JPH06507306A - ウイルスタンパクと破壊酵素との融合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルスタンパクと　壊　、との融Ａ 光二Ω艮癒公野 本発明の一般的な分野は抗ウィルス剤の領域に入るものである。とりわけ、本発 明はウィルスとレトロトランスポゾンの複製を阻害する組み換えＤＮＡ構築物に 関する。

光盟Ω宜景 一部のウィルスに対するワクチンの存在にもかかわらず、ウィルス感染は深刻な 健康上の問題の原因となり続けている。一般的な風邪やＡＩＤＳを起こすものの ような多数のウィルスに関するワクチンは開発されていない。一部のウィルスに ついては、ワクチンを開発しようとする試みは困難であると考えられそいるため 、抗ウイルス療法及び予防法に関する他の手法が必要とされている。

伝統的なワクチン以外に、ウィルスに対する免疫性を誘導するためのいくつかの 技術が探索されている。そのような技術の一つにおいては、哺乳動物の細胞をＨ ＩＶに対する細胞の免疫性を作り出すために操作している。ＨＩＶプロモーター 及びポリオウィルスタンパク２人のようなＨＩＶに感染された細胞に対して毒性 のある生産物の配列を含むＤＮＡ構築物が、細胞に導入される。ＨＩＶに感染さ れた細胞はウィルス活性化プロモーターを用いる毒性産物の発現により殺される 。別のこのような技術においては、突然変異体ウィルスのキャプシドタンパクが 、生存可能なウィルスの生産を妨害するために用いられている。

これらの技術は”呻乳類細胞内でのＨＩＶの細胞内阻害方法”という名称のバル チモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）等によるＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１２ ６６）に記載されている。デビット（Ｄｅｖｉｄ）バルチモアによる”Ｉｎｔｒ ａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ−（Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、 　３３５、　ｐＪ９５．２９５ｅｐｔ、　１９８８）という標題の論文では、バ ルチモア等に準拠して操作された細胞を用いてウィルス耐性とする治療法が論じ てられている。

タンパクの機能を研究するためのドミナントネガティブ法（優性劣性法）の利用 は、＋Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　１ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　 ｂｙ　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｍｕｔａｔ奄盾獅刀| という標題の論文に、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚにより記載されている」担巴猥より ｏｌ　、　３２９．　ｐ２１９、１９８７）。Ｔｒｏｎｏ等は、”ＨＩＶ−Ｉ　 Ｇａｇ　Ｍｕｔａｎｔｓ　Ｃａｎ　Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ 　ｗ奄狽■ ｔｈｅ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ　Ｖｉｒ ｕｓ−という標題の論文（Ｃｅ１１．　Ｖｏｗ、　５９、　ｐｐ、　１１３−１ ２０．１９８９）において、ウィルスの阻害に関してこの方法を応用した。ＰＣ Ｔ出願（ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０１２６６）も参照されたい。これらの論文は” ドミナントネガティブ突然変異体を作成するために遺伝子に突然変異またはトラ ンケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を施す方法を教示する。突然変異遺伝子 によって発現されたタンパクは不完全であるが、別の対立遺伝子によって生産さ れたタンパクの野性型単量体とまだなお相互作用しつる。ドミナントネガティブ 法を教示する他の参考文献には次のようなものがある；　５ｚｙｂａｌｓｋｉに よる”生物学的宿主に免疫を付与するための部分的欠損外来遺伝子”という名称 の米国特許４，７７４，１８２；　Ｍａｌｉｍ等による＋Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ 　Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖ　Ｔｒａｎｓ−Ａ ｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｄｅｒｉｖ≠狽奄盾氏@。

ｆ　ａ　Ｔｒａｎｓ−Ｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　Ｒｅｖ、 　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”＋！：いう標題の論文（Ｃｅ’１１．@Ｖｏ１ ５８、　ｐｐ、　２０５−２１４．１９８９）；　Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙ　ｅ ｔ　ａｌによる一Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｎ５ｅ獅■ ｕｓ　Ｐｕｒｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　ｉｎ 　ｔｈｅ　Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓ@Ｊ肛−Ｇｅ ｎｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ａ　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｐｈｅ ｎｏｔｙｐｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＋■■■W 題の論文（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　、　１９９０．　ｐｐ、　１ ７６４−１７７０）：　Ｇｒｅｅｎ等による”Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ　ｏｆ　ＨＩＶ（Ｔａｔ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅｓ：　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ氏@ｏｆ　Ｔｒ ａｎｓ−Ｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｍｕｔａｎｔｓ　ｔｈａｔ　５ｕｐｐｒｅｓｓ　Ｈ ＩＶ−ＬＴＲＤｒｉｖｅｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ氏|という 標題の論文居１ＬＶｏ１．５８．　ｐｐ、　２１５−２２３．１９８９）：及び Ｆｒｉｅｄｍａｎ等による一Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｆ　ａ　Ｔｒｕｎｃａｔ ｅｄ　Ｖｉｒａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　 Ｉｍｐｅｄｅｓ　Ｌ凾狽奄メ@Ｉｎｆｅ ｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｏｇｎａｔｅ　Ｖｉｒｕｓ−という標題の論文（Ｎａｔｕ ｒｅ、　Ｖｏｌ、　３３５．　ｐ、４５２．１９８８）ウィルスのコア、即ちキ ャプシドタンパクと他のタンパクの融合、及び該融合タンパクのウィルス粒子構 造への構築が、当該分野において開示されている。Ｋｉｎｇｓｍａｎ等による” 粒状ハイブリッドＨＩＶ抗原”という名称の特許（米国特許　４゜９１８．１６ ６）及び関連すルＰＣＴ出願（Ｗｏ　８８１０３５６３．名称”融合タンハク及 ヒ粒子”及びＷＯ３８１０３６６２、名称”粒状ハイブリッドＨＩＶ抗原”はレ トロトランスポゾンやレトロウィルスのキャプシドタンパクに対するＨＩＭ抗原 の融合を教示している。キャプシドタンパク／ＨＩＶ抗原融合物の存在下でのウ ィルスやウィルス様粒子の自己構築は、キャプシド構造に取り入れられた融合抗 原を有するウィルス構造を生成する。Ｇｉｌｍｏｕｒ等による関連論文−Ａ　Ｎ ｏｖｅｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　。

ｆ　ＨＩＶ−１ｐ２４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｔｙ　Ｖｉ ｒｕｓ　１ｉｋｅ　ｐａｒｔｉｌｅｓ　（Ｔｙ−ＶＬＰｓ）|（ＡＩＤＳ　１ ９８９、　Ｖｏｌ、　３．　Ｎｏ、１１）はＨＩＶ抗原を活性化因子Ｘａを用い てウィルス様粒子から分裂できることを示している。同様に、Ｗｅｌｄｏｎ等は −Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、　６４、　ｐｐ、　４１ ６９−４１７９．１９９０）の中で、Ｒｓｖ　■Ｌ　融合タンパクからの１ｓｏ −１−チトクロームの分裂と分泌を教示している。Ｋｉｎｇｓｍａｎ等による論 文”Ｈｏ５ｔ−ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ”（Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、 　Ｌｏｎｄ、　Ｂ５２４．　ｐｐ、　４７７−４８５　（１９８９）は、キャプ シド／抗原融合物が箇母内でウィルス様粒子に組み込まれ、該粒子の表面にＨＩ Ｖ抗原遺伝子が表れることを教示している。

さらに種々の参考文献が、組み換え体の表面タンパクを用いてウィルスを生成す る遺伝子構築物の利用法を教示している・Ｄｕｌｂｅｃｃｏによる米国特許４． ５’９３．００２号「組み換え体表面タンパクを有するウィルス」、及びＪｏｎ ｅｓ等による論文”Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｇａｇ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉ ｄａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１ｎｔｏ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｐｒａｒｔｉ ｃｌｅ刀h。こ れらの参考文献は、ワクチン及び診断法として使用するためにウィルス粒子の表 面上に非ウィルス部分を発現させた融合タンパクの生成を教示している。

当該分野におけるこれらの向上にもかかわらず、まだウィルス性の病気と戦うた めの新しい方法が必要とされている。

光咀９贋斐 本発明の目的は、ウィルスあるいはウィルス様の粒子に組み込まれ、粒子の複製 能力を破壊することのできる融合タンパクを与えることにある。

本発明の別の目的は、ウィルス又はウィルス様粒子に組み込むことができ、さら に粒子の複製能力を破壊することのできる融合タンパクをコードするＤＮＡ分子 を与えることにある。

本発明のさらに別の目的は、他のウィルスやウィルス様の粒子の複製能力を破壊 することのできる組み換えウィルスあるいはウィルス様粒子を与えることにある 。

本発明のさらに別の目的は、ウィルスの複製やレトロトランスポゾンの転位を阻 害する方法を与えることにある。

またもう一つの発明の目的はウィルスやウィルス様粒子に対して耐性のある動物 を生産する方法を与えることである。

これらのそして他の発明の目的は一つ又はそれ以上の以下に記述した実施態様に よって与えられる。

その発明の一つの実施態様においては、ウィルス又はウィルス様粒子のキャプシ ド又はエンベロープタンパク：及び前記ウィルス又はウィルス様の粒子の複製能 力を破壊することができる酵素を含む融合タンパクが提供される。

さらに別の発明の実施態様において、ウィルス又はウィルス様の粒子のキャプシ ド又はエンベロープタンパク、及び前記ウィルス又はウィルス様の粒子の複製能 力を破壊することができる酵素を含む融合タンパクをコードするＤＮＡ分子が提 供される。

さらに別の発明の実施態様において、ウィルス又はウィルス様の粒予めキャプシ ド又はエンベロープタンパク；および前記キャプシドウィルス又はウィルス様の 粒子の複製能力を破壊することができる酵素を含む融合タンパクをコードするＤ ＮＡ分子を含む組換えウィルス又はウィルス様粒子が提供される。

さらに別の発明の実施態様において、ウィルス又はウィルス様の粒子のキャプシ ド又はエンベロープタンパク：及び前記ウィルス又はウィルス様の粒子の複製能 力を破壊することができる酵素を含む融合タンパクをコードしている核酸分子を 、ウィルスに感染しやすい細胞に導入することを含むウィルス複製又はレトロト ランスポゾン転位を阻害する方法が提供される。

さらに別の発明の実施態様において、ウィルスのキャプシドはエンベロープタン パクおよび該ウィルスの複製能力を破壊することができる酵素を含む融合タンパ クをコードするＤＮＡ分子を、ウィルス感染に感受性の動物の生殖細胞又は胚へ 導入する工程からなるウィルス耐性動物の製造方法が提供される。

本発明の、以上の及び他の実施態様は、下記の詳細な説明より当該分野の技術者 に明らかなとおり、ウィルス感染に免疫性の細胞およびその作製方法を提供する 。本発明は、ウィルスの複製またはレトロトランスポゾン転位に必須のウィルス 核酸、またはタンパク、または脂質の特異的破壊を可能にする。本発明の特別な 遺伝子構築物は、使用されるキャプシドまたはエンベロープタンパクにより、あ る特定のウィルスまたはレトロトランスポゾンに特異的であるが、本性は極めて 一般的で、様々なウィルス、レトロトランスポゾンの複製を妨げる、様々な融合 タンパクの構築を可能にする。

区皿Ｑ皇奥鼠脱皿 図１は、本発明により示唆されるキャプシドタンパク／ヌクレアーゼ融合物存在 下での欠陥ピリオンの構築を示す。

図２は、レトロトランスポゾンＴｙ１のＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅにおける転位または複製サイクルを示すが、これはレトロウィルス 複製と類似していることを示す。

図３はＴ３／１エレメントのキャプシドタンパクをコードする遺伝子とブドウ球 菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）をコードする遺伝子との組み換え構築物を示す（ＳＥＱ ｎ　ｖｉｔｒｏ実験の結果を示す。図４ａはＧＮ１７３からの逆転写酵素分析を 示す。図４ｂはＧＮ１７３からのａｎｔｉ−Ｔｙｌイムノプロットを示す。図４ ＣはＧＮ１７３からのヌクレアーゼ分析を示す。図４ｄはＧＮ１７３とＧＮ１７ ６からのａｎｔ　１−３Ｎイムノプロツトを示す。図４ｅはＧＮ１７６がら逆転 写酵素活性を示す。図４ｆはＧ１７６からのａｎｔｉ−ＴＹＡイムノプロットを 示す。図４ｇはＧＮ１７６からのヌクレアーゼ分析を示す。

図５はＴｙｌのキャプシドタンパクをコードする遺伝子と酵素Ｂａｒｎ＋ａｓｅ 　（ＢＮ）をコードする遺伝子の組み換え構築物を示す（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： ５）。

図６はＴｙ１転位の分析法を示す。

図７はＴｙｌ−ＢＮ融合プラスミドによってＴｙ１転写を阻害する方法を示す図 ８はＨＩＶ複製を阻害するよう設計された構築物を示す（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０＝ ６）。

図９はＡＬＶ複製を阻害するよう設計された構築物を示す（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ： 　７）。

及咀Ω距胆望脱盟 本発明はここでは複製能と総称されるウィルス複製またはレトロトランスポゾン 転位を阻害する方法を記載するものである。特に、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ま たはプロテアーゼなどの酵素のキャプシドまたはエンベロープ成分への融合が、 欠陥ウィルス粒子の形成を導き得るということが見出された。該融合タンパクは 、ピリオン構造に導入されると、必須のウィルス成分、例えば複製に必要な核酸 又はタンパク又は脂質を不活性化することができる。この技術は本明細書におい て、キャプシド−標的ウィルス不活性化（ＣＴＶＩ）と記載するが、これはエン ベロープへの融合の目的をも含むものである。

本発明は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼを、特に、必須のウィル ス成分、例えば複製に必要な核酸又はタンパク又は脂質を分解又は修飾する抗ウ イルス治療剤として使用する。本発明の方法は、比較的柔軟なキャプシド構造を 有するウィルス、例えばレトロウィルス類、ヘルペスウィルス類、ポックスウィ ルス類、トガウィルス類、ヘパドナウィルス類、カウリモウィルス類、ミクソウ ィルス類およびバラミクソウィルス類であって、ウィルス核酸を含む水性内部コ ンパートメント内の外来タンパクのエンキャプシデーションを容易に可能にする ものに適用されうる。好ましくは、融合タンパクの酵素部分は組み込まれたキャ プシド構造に対して内側を向くように配向される。しがしながら、プロテアーゼ 及びリパーゼの場合には、外側を向く酵素も使用しうる。そのような構築物の使 用は、ウィルスが水性内部コンパートメントを有することを要求しない。リパー ゼの場合には、ウィルスのエンベロープを酵素の標的とすることが望ましい。

酵素部分はウィルスエンベロープの内側又は外側に存在しうる。このようにして 、全てのエンベロープされたウィルスがＣＴＶＩにより標的とされうる。

レトロウィルス、及びここにおいて一般的にレトロウィルスとして記載されるレ トロウィルスに非常に関連性の高いレトロトランスポゾンは、その組立てメカニ ズムのために、特にキャプシド標的ウィルス不活性化（ＣＴＶＩ）に感受性であ る。これらのキャプシドが、ウィルスの核酸又はタンパクと接触できる場合には 、破壊酵素分子をキャプシド表面の内側に導くためにこれらのキャプシドをいか に組立てるかの知識を利用することもできる。レトロウィルス又はレトロトラン スポゾンの逆転写酵素は、ポリメラーゼが第一の翻訳生成物のＣ末端部を生成し 、ｇａｇタンパクがＮ末端を生じる天然融合タンパクとして発現される。Ｇａｇ −Ｐｏｌ融合タンパクか生じるメカニズムは各レトロウィルスにおいて異なって おり、しばしば翻訳中のフレームシフト、ナンセンスコドンの抑制又は又はスプ ライシングに影響を与える。合成のメカニズムとは無関係に、逆転写酵素タンパ ク配列がＧａｇタンパク配列のＣ末端で見出される。さらに、逆転写酵素はキこ と）により、レトロウィルス粒子内に酵素が組み込まれる。さらに、ヌクレアー ゼ又はプロテアーゼがウィルスＲＮＡ又は逆転写酵素にアクセスできるようキャ プシドに対して配向させる。

本発明は、その効果を達成するために単にサブユニットの混合に頼るめではない という点で、従来技術の“ドミナントネガティブ法とは異なる。むしろ、ドミナ ントネガティブ効果は、ウィルスの必須の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ。

又はタンパク）を変化させ得る又は破壊し得る破壊または修飾を施す酵素活性を 伴うタンパクの融合により行われる。この破壊又は修飾活性は、活性の望まれる 部位（ウィルス粒子の内側又は密接した位置）を狙う。逆転写酵素と同じように ウィルス粒子のコアタンパク（図１）に共有結合するからである。

その多様性の他に、キャプシド標的ウィルス不活性化（ＣＴＶＩ）の主な利点の 一つは、それが酵素的であるということである。すなわち、上記で参照した方法 のように、ある場合にはウィルスのライフサイクルに影響を及ぼすような突然変 異タンパクの大量の過剰発現に頼らない。むしろ、少量の酵素分子（例えばヌク レアーゼ）をウィルス粒子に導入し、ウィルスの１種又はそれ以上の必須成分を 分解又は修飾する。

キャプシド標的ウィルス不活化（ＣＴＶＩ）はまた、伝統的な化学療法に対して も有利である。特に、ＨＩＶウィルス及び他のレトロウィルス等のエラーを伴い がちな複製機構を有するウィルスはあらゆる化学療法剤に抵抗性となるようであ る。例えば、広く使用されている抗ＨＩＶ薬であるＡＺＴに対して耐性のＨＩＶ アイソレート（分離株）が既に報告されている。明らかに、医薬に対する耐性は ウィルス感染についても、細菌に対するそれと同様に、重要な問題である。遺伝 子治療又は細胞内免疫法においても、耐性が問題となっている。例えば、キャプ シドタンパクが本発明のキャプシド融合タンパクと共にはもはや組み込まれない ような突然変異をウィルスが起こした場合ぜそのウィルスは特定のＣＴＩＶ療法 に耐性になるであろう。しかしながら、突然変異ウィルスのＤＮＡをクローン化 して、ヌクレアーゼ又は他の酵素をコードする遺伝子に突然変異キャプシド遺伝 子を付けることにより治療の有効性を保持することができる。そのような措置は 通常の医薬品治療においては不可能である。与えられた医薬に対して、ウィルス が一度耐性になれば、その医薬の使用は放棄しなければならない。

本発明による融合タンパクは、ウィルス又はウィルス様粒子の複製能を破壊する ことができる破壊酵素を含む。本発明において使用される“複製能”は、ウィル ス粒子の感染性又はレトロトラスボソンの転位を含む。感染及びトラシスポジシ ョンの段階の両方が、その核酸エレメントの複製（逆転写）を要求する。典型的 には、破壊酵素はヌクレアーゼ、リパーゼ、又はプロテアーゼである。タンパク 修飾酵素、例えば酵素活性を減少させるキナーゼ、例えば、ウィルスコードポリ メラーゼを不活化するものも使用することができる。融合タンパクはエンベロー プタンパク、例えばＧａｇ又はＴＹＡのキャプシドを含むこともでき、これは融 合タンパクに、ウィルス粒子又はウィルス様粒子内に共に組み込まれる能力を与 える。上記のように、リパーゼ融合の場合には、融合タンパクのウィルスコード 部分がキャプシドタンパクよりもむしろエンベロープタンパクであることが好ま しい。

本発明の実施において融合物を作るために使用されうるヌクレアーゼには、Ｅｃ ｏＲＩのような制限エンドヌクレアーゼ、並びにＴＩ　ＲＮＡ５ｅ、バルナーゼ （Ｂａｒｎａｓｅ）及びブドウ球菌ヌクレアーゼのようなより特異性の低いＲＮ Ａ５ｅが含まれる。本発明の実施において使用されうる他の破壊酵素には、プロ テアーゼ及びリパーゼが含まれる。本分野で知られているそのような酵素のいず れを使用することもできる。これらの酵素は、特定のウィルスの複製（感染性） に必要だと考えられるタンパク及び脂質を分解する。タンパク構造を修飾する他 の酵素も、ウィルスのライフサイクルに必要なタンパクの不活化をもたらすので あれば、使用されうる。そのようなタンパク修飾酵素には、キナーゼ、グリコン ラーゼ、ホスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、アシラー ゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ及びデミリスチラーゼが含まれる。

高レベルの融合タンパクの発現は要求されず、ウィルス粒子の不活化には一つの 活性酵素分子で充分であり得る。しかしながら、生じた各ウィルス粒子が少なく とも一分子の融合タンパクを有することが望まれる。従って、統計的な考慮がら 、ウィルス粒子当たり一分子の融合タンパクより多い割合でり発現させることが 望まれる。

本発明のいくつかの実施態様においては、酵素の破壊活性は、本発明の構築物を 製造するために使用される細胞に対しても有害でありうるので、条件材で活性か 、又は制限的に活性な酵素を使用するのが望ましい。従って、例えば活性に域値 以上のカルシウムを必要とするカルシウム依存性酵素が使用されつる。”使用さ れうるカルシウム依存性酵素には、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）　、ホスホリ パーゼＡ２、及びブドウ球菌ヌクレアーゼが含まれる。非条件的に破壊酵素の活 性を細胞には毒性ではないが、ウィルスに毒性であるレベルに減少させることも 望ましい。

以下により詳細に説明するように、ランダム突然変異源をこの目的のために使用 することもできる。

上記のような融合タンパクをコードするＤＮＡ分子も本発明により提供される。

ＤＮＡ分子には、ＤＮＡ分子がキャプシド又はエンベロープタンパクが誘導され るウィルスの宿主細胞において発現することを可能にする適当な転写及び翻訳調 節信号も含まれる。細胞内のウィルスの存在に依存して融合タンパクを発現させ ることもできる。

組み換えウィルス又はウィルス様粒子も本発明により提供される。これらの粒子 には、上記のように融合タンパクをコードする核酸分子も含まれる。従って、こ れらの組み換えウィルスによる細胞への感染により、融合タンパクの発現が誘導 される。組み換えウィルスは、前記融合タンパクのキャプシド又はエンベロープ タンパクが誘導されるウィルスに関しないものであることが望ましい。組み換え ウィルスは融合構築物の導入のための輸送手段に過ぎない。細胞が、融合タンパ クキャプシド又はエンベロープ部と同種のウィルスで感染されると、ウィルスの 通常の感染サイクルが進行する。しかしながら、ウィルスがウィルス核酸をキャ プシドで包むと、野性型のキャプシド又はエンベロープタンパクが融合タンパク と共に組みこまれる。従って、新たに組立てられたウィルスは野性型及び融合キ ャプシド又はエンベロープタンパクを含むハイブリッドである。新たに組み立て られたウィルスは、融合タンパクの酵素部分がウィルスの核酸又はウィルスエン ベロープを含む必須ウィルスパッケージタンパクもしくは脂質のいずがを不活化 するので、感染性ではない。

ウィルスの複製、感染又はレトロトランスポゾンの転位を抑制する方法も、本発 明により提供される。融合タンパクをコードする核酸分子がウィルスに感染しや すい細胞に導入される。融合タンパクには、ウィルスのキャプシド又はエンベロ ープタンパク、並びに上記のような破壊酵素が含まれる。核酸分子を細胞内に導 入する方法は、本発明において限定的ではなく、多くのそのような方法が当該分 野において知られている。これらには、限定的ではないが、トランスフォーメー ション、トランスフェクション、リポフエクション、タングステンマイクロプロ ジェクタイル（ｔｕｎｇｓｔｅｎ　ｍ１ｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）　、電気 穿孔法、融合及びトランスダクションが含まれる。

本発明の融合タンパクをコードする核酸分子は、造血細胞系（ｌｉｎｅａｇｅ） の幹細胞に導入されうる。Ｔ−リンパ球及び単球マクロファージは、造血幹細胞 がら誘導され、ＨＩＶのようなウィルスの第一の標的となる。骨髄細胞は、個体 から取り出すことができ、所望により、幹細胞を混合された骨髄細胞の集団がら 精製することができる。本発明の核酸分子は、トランスフェクションの方法によ り、又は該技術分野において知られている他のいずれの手段によっても幹細胞に 導入することができる。トランスフェクションされた幹細胞は、その後、個体に 再導入することができる（幹細胞自家移植）。移植した幹細胞の増殖を促進する ため、個体の骨髄細胞を照射又は化学療法剤により部分的に破壊することもでき る。

本発明の核酸分子を動物に導入する別の経路においては、配偶子細胞又は胚が処 理される。当該技術分野において知られているように、マイクロインジエクシラ ン、又はトランスフェクションのような技術が使用されうる。核酸で処理された 細胞は、人口的な受精（配偶子）において使用することができ、また、当該分野 で知られているように、ホルモン処理した雌動物（胚）に再移植することもでき る。

本発明の核酸を細胞又は動物に導入するさらに別の方法においては、組み換え体 ウィルスを使用することができる。組み換え体ウィルスは望ましくは、遺伝子融 合のキャプシド又はエンベロープタンパクが誘導されるウィルスと同じ細胞型フ タ−か使用されつる。明らかに、該ベクターは不活性化された発癌遺伝子を有す る。その後、組み換え体ウィルスを該ベクターの特定のウィルスのウィルス感染 の公知の経路により投与することができる。例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ構築物のため には、血液流への直接の投与を用いうる。

本発明の融合タンパクコード構築物を細胞又は動物に導入する別の方法は、本発 明の核酸は含むが、本発明の融合タンパクは含まないハイブリッドウィルス粒子 を用いるものである。本発明の融合タンパクをコードする核酸を含むハイブリッ ドウィルスは、パッケージ細胞系を用いて製造させることができる。そのような 細胞系は、当該技術分野で良く知られている技術により培地内で繁殖させうる。

そのような細胞系は、ウィルスゲノムのパッケージングに必要なタンパクを生産 する。本発明の核酸は、そのようなパッケージング細胞系に導入することもでき る。望ましくは、該核酸は、細胞系゛のパッケージングタンパクにより認識され るパッケージングシグナルを含む。好ましくは、融合タンパク遺伝子は、誘導プ ロモーター、例えばメタロチオニンプロモーターの制御下にある。本発明の核酸 を有するウィルス粒子を生産することが望まれる場合には、誘導プロモーターは 融合タンパク遺伝子構築物の転写を開始させるように誘導され、シクロへキシミ ドのようなタンパク合成阻害剤は、融合タンパク遺伝子の転写物がパッケージン グ細胞系内で翻訳されないように添加されつる。従って、融合タンパク遺伝子構 築物は、転写され、融合タンパクから妨害（コアセンブリ−）されることなく細 胞系により製造された粒子内にパンケージングされる。パッケージされた粒子は 細胞を感染するために使用されると、融合タンパクをコードする核酸が発現し、 そして融合タンパクが子孫粒子と共に組み立てられそれらを非感染性にする。

ウィルスに耐性の動物を生産する方法も、本発明により提供される。上記のよう に融合タンパクをコードする核酸分子は、動物の生殖細胞系又は胚に導入される 。そのような導入のための方法は当該分野で知られている。核酸分子を含む接合 体の発達から得られる全ての体細胞は、そこから融合タンパクキャプシド又はエ ンベロープ部分が誘導されるウィルスに耐性である。各細胞に外来遺伝子を有す るトランスジェニック動物の作製方法は当該分野において知られている。

去施皿 二つの組み換え体、即ち１）Ｔｙ１ウィルス様粒子粒子構造タンパクＹＡ）遺伝 子とブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）遺伝子との融合体（即ちＴＹＡ−５Ｎ融合 ）、及θ２）　ｉｙｉウィルス様粒子粒子構造タンパクＹＡ）遺伝子とバルナー ゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）ヌクレアーゼキャプシド標的ウィルス不活性化（ＣＴＶＩ ）の成否が生化学的に及び生物学的に実験された。酵母細胞内で生産されたキャ プシドタンパク−ヌクレアーゼ融合タンパクは、ウィルス粒子内に、酵素的に活 性な形態で導入されたことが確認された。さらに、キャプシドタンパク−ヌクレ アーゼ融合タンパクは、Ｔｙｌ−ヌクレアーゼ融合物及び通常のＴＹ−１エレメ ントの両者が同じ細胞内で発現する場合、通常のＴｙｌエレメントの転位を抑制 する。

図３ａに示されるように、ＴＹＩエレメントとブドウ球菌ヌクレアーゼ遺伝子（ ＳＮ）の融合体が構築された。ＳＮ遺伝子はＴｙｌにＴＶ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１）の＋２６００位に融合された。Ｔｙ配列は、Ｂｏｅｋｅ、　Ｊ、Ｄ、 、　Ｄ、Ｊ、　Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ、Ｄ、　Ｃａ５ｔｒｉｌｌｏｎ　ａｎｄ　Ｇ 、Ｒ。

Ｆｉｎｋ、　（１９８８ａ）　−Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｃｏｎｔ ａｉｎｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｎｏｎｆｕｎｃ狽奄盾獅≠戟@ｃ。

ｐｉｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｔｙｌ”、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ　８：　１４３２−１４４２に論じられている。このｒｙｔ配列は、完全な １読み枠（ＯＲＦ）並びにＴＹＢＯＲＦ　（プロテアーゼ（ＰＲ）領域）の部分 を含む。ＳＮ遺伝子は、ＳＮのリーダー配列内で、この構築物にコードされたＳ Ｎの第一のアミノ酸が、５ｈｏｒｔｌｅ　（１９８３）”Ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　 ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ 　ｎｕｃｌｅａｓｅ″Ｇｅｎｅ、　２２：　１８１−１８９　（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：２）の配列の一５位のプロリンになるようにＴｙｌに融合される。ｐＩＢ ＋３１　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　 Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）ポリリンカー由来の短い配列はＴＹＢ 　ＰＲコード領域をＳＮコード領域に結合する。ＴＹＢとＳＮの間の結合部の正 確な配列は、図３の下に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３）　、　ｒｙｔプロモ ーター（即ち、ＴｙＩ　ＬＴＲのυ３領域）を、Ｂｏｅｋｅ、　ＪＤ、　、　Ｄ 、Ｊ、　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ、　Ｃ，Ａ、　５ｔｙｌｅｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆ ｉｎｋ　（１９８５）ゴｙ　ｅｌｅｍｎｔｓ　狽窒≠獅■ ｐｏｓｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｎ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ″Ｃｅ１ ｌ　４Ｑ：４９１−５００に記載されているように、強い、調節された酵母ＧＡ Ｌ　１プロモーターに置き換えた。

最終的にはＴＹＡ−ＰＲ−ＳＮ遺伝子結合体を有するプラスミドは、大腸菌（図 示していない）と酵母（２μ複製開始点及び酵母ＵＲＡ３遺伝子）の双方で複製 及び選択を可能にする配列を含んでいる。この構築物にはＴｙｌの３°ＬＴＲが 含まれていて転写が正確な位置で終了するようにされている。最終的な形のプラ スミドをｐＧＮ’１３０６と命名する。このプラスミドの骨格は、Ｂｏｅｋｅ、 Ｊ、　Ｄ、、　Ｄ、　Ｊ、　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ、　Ｃ，Ａ、　５ｙｌｅｓ　ａ ｎｄ　Ｇ、　Ｒ，Ｆｉｎｋ　（１９８５）ゴｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｔｒａｎｓ ｐｏｓｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｎ　ＲＮＡ　ｉ獅狽■窒高■ ｄｉａｔｅ”、　Ｃｅ１ｌ　４０：　４９１−５００に記載されているｐＧＴｙ Ｈ３の骨格と事実上はとんど同一である。

転位可能な（コンピテント）Ｔｙｌを含む第二のプラスミド、　ｐＪＥＦ１６７ ８も、この実験に使用した。このプラスミドは、選択マーカーＵＲＡ３が、亜選 択マーカーで置き換えられていること以外は、Ｂｏｅｋｅ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｈ， Ｘｕ　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆｉｎｋ、　（１９８８ｂ）　−Ａｇｅｎｅｒａｌ　ｍ ｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｙｅ≠唐煤A”　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３９：２８０−２８２に記載されたｐＧＴｙＨ３−ｎｅｏと同一 である。このプラスミド内のＴｙ１エレメントも、ＧＡＬ　ｌプロモーターの調 節下にあるが、この場合、ＴＹＡ　及び葺Ｂ　ＯＲＦの両者とも損なわれてない 。さらに、転位実験のためのマーカーとして使用できる細菌のｎｅｏ遺伝子は、 ＴＹＢ　ＯＲＦの３゛末端と３°ＬＴＲの５°末端の間に挿入され、従って、Ｔ ｙ１コード領域を損なわない。このプラスミドは図６に模式的に示される。

二種の酵母菌、ｐＪＥＦ　１６７８及びｐＧＮ１３０６　（７ｙ１−５Ｎ構築物 ）を含むＧＮ１７３　、並び１：ｐＪＥＦ１６７８及び２ｕ、ＵＲＡ３及びＧＡ ＬＩ配列を有するがＴＹＩ−ＳＮ挿入を欠く第二のプラスミドｐＢ６２１を含む 対照菌、ＧＮ１７６を、この実験に使用した。ＧＮ１７３及びＧＮ１７６を、Ｇ ＡＬ　１プロモーターからの転写を誘導するために、ガラクトース含有培地で生 育させた。ｒｙｔウィルス様粒子粒子ＬＰｓ）を、Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｄ、 Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、　Ｂｏｅｋｅ　（１９８８）”Ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｉｎｔ ｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　Ｔｙｌ　ｅｌｅｒｔｋｅｎｔ　ｔｒａ ｎｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｃｏｐｕｒ奄■奄■刀@ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ−１ｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　Ｔｙｌ　 ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ″Ｃｅ１ｌ　５４：　９５５−X６６に詳 細に記載されるように二つの菌種から精製した。この精製は、２Ｏ−３０−７０ ％のスクロースの段階的勾配で細胞質抽出物を分画することを含む。３Ｏ−Ｔｏ ％界面で見出された逆転写酵素（ＲＴ）の活性のピークをプールし、第二の１５ −５０％線型スクロース勾配にロードした。この勾配の各１２ｍ１のフラクショ ン３０個分を集め、ＲＴ活性（図４ａ及び４ｅ参照）、抗−ＴＹＡ免疫反応性（ 図４ｂ及び４ｆ参照）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ酵素活性（図４０及び４ｇ＃照 ）及びＳＮ酵素活性が検出された場合には、抗−ＳＮ免疫反応性（図４ｄ参照） について分析した。図４の左側の部分は、ＧＮ１７３株（ヌクレアーゼ含有実験 株）についての結果を含み、図４の右側の部分は、ＧＮ１７６株（対照株）につ いての結果を含む。Ｒ７分析は、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ、　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ 、Ｄ、　Ｂｏｅｋｅ　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆｉｎｋ、　（１９８５）ゴｙ　ｅｌｅ ｍｅｎｔ　ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔＬｏｎ：　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎ唐モ窒奄 垂■ ａｓｓ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ−１ｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、”　Ｃｅ１ｌ　 ４２：　５０７−５１７に記載されているように行った。ＳＮ酵素分析は、下記 のように行った＝２Ｐ１の各フラクションを、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化されたλ ＤＮＡ　０．５ｕｇを含む２０）＋１のＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ５０ｍＭ　ｐＨ７， ８，ＣａＣｌ２１０　ｍＭ溶液中、３０Ｃで３０分間インキュベートした。この 反応の生成物をその後、ｏ、８％のアガロースゲル上で電気泳動にかけた。ＴＹ Ａ及びＳＮタンパクに対する免疫反応性を、１２５Ｉ−タンパクＡを用いて、標 準イムノプロット分析により分析し、Ｔ。

ｗｂｉｎ、　Ｈ，、Ｔ、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｇｏｒｄｏｎ、 　（１９７９）　−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒ≠獅唐■■秩@。

ｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ　 ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ：　ｐ窒盾モ■р浮窒■ ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｊ、ｏｎ″　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：４３５０−４３５４にL載さ れたように、イムノフンブレックスを検出した。

この実験は、ＧＮ１７３から単離されたＶＬＰｓが、がなり高いヌクレアーゼ活 性を有し、ＧＮ１７６から単離された対照ＶＬＰｓが、完全にこの活性を欠くこ とを示す（図４ｃ及び４ｇを比較）。これらのＶＬＰｓのＳＮ活性は、天然のＳ Ｎの挙動から期待されるように、完全にカルシウムの添加に依存する（データは 示さない）。ヌクレアーゼ活性の存在及び勾配におけるその位置（フラクション １５−２０）は、図４ｄに示すように抗−３Ｎ免疫反応性材料と相関する。最後 に、二つのＶＬＰブレバレーシラン中のＲＴ活性の量及びＴＹＡタンパクの量は ほぼ同等で、ＴＹＡ−ＰＲ−３Ｎ融合タンパクと野性株のＴＹＡ及びＴＹＡ−Ｔ ＹＢとの融合が、これらのハイブリッドＶＬＰｓの特性をそれほど変えないこと に注意するのか重要である。この実験は、キャプシドタンパク−ヌクレアーゼ融 合タンパクを製造することが可能であること、及び野性株のキャプシドタンパク とコアセンプルしてハイブリッドウィルス粒子を生成することを示す。さらに、 これらの粒子に含まれるキャプシドタンパク−ヌクレアーゼ融合タンパクか、ｉ ｌ　ｖｉｔｒｏで酵素活性を有することを示す。

実施例２ キャプシドタンパク−ヌクレアーゼ融合タンパクによるＴの　のキャプシドタン パク−ヌクレアーゼ融合タンパクかｉｎ　ｖｉｖｏで野性株のＴｙｌの転位を抑 制できることを示すために、二つのタイプの融合を用いた。第二のものは、上記 のプラスミドｐＧＮ１３０６により行われるＴｙｌ−ＳＮ融合である。第二は、 ＴＹＩ素は、活性のためにカルシウムを要求しない。従って、カルシウム濃度の 低い細胞内の環境で活性及び毒性である。野性株のＢＮはＥ、ｃｏｌｉに対して 毒性であることが知られており、酵母に対しても毒性であると予想されているの で、ＢＮの野性株遺伝子とコドンが一つたけ異なる突然変異バージョンが出発物 質としてクローン化された。この突然変異体は、触媒能が著しく減少された（下 記参照）。

下記の構造のカセットを製造するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使 用した。ＢＮのＯＲＦに対するＰＣＦＩ用の５°側のオリゴヌクレオチドは、５ ′側からＥｃｏＲ１部位下流のＢＮ遺伝子とインフレームの終止コドン、ＢＮ遺 伝子をＴｙｌまたは他のエレメントと結合させるためのＸｈｏＩ及びＮｌｕｌ部 位、そして成熟ＢＮタンパクの第一コドンという構成をとった（図５参照）。終 止コドンは、ＢＮ遺伝子のあらゆる可能な発現を除くことを意図させた。ＢＮ　 ＯＲＦに対するＰＣＲ用の３゛側のオリゴヌクレオチドは、ＢＮ終止コドンのす ぐ３゛側にＸｂａ１部位を含ませた。最初の実験において、プラスミドｐＭＴ４ １６　（プラスミドｐＭＴ４１６の記載については、Ｈａｒｔｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ 、　（１９８８）　”Ｂａｒｎａｓｅ　ａｎｄ　ｂａｒｓｔａｒ：　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｃｌｏｎｅｄ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐ■窒高奄狽 刀@ｅｘ ｐｒｅｓｓｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｌｏｎｅｄ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ″Ｊ、　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２０２：　９１３−９１５を参照）■ にクローン化された野性株のＢＮを鋳型として用いた。ＰＣＲ生成物がＭ１３ベ クター（Ｍ１３ｍｐ１８）内にクローン化されて、ｐＧＮ１３３０が作製された が、殆どの回収された組み換え体ファージがＢＮコード領域（データは示さない ）内で突然変異を含んでおり、これは上流の終止コドンの存在及び適当な開始コ ドンの欠損にもかかわらず、無傷のＢＮ　ＯＲＦがこれらの条件では致命的であ ることを示唆した。同じＰＣＲ法を、ＢＮ　ＯＲＦ内にアミノ酸置換を含むプラ スミド（アラニンの代わりにリジン２７゜図５においてに２７Ａとして示される ）をテンプレートとして用いて行った（Ｍｏｓｓａｋｏｗｓｋａ、　Ｄ、Ｅ、、 に、Ｎｙｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ａ、Ｒ，Ｆｅｒｓｈｔ、　（１９８９）　”Ｋｉｎ ｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅ窒奄嘯≠狽奄盾■ ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｏｒ ａ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎ刀@（Ｂａｒｎａ ｓｅ）　ａｎｄ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｋｅｙ　ｒｅｓｉｄｕｅ ｓ　ｉｎ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　５ｉｔｅ−ｄｉｒｅモ狽■п@ｍｕｔａ ｇｅｎｅｓｉｓ”　ＢＬｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：　３８４３−３８５０） 。ＢＮ−に２７Ａの比活性は、野性型めＢＮの１３％であった。ＰＣＲ反応の生 成物をＭ］３ｍｐ１８にクローン化し、ｐＧＮ１３４４．２を得た。ｐＧＮ１３ ４４．２の挿入部分の塩基配列を決定したところ、予想されたアミノ酸配列のタ ンパクをコードすることがわかった。ＢＮ−に２７Ａ遺伝子は、ｐＧＮ１３０６ （ＳＮ）構築物におけるのと同じ位置（＋２６００）でＴｙ１配列に融合した。

従って、得られたプラスミドｐＧＮ１３５０．１８は、ｐＧＮ１３５０．１Ｂ内 では、ＳＮ遺伝子がＢＮ−に２７Ａ遺伝子に変えられていること以外は、図３に 記載したｐＧＮ１３０６に非常に似ていた。ｐＧＮ１３０６とは異なり、Ｔｙｌ の３°ＬＴＲは、ｐＧＮ１３５０．１８内には存在しない。このプラスミドの場 合、転写はＵＲＡ３遺伝子のターミネータ−内の下流で終了すると予想される。

ｐＧＮ１３５０．１８はｌ：、ｃｏｌｉには取り込まれたが、このプラスミドを 有する酵母形質転換体は、形質転換体混合物をグルコース含有培地にプレートし ても（即ちＧＡＬ　１プロモーターに対して強い抑制条件にあるとき）標準的な 形質転換方法では得られなかった。このことは、きわめて少量のＴＹＡ−ＰＲ− ＢＮ−に２７Ａ融合タンパクの発現でさえ、酵母細胞にとって十分致命的である ことを示唆する。Ｔｙ１転位を抑制するにはなお充分に活性で比較的非毒性の対 立遺伝子を同定するために、ＢＮ−に２７Ａ遺伝子のさらに別の突然変異体を作 製しスクリーニングしなければならないことが明らかになった。

１０マイクログラムのプラスミドｐＧＮ１３５０　、１８に、Ｒｏｓｅ、　Ｍ、 Ｄ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆｉｎｋ″ＫＡＲ１，ａ　ｇｅｎｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ 　ｆｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ＬｎｔｒａｎｕｃＬｅａｒ　ａ ｎｄ　ｅｘｔｒａｎ浮モkｅａｒ　ｍ １ｅｒｏｔｕｈｕｌｅｓ　ｉｎ　ｙｅａＳｊ″Ｃｅ１ｌ　４８：　１０４７−１ ０６１に記載されたように、ヒドロキシルアミンで突然変異を起こさせた。突然 変異Ｉまたプラスミドの混合物および同■ｔ；ものからは１５の形質転換体が回 収されたのに対し、対照の突然変異をしていないＤＮＡを用いたものからは一つ も得られなかった。突然変異をした１５の形質転換体のうち５つは、ガラクトー ス含有培地上で生育することができた。

これらの単離体のＴｙｌエレメントの転位に対する潜在的な抑制効果を記載する 前に、使用したＴｙ１転位分析法を記載する必要がある（図６参照）。これはＢ ｏｅｋｅ、　Ｊ、ｄ、　、　Ｈ，Ｘｕ　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，Ｆｉｎｋ、　−Ａ　ｇ ｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｌ！１ｏ唐盾高＝fｌ 　ａｍｐｌｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ”　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３９：２８０−２８２に記載された分析法と非常に似ている。出発株は酵母形 質転換体であって、制御されたＧａｌ　１プロモーター支配下にある転位可能な Ｔｙｌエレメントおよび酵母の選択マーカー（この場合はＨｉＳ遺伝子）を含む プラスミド、ｐＪＥＦ１６７８を有するものである。Ｔｙ１エレメント自体は、 大腸菌由来のｎｅｏ遺伝子で遺伝学的にマークされる。この遺伝子は、通常の酵 母細胞には毒性のネオマイシンの同族体である薬剤Ｇ４１８に対する耐性を与え る。ｐＪＥＦ１６７８を現す出発株の表現型は、従って、ＨｉｓゝＮｅｏ　’で ある。ＧＡＬＬプロモーター（図６中の斜線を入れた箱）は、ガラクトース含有 培地上で成長させることにより誘導される。Ｔｙｌ−ｎｅ旦−ｍＲＮＡは細胞質 に移され、翻訳される。Ｔｙ１タンパクは組み立てられ、Ｔｙｌ−ｎｅｏ　ＲＮ Ａをパッケージするウィルス様粒子を形成する。ＴＹＢ　ＯＲＦにコードされる 逆転写酵素は、Ｔｙ−ｎｅｏ　ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変える。最後に、やは りＴＹＢ　ＯＲＦにコードされるインテグラーゼが、新たに合成されたＴｙ−ｎ ｅｏ　ｃＤＮＡを宿主ゲノムに組み込まれる。そして、このプラスミドは、ヒス チジン含有培地上で菌を成長させることにより分泌される。数百の細胞がその後 栄養培転位頻度はｎｅｏ　’となったＨｉｓ−の総コロニーのフラクションとし て単純に現される。

転位抑制分析法は、上記転位分析法の変形である。図７に示すように、出発株は 、二つのプラスミドを有する。第一のプラスミドはｐｌＥＦ　１６７８であり、 ！マークされた転位可能なＧＡＬ−７ｙ１エレメントを含む。第二のプラスミド は、潜在的に抑制活性を有するヌクレアーゼ配列の一つに又はコントロールベク ターＤＮＡに融合したＧＡＬ−Ｔｙｌを含む。この二重に形質転換された菌に、 上記の転位誘導操作を行い、非選択的ＹＰＤ培地上で成長させることによりｐＪ ＥＦ１６７８プラスミドを分泌させる。この抑制配列を含む菌の転位頻度を調べ 、コントロールプラスミドを含むがヌクレアーゼ配列を結合していない菌の転位 頻度と比較する。その後、抑制レベルをこれらの二つの頻度の比として定めた。

表１ ＢＡＲＮＡＳＥ含有プラスミドによるＴｙｌの転写抑制ｎｅＯｒＨ１Ｓ−−プラ スミド　プラスミド　＼ＧＮ３２８　ｐＪＥＦ１６７８　ｐＧＮ１３５ｇ　（Ｔ ｙｌ−３ａｌ）　８５／３１９＝２７％ＧＮ１７３　ｐＪＥＦ１６７８　ｐＧＮ １３０６　（Ｔｙｌ−３Ｎ）　３１／９０＝３４％ＧＮ３３５　ｐＪＥＦ１６７ ８　ｐＧＮ１３０６　（Ｔｙｌ−ＢＮ）　１／１５０＝０．６６％ｐＧＮ１３８ １　（Ｔｙｌ−ＢＮ）によるｐＪＥＦ１６７８の転位抑制は、２７７０．６６＝ ４１倍である。ｐＧＮ１３０６（Ｔｙｌ−ＳＮ）は転位に抑制効果を示さなかっ た。

種々の潜在的抑制プラスミドの存在下でのｐＪＥＦ１６７８の転位頻度を分析し た。ｐｃＮ１３０６によるＴｙｌ−３Ｎ融合構築物、ｐＧＮ１３５０．１８の誘 導体によるヒドロキシルアミンで突然変異をされた５種のＴｙｌ−ＢＮ融合構築 物、およびＢＮ又はＳＮ配列を欠失し、ＴＹ配列を２１７３位のＳａｌ　１部位 まで含むこと以外はｐＧＮ１３０６の構造と同様のコントロール構築物について 試験を行った。第１表に示すように、転位頻度は、Ｔｙｌ−ＳＮ融合構築物によ り抑制されなかった。ガラクトース上で成長した五つのｈ　７ｙｌ　−３Ｎ融合 構築物のうち、四つが転位に効果を有しながった（表１にはデータを示していな い）。しかしながら、突然変異させた７ｙ１−ＢＮ構築物の一つであるｐＧＮ　 １３８１は、非常に著しい転位抑制効果を示した。ｐＧＮ１３８１は、ｐＪＥＦ １６７８の転位頻度を約４０倍減少した。

いくつかの実験は、ｐＧＮ１３８１に含まれる突然変異Ｂａｒｎａｓｅ遺伝子融 合物が、転位を抑制するという結論を支持した。第一に、菌ＧＮ３３５における 転位の抑制は、下記のようにｐＧＮ１３８１によることが示された。ｐＧＮ１３ ８１を欠＜　ＧＮ３３５の誘導体を単離した。この誘導体におけるｐＪＥＦ１６ ７８の転位頻度は、野性型のレベルに戻る。

第二に、ｐＧＮ１３８１に含まれるＢａｒｎａｓｅ挿入部分を単離し、非突然変 異プラスミド骨格に再クローン化し、このプラスミドにｐＧＮ１３８１と同じ抑 制性を与えた。最後に、元来ｐＧＮ１３５０．１８に含まれているＢＮ−に２７ Ａ対立遺伝子が、ヒドロキシルアミン突然変異操作の間に第二の突然変異を獲得 した。ｐＧＮ１３８１に含まれるＢＮセグメントの全ＤＮＡ配列か決定された。

一つのヌクレオチドが置換されているこ呂がわがった。この突然変異は、予想さ れたように、ヒドロキシルアミン突然変異誘発後にＣからＴへ塩基か転位したも のであった。この突然変異はコドン８９を変化させ（ＣＴＴからＴＴＴ）、ロイ シンをフェニルアラニンに置換する結果となる。これにより、抑制キャブシドタ ンパクーヌクレアーゼ融合タンパクはＴＹＡ−ＰＲ−ＢＮ−に２７Ａ、　Ｌ８９ Ｆ融合タンパクとして完全に記載され得る。

結論とし、て、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　及びｉｎ　ｖｉｖｏ実験の両方から、ヌク１ ノアーゼのような破壊酵素か酵素的に活性な形態でキャプシドタンパクに融合さ れ得ることが示された。該融合物は、野性型ウィルスタンパクと共にウィルスに 組み込まれ、同種の（コグネート）ウィルスの複製能を抑制することができる。

実施例３ 回Σ蚤束１２乙土各肚ＬΩ迎對 １（ＩＶはＡＩＤＳの原因である。ＨＴＬＶ−１はヒトの疾患に関連する別のヒ トレトロウィルスであり、例えば成人Ｔ細胞白血病を引き起こす。近年、ＨＩＶ に関連するが、明らかにこれとは区別される新しいレトロウィルスである、ヒト ＴＡＰが、自己免疫疾患であるソグレンンンドローム（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ　ｓ ｙｎｄｒｏｍｅ）（Ｒ，Ｆ、　Ｇａｒｒｙ　ｅｔ　ａｔ、。

１９９０５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０１１２７−１１２９参照）の可能な原因であ ることが示唆された。

キャプシド標的ウィルス不活性化（ＣＴＶＩ）を、重要なヒト感染源ＨＩＶの複 製の抑制のために使用する。ＨＩＶのキャプシドタンパク遺伝子」弘）をクロー ン化（。

、塩基配列を決定したところ、下流の四り及びｅｎｖ遺伝子を有した。図８に示 すように、ＳＮ及び突然変異体ＢＮ遺伝子を、フレーム内で匹辷に融合し、プラ スミドｐＨＩＶ−ＢＮ及びｐＨＩＶ−ＢＮを生じさせる（ジャンクション配列は 、ＨＩＶ−ＳＮについてのみ図８に示す、　ＨＩＶ−ＢＮプラスミドは同じジャ ンクションを有する）。これらのプラスミドをＨＩＶに感染しやすいヒト組織培 養細胞、例えばＨＴ４−６Ｃ細胞に、選択マーカーとして二遺伝子を用いて導入 する。これらのプラスミドによるｉｎ　Ｖｆｔｒ９−でのＨＩＶ複製の抑制を、 Ｔｒｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）の方法を用いて調べた。復製抑制ｐＨ ＩＶ−ＳＮ又ハｐＨＩＶ−ＢＮ構築物（トランスジエン）ハ、ＡＩＤＳ患者（７ ）ＨＩＶ　ｇ受性細胞に導入される。

実施例４ トリ　病ウィルス（ＡＬＶ）　ｏη朋糾トリ白血病ウィルス（ＡＬＶ）は、家禽 に感染Ｉ−３養鶏産業に著しい経済的問題を起こしている。ＣＴＶＩは、ＡＬＶ に耐性の鳥の品種を開発するために使用される。

ＡＬＶのキャプシドタンパク遺伝子（コ烈をクローン化し、塩基配列を決定した ところ、下流の匹辷及びｅｎｖ遺伝子を有した。図９に示すように、ＳＮ及び突 然変異体ＢＮ遺伝子を、フレーム内で１２９Ｌに融合し、プラスミドｐＡＬＶ− ＳＮ及びｐＡＬＶ−ＢＮを生じさせる（ジャンクション配列は、ＡＬＶ−３Ｎ融 合体についてのみに示す：　ＡＬＶ−ＢＮプラスミドは同様のジャンクションを 有する）。これらのプラスミドをうずら又は鶏の細胞に、選択マーカーとしてｎ ｅｏ遺伝子を用いて導入する。トランスジエンタントは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの ＡＬＶ複製の抑制を調べるために分析された。

抑制プラスミドを、鶏のゲノムに下記の方法により挿入する。第一に、鶏の細胞 内で活性のプロモーター及びＡＬＶ　ｇａｇ／ｐｏｌ／ＳＮ　（又はＢＮ）コー ド領域からなる発現カセットを、複製可能なトリレトロウィルスベクター（ＡＬ Ｖ以外）に挿入する。このＤＮＡを、鶏の細胞にトランスフェクトすると、組み 換え体レトロウィルス粒子が形成される。組み換え体レトロウィルスを、５ａｌ ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　６５：　１４５５− １４５８．５ａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５７ ：　２３６−２４０及び５ａｌ狽■■ ＆　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄｅｎ　１９８９　Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　？７：　４５７−４６１にL載さ れているように、雌の鶏の卵内に注入する。育ったキメラ鶏を交配し、それらの 子孫を、ＡＬＶ　ｇａｇ／ｐｏｌ／ＳＮ　（又はＢＮ）カセットＤＮＡが生殖細 胞系列に挿入されたが否かを調べるためにゲノムＤＮＡプロッティングによりス クリーニングした。トランスジェニック動物が、抗ＡＬＶ　ｇａｇ抗血清又は適 当な抗ヌクレアーゼ抗血清を用いて、ｐＡＬＶ融合タンパクの発現についてスク リーニングされた。

（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ　に関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ （ｉｖ）アンチセンス・Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物芯＋　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ（ｘｉ） 配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣ ＴＡ　ＡＣＴＣＡＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＡＣＡ　Ｇ　４１（２）ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２　に関する情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝５３５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列・Ｎ （ｉｖ）アンチセンス　Ｎ （ｖｉ）起源・ （Ａ）生物芯：　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ。

（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ｒｏ　ＮＯ：２ＡＣＣＡＡＴＧＡＣＡ　ＴＴＣＡ ＧＡＣＴＡＴ　ＴＡＴＴＧＧＴＴＧＡ　ＴＡＣＡＣＣＴＧＡＡ　ＡＣＡＡＡＧＣ ＡＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＧf　１８０ 丁ＧＴＡＧＡＧＡＡＡ　ＴＡＴＧＧＴＣＣＴＧ　ＡＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴ ＡＣＧＡＡＡ　ＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧ　ＡＡＡＡＴＧＣＡＡ`　２４０ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３　に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎮 （Ｄ）トポロジー　１１１！ＪＬ状 （Ｌｉ）配列の種類　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列・Ｙ （ｉｖ）アンチセンス　Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物芯：　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ（ｘｉ） 配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＣ ＡＣＧＣＧＴＣＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ　ＣＣＡＡＣＡ　４６（２）Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４　に関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア９１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー°直鎮状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列、Ｎ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物芯：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ｘ ｉ）配列の記載ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５　に関す る情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・４２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （０鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列・Ｎ （ｉｖ）アンチセンス　Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ（ｘｉ） 配列の記載：ＳＥＱ　ｉＤ　ＮＯ：５：ＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣ ＴＡ　ＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡ　ＣＧＣＧＴＣＧＣＡＣＡＧ　４２（２）ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：６　に関する情報゛（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ°３９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列　Ｙ （ｉｖ）アンチセンス、Ｎ （ｖｉ）起源 （Ａ）生物基：ヒト　免疫不全ウィルス　タイプ１（ｘｉ）配列の記載ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：６：ＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡ　ＴＣＣＡＡＣＡ ＧＴＡ　ＴＡＴＡＧＴＧＣＡ　３９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア　に関する情 報゛（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ、４２塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列　Ｙ （ｉｖ）アンチセンス　Ｎ （ｖｉ）起源 （Ａ）生物名　Ａｖｉａｎ　Ｌｅｕｋｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ（ｘｉ）配列の記載 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：ＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＴ　ＴＧＡ ＴＣＣＡＡＣＡ　ＧＴＡＴＡＴＡＧＴＧ　ＣＡ　４２ＦＩＧ、　４ｂ １　３　５　７　９　Ｉ＋　１３１５１７　１９２１２３２５２７２９ＦＩＧ、 　４ｅ ○　１０　２０　３０ フラクシヨン ＦＩＧ、４ｆ １　３　５　７　９　１１１３１５１７１９　２１　２３　２５　２了　２９・ ・働・ ＦＩＧ、　４ｇ 手続補正書 平成　６年令月ｌ？議

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルス又はウイルス様粒子のキャプシド又はエンベロープタンパク質；及 び前記ウイルス又はウイルス様粒子の複製能を破壊できる酵素、からなる融合タ ンパク質。
2. ２．ウイルス又はウイルス様粒子が外来タンパク質をパッケージするのに充分な 内部水性コンパートメントを含む請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
3. ３．ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、トガ ウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａｄｎａ）ウイルス、カウリモ（ｃａｕｌｉｍｏ） ウイルス、ミクソウイルス及びパラミクソウイルスからなる群から選択される請 求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
4. ４．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲第３項記載の融合タンパク質。
5. ５．ウイルス様粒子がＴＹ粒子である請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
6. ６．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
7. ７．酵素がプロテアーゼである請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
8. ８．酵素がリパーゼである請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
9. ９．酵素の活性がカルシウム依存性である請求の範囲第１項記載の融合タンパク 質。
10. １０．酵素がブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）である請求の範囲第９項記載の融 合タンパク質。
11. １１．ヌクレアーゼが、バチルスアミロリクェファシェンスのＲＮＡｓｅ（バル ナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ））である請求の範囲第６項記載の融合タンパク質。
12. １２．ウイルス又はウイルス様粒子のキヤプシド又はエンベロープタンパク質； 及び、前記ウイルス又はウイルス様粒子の複製能を破壊できる酵素、からなる融 合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
13. １３．ウイルス又はウイルス様粒子が外来タンパク質をパッケージするのに充分 な内部水性コンパートメントを含む請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
14. １４．ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ト ガウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａｄｎａ）ウイルス、カウリモ（ｃａｕｌｉｍｏ ）ウイルス、ミクソウイルス及びパラミクソウイルスからなる群から選択される 請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ分子。
15. １５．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ分子。
16. １６．ウイルス様粒子がＴＹ粒子である請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
17. １７．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
18. １８．酵素がプロテアーゼである請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
19. １９．酵素がリパーゼである請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。
20. ２０．酵素の活性がカルシウム依存性である請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分 子。
21. ２１．酵素がブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）である請求の範囲第２０項記載の ＤＮＡ分子。
22. ２２．ヌクレアーゼが、バチルスアミロリクェファシェンスのＲＮＡｓｅ（バル ナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ））である請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ分子。
23. ２３．ウイルス又はウイルス様粒子のキャプシド又はエンベロープタンパク質； 及び、前記ウイルス又はウイルス様粒子の複製能を破壊できる酵素からなる、融 合タンパク質をコードする核酸分子を含む組み換え体ウイルス又はウイルス様粒 子。
24. ２４．ウイルス又はウイルス様粒子が外来タンパク質をパッケージするのに充分 な内部水性コンパートメントを含む請求の範囲第２３項記載の組み換え体ウイル ス又はウイルス様粒子。
25. ２５．ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ト ガウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａｄｎａ）ウイルス、カウリモ（ｃａｕｌｉｍｏ ）ウイルス、ミクソウイルス及びパラミクソウイルスからなる群から選択される 請求の範囲第２４項記載の組み換え体ウイルス。
26. ２６．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲第２５項記載の組み換え体ウ イルス。
27. ２７．ウイルス様粒子がＴＹ粒子である請求の範囲第２４項記載の組み換え体ウ イルス様粒子。
28. ２８．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲第２３項記載の組み換え体ウイルス 又はウイルス様粒子。
29. ２９．酵素がプロテアーゼである請求の範囲第２３項記載の組み換え体ウイルス 又はウイルス様粒子。
30. ３０．酵素がリパーゼである請求の範囲第２３項記載の組み換え体ウイルス又は ウイルス様粒子。
31. ３１．酵素の活性がカルシウム依存性である請求の範囲第２３項記載の組み換え 体ウイルス又はウイルス様粒子。
32. ３２．酵素がブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）である請求の範囲第３１項記載の 組み換え体ウイルス又はウイルス様粒子。
33. ３３．ヌクレアーゼが、バチルスアミロリクエファシエンスのＲＮＡｓｅ（バル ナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ））である請求の範囲第２８項記載の組み換え体ウィル ス又はウィルス様粒子。
34. ３４．ウイルス又はウイルス様の粒子のキャプシド又はエンベロープタンパク質 および前記ウイルス又はウイルス様の粒子の複製能力を破壊することができる酵 素からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ウイルスに感染しやすい 細胞に導入することからなる、ウイルスの複製又は感染又はレトロトランスポゾ ン転位を抑制する方法。
35. ３５．ウイルス又はウイルス様粒子が外来タンパク質をパッケージするのに充分 な内部水性コンパートメントを含む請求の範囲第３４項記載の方法。
36. ３６．ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ト ガウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａｄｎａ）ウイルス、カウリモ（ｃａｕｌｉｍｏ ）ウイルス、ミクソウイルス及びパラミクソウイルスからなる群から選択される 請求の範囲第３５項記載の方法。
37. ３７．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲第３６項記載の方法。
38. ３８．ウイルス様粒子がＴＹ粒子である請求の範囲第３４項記載の方法。
39. ３９．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲第３４項記載の方法。
40. ４０．酵素がプロテアーゼである請求の範囲第３４項記載の方法。
41. ４１．酵素がリパーゼである請求の範囲第３４項記載の方法。
42. ４２．酵素の活性がカルシウム依存性である請求の範囲第３４項記載の方法。
43. ４３．酵素がブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）である請求の範囲第４２項記載の 方法。
44. ４４．ヌクレアーゼが、バチルスアミロリクェファシェンスのＲＮＡｓｅ（バル ナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ））である請求の範囲第３９項記載の方法。
45. ４５．ウイルスのキャプシド又はエンベロープタンパク質及び前記ウイルスの複 製能力を破壊することができる酵素からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ 分子を、ウイルス感染に感受性の動物の生殖細胞または胚へ導入することからな る、ウイルス耐性動物の製造方法。
46. ４６．ウイルス又はウイルス様粒子が外来タンパク質をパッケージするのに充分 な内部水性コンパートメントを含む請求の範囲第４５項記載の方法。
47. ４７．ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ト ガウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａｄｎａ）ウイルス、カウリモ（ｃａｕｌｉｍｏ ）ウイルス、ミクソウイルス及びパラミクソウイルスからなる群から選択される 請求の範囲第４６項記載の方法。
48. ４８．ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲第４７項記載の方法。
49. ４９．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲第４４項記載の方法。
50. ５０．酵素がプロテアーゼである請求の範囲第４４項記載の方法。
51. ５１．酵素がリパーゼである請求の範囲第４４項記載の方法。
52. ５２．酵素の活性がカルシウム依存性である請求の範囲第４４項記載の方法。
53. ５３．酵素がブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮ）である請求の範囲第５２項記載の 方法。
54. ５４．ヌクレアーゼが、バチルスアミロリクェファシェンスのＲＮＡｓｅ（バル ナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ））である請求の範囲第４９項記載の方法。