JPH06507708A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析方法 本発明は、＋１１液状の生体分子の検出方法または検量方法に関するものであり 、特に、生物源から得たサンプルに含まれる酵素、およびそれらの基質の検出方 法に関するものである。

近年、溶液状の生体分子である分析対象物の自動検出装置の開発が望まれている 。概して、そのような装置（バイオセンサー）は、共振場の消失領域に配置され ている感作被覆層を有している。一般に、分析対象物の検出には、例えば、表面 プラズモン共振（ＳＰＲ）等の光学技術を利用しており、この技術は分析対象物 と上記層との相互作用により生じる被覆層の厚さおよび／または屈折率を変化さ せることを基彎としている。これにより、例えば、共振の角位置を変化させるこ とができる。

他の光学的なバイオセンサーは光線を伝達させる導波管を有している。この装置 の光学的特徴は、上記導波管の表面に発生する変化によって影響を及ぼされるき いう点にある。光学的なバイオセンサーの一つの形態は、漏れ全反射をベースと している。この漏れ全反射（ＦＴＲ）の原理は周知であり、この技術は、例えば 、ボサッチとオエールによって文献（オブティクス（１９８２）、２１　２＋６ ７−２１７３）に開示されている。免疫学的検定において使用されるＦＴＲ装置 は、米国特許公報Ｎｏ、４，８５７，２７３に開示されており、それによれば一 端が調査すべきサンプルに接し、他端が順番に基質に取り付けられたスペーサー 層に接するキャビティ一層を有している。基質−スペーサー層の界面には、全反 射が起こり、それに関係した消失場がスペーサー層を介して浸透するように、単 一エネルギー放射線が照射されている。このスペーサー層の厚さが正しく、入射 平行波ベクトルが共振モードの伝わり定数のいずれかと一致するなら、全反射は 濁れ、放射線は上記キャビティ一層に行き渡る。このキャビティ一層は、上記ス ペーサー層をなす物質の屈折率より大きな屈折率を有し、入射放射線の波長にお いて透明である物質から形成されていなければならない。

より最近では、ＦＴＲバイオセンサーは文献（例えば、ＰＣＴ出願明細書ＷＯ９ ０１０６５０３）に開示されており、それによれば、キャビティ一層はかなり大 きい屈折率を有する物質、一般には無機酸化物からなる薄膜とされている。

全てのバイオセンサーにおいて、感作被覆層が化学的に安定した橿または生化学 的に安定した種からなる層として構成されていることが必要である。酵素−基質 対の１メンバーを検出するための方法は文献（ＰＣＴ出願明細書Ｎｏ、ＷＯ９０ ／１１５１０）に開示されており、その文献によれば、上記方法はＳＰＲ／イイ オセンサーの表面上の対の他のメンバーを安定化させ、ついで装置表面上に反応 生成物が積層する様子をモニターする工程からなる。この装置の特性を効果的に 引き出すためには、反応生成物は不溶解性でなければならず、さらにこの方法に よって検出される酵素および基質の領域をこれが大きく圧迫しなければならない ということは明かである。また、装置の表面手段上の不溶解性生成物の堆積物は 、一般に、再使用することはできない。

我々は、上記欠点を予め取り除いたまたは克服したバイオセンサーを使用した、 酵素およびそれらの基質検出の方法を提案するものである。

本発明によれば、直接的にまた１ｊ間接的に吸収反応生成物を形成するように、 上記光学導波管バイオセンサーの表面付近または表面に酵素−基質対メンバーを 接触させることからなる、酵素−基質対の１メンバーを検出するための方法を提 供することができる。

本発明の方法は、可溶性吸収反応生成物を形成する酵素および基質は、不溶解性 生成物を形成するものよりも、より広範囲で使用することができるという利点を 有している。これは、直接分析される酵素および基質の数はかなり多いというこ とを意味している。多くの場合、好ましい基質を改めて合成することは容易であ るが、不溶解性生成物をなす基質はこの限りではない。また、センサー表面の酵 素が安定であり、かつこの酵素がその活性を保持しているなら、センサーは数サ ンプルに対して再使用することができる。しかしながら、同様に、不溶解性反応 生成物においてはこの限りではない。

放出されるエネルギー放射線のどの様なパラメーターでさえもモニターされるで あろう。明かに、反応生成物の吸収性質は導波管からの結合した（ｃｏｕｐｌｅ ｄ　）エネルギー放射線の強度に影響を及ぼす。その生成物は蛍光性または発光 性であり、その蛍光または発光はモニターされるであろう。

本発明にかかる方法のある特別な具体例は、ａ）（分析対象物が存在する場合） 可溶性吸収反応生成物を形成するように、検出すべき分析対象物が含有されてい るサンプルを、その上では酵素−基質対の他のメンバーは安定である光学的導波 管バイオセンサーの表面に接触させ、ｂ）反応生成物によって吸収された波長の 光が導波管内を伝達するように、電磁放射線をバイオセンサーに照射し、そして Ｃ）バイオセンサーからの放射線をモニターするという工程から構成されている 。

本発明の方法は、酵素−基質反応の速度に影響を及ぼす分析対象物、例えば酵素 抑制因子、および活性化剤等を検出するためにも使用することができる。この場 合、方法は Ｓ）検出すべき酵素の抑制因子、または活性化剤が含有されているサンプルを、 その上では酵素またはその基質は安定である光学的導波管バイオセンサーの表面 に接触させ、上記基質は酵素の存在により可溶性吸収反応生成物を形成するもの の一つである、 ｂ）酵素−基質対の他のメンバーをサンプルに添加し、Ｃ）反応生成物により吸 収される波長の光が導波管内を伝達するように、電磁気放射線をバイオセンサー に照射し、そしてｄ）バイオセンサーからの放射線をモニターするという工程か ら構成されている。

この方法では、吸収反応生成物の形成はサンプル中の活性化剤の濃度と相関関係 を有しており、抑制因子の濃度の逆数とも相関関係を有してｔ４゜本発明にかか る池の方法では、分析対象物は吸収反応生成物を形成しな一＼基質であり、セン サー表面とサンプルとが接触する前に、吸収反応物を生成する基質類似化合物が 添加される。上記基質類似化合物は、安定した酵素との結合とＬＮう点において は、天然基質に匹敵する。

他の変形例では、本発明はまた酵素−基質対（分析対象物）の１メンＩ（−を検 出する方法を提供するものであり、その方法は、８）検出すべき分析対象物が含 有されているサンプルを、その上で：よ第二酵素＋１安定である光学的導波管バ イオセンサーの表面に接触させ、ｂ）酵素−基質対の反応生成物の存在下で、可 溶性反応生成物を形成する固定された酵素のために、酵素−基質対の他のメンフ ィーおよび基質とをサンプル番ご添加する、 Ｃ）反応生成物により吸収される波長の光が導波管内を伝達するようζこ、電磁 気放射線をバイオセンサーに照射し、そしてｄ）バイオセンサーからの放射線を モニターするという工程から構成されている。

分析対象物が基質である場合、上記どちらの酵素も上記センサー表面上で固定さ れる。吸収性の可溶反応生成物を形成する第二酵素反応のための基質の存在下で 、生成物を形成するために、その内の１酵素はサンプル中の基質と反応する。

可溶性反応生成物は、分析過程において、光学波導管センサーの消失場から拡散 してはならないが、固定酵素に接近した場所に残存していなければならな−１゜ このことは数種の酵素二とっては周知である。例えば、界面を改質する可溶のフ ルオレセイン誘導体の存在下で、基質リン酸ジオキセテイン（ｄｌｏｘｅＬａｎ ｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ　）を用いてアルカリ性フォスファターゼを分析する際、 発光シグナルが酵素活性場所付近に生じる（文献：　５ｃｈａｓｐ　ｅｔ　ｓ＋ 　（１９８９）　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　３５．１８０−１８６４をＩＩ照）。こ れらの酵素は、物理的なバリア手段によって、あるいは抗体手段によるセンサー 表面に捕獲することによって、反応生成物を上記消失場内に保持できない。例え ば、酵素反応にかかる生成物に結合するけれども基質とは結合しない抗体は用意 できるであろう。抗体は、酵素と同様の小片上に固定される反応生成物が、それ らが形成される表面付近に強制的に集められている場合、同じサンプル内で数種 の分析対象物を検出することが可能である。

幾つかの好ましい酵素−基質対を以下に例示する。

吸腹１１底ｎ β−ガラクト７ダーゼ　レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドラクトβ− ガラクトシダーゼ　メトキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノβ−グル クロニターセ　レゾルフィン−β−Ｄ−グルクロニド１ル１１腹宜 シアイルトランスフェラーゼ　フチジン−５−モノフォスフエイト−（３−（ｇ ｌａｙｌｔｒａｎｓ４ｅｒａｓｅｓ　）　フルオレセイニルーチオウレイド）− チオキシ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸 β−ガラクトシダーゼ　フルオレセイン　ジー（β−Ｄ−ガラクトピラノシド） ＆光１Ｊｊ【曳 アルカリ性ホスファターゼ　界面改質性−可溶化誘導フルオレセインの存在下の リン酸ジオキセテイン（ｄｌｏｘｓｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ　） ホタル　ル／フェラーゼ　ＡＴＰおよびルシフェリンいくつかの酵素の分析は、 ある特別な波長での吸収度の減少を測定することによって行われる。例えば、ア ンギオテンシン転化酵素は基質ＦＡ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　（ＦＡはフリル アクリロイル（ｆｕｒｙｌ富ｅｒｙｌｏｙｌ　）を意味する）を用いて、吸収度 の減少を測定することによって分析することができる。

直接測定するのに好ましい基質を有していない酵素の場合、対酵素を使用して検 出することができる。例えば、シュウ酸エステルオキシダーゼは以下のようにし て検出される。

（ＣＯｏｏ）　２　＋　ｏ２−−−−−−−−−→　２ＣＯ２＋　Ｈ，０２ゾ２ つ酸エステルｉ什夕゛−セ゛ Ｈ，Ｏ，＋ＭＢＴＨ＋ＤＭＡ　−−−−−−−一一　インダミン染料＋２Ｈ３〇 八°−瀘キツタ゛−セ゛ ＭＢＴ）（＝３−メチル−２−ペンゾチアノゾリノンヒドラゾンＤＭＡ−Ｎ、Ｎ −ジメチルアニリン また、吸収槽を生成するための反応生成物を使用する、好ましい１段階からなる 化学反応は有用である。例えば、クリアナ／キナーゼまたはクレアチン燐酸は以 下のようにして検出される。

クレアチン燐酸　＋　ＡＤＰ　−−−−−−→　クレアチニン　＋　ＡＴＰりｖ ｒチン今ナー七゛ クレアチニン＋　ナフトール＋　ジアセチル　−一一一一　ピンク複合体（ｐｌ ｎｋ　ｃｏｍｐｌｅｘ） 本発明に係る方法は、どの様な彩管の光学導波管バイオセンサーも使用すること ができる。しかしながら、漏れ全反射（ＦＴＲ）の原理を基礎とした共振バイオ センサーを使用することはより好ましい。そのようなバイオセンサーは、典型的 には以下の通り構成されている。

８）屈折率がｎ、である誘電体からなるキャビティ一層と、ｂ）屈折率がｎ、で ある誘電体基質と、Ｃ）上記率ャビティ一層と、基質との間に配置され、屈折率 がｎ、からなる誘電体スペーサー層とから構成されている。

使用する際、上記基板とスペーサー層との界面には、全反射するような光が照射 される。この場合、”光”とは可視光だけでなく、それより波長の長い範囲およ び短い範囲の光、例えば、紫外線および赤外線をも意味する。

キャビティ一層のガイドモード共振伝達は、予め与えられた波長で、特別な入射 角を有する励起放射線によって起こる。したがって、以下に示す２種の基礎的な 測定方法、つまり：波長を固定して入射角度をスキャンする、または入射角度を 固定して波長をスキャンする、という方法が可能となる。レーザー源を使用する ことができ、光線を平行にする問題が容易であり、そして拡散効果を防止でき、 その結果容易に分析できるから、前者の方法は単一エネルギー放射線を使用した 方法であるが、この方法がより好ましい。

共振角度は、各層の屈折率および厚さなど、バイオセンサー装置の種々のパラメ ーターに依存している。一般に、上記キャビティ一層の屈折率ｎ１．および基板 の屈折率ｎｌは両方ともにスペーサーの屈折率であるｎ２よりも大きくなければ ならない。また、共振させるためには、キャビティーに少なくとも１モードを存 在させねばならないため、キャビティ一層をある一定の最低の厚さよりも厚くし なければならない。

キャビティ一層は誘電体からなる薄膜であることが好ましい。キャビティ一層を なす透過型誘電物質としては、二酸化ジルコニウム、二酸化チタン、酸化アルミ ニウム、または酸化タンタルが好ましい。

上記キャビティ一層は周知の技術、例えば、真空蒸着法、スパッタリング法、化 学蒸気蒸着法、非拡散法などにより形成することができる。

上記誘電スペーサー層は入射照射が伝導しやすく、そしてキャビティ一層および 基質の屈折率よりもその屈折率が小さくなければならない。例えば、上記スペー サー層はツブ化マグネシウムをスパッタリングした層または蒸着した層から構成 されている。この場合、赤外線レーザーを光源として使用することができる。

そのような光源からの光は、概して８００ｎｍあたりに波長を有している。その 他の好ましい物質としては、フｙ化リチウム、二酸化シリコンを例示できる。さ きに述べたような蒸着法およびスパッタリング法の他に、ゾル−ゲル法によって スペーサー層を基板上に積層することができる。また、基板と化学反応させるこ とによっても得ることができる。

基質の屈折率（ｎ、）は、スペーサー層の屈折率（ｎ２）よりも大きくなければ ならない。しかしながら、本発明に係る方法を実施するにあたっては、一般に、 基板の厚さは限定されない。

これに対して、キャビティ一層の厚さは、好ましい結合角度（ｃｏｕｐ口ｎｇａ ｎｇｌｅｓ）の範囲内で共振が起こるような厚さでなければならない。概してス ペーサー層は数百ナノメーターオーダー、敢えて言うなら約２００ｎｍから２０ ００ｎｍ、より好ましくは５００ｎｍから＋５００ｎｍ、例えばｌｏｏｏｎｍの 厚さを有している。また、キャビティ一層は数十ナノメーター、敢えて言うなら ｌＯｎｍから２００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍから１５０ｎｍ、例えば、ｌｏｏ ｎｍの厚さを有している。

キャビティ一層の厚さが３０ｎｍから１５０ｎｍであり、二酸化ジルコニウム、 ハフニウム、窒化シリコン、二酸化チタン、酸化タンタル、または酸化アルミニ ウムから形成されており、スペーサー層は５００ｎｍから１５００ｎｍの厚さを 有し、ふつ化マグネシウム、ふう化リチウム、または二酸化シリコンから形成さ れており、それらの物質はそれぞれ、スペーサー層の屈折率がキャビティ一層の それよりも小さくなるように選択されていることが特に好ましい。

キャビティ一層およびスペーサー層にとってより好ましい物質は、それぞれ酸化 タンタルであり、二酸化シリコンである。

適切な放射源として入射光源を使用できるが、単一エネルギー放射を使用するこ とがより好ましく、レーザーのような放射源を使用することが最も好ましい。

このようなレーザーの選択は、とりわけ、特に吸収反応生成物、例えばさきに例 示されたような種々の層を形成する物質によるところが大きい。

角度をスキャンするのは、連続してまたは同時に行われる。つまり、光の平行ビ ームの入射角を変化させることによって、またはヨーロッパ特許明細書Ｎｏ。

０３０５１０９Ａに開示されているような扇状のビーム（ＳＰＨに関係している 〉を使用して、角度の領域にわたって同時に照射することによって行われる。前 者の場合、ンングルチャンネル検出器を使用することができる。この検出器は角 度領域にわたって機会的にスキャンする機器である。後者は、角度領域にわたっ て同時に照射するものであり、一般に角度分解能を有するマルチチャンネルを使 用する必要が生じる。

共振では、入射光はＦＴＨによってキャビティ一層に入射して結合し、キャビテ ィ一層に沿って一定の距蝋伝わり、そして（やはりＦＴＲによって）出射する。

この伝わり距離は装置の種々のパラメーターに依存しているが、概して１ｍｍま たは２ｍｍ程度である。

本発明に係る方法の過程での吸収反応生成物の生成の結果、反射光強度が減少す る。反応生成物が蛍光性または発光性である場合、蛍光性波長または発光性波長 での強度増加が分析対象物を検出するのに用いられる。

本発明に係る方法のいくつかを、添付された図面を参照して以下にさらに詳しく 説明する。

図１は、酵素Ｅｌの検出をするための分析方法を図式的に示している。酵素のた めの基質３１はＦＴＲバイオセンサーのキャビティ一層Ｃの表面上に固定されて いる。上記基質Ｓ！は上記亭ヤビテイ一層Ｃ上に直接固定されても良いし、ジェ ルからなる層に固定されていてもよい。酵素Ｅｌを含有するサンプルがバイオセ ンサー表面Ｃに接触すると、検出可能なく吸収性）生成物Ｐｉが形成される。

図２は基質Ｓの検量方法について図示している。この場合、酵素Ｅｌがセンサー 表面Ｃ上に固定されている。

図３は酵素Ｅｌの検量方法を図示しており、対酵素Ｅ２が表面Ｃ上に固定されて いる。Ｅｌを含有するサンプルに対して、酵素に対する基質Ｓ１と、対酵素Ｅ２ に対する基質Ｓ２とを添加する。上記対酵素Ｅ２は、生成物Ｐｉ（Ｅｌの作用に より９１から形成される）の存在下で検出可能な（吸収性）生成物Ｐ２を生成す るものである。

図４は基質Ｓｌが分析対象物であり、２橿の酵素Ｅ１．Ｅ２がセンサーＣ上に固 定されている状態を図示している。対甚質Ｓ２が、Ｓｔを含有するサンプルに添 加される。分析対象物である基質Ｓ１は、酵素Ｅ！によって、生成物Ｐ１に転化 する。この生成物ＰＩは、検出可能な（吸収性生成物である）Ｐ２を生成するた めに、酵素Ｅ２の存在下で、対基１１ｓ２と反応する。

図５は図２に示された状態の変形例を示しており、ここでは反応生成物Ｐが、固 定された特殊な抗体で、センサーの表面Ｃに捕獲および保持される。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．直接または間接的に吸収反応生成物を形成するように、光学導波管バイオセ ンサーの表面にまたはその付近に対メンバーを接触させる工程からなることを特 徴とする、酵素−基質対（分析対象物）の１メンバーを検出するための方法。
2. ２．ａ）可溶性の吸収反応生成物（分析対象物が存在する場合）を生成すべく、 検出すべき分析対象物がその中に含有されているサンプルを、その上に他の酵素 −基質対が固定されている光学的導波管バイオセンサーの表面に接触させ、ｂ） 反応生成物により吸収される波長の光が波動管内を伝わるような電磁気放射線ビ ームをバイオセンサーに照射し、そしてｃ）バイオセンサーから放出された放射 線をモニターする、という工程から構成されていることを特徴とする請求項１記 載の方法。
3. ３．請求項１記載の方法であって、 ａ）分析対象物を含有するサンプルを、その上に酵素または基質が固定されてい る光学的導波管バイオセンサーの表面に接触させ、上記基質は酵素の存在下で可 溶性吸収反応生成物を形成するものの一つでありｂ）酸素−基質対の他のメンバ ーをサンプルに添加和し、ｃ）反応生成物により吸収される波長の光が波動管内 を伝わるような電磁気放射線ビームをバイオセンサーに照射し、そしてｄ）バイ オセンサーから放出された放射線をモニターする、という工程から構成されてい ることを特徴とする酵素−基質反応の速度に影響する分析対象物の検出方法。
4. ４．前記分析対象物が吸収反応生成物を形成しない基質であって、さらにそれが センサー表面と接触する前に吸収反応生成物を形成するような基質類似化合物を サンプルに添加する工程を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．ａ）検出すべき分析対象物がその中に含有されているサンプルを、その上に 第二酵素が固定されている光学的導波管バイオセンサーの表面に接触させ、ｂ） サンプルに、酵素−基質対の値のメンバー、および酵素−基質反応生成物の存在 下で可溶性吸収反応生成物を形成する固定された酵素のための基質を添加し、ｃ ）反応生成物により吸収される波長の光が波動管内を伝わるような電磁気放射線 ビームをバイオセンサーに照射し、そしてｄ）バイオセンサーから放出された放 射線をモニターする、という工程から構成されていることを特徴とする請求項１ 記載の方法。
6. ６．前記酵素の両方がセンサー表面に固定されていることを特徴とする請求項１ 記載の方法。
7. ７．前記反応生成物が、物理的なバリア手段によりセンサー表面付近に無理に配 置されている、または抗体手段によりセンサー表面に捕獲きれていることを特徴 とする請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載の方法。
8. ８．前記光学導波管バイオセンサーが漏れ全反射の原理をベースとした共振バイ オセンサーであり、 ａ）屈折率がｎ３である誘電体物質からなるキャビティー層と、ｂ）屈折率がｎ １である誘電体物質からなる基質と、ｃ）上記キャピティー層と基質との間に配 置されており、屈折率がｎ２である誘電体物質からなるスペーサー層とから構成 されていることを特徴とする請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の 方法。
9. ９．前記キャビティー層が誘電体物置からなる薄膜であることを特徴とする請求 項８記載の方法。
10. １０．前記キャピティー層が３０ｎｍから１５０ｎｍまでの厚さを有しており、 二酸化ジルコニウム、ハフニウム、窒化シリコン、二酸化チタン、酸化タンタル 、および酸化アルミニウムからなるグループから選択される物質で構成されてお り、スペーサー層は５００ｎｍから１５００ｎｍの厚さを有し、ふつ化マグネシ ウム、ふつ化リチウム、および二酸化シリコンからなるグループから選択される 物置で構成されており、それらの物質がスペーサー層の屈折率がキャビティー層 のそれよりも小さくなるように選択されていることを特徴とする請求項８記載の 方法。