KR20020008069A

KR20020008069A - 진단 분석법

Info

Publication number: KR20020008069A
Application number: KR1020010043194A
Authority: KR
Inventors: 총진 온; 웨이닝 첸
Original assignee: 추후제출; 싱가폴 공화국 정부
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-18
Publication date: 2002-01-29
Anticipated expiration: 2021-07-18
Also published as: IL143739A; CN1223682C; CN1333378A; IL143739A0; HK1040096A1; RU2228530C2; CA2349743A1; SG90149A1; AU772692B2; BR0102408A; JP2002330780A; EP1174523A3; US20030017450A1; CN1680592A; AU5014001A; EP1174523A2; TWI248515B; TWI240005B; NZ528214A; KR100602771B1

Abstract

본 발명은 일반적으로 바이러스 병원체, 특히 B형 간염 바이러스의 존재를 검출하기 위한 핵산 기초 분석법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 B형 간염 바이러스 핵산 서열들을 검출하기 위하여 일 단계 증폭 분석법을 제공한다. 본 발명의 분석법은 자동화에 용이하게 적용될 수 있고, 테스트될 샘플들의 빠른 처리를 가능하게 한다. 본 발명은 또한 B형 간염 바이러스에 대한 핵산 기초 검출 분석법을 수행하는 데 이용할 수 있는 제제들과 상기 제제들을 포함하는 키트를 제공한다.

Description

진단 분석법{DIAGNOSTIC ASSAY}

본 발명은 일반적으로 바이러스 병원체(viral pathogen), 특히 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus)의 존재를 검출하기 위한 핵산 기초 분석법(nucleic acid-based assay)에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 B형 간염 바이러스 핵산 서열(hepatitis B viral nucleic acid sequence)들을 검출하기 위하여 일 단계 증폭 분석법(single-step amplification assay)을 제공한다. 본 발명의 분석법은 자동화에 용이하게 적용될 수 있고, 테스트될 샘플들의 빠른 처리(through-put)를 가능하게 한다. 본 발명은 또한 B형 간염 바이러스에 대한 핵산 기초 검출 분석법을 수행하는 데 이용할 수 있는 제제(agent)들과 상기 제제들을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.

본 명세서에서 숫자로서 언급되는 관련서적들의 서지 사항은 발명의 상세한 설명의 끝 부분에 정리하였다.

B형 간염 바이러스(이하 "HBV"라 함)는 쇠약하게 하는 질병 상태와 간경화 (cirrhosis) 및 원발성 간암(primary liver cancer)으로부터 나오는 급성 간 장애 (acute liver failure)에 이를 수 있다. HBV는 매년 수백만의 개체들을 감염시키고 있으며 이로 인하여 매년 적어도 백만 명 이상이 사망하고 있다.

HBV는 RNA 중간체(RNA intermediate)를 통하여 복제를 하고 그 복제 방법(replication strategy)에서 역전사(reverse transcription)를 이용하는 DNA 바이러스이다. HBV 게놈(HBV genome)은 다양한 바이러스 단백질(viral protein)들을 인코딩하는 열린 번역틀(open reading frame)을 중첩하면서 부분적 이중가닥 DNA 구조(partially double stranded DNA structure)를 갖는 복합특성을 갖는다.

HBV 백신의 유용성에도 불구하고, 수억의 인구들이 바이러스를 지니고 있다. HBV는 일반적으로 HBV 표면 항원(HBV surface antigen)(HBsAg), 바이러스 핵심 항원(viral core antigen)(HBcAg) 및 HBeAg(안티-HBeAg)에 대한 항체(antibody)들의검출에 의하여 확인된다.

HBV 감염 또는 HBsAg 백신 접종 후에, 혈청 항체(serum antibody)들이 HBsAg(안티-HBs)에 나타난다. 이는 HBsAg의 면역 기초 검출(immune-based detection)을 위한 기본이었다. 이러한 검출 시스템에서, HBsAg와 안티-HBs 중의 하나가 스크린된다. 분석법은 HBV에 대한 수혈(transfusion) 이전에 혈액을 스크린하고, 급성 및 만성 간염, 간경화 및 원발성 간암 환자들에게서 HBV 관련 간질병을 검출하고, 이식 제공자 및 피제공자(transplantation recipients and donors)들에서와 같이 HBV 운반체(carrier)들에 대해 스크린하는 데 사용되어 왔다.

HBsAg는 "a" 결정인자(1)로 언급되는 항원 영역(antigenic region)을 포함한다. "a" 결정인자는 복합적(complex)이고, 입체형태(conformational)이며, 보존된 시스테인 잔기(cysteine residue)들 중 이황 결합(disulphide bonding)에 의해 결정된다. "a" 결정인자에서 변화에 이르는 유전자 변이(genetic variation)는 기존의 백신들(2-6)에 발생하는 면역 대응(immunological response)을 탈출하는 HBV 변이에 관련되었다. 하나의 특히 일반적인 변이는 HBsAg의 아미노산 위치 145(G145F)에서 글라이신(G)에서 아르지닌(R)으로의 치환(glycine to arginine substitution)이다. 이러한 변이는 "a" 항원 결정기 영역(epitope region)에 작용한다.

HBV 감염을 치료하고 방지하는 데서 화학적 면역적 간섭(intervention)에 대한 의존이 증가하는 것은 간섭치료(interventionist therapy)에 저항력을 갖는 HBV의 변이종의 응급상황에 대해 더 큰 선택압(selective pressure)을 야기한다. HBV의 중첩 게놈 구조(overlapping genomic structure)로 인하여, HBV 변이종들은 화학적 제제 또는 백신들을 이용하여 직접적 또는 간접적으로 선택될 수 있다.

결과적으로 HBsAg에 대한 기존의 항체 기초 분석법은 잘못된 음성적인 결과들을 야기할 수 있다. 이는 질병의 확산을 제어하는 것과 환자의 관리에서 매우 중요한 의미를 가질 수 있다.

본 발명에 이르는 연구에서, 발명자는 HBV에 대한 다른 분석법을 찾았다. 본 발명에 따르면, 발명자들은 면역 검출 바이러스 표지자(immuno-detectable viral marker)를 나타내거나 아닐 수 있는 HBV로부터의 HBV 핵산 서열(HBV nucleic acid sequence)들에 대해 스크린하기 위한 단일 단계 핵산 증폭 분석법(single-step nucleic acid amplification assay) 을 개발하였다. 본 발명의 핵산 기초 분석법은 특히 이러한 제제들이 기존의 면역기초 진단 시험에 의하여 검출될 수 없는 경우에 HBV 제제에 대해 민감한 분석법(sensitive assay)을 제공한다. 또한 본 발명의 검출법은 HBV 변이종들 중에서 보전 영역을 기초로 하는 특정한 면역글로불린 (immunoglobulin)(예를 들어, IgG) 및 백신들의 개발을 가능하게 한다.

본 명세서를 통하여, 내용이 다르게 요구하지 않는, "포함하는" 또는 "포함하다" 라는 말은 언급된 구성요소 또는 구성요소들의 집단으로 구성되는 것을 의미하며 임의의 다른 구성요소 또는 다른 구성요소들의 집단을 배제하는 것을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 하나의 특징은 샘플에서 HBV 유도 핵산 표적 서열(HBV-derived nucleic acid target sequence)을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태(single stranded form)를 산출하기 위하여 샘플이 변성조건(denaturing condition)을 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머(primer)들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 변이 생성될 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성하고, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물(extension product)을 형성하도록 그들의 3' 말단(3' termini)으로부터 연장 가능하다),

상보성 연장 산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 조건을 샘플이 거치게 하는 단계, 및

증폭 산물의 존재를 검출하는 단계(여기서 상기 증폭된 산물은 상기 HBV 유도 핵산 표적 서열을 표시한다)를 포함한다.

본 발명의 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 핵산 표적 서열(HBV-derived nucleic acid target sequence)을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태(single stranded form)를 산출하기 위하여 샘플이 변성조건(denaturing condition)을 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 변이 생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이생성되는 가닥에 상보적인 연장산물(extension product)을 형성하도록 그들의 3'말단으로부터 연장 가능하고, 프라이머들은 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)내의 또는 일부의 보존된 뉴클레오티드 서열에 대응 또는 인접하는 구역들로 변이생성하도록 선택된다),

상보성 연장산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 조건을 샘플이 거치게 하는 단계, 및

증폭 산물의 존재를 검출하는 단계(여기서, 상기 증폭된 산물의 존재는 상기 HBV 유도 핵산 표적 서열을 표시한다)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 HBV 유도 mRNA로부터 단일 또는 이중가닥의 cDNA 분자들을 산출하기 위하여 역전사 조건을 상기 샘플이 선택적으로 거치게 하는 단계,

상기 표적 서열에 대응하는 단일 가닥 DNA 분자들을 산출하기 위하여 샘플이 변성조건을 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 DNA 가닥으로 변이생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머들은 상기 최초 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장 가능하다),

상보성 연장산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 증폭 조건을 샘플들이 거치게 하는 단계, 및

증폭 산물을 검출하는 단계(여기서, 상기 증폭된 산물의 존재는 상기 HBV 유도 DNA 표적 서열을 표시한다)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 HBV 유도 mRNA로부터 단일 또는 이중가닥의 cDNA 분자들을 산출하기 위하여 상기 샘플이 역전사 조건(reverse transcription conditions)을 선택적으로 거치게 하는 단계,

상기 표적 서열에 대응하는 단일 가닥 DNA 분자들을 산출하기 위하여 샘플이 변성조건을 거치도록 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머를 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 DNA 가닥으로 변이생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장가능하고, 상기 프라이머들의 하나는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자(reporter molecule)로 표지(label)되고, 상기 프라이머들의 다른 하나는 포획가능한 모이어티(capturable moiety)로 표지된다),

하나의 가닥에 확인된 신호를 제공할 수 있는 지기기 분자와 다른 가닥상의 고형지지(solid support)로의 포획가능한 모이어티를 갖는 상보성 연장산물들을 포함하는 증폭 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 조건을 상기 샘플이 거치게 하는 단계,

그것의 포획가능한 모이어티를 통하여 증폭산물을 고정시키는 단계, 및

검출가능한 신호에 대해 스크린하는 단계(여기서, 신호의 존재는 증폭 산물을 표시하고 그럼으로써 HBV-유도 표적 DNA 서열을 표시한다)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 고형지지에 고정된 프라이머 및 용액 상의 제2 프라이머를 갖는 반응 용기에 상기 샘플을 도입하는 단계(여기서, 양쪽 프라이머들은 HBV 게놈상의 보존된 구역내의, 가까운, 또는 인접한 구역에서 HBV 유도DNA의 상보성 단일 가닥들 상의 상보성 뉴클레오티드 서열로 변이생성할 수 있고, 용액상 프라이머(solution phase primer)는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자로 표지된다),

반응 용기(reaction vessel)가 증폭을 할 수 있는 조건을 거치게 하는 단계, 및

확인 가능한 신호의 존재를 검출하는 단계(여기서 상기 신호의 존재는 HBV 유도 DNA의 존재를 표시한다)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 HBV의 동일한 또는 다른 가닥들 또는 변이종으로부터 하나 또는 그 이상의 HBV 유도 DNA 표적 서열들을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 단일 가닥 형태의 HBV 유도 DNA를 추정적으로 포함하는 샘플을 개별적으로 고정되거나 또는 용기내의 고형지지로의 배열 내의 두 개 또는 그 이상의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 반응 용기는 추가적으로 고형 지지에 고정된 짝(partner)을 갖는 용액상 프라이머(solution phase)들을 포함하고, 여기서 고정된 프라이머와 그것의 용액상 짝 프라이머(solution phase partner primer)는 증폭 조건하에서 HBV 유도 DNA의 구역을 증폭할 수 있고, 여기서 용액상 프라이머는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자를 운반하여 고형 지지상의 정의된 위치에서 신호의 존재가 특정한 HBV 격리 또는 변이종의 확인을 가능하게 한다)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 고형 지지에 고정된 두 개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열을 제공하며, 상기 프라이머들은 HBV 유도 DNA로부터 상보성 뉴클레오티드 서열로 변이생성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 매트릭스(matrix)의 사용을 제공하는 데, 상기 매트릭스는 매트릭스(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)상의 좌표를 갖는 식 a₁, a₂, ... , a_n에 의하여 정의되는 올리고뉴크레오타이드(oligonucleotide)의 배열(array)을 포함한다(여기서, a₁a₂....a_n은 n뉴클레오티드들을 합계하는 동일한 또는 다른 올리고뉴클레오티드들을 나타내고 각각의 올리고뉴클레오티드는 격자 좌표(grid coordinate)들(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)에 의하여 정의될 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드들은 b₁b₂....b_n에 의하여 정의되는 증폭짝(amplification partner)들을 가짐으로서 올리고뉴클레오티드들 a₁b₁, a₂b₂...a_nb_n은 HBV 유도 DNA의 상보성 가닥들로 변이생성할 수 있고, 여기서 개재 DNA(intervening DNA)는 HBsAg 변이종들과 같은 둘 또는 그 이상의 HBV 변이종들 사이에서 보존되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 매트릭스는 상기 HBV 유도 DNA의 보존된 증폭 구역을 지니게 됨으로서 정의되는 특정 HBV 제제를 검출하기 위하여 이용될 수 있다).

도1은 HBV 표면 항원(HBV surface antigen)의 구조적인 조직을 도시하는 개략도.

도2는 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드(<400>1과 <400>2)를 이용하는, 면역 기초 진단 키트에 의하여 HBsAg에 대하여 음성적이고, 안티 HBc 및 안티 HBs에 대하여 양성적인 테스트 샘플들로부터 PCR 증폭된 HBV 조각의 전기 영동 패턴(electrophoresis pattern)을 도시하는 사진도.

도1은 HBV 표면 항원(HBV surface antigen)의 구조적인 조직을 도시하는 개략도이다. (A) 보전된 "a" 결정인자를 커버하는 주 친수루프(major hydrophilic loop)의 국부화(Chen et al.(7)로부터 변형됨). 아미노산 잔기(amino acid residue)에서 전체 길이의 HBsAg 크기는 (1-400)으로 표시된다. preS1(1-118), preS2(119-174) 및 주 HBsAg(175-400)의 위치는 박스 아래에 표시된다. 전체 길이의 HBsAg에 관련된 주 친수루프의 위치가 또는 표시된다. 주 HBsAg(SHBsAg)내의 주 친수루프의 해당 위치는 아미노산 100에서 160에 이르고, 보존된 "a" 결정인자는 SHBsAg내의 124로부터 147이다. (B) SHBsA에 대하여 코딩하기 위한 구역의 게놈 위치. 코딩 구역의 5'-종단 및 3'-종단의 위치들은 박스 아래에 표시된다(각각 HBV 게놈의 nt 156 및 835, 위치 1은 그것의 젠뱅크 수납번호(Genbank accession number)인 Z35717의 야생형 HBV의 EcoRI 자리-GAATTC(<400>3)의 제1A 뉴클레오티드로서 정의된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 위치(<400>1 및 <400>2)는 또한 박스 아래에 표시된다(각각 HBV 게놈의 nt 456 및 689로부터 시작됨). 본 발명의 프라이머 올리고뉴클레오티드(<400>1 및 <400>2)를 이용하는 PCR 증폭된 DNA 조각의 크기는 박스 아래에 표시된 것과 같이 223 염기쌍들(bp)이다.

도2는 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드(<400>1과 <400>2)를 이용하는, 면역 기초 진단 키트에 의하여 HBsAg에 대하여 음성적이고, 안티 HBc 및 안티 HBs에 대하여 양성적인 테스트 샘플들로부터 PCR 증폭된 HBV 조각의 전기영동 패턴(electrophoresis pattern)을 도시하는 사진도이다. 분자 크기의 표지자(100 bp 사다리(ladder), MBI 효소(fermentas))의 이주 위치(immigration position)는 레인 4에 표시된다. 레인 1은 표 1에서 제1 테스트 샘플에 해당한다. 레인 2는 표1a 내지 표1f의 제2 테스트 샘플에 해당한다. 레인들 6과 9는 각각 테이블 1의 제3 및 제4 테스트 샘플들에 해당한다. 유사한 바이러스 표지자(viral marker)(HBsAg에 대하여 음성적이고 안티 HBc 및 안티 HBs에 대하여 양성적인)를 나타내는 테스트 샘플들을 표시하는 증폭 산물들이 레인들 3, 5, 7 및 9에는 없다.

본 발명은 부분적으로는 HBV 변이종들중에서 보존되는 뉴클레오티드 서열의 확인에 관한 것이고, HBV에 대한 증폭 기초 진단 분석법에 대한 프라이머를 개발하기 위한 그들의 이용에 관한 것이다

보다 명확한 설명을 위하여 몇몇 용어를 이하 정의한다.

"증폭 혼합물(amplification mixture)"은 표적 바이러스 유도 핵산 서열을 증폭하기 위하여 필요한 다양한 시약(reagent)을 포함하는 수용액(aqueous)을 가리킨다. 이들은 효소, 수성의 완충액(aqueous buffer), 염(salt), 표적 핵산(target nucleic acid) 및 삼인산 디옥시뉴클레오사이드(deoxynucleoside triphosphates)를 포함한다.

"증폭 시스템(amplication system)"은 핵산(nucleic acid)의 표적 서열의 카피(copy)들을 다중화하기 위한 시험관내 수단(in vitro means)을 가리킨다.

"증폭 시약(amplification reagent)"은 증폭을 위하여 요구되는 다양한 완충액(buffer), 효소(enzyme), 프라이머(primer) 및 삼인산 디옥시뉴클레오사이드 (deoxynucleoside triphosphates)를 가리킨다.

"핵산(nucleic acid)"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 라이보뉴클레오티드 (ribonucleotide) 또는 데옥시라이보뉴클레오티드 폴리머(deoxyribonucleotide polymer)를 가리킨다.

"폴리머라아제(polymerase)"는 삼인산 뉴클레오사이드 전구체(nucleoside triphosphate precursor)들로부터 DNA의 합성을 촉매반응시킬수 있는 효소를 가리킨다. 본 발명의 PCR 증폭에서 폴리머라아제는 바람직하게는 틀 의존적(template-dependent)이고 열안정적(thermostable)이며, 일반적으로 연장되는 DNA 폴리머의 3'-말단으로 뉴클레오티드를 추가한다.

"올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)'는 둘 또는 그 이상의 라이보뉴클레오티드 또는 데옥시라이보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 포함하는 분자를 가리킨다.

"프라이머(primer)"는 자연적 또는 합성적이건 간에 표적 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물(primer extension product)의 합성이 유도되는 조건하에서 DNA 합성의 초기화 지점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)를 가리킨다. 이러한 조건은 적절한 완충액과 적절한 온도에서 4개의 다른 삼인산 뉴클레오사이드 및 폴리머라아제를 포함한다. 프라이머는 바람직하게는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머 이용의 목적 및 조건(표적 핵산, PCR 고리화 조건(PCR cycling condition) 및 프라이머의 합성을 포함한다)에 의존한다.

본 발명은 샘플에서 HBV 유도 핵산 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태를 산출하기 위하여 샘플이 변성조건을 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 변이 생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성할 수 있고, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이 생성하는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장 가능하다),

상보성 연장 산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하기 위하여 샘플이 증폭을 할 수 있는 조건을 거치게 하는 단계, 및

하나의 실시예에서, 표적 서열은 HBV 변이종들, 특히 변형된 HBsAg의 변이종을 갖는 HBV 변이종들 중에서 보존되는 HBV 게놈상의 구역에 해당한다. 변형된 HBsAg는 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 단일 또는 다중 뉴클레오티드 치환, 삭제 및/또는 추가에서 기인하는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 삭제 및/또는 추가를 포함할 수 있다. HBV 게놈에서 보존된 구역, 특히 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내의 보존된 구역은 HBsAg로의 면역적 변화(immunological changes)에도 불구하고 상대적으로 안정될 수 있다. 결과적으로 면역기초 HBsAg 분석법에서 더 이상 검출되지 않는 HBV 변이종들은, 본 발명에 따라서, HBsAg 유전자에서 보존된 구역을 통하여 여전히 검출 가능하다. 본 발명은 그러나 변경되거나 또는 새로운 항원 결정기(예를 들어, HBsAg 상에서)에서 발생하는 것과 같은 HBV 게놈의 변형하는 구역을 확인하는 본 방법의 이용용까지 확대된다.

HBsAg 변이종이라 함은 또한 DNA 폴리머라아제와 같은 다른 중첩 유전자(overlapping gene)에서의 변이종들을 포함한다.

본 발명의 이러한 특징과 다른 특징들은 "핵산 분자 인코딩(nucleic acid molecule encoding)", "뉴클레오티드 서열 인코딩(nucleotide sequence encoding)" 및 유전자 서열 인코딩(genetic sequence encoding)"과 같은 용어에 포함되는 "유전자"라는 용어에 의하여 제한되지 않는다.

용어 "유전자"는 가장 광범위한 의미에서 사용되고 유전자의 엑손(exon)에 해당하는 cDNA를 포함한다. 따라서 여기서 "유전자"라 함은

(i) 전사 및/또는 번역 조절 서열들 및/또는 코딩 구역 및/또는 비번역 서열들(예를 들어, 인트론(intron), 5'- 및 3'- 비번역 서열들(5'- and 3'- untranslated sequences))을 포함하는 고전의 염색체 유전자(genomic gene), 또는

(ii) 코딩 구역들(즉, 엑손)에 해당하는 mRNA 또는 cRNA와 유전자의 5'- 및 3'- 비번역 서열들을 포함한다.

용어 "유전자"는 또한 발현산물(expression product)의 모든 또는 일부를 인코딩하는 인공 또는 합성 분자들을 설명하기 위하여 이용된다. 특정한 실시예에서, 용어 "핵산분자" 및 "유전자"는 상호 교환적으로 이용될 수 있다.

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 변이 생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이생성되는 가닥에 상보적인 연장산물을 형성하도록 그들의 3'말단으로부터 연장 가능하고, 프라이머들은 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내의 또는 일부의 보존된 뉴클레오티드 서열에 대응 또는 인접하는 구역들로 변이 생성하도록 선택된다),

샘플은 일반적으로, 그러나 배타적이지 않게, 조직 또는 조직 추출물(tissue extraction), 혈액 또는 배설물(excretia)을 포함하는 유체, 또는 HBV 입자들 또는 HBV DNA, mRNA 또는 RNA 복제 중간체를 잠재적으로 포함하는 다른 물질들로 구성되는 생물학적 샘플이다. 제1단계는 일반적으로 바람직한 실시예에서, 인간을 포함하는 포유류 대상으로부터 샘플을 격리시키는 것을 포함한다. 샘플은 또한 주변 샘플(environmental sample) 또는 HBV 전염의 잠재적인 출처로부터의 샘플일 수 있다.

본 발명이 특히 HBV 변이종, 즉 HBsAg의 적어도 한 형태에 대한 항체가 더 이상 실질적으로 상호작용하지 않는 변이종들을 "탈출(escape)" 하는 것을 목적으로 함에도 불구하고, 본 발명은 또한 HBV 변이종들, 특히 임상적으로 관련된 HBV 변이종 들 중에서 보존되고, 실용적인 표적 서열로서 역할을 하는 HBV 게놈의 구역으로 확장된다. 특히 HBV 게놈상에서 고려되는 유용한 구역들은 새로운 항원 결정기 또는 HBsAg를 인코딩하는 것들이다. 이러한 구역들은 진단 목적에 대하여 제조합형 펩타이드(recombinant peptide)를 생성시키는 데 유용하다.

본 발명은 따라서 HBV 유도 핵산 서열들을 검출함으로서 HBV을 검출하기 위한 수단을 제공한다. "HBV 유도" 핵산 서열은 HBV 게놈 자체, 그것의 단일 가닥 DNA 형태, 리버스 트란스크립테이스(reverse transcriptase)를 이용하여 준비되는 cDNA 단일 또는 이중 가닥 분자들은 물론이고 RNA 복제 중간체를 포함한다. 후자에 있어서, HBV 유도 뉴클레오티드 서열로부터의 mRNA 전사물(transcript)은 상보성 DNA 가닥을 생성하기 위하여 역전사(reverse transcription)를 거치게 된다. 후자의 가닥 및/또는 그 DNA 보체(complement)는 증폭반응의 대상이 될 수 있다. RNA 복제 중간체 및/또는 HBV 유도 mRNA에 해당하는 cDNA의 검출은 또한 활성 바이러스 복제를 표시한다.

중합효소 연쇄 반응(PCR; polymerase chain reaction), 연결 연쇄반응 (ligation chain reaction), 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification), Q 레플리케이스 기초 증폭(Q replicase based amplification), 가닥 치환 방법(strand displacement method), 회전 원형 증폭(rolling circleamplification) 및 재순환 대립유전자 -특이 프라이머 연장(recirculating allele-specific primer extension)을 제한됨이 없이 포함하는임의의 형태의 증폭 반응이 본 발명의 수행에서 사용될 수 있다. 그러나 바람직하게는 PCR이 사용된다.

따라서 본 발명의 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 HBV 유도 mRNA로부터 단일 또는 이중가닥의 cDNA 분자들을 산출하기 위하여 역전사 조건을 상기 샘플이 선택적으로 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 DNA 가닥으로 변이 생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머들은 상기 최초 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장 가능하다),

증폭 산물을 검출하는 단계(여기서, 상기 증폭 산물의 존재는 상기 HBV 유도 DNA 표적 서열을 표시한다)를 포함한다.

특정한 바람직한 실시예에서, 프라이머들은 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내에서 선택된다. 가장 바람직하게는 프라이머들은 <400>1[센스 프라이머 (sense primer)]이고 <400>2[안티센스 프라이머]이다. 본 발명은 또한 <400>1 또는 <400>2 또는 낮은 엄격 조건(stringency condition)에서 그들의 보체로 변이 생성할 수 있는 프라이머들 뿐만 아니라 <400>1 또는 <400>2에 적어도 대략 70%의 유사성(similarity)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머들까지 확장된다.

여기에서 사용되는 용어 "유사성"이란 뉴클레오티드 레벨에서 비교되는 서열들 사이에서 실질적인 동질성(identity)을 포함한다. 뉴클레오티드 레벨에서 비동질성(non-identity)이 있는 경우에, "유사성"은 구조적, 기능척, 생화학적 및/또는 입체형태 레벨에서 서로 관련되는 다른 아미노산들의 원인이 되는 서열들 사이의 차이점을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 뉴클레오티드 서열 비교는 유사성보다는 동질성의 레벨에서 수행된다.

두 개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드사이의 서열관계를 설명하기 위하여 사용되는 용어는 "기준 서열(reference sequence)", "비교창 (comparison window)", 서열 유사성(sequence similarity)", "서열 동질성 (sequence identity)", "서열 유사성 퍼센트", "서열 동질성 퍼센트", "실질적으로 유사" 및 "실질적 동질"을 포함한다. "기준 서열"은 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기들을 포함하여, 30 모노머 유닛(monomer unit)들과 같이, 그 길이에서 적어도 12그러나 자주는 15 내지 18, 그리고 가끔은 적어도 25 또는 그 이상이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드들 각각은 (1) 두 개의 폴리뉴크레오타이드들 사이에서 유사한 서열(즉, 단지 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 부분)과 (2) 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 분지 서열(divergent sequence)을 포함하기 때문에, 두 개의(또는 그 이상의) 폴리뉴클레오티드들 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국부 구역을 확인하고 비교하기 위하여 "비교창(comparison window)"에 대하여 두 개의 폴리뉴클레오티드의 서열들을 비교함으로서 수행된다. "비교창"은 기준 서열에 비교되는 일반적으로 12 인접 잔기(contiguous residue)들의 개념적 분절(conceptual segment)을 가리킨다. 비교창은 두 개의 서열들의 최적의 배열을 위한 기준 서열(이는 부가나 결손을 포함하지 않는다)에 비교하여 대략 20 % 또는 그 이하의 부가 또는 결손(즉, 갭(gap)들)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열들의 최적의 배열은 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)의 컴퓨터 실행에 의하여 또는 선택된 다양한 방법들 중의 임의의 하나에 의하여 발생하는 정밀검사 및 최선의 배열(즉, 비교창에 대한 최고의 퍼센트의 상동(homology)을 일으키는) 의하여 수행될 수 있다. 또한 예를 들어 Altschul et al.(8)에 개시된 프로그램의 BLAST 패밀리(BLASTfamily)를 참조할 수 있다. 서열 분석의 상세한 검토는 Ausubel et al.(9)의 유닛 19.3에 개시된다.

여기서 사용되는 용어들 "서열 유사성" 및 "서열 동질성"은 서열이 비교창에대한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드(nucleotide-by-nucleotide)에 기초하여 동일한 또는 기능적으로 구조적으로 유사한 범위를 말한다.

따라서 예를 들어 "서열 동질성 퍼센티지"는 비교창에 대하여 최적으로 배열된 두 개의 서열들을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 짝맞춤 위치(matched position)의 개수를 산출하기 위하여 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하고, 비교창(즉 창 크기(window size)에서 위치들의 전체 개수에 의하여 짝맞춤되는 위치의 개수를 나누고, 서열 동일성의 퍼센티지를 산출하기 위하여 결과에 100을 곱함으로서 계산된다. 본 발명의 목적에 대하여 "서열 동일성"은 소프트웨어를 동봉하는 참조 매뉴얼에 사용되는 표준 디폴트(standard default)를 이용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램(Version 2.5 for windows; available from Hitachi Software engineering Co., Ltd. South San Francisco, California, USA)에 의하여 계산된 "짝맞춤 퍼센티지(matching percentage)"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 서열 유사성과 관련하여 유사한 설명이 적합하다.

여기서 낮은 엄격도(low stringency) 함은 적어도 대략 0 에서 적어도 대략 15% v/v의 포름아마이드(formamide)와 튀기 생성을 위한 적어도 대략 1M에서 적어도 대략 2M의 염, 및 세척 조건에 대한 적어도 1M에서 적어도 2M의 염을 포함한다. 온도는 변화하며 더 높은 온도들이 포름아마이드를 대체하고 대체 엄격 조건 (stringency condition)을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 적어도 대략 16%v/v에서 적어도 대략 30%v/v의 포름아마이드, 그리고 적어도 대략 0.5M에서 적어도 대략0.9M의 튀기생성을 위한 염, 그리고 적어도 대략 0.5 M에서 적어도 대략 0.9M의 세척 조건을 위한 염을 포함하고 중간의 엄격도(medium stringency) 또는 적어도 대략 31%v/v에서 적어도 대략 50%v/v의 포름아마이드와 적어도 대략 0.01M에서 적어도 대략 0.15M의 튀기생성을 위한 염과 적어도 대략 0.01M에서 적어도 대략 0.15M까기의 세척 조건의 위한 염을 포함하는 높은 엄격도와 같은 다른 엄격 조건(stringency condition)들이 필요한 곳에 적용될 수 있다. 일반적으로 세척은 T_m= 69.3 + 0.41(G+C)%로 수행된다(10). 그러나 두가닥 DNA의 T_m은 틀린짝 염기쌍 (mismatch base pairs)의 개수의 매 1% 증가에 대하여 1 ℃씩 감소한다(11). 포름아마이드는 이러한 튀기생성 조건들에서 선택적이다. 따라서, 특히 바람직한 레벨의 엄격도는 다음과 같이 정의된다. 낮은 엄격도(stringency)는 6 x SSC 완충액 (buffer), 25-42℃에서 0.1% w/v SDS이고, 중간 엄격도는 2 × SSC 완충액, 20-65℃ 범위의 온도에서 0.1% w/v SDS이며, 높은 엄격도는 0.1× SSC 완충액, 적어도 65℃의 동도에서 0.1% w/v SDS이다.

여기서 "프라이머(primer)"라 함은 구조, 크기 또는 기능에 제한되지 않는다. 프라이머는 증폭 분자(amplication molecule)로서 사용될 수 있고 튀기생성 목적의 탐지자(probe)로서 사용될 수 있다. 분자의 바람직한 형태는 증폭을 위한 핵산 프라이머이다.

여기서, "핵산 프라이머(nucleic acid primer)"라 함은 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 데옥시라이보뉴클레오티드 또는 라이보뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 일반적으로 핵산 프라이머는 대략 3에서 대략 100의 뉴클레오티드, 바람직하게는 대략 5에서 대략 50의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 대략 5에서 대략 25의 뉴클레오티드를 포함한다. 50 뉴클레오티드 이하를 갖는 프라이머는 여기서 "올리고뉴클레오티드 프라이머"로 언급된다. 본 발명의 프라이머들은 예를 들어 뉴클레오티드의 단계적 부가(stepwise addition)에 의하여 합성적으로 생산되거나 또는 다른 핵산 분자들의 조각(fragment), 부분(part), 일부분(portion), 연장산물 (extension product)일 수 있다. 용어 "프라이머"는 그 가장 일반적인 의미에서 증폭 목적으로 사용될 때 DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성의 시작에 대한 유리 3' 하이드록실기(free 3' hydroxyl group)를 제공하는 임의의 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. DNA 합성은 프라이머가 튀기생성되는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장산물을 산출하기 위한 프라이머의 연장을 발생시킨다.

연장 산물을 산출하기 위하여 튀기 생성된 프라이머의 연장은 여기서 용어 "증폭(amplification)"에 의하여 포함된다. 증폭은 일반적으로 프라이머 튀기 생성 및 연장이 뒤따르는 변성 사이클들에서 발생한다. 본 발명은 대략 1 사이클에서 대략 120 사이클, 바람직하게는 대략 2 사이클에서 70 사이클, 더욱이 바람직하게는 10, 15, 20, 25 및 30 사이클들을 포함하는 대략 5 사이클에서 40 사이클을 포함한다.

증폭 산물(이하 앰플라이머(amplimer)라 칭함)은 임의의 적절한 수단에 의하여 검출될 수 있다. 하나의 실시예에서, 증폭 산물은 전기영동(electrophoresis)에 의하여 분리되고, 예를 들어 브롬산 에티디움 염색(ethidium bromide staining)후에 자외선(ultralviolet)을 사용하여 가시화된다. 다르게는 증폭 산물은 HPLC와 같은 다양한 형태의 크로마토그래피(chromatography) 또는 MALDI-TOF와 매스 스펙트로메트리(mass spectrometry)와 같은 분광광도법을 이용하여 분리(resolved)된다. 또 다르게는 지시기 분자(reporter molecule)로 표지된 프라이머를 이용한다. 후자에 관하여 프라이머들 중의 하나는 지시기 분자로 표지되고, 프라이머들중의 다른 것들은 지시기 신호(reporter signal)에 의하여 확인되는 고형 지지(solid support)로의 고정 앰플라이머(anchor amplimer)로의 포획 모이어티(capturing moiety)로 표지된다. 이러한 실시예는 증폭을 위하여 사용되는 프라이머 세트들 또는 프라이머들의 제2의 세트(nested set)로 실행된다. 그러나, 바람직한 실시예에서 단지 단일 세트의 프라이머들이 사용되기 때문에 분석법은 단일단계 증폭 분석법(single step amplification assay)이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 HBV 유도 mRNA로부터 단일 또는 이중가닥의 cDNA 분자들을 산출하기 위하여 상기 샘플이 역전사 조건을 선택적으로 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머를 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 DNA 가닥으로 변이생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이생성할 수 있으며, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장가능하고, 상기 프라이머들의 하나는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자로 표지되고, 상기 프라이머들의 다른 하나는 포획가능한 모이어티로 표지된다),

하나의 가닥에 확인된 신호를 제공할 수 있는 지기기 분자와 다른 가닥상의 고형지지로의 포획가능한 모이어티를 갖는 상보성 연장산물들을 포함하는 증폭 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 조건을 상기 샘플이 거치게 하는 단계,

검출가능한 신호에 대해 스크린하는 단계(여기서, 신호의 존재는 증폭 산물을 표시하고 그럼으로써 HBV 유도 표적 DNA 서열을 표시한다)를 포함한다.

상술한 분석법에 대한 많은 변형들이 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 증폭반응은 용기 또는 우물의 벽에 고정된 포획 분자를 갖는 용기 또는 마이크로역가 우물(microtitre well)에서 발생할 수 있다. 포획분자는 예를 들어 앰플라이머 또는 프라이머들 중의 하나의 포획 모이어티상의 포획 분자에 상보적인 뉴클레오티드 서열내에서 뉴클레오티드 서열을 튀기생성하고 포획할 수 있는 프라이머이다. 다르게는 포획 분자는 프라이머들 중의 하나의 포획 모이어티(capturable moiety)를 구체적으로 확인할 수 있는 DNA 결합 단백질(DNA binding protein)일 수 있다. 포획 분자는 또한 증폭 반응에 참가할 수 있다.

포획 분자는 임의의 적절한 수단에 의하여 고체상에 고정될 수 있다.핵산 프라이머 또는 다른 포획 분자를 고정하기 위하여 유도될 수 있는 표면을 갖는 구조일 수 있다. 바람직하게 고체상(solid phase)은 마이크로역가우물(microtitre well)의 면 또는 딥스틱(dipstick)의 면과 같은 평면 물질(planar material)이다.

여기서 고려되는 고형 지지(solid support)는 일반적으로 제한되지는 않으나 셀룰로스(cellulose), 세라믹 물질(ceramic material), 나이트로셀룰로스 (nitrocellulose), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 나이론(nylon), 폴리스티렌(polystyrene)과 그 유도체(derivative), 폴리비닐아이덴 플루오르화물 (polyvinylidene difluoride)(PVDF), 메타크릴레이트 (methacrylate) 및 그 유도체(derivative), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride) 또는 폴리프로필렌 (polypropylene)을 포함하는 유리 또는 폴리머 (polymer)이다. 나이트로셀룰로스는 특히 실용적이다. 고형지지는 유리 또는 폴리머 매트릭스 상에 지지되는 나이트로셀룰로스 필름(nitrocellulose film)과 같은 잡종(hybrid)일 수 있다.

고형 지지는 막(membrane) 또는 관(tube), 비드(bead), 디스크(disk), 또는 마이크로 플레이트(microplate), 딥스틱(dipstick), 마이크로역가 트레이 우물(microtitre tray well) 또는 분석법을 실행하기에 적합한 임의의 다른 표면의 형태이다.

하나의 실시예에서, 고정된 핵산은 표적 핵산 분자를 튀기생성에 의하여 포획하고, 선택적으로 증폭반응에 참가한다. 다르게는, 고정된 핵산 분자는 증폭된 핵산 분자를 포획한다.

핵산 분자들을 고체 지지에 연결시키는 것은 당해 기술 분야에서 공지된 것이다. 프라이머를 고체상에 연결시키기 위한 공정은 아미드 연관(amid linkage), 아미드산염 연관(amidate linkage), 타이오이터 연관(thioether linkage), 및 고체상으로의 아미노기(amino group)의 도입을 포함한다. 고체상으로의 연관의 예는 국제특허출원번호 PCT/AU92/00587[WO 93/09250]에 개시되어 있다.

고정된 프라이머는 증폭반응에서 용액상 프라이머와 관여한다. 다르게는 "속" 프라이머("generic" primer)가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자를 증폭하기 위하여 고형지지에 고정된다. 표적 서열의 특정 증폭은 용액상 프라이머들에 의하여 달성될 수 있다.

검출가능한 신호를 제공하는 일정 범위의 표지(label)가 사용될 수 있다. 표지는 특정한 핵산 분자 또는 뉴클레오티드와 관련될 수 있고, 이는 결과적으로 핵산 분자 도는 뉴클레오티드와 결합하는 중간체에 부착될 수 있다.

표지는 색원체(chromogen), 촉매(catalyst), 효소(enzyme), 형광단 (fluorophore), 발광 분자(luminescent molecule), 화학발광 분자 (chemiluminescent molecule), 유러퓸(EU³⁴)와 같은 란탄계열 원소이온 (lanthanide ion), 방사성 동위원소(radioisotope) 및 직접 시각적 표지(direct visual label)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 직접적인 가시적 표지의 경우에, 콜로이드 금속재(colloidal metallic) 또는 비금속재 입자(non-metallic particular), 색소 입자(dye particle), 효소 또는 기질(enzyme or substrate), 유기 폴리머(organic polymer), 레이텍스 입자(latex particle), 리포솜(liposome), 또는 기질 및 그와 같은 것을 생성하는 신호를 포함하는 다른 소포(vesicle)를 포함한다. 표지로서의 사용에 적합한 다수개의 효소들이 미국 특허 4,366,241, 4,843,000 및 4,849,338에 개시되어 있다. 본 발명에서 유용한 적절한 효소 표지는 알칼리성 인산(alkaline phosphatase), 홀세라디시 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase), 루시페라아제 (luciferase), -갈락토시데이스(-galactosidase), 글루코스 옥시데이스(glucose oxidase), 라이소자임(lysozyme), 말레이트 디하이드로저네이스(malate dehydrogenase)와 같은 것들을 포함한다. 효소 표지는 단독으로 사용될 수 있고, 용액 내에 있는 제2 효소와 결합하여 사용될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따라서 적절한 표지로서 사용되는 형광단(fluorophore)은 제한되지 않고, 플로오레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(Texas red), 루시페 옐로우 (lucifer yellow), 또는 R-피코에리트린(R-phycoerythrin)을 포함한다.

다른 실시예에서, 프라이머들 중의 하나는 용기 또는 마이크로역가 우물의 벽과 같은 고형지지에 고정되고 프라이머들 중의 다른 하나는 용액상이다. 용액상 프라이머는 일반적으로 지시기 분자로 일반적으로 표지된다. 증폭반응 후에, 검출가능한 신호의 존재는 앰플라이어(amplier)를 표시한다.

본 발명의 또 다른 특징은 샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 상기 방법은 상기 샘플을 고형지지에 고정된 프라이머 및 용액상의 제2프라이머에 고정된 프라이머를 갖는 반응 용기에 상기 샘플을 도입하는 단계(여기서, 두 프라이머들은 HBV 게놈상의 보존된 구역내의, 아주 가까운, 또는 인접한 구역에서 HBV 유도 DNA의 상보성 단일 가닥들 상의 상보성 뉴클레오티드 서열로 변이 생성할 수 있고, 용액상 프라이머(solution phase primer)는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자로 표지된다),

반응 용기를 증폭을 할 수 있는 조건을 거치게 하는 단계, 및

확인 가능한 신호의 존재를 검출하는 단계(여기서, 상기 신호의 존재는 HBV 유도 DNA의 존재를 표시한다)를 포함함을 특징으로 한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 HBV 게놈 상의 보존된 구역 또는 보존 및 변이구역들과 같은 HBV 게놈의 다른 구역들에 프라이머들의 배열을 이용한다. 이는 특히, HBV가 "타입화"(typed)될 필요가 있고 그 변이 구역(variable region)이 확인될 필요가 있다. 하나의 유용한 실시예에서, HBV 게놈의 다른 구역들을 가리키는 다중 프라이머(multiple primer)들은 마이크로칩(microchip), 반응 용기벽(reaction vessel wall), 딥스틱(dipstick), 슬라이드(slide) 또는 다른 매트릭스와 같은 고형지지에 고정된다. 프라이머들은 일반적으로 프라이머의 인식에 대한 특정의 좌표(coordinate)들을 갖는 배열에 정렬될 수 있다. 그러나 용어 "배열"은 특정한 순서를 의미하는 것이 아니며 또한 전체 패턴 내의 불규칙한 점들을 포함할 수 있다.

어째튼 각각의 고정된 프라이머들은 일반적으로 용액상 제2 프라이머들을 가짐으로서 HBV 게놈의 특정구역들이 증폭을 위하여 표적화될 수 있다. 용액상 프라이머들은 일반적으로 확인 가능한 신호들을 제공할 수 있는 지시기 분자들을 지닌다. 증폭 후에, 배열상의 정의된 위치 내에 신호의 존재는 특정 HBV를 타입(type)화하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 HBV의 동일한 또는 다른 가닥(strain)들 또는 변이종으로부터 하나 또는 그 이상의 HBV 유도 DNA 표적 서열들을 검출하기 위한 방법을 제공하는 데, 단일 가닥 형태의 HBV 유도 DNA를 추정적으로 포함하는 샘플을 개별적으로 고정되거나 또는 용기내의 고형지지로의 배열 내의 두 개 또는 그 이상의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 반응 용기는 추가적으로 고형 지지에 고정된 짝을 갖는 용액상 프라이머들을 포함하고, 여기서 고정된 프라이머와 그것의 용액상 짝 프라이머는 증폭 조건하에서 HBV 유도 DNA의 구역을 증폭할 수 있고, 여기서 용액상 프라이머는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자를 운반하여 고형 지지상의 정의된 위치에서 신호의 존재가 특정한 HBV 격리 또는 변이종의 확인을 가능하게 한다)를 포함한다.

상술한 바와 같이 바람직한 프라이머들은 <400>1 및 <400>2에서 설명된 바와 같고 프라이머들은 <400>1 또는 <400>2로 튀기 생성할 수 있는 프라이머들 뿐 아니라 <400>1 또는 <400>2에 적어도 70%의 유사성을 갖는 프라이머들 또는 낮는 엄격조건 하에서의 그들의 보체(complement)일 수 있다. 바람직하게, 이들은 화학적 합성에 의하여 준비될 수 있으나, 그들은 제한되지는 않으나 제한 조각(restriction fragment)과 같은 핵산 분자의 조각으로서 생성될 수 있다. 프라이머들은 HBsAg의 주 친수루푸 내의 변이를 지닐 수 있는 것과 같은 변이종들을 포함하는 공지된 HBV 주(strain)의 서열 정렬(sequence alignment)에 이어서 적절하게 선택된다. 대략 20의 인접하는 뉴클레오티드들이 보존되게 나타나는 경우, 이들은 HBV 게놈의 보존된 구역들에 대한 프라이머 후보들(primer candidates)로서 선택된다.

본 발명의 또 다른 특징은 고형 지지에 고정된 두 개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열을 제공하며, 상기 프라이머들은 HBV 유도 DNA로부터상보성 뉴클레오티드 서열로 변이생성할 수 있는 것이다.

프라이머들이 튀기 생성하는 구역은 두 개 또는 그 이상의 HBsAg 변이종들 사이에서 보존되는 적어도 대략 10에서 대략 50의 뉴클레오타이의 뉴클레오티드 서열내에 있거나, 가까이 있거나 또는 인접한다.

바람직하게, 배열은 바이오칩(biochip) 또는 다른 마이크로 매트릭스(micro-matrix), 마이크로역가 우물의 벽, 슬라이드, 딥스틱 또는 다른 적절한 매트릭스의 형태이다.

배열은 검출가능한 신호를 제공하는 고정된 앰플라이머들의 존재를 검출할 수 있는 컴퓨터 프로그램에 의하여 분석되도록 개조될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 특징은 HBV 유도 핵산 서열들을 검출하고 확인하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법을 제공하는 데, 상기 방법은

(i) 적어도 하나의 프라이머는 표적 서열의 하나의 가닥으로 튀기 생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급한 제1 가닥에 상보적인 가닥으로 튀기 생성할 수 있는 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 한 세트의 프라이머들을 사용하는 증폭 반응을 수행하기 위한 수단, 및

(ii) 확인 가능한 신호의 존재를 기록하기 위한 데이터 처리 수단을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 매트릭스의 사용을 제공하는 데, 상기 매트릭스는 매트릭스(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)상의 좌표를 갖는 식 a₁, a₂, ... , a_n에 의하여 정의되는 올리고뉴크레오타이드의 배열을 포함한다(여기서, a₁a₂....a_n은 n뉴클레오티드들을 합계하는 동일한 또는 다른 올리고뉴클레오티드들을 나타내고 각각의 올리고뉴클레오티드는 격자 좌표들(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)에 의하여 정의될 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드들은 b₁b₂....b_n에 의하여 정의되는 증폭짝들을 가짐으로서 올리고뉴클레오티드들 a₁b₁, a₂b₂...a_nb_n은 HBV 유도 DNA의 상보성 가닥들로 변이생성할 수 있고, 여기서 개재 DNA는 HBsAg 변이종들과 같은 둘 또는 그 이상의 HBV 변이종들 사이에서 보존되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 매트릭스는 상기 HBV 유도 DNA의 보존된 증폭 구역을 지니게 됨으로서 정의되는 특정 HBV 제제를 검출하기 위하여 이용될 수 있다).

본 발명의 프라이머 올리고뉴클레오티드가 표적 HBV 핵산 서열의 PCR과 같은 증폭 반응과 관련되어 사용된다. 증폭 처리는 당해 기술 분야에서 공지된 사실임에도 불구하고, 본 발명에 따라서 사용되는 PCR 공정에 대한 일반적인 정보가 명확한 설명을 위하여 이하 강조된다.

테스트 샘플에서 표적 HBV 핵산 서열을 증폭하기 위하여, 서열은 증폭 시스템의 성분에 억세스 가능하도록 요구된다. 이는 PCR 증폭 이전에 샘플로부터 HBV 표적 핵산을 격리시킴으로서 달성될 수 있다. 핵산 분자들을 생물학적 샘플로부터 추출하기 위한 기술이 잘 정립되고 광범위하게 사용된다(12).

PCR 증폭의 각각의 사이클의 제1단계는 95℃와 같은 적절한 온도에서 샘플을 가열함으로서 HBV 핵산 두 가닥(HBV nucleic acid duplex)의 분리를 포함한다. 가닥이 일단 분리되면 PCR에서의 다음 단계는 표적 서열과 인접하는 프라이머들과 분리된 가닥들을 튀기 생성하는 것을 포함한다. 프라이머들은 그 후 표적 가닥들의 상보적 카피들을 형성하도록 연장된다. PCR 증폭에 있어서, 프라이머들은 각각의 이중가닥 서열을 따라서 튀기 생성하는 위치가, 틀로부터 분리될 때, 하나의 프라이머로부터 합성되는 연장 산물이 다른 프라이머의 연장에 대한 틀로서 역할을 한다. 변성(denaturation), 튀기생성(hybridization) 및 연장 사이클(extension)은 하나의 사이클로부터 대략 120 사이클 동안 반복되지만 일반적으로 PCR 증폭을 통하여 증폭된 산물로 도입되는 변이의 개수를 최소화하기 위하여 일반적으로 대략 35 사이클동안 반복된다.

PCR 증폭에서 프라이머들의 틀 의존 연장(template-dependent extension)은 적절한 염(salts), 금속 양이온(metal cation) 및 pH 완충 시스템을 포함하는 반응 매체에서 네 개의 데옥시라이보뉴클레오사이드 트리포스페이트(deoxyribonucleoside triphosphates) (일반적으로 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)의 적절한 양의 존재 하에 중합 제제(polymerizing agent)에 의하여 촉매 반응된다. 적절한 중합제제는 틀 의존 DNA 합성(template-dependent DNA synthesis)을 촉매반응시키는 효소이다. 이는 Taq 폴리머레이즈(Taq polymerase), Thermus aquaticus로부터 격리된 열안정 DNA 폴리머레이즈(heat-stable DNA polymerase) 및 고정확도 Pfu 폴리머레이즈(high fidelity Pfu polymerase)를 포함한다. 나중의 효소는 고정밀 증폭들(high precision amplification)에서 폭넓게 사용된다. PCR 증폭은 일반적으로 열안정 효소(thermostable)를 갖는 자동화된 공정으로서 처리된다. 이러한 공정에서, 반응 혼합물의 온도는 변형상(denaturing phase), 프라이머 아닐링상 (primer annealing phase) 및 연장 반응상(extension reaction phase)을 통하여 순환된다.

실험 방법은 다른 반응들 및 불특정 증폭으로부터의 증폭된 핵산에 의하여 PCR 증폭의 오염을 피하도록 채택된다. 다른 반응으로부터의 오염을 피하기 위하여, 적절한 염. 금속 양이온 및 pH 완충 시스템, 절절한 양의 네 개의 데옥시라이보뉴클레오사이드 트리포스페이트(일반적으로 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 및 프라이머 올리고뉴클레오티드, 그러나 생물학적 샘플로부터 분리된 바이러스 표적 핵산을 제외하고는 260nm에서 5분 동안 UV 방사선조사를 거치게 된다. 이러한 처리는 예비 증폭 반응 혼합물에서, 모든 잠재적인 이중 가닥 DNA 분자들을 제거하면서, 단일 가닥 프라이머 올리고뉴클레오티드와 반응 혼합 인택트(reaction mixtureintact)의 다른 상술한 성분을 유지한다. 반면에, 증폭된 바이러스성 핵산의 서열 분석은 불특정 증폭에 의한 감염의 경우를 배제하지 않을 뿐만 아니라, 또한 증폭된 산물의 특성, 특히 전류 면역 기초 진담 분석법(current immuno-based diagnostic assay)을 사용하여 검출로부터 바이러스 탈출을 일으키는 주 친수루프상의 잠재적 변이의 특성을 결정한다.

본 발명은 따라서 본 발명의 방법에 따라서 확인되는 것들과 같은 신규한 HBV 변이종들을 포함한다.

따라서 본 발명의 다른 특징은 일반적으로 격리된 형태의 HBV 변이종을 제공하는 데, 이러한 HBV 변이종은 HBV 유도 핵산 표적 서열을 검출하기 위한 방법에 의하여 식별되고, 상기 방법은 샘플을 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태를 산출하기 위하여 변성 조건을 거치는 단계, 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 변성된 샘플을 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 튀기생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 제1 가닥에 상보적인 가닥으로 튀기생성하고, 상기 프라이머들은 그들의 3'말단으로부터 연장하여 상기 프라이머들 각각이 튀기 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 생성한다),

샘플을 상보성 연장 산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하도록 증폭을 할 수 있는 조건을 거치는 단계, 및

증폭 산물의 존재를 검출하고(여기서, 상기 증폭된 산물의존재는 상기 HBV 유도 핵산 표적 서열을 표시한다) 그렇게 검출된 상기 HBV를 격리시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징은 펩타이드(peptide), 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 면역 표지자(immunological marker)로서 유용한 단백질과 같은 발현 산물(expression product)을 확인하고 ,진단 및/또는 처리요법에 이용하기 위한 면역글로불린(immunoglobulins)을 발생시키기 위한 수단을 포함한다.

본 발명에 의하여 확인되는 HBV의 뉴클레오티드 서열은 다양한 종류의 재결합 발현 시스템(recombinant expression system)들에서 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 보존되거나 가변적이다. 후자의 예는 HBsAg상의 변경된 (modified) 또는 새로운 항원결정기이다. 이러한 발현 시스템들(expression)은 바라는 유전자, 특히 HBsAg 또는 그 변이종을 인코딩하는 유전자의 적절한 발현을 가능하게 한다. 원핵세포(prokaryotic) 및/또는 진핵세포 숙주(eukaryotic host)내의 뉴클레오티드 서열의 재결합 발현(recombinant expression)은 잘 수립되고, 이러한 발현된 단백질들이 특정 HBsAg들의 것에 특정한 면역글로불린(immunogloblin)을 양생하기 위해 이용된다. 그리고 면역글로불린은 바이러스의 존재를 검출하기 위하여 분석법에서 이용된다. 단백질은 또한 HBV에 의하여 감염된 환자의 항체의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

바람직한 바이러스 서열은 발현을 위한 포유류, 효소 또는 곤충 세포주 (insect cell line)에 표준 기술을 사용하여 변환/이입 전에 적절한 벡터로 적절하게 삽입된다. 원생생물은 바람직하게는 중간 클로닝 단계(intermediate cloning step)에서 이용되나 바람직한 높은 레벨의 바이러스성 서열의 유도 발현(inducible expression)에 효과적으로 이용될 수 있다.

바이러스성 서열의 발현을 위하여 변형된 유전 물질을 숙주세포에 도입하는 데 사용되는 특정의 공정은 특히 중요하지는 않다. 외부의 뉴클레오티드 서열들을 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 공정이 이용될 수 있다. 이러한 것들은 인산칼슘 이입(calciumphosphate transfection), 전기청공(electroporation), 리포솜(liposomes), 플라스미드 벡터(plasmid vector), 바이러스 벡터(viral vector) 및 클로닝된 바이러스 DNA를 도입하기 위한 다른 잘 정립된 방법, 특히 면역기초 진단 테스트에 의하여 검출되거나 검출되지 않을 수 잇는 바이러스 표지자(viral marker)를 나타내거나 나타내지 않을 수 있는 테스트 샘플에서 본 발명에 의하여 확인되는 것들을 포함한다.

유전자 정보를 세포로 운반하기 위하여 이용되는 특정 벡터는 특히 중요하지 않다. 원핵생물세포에서 재결합 단백질의 발현에 대하여 이용되는 기존의 임의의 벡터가 사용될 수 있다.

발현 벡터(expression vector)는 원핵생물 세포에서 바이러스 핵산 서열들의 발현에 대하여 요구되는 모든 원소들을 포함하는 원색생물 전사 단위(eukaryotic transcription unit) 또는 발현 카세트(expression cassette)를 포함한다. 전형적인 발현 카세트는 생단백질(vital protein)을 인코딩하는 DNA 서열에 작용 가능하게 링크되는 프로모터(promoter)와 전사된 mRNA의 효과적인 폴리아데닐화 (polyadenylation)에 대하여 요구되는 신호들을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 일반적으로 단지 포유류 세포들과 같은 원핵생물 세포에서 발현되는 하나 또는 그 이상의 원생생물 전사 단위는 물론이고 박테리아(예를 들어 E. coli)내의 벡터의 클로닝을 가능하게 하는 원핵생물 서열들도 포함할 수 있다. 벡터는 원핵생물 레플리콘(eukaryotic replicon)을 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 레플리콘이 존재하면 벡터는 적절한 선택 표지자를 이용하는 원핵생물 세포에서 증폭가능하다. 벡터가 원핵생물 레플리콘을 포함하지 않으면, 에피솜 증폭(episom amplification)이 가능하지 않다. 이러한 조건하에서, 이입된 DNA가 숙주세포로 통합되며, 바이러스 유전자 발현은 발현 벡터 상에 공통합 포유류 프로모터(co-integrated mammalian promoter)에 의하여 구동된다.

발현벡터가 세포로 도입된 후에, 이입된 세포는 바이러스 단백질의 발현에 유리한 조건하에서 배양되고, 단백질은 표준 기술을 사용하는 배양으로부터 정제된다. 예를 들어 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)와 같이 단백질을 정제하기 위한 다수개의 표준 공정들이 이용된다.

바람직한 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 단백질의 사용에 추가적으로, 바이러스에 특정한 항원결정기를 의태(mimic)하는 펩타이드가 바이러스에 특정한 항체를 양육하기 위하여 이용될 수 있다.

상술한 정제된 폴리펩타이드 또는 합성 펩타이드는 표준 공정을 이용하여 항체를 양육하기 위하여 사용될 수 있다. 면역글로불린은 다양한 적용에 이용될 수 있다. 예를 들어, 그들은 친화 크로마토그래피를 이용하여 테스트 샘플에서 바이러스의 존재를 분석하기 위하여 그리고 바이러스성 항원을 정제하기 위하여 이용될 수 있다. 그들은 전체 바이러스의 전염을 저해를 포함하여 해당 바이러스 단백질을 중성화하기 위하여 또한 이용될 수 있다. 다양한 면역글로불린의 생성 및 조작에 이용할 수 있는 다수의 기술들이 테스트 샘플에서 특정 HBV 주의 진단 및 검출에 유용한 분자를 생성하는 데 용이하게 적용될 수 있으며 이는 면역 기초 진단 테스트에 의하여 검출되거나 되지 않을 수 있는 바이러스성 표지자를 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.

바람직한 HBV주에 특정한 항원결정기를 결합하는 항체들은 다양한 수단에 의하여 생성될 수 있다. 인간이 아닌 단클론 항체(예를 들어 뮤린(murine))의 생성은 공지된 것이고 바이러스 또는 그 조각(fragment)을 포함하는 표본(preparation)으로 동물을 면역접종으로서 달성될 수 있다. 면역접종된 동물로부터 얻어지는 항체 생성 세포(antibody-producing cell)는 표준 기술을 이용하여 죽지 않을 수 있고 스크린된다.

그 후 상술한 바와 같이 생성되는 면역글로불린(immunoglobulin)은 면역 기초 진단 테스트에 의하여 검출되거나 검출될 수 없는 바이러스 표지자(viral marker)를 나타내거나 나타내지 않을 수 있는 테스트 샘플에서 HBV주의 존재에 대한 다양한 진단 분석에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 면역글로불린은 면역 기초 진단 테스트에 의하여 검출되거나 검출되지 않을 수 있는 바이러스성 표지자를 나타내거나 나타내지 않는 HBV주를 포함하는 것으로 추정되는 테스트 샘플과 접촉시키는 것과 복합체가 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 광범위한 표지들이 면역글로불린에 결합되도록 이용될 수 있다. 통상적인 검출 방법은¹²⁵I 또는³⁵S를 이용한 자가방사법(autoradiography)을 이용하는 것이다. 비방사성 표지(non-radioactive label)가 사용될 수 있다. 이러한 비방사성 표지는 종종 비직접적인 수단에 의하여 부착될 수 있다. 일반적으로 리간드 분자(ligand molecule)(예를 들어, 바이오틴(biotin))이 공유적으로 분자에 결합된다. 그리고 리간드는 본질적으로 검출가능하거나 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물과 같은 신호 시스템에 공유적으로 결합되는 안티리간드(anti-ligand)(예를 들어, 스트렙타비딘(streptavidin))에 결합된다.

분자들은 또한 예를 들어 효소를 연결시킴으로서 신호 발생 화합물에 직접 연결될 수 있다. 표지자로 의미가 있는 효소는 포스파테이스(phosphatases) 또는 퍼옥시데이tm(peroxidases)일 수 있다.

복합물의 존재를 검출하기 위하여, 혼합물은 제2항체, 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 면역글로불린의 Fc 구역을 결합할 수 있는 단백질과 접촉될 수 있다. 단백질은 바람직하게는 고형 표면상에 고정되고, 고형표면은 바람직한 바이러스에 대하여 특정한 비결합 면역글로불린을 제거하기 위하여 세척된다. 예를 들어 고형 표면은 막(예를 들어, 나이트로셀룰로오스), 마이크로역가 접시(microtitre dish)(예를 들어, 폴리스티렌(polystyrene)) 또는 비드(bead)일수 있다. 바람직한 화합물은 공유적으로 또는 비공유적으로 불특정 결합을 통하여 부착된다. 그 후 표지는 표준 기술을 이용하여 지시된다.

재결합적으로 발현되고 정제된 바이러스성 단백질 또는 바이러스 용해질(lysate)은 진단 공정에서 또한 이용될 수 있다. 이러한 공정들은 일반적으로 HBV에 대한 항체를 포함하고 있다고 추정되는 생물 샘플(예를 들어, 혈청(serum))을 접촉시키고, 면역 반응(immunological reaction)을 검출하는 것을포함한다. 반응은 바람직하게는 상술한 표지된 단백질을 이용하여 검출된다.

본 발명의 방법은 따라서 HBsAg와 같은 HBV 단백질에서 보존 구역에 대응할 수 있는 HBV 게놈의 보존된 구역을 확인하는 데 유용하다. 본 방법은 변이 구역을 또한 확인할 수 있다. 결과적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 및 보존 구역에 대응하는 단백질은 백신 화합물(vaccine component) 및 진단 테스트에서 유용하다. 비슷하게 변이 구역들을 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 특정 HBV 변이종들에 대한 구체적인 백신에 대하여 또는 진단 제제(diagnostic agent)로서 유용하다.

따라서 본 발명은 둘 또는 그 이상의 HBV 독립체(HBV isolate) 사이에서 보존 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열들을 포함하고, HBV 야생형으로부터 변이하는 재결합 또한 화학적 합성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 유도체(derivative), 그것의 상동체(homologues) 또는 유사체(analogues)를 제공한다. HBV 야생형은 HBV 유전자형 E 및 A 내지 F(13)으로부터 복합 또는 공통 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한다고 고려된다.

"유도체(derivative)"는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결손을 포함하는 폴리펩타이드들로 구성되는 폴리펩타이드의 부분(part), 일부 (portion), 단편(fragment), 섹션(section) 또는 구역(region)으로 이루어진다. 간단히 말해서, 펩타이드 및 단백질은 용어 "폴리펩타이드"에 의하여 포함된다.

본 발명은 곁가지(side chain)에 대한 수식(modification)을 갖는 것들과 비자연적인 아미노산을 편입하는 것들을 포함하는 대상 폴리펩타이드의 화학적인 유사체까지 확장된다. 폴리펩타이드의 이러한 화학적으로 수식된 유사체 또는 합성 유사체는 진단 제제로서 또는 치료요법에서 이용하기에 보다 안정적이다.

본 발명에 의하여 고려되는 곁가지 수식(side chain modification)의 예는 아미노기의 수식(modification)을 포함한다. 예를 들어, NaBH₄에 의한 환원이 뒤이어 일어나는 알데하이드(aldehyde)와의 반응에 의한 환원성 알킬화(reductive alkylation)에 의하여, 메틸아세티미데이트(methylacetimidate)와의 아미드화 (amidination), 아세트 무수물(acetic anhydride)와의 아실화(acylation), 아미노기(amino group)들을 시안(cyanate)과 카르바모일화(carbamoylation), 아미노기를 2, 4, 6- 트리나이트로벤젠 술폰산(TNBS; trinitrobenzene sulphonic acid)과 트리나이트로벤젠화(trinitrobenzylation), 아미노기를 석신산 안히드라이드(succinic anhydride)와 아실화(acylation) 및 NaBH₄의 환원이 뒤따르는 라이신(lysine)을 피리독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate)와 피리독실화(pyridoxylation)와 같은 아미노기의 수식을 포함한다.

상기 아르기닌 잔기(arginine residues)의 구아니딘기(guanidine group)는 2,3- 부탄디온(butanedione), 페닐글라이옥살(phenylglyoxal) 및 글라이옥살(glyoxal)과 같은 시약과 이종고리 축합 산물(heterocyclic condensation product)의 형성에 의하여 수식될 수 있다.

카르복실기는 예를 들어 후속하는 해당 아마이드(amide)로의 유도화 (derivitisation)가 따르는 O-아실리소레아(O-acylisourea)를 통하여 카르보이아미드(carbodiimide) 활성화에 의하여 수식될 수 있다.

설프하이드릴기(sulphydryl group)는 아이오도 아세트산(iodoacetic acid) 또는 아이오도아세트아미드(iodoacetamide); 시스테인산(cysteic acid)로의 퍼포믹산 산화(performic acid oxidation); 타이올 화합물(thiol compound)과 혼합된 이설프하이드(disulphides)의 형성; 말레이마이드(maleimide)와의 반응, 말레 무수물(maleic anhydride) 또는 다른 치환된 말레이마이드(maleimide)와의 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트(4-chloromercuribenzoate), 4-클로로머큐리페닐술포닉 산 (4-chloromercuriphenylsulphonic acid), 페닐머큐리 클로라이드(phenylmercury chloride), 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀(2-chloromercuri-4-nitrophenol) 및 다른 수은제(mercurials); 알카린 pH(alkaline pH)에서의 시안과 카르바모일화 (carbamoylation)와 같은 방법들에 의하여 수식될 수 있다.

트립토판 잔기(tryptophan residue)는 예를 들어 N-브로모석신이마이드(N-bromosuccinimide)와의 산화 또는 인돌링(indole ring)의 2-하이드록시-5-나이트로벤질 브로마이드(2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide) 또는 술페닐 할리드(sulphenyl halides)와의 알칼리화에 의하여 수식될 수 있다. 반면에 타이로신 잔기(tyrosine residue)는 3-나이트로타이로신 유도체(3-nitrotyrosine derivative)를 형성하기 위하여 테트라나이트로메탄(tetranitromethane)과의 질화(nitration)에 의하여 수식될 수 있다. 히스티딘 잔기(hystidine residue)의 이미다졸 링(imidazole ring)의 수식은 아이오도아세트 산 유도체(iodoacetic acid derivatives)와의 알킬화 (alkylation) 또는 이에틸피로카르보네이트(diethylpyrocarbonate)와의 N-카르베톡실화(N-carbethoxylation)에 의하여 달성될 수 있다.

펩타이드 합성 동안 비자연적인 아미노산 및 유도체를 편입시키는 예는, 제한되지 않고, 노르류신(norleucine), 4-아미노 부티르산(4-amino butyric acid), 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜타노산(4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid), 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid), T-부틸글라이신(t-butylglycine) , 노르발린(norvaline), 페닐글라이신(phenylglycine), 오르니틴 (ornithine), 사르코신(sarcosine), 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산 (4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 2-티에닐 알라닌(2-thienyl alanine) 및/또는 아미노산의 D-이성체(D-isomers)의 이용을 포함한다. 여기서 고려되는 비자연적 아미노산 리스트는 표1a 내지 표1f에 보인 바와 같다.

본 발명의 폴리펩타이드는 HBV 또는 HBV 변이종에 대하여 백신접종을 하기 위하여 약학 합성물에 사용될 수 있다. 약학 합성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용 가능한 캐리어 및/또는 희석제 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한다.

약학적으로 수용 가능한 캐리어 및/또는 희석제는 임의의 그리고 모든 용매(solvent), 분산 매개체(dispersion media), 코팅(coating), 항박테리아 및 항균성 제제(antibacterial and antifungal agent), 등장 및 흡수지연제제(isotonic and absorption delaying agent)와 그 등가물을 포함한다. 약학적 활성 물질등에 대한 이러한 매개체 및 제제의 이용은 당해 기술 분야에서 공지된 사실이다. 종래의 매개체(media) 및 제제(agent)가 활성 성분과 병립할 수 없는 경우를 제외하고는, 약학적 활성 물질에서 이러한 매개체와 제재의 이용이 고려된다. 보충적인 활성 성분이 합성물에 또한 포함될 수 있다.

약학적 합성물은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하고 라이보자임 (ribozyme) 또는 안티센스 분자(antisense molecule)를 HBV 유전자 서열로 인코딩하는 핵산 분자를 벡터가 지니는 경우에, 표적 세포를 이입시킬수 있는 벡터와 같은 유전자 분자를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진핵세포 벡터(viral, bacterial or eukaryotic vector)일 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체에까지 확장된다. 항체는 단클론(monoclonal)이거나 다클론(polyclonal)일 수 있다. 이러한 항체는 치료요법 또는 진단 분석법에서 유용하다.

본 발명의 다른 특징은 대상으로부터의 생물학적 샘플 내에서 HBV를 검출하기 위한 방법을 고려하는 데 상기 방법은 일정 시간 동안 그리고 항체-HBV 복합물(antibody-HBV complex)을 형성하기에 충분한 조건하에서 HBV 또는 그 변이종에 대하여 특정한 항체에 상기 샘플을 접촉시키는 단계 및 상기 복합물을 검출하는 단계를 포함한다.

HBV의 존재는 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 공정과 ELISA 공정과 같은 임의의 방식으로 달성될 수 있다. 미국특허번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조하면 보듯이 광범위한 면역분석기술이 이용가능하다. 이러한 것들은 종래의 경합 결합 분석법(competitive binding assay)에서 뿐만 아니라 비경합 타입(non-competitive type)의 외자리 및 두자리 또는 "샌드위치" 분석법(single-site and two-site or "sandwich" assay)을 포함한다. 이러한 분석법들은 표적으로의 표지된 항체의 직접결합을 또한 포함한다.

샌드위치 분석법은 가장 유용하고 통상적으로 사용되는 분석법중의 하나이고 본 발명의 이용에 바람직하다. 샌드위치 분석 기술의 다양한 변형이 존재하는 데이들 모두가 본 발명에 의하여 포함될 수 있다. 간략하게, 일반적인 전진 분석법(forward assay)에서 비표지 항체는 고형기질 상에 고정되고, 시험될 샘플은 결합 분자와 접촉하게 된다. 적절한 시간의 항온처리 후에, 항체-항원 복합체의 형성에 충분한 시간 동안, 항체-항원 표지된 항체의 다른 복합체의 형성에 충분한 시간을 주면서, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 지시기 분자(reporter molecule)로 표지된 항원에 특정한 제2 항체가 추가되고 항온처리되어, 항체-항원-표지 항체(antibody-antigen-labelled antibody)의 다른 복합체의 형성에 충분한 시간이 가능하게 한다. 임의의 비반응 물질이 세척되어 나가고, 항원의 존재는 지시기 분자에 의하여 생성된 신호를 관찰함으로서 결정된다. 결과는 가시적인 신호의 단순한 관찰에 의하여 정성적(qualitive)일 수도 있고, 또는 알려진 양의 합텐(hapten)을 포함하는 제어 샘플(control sample)과 비교함으로서 정량적(quantitive)일 수 있다. 전진 분석법에 대한 변이종들은 동시 분석법(simultaneous assay)을 포함하는 데, 여기서는 샘플과 표지된 항체가 결합 항체에 동시에 추가된다. 이러한 기술은 당업자에게 공지된 것으로서, 명백한 임의의 작은 변형들을 포함한다. 본 발명에 따르면, 샘플은 세포 추출물(cell extract), 조직 생체(tissue biopsy) 또는 가능하게는 혈청(serum), 타액(saliva), 점막 분비물(mucosal secretion), 림프(lymph), 조직액(tissue fluid) 및 호흡액(respiratory fluid)을 포함하는 HBV 유도 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다. 샘플은 따라서 일반적으로 생물학적 액을 포함하는 생물학적 샘플일 수 있으나 또한 세포 배양으로부터의 발효액(fermentation fluid) 및 상층액(supernatant fluid)까지 확대될 수 있다.

일반적인 전진 샌드위치 분석법에서, HBV 또는 그것의 항원부에 대하여 특이성을 갖는 제1 항체는 고형 표면에 공유적으로(covalently) 또는 비활동적으로 (passively) 고정된다. 고형 표면은 전형적으로 유리 또는 폴리머(polymer)이고, 가장 일반적으로 사용되는 폴리머는 셀룰로스(cellulose), 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide), 나이론(nylon), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리비닐 클로라이드 (polyvinyl chloride) 또는 폴리프로필렌(polypropylene)이다. 고형 지지체는 관 (tube), 구슬(bead), 미세판(microplate)의 디스크(disc) 또는 면역분석법을 수행하기 위한 적절한 표면의 형태일 수 있다. 결합 공정은 당해 기술분야에서 공지된 사실이고, 공유적으로 연결하거나 물리적으로 흡수하는 교차 결합으로 구성된다. 폴리머-항체 복합물(polymer-antibody complex)은 테스트 샘플(test sample)을 준비할 때 세척된다. 테스트될 샘플의 약수(aliquot)는 그후에 고체상 복합체(solid phase complex)에 추가되고 충분한 시간(예를 들어 2-40분 또는 가능하다면 밤새도록) 그리고 적절한 조건(예를 들어 대략 25℃와 같은 실내온도에서 대략 37℃ 사이)하에서 항체 내에 존재하는 임의의 서브유닛(subunit)의 결합이 가능하도록 항온처리된다. 항온처리에 이어, 항체 서브유닛 고체상(antibody subunit solid phase)은 세척되고, 건조되고, 합텐의 일부분에 대하여 특정한 제2 항체와 항온처리된다. 제2항체는 합텐으로의 제2 항체의 결합을 나타내기 위하여 이용되는 지시기 분자에 연결된다.

다른 방법은 생물학적 샘플에서 표적 분자들을 고정하고 지기기 분자로 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 특정한 항체에 고정된 표적을 노출시키는 것을 포함한다. 표적 및 지시기 분자 신호의 강도에 따라서 결합 표적은 항체로 직접 표지됨으로서 검출가능할 수 있다.

다르게는 제1항체에 대하여 특정한 제2 표지 항체는 표적 제1항체-제2항체 삼차 복합체(target-first antibody-second tertiary complex)를 형성하기 위하여 표적 제1항체 복합체(target-first antibody complex)로 노출된다.

본 명세서에서 사용되는 "지시기 분자"는 항원-결합 항체(antigen-bound antibody)의 검출을 가능하게 하는 분석적으로 확인가능한 신호를 그 화학적 특성에 의하여 제공하는 분자를 의미한다. 검출은 정성적이거나 정량적일 수 있다. 이러한 종류의 분석법에서 가장 일반적으로 사용되는 지시기 분자는 효소(enzyme), 형광단(fluorophore) 또는 방사성 핵종 함유 분자(radionuclide containing molecule)(예를 들어 방사성 동위원소(radioisotopes)) 및 화학발광 분자 (chemiluminescent molecules)일 수 있다.

효소 면역 분석법(enzyme immunoassay)의 경우에, 일반적으로 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 또는 과옥소산(periodate)에 의하여 효소는 제2항체와 결합된다.

쉽게 인식되겠지만, 광범위한 다른 결합 기술이 존재하고, 이는 당업자들이 용이하게 이용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 효소는 다른 것들 중에서 홀세라디시 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase), 글루코스 옥시데이스(glucose oxidase), -갈락토시데이스(-galactosidase) 및 알칼리성 포스파테이스(alkaline phosphatase)를 포함한다. 특정한 효소와 사용되는 기질은 일반적으로 해당하는 효소의 가수분해시 검출가능한 색상 변화의 생성을 위하여 선택된다. 또한 상술한 색체 유전자 기질(chromogenic substrate) 대신에 형광성 산물(fluoreascent product)을 산출하는 형광유전자 기질을 이용하는 것도 가능하다. 모든 경우에 있어서, 효소 표지 항체(enzyme-labelled antibody)는 제1 항체 합텐 복합체(first antibody hapten complex)에 추가되고 결합되며,그리고 과잉 시약(excess reagent)이 세척된다. 적절한 기질을 포함하는 용액이 그 후에 항체-항원-항체의 복합체(antibody-antigen-antibody)에 추가된다. 기질은 제2항체에 연결되는 효소와 반응하여 정량적인 시각적 신호를 제공할 수 있으며 더욱이 이는 일반적으로 분광광도측정법에 의하여 정량화되며, 샘플에 존재하는 합텐의 양을 표시한다. "지시기 분자(reporter molecule)"는 또한 레이텍스 비스(latex bead)상의 적혈세포와 같은 세포 응집 또는 응집 저해(inhibition of agglutination)의 이용까지 확장된다.

다르게는 플로오레세인(fluorecein) 및 로다민(rhodamine)과 같은 형광성 화합물(fluorescent compound)은 그들의 결합능(binding capacity)을 바꾸지 않고 항체들에 화학적으로 결합할 수 있다.

특정한 파장의 빛의 조도에 의하여 활성화될 때, 플로오르크롬표지 항체(fluorochorme-labelled antibody)는 빛 에너지를 흡수하고, 상태를 분자에서 흥분하도록 유도하며, 이에 이어 광현미경(light microscope)으로 시각적으로 검출 가능한 특정의 색상에서 빛의 방출이 따른다. EIA에서와 같이, 형광 표지항체 (fluorescent labelled antibody)는 제1항체-합텐 복합체(first antibody-hapten complex)에 결합될 수 있게 된다. 비결합 시약(unbound reagent)의 세척한 후에, 잔여 삼차 복합체(remaining tertiary complex)는 적절한 파장의 빛에 노출되고, 관찰된 형광은 관심의 대상인 합텐의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 (Immunofluorescene and EIA technique)은 당해 기술분야에서 잘 수립되었으며 본 발명에 대하여 특히 바람직하다. 그러나, 방사성 동위원소, 화학 발광 또는 생물발광 분자와 같은 다른 지시기 분자들이 사용될 수 있다.

본 발명은 뒤따르는 제한되지 않는 예들에 의하여 계속 설명된다.

실시예 1

높은 안티 HBs 레벨을 갖으나 표면 항원에 대하여 음성적인 싱가포르 성인들과 백신접종한 미성년자들에서 HBV 표면 항원 변이종의 검출과 확인

HBsAg에 대하여 음성적인 싱가폴 성인 및 백신접종한 미성년자에서 HBV DNA의 존재는 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 이용하는 폴리머라아제 연쇄반응 증폭(PCR amplication)에 의하여 조사된다. 다른 인종적 집단으로부터 63인의 성인과 15명의 백신접종한 미성년자(15세 이하의 나이이고 재조합 백신으로 접종함)들로부터 선택되며(표2), 이들은 4개의 독립적인 상업적인 면역기초 진단 키트에 의하여 HBsAg에 대하여 음성적으로 테스트되었다. 그들은 HBV 핵심항원(anti-HBc)에 대한 전체 항체들에 대하여 모두 양성적이다(Corzyme, Abbott Laboratories, USA). 모두 또한 안티-HBs에 대하여 양성적이다(Ausab, Abbott Laboratories, USA)(표2). 혈청 100μl로부터의 DNA가 프로티네이스 K 처리 (proteinase K treatment)에 의하여 추출되고, 클로로포름/페놀 추출 (chloroform/phenol extraction) 및 에탄올 침전(ethanol precipitation)이 뒤따른다. 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 Pfu DNA 폴리머라아제 (Stratagene, USA)로 폴리머라아제 연쇄 반응 증폭하는 데 이용된다. 증폭은 35사이클 동안 수행되고, 각각의 사이클은 94℃에서의 변성(denaturation)(1분), 50℃에서의 어닐링(annealing)(2분) 및 73℃에서의 신장(extension)(3분)으로 구성된다. 결과는 15명의 미성년자(20%)들 중에서 3명 및 63(13%)명의 성인들 중에서 8명에 본 발명에서 제공되는 시발자 올리고뉴클레오티드를 이용하여 HBV DNA가 증폭되는 것을 나타낸다. 이러한 HBsAg 음성 미성년자의 HBsAg 변이종의 확인은 HBsAg에 양성적으로 테스트된 백신접종된 싱가포를 미성년자들에서 HBsAg 변이종들의 검출에 대한 이전의 보고와 비교할 때 특이한 상황을 나타낸다. HBV DNA는 이러한 백신접종된 미성년자의 집단내의 모든 샘플들에서 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭된다.

증폭된 DNA 조각들의 직접 서열결정은 이러한 샘플들내에서 MHR의 다양한 위치에서 변이종들은 나타낸다(표2). 이러한 것들은 여섯 가지 경우에서 가장 흔한 백신 탈출 G145R을 포함한다. 또한 라미부딘 처리요법과 관련되는 하나의 경우의 보고에서 최근에 발견된 G130D 변이종(표2)을 갖는 세 개의 경우들이 여기에 있다. 추가적으로 T131N 변이종은 네 개의 경우들에서 확인되었다. 항상 HBsAg상에 동시 발생 T114S를 지니는 보고된 유전자형-관련 T131N과는 달리, 본 발명에서 제공되는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 이용하여 확인되는 T131N 변이종은 잔기(residue) 114에 야생형 S(세린)를 갖는다. 이는 따라서 검출의 탈출이 가능한 변이종일 수 있다는 것을 암시한다.

당업자들은 여기서 구체적으로 설명된 발명이 구체적으로 설명된 것 외에 변형 및 변경이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 또한 본 발명은 모든 이러한 변형 및 변경들을 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로, 전체적으로 또는 임의의 둘 또는 그 이상의 상기 단계들 및 특징들의 결합으로 언급 또는 표시된 모든 단계들, 특징들, 합성물들, 화합물들을 포함한다.

관계서적

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12. Oon et al. Vaccine 13: 699-702, 1999

Claims

샘플에서 HBV 유도 핵산 표적 서열을 검출하기 위한 방법에 있어서,

상기 방법은 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태를 산출하기 위하여 샘플이 변성조건을 거치게 하는 단계,

변성된 샘플을 적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 변이 생성될 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 처음 언급된 가닥에 상보적인 가닥으로 변이 생성하고, 상기 프라이머들은 상기 프라이머들 각각이 변이생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 형성하도록 그들의 3' 말단으로부터 연장 가능하다),

상보성 연장 산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하기 위하여 증폭을 할 수 있는 조건을 샘플이 거치게 하는 단계, 및

증폭 산물의 존재를 검출하는 단계(여기서 상기 증폭된 산물은 상기 HBV 유도 핵산 표적 서열을 표시한다)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프라이머들은 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내의 또는 일부의 보존된 뉴클레오티드 서열에 대응 또는 인접하는 구역들로 변이생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 프라이머들은 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부내에서 보존된 뉴클레오티드 서열에 대응 또는 인접하는 구역으로 튀기생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서,

HBV 유도 mRNA로부터 단일 또는 이중가닥 cDNA 분자들을 산출하기 위하여 샘플이 역전사 조건을 먼저 거치게 하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프라이머들 중의 하나는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자로 표지되고, 상기 프라이머들 중의 다른 하나는 포획가능한 모이어티로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
샘플에서 HBV 유도 DNA 표적 서열을 검출하기 위한 방법에 있어서,

상기 방법은 고형지지에 고정된 프라이머 및 용액 상의 제2 프라이머를 갖는 반응 용기에 상기 샘플을 도입하는 단계(여기서, 양쪽 프라이머들은 HBV 게놈상의 보존된 구역내의, 가까운, 또는 인접한 구역에서 HBV 유도 DNA의 상보성 단일 가닥들 상의 상보성 뉴클레오티드 서열로 변이생성할 수 있고, 용액상 프라이머는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자로 표지된다),

반응 용기가 증폭을 할 수 있는 조건을 거치게 하는 단계, 및

확인 가능한 신호의 존재를 검출하는 단계(여기서 상기 신호의 존재는 HBV 유도 DNA의 존재를 표시한다)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
HBV의 동일한 또는 다른 가닥들 또는 변이종으로부터 하나 또는 그 이상의 HBV 유도 DNA 표적 서열들을 검출하기 위한 방법에 있어서,

단일 가닥 형태의 HBV 유도 DNA를 추정적으로 포함하는 샘플을 개별적으로 고정되거나 또는 용기내의 고형지지로의 배열 내의 두 개 또는 그 이상의 프라이머들과 접촉시키는 단계(여기서, 반응 용기는 추가적으로 고형 지지에 고정된 짝을 갖는 용액상 프라이머들을 포함하고, 여기서 고정된 프라이머와 그것의 용액상 짝 프라이머는 증폭 조건하에서 HBV 유도 DNA의 구역을 증폭할 수 있고, 여기서 용액상 프라이머는 확인 가능한 신호를 제공할 수 있는 지시기 분자를 운반하여 고형 지지상의 정의된 위치에서 신호의 존재가 특정한 HBV 격리 또는 변이종의 확인을 가능하게 한다)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
둘 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 배열은 고형지지에 고정되고 상기 프라이머들은 HBV 유도 DNA로부터 상보적인 뉴클레오티드 서열로 잡종생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 배열.
제8항에 있어서, 상기 배열은 매트릭스(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)상의 좌표를 갖는 식 a₁, a₂, ... , a_n에 의하여 정의되는(여기서, a₁a₂....a_n은 n뉴클레오티드들을 합계하는 동일한 또는 다른 올리고뉴클레오티드들을 나타내고 각각의 올리고뉴클레오티드는 격자 좌표들(x₁y₁), (x₂y₂)...(x_ny_n)에 의하여 정의될 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드들은 b₁b₂....b_n에 의하여 정의되는 증폭짝들을 가짐으로서 올리고뉴클레오티드들 a₁b₁, a₂b₂...a_nb_n은 HBV 유도 DNA의 상보성 가닥들로 변이생성할 수 있고, 여기서 개재 DNA는 HBsAg 변이종들과 같은 둘 또는 그 이상의 HBV 변이종들 사이에서 보존되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 매트릭스는 상기 HBV 유도 DNA의 보존된 증폭 구역을 지니게 됨으로서 정의되는 특정 HBV 제제를 검출하기 위하여 이용될 수 있다)것을 특징으로 하는 배열.
제1항에 있어서,

프라이머들은 <400>1 및 <400>2, 또는 거기에 적어도 70%의 유사성을 갖는프라이머들 또는 낮은 엄격조건하에서 <400>1 또는 <400>2로 잡종생성할 수 있는 프라이머들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
HBV 유도 핵산 표적 서열을 검출하기 위한 방법에 의하여 확인되는 일반적으로 격리된 형태의 HBV 변이종에 있어서,

상기 방법은 샘플을 상기 표적 서열의 단일 가닥 형태를 산출하기 위하여 변성 조건을 거치는 단계,

적어도 두 개의 프라이머들을 포함하는 일련의 프라이머들과 변성된 샘플을 접촉시키는 단계(여기서, 적어도 하나의 프라이머는 상기 표적 서열의 하나의 가닥으로 튀기생성할 수 있고, 적어도 하나의 다른 프라이머는 상기 제1 가닥에 상보적인 가닥으로 튀기생성하고, 상기 프라이머들은 그들의 3'말단으로부터 연장하여 상기 프라이머들 각각이 튀기 생성되는 가닥에 상보적인 연장 산물을 생성한다),

샘플을 상보성 연장 산물들을 포함하는 증폭된 산물을 생성하도록 증폭을 할 수 있는 조건을 거치는 단계, 및

증폭 산물의 존재를 검출하고(여기서, 상기 증폭된 산물의 존재는 상기 HBV 유도 핵산 표적 서열을 표시한다), 그렇게 검출된 상기 HBV를 격리시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 HBV 변이종.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 면역 표지자로서 유용한 단백질과 같은 발현 산물을 확인하고/ 하거나, 진단 및/또는 처리요법에 이용하기 위한 면역글로불린을 발생시키기 위한 수단.