを多く合成することで行った。変性、ランダムプライマーとＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎａｗ＠片の添加、再接合、伸長の循環がこの手法に含まれる。この方法によって標識されたヌクレオチドが生成物の中に直鎖状にとり込まれているのが、合成のサイクル数が増えるにつれて増えて観察された。行われるサイクル数は過剰の小さな断片の合成を避けるために限定した（１０以下）。ノーワークのｃＤＮＡの場合には、８サイクルの増幅を行い、約２１５μｇのＤＮＡを得たがそれは出発のテンプレートｃＤＮＡから少くとも１００倍の増幅されたものである。この増幅ｃＤＮＡは対合連結によってｐＵＣ−１３の中にクローン化され、陽性のクローン（ｐＵＣＮＶ−９５３）を分離した。

陽性のノーワーク・ウィルス・クローンを得るために、陽性挿入部を含むプラスミドＤＮＡの微小標品をアガロースゲル電気泳動によって検査した。ゲル中のより大きなりローンの挿入部を切り出し、「プライム・ア・ジーン０標識システム（プロメガ社）」を使ってゲル中のＤＮＡでプローブを作った。

これらのプローブを夫々２人のボランティアから対にした糞便試料（ノーワーク感染前後の対）とハイブリダイズさせた。

（図２ａ）、１クローン（ｐＵｃＮＶ−９５３）が両者の感染後の糞便試料と反応し、感染前には反応しなかった。

実施例３　ローンＵＣＮＶ−９５３のウィルス　のクローンｐＵＣＮＶ−９５３のウィルス起原をさらに確かめるために、さらに６つの対にした糞便試料をテストし、同じ結果を得た。図２ｂはこの病気の感染径異なる時期に採取した糞便とこのクローンをドツトプロットハイブリダイズした結果を示している。急性期の糞便でのみ強い信号が得られたが病気の前後ではみられない。この結果は、ノーワーク下痢症患者からとった血清を使ってウィルス性抗原についてのＲＩＡ分析した結果及びウィルス粒子の検査のために試料を免疫電顕（ＩＥＭ）の結果と一致していた。この結果はまたこの病気の経緯中の糞便中のウィルス像とも一致している（Ｔｈｏｒｎｈ　ｉ　１１ら、　１９７５年）。ノーワーク・ウィルス精製過程から得られるＣ５ＣＱ勾配の画分とこのクローンをハイブリダイズしたとき、ハイブリダイゼーションと電顕のウィルス粒子数の間には相関がみられた（図３）。ハイブリダイゼーションの信号とウィルス粒子数ともにそのピークは１．３８ｇ／ｃ＋＋Ｉの密度の両分にあり、それはノーワーク・ウィルスの生物物理学的性質について既報のものと一致している。最後に、高度に精製したノーワーク゛ウィルスをアガロースゲルで電気泳動してハイブリダイゼーションすることによって検査した。ノーワーク・ウィルスではみもれるがＨＡＶ　（図４）やロタウィルスではみられない単一のハイブリダイゼーション・バンドが観察された。ｐＵＣＮＶ−９５３ｃＤＮＡの配列解析によってこのクローンは５１１ｂｐであることが示された（図５）。この部分染色体ｃＤＮＡはアミノ酸配列が推定されるオープン・リーディング・フレームをコードしている（図５）。Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　（ベイラー医科大学のＥｕｇｅｎｅソフトウェア、分子生物学情報源）によって他の配列を比較してもヌクレオチドあるいは推定アミノ酸配列に有意なホモロジーはみつからなかった。

実施例４　ウィルスの　を　づ番るためのノーワーク・ウィルスｃＤＮＡのＪｐＵｃＮＶ−９５３ｃＤＮＡを転写ベクターｐＧＥＭ−３２ｆ　（＋　）にサブクローン化し、増殖させた。それからＳＦ３とＴ７ポリメラーゼを使ってｉｎ　ｖｉｔｒｏで転写して５ｓＲＮＡプローブを生産した。

２つの逆向きのセンス５ｓＲＮＡプローブを別々にウィルスの核酸とハイブリダイズしたとき一つだけの鎖がウィルスと反応しこれはウィルスの染色体が一本鎖であることを示している。

図２ｂに示されるように、ハイブリダイゼーション信号は濾紙の上にそれを添加する前にウィルスの核酸をＲＮＡアーゼ（ＤＮＡアーゼではない）で処理することによって除かれたが、それはウィルスの染色体が５ｓＲＮＡを含んでいることを示している。ｐＵＣＮＶ−９５３の配列をコンピュータで分析することによって押入されたＤＮＡの２つの鎖のうちの１つに長いオープン・リーディング・フレームがみつかった。このコードしている鎖と同じ配列をもった５ｓＲＮＡプローブはウィルスの核酸と反応しないが、その相補的な５ｓＲＮＡプローブはハイブリダイゼーション試験で反応する。それ故、ノーワーク・ウィルスは陽性のセンス単＃　ＲＮＡ染色体を含んでいる。このノーワーク・ウィルス染色体の大きさは分子量マーカーとアガロースゲルで精製したウィルスＲＮＡの移動度を比較することにもとづき約８ｋｂと測定されたにの大きさはピコルナウィルス［ＨＡＶ及びポリオウィルス（［１１４））のそれより若干大きい。

第二のｃＤＮＡライブラリーを再検査するために使われるｐＵＣＮＶ−９５３ｃＤＮＡは次のようにして作られた。ノーワークあるいは関連のウィルスのクローンを精製したノーワーク・ウィルスから得た核酸から分離することによって合成した。ｃＤＮＡは逆転写酵素とランダムプライマーを用いて合成された。

ＤＮＡの二番目の鎖はｃＤＮＡから合成された。そして少くともＤＮＡ１コピーがプラスミドまたはクローニング、発現ベクターの中に挿入された。そのライブラリーを元のｐＵＣＮＶ−９５３ｃＤＮＡでスクリーニングしてノーワークまたは関連の染色体の断片（または完全な形の）を含むクローンを同定した。一方、少くともｌコピーのＤＮＡをラムダＺＡＰＴＩ［Ｆ］　（ストラティジーン社）のようなりローニング及び！ベクターに挿入し、そのｃＤＮＡライブラリーをノーワークまたは関連の染色体の断片または完全な形を含む組換えファージをスクリーニングして同定した。その他のｃＤＮＡも作られこの方法でみつけられた。

ライブラリーを再検査するのにこれらの付加的なｃＤＮＡを使うことによって新しいクローンを検出させたＣ図６）。オリジナルのｐ［１ｃＮＶ−９５３と付加的な重複シテイナイｃＤＮＡ　（ｐ［Ｊ（１：ＮＶ−１０１１）　ヲプローブとして使うことでウィルスを検出することを確認した（図７）、、他の重複しているｃＤＮＡ　（ｐＵｃＮＶ−４１４５）と重複していないｃＤＮＡ　（ｐ［ＪＣＮＶ−４０９５）がノーワーク及び関連のウィルスを検出するプローブとして有用である。

かくしてｃＤＮＡまたはそれからの断片または誘導体がノーワーク及び他の関連のウィルスの染色体の検出するための検査に使うことができる。検出法にはノーワーク・ウィルス染色体を直接検出し、結合した量を測定するための標識したｃＤＮＡまたは５ｓＲＮＡプローブが含まれる。一方、小さなオリゴヌクレオチドプローブ（１０ヌグレオチドかそれ以上）とポリメラーゼ鎖反応増幅法がノーワーク及び関連のウィルス染色体の検出に使われる。ｃＤＮＡにおいてオープン・リーディング・フレームを発現させることが診断製品やワクチンに使われる抗血清やモノクロナール抗体を作るのに使われる。

上記の方法論を作って以下のようなノーワーク・ウィルス染色体のヌクレオチド配列が同定されている。

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ＡＣＣＴＴＣ４２４０Ｇ丁ＴＧＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＡ　ＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＡ　４２８０ＴＧＴＡＴＧＡＧＡＡ　ＴＧＣＴＡＡＡＣＡＴ　ＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡ　ＴＴＴＡＣＡＣＴＧＣ４３２０ＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡ　ＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧ　ＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡ　ＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴ　４３６０ＣＡＡＡＡＡＧＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＧＴＣＴ　ＡＣＴＡＴＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧ　４４００ＧＡＡＣＡＧＴＧＧＴ　ＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴ丁ＴＴＧ　ＧＣＣＣＡ丁ＴＴＴＧ　４４４０ＴＧＡＣＧＣＴＡＴＡ　ＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧ　ＴＣＡＴＣＡＡＡＴＴ　ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡ　４４８０ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＡ　ＡＣＡＣＡＡＴＡＧＡ　ＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧ　４５２０ＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧ　ＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧ　ＡＴＧＣＡＧＡＴＴＡ　４５６０ＴＡＣＡＧＣＡＴＧＧ　ＧＡＣＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡ　ＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡ　４６００ＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴ　ＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＧＣＧＣＣＴＴＡＣＧ　ＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧ　４６４０ＡＡＴＴＧＧＣＣＧＡ　ＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣ４６８０ＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴ　ＧＴＡＧＧＴＧＡＴＴ　ＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧ　ＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧ　４７２０ＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴ　ＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡ　４７６０ＧＣＡＴＡＡＡＴＣＡ　ＣＴＧＧＡＴＡＡＴＴ　ＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧ　ＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡ　４８００ＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴ　ＴＴＡＴＣＡＣＣＴＧ　ＡＴＧＴＧＧＴＧＣＡ　ＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡ　４８４０ＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴ　ＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡ　ＴＧＡＴＧＡＧＡＴＴ　ＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧ　４８８０ＡＣＡＴＡＧＡＴＴＴ　ＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡ　４９２０ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＡＡ　ＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡ　ＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡ　４９６０ＧＧＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡ　ＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴ　ＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴ　５０００ＴＣＴＴＧＣＧＧＣＧ　ＣＡＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＧＧ　ＣＡＧＧＧＴＴＣＣＡ　５０４０ＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ　ＧＡＴＡＧＧＧＣＴＴ　ＣＧＡＴＴＧＡＡＣＧ　ＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣ５０８０ＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧ　ＧＧＣＣＣＡＡＴＣＡ　ＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡ　ＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣ５１２０ＴＡＧＴＧＣＣＡＣＡ　ＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡ　ＡＡＡＡＴＡＣＡＧＴ　ＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴ　５１６０ＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡ　ＧＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡ　ＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡ　５２００ＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡ　ＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴ　ＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＴＧ　５２４０ＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴ　ＧＴＡＴＧＴＣＣＣＡ　ＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧ　ＣＣＡＴＧＴＴＣＣＧ　５２８０ＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＴＴＧＴＧ　ＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴ　５３２０ＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴ　ＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴ　ＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡ　５３６０零零ＡＧＧＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＧ　ＧＡＴＧＧＣＧＣＴＡ　ＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧ　５４００ＴＣＡＧＴＴＧＧＴＡ　ＣＣＧＧＡＧＧＴＴＡ　ＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡ　ＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡ　５４４０ＡＴＧＧＡＴＣ，ＣＴＧ　ＴＡＧＣＡＧＧ丁ＴＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＡ　ＧＴＣＧＣＧＡＣＴＧ　５４８０ＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴ　ＴＡＡＴＣＣＴＡＴＴ　ＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡ　ＴＡＡＴＴＡＡＴＡＡ　５５２０ＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡ　ＧＣＣＣＣＣＣＡＡＧ　ＧＴＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＣＣＣＣＡ　５５６０ＡＡＴＡＡ丁ＡＣＣＣＣＣＧＧＴＧＡ丁Ｇ丁　丁丁丁ＧＴＴＴＧＡＴ　ＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧ　５６００ＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴ　ＴＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴ　５６４０ＧＴＡＴＡＡＴＧＧＴ　ＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡ　ＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴ　ＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧ　５６８０ＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡ　ＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＧＧＧＧＡＡＧ　ＡＴＡＡＴＡＧＴＴＴ　５７２０ＣＣＴＧＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴ　ＧＧＴＴＣＡＣＡＴＡ　ＡＴＣＴＴＡＣＴＡＴ　５７６０ＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡ　ＡＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴ　ＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴ　５ｇ００ＡＧＧＡＣＴＣＴＡＧ　ＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡ　ＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧ　ＧＡＡＧＡＴＧＴＴＡ　５８４０ＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴ　ＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴ　ＡＡＴＧＡＴＡＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣ５８８０ＣＡＴＧＣＧＣＣＴＴ　ＧＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣＡＣＴ　５９２０ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡ　ＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＧＴＴ　ＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧ　５９６０ＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧ　ＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴ　ＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴ　ＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴ　６０００ＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴ　ＡＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧ　ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡ　６０４０ＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＡＧ　ＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴ　ＡＡＣＴＣＡＣＧＴＧ　６０８０ＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＡＧＴ　ＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴ　ＣＣＣＣＡＧＡＣＡＡ　６１２０ＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴ　ＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡ丁ＧＧＴＣＧ　Ｇ丁ＧＴＡＣＴＣＴＧ　６１６０ＧＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴ　ＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣ６２００ＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡ　ＧＡＴＡＡＧＡＧＧＧ　ＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧ　ＧＣＡＣＴＧＴＡＡＴ　６２４０ＣＡＡＣＣＴＴＡＣＴ　ＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧ　ＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴ　ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴ　６２８０ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＣＡＴＴＧＧ　ＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＧＴＴ　６３２０ＧＴＧＡＴＴＧＧＣＡ　ＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧ　ＡＣＡＣＡＧＴＴＴＧ　ＧＣＣＡＴＴＣＴＡＧ　６３６０ＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧ　ＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧ　ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＴ　６４００ＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＴ　ＴＣＡＧＧＣＡＡＡＴ　ＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡ　６４４０ＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡ　ＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴ　ＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡ　ＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣ６４８０ＡＴＣＡＣＡＣＣＣＧ　ＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＣＴ　ＴＴＧＧＡＡＧＡ丁Ｃ６５２０ＣＣＣＡＡＴＴＡＴＧ　ＧＧＴＣＡＡＧＴＡＴ　ＴＡＣＧＧＡＧＧＣＡ　ＡＣＡＣＡＴＣＴＡＧ　６５６０ＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴ　ＡＴＡＣＣＣＣＣＣＴ　ＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧ　ＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴ　６６００ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧ　ＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧ　ＴＧＣＴＴＡＴＡＡＴ　６６４０ＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＣＡＣＡ　ＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴ　ＴＣＡＣＡＴＣＴＴＧ　６６８０ＣＴＡＧＴＧＡＡＣＡ　ＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴ　ＧＴＡＧＧＴＧＡＧＧ　ＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴ　６７２０ＣＣＡＣＴＡＴＧＴＴ　ＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡ　ＣＣＧＧＴＣＧＧＡＡ　ＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡ　６７６０ＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴ　ＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧ　ＴＴＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡ　６８００ＡＴＧＧＧＧＣＴＡＧ　ＣＴＣＧＧＧＴＣＣＡ　ＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＡＴＧＧ　６８４０ＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴ　ＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧ　ＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡ　６８８０ＴＴＡＡＡＧＣＣＴＧ　ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡ　ＡＧＡＧＧＴＡＧＧＣ６９２０ＴＴＧＧＴＣＴＧＣＧ　ＣＣＧＡＴＡＡＴＧＧ　ＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴ　ＡＡＴＴＧＧＴＧＣＡ　６９６０ＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴ　ＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧ　ＴＡＧＴＧＣＴＣＴＧ　ＧＧＡＧＣＧＧＧＣＡ　７０００ＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧ　ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧ　ＣＣＡＡＡＧＧＴＡＴ　７０４０ＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴ　ＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡ　ＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴ　ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧ　７０８０ＡＣＡＧＧＧＡＡＡＴ　ＧＡＴＴＧＧＧＴＡＴ　ＣＡＧＧＴＴＧＡＡＧ　ＣＴＴＣＡＡＡＴＣＡ　７１２０ＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴ　ＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧ　ＣＡＡＣＴＡＧＡＴＡ　ＴＴＣＡＣＴＣＣＴＣ７１６０ＣＧＴＧＣＴＧＧＧＧ　ＧＴＴＴＧＡＣＣＡＧ　ＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡ　ＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧ　７２００ＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＴＡＧ　ＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧ　７２４０ＣＧＴＧＡＧＡＧＴＧ　ＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧ　ＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧ　７２８０ＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧ　ＧＣＴＴＣＡ丁ＧＴＧ　ＡＧＴＴＣＣＣＡＴＡ　ＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴ　７３２０ＣＴＡＡＧＣＡＡＡＡ　ＡＣＡＧＧＴＴＣＡＡ　ＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡ　ＴＴＡＧＴＡＡＴＣＣ７３６０ＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡ　ＴＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＧ　７４００ＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＧＧＡ　ＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣ７４４０ＡＣＴＡＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＴＧＴ　ＧＧＴＴＧＡＣＴＣＣ７４８０ＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡ　ＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴ　ＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣ丁ＴＣＴＧＴＧＣＣＡ　７５２０ＣＧＴＧＧＴＴＡＴＴ　ＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡ　ＣＡＧＧＴＴＧＣＣＡ　ＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡ　７５６０ＡＴＡＡＴＡＧＧＣＧ　ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴ　ＡＡＴＡＴＧＡＡＡＴ　ＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡ　７６００ＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡ　ＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡ　ＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡ　ＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴ　７６４０ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　７６８０ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　７７２０ＡＡ　７７２２配列の中にはヌクレオチド５３５４と５３５５のＧとＣの間にさらに塩基Ｇが加わることがありうる。

また上のヌクレオチド配列の４５４３から４９２４までの塩基の中にＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある。

この染色体の部分がＲＮＡポリメラーゼであるという事実は他の陽性センスＲＮＡウィルスにあるＲＮＡポリメラーゼと比較することで確められている。（図８）実施例５　ノーワーク・ウィルス　の　ることに　づくウィルスは臨床的な検体や汚染した水、食品検体においては少量しか存在しないのでノーワーク・ウィルスを検出するためにはハイブリダイゼーション法が選ばれる。以前にはノーワーク・ウィルスの染色体が知られておらず、配列についての情報が使えないのでノーワークとその関連の核酸を検出する可能性はながった。ノーワーク・ウィルスのｃＤＮＡがら作られたプローブあるいはノーワーク・ウィルス染色体配列から作られたプライマーが診断用製品のための染色体を増幅させる方法を確立させる。ノーワーク・ウィルスだけを同定させるプローブとノーワーク群の中の他のウィルスを同定するだめのプローブがこれら試薬の多くあるいは全てに共通な配列を検出するためのノーワークに特異的な試験法も、あるいは普遍的な試験法の開発を可能にする。

過去において糞便試料中のウィルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出で遭遇する一つの大きな困難は、逆転写酵素とＴａｑポリメラーゼの両方の酵素活性を阻害する何がわがらない因子が存在することであった（ＷｉｌｄｅらＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２８１３００〜１３０７．１９９０年）。これらの因子は核酸抽出の通常の方法では除くことがむずかしがった。セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）やオリゴｄ　（Ｔ）セルロースを使ってウィルスＲＮＡをこの阻害因子と特異的に分ける技術が開発された。これらの技術は核酸を選択的に沈澱させるが酸に不溶の多糖類を上清に残したままにするＣＴＡＢの独特な特性に基づいていた。得られる核酸はさらにオリゴｄ　（Ｔ）セルロースに吸着させ、そして溶出することによって精製された。このステップはポリ（Ａ、　）尾部を欠いた無関係の核酸を取除く。この技術によって、ノーワーク・ウィルスは少量の糞便試料（１０％懸濁液で４００μＱ）でもＰＣＨによって容易に検出された。

例えば、少量の糞便中の低濃度に存在するＲＮＡウィルスの染色体をＲＴ−ＰＣＲ及びランダムプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＨによってウィルスＲＮＡを増幅するステップを行った後にクローン化することが可能であることをこの技術分野に通じた者は認識するだろう。さらに、糞便から阻害因子を除くことができる現在、糞中に存在する他のウィルス（ＤＮＡウィルス、ｐｏｌｙ（Ａ）尾部をもたないＲＮＡウィルスなど）の核酸を検出しクローン化することもできよう。

ＣＴＡＢとオリゴｄ　（Ｔ）セルロースによる抽出法とそれに続くＲＴ−ＰＣＲによるウィルスＲＮＡの検出は糞便試料に用いられるが水や食品試料についても使われる。糞便試料は蒸留水に懸濁され（約１０％、　ｗ／ｖ）　、ジェネトロンで一回抽出される。上清のウィルスは約８％の終濃度でポリエチレングリコールで沈澱された。ウィルスのペレットはＳＤＳの存在下に約３７℃。

約３０分間プロテイナーゼＫ（約４００μｇ／ｍＱ）で処理されてから、フェノール・クロロホルムで１回そしてクロロホルムで１回抽出された。約５％のＣＴＡＢと約０．４Ｍ　ＮａｃＱの溶液を試料：ＣＴＡＢ　＝約５：２の割合で添加された。室温で約１５分間、そして４５℃で約５分間反応させた後、核酸（ウィルスのＲＮＡを含む）を約３０分間微量遠心分離機で遠沈することで採集した。

得られたペレットを約ＩＭのＮａｃＱに懸濁し、クロロホルムで２回抽出した。

水層にあるウィルスのＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ反応に直接使われるかまたは、オリゴｄ　（Ｔ）セルロースで吸着／溶出によってさらに精製された。

オリゴｄ　（Ｔ）セルロースによる吸着／溶出の回分法はポリ（Ａ）尾部をもったＲＮＡの精製に用いられた。この方法においては、上記のようにして部分精製された核酸またはフェノール・クロロホルムで、直接抽出されたＲＮＡ　（ＣＴＡＢ処理はしない）は結合用緩衝液（約０．５Ｍ　ＮａｃＱと１０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５）中でオリゴｄ　（Ｔ）セルロースと混合した（約２〜４■／試料）。混合液は約４℃で約１時間、穏やかに振とうしながら反応させ、それから約２分間微量遠心分離機で遠沈した。オリゴｄ　（Ｔ）セルロースのペレットは３〜４回結合緩衝液で洗ってそれからポリ（Ａ）尾部をもったＲＮＡをＩＸＴＥ緩衝液（約１０ｍＭトリス、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５）で溶出した。オリゴｄ　（Ｔ）セルロースを除くため遠心分離して上清を集め、そして上清中のウィルスＲＮＡをエタノールで沈殿させた。この段階で得られたＲＮＡは基本的に阻害因子を含まず、ＲＴ−ＰＣＲに使うことができる。

予備的な試験では、ノーワーク・ウィルスのＲＮＡはＣＴＡＢ法を用いて糞便試料０．０５ｇ以下で検出できた。ＣＴＡＢまたはオリゴｄ　（Ｔ）のいずれかだけで抽出したＲＮＡには痕跡の阻害活性がみられたが、これはＲＴ−ＰＣＨの前に抽出された核酸を希釈する（１　：　２）ことによって容易に除かれた。ＣＴＡＢとオリゴｄ（Ｔ）法を組合せると高品質の、阻害因子を含まない、ウィルス染色体のＲＴ−ＰＣＲ検出とクローニングに直接使うことのできるＲＮＡを得ることができた。少量の糞便からクローン化するこの方法の開発で、この技術分野に通じた者は我々がいまや、染色体の５′−末端を表わしているものを含む残りの染色体に対するｃＤＮＡを得ることができることがわかるだろう。

ＰＣＲでの検出のために上記の染色体のヌクレオチド配列に基づくプライマーが作られた。これらのプライマーには以下のものが含まれる。すなわちプライマー１　：　ＣＡＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＴでヌクレオチドの７４４６から７４６３に位置している。プライマー４＝ヌクレオチド７００９から７０２６に位置しているＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＣＣ，プライマー８：ヌクレオチド１４０９から１４２６に位置するＴＣＡＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧ　、プライマー９：ヌクレオチド６１２から６２９に位置するＡＴＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＧＧＴＣ，プライマー１６：ヌクレオチド４０１Ｏから４０２７に位置するＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＡＣ、プライマー１７：ヌクレオチド４６５４かも４６７１に位置しているＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴ、これらのプライマーは逆転写とポリメラーゼ・チェーン・リアクシコン法（ＲＴ −ＰＣＲ）を用いたウィルスの検出に有用であることが示されている。図９はこれらプライマーを用いたデータを示している。

実施例６　ノーワーク・ウィルス　白に・　るポリ　ローナル　とモノクローナル　のＣＤＮＡ断片またはそれの誘導体にコードされている蛋白が原核生物あるいは真核生物の発現系において生産され、診断検査法のためにポリクローナル抗体を製作するために動物を免疫するのに使われる。原核生物の宿主はＥ、　ｃｏｌｉ、　Ｓ。

ｔ　ｍ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ、　５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓのようなグラム陰性、グラム陽性の細菌が含まれる。真核生物の宿主にはＰｉｃｈｉａ　匹匹虹旦のような酵母や昆虫、哺乳動物細胞が含まれる。免疫される動物はモルモット、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、あるいはウマやその他のトリのような非哺乳類や非ネズミの属が含まれる。

発現した蛋白を免疫応答刺激を高めるためにフロイント・アジュバントのようなアジュバントと混合して、これらの動物に繰り返し免疫することによってその蛋白に対する抗体が作られる。

一方、部分ｃＤＮＡ配列から（或いは、元のまたは他のクローンで検出される付加的なｃＤＮＡの配列を決めることによって確かめられた他の配列から）推定されるアミノ酸配列にマツチさせるように作られた１５アミノ酸より大きな合成ペプチドがウシ血清アルブミンまたはりゾチームのようなキャリアー蛋白に結合されるか、またはグルタルアルデヒドで処理することによって架橋され、そして診断検査のためのポリクローナル抗体を生産するために動物に免疫するのに使われる。

発現される蛋白または合成ペプチドで免疫された動物の血清を免疫電顕やウェスタン・プロット（免疫プロット）、ブロッキングＥＬＩＳＡのような免疫学的な分析法で検査してノーワークや関連のウィルスに対する抗体が作られているかどうかを調べる。発現された蛋白あるいは合成ペプチドとの反応はポリクローナル血清の特異性を示している。ノーワーク群において他のウィルスとの反応（スノウ・マウンテン例、ハワイ例、タウントン例など）は交差反応するエピトープを認識する試薬が作られていることを示している。

上述したような免疫源を投与され、ポリクローナル抗体を産生じていることを示しているＢａ１ｂ／ｃマウスに免疫原を追加投与し、それから屠殺した。その膵臓を摘出し、ハイブリドーマとするためにミエローマ細胞と牌細胞の融合を行った。

この融合で生じたハイブリドーマを発現蛋白やペプチド、ウィルス粒子などとの反応でスクリーニングしてノーワーク・ウィルスに対するモノクローナル抗体を産生じている細胞を選択した。ノーワーク関連のウィルスでそのようなハイブリドーマをスクリーニングすることでこれらウィルスに対するモノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマもとらえることができる。

この発明に特徴的な新しい特色が特許請求の囲にみられる。本発明はまたここに含まれるその他のものと同じくその目的を実施し、そして述べられている目標や利点を得るために適合される。この発明についてのここに選んで示された内容は開示のために示されたものでここに述べられた合成や使い方の詳細には多くの変更ができることはこの技術分野に通じる者にとって明白である。しかしながら、開示した特定の形にこの発明を限定するつもりはないが逆にその意向が本発明の意図するところや展開の中で作り方や使い方やそれに当るものに加えられる変更法や修正の全てをカバーすることを理解すべきである。

Ｆ／６／ＰＡＴＩＥＮ下Ｆ／Ｇ　２ＡＦ／Ｇ　２Ｂヨ８ＶｎＯ５／Ｓ工Ｎｌ”１０つ　つＡＶＹＥＡＳＴ　ＮＶ　ＨＡＶ　Ｎ、ＶＲＮＡＲＮＡＲＮＡ　ＲＮＡＦ／Ｇ、　５ＡＡＡ　ｐＵｃＮＶ４　にＦ／６６・　・　・ククｐ−Ｎ　ｅＩ′Ｂ　９６Ｎ０ＲＷＡＬＫ　ＶＩＲＵＳ　ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ　ＢＹ　ＰＣＲ補正書の写しく翻訳文）提出帯（特許法第１８４条の８）平成４年５月７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．【配列があります】【配列があります】の配列をもつたｃＤＮＡ配列とそれから得られる断片及び誘導体で、ノーワーク及びその関連のウイルス染色体の同定または増幅のためその染色体に結合するのに十分な大きさをもつ断片または誘導体。
２．以下に示す配列のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとそれから得られる断片及び誘導体【配列があります】
３．請求項１のｃＤＮＡ配列またはそれから得られる断片及び誘導体の配列から推定されるオリゴペプチドの少くとも１つの抗原部位に特異的に結合するポリクローナル抗体。
４．請求項１のｃＤＮＡ配列またはそれから得られる断片及び誘導体の配列から推定されるオリゴペプチドと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
５．請求項４のハイプリドーマによって生産されるモノクローナル抗体。
６．ノーワーク・ウィルスのｃＤＮＡクローンを転写ベクターにサブクローニングし；その転写ベクターを含むｃＤＮＡを増殖させ；ｉｎｖｉｔｒｏ転写による一本鎖のＲＮＡを生成させるために、ＲＮＡポリメラーゼを添加して；その一本鎖ＲＮＡを分離するというステップを含むノーワークまたはそれに関連のウィルスを検出するためのＲＮＡプローブを作る方法。
７．ノーワークまたはそれに関連のウィルス染色体にｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブが結合するような条件下で検査されるべき試料にノーワークまたはそれに関連のウイルスに特異的なｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを加え；そのｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブの結合量を測定するステップを含むノーワークまたはそれに関連するウィルスを含むと考えられる試料中のノーワークまたはそれに関連するウィルスを同定する方法。
８．食物、水、及び糞便から成る群から検体が選ばれる請求項７の方法。
９．ｐＵＣＮＶ−９５３，ｐＵＣＮＶ−４１４５，ｐＵＣＮＶ−４０９５及びｐＵＣＮＶ−１０１１またはそれらから得られる断片または誘導体からなる群からｃＤＮＡが選ばれる請求項７の方法。
１０．各々が約１０以上のヌクレオチドの少くとも２つのオリゴヌクレオチドをそのオリゴヌクレオチドがノーワークまたは関連のウイルス染色体に結合する条件下で検体に加え；その結合したオリゴヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を増幅し；その増幅した配列の量を測定するステップを含むノーワークまたは関連のウィルスを含むと思われる検体中のノーワークまたは関連のウィルスを同定する方法。
１１．ＣＴＡＢ法を使って核酸を分離し；核酸を増幅し；増幅された産物を測定するステップを含むノーワークまたは関連のウィルスを含むと思われる検体中のノーワークまたは関連のウィルスを同定する方法。
１２．ＣＴＡＢ法に検体をジェネトロンで抽出し；そのジェネトロンで抽出された検体の上清を取り出し；その上清中のウィルスをポリエチレングリコールで沈殿させ；約３７℃で３０分間程ＳＤＳの存在下でプロテイナーゼＫでその沈殿を処理し；その後処理された沈殿物をフェノール・クロロホルム及びクロロホルムで抽出し；約５％のＣＴＡＢと約０．４ＭＮａＣｌの溶液を検体：ＣＴＡＢの比率を約５：２として続いて抽出された検体の上清液に加えることによって混合液を形成し；その混合液をインキュベートし；その混合液を遠心分離して核酸を集め；その核酸を１ＭＮａＣｌ懸濁し、その後にクロロホルムで抽出するというステップが含まれる請求項１１の方法。
１３．核酸について逆転写を行わせ；プライマーを使って核酸を増幅させ；そしてアガロースゲル電気泳動によって増幅された核酸を検出することをさらに含む請求項１１の方法。
１４．ＣＴＡＢ法を使って核酸を分離し；核酸を増幅し；その増幅した核酸をベクターに取り込ませることを含む食物、生物試料及び環境試料からノーワーク・ウィルスまたは病原体をクローニングする方法。
１５．請求項１の、またはそれから得られる断片または誘導体から推定されるオリゴヌクレオチドで動物を免疫することを含むノーワーク及び関連ウィルス蛋白に対する抗体を生産する方法。
１６．免疫応答の刺激を高めるためアジュバントを添加する請求項１５の方法。
１７．アジュバントがフロイントのアジュバントである請求項１６の方法。
１８．動物が烏と哺乳類の中から選ばれる請求項１５の方法。
１９．鳥類がニワトリである請求項１８の方法。
２０．哺乳類がウサギ類、げっ歯類、有蹄類、人類からなる群から選ばれる請求項１８の方法。
２１．げっ歯類がマウス、モルモット、ラットからなる群から選ばれる請求項２０の方法。
２２．ウサギ類がラビットである請求項２０の方法。
２３．有蹄類がヤギ、ウシ、ウマからなる群から選ばれる請求項２０の方法。
２４．アミノ酸配列が請求項１またはそれから得られる断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定される少くとも５アミノ酸からなる合成ペプチドで動物を免疫することを含むノーワーク及びその関連のウィルス蛋白に対する抗体を生産する方法。
２５．アミノ酸配列が請求項１またはそれから得られる断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定される少くとも１５アミノ酸からなる合成ペプチドで動物を免疫することを含むノーワーク及びその関連のウィルス蛋白に対する抗体を生産する方法。
２６．請求項１またはそれから得られる断片または誘導体から推定されるオリゴペプチドを抗原性反応を起させるために動物に免疫し；その抗原性応答を示している動物でポリクローナル抗体の生産を増加させるためそのオリゴペプチドによる免疫を追加投与し；その応答している動物を屠殺し、脾臓を摘出し；その脾臓からとった脾細胞をミエローマ細胞と融合し；そして請求項１，またはそれから得られる断片または誘導体から推定されるオリゴペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体を生産していることで融合した細胞を検索するというステップを含むハイプリドーマを作る方法。
２７．抗原性反応を起させるために、請求項１またはそれから得られる断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に相応するように作られた少くとも５アミノ酸からなる合成ペプチドで動物を免疫し；その抗原性応答を示している動物においてポリクローナル抗体の生産を増やすためにその合成ペプチドで免疫している動物にさらに追加免疫し；その応答のある動物を屠殺して脾臓を摘出し；その脾臓からとった脾細胞をミエローマ細胞と融合し；請求項１またはそれからの断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定されるオリゴペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体の生産をしていることについて融合した細胞を検索するというステップを含むハイプリドーマを生産する方法。
２８．抗原性応答を起させるために請求項１またはそれから得られる断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に相応するように作られた少くとも１５アミノ酸からなる合成ペプチドで動物を免疫し；その抗原性応答を示している動物においてポリクローナル抗体の生産を増やすためにその合成ペプチドで免疫している動物にさらに追加免疫し；その応答のある動物を屠殺して脾臓を摘出し；その脾臓からとった脾細胞をミエローマ細胞と融合し；請求項１またはそれからの断片または誘導体のｃＤＮＡ配列から推定されるオリゴペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体の生産をしていることについて融合した細胞を検索するというステップを含むブリドーマを生産する方法。