JPH06507307A

JPH06507307A - トランスジェニック動物の乳腺組織における活性ヒトプロテインｃの発現

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Publication number: JPH06507307A
Application number: JP4504437A
Authority: JP
Inventors: ドローハン，ウイリアム・エヌ; ウイルキンス，トレイシー・デイー; ベランダー，ウイリアム・エイチ; ジヨンソン，ジヨン・エル
Original assignee: アメリカン・レツド・クロス; バージニア、テック・インテレクチャル、プロパティーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-01-11
Filing date: 1992-01-07
Publication date: 1994-08-25
Also published as: AU1228592A; EP0591219A4; EP0591219A1; EP0591219B1; CA2099562C; DE69232310T2; ATE211177T1; US5589604A; DE69232310D1; CA2099562A1; WO1992011757A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック動物の乳膜組織における活性ヒトプロテインＣの発現本発明は天然及び修飾形のヒト凝固因子プロティンＣの製造に係る。特に本発明は、そのゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれ、プロティンＣが動物により生成される乳汁中に分泌されるように乳腺組織中に特異的に発現される外因性遺伝子を含むトランスジェニック動物に係る。

発明の背景プロティンＣは強力な抗凝固活性を有する凝固系の重要な成分である。プロティンＣはその活性形においてＶａ及びＶＩＩＩａ因子をタンパク分解により不活化するセリンプロテアーゼである。

ヒトプロティンＣ（ｈＰＣ）は２５ｋＤのＬ鎖（また番よ軽鎖）と４１ｋＤのＨ！［（または重鎮）とから構成され、血漿中で不活性チモーゲンとして循環する６２ｋＤジスルフィド結合へテロダイマーである。ヒトプロティンＣは内皮細胞表面においてトロンボモジュリンの存在下で限定トロンビンタンパク分解により活性化され、活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）となる、Ｈ鎖のアミノ末端部分でＡｒｇ−Ｌｅｕ結合が開裂すると１２個のアミノ酸ベブチドカｆ遊離する、一般にＧａｒｄｉｎｅｒ　＆　ＧｒｉｆｆｉｎｉＦＰＲＯＧＲＥＳＳ　ＩＮ　ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ、　Ｖｏｌ。

Ｘｌｌ１．　２６５−２７８頁（Ｂｒｏｗｎ、Ｇｒｕｎｅ及び５ｔｒａｔｔｏｎ、　Ｉｎｃ、１９８３）を参照されたい。

分子の数個の領域は止血の調節において抗凝固剤として機能する上で重要な意味を有する。Ｌ鎖のアミノ末端部分は、カルシウム依存性膜結合及び機能的活性化に必要な９個のγ−カルボキシグルタミンｒａ（Ｇｌａ）残基を含む。

別の翻訳後修飾は、Ｇｌａ領域の結合活性から独立したカルシウム依存性膜結合に必要であり得るアスパラギン酸残基７１のβ−ヒドロキシル化である。

プロティンＣが有益であるとされる臨床状況には種々のものがある。プロティンＣは新生児電撃性紫斑病に罹患したホモ接合不全乳児で置換療法として使用することができる。プロティンＣは血漿インヒビタータンパク質からｔｐＡを保護することができるので、付加的なワルファリン療法が必要なワルファリン誘発皮膚壊死、ヘパリン誘発血小板減少症、敗血症性ショックの病歴を有する患者を血管向凝固及び器官損傷から予防するためや、繊維素溶解療法に適応させるためにも使用できる０表１は精製プロティンＣにより処置可能な数種の臨床症状の個々の症例数の概算である。最近まで臨床試験用血漿がら十分な材料を入手できていないので、これらのデータは必然的にプロティンＣの治療力価の不完全な評価に基づく。

艮１ヒトプロティンＣをコードする遺伝子はウシプロティンＣ遺伝子と同様にクローニング及び配列決定されている。

Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８２：　４６７３　（１９８５）−米国特許第４７７５６２４号参照、ヒトプロティンＣをコードする遺伝子は不活性前駆物質として合成され、分泌及び活性化過程中に数回タンパク分解を受ける。まず最初に分泌時にタンパク分解によりシグナル配列が除去される。第２のタンパク分解によりジペプチドＩｙｓ１５６　ａｒｇ１５７が除去され、１５５アミノ酸のし鎖と２６２アミノ酸のＨ，ＩＩとから構成される２鎖ジスルフイド架橋タンパク質である不活性チモーゲンが得られる。チモーゲンは最終タンパク分解により活性化され、残基１５８−１６９を除去し、強力な抗凝固活性を有するセリンプロテアーゼである活性なプロティンＣを生じる。Ｂｅｃｋｍａｎｎ　ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：　５２３３　（１９８５）。

タンパク分解プロセシング以外に、ヒトプロティンＣは数種の翻訳後修飾を受ける。恐らくこれらの修飾のうちの最も馴著なものはビタミンに依存性酵素によるプロティンＣ中の最初の９個のグルタミン酸のγ−カルボキシル化である。ＤｉＳｃｉｐｉｏ　＆　Ｄａｖｉｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ３／　１８：　８９９（１９７９，）、γ−カルボキシル化は抗凝固活性に必要であり、Ｃａ”依存性膜結合に関連付けられる。プロティンＣの抗凝固活性はγ−カルボキシル化の程度に応じて直接的に変化し、最高レベルの活性は６番目及び７番目のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化が行われるときのみ達せられる。Ｚｈａｎｇ＆　Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：　１０８２９　（１９９０）。

プロティンＣは更にアスパラギン酸７１のβ−ヒドロキシル化により翻訳後修飾される。Ｄｒａｋｅｎｂｅｒｇら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０　：１８０２　（１９８３）、β−ヒドロキシル化はプロティンＣ活性に重要であり得る。その機能は解明されていないが、γ−カルボキシグルタミン酸非依存性Ｃａ２″結合に関与するらしいこと、及び完全な抗凝固活性に必要とされるらしいことなどが示唆されている。

ヒトプロティンＣは更にグリコジル化される。Ｋ１５ｉｅｌ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６４：　７６１（１９７９）、ヒトプロティンＣはＡｓｎ９７．Ａｓｎ２４８゜Ａｓｎ３１３及びＡｓｎ３２９に位置する４つの潜在的Ｎ結合グリコジル化部位を含む、最初の３（１１のシグナルはコンセンサスＡｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒグリコジル化配列に匹敵し、積極的にグリコジル化される。Ａｓｎ３２９には非典型的なグリコジル化シグナルＡｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒが存在する。Ａｓｎ３２９シグナルはウシプロティンＣ中ではグリコジル化されるが、Ａｓｎ３２９がヒトプロティンＣ中でグリコジル化されるか否かは未だ解明されていない、Ｍｉ　１ｅｔｉｃｈら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５：　１１３９７　（１９９０）、グリコジル化のパターン及び程度はプロティンＣの生理学的活性を変化させ得る。

最近まで実験及び治療用のヒトプロティンＣは専らヒト血漿から採取されてた。

しかしながら、ヒト血清から入手可能なタンパク質の量は限られている。更に、ヒト血清に由来する生成物は信頼性、純度及び安全性に問題がある。

組換えＤＮＡ技術による治療用タンパク質の発現は、血液起源のウィルスによる潜在的汚染の危険がなく、理論的に無制限の生成物を提供できるという点で、プロティンＣの血漿生成に代わる魅力的な方法である。しかしながら、上述のように翻訳後修飾が複雑であるため、異種宿主における発現により商業的に使用可能な量の十分に活性なプロティンＣを製造するには問題があった。

実際に１種々の発現系を使用して努力されているにも拘わらず、プロティンＣのようなビタミンに依存性タンパク質を活性形で十分に高いレベルで製造することは従来不可能であった。Ｇｒｉｎｎｅｌｌら著ＡＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　５ＥＲＩＥＳ、第１１巻、第３章（Ｇｕｌｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）参照、特に、トランスジェニック動物の乳腺でプロティンＣを発現させ、該タンパク質を乳汁中に分泌させるという口論み（例えば米国特許第４８７３３′　１６号（１９８９＞参照）は、プロティンＣが通常肝臓で合成されるという事実により妨げられている。ヒト肝臓に由来するＨｅ　ｐＧ２細胞系でさえも異常型のプロティンＣを産生ずる。Ｍａｒｌａｒ　＆　Ｆａｉｒ（１９８５）１）照。

この点に関連して、ヒトタンパク質ＣをコードするｃＤＮＡを担持するウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクターでトランスフェクトしたマウス乳腺上皮細胞系（Ｃ−１２７）が発現するプロティンＣは３０〜４ｏ％しが活性でないことが判明した。更に分析した結果、プロティンＣのγ−カルボキシグルタミン酸含有率は低く、β−ヒドロキシアスパラギン酸を含有するとしてもほんの僅がであることが判明した。５ｕｔｔｉｅら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、４４　：　１２９　（１９８６）、これらの実験は、マウス乳腺上皮細胞が十分に活性なプロティンＣを得るために必要な全翻訳後修飾を実施できないことを示しており、トランスジェニック哺乳動物の乳汁がらこのようなプロティンＣを得る可能性は疑わしい。

１１］ｌ在従って、本発明の目的は従来達せられているよりも著しく高い百分率の活性なタンパク質を含有する組換えプロティンｃｔ乳汁中に生成するトランスジェニック動物を提供することである。

本発明の別の目的は、トランスジェニック動物を介して商業的に使用可能な量のプロティンＣを製造するための方法を提供することである。

上記目的を達成する際に、本発明の１特徴によると、そのゲノム中に安定的に組み込まれた外因性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック哺乳動物が提供され、該外因性ＤＮＡ配列はプロティンＣ活性を有するポリペプチドとシグナルペプチドとをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合したプロモーターを含み、プロモーターは乳腺細胞、特に乳腺上皮細胞中で特異的に活性であり、シグナルペプチドはトランスジェニック哺乳動物の乳汁中にプロティンＣを分泌するのに有効である。好適態様によると、プロモーターは乳漿酸性タンパク質プロモーターである。

本発明の別の特徴によると、プロティンＣの製造方法が提供され、該方法は、（Ａ）プロティンＣ活性を有するポリペプチドとトランスジェニック哺乳動物の乳汁にプロティンＣを分泌するのに有効なシグナルペプチドとをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合しており、且つ、乳腺細胞中で特異的に活性であるプロモーターを含み、そのゲノムに安定的に組み込まれた外来ＤＮＡ配列により特徴付けられるトランスジェニック哺乳動物を提供する段階と、（Ｂ）トランスジェニック哺乳動物がら乳汁を生成する段階と、（Ｃ）乳汁を収集する段階と、（Ｄ）乳汁がらポリペプチドを単離する段階とを含む、好適ｎ様によると、トランスジェニック哺乳動物はマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ又はヤギである。

本発明の更に別の特徴によると、トランスジェニック動物の作出方法が提供され、該方法は、（Ａ）遺伝子構築物を含む混合物を提供する段階と、（Ｂ）混合物をアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーにがけ、精製遺伝子構染物を得る段階と、その後、（Ｃ）精製遺伝子構築物を含有する水性Ｍ衝溶液を動物胚にマイクロインジェクトする段階とを含む、好適態様によると、段ＦＭ　（Ｂ　）は、混合物をアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーカラムに載置する工程と、遺伝子構築物をカラムから溶離する工程と、次いで遺伝子構築物を第２のアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーにかける工程とを含む。

本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明に明示される。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は本発明の好適態様を示すものではあるが、単なる例示であり、当業者はこの詳細な説明から本発明の趣旨及び範囲内で種々の変形に想到し得るものと理解すべきである。

図面の簡単な説明図１は無傷のマウス乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ＞遺伝子の単一のＫＬＬ１部位に挿入されたヒトプロティンＣをコードするｃＤＮＡを含む構築物であるＷＡＰｐＣＩを示す概略図である。

図２はトランスジェニック動物中でＷＡＰ−プロティンＣＤＮＡを検出するために有用なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対を示す。

図３はトランスジェニックマウスから得た乳汁中のヒトプロティンＣの酵素抗体法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）の結果を示すグラフである。

図４はトランスジェニックマウスがら得た乳漿中のヒトプロティンＣ抗凝固活性を測定するためのＡＰＴＴアッセイの結果を示すグラフである。

（２１５は、トランスジェニックマウスＹ５２がらの乳漿中のヒトプロティンＣ中のγ−カルボキシグルタミン酸がヒト血清に由来するプロティンＣ中のγ−カルボキシグルタミン酸に想似することを立証するＣａ”依存性及びＣａ”非依存性り鎖（または軽鎖）捕獲ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明形質転換入膜細胞を含む数種の異なる発現系で十分に高い活性を有する組換えプロティンＣを発現させすることは従来不可能であったが、本発明のＤＮＡを組み込んだトランスジェニック動物の乳汁中では高い百分率の活性タンパク質により特徴付けられる組換えプロティンＣが得られることが知見された０本発明のトランスジェニック動物は、ＤＮＡが成熟動物の生殖系細胞のＤＮＡ中に安定的に組み込まれ、正常なメンデルの法則に従って遺伝するように、プロティンＣをコードするＤＮＡを発生中の胚に導入することにより作出される。

本発明によると、トランスジェニック動物を作出するために種々の手段によりＤＮＡを胚に導入することができる。

例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウィルス感染又は他の手段により分化全能性又は分化可能性幹細胞を形質転換することができる。形質転換細胞を次に胚に導入し、胚に組み込んでトランスジェニック動物を形成する。好適方法によると、発生中の胚にレトロウィルスベクターを感染させ、感染した胚からトランスジェニック動物を形成することができる。しかしながら、最適方法によると、本発明のＤＮＡを好ましくは単細胞段階で胚に注入し、成熟トランスジェニック動物まで生長させる。

こうしてトランスジェニック動物を作出するために使用される適切なプロティンＣをコードするＤＮＡは、ｈＰＣ遺伝子をクローニングするためのソースとしてヒト肝組織を使用することにより得られる。プロティンＣをコードするＤＮＡを追って詳述するように適正な読み枠内て適切な調節シグナルと融合させ、遺伝子構築物を生成し、その後、例えば従来方法に従って細菌ベクター中で増殖させることにより増幅する。

増幅した構築物を次いで、ベクターから切り出し、マイクロインジェクションで使用するために精製する８精製は好ましくは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われ、細菌ベクター及び〈従来のアガロース電気溶離のような他の方法を使用する場合に典型的に存在する）多糖からの汚染を構築物から除去する。好適なＨＰＬＣ法によると、構築物をアニオン交換ＨＰＬＣ支持体に吸着させ、好ましくは塩化ナトリウム水溶液で構築物を支持体から選択的に溶離させ、ベクターからの汚染を除去する。（溶離はＰＨ勾配のような他の手段により実施してもよい、）あまり好ましくはないが、別の方法として、水性スクロース勾配を介して超遠心分離により精製してもよい。

構築物は不純物含有量が最少であることが好ましいので、ＨＰＬＣ又は他の精製を２サイクル以上行うと有利である。

特に、上述のようにＨＰＬＣＭ製ＤＮＡｅマイクロインジェクションに使用すると、マウス及びブタの両方で２０％のオーダー又はそれ以上の著しく高い形質転換頻度に達することができる。

全乳汁分泌動物即ち全哺乳動物は本発明での使用に適している。好適哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びウシを挙げることができる。より特定的には、マウス、ブタ、ヒツジ及びウシが好適である。

現在では、マウス、ブタ及びヒツジが最適である。

本発明で有用なりＮＡｉ築物染物プロティンＣの乳腺組織特異的発現、プロティンＣの翻訳後修飾、乳汁中へのプロティンＣの分泌及びプロティンＣの完全な生物学的活性に必要な全ｃｉｓ作用シグナルに作動的に結合したプロティンＣをコードするＤＮＡ配列を提供する。

本発明で有用なりＮＡは、天然に存在するプロティンＣをコードするゲノム又は相補的ＤＮＡを含む、好適態様によると、ヒトプロティンＣをコードするＤＮＡが使用され、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む、う・ｙト、ブタ、ヒツジ、ウシ及びチンパンジーによりコードされるプロティンＣのような他の種からのプロティンＣをコードするＤＮＡも使用できる。

本発明では修飾プロティンＣ配列も使用できる。この関連で有用な修飾の非限定的な例は、プロティンＣの翻訳後プロセシングを改変する修飾、プロティンＣのサイズを改変する修飾、プロティンＣもしくはその一部を別のタンパク質の一部に融合する修飾、又はプロティンＣの活性部位を改変する修飾などである。好適修飾は、活性化プロティンＣを提供する修飾及びトロンボモジュリンの不在下でプロティンＣを活性化させる修飾を含む、好適態様によると、ヒトプロティンＣの修飾形が使用される。

このような修飾は当業者に周知の方法によりプロティンＣに導入することができ、例えば重複オリゴヌクレオチドの連結により、及び特にオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発などの方法でクローン化遺伝子に突然変異を直接導入することにより、修飾遺伝子を合成する０本発明で有用なｃｉｓ作用調節領域は、プロティンＣ遺伝子を発現させるために使用されるプロモーターを含む１本発明で有用なプロモーターは乳腺組織中で活性である。特に有用なプロモーターは、乳腺組織中で特異的に活性なプロモーター、即ち乳汁が合成される生理的条件下で他の組織よりも乳腺組織において活性度の高いプロモーターである。乳腺組織に特異的であり且つ乳腺組織中で有効なプロモーターが最適である。「有効」なる用語は、プロモーターが乳腺組織中で強力なプロモーターであり、乳汁中に分泌するために大量のタンパク質の合成を補助し得ることを意味する。

このようなプロモーターとしては、カゼイン、ラクトアルブミン及びラクトグロブリンプロモーターが好適であり、非限定的な例としては、α−カゼインプロモーター、β−カゼインプロモーター、γ−カゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター及びβ−ラクトグロブリンプロモーターが挙げられる。プロモーターとしては誓歯動物（マウス及びラット）、ブタ及びヒツジに由来するプロモーター、特にラットβ−カゼインプロモーター及びヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーターが好適である。最適なプロモーターは乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）遺伝子を調節するプロモーターであり、最適なＷＡＰプロモーターはマウスＷＡＰプロモーターである。

トランスジェニック動物の乳汁中にタンパク質を分泌させるシグナル配列も本発明に重要である。この点では、内在性及び異種シグナル配列の両方とも本発明では有用である。一般に、乳汁中に正常に分泌されるタンパク質のシグナルペプチドが本発明で有用である。乳汁中に高濃度で存在するタンパク質のシグナル配列が特に好適であり、例えば、カゼイン、ラクトアルブミン及びラクトグロブリンのシグナルペプチド、非限定的な具体例としてはα−カゼイン、β−カゼイン、 γ−カゼイン、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが挙げられる。

より特定的には、乳漿酸性タンパク質のシグナル配列が好適であり、特にマウス乳漿酸性タンパク質のシグナル配列が好適である。

分泌凝固因子のシグナルペプチドも特に好適である。この点ではプロティンＣ及びｔＰＡのシグナルペプチドが特に好適である。ヒトプロティンＣの分泌シグナルが最適である。

本発明で有用な転写調節配列としては、上記プロモーター配列以外に、特にエンハンサ−、スプライスシグナル、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位が挙げられる。

特に有用な調節配列はトランスジェニック動物においてプロティンＣの乳腺細胞特異的発現の効率を増加させる。

この点では乳腺細胞中に高レベルで発現される遺伝子の他の転写調節配列が特に好適であり、例えば上記α−カゼイン遺伝子、β−カゼイン遺伝子、γ−カゼイン遺伝子、α−ラクトアルブミン遺伝子及びβ−ラクトグロブリン遺伝子が挙げられる。この点で調節配列の好適源は誓歯動物（マウス及びラット）、ブタ及びヒツジである。好適調節配列の例は、ラットβ−カゼイン遺伝子及びヒツジβ− ラクトグロブリン遺伝子に夫々関連する配列である１本発明で使用するために最適な調節配列は、乳漿酸性タンパク質遺伝子に関連する配列である。この関連ではマウス乳漿酸性タンパク質が特に好適である。

翻訳を調節する配列としては、上記シグナル配列以外に、プロティンＣｍＲＮＡに安定性を増加するリポソーム結合部位及び配列が挙げられる。乳腺細胞中で高レベルで発現される遺伝子の翻訳調節配列が特に有用である６例えば、特に替歯動物（マウス及びラット）、ブタ及びヒツジに由来するα−カゼイン遺伝子、β −カゼイン遺伝子、γ−力ゼイン遺伝子、α−ラクトアルブミン遺伝子及びβ− ラクトグロブリン遺伝子の調節配列が好適である。ラットβ−カゼイン及びヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の調節配列がより好適である０本発明の最適な翻訳調節配列は乳漿酸性タンパク質及びプロティンＣ遺伝子の調節配列である。

特に最適な調節配列は、マウス乳漿酸性タンパク質及びヒトプロティンＣ（ヒトゲノムプロティンＣ及びヒトプロティンＣｃＤＮＡ楕築物構築物にイントロン配列を含むヒトプロティンＣｃＤＮＡｉｌ染物を含む）である。

本発明のトランスジェニック動物で産生されるプロティンＣが活性であるようにプロティンＣの翻訳後修飾を有利に調節する配列が本発明では特に有用である。

特に、ヒトプロティンＣ遺伝子のゲノム配列が好適である。従って、本発明によると、プロティンＣをコードするＤＮＡ配列は乳汁中でプロティンＣを有効に発現させるｃｉｓ作用調節配列に作動的に結合している。得られるキメラＤＮＡは哺乳動物胚に導入され、胚ゲノムに組み込まれ、胚から生長する成体の全細胞（生殖系細胞を含む）の遺伝可能な遺伝子賦与物の一部となる。乳腺組織中に発現され、こうして得られるトランスジェニック嘲乳動物の乳汁中に分泌されるプロティンＣは、プロティンＣ活性を検出するために従来使用されている酵素及び凝固阻害アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、色素産生活性アッセイ及び凝固阻害アッセイ）により測定した場合に驚くほど高い百分率の活性タンパク質を示す、８０％〜９０％のオーダー又はそれ以上の活性タンパク質のレベルは、本発明に従って発現されるプロティンＣの特徴を表す。

本発明の範囲内でトランスジェニック動物がら乳汁を得るには従来手段を使用できる。ＭｃＢｕｒｎｅｙら、　Ｊ。

Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、６４：　４８５（１９６４）。

このような乳汁に含まれるプロティンＣは活性に悪影響を与えることなく既知手段により精製することができる。この点で１つの適切な精製アプローチは免疫親和性クロマトグラフィーである。あるいは他の従来手段、例えばＫ１５ｉｅｌ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６４：　７６１（１９７９）の方法により、発現されたプロティンＣを乳汁から単離することができる。いずれにせよ、本発明に従って乳汁中に産生されたプロティンＣは、タンパク質の安定性に及ぼす有害な効果を軽減するように、乳汁をトランスジェニック晴乳動物から採取直後に単離することが好ましい。

以下、例示的実施例により本発明を更に説明する。

ＬＬＬＬ）ランスジェニック動物でプロティンＣを発現するために有用なりＮＡ。

５′非翻訳配列及び３°非翻訳領域の２．５ｋｂを含む完全マウスＷＡＰ遺伝子はり、Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎから入手した。Ｃａｍｐｂｅ　Ｉ　Ｉら、ＮｕｃｌｅｔｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１２：　８６８５（１９８４）参照、ヒトプロティンＣをコードするヒト胎盤ｃＤＮＡはＣ１ＳｈｏｅＣ１５ｈｏｅから入手した。

標準組換ＤＮＡｔ！Ｌ術を使用して好３ｉ！！ｒｓ様のベクター及び発現構築物を生成すると共に、後述するようにＤＮＡの他の操作を行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第１−３巻（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）参照。

（１）菫ＬＬＬ二二単−のＫＪＬＬ１部位に挿入されたヒトプロティンＣｃＤＮＡの１つのコピー、ＷＡＰＩＩ伝子の転写開始部位の３′の２４塩基対を含む完全マウスＷＡＰ遺伝子から構成されるＤＮＡ構築物染物ＰＰＣＩを作成した（図１）、その後の操作を容易にするためにこのＷＡＰ−プロティンＣ構築物をブルースクライプベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。

（２）ＷＡＰ　Ｃ２ＷＡＰＰＣ２はＷＡＰｐＣｌに類似しており、完全マウスＷＡＰ遺伝子及びヒトプロティンＣｃＤＮＡがら構成されるが、ＷＡＰｐＣｌとは異なり、該構築物を形成するために使用されるクローニング手順の結果としてＷＡＰｐＣ１に存在する人工的な５°フランキング配列を欠失する。

特に、プロティンＣＡＴＧの５゛の３３ｂｐ及びプロティンＣｃＤＮＡの３°末端の１１８ＡはＰＣＲにより除去され、５′及び３”末端には新しいＫＬＸＬＩ部位が付加された。

！ＥＪＪＬＩ　マイクロインジェクションのためのＤＮＡの調製ＷＡＰＰＣＩからのＤＮＡについて以下に述べる手順に従ってマイクロインジェクション用ＤＮＡを調製した。

制限酵素Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩを用いてベクターから９ｋｂ　ＷＡＰＰＣ１フラグメントを取り出した。ＥｃｏＲｒで消化後、ＷＡＰｐＣＩ　ＤＮＡを含有する溶液を１０ｍＭマグネシウム、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ及びｏ、ｉ％ＳＤＳに加えた後、フェノール／クロロホルムで抽出した。０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下に一２０℃で一晩、２．５容量のエタノールでＤＮＡを水層から沈殿させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗い、乾燥し、滅菌蒸留水に再懸濁させた。

マイクロインジェクション用ＤＮＡをＨＰＬＣにより精製した。消化したＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させた後、ＴＥｇｇ液に０．３μｇ／ｒｒｌの割合で溶解させた。

Ｗａｔｅｒｓ　ＧＥＮ　ＦＡＸ　ＰＡＣＨＰＬＣカラムを使用してＨＰＬＣによりフラグメントを精製した。２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　１ｍＭナトリウムＥＤＴＡ及び０．６３Ｍ　ＮａＣ＋から構成される緩衝液を使用してカラムを均質に走査した。これは大きい構築物フラグメントを溶出する最小ＮａＣＩ濃度であり、構築物フラグメントの直前に溶出する小さいベクターフラグメントから最良に分離することができる。消化したＤＮＡ約１５μｇを一度にカラムに充填した０次に全クロマトグラフィー実験からの構築物フラグメントサンプルをプールし、再沈殿させ、再びカラムに通して走査した。ＨＰＬＣ精製ＤＮＡを使用してブタ及びマウスで以下に報告する結果を得た。

ＤＮＡ濃度は臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡのアリコートの蛍光強度を標準の強度と比較することにより、アガロースゲル電気泳動により測定した０次にサンプルを１０μｇ　／　ｍ　ｌに調整し、マイクロインジェクションまで一２０℃ で保存した。

！）ランスジェニック動物（１）マウス主にＨｏｇａｎら、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８６）に記載されているようにトランスジェニック動物を作出した。使用した手順を以下に要約する。

マイクロピペットブラー及びマイクロフオージを使用してマイクロインジェクション用ガラス針を作成した。注入は、Ｈｏｆｆｍａｎ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒａｓｔレンズを有するＮ１ｋｏｎｌｉ微鏡を、Ｎａｒａｓｈｉｇｉマイクロマニピュレータ及びＮ２により駆動されるピコインジェクター（Ｎａｒａｓｈｉｇｉ）と併用して行った。

過剰排卵した雌ＣＤ−１マウスの卵管から受精したマウス胚を外科的に取り出し、Ｍ２培地に入れた。小丘細胞を３００μｇ、／ｍｌのヒアルロニダーゼで胚から取り出した。

次に胚を新しいＭ２培地で濯ぎ、Ｍ１６培地に移し、注入まで３７℃で保存した。

ＤＮＡ溶液を雄性前核に注入後、精管切除した雄と交配することにより偽妊娠させたＣＤ−ルシピエント雌にアベルチン麻酔し、胚を移植した。胚を満産期まで維持し、後述するようにトランス遺伝子の存在について新生マウスを分析した。

（２）′ＬＬ胚を卵管から回収する。約０．５ｍｌの胚移入用培地（リンＷｉ１ｆ衝食塩溶液＋１０％ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を収容する１、５ｍｌ容マイクロ遠心管に入れる。

次にマイクロ遠心機（ＡＩｌｉｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、モデル２３５Ｃ）で１２分間１６０００Ｘｇ　ＲＣＦ　（１３４５０ＲＰＭ）で遠心分離する。

細く焼き引き及び研磨したパスツールピペットで胚をマイクロ遠心管から取り出し、試験のために３５ｍｍベトリ皿に入れる１ｍ胞質が依然として脂質により不透明で前核が目に見えない場合には、胚を再び１５分間遠心分離する。マイクロインジェクトすべき胚を１００ｍｍペトリ皿の蓋の中心の培地の微量液滴（約１００μｌ）に入れる。シリコーン油を使用して微量液滴を覆い、培地が蒸発しないように蓋を覆う、胚を含むペトリ皿の蓋を、加熱処理した台及びＨｏｆｆｍａｎ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒａｓｔレンズ（２００×最終倍率）を備える反転票微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ＞に載せる。ＤＮＡ構築物約２００〜５００コピーを含むＨＰ　Ｌ　Ｃ精製ＤＮＡ溶液約１〜２ピコリツトルを別の微細引抜きマイクロとベットで雄性前核に放出しながら、微細引抜き（Ｋｏｐｆ　Ｖｅｒｔｉｃａｌ　Ｐｉｐｅｔｔｅ　Ｐｕ１ｌｅｒ、モデル７２０）及び研磨（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅマイクロフォージ、モデルＭＦ−３５）マイクロピペットを使用して胚を安定化させる。形態的観察により判断されるようにマイクロインジェクションプロセス後に生存している胚をポリプロとシンチューブ（２ｍｍＩＤ）に充填し、レシピエンドブタに移す。

（３）虹へ１１他の動物種のマイクロインジェクション法は上記方法と同様である。

ｍｔ−ランスジェニック動物におけるＷＡＰ／ｈＰＣ構築物のＰＣＨによる評価（１）トーンスジェニ・・　）のＤＮＡの・６以下にマウスについて例示する方法により任意の種のトランスジェニック動物の組織からＤＮＡをＸｌｌ製することができる。

離乳期（３週齢）の潜在的にトランスジェニックの子マウスからマウス尾の５ｍｍ片を切り取り、細断し、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳで３７℃で一晩処理した０次に混合物をＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼと共に３７℃で１〜２時間インキュベートした。ＤＮＡを酢酸ナトリウム及びエタノールで混合物がら−２０” Ｃで一晩沈殿させ、遠心分離により収集し、７０％エタノールで洗い、乾燥した。乾燥したＤＮＡベレットを直接ＰＣＲに使用した。場合により、混合物をエタノール沈殿前にフェノール／クロロホルムで更に抽出した。

オリゴヌクレオチド対を使用してポリメラーゼ連鎖反応を開始し、トランスジェニック動物中のＷＡＰ−プロティンＣ構築物の存在を検出した。これらの対及びその伸長産物を図２に示す。反ＬＬＩ部位の５゛のＷＡＰ配列がらの領域とＫ」ト」−Ｉ部位の３°に天然に存在する内在ＷＡＰ配列とを架橋するオリゴヌクレオチド対はマウスにおける陽性対照を提供した。

（３）ＰＣＲアニール温度５８℃、変性温度９４℃及び伸長温度７２℃を使用し、反応あたりオリゴプライマー１００ｎｇ及び（ゲノム）鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを使用し、自動温度サイクラ−（Ｍ、Ｊ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を使用して４０回の前記温度サイクルを繰り返すことによりＰＣＲ反応を実施しな。

アガロースゲル上で反応産物の２０％を走査し、マーカーＤＮＡフラグメントとの比較によりフラグメントサイズを同定することにより、ＰＣＲ反応物を分析した。

（４）　−ンスジ　ニ・・　ＰＣＲのＷＡＰｐＣｌ及びＷＡＰｐＣ２楕築物をマイクロインジェクトした胚から生長した潜在的にトランスジェニックなマウス及びブタのＰＣＲ分析を表２に要約する。結果から明らかなように、ＷＡＰｐＣ構築物はマウス及びブタの両方の胚ゲノムに高頻度で組み込まれている。更に、試験した１６匹のマウスのうち５匹ではメンデルの伝達が観察された。

宍」しｍ　トランスジェニック動物からの乳汁及び乳漿の調製（Ａ）マウス：　乳汁分泌マウスから週平均３回搾乳した。

マウスをまず最初に約５時間子から離した０次に２．５％アベルチン０．４ｍｌで麻酔（１，Ｍ、）Ｌ、その後、オクトシン０．２ｍｌを２．５ＩＵ／ｍｌの割合で投与（Ｉ。

Ｐ、）し、乳汁を放出させた。真空ポンプ（２，５ｐｓｉ）及びエツペンドルフチップ付き注射器から構成される装置取中、全サンプルが得られるまで乳汁を氷上においた。

乳漿を調製するために、乳汁をＴＳ緩衝液（０．０３ＭＴｒｉｓ　ｐＨ７．４；　０．０６ＮａＣＩ）　で　１　二　１に希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＴＬ−１００テーブルトップ超遠心分離機中のＴＬＡ−１００ロータで５１０００ｒｐｍ　（８９０００Ｘｇ）で３０分間４℃で遠心分離した。遠心分離後、チューブを氷上に置き、カゼインベレット及びクリーム状上層をチューブ中に残して乳漿を１８ゲージ針で集めた。最初の回収中に同時に移動した固体又はクリームを除去するために、最初の遠心分離から得られた乳漿をＴｏｍｙ　ＭＴＸ−１５０遠心機中のＴＭＡ−４０−ターで１２０００ｒｐｍで３０分間４℃で第２回目の回転にかけた。第２の回転後、チューブを氷上に置き、乳漿を上述のように回収した。

及Ｉｌ［トランスジェニック補乳動物により産生されるプロティンＣのＥＬＩＳＡ定量トランスジェニック動物により乳汁又は乳漿中に産生されたプロティンＣタンパク質の量をＥＬＩＳＡにより測定した。２種のモノクローナル抗体７Ｄ７Ｂ１０及び１２Ａ８と１種のポリクローナル抗血清とをＥＬＩＳＡで使用し、種々の他のプロティンＣ特異的抗体を使用することができた。７Ｄ７Ｂ１０モノクローナルはプロティンＣのＬ鎖のＮＨ２末端に対して特異的である。１２Ａ８はプロティンＣのＨ鏡上の反応性部位に対して特異的である。マイクロタイタープレートウェルを、ｐＨ８，３のＯ，ＬＭ重炭酸ナトリウム緩衝液５０μｍ中３μｓ／ｍｌのモノクローナル抗体で４℃で一晩被覆した。ウェルをＴＥＴ緩衝液（０゜０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５；　０．ＯＩＭ　ＥＤＴＡ；　０．０２％　Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７，４５）で１回洗った後、ウェル当たり４００μｍのＰＢＳ中１％ＢＳＡで１時間３７℃でブロックした。プレートを再びＴＥＴ［漬液（５ ×）で洗った後、サンプル乳漿又は血漿由来ヒトプレートでスパイクした正常乳漿１００μｌを加え、標準曲線を作成した。ＴＥＴ緩衝液で５回洗浄後、ウサギ抗ｈＰＣに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．１％ＢＳＡ／ＴＥＴでｌ　：　１０００に希釈し、ウェル当たり１００μｌを加え、１１００ｒｐで振盪しながら２時間室温でインキュベートした。再びＴＥＴ［漬液で５回洗浄後、０１１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，Ｏ）２０ｍｌにオルトフェニルジアミン（ＯＰＤ）タブレット１個を溶解させることにより調製したストック溶液がらのＯＰＤ　１００μｌを各ウェルに加えた。室温で１ｏ分後、ＩＮ硫酸で反応を停止した。４９０ｎｍで生成物吸収を測定することにより反応の程度を決定した。

１匹のトランスジェニックマウス（マウス番号５）からの乳汁のＥＬＩＳＡ分析の結果を図３に示す、固定化７Ｄ７Ｂ１０抗体で免疫親和性クロマトグラフィーにより得られたヒトプロティンＣを標準として、モノクローナル抗体１２ＡＢ及びウサギポリクローナル抗体の標準曲線を得た。

トランスジェニックマウス番号５から採取した乳汁サンプルは約２００ｎｇ／ｍ＋のプロティンＣを含有していた。

２種の異なるモノクローナル抗体及び１種のポリクローナル抗体混合物による免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）に基づく適正なプロティンＣ構造を確保するために、数種の異なるトランスジェニックマウスのサンプルをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした１表２Ａは、３種の異なる免疫捕獲及びＥＬＩＳＡによる検出に基づくほぼ等価の抗原レベルを示す、ＷＡＰｐＣｌのマイクロインジェクションにより作出されたマウスの大半は１〜４μｇ　／　ｍ　＋の範囲の抗原レベルを産生じた。

轟１２（トランスジェニックマウスから得られた乳漿及び乳汁中のヒトプロティンＣの濃度を同様にこうして決定し、等価の結果を得た。

同様のアッセイを定期的に行い、トランスジェニック動物から得た乳汁中のプロティンＣをアッセイした１表３はＬ鎖捕獲ＥＬＩＳＡで７Ｄ７Ｂ　１０抗体を使用して得られた結果を表３にまとめたものであり、最初の４回の乳汁分泌期間の間にトランスジェニックマウスがら得られた乳汁中のプロティンＣの濃度を要約した。−は試験を実施しなかったことを示す、全動物は乳汁中に相当のレベルのプロティンＣを提供した。予備結果は更に、第２の乳汁分泌期間が場合により他の試験期間よりも長いことを示している。

註　ｈＰＣＥＬＩＳ＾スクリーニング（Ｌ鎖捕獲）他の種から得た乳汁中のヒトプロティンＣも同一の方法により測定することができる。ちなみに、ブタ乳汁にスノ（イクしたヒト血漿からのプロティンＣを上記ＥＬＩＳＡを介して正確に検出した。

！　色素産生基質Ｓ−２３６６を使用するプロティンＣアミド分解活性アッセイＯｄｅｇａａｒｄら、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　１７：　１０９　（１９８９＞に主に記載されているような色素産生アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）を使用してトランスジェニック動物の乳汁中のプロティンＣの酵素活性を直接測定した。このアッセイでは、マイクロタイタープレートウェルをｐＨ８，６のＯ，１Ｍ重炭酸緩衝液５０μｍ中７Ｄ７Ｂ１０モノクローナル抗体（５０Ｍｇ／ｍ　＋　）で４℃で一晩被覆した。その後、プレートをＴＥＴ［漬液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ；　０．０３Ｍ、ＥＤＴＡ：　０．０５％　ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　−２０）で濯ぎ、ＰＨ３中　・１％ＢＳＡ　４００μｍ／ウェルでブロックし、室温で１〜１．５時間インキュベートした。ＴＥＴＭ衝液で漬液濯いだ後、各ウェル当たり乳漿サンプル５０μｌ及び０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，０，０３Ｍ　ＥＤＴＡ５０μｌを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＴＥＴ［漬液で３回洗った。へび毒酵素（バイアル当たり蒸留水１２ｍ１）を含有する市販試薬であるＰｒｏｔａＣ（登録商標）１２０μｍ、ＴＳＰｉｆ衝液及び漬液１％ＢＳＡ、ＰＨ７，５３０μｌを各ウェルに加えることにより、捕獲したヒトプロティンＣを活性化した。Ｎ温で６〜１０分間インキュベーション後、Ｓ−２３６６（Ｋａｂ　ｉ基質）１２０μｍを２５ｍｇ／１０．８ｍｌ　Ｔｒｉｓｐ８７．８の割合で各ウェルに加え、プレートを室温で２〜８時間、又は４℃で数日間インキュベートした。４０５ｍｍの吸収により反応生成物の形成を測定することにより、各サンプル中のプロティンＣ活性の量を決定した。

表４は、１匹のトランスジェニックマウスからの乳汁及び乳漿と、数匹のトランスジェニックマウスの乳汁及び乳漿のプールとを使用して得た結果を示すものであり、サンプル中のプロティンＣの量及び比活性を示す、サンプルは第１の乳汁分泌期間Ｌ１の間に得たか、又は第２及び第３の乳汁分泌期間Ｌ２及びＬ３から得たものであることに留意されたい、これらのアッセイで決定したトランスジエニ・ンクマウスから得たヒトプロティンＣの比活性２０５単位（Ｕ）／ｍｇは、天然源から得た頭似純度のヒトプロティンＣに類似している。（１「単位」は多数の個体からの血液をプールし、プールした血液１ｍｌ中の活性を測定することにより決定される。）宍」工！Ｌ！Ｌｆｉｌ　活性化部分的トロンボプラスチン凝固時間アッセイによるトランスジェニック補乳動物で産生されるプロティンＣの測定更に凝固時間アッセイとして活性化部分的トロンボプラスチン凝固時間アッセイ（ＡＰＴＴ）でプロティンＣの活性を測定した。このアッセイではプラスチックＣｏａｇ−ａ−ｍａｔｅ）レーの各ウェルにｐｃ欠失血漿９０μｌ及びＴｒｉｓ／食塩水／ＢＳＡで希釈した標準又は未知ＡＰＣＩＯμｌを加えた０次にトレーを自動アナライザ（ＡＰＴＴモード、２４０秒活性化）上に置いた。運転を開始し、ＡＰＴＴ試薬１００μｌ及び０　、０２５　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２１００μｌの添加を自動的に行った。標準ＡＰＣ調製物を使用して得たデータを式ｙ−ａｘ＋ｂ（式中、ｙ＝凝固時間及びｘ　＝　Ａ　Ｐ　Ｃ）にあてはめた後、サンプル中のＡＰＣの量を決定するために使用した。

トランスジェニックマウスからプールした乳漿のＡＰＴＴアッセイの結果を図４に示す０図面中の標準曲線はＡＰＴＴアッセイにより決定した活性をマウス乳汁又はマウス乳漿中の活性ヒトプロティンＣの量に相関している。トランスジェニックマウスから得た乳漿サンプルのＡＰＴＴアッセイにおける活性は、乳漿中のヒトプロティンＣの標準曲線から補間される約０．５７μｇ　／　ｍ　ｌの濃度に対応した。

同一の乳漿サンプルのＥＬＩＳＡ（図示せず）はタン）＜り質として約０．６０Ｍｇ　／　ｍ　ＩのヒトプロティンＣを検出した。即ちこれらのアッセイの正規誤差範囲内において、トランスジェニックマウスから産生されたヒトプロティンＣは対照ヒトプロティンＣと同程度に活性である。

！　金属依存性免疫親和性によるカルシウム依存性コンホーマーのマツピング２５ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下でｈｐｃ又はＧｌａ領域をもたないｈＰＣの濃度を変化させながら、正常マウス乳汁乳漿で標準ＥＬＩＳＡを実施した。７Ｄ７Ｂ１０による捕獲後、２５ｍＭ　ＥＤＴＡで実施したアッセイ複製物（ａｓｓａｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）を２５ｍＭ　ＣａＣｌ２の数回洗浄で処理した後、上述のＥＬＩＳＡ検出プロトコルを実施した。Ｇｌａなしのタンパク質はＣａＣ１゜の存在下で捕獲抗体に結合し続けたが、ＰＣ標準は添加したＣ　ａ　Ｃｌ　ｘの存在下で結合し続けなかった。トランスジェニックマウスＹ５７からの乳漿は γカルボキシル化天然ＰＣと同様に挙動することが観察され、従って天然分子と同様にγ−カルボキシル化されたと予想された。

！）ランスジェニック動物の乳汁からのヒトプロティンＣの精製（１）　ンプルの− 数匹のＷＡＰｐＣ１トランスジェニックマウス系からの乳汁をプールし、氷冷し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１ｐ８７．２　（ＴＢＳ）（１ｍｌ乳汁１５ｍ１　ＴＢＳ）で６倍に希釈し、１２５０００Ｘｇで３０分間４℃で遠心分離した。遠心分離後、乳漿を藁め、脂肪性上層又はカゼインベレットを撹乱しないように注意しながらパスツールピペットを使用してプールした。

その後のアッセイのためにサンプルをプールから取り出し、サンプルとプールした乳漿との両方を一９０℃で凍結保存した。サンプル中のヒトプロティンＣを上述のようにＥＬＩＳＡにより定量した。

個々の乳漿プールを２℃で融解して結合し、結合したプール中のヒトプロティンＣ（ｈＰＣ）の量を７Ｄ７Ｂ　１０モノクローナル抗体（Ｍａｂ＞を使用するＥＬＩＳＡにより決定した。結合したプールはこのアッセイによると約３０μｇのｈＰＣを含有しており、これは、個々のプールの定量値を加算することにより決定した合計の２０％以内であった。

結合したプール約１５０ｍ１を、純水で５倍に希釈した２５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＴＢＳで透析（１４０００ＭＷカットオフ）した、透析した乳漿を凍結乾燥による５倍に濃縮した後、ナノ純水（ｎａｎｏｐｕｒｅ　ｗａｔｅｒ）で再構成し、ＴＢＳ中２５ｍＭ　ＥＤＴＡに等価の最終緩衝液濃度及び５倍のタンパク質濃度増加を得た。濃縮乳漿は２８０ｎｍの光学吸収により換算した処、１６ｍｇ／ｍｌの割合で９３０ｍｇのタンパク質を含有していた。

（２）　ロマ　−フ　− トランスジェニックマウスの乳漿中のヒトプロティンＣを精製するために使用した樹脂イムノソルベント（Ａｆｆｉｐｒｅｐ、登録商標）はＡｆｆｉｐｒｅｐ樹脂ｍ１当たり３．３ｍｇの７Ｄ７Ｂ１０　Ｍａｂを含有していた。対＠（非トランスジェニック）マウス乳漿にドープした血漿由来ｈＰｃ３０μｇを使用するモック免疫精製により７Ｄ７Ｂ１０　ＡｆｆｉｐｒｅｐＨ脂を評価した。はぼ同一の相対量の合計タンパク質をカラムに充填しく１０ｍＬ　Ａｆｆｉｐｒｅｐに６６０ｍｇ＞、以下に記載するように処理した。

新たに濃縮した乳漿（２８０ｎｍでの光学吸収により測定した場合に１６ｍｇ／ｍ１．９３０ｍｇ合計タンパク質）を、キャリヤータンパク質を加えることなく、２℃で４時間３．３ｍｇ　７Ｄ７Ｂ１０　Ｍａｂ／ｍｌ樹脂を含有する７Ｄ７Ｂ１０　Ａｆｆｉｐｒｅｐ　１３ｍ１にバッチ充填した。カラムは新しく、高い合計（バックグラウンド）タンパク質充填はカラムを条件付けるために十分であると思われた８次に樹脂を直径１ｃｍのカラムに充填し、基線量の光学密度（０，Ｄ、）が２８０ｎｍで検出される（く０．０００５　０．Ｄ、を得るためには３カラム容量）まで２５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＴＢＳで洗った。

次にカラムをＰＨ７，２のＴＢＳ中２５ｍＭ　ＣａＣｌ２、次いでＴＢＳ中１００ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、４Ｍ　ＮａＣ１，２Ｍ　チオシアン酸Ｎａにより０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶離した。カラムを５カラム容量の２５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＴＢＳ、０．０２％ナトリウムアジドで再平衡化した。

１４０００ＭＷカットオフ透析チューブを使用して全ピークプールを５０ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ　ＮａＣ１緩衝液の１００倍希釈液（ナノ純水）で透析した後、凍結乾燥し、（ナノ純水を使用して）５０ｍＭイミダゾ−１し、０．１ＮａＣ＋緩衝液濃緩衝液槽成し、１００倍濃炭槽タンパク質を得た。

これらの溶出液プール濃縮物のサンプルをＬａｅｍｍｌｉ　（１９７０）の方法により調製し、７．５ｃｍ、７，５％分離（３０％：　２．７％ビス）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上の１５ウエル、９ｃｍＸ２ｃｍ、４％スタッキングゲルに加え、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた、を気泳動後、ゲルを１．２５％クーマシーブルー染料溶液で染色した。

ＷＡＰｐＣｌ−）ランスジェニックマウスからの乳漿の免疫精製から得た溶出液ピークの面積は対照マウスからの（血漿由来＞ｈｐｃドープ乳漿の等量を使用したモツク試験に非常に類似していることが判明した。ＷＡＰＰＣＩ）ランスジェニックからの１００倍濃縮２５ｍ、Ｍ　ＣａＣｌ２溶出液のアッセイは、クーマシーブルーで染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーに基づき４０％収率を示した（収率はモック精製については決定しなかった）、モツク及びＷＡＰｐＣｌ−乳漿からの合計ピーク面積は２Ｍチオシアン酸Ｎａビークを含む全溶出液ピークでほぼ同一であった。ＥＤＴＡ−ＴＢＳ洗浄物と結合しておいたカラム降下物中には約２μｇのｈｐｃ抗原（７Ｄ７Ｂ１０　Ｍａｂｔ使用する免疫捕獲によるＥＬ　Ｉ　ＳＡ）が検出された。

２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液プール中には約１４μｇのｈｐｃ、１００ｍＭ　Ｃａ” 溶出液プール中には０．１．ｃｚｇ未満のｈＰＣ抗原が検出されたが、４Ｍ　ＮａＣｌプール中にｈＰＣ抗原は検出されず、２Ｍ　チオシアン酸Ｎａ溶出液プール中には約１０μｇのｈＰＣが検出された。即ち、カラムに加えたｈＰＣ抗原の８７％がカラム流出液から回収した合計抗原中で検出された。２５ｍＭ　Ｃａ” 溶出液ピーク中で回収されたｈＰＣ抗原に基づいて４７％の抗原収率が得られた。

カラムに加えた出発乳漿、２Ｍチオシアン酸ナトリウム溶出液、２５ｍＭ　Ｃａ２゛溶出液産物及び米国赤十字社による血漿由来参照ｈＰＣ（Ｌｏｔ　＃２８３００２７７、Ｃａｒｏｌｙｎ　０ｒｔｈｎｅｒ博士により提供）を還元及び非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。２Ｍチオシアン酸ナトリウム及び２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液プールを上述のように濃縮し、各レーンにつき抗原４μｇをゲルに加えた。免疫精製ｈｐｃ参照を２８０ｎｍのＯ，Ｄ、に基づく合計タンパク質４μｇとしてゲルに加えた。この参照ｈＰＣの走査デンシトメトリーによると、サンプルは非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で純度９９％以上、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で純度７１％であることが判明した０次いでｈＰＣ讐照材料上で抗原アッセイを実施した処、参照サンプルを２．７μｇしかゲルに加えなかったようなサンプルの濃度を示した。２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液産物は非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥによると純度９４％以上、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥによると純度８６％である。２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液レーンの染色強度は４μｇ抗原適用のための先の実験に一致する。参照ｈＰＣに対応するバンドは２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液に対して弱い強度を有していた。約６２０００相対分子量（Ｍｒ）の１かに分裂したバンドが非還元参照ｈＰＣ及び２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液の両方に観察される。約４００ＱＱＭｒのダブレット及び２２０００Ｍｒの拡散した単一バンドが還元参照ｈＰＣ及び２５ｍＭ　Ｃａ”°溶出液の両方で観察される。ｈｐｃ参照中に現れる２　２０００　Ｍ　ｒ　ｉ＜ンドはトランスジェニックマウスの乳漿からの２５ｍＭＣａ” 溶出液中に現れる類似のバンドよりもやや拡散性又は不均質である。チオシアン酸ナトリウムピーク；よ、ＪＰ還元サンプルでは１８００００Ｍｒ過剰のノ〈ンド、還元サンフルテは５００００Ｍｒ及び２５０００Ｍｚ７）多重バンドを示した。

ＷＡＰｐＣｌ−乳漿のクロマトグラフィーは、対照乳漿にドープした血漿由来ｈＰＣを使用するモック試験にほぼ同一であった。どちらの試験でも２５ｍＭ　Ｃａ”溶出液中のｈＰＣの合計面積及び収率と２Ｍチオシアン酸ナトリウムと−クの面積と類似しており、従って、トランスジェニックｈＰＣ又は血漿由来ｈＰＣへの７Ｄ７Ｂ１０　Ｍａｂの結合特性は類似していた。乳漿から免疫捕獲するために７Ｄ７Ｂ１０　Ｍａｂを使用するＥＬＩＳＡアッセイにより判断した処、これは血漿由来及びトランスジェニックｈＰＣＣａ２°依存性コンホーマーの間に見いだされる類似性に一致する。５ＤＳ−ＰＡＧＥにより判断される一次構造は類似しており、α形及びβ形ＨＭの量は血漿由来及びトランスジェニックｈＰＣでほぼ同一であった。トランスジェニックは６８％α形及び３２％β形を有しており、血漿由来材料は６９％α形及び３１％β形を有していた。

Ｌ鎖も参照及びトランスジェニックｈＰＣで類似の寸法であった。ｈｐｃのクーマシーブルー染色を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥによる先の実験は、ゲルに加えた２〜５μｇのｈＰＣの範囲にわたって両方の鎖で線形性を示した。従って、翻訳後タンパク分解プロセシングの成分の多くは乳腺組織中で正しく発生したと考えられる。

これらの試験の純度は更に、マウス系に開発された免疫精製法の満足な有用性を立証した。トランスジェニックマウスからの乳漿の２Ｍチオシアン酸ピーク中でＥＬＩＳＡにより検出されたｈＰＣ抗原の強い結合（モック試験ではアッセイせず）は新鮮なイムノソルベントに見いだされる収率に特徴的であり、異常ｈＰｃｉｌｌ造によるものではないと考えられる０合計バックグラウンドタンパク質は、カラムを条件付けるとは思われず、従って、相互作用は７Ｄ７ＢＩＯＭａｂに特異的であると考えられる。全般に、この２段階法の結果、マウス乳漿から回収されるｈＰＣに２７０００の最小精製係数がえられる。大規模精製法ではマウス乳汁に使用した超遠心分離段階の代わりに低速遠心分離に結び付けられるクエン酸又はＥＤＴＡ沈殿を使用することができる。

アミド分解及び抗凝固剤アッセイの両方をトランスジェニックマウスからの免疫精製乳汁で実施した。これらのアッセイの感度内で、アミド分解及び抗凝固活性は血漿由来免疫精製プロティンＣと同一であった。どちらの型のアッセイでも比活性は２７０　Ｕ　／　ｍ　ｇ以上であった。

ＷＡＰ−ＰｒＯＣフ）づ文−大中ＷＡＰ　ジし〒づンＣＷＡＰＫｐｎｌ　Ｋｐｎｌプラづマー江　フラ外ネ長ａ−ｃ　４４１ｂ−ｃ　３２４ｂ　−ｄ　５６３ａ−ｅ（（へ）参゛に）　２２２４セ９”プ曳４マー大ｔ１８ｓｒＲＮＡ　３３７図　４０．００．２０．４０．６０．８１．０　＋、２１．４１．６　＋、８２．０２．２１．１ｇ　ＰＣ／ｍ１図　５ｈＰＣ：ＲＲｄａ−ｇｉａ　ＰＣ（ｐｇ／ｍｌ）補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年７月１２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．そのゲノムに安定的に組み込まれた外因性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック哺乳動物であって、前記外因性ＤＮＡ配列がプロテインＣ活性を有するポリペプチドと前記トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に前記プロテインＣを分泌するのに有効であるシグナルペプチドとに作動的に結合しており、巨つ、乳腺細胞中で特異的に活性であるプロモーターを含むことを特徴とするトランスジェニック哺乳動物。
２．前記プロモーターがカゼイン、ラクトアルブミン又はラクトグロブリンプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
３．前記プロモーターが乳漿酸性タンパク質プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
４．前記ポリペプチドがヒトプロテインＣであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
５．前記哺乳動物がマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ又はヤギであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
６．（Ａ）プロテインＣ活性を有するポリペプチドとトランスジェニック哺乳動物の乳汁中に前記ポリペプチドを分泌するのに有効なシグナルペプチドとをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合しており、且つ、乳腺細胞中で特異的に活性であるプロモーターを含み、そのゲノムに安定的に組み込まれた外因住ＤＮＡ配列により特徴付けられるトランスジェニック哺乳動物を提供する段階と、（Ｂ）前記トランスジェニック哺乳動物から乳汁を生成する段階と、（Ｃ）前記乳汁を収集する段階と、（Ｄ）前記乳汁から前記ポリペプチドを単離する段階とを含むことを特徴とするプロテインＣの製造方法。
７．前記プロモーターがカゼイン、ラクトアルブミン又はラクトグロブリンプロモーターであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．前記プロモーターが乳漿酸性タンパク質プロモーターであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
９．前記ポリペプチドがヒトプロテインＣであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
１０．前記哺乳動物がマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ又はヤギであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
１１．（Ａ）遺伝子構築物を含有する混合物を提供する段階と、（Ｂ）前記混合物をアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーにかけ、精製遺伝子構築物を得る段階と、その後、（Ｃ）前記精製遺伝子構築物を含有する水性緩衝溶液を動物胚にマイクロインジェクトする段階とを含むことを特徴とするトランスジェニック動物の作出方法。
１２．段階（Ｂ）が、前記混合物をアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーカラムに載置する工程と、前記遺伝子構築物を前記カラムから溶離させる工程と、次いで前記遺伝子構築物を第２のアニオン交換高性能液体クロマトグラフィーにかける工程とを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。