JPH06507786A - Ａｔｐ依存性プロテアーゼおよびそれに対する拮抗剤の悪液質および筋肉るいそうの処置における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＡＴＰ依存性プロテアーゼおよびそれに対する拮抗剤の悪液質および筋肉るいそ うの処置における使用発明の背景 哺乳類の細胞は少なくとも４種の蛋白質分解系を含み、それらは細胞蛋白質の代 謝回転に別個の機能を果たしていると思われる。サイドシル中には、ＡＴＰを必 要とし、そしてポリペプチドであるユビキチンが関連する溶解性蛋白質分解経路 が存在する。この多成分系は高度に異常な蛋白質および寿命の短い調節蛋白質の 選択的分解を触媒する。しかし、この過程は成熟中の網状赤血球（Ｂｏｃｈｅｓ 、　Ｆ、およびＡ、Ｌ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、５ｃｉｅｎｃｅ、２１５：９７８− ９８０　（１９８２）　、５ｐｅｎｓｅｒ、Ｓ、およびＪ、　Ｅｔ　ｌ　ｉｎｇ ｅｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７：１４１２２〜１４１２７　（１９８５））およ び成熟中の繊維芽細胞（Ｃ４ｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａ　など、Ｃｅ１ｌ、３７５ ７−６６　（１９８４）　、Ｇｒｏｎｏｓ　ｔ　ａ　ｊ　ｓｋ　ｉ、Ｒ，など、 Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ　、２６０　：　３３４４〜３３４９　（１９８４））の中の大部分の 蛋白質の分解にも関与していると思われる。インシュリンまたは血清を除去した 細胞では標準的細胞蛋白質の分解は２倍まで増加する。この加速された蛋白質分 解はリゾソームを含み、これはエンドサイトーンスを受けた蛋白質および膜蛋白 質の分解のための部位でもある。骨格筋が全蛋白質分解を増加することのできる 他の系にはＣａ”−依存性プロテアーゼ（カルバインＩおよびＩＩ）が関連する 。ジストロフィーまたは損傷を受けた筋肉または細胞間Ｃａ”が増加している術 後正常筋肉の中では、主にカルパインの活性化により全蛋白質分解が増加する。

さらに、ＡＴＰとは独立に機能する非すリゾーム性分解系があり；赤血球中では この系は酸化剤−損傷蛋白質の分解を選択的に触媒する。筋肉で各種条件下にお ける種々の細胞成分の分解におけるこれらの系の相対的な重要性は知られていな い。

ｕｂを要求する経路では、多くの蛋白質の分解における最初の段階はＡＴＰ−依 存性過程によるこの小さいポリペプチドへの抱合を含む。ユビキチン化蛋白質は 次に１０００〜１５００ｋＤａ　（２６Ｓ）のＡＴＰ−依存性蛋白質分解複合体 であるＵｂ−複合体−分解酵素（ｒＵＣＤＥＮＪ）によって分解される。この経 路は網状赤血球中で最もよく特徴付けられるが、骨格筋内および他の細胞内にも 証明される。これは高度に異常な蛋白質および寿命の短い酵素または調節蛋白質 多数の迅速な分解を司ると信じられている。

真核細胞中の大きな（７００ｋＤａ）多量体プロテアーゼは、プロテアソームと 呼ばれ、ＴＪＣＤＥＮの成分である。これは別個のサブユニット１２〜１５種お よび特異性の異なるペプチダーゼ３種を含む。それ自身では、プロテアソームは ユビキチン化蛋白質を分解できないが、そしてＵＣＤＥＮにおける蛋白質分解活 性の殆どを提供する。

発明の要約 本発明は種々の生理学的および病理学的段階を伴う、そして神経損傷、絶食、発 熱、アチドーシスおよび成る種の内分泌障害で起きる筋肉量の損失（萎縮）の大 部分の原因となっている筋肉蛋白質の加速された分解を阻止（削減または予防） する方法に関する。本文に述べるように、非すリゾーム性ＡＴＰ−ユビキチンー 依存性蛋白質分解過程はこれらの状況下での筋肉内で増加し、萎縮筋肉内に起き る加速された蛋白質分解の大部分の原因であることが証明されている。これも、 本文に述べるように、萎縮筋肉内には同一条件下の非筋肉組織内には見られない ユビキチンｍＲＮＡの特異的増加、プロテアソームのためのｍＲＮＡの誘導およ びユビキチン化蛋白質含量の増加があることの証明によって支持される。

本発明はさらにユビキチン化蛋白質の分解に関与し、プロテアソームと複合体を 形成し、ユビキチンに抱合した蛋白質を迅速に分解する１３００〜１５００ｋＤ ａのＡＴＰ＝依存性蛋白質分解複合体（ＵＣＤＥＮ、１５００ｋＤａ複合体と称 する）の一部と思われる新ＡＴＰ＝依存性プロテアーゼに関する。マルチパイン （ｍｕｌｔｉｐａｉｎ）と命名されたこの新プロテアーゼはＡＴＰ−ユビキチン ー依存性経路において重要な役割を果たしていると思われる。

マルチパインは分子量約５００ｋＤａの多量体性酵素で、活性化のためにＡＴＰ の加水分解を必要とし、またユビキチン化蛋白質を優先的に分解する。この新Ａ ＴＰ依存性酵素はチオールプロテアーゼであると思われ、Ｕｂ−抱合蛋白質を酸 溶解性産物まで分解することが示されている。マルチパインは筋肉内に確認され 、種々の型の筋肉るいそう中に活性化されているサイドシル経路で決定的な役割 を果たしていることが示されている。

本発明はさらに骨格筋細胞のようなそれが正常には存在する資源から得られる精 製マルチパイン：マルチパインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、組換えＤＮＡ 法によって製造されたマルチパイン；この酵素に特異的な抗体；マルチパインの 使用法；およびマルチパイン阻害剤および殊に各種の疾患または状況中に起きる 筋肉量減少を削減するためのその使用に関する。

新マルチパイン阻害剤は、本文に述べる、この酵素およびその構造に関する知識 および技術認識的方法を用いて設計および製造されることができる。例えば、蛋 白質分解サブユニット、ＡＴＰアーゼおよびユビキチンー結合構成要素のような マルチパインの種々のサブユニットの知識はこの目的のために有用であろう。

本発明はさらにマルチパインまたはこの多量体酵素の構成要素の阻害剤である既 存の化合物または分子を確認する方法に関する。例えば、マルチパインはシスタ チンＡで阻害されることが示されている。故に、クローン化されたマルチパイン を発現する細胞はこの酵素を阻害する性能をめてンスタチン類似体を検定するた め、ならびに他のマルチパイン阻害剤を確認するために用いることができる。

微生物培養液をマルチパインの抗生物質性阻害剤をめてスクリーニングすること もできる。マルチパイン阻害剤はペプチド、ペプチド様分子であるか、ペプチド アルデヒド、β−ラクタム誘導体、ペプチドクロロメチルケトン、エポキシド、 またはペプチドイソクマリンのようなペプチド誘導体であることができる。

本文に述べるように、本発明は４０ｋＤａプロテアソ一ム調節剤に関する。この ４０ｋＤａポリペプチドは精製され、ＡＴＰに結合してプロテアソームのベブラ ーダーゼ（分解的）活性を阻害する大きい複合体の一員であることが示されてい る。

天然に存在する４０ｋＤａ阻害剤が入手できたのでプロテアソーム阻害に必要な 構造を決定し７、この調節ペプチドの活性領域またはフラグメントを確認し、そ して新ブｐテアソーム阻害剤を設計し、あるいはプロテアソームを阻害する既存 化合物を確認することが可能になった。

マルチパイン阻害剤または１５００ｋＤａ複合体の他の構成要素の明害剤は筋肉 量減少（たとえば、神経損傷、絶食、感染症またはある種の内分泌障害による） が起きている個体に投与することができる。筋肉量減少は、そのような状況下で は、本文に述べるように、今度は主にマルチパインが関与している非すリゾーム 性ＡＴＰ−ユビキチンー依存性経路の活性化による筋肉蛋白質の加速された分解 の結果であることが示されている。マルチパイン阻害剤またはＡＴＰ−依存性蛋 白質分解複合体の他の構成要素の阻害剤の投与はこのような状況下には通常的に 起きる強化された蛋白質分解を妨害または削減する。その結果、蛋白質分解は減 少し、筋肉蛋白質減少の程度はその状況下に普通に起きているよりも小い程度で 起きる。マルチパインまたは１５００ｋＤａ複合体の他の構成要素の阻害方法お よび、その結果、筋肉蛋白質分解の阻害方法は癌、慢性感染症病、発熱および筋 肉不使用および脱神経のような状況下に起き、し５ばしは極度に消耗性である各 種の状況下に用い得ることができる。また、この方法はアチドーシスが起きてい る腎障害または肝障害の症例にも有用なのはアミノ酸の発生を削減することで、 罹轡している腎臓または肝臓の窒素負荷を軽減できるからである。

図面の簡単な説明 図１〜３は５００ｋＤａプロテアーゼの精製段階を示す。

図１はウサギ骨格筋の画分１１からの抽出物の七ノーＱアニオン交換クロマトグ ラフィーによる分別結果のグラフ表示である。本文に述べるように、ピーク２は ＡＴＰ−刺激されたりゾチーム分解の大部分の原因であり、酸化剤で損傷したヘ モグロビンに対して強い活性を持ち、プロテアソームに特性的な基質であるＳＬ ＬＶＴ−ＭＣＡＩ：対しては殆ど活性を持たないことが示されたので後続する分 析はピーク２に絞った。

図２はピーク２のＵｂ　１２８１−リゾチーム抱合体分解活性のゲル濾過を用い る分析のグラフ表示である。ここに、標本はＡＴＰ存在下（ム）または不在下（ △）のＵｂ−Ｉ２Ｓ■−リゾチームおよびＯＨ／Ｃｈ−処理１４ｃｍヘモグロビ ン（・）について検定した。使用した分子量標準品はブルーデキストラン、チロ グロブリン、フェリチンおよびβ−アミラーゼであった。

図３は５００ｋＤａプロテアーゼの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ ］００％の結果を示し、これはスペロース６カラムからのＵｂ　１２５１−リゾ チームを分解する活性のピークを濃縮し、蛋白質２５μｇを分析したものである 。

図４はりゾチーム、ユビキチン化リゾチーム、ヘモグロビンおよび酸化剤−損傷 ヘモグロビンの５ＱＱｋＤａプロテアーゼによる加水分解の相対的速度のグラフ 表示である。

図５はプロテアソームとマルチパインとをＭｇＡＴＰでブレインキュベーション した後の１３００ｋＤａ多量酵素複合体形成のグラフ表示である。使用レニ分子 量標準品はブルーデキストラン、ホスホリラーゼキナーゼ、チログロブリン、フ ェリチンおよびβ−アミラーゼであった。

図６はマルチパイン、プロテアソームーマルチノ々イン複合体および部分的にす 精製したプロテアソームの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示 す。

図７はマルチパイン（釦またはプロテアソームとマルチ）＜インとのインキュベ ーションで形成された複合体（０）　ｌこよって分解されたＵｂ　１２ｓｌ−リ ゾチーム抱合体の酸溶解性１２５Ｉ−生成物のグラフ表示である。分子量標準品 は物質Ｐ（１３４７Ｄａ）　、ＡＴＰ　（５５１Ｄａ）　、ＡＤＰ　（４２７Ｄ ａ）およびアデノシン（２６７Ｄａ）であった。

図８はマルチパインまたはプロテアソームとマルチノ（インとのインキュベーシ ョンによって形成した複合体によるＵｂ　１２ｆｉｌ−リゾチームの分解刺激に 対するＡＴＰ−依存性のグラフ表示である。

図９は脱神経および正常ヒラメ筋の蛋白質分解に対するＡＴＰ−枯渇の影響のグ ラフ表示である。これらのデータは脱神経に続（−次的にはＡＴＰ−依存性経路 の活性化による総蛋白質分解の増加を示す。値は両坐骨神経を切断したラットま たは無処置正常ラットの双方について最少５匹の平均値±ＳＥＭである。土庄類 似の体重（６０〜７０ｇ）を持つラットにおける坐骨神経切断後および正常筋肉 の毎日の総計蛋白質分解、上台　蛋白質分解速度に対するＡＴＰ−枯渇の影響。

上左　悦神経後のエネルギー−非依存性蛋白質分解過程および全蛋白質分解にお ける相対的変化（すなオ〕ち、脱神経筋肉と正常筋肉との間の蛋白質分解平均連 間の差）。下布　脱神紅後の、へＴＰ−依存性過程における相対的変化。

図１０はラットの長指伸筋における蛋白質分解に対する絶食および再給餌の影響 のグラフ表示である。左図　給餌または絶食ラットから得た筋肉内での合計蛋白 質分解およびエネルギー非依存性過程を絶食後の異なる時間および再給餌後２４ 時間に測定した。右図　蛋白質分解のＡＴＰ−非依存性構成要素。値はラット６ 匹の平均値±ＳＥＭである。

図１１は絶食および絶食−給餌ラットからの筋肉内でのＵｂ−ｍＲＮＡのノーザ ンブロソト分析結果を示す、給餌ラット（ａ）　、２４時時間量ラソ）（ｂ）、 ・１８時間（Ｃ）、または４８時間絶食後２４時間再給餌ラッ１−（ｄ）から得 たヒラメ筋から分離した全ＲＮＡ、／レーンの１０μｇ中のポリＵｂ−ｍＲＮＡ 水準を示す。２８Ｓおよび１８ＳはこれらのリポソームＲＮＡの位置を示す。

図１２は実施例６記載のように絶食および絶食−再給餌ラットのヒラメ筋におけ るドツトプロット分析により測定した全ｍＲＮＡ水準のグラフ表示である。給餌 動物での有！差はｐ＜Ｑ、００５、　ｐ＜Ｑ、０５である。

発明の詳細な記載 本発明は重篤な体重減少（たとえば、悪液′ｌｉ）および負の窒素収支がある状 況または病状で起きている過剰な蛋白質分解の原因である経路の発見およびこの 経路を構成要素の知見に基づき、この経路および異化状況における負の窒素収支 を阻止することを可能にしたものである。

本文に述べるように、蛋白質分解系のどれが脱神経性萎縮症、絶食および他の異 化状況（たとえば、発熱）の間の骨格筋内で蛋白質分解の大きい増加の原因であ るかを研究するための仕事は絶食または脱神経萎縮における筋肉内の加速された 蛋白質分解の大部分は非すリゾーム性（サイドシル性）ＡＴＰ−ユビキチンー依 存性蛋白質分解過程の活性化が原因であることを示したが、今迄は一般に構成的 過程（しばしば「基本的蛋白質分解」と呼ばれた）であり、そして異常または寿 命の短い調節ポリペプチドの除去のために一次的な原因であると信じられてきた 。しかし、本文に述べるように、筋肉蛋白質の損失を導き、各種の生理学的およ び病理学的刺激により引起こされる特別の細胞応答があることが示された。例え ば、絶食時には筋肉蛋白質分解の強化はグルココルチコイドと低イン／ニリンを 要し、発熱性感染症ではインターロイキン−１およびＴＮＦを要する。また、本 文に述べるように、脱神経性萎縮、絶食およびホルモンまたはエンドトキシン処 置における筋肉内での非すリゾーム性ＡＴＰ−依存性過程の活性強化ではユビキ チンは重要である。

このＡＴＰ−Ｕｂ−依存性経路での多数の段階が筋肉内で絶食および脱神経に影 響されることはあり得るが、本文に述べる研究は、共因子ユビキチンとの共有結 合によって分解のために標識される細胞蛋白質を加水分解する大きな（１５００ ｋＤａ）酵素複合体内の新規の律速的な構成要素の単離に至った。ここに述べた 研究は阻害のための鍵となる対象を確認した。記載のように、筋肉内にプロテア ーゼを確認し、サイドシル性ＡＴＰ−ユビキチンー依存性蛋白質分解経路で根本 的な役割を演じることが確認され、今では種々の型の筋肉るいそうでは活性化さ れることが判明した。さらに本文に述べるように、プロテアソームの分解活性の ポリペプチド性阻害剤も確認されている。

本発明は萎縮筋肉に起こり、ユビキチンが重要な役割を演じる非すリゾーム性Ａ ＴＰ要求性過程の活性化に起因することが知られている加速または強化された蛋 白質分解の阻止（削減または予防）方法に関する。この方法では、加速された蛋 白質分解はＡＴＰ−Ｕｂ−依存性経路を−またはそれ以上の可能性がある段階（ たとえば、蛋白質のユビキチン抱合の削減により、ＵＣＤＥＮ活性の阻害により 、またはその構成要素の一つの活性の阻害により、新規プロテアーゼであるマル チパインや天然阻害剤のようなもの）で阻害することによって阻止される。

本発明はまた筋肉内における機能のためにＡＴＰ加水分解を必要とし、種々の型 の筋肉るいそう時に活性化されるサイドシル性ＡＴＰ−ユビキチンー依存性蛋白 質分解性経路に根本的役割を持つプロテアーゼの発見に関する。「マルチパイン 」と呼ばれるこの蛋白質分解酵素は５００ｋＤａの多量体であり、あるいはパパ イン族プロテアーゼに関連するチオールプロテアーゼであると思われる蛋白質複 合体である。これは６個またはそれ以上の高分子量サブユニット（大きさ５０〜 １３０ｋＤａ）を含み、ユビキチンー抱合蛋白質を優先的にＡＴＰ−依存性反応 によって分解することが示されている。本文に述べる種々の観察も、このプロテ アーゼはユビキチンに抱合した蛋白質の認識および分解において律速成分である ことを示す。マルチパインは多重−ユビキチン鎖をイソペプチダーゼ活性によっ て解重合する性能も持っている。これはスルフヒドリル基閉塞剤であるシスタチ ンおよび関連するポリペプチドおよびペプチドクロロメチルケトンには感受性で あるが、リュウペプチン、Ｅ−６４またはセリンプロテアーゼ阻害剤には感受性 がない。ＡＴＰの存在下にマルチパインはプロテアソームと１１種合体を形成す るが、複合体形成はシスタチンによって阻害される。

それで、ＡＴＰ−ユビキチンー依存性経路の阻害は異化段階における負の窒素収 支を処置するための新規な方法である。これは、例えば、この新たに発見された 蛋白質分解酵素の阻害剤の使用が起きている筋肉量減少の削減に至ることによっ て達成される。このような阻害剤は筋肉細胞以外の細胞型でのサイドシル性ＡＴ Ｐ−ユビキチンー依存性蛋白質分解系の活性を削減するときにも用いることもで きる。過剰な蛋白質損失は敗血症、火傷、外傷、多（の癌、慢性または全身性感 染症、筋萎縮症、アチドーンスまたはを髄または神経損傷のような神経運動変成 病を持つ人を含む多くの型の患者に共通している。それはまた、副腎皮質ステロ イド投与を受けている人、食事摂取が減少および／または吸収が傷つけられてい る人にも起きる。その上、蛋白質分解経路の阻害は多分、動物（たとえば、しば しば牛や豚で重篤な体重減少を起こす「輸送熱」の処置のために）で有用である 。

以下はこの状況下にある筋肉内での加速された蛋白質分解は主に非すリゾーム性 ＡＴＰ−要求性過程の活性化が原因であることの知見に至る研究；プロテアーゼ であるマルチパインの単離と特性解析；蛋白質分解におけるその機能；プロテア ソームに対する２５０ｋＤａの天然に存在する阻害剤の単離と特性解析；マルチ パイン阻害剤の確認方法およびこの方法で確認された阻害剤およびマルチパイン の阻害方法およびその筋肉分解への効果の記載である。

特に実施例３〜５など、本文に述べるように、脱神経や絶食に伴う骨格筋の萎縮 により明白に加速された蛋白質分解が非すリゾーム性ＡＴＰ依存性またはエネル ギー非依存性分解系によって触媒されるかどうかの評価を行った。この研究は非 すリゾーム性ＡＴＰ＝依存性経路と筋肉るいそうの間の関連を明確に証明した。

本文に述べるように、各種異化状況（たとえば、脱神経、絶食、発熱、成る種の 内分泌障害または代謝性アチドーシス）下では筋肉るいそうは一次的に蛋白質分 解の加速および、加えるに、蛋白質分解の増加は以前は異常蛋白質および寿命の 短い成る種の酵素の迅速な除去においてのみ役立つと信じられていた、サイドシ ル牲ＡＴＰ−ユビキチンー依存性蛋白質分解系の活性化に起因することが示され た。異化段階での加速された蛋白質分解の原因がこの経路であることの発見はイ ンキュベートした筋肉で種々の蛋白質分解経路を阻止するかまたは選択的に測定 した研究、およびこの経路の構成要素（たとえば、ユビキチンおよびプロテアソ ームサブユニット）のためのｍＲＮＡ増加および萎縮筋肉でのユビキチンー蛋白 質抱合体の濃度増加の知見に基づいている。本文に述べるように、これらの異化 状況（たとえば、不使用、萎縮、敗血症、発熱と筋肉萎縮の模倣であるエンドト キシン処理）をよく模倣する単純な動物モデルが開発され、また試験管内インキ ュベーションの間に筋肉での蛋白質分解速度を精密に測定する方法ができた。

正常な骨格細胞中のＡＴＰを殆ど完全に除いて試験管内でインキュベートした時 、蛋白質分解は約４０〜７０％減少した結果が示された。ＡＴＰ−依存性（非す リゾーム性）蛋白質分解過程は対照である対側性筋肉に見られる全蛋白質分解か ら残余のＡＴＰ依存性過程を減じれば特定的かつ再現的に測定されることが発見 された。ヒラメ筋の脱神経後１および３日以内に、このＡＴＰ−依存性過程は５ ０〜２５０％増加したが、残余の（エネルギー非依存性）過程は変化しなかった 。このＡＴＰ−依存性、非すリゾーム性過程は、アクチンの迅速な分解（３−メ チルヒスチジン生産の増加で示されるように）を含む脱神経萎縮の間の蛋白質分 解の増加のすべての原因である。この反応は絶食時に強化された蛋白質分解の大 部分の原因である。

食餌を止めた後、筋肉内のＡＴＰ−依存性蛋白質分解は選択的に１５０〜３５０ ％増加した。再給餌後に、この過程は１日以内に対照値に戻った。加えるに、絶 食ウサギからの筋肉抽出物中では、内因性蛋白質および１４Ｃ−カゼインのＡＴ Ｐ−依存性分解は給餌動物からの抽出物におけるよりも約２倍速かった。同様に 、エノドトキンン（ＬＰＳ）の注射をモデルとする敗血症でも筋肉内のＡＴＰ− 依存性蛋白質分解の選択的増加が起きた。

本文に示すように、筋肉でのＡＴＰ−依存性過程の増加は細胞の特異的な応答で あり、種々の異化状況で活性化され、萎縮筋肉での加速された蛋白質分解の大部 分の原因であると思われる。ＡＴＰ−要求性分解系に影響する状況は脱神経萎縮 、絶食、発熱、成る種の内分泌障害およびアチドーシスを含む。

絶食時および脱神経萎縮筋肉内のＡＴＰ−ユビキチンー依存性の系の活性化前記 のように１．Ａ　Ｔ　Ｐ−依存性蛋白質分解過程の活性化は絶食および脱神経萎 縮の間の骨格筋内で増加した蛋白質分解の大部分の原因であると思われる。この 過程はＡＴＰ−ユビキチンー依存性経路の活性化を含むであろうから、萎縮筋肉 内のユビキチン（Ｕｂ）のためのｍＲＮＡ濃度およびＵｂ−蛋白質含量を測定し た（実施例６参照）。ラットの食事を１日除いた後、２種のポリュビキチン転写 物（２，４および１．３ｋＤａ）の水準における２〜４倍の増加はヒラメ筋およ び長指伸筋に見られたが、全ＲＮＡおよび全ｍＲＮＡ含量は５０％減少した。ヒ ラメ筋を脱神経後、１日以内にポリＵｂ−ｍＲＮＡの２〜３倍の増加も起きたが 全ＲＮＡ含量は減少した。絶食または脱神経によるＵｂ−ｍＲＮＡの増加にはこ れらの筋肉内でユビキチン全含量の６０〜９０％上昇を伴った。絶食動物を再給 餌すると、Ｕｂ−ｍＲＮＡ水準は１日以内に対照の水準に戻った。

プロテアーゼ・マルチパインの単離と特性解析前記のように、真核細胞では多く の蛋白質の分解はそれらのＡＴＰ−要求性過程による小さいポリペプチドである ユビキチンへの抱合を含む。ＵＣＤＥＮ　（Ｕｂ−抱合体分解酵素またはメガパ イン）はユビキチン化蛋白質を分解する。ＵＣＤＥＮの正確な性質は不明確であ るが、エネルギー枯渇網状赤血球の抽出物の中ではＣＦ−１、ＣＦ−２およびＣ Ｆ−３と呼ばれる構成要素３種のＡＴＰ−依存性の会合によって１０００〜１５ ００ｋＤａ　（２６Ｓ）複合体が形成されていることが示されている。（Ｇａｎ ｏｔｈ、Ｄ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６３　：１２４１２〜１２４１９　（１９８８））。前に討議したプロテアソ ームはＵＣＤＥＮの構成要素の一つ（ＣＦ−３）であることが示されている。（ Ｅｙｔａｎ、Ｅ、など、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６ ：７７５１０７７５５　（１９８９）；Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ、およびＡ、　Ｌ 、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６５＋４７８９〜４７ ９２　（１９９０））。しかし、他の二つの構成要素は性質も機能も未だに不明 である。

マルチパインの性質の要約 下記のように、骨格筋内に新型のプロテアーゼが確認され、ＵＣＤＥＮ複合体の 一部であることが判明した。この新プロテアーゼ、マルチパインは、プロテアソ ームと約１５００ｋＤａの複合体を形成し、ＵＣＤＥＮのＣＦ−１構成要素の活 性型の一つに対応すると思われる。プロテアソームとは異なり、マルチパインは ａ）それ自体がＡＴＰ−依存性過程においてユビキチン化蛋白質を分解し、また 、Ｎ−サクンニルーＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　］−］Ｔｙｒ−７−アミノー４−メ チルクマリンｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ）およびカゼインのような典型的なプロテアソ ームの基質に対しては殆どまたは全く活性を持たない；ｂ）シスタチンＡ（パパ イン様酵素の阻害剤）および成る種の低分子量阻害剤（たとえば、ヘミンまたは 成る種のペプチドクロロメチルケトン）には感受性であるが、セリンプロテアー ゼ阻害剤（たとえば、ジイソプロピルフルオロホスフェート）には非感受性であ るので、チオールプロテアーゼであると思われる；Ｃ）抗プロテアソーム抗体と は反応しない；およびｄ）主なサブユニット（５０〜１５０ｋＤａ）少なくとも ６個の組を含むが、プロテアソームにある特徴的な２０〜３０ｋＤａのサブユニ ットは含まない。

この新プロテアーゼはユビキチン化蛋白質（ユビキチン化リゾチーム）を分解す るよりは低速であるが、ＡＴＰ−依存性過程によって非ユビキチン化蛋白質（た とえば、リゾチーム）も分解し、また酸化剤−損傷ヘモグロビンもＡＴＰ−依存 性機構によって分解することが示されている。この新プロテアーゼは鍵となるサ イドシル性（非リソシーム性）蛋白質分解経路で重要な役割を果たし、ユビキチ ン化蛋白質のＡＴＰ−依存性分解においてプロテアソーム（ＵＣＤＥＮと同様な 大きさの複合体の構成要素として）と相乗的に機能することが示されている。大 きい複合体の中で、マルチパインはユビキチンー抱合蛋白質の最初の分解を触媒 すると思われる。総括すると、ここに示した知見はマルチパインはユビキチン抱 合蛋白質の認識と分解における律速構成要素であることを示す。

マルチパインの精製 実施例１に詳記するように、新プロテアーゼは哺乳類の骨格筋から得られている 。要約すれば、筋肉を入手し、実施例１に記載のように処理し、ｔｕｂ−蛋白質 抱合体分解活性を含む両分を単離した。活性を含む画分をクロマトグラフィーに よりさらにＵｂ−蛋白＠　（Ｕｂ−”Ｉ−リゾチーム）−分解活性を持つピーク ２個に分離した。ピーク２はユビキチン化リゾチームのＡＴＰ−に刺激される分 解の大部分の原因であり、酸化剤−損傷ヘモグロビンに対して強い活性を持つが 、プロテアソームの特徴的な基質であるＮ−サクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ 　１−Ｔｒｙ−７−アミノ−４−メチルクマリン（ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ）に対し て活性を持たないことが示された（図１）。活性はさらに精製して分子量約４４ ００００の活性な単一ピークを得た。これは見かけの分子量５４０ｋＤａを持つ 。

マルチパインの特性解析 この精製プロテアーゼの特性解析は、これが主サブユニットバンド（Ｍｒ値４０ ０００−１５００００）少なくとも６個の組合せであり、プロテアソームの特徴 的な２０〜３０ｋＤａのバンドはどれも含まないことを示した。

このプロテアーゼの触媒的性質を評価した（実施例１）。Ｕｂ−リゾチームの加 水分解はＡＴＰの添加で５倍に刺激され、リゾチームの分解は３倍に刺激された 。対照的に、このプロテアーゼによる天然および酸化剤−損傷ヘモグロビンのこ のプロテアーゼによる分解はＡＴＰには非依存性であった。酸化剤−損傷ヘモグ ロビンは天然ヘモグロビンよりも１５倍速く分解された。

このプロテアーゼはまたユビキチン化基質（非ユビキチン化基質と対比して）に 明瞭な優先性を持つことが示された。反対に、プロテアソームはＵｂ−抱合体に 対してはあるとしても極（僅かな活性を示した。このプロテアーゼがＵｂ抱合体 を分解する蛋白質分解反応の性質はＵｂｊ２ｆｉｉ−リゾチームから発生した酸 可溶性生成物の大きさを測定することで評価した。この評価はこのプロテアーゼ がエンドペプチダーゼであり、エキソペプチダーゼ活性を欠（と思われることを 示した。

この新プロテアーゼがプロテアソームと共通の構成要素を共有するとの可能性は ヒト肝粒子に対するモノクロナール抗体（表１１　；Ｍａｔ　ｔｈｅｗｓ、Ｗ、 など、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６　：　２５９ ７〜２６０１　（１９８９）’）およびラット肝プロテアソームに対するポリク ロナール抗体を用いて研究した（実施例１）。これらの処理は新プロテアーゼと プロテアソームの間には交差活性がないことを証明した。交差活性の欠如はウェ スターンプロット分析により確認した：２種の抗体は新プロテアーゼとは反応し なかった。

酵素阻害剤のマルチパインへの影響 この新プロテアーゼに対する種々の型の酵素阻害剤の効果も実施例１に記載する ように検討した。結果を表Ｉに示す。不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤である ジイソプロピルフルオロホスフェート（Ｄ　Ｆ　Ｐ）は抱合体分解には影響しな かった。重金属にキレートするＯ−フェナントロリンは幾分かの阻害を示した。

対照的に、チオール閉塞剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）および多数の パパイン様チオールプロテアーゼの強力な阻害剤である卵白シスタチン（シスタ チンＡ）はこの活性を強く阻害した。同様な濃度で、シスタチンＢ（ステフィン Ｂ）は５５％阻害を示し、シスタチンＣでは有意な効果を示さなかった。それで この新活性はチオールプロテアーゼであると思われるが、共に多数のチオールプ ロテアーゼ（たとえば、リソソームの酵素またはカルパイン類）の阻害剤である リューベプチンの存在下では３０％のみが阻害され、Ｅ６４では全（阻害されな かった。しかし、リューベブチンおよびＥ６４に対する感受性は定着結合に先行 する配列に強く影響され、感受性であるのはチオールプロテアーゼ全てではない 。ＡＴＰ−Ｕｂ−依存性蛋白質分解系およびプロテアソームを完全に阻害できる ヘミンはこの新プロテアーゼによる抱合体分解活性も阻害した。

これらの結果は、この新酵素がその活性部位にチオール基を持つことを示唆する 。有効な阻害剤のパターンは活性化されたときセリンプロテアーゼとして働く多 重の触媒部位があるプロテアソームからこの新酵素の活性を明瞭に区別する。

＋２５Ｉ−リゾチーム（非−Ｕｂ）および酸化剤−損傷ヘモグロビンの新プロテ アーゼによる分解への異なる阻害剤の効果はＬ７ｂ−リゾチームと同様な結果を 示した。

これは単一な型の活性部位がこの異なる型の蛋白質の加水分解に包含されている ことを示唆する。

ユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質がこの新プロテアーゼの同じ部位に結 合するかどうかの評価を行った（実施例１）。結果はりゾチーム、ヘモグロビン および酸化剤−処理ヘモグロビンの間に競合を示さなかった（すなわち、これら の基質はどれも［Ｊｂ　１２５１−リゾチームの分解を削減しなかった）。これ はこの新プロテアーゼがユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質基質双方を認 識する特異的結合領域を持つことを示唆する。

マルチパイン−プロテアソーム複合体 この新プロテアーゼと十分に精製したプロテアソームは両者をＡＴＰとＭｇ２＋ の存在下にインキュベートした時に１５００ｋＤａの複合体を形成することが示 された。得られた複合体はユビキチン化リゾチームを分解し、そのＵｂ−抱合体 −分解活性は抗プロテアソーム抗体との免疫沈降によって阻害されることが示さ れた。

マルチパインとプロテアソームの間で試験管内で形成された複合体は１５００ｋ ＤａのＵｂ−抱合体分解酵素または以前に網状赤血球および筋肉から単離した２ ６Ｓ蛋白質分解複合体ＵＣＤＥＮに極めて類似もしくは同一であると思われる。

これらの構造は似た大きさであり、不安定であり、そして同じヌクレオチドで活 性化される。これらは同じ基質（Ｕｂ−リゾチーム抱合体、カゼインおよびフル オロメトリックペプチド）を分解し、同じ群の阻害剤に感受性である。ここに記 載した複合体は、以前に単離したものと同様に、特徴的な２０〜３０ｋＤａプロ テアソームサブユニツトおよびマルチパインに見出される大きいポリペプチド６ 個を含む多数のより大きいサブユニットを含む。ここに形成した複合体は４０〜 １５０ｋＤａのポリペプチドを少なくとも１０〜１２個を含む（図２）。

各種の観察（実施例２）はプロテアソームとマルチパインはこの複合体中に等量 存在することを示唆する。本文に述べる事実はまたプロテアソームとマルチパイ ンはユビキチン化蛋白質のＡＴＰ−依存性分解においては相乗的に機能すること を示す。例えば実施例２に記載するように、マルチパイン単独でＵｂ　Ｉ！８ｉ −リゾチームを分解する時に、約１１残基のペプチド１種だけが１２６■−生成 物である。しかし、プロテアソーム−マルチパイン抱合体はこの基質をより迅速 に分解しく実施例２）、約３および５残基のさらに小さい＋ｕ■−ペプチドのみ を発生した。

実施例７に記載するように、プロテアソームの蛋白質分解活性を阻害する４０ｋ Ｄａのプロテアソーム調節ポリペプチドが網状赤血球から精製され、その放出が 蛋白質分解を活性化すると思われるＡＴＰ−結合蛋白質であることが示された。

単離された阻害剤は２５０ｋＤａの多重体として存在し非常に不安定（４２℃で ）ある。それはＡＴＰまたは非加水分解性ＡＴＰ類似体の添加で安定化されるが 、精製された阻害剤はプロテアソーム機能の阻害にはＡＴＰを必要とせず、ＡＴ Ｐ−アーゼ活性も持たない。この阻害剤は１５００ｋＤａの蛋白質分解複合体の 必須の構成要素に対応することが示されている。網状赤血球からＡＴＰを除くと 、１５００ｋＤａのＵＣＤＥＮは見出されない。代わりにＧａｎｏｔｈなどはＣ Ｆ＝１、ＣＦ−２およびＣＦ−３と名付けた構成要素３個を確認した。本文に記 載する単離した阻害剤は多くの点からＣＦ−２と同一と思われる。これらの知見 はこの阻害剤がＵＣＤＥＮ複合体のＡＴＰ−依存性機構において一つの役割を演 じているとの考え方を示す。例えば、蛋白質分解の間に１５００ｋＤａ複合体の ＡＴＰ加水分解中に４０ｋＤａ阻害剤を機能的に放出して一時的にプロテアソー ムの活性を表すことおよびユビキチン化蛋白質がこの機構を開始する可能性があ る。

精製された因子は実施例７に記載するようにフルオロゲン性テトラペプチドおよ び蛋白質基質の双方のプロテアソームによる加水分解を阻止することが示されて いる。この阻害剤、プロテアソームおよび部分的に精製したＣＦ−１をＡＴＰと Ｍ　ｇ２−の存在下に混合した時に、１５００ｋＤａの複合体は再構築されてＵ ｂ１２５■−リゾチームの分解が起きた。

プロテアソームの多重ペプチダーゼ活性へのこの阻害剤の単離は薬理学的介入に 魅力ある部位を与えた。続いて記載するように、これはその構造的および機能的 特徴を評価すればプロテアソーム阻害剤を開発するのに有用な情報を得ることの できる天然阻害剤を提供する。

本発明の使用 この発見は構成的過程（しばしば「基礎的蛋白質分解」とよばれる）として主に 異常または寿命の短い調節ポリペプチドの除去の役目をすると信じられている溶 解性ＡＴＰ−Ｕｂ−依存性経路の生理学的役割に関する現在法がっている見解を 変更するものである。ここに初めて示すように多くの病状や状況に特徴的に見ら れる体重の減少および負の窒素収支はこの経路を経る加速されたまたは過剰な蛋 白質分解の結果である。脱神経、絶食、発熱または代謝性アチドーシスの際に起 きる筋肉るいそうは主にこの加速された蛋白質分解による。原因となる経路と鍵 となる構成要素（たとえば、マルチパインおよび天然プロテアソーム調節剤）が 確認されたので、今では加速された蛋白質分解、従って、体重減少と負の窒素収 支を減少または除くことが可能である。ＡＴＰ−Ｕｂ−依存性経路における多重 の段階は筋肉内では絶食および脱神経により影響されるかも知れないが、調節の 一つの明瞭な点は実施例６に示すようにＵｂ−ｍＲＮＡの製造速度である。加え るに、筋肉蛋白質とユビキチンとの抱合の増加はこれらの状況下に認められてい る。

この知見はこの蛋白質分解過程を削減し、それで各種の型の癌およびエイズ、発 熱性感染症、脱神経萎縮（不活用化および不使用）、ステロイド療法および外科 手術を含む疾病に伴う悪液質のような状況における負の窒素収支および筋肉るい そうを処置するための効果的な方法の基礎とすることができる。これは激しく消 耗性で個人の治癒能力を激しく損ない得るそのような病気または状況の特徴を逆 転するか回避するために有用であることができる。殊に、ＡＴＰ−Ｕｂ−依存性 経路の部分的な阻止は処置への一方法である。これで多数の生理学的および病理 学的状況に起きる加速された蛋白質分解の削減（全部または一部）に至るが、こ の過程を経て行われる正常な分解過程には影響しない。

本文に述べる研究の結果、マルチパインは入手でき、種々の型の筋肉るいそうで は活性化されることが明らかなサイドシールの蛋白質分解経路において決定的な 役割を演じることが示された。本発明の精製マルチパインを入手できたので、既 知方法を用いてこの酵素の活性部位または蛋白質分解サブユニットの決定を可能 にした。例えば、蛋白質分解はシスタチンにより阻止されるので（Ｋ　ｉ　＜　 １　ｕＭ）ので、活性サブユニットのアフィニティークロマトグラフィーには、 パパインで行われたように、ニワトリシスタチンをリガンドとして用いることが できる。

他に　＋２５７−標識シスタチンとマルチパインとのジエチルスペルイミデート のような二官能性試薬を用いる交差結合はシスタチン−結合の構成要素の標識を 可能にするであろう。さらに、放射性ペプチドクロロメチルケトン（ＣＫ類）は 活性部位を共有結合で標識するのに用いることができる。加えるに、これらの阻 害剤を１２ｓ１で化学的に目印をつけるための方法も発展させた。閉鎖ＣＢＺ基 をＣＢＺ−Ａ　］　ａ−Ａ　ｒ　ｇ−Ａ　ｒ　ｇ−ＭＮＡから除去し、１２５Ｊ −ポルトン−ハンター試薬と反応させてこの阻害剤を高比活性に標識できること を見出した。マルチパインの活性部位は標識できる。一度、活性サブユニットが 確認されると、以下に述べるように決定的なポリペプチドをクローンできる。

他のマルチパインサブユニットの機能も決定できる。例えば、ＡＴＰ結合サブユ ニット（多分、ＡＴＰ−アーゼであろう）の機能を決定するのは興味深く、また ポリュヒキチン鎖を解重合して遊離のユビキチンを再生するイソペプチダーゼ活 性を司るサブユニットの確認は興味深い。一度活性部位またはサブユニットが確 認されると、これを結晶化し、結晶構造の特性値（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を 用いて合理的なドラッグデザインの基礎とすることができる。例えば、活性サブ ユニットをシスタチンＡのような既知の阻害剤との複合体として結晶化させ、相 互作用に関する情報を得、これを「シスタチン様」物質（シスタチン類似体であ る物質）またはマルチパイン活性部位に結合してマルチパインが個々にまたは形 成複合体の一員として作用を予防する他のマルチパイン阻害剤の設計に用いるこ とができる。阻害剤は、例えば、ペプチドまたはペプチド様の分子（たとえば、 ペプチドアルデヒド、ペプチドクロロメチルケトンまたはペプチドイソクマリン ）であり得る。マルチパイン活性部位構造の知識はマルチパインが重要な一員で あり、その活性化が、ここで最初に示したように、絶食、脱神経および感染症の 間に骨格筋に起きる蛋白質分解増加の大部分を占めるＡＴＰ−依存性蛋白質分解 過程を妨害するために用いることのできる薬品を設計できるようにするであろう 。

マルチパインの構成要素である特定のサブユニットまたはポリペプチドと特異的 に相互作用する阻害剤も造ることができる。

精製されたマルチパインはまたペプチド配列の情報を得てオリゴヌクレオチドプ ローブの製造に用い、次にこれをヒトおよび他の哺乳類のｃＤＮＡライブラリー からマルチパインをクローンするために用いることができる。精製マルチパイン の一部のアミノ酸配列は既知の方法（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、など、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ−Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ−ＬａｂｏｒｔｏｒｙｊＭａｎｕａｌ 、第２刊、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ−Ｈａｒｂｏｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ４’ｒ ｅｓｓ、１９８９）および推論されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを 用いて得ることができる。推論された配列を持つオリゴヌクレオチドは公知方法 （たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、など、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｃｌｏｎｉｎ ｇ；ａ争Ｌａｂｏｒｔｏｒ）ｚＭａｎｕａｌ、第２刊、Ｃｏ１ｄ争Ｓｐｒｉｎｇ ・Ｈａｒｂｏｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｐｒｅｓｓｓ　１９８９）を用いて製 造され、プローブにハイブリダイズする配列をヒトまたは他の哺乳類のｃＤＮＡ ライブラリーに探索するために用いることができる。ライブラリーから得たｃＤ ＮＡ配列は次に適当なベクター（たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ）に挿入し、 適当な宿主（たとえば、大腸菌に１２）で発現して組換え一製造したマルチパイ ンまたはマルチパイン構成要素に至る。この方法で製造したマルチパンの同一性 は公知技術（たとえば、物理的性質、精製マルチパインと反応することが公知の 抗体との反応、プロテアソームとの複合体形成能）で証明できる。

大腸菌でのクローン化遺伝子の発現はマルチパインの蛋白質分解サブユニットの 利用価値を増すために有用である。蛋白質分解サブユニットを活性型で得るのは 望ましいが、マルチパインの他のサブユニットはその正しい折りたたみと安定性 のために必要でありうる。このサブユニットを多量に入手できれば、これをそれ 自身としてまたはシスタチンとの複合体として結晶化できるであろう。得られる 結晶はＸ線回折分析を行い、結晶構造の情報を新薬またはマルチパインを阻害で きる既存薬品を選ぶために用いることができる。

マルチパイン遺伝子の配列を決定し、そのヌクレオチド配列に基づ（オリゴヌク レオチドプローブ（マルチパイン遺伝子を確認しまたはハイブリダイズする遺伝 子）を他の哺乳類並びに他の型の細胞中の同様な遺伝子の確認に用いることがで きる。本文中で用いる用語マルチパイン遺伝子とは前記のように製造した精製マ ルチパインをコードするＤＮＡ、マルチパインサブユニットをコードするＤＮＡ 、上記のようにして得られた精製マルチパインと実質的に同一の活性と機能的性 質を持つ蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡおよびマルチパイン遺伝 子に基づくオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするＤＮＡを含むこと が意図されている。

マルチパインと反応するか認識する抗体は公知方法を用いて製造でき、本発明の 対象でもある。ポリクロナール血清は適当な動物宿主（たとえば、ウサギ、マウ ス、サル）に精製または組換え一製造マルチパインを１回またはそれ以上注射し 、抗体生産が起きるために適当な時間後にその動物から血液を得る。モノクロナ ール抗体はＫｏｈ　Ｉ　ｅ　ｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの技術のような公知技術を用 いて製造できる。どちらの方法で製造した抗体も他の組織および他の動物におけ るマルチパインまたはサブユニットを確認するために用いることができる。

本文に述べるように、ＡＴＰ−依存性蛋白質分解（たとえば、萎縮筋肉、絶食） が強化されている状況下にはＵｂ−ｍＲＮＡ水準（すなわち、ポリＵｂ遺伝子が 特異的に誘導される）が増加する。この濃度は強化された分解が逆転した時（た とえば、再給餌）には正常に戻る。適当なオリゴヌクレオチドプローブを構築し てＵｂ−ｍＲＮＡを検出し、また正常量より多く存在するかどうか決定すること もできる。これを加速された蛋白質分解の指標として用いることができる。

マルチパイン遺伝子が発現している細胞（たとえば、それが発現している細胞系 ）を阻害剤の検定に用いることができる。また、精製マルチパインまたは組換え 一製造マルチパインは阻害剤の検定に用いることができる。潜在的マルチパイン 阻害剤のスクリーニングには潜在的阻害剤がプロテアーゼの活性を妨害する性能 を測定して実施する二とができる。例えば、潜在的阻害剤をこのプロテアーゼが ユビキチンー蛋白質抱合体を分解するのに適当な条件下にマルチパイン、ユビキ チン化蛋白質基質（たとえばユビキチン化リゾチーム）、ＡＴＰおよびＭｇ！＋ と混合する。潜在的阻害剤を除いて同じ成分を含む対照を比較の目的で用いる。

阻害剤は抱合体の分解を減らす性能によって特性解析する。微生物の培養液も同 様にマルチパインの抗生物質阻害剤の検定に用いることもできる。

マルチパイン阻害剤ならびにプロテアソーム阻害剤とＵＣＤＥＮ阻害剤は絶食、 脱神経または不使用（不活動）、ステロイド療法、発熱性感染症および他の状況 下に起きる蛋白質分解の増加原因の大部分であることが示されている非すリゾー ム性ＡＴＰ−依存性蛋白質分解を（完全にまたは部分的に）削減するために用い ることができる。本文に述べるように、シスタチンは多重性阻害剤であって個別 的にまたは７００ｋＤａのプロテアソームと共に１５００ｋＤａの複合体の一部 としてマルチパインの機能を妨げるために用いることができる。シスタチン類似 体またはマルチパインおよび／または複合体の形成を妨げる分子も使うことがで きる。

低分子量プロテアーゼ阻害剤をそれらのマルチパインを阻害する性能またはそれ がマルチパインを阻害するように修飾するための評価をすることができる。例え ば、Ｅ−６４とその誘導体は大部分のチオールプロテアーゼの強力な阻害剤であ る。しかし、それらはマルチパインを阻害できない。Ｅ−６４の多数の新類似体 と誘導体を合成しこれら、ならびに本研究に基いて設計した別の誘導体も、マル チパインを阻害する性能について検定することもできる。各種ペプチドクロロメ チルケトン類（ＣＫ類）は不可逆的にセリンおよびチオールプロテアーゼ双方に おける活性部位のヒスチジンと反応する。成る種のトリペプチドＣＫ類（たとえ ばＣＢＺ−ａ　Ｉ　ａ−ａ　ｒ　ｇ−ａ　ｒ　ｇ−ＣＫ）はマルチパインおよび １５００ｋＤａの複合体を比較的低濃度（５０ｕＭ）で不活化することが示され た。このような試薬はペプチド配列を検討して非常に特異化することができるの で、マルチパイン阻害能を評価した。評価できる他の化合物はチオールプロテア ーゼの選択的阻害剤であるペプチドジアゾメタン、複素環阻害剤であるイソクマ リンおよび種々の合成β−ラクタムを含む。予備的データはこれらの化合物のあ るものは１５００ｋＤａのＡＴＰ−依存性複合体を阻害できることを示唆してい る。

潜在的なマルチパイン阻害剤として特に興味があるものはシスタチンおよびシス タチンスーパーファミリーの構成員（ステフィンＡおよびＢ１シスタチンｃ１キ ニノーゲン）である。そのパパインとの複合体中での三次元構造およびクローン 化ヒトシスタチンＡの部位指向突然変異誘発に関する情報はマルチパインの蛋白 質分解サブユニットの性質、機構および構造さえも決定する価値ある根拠であろ う。

１５００ｋＤａの蛋白質分解複合体に対して効果的なことが判明した阻害剤のあ るものが無処置細胞で蛋白質分解を選択的に阻害することができるかどうかを決 定する必要があろう。これは以下のようにして行う：第一に、筋肉の粗製抽出物 を用いて阻害剤がＡＴＰ−ユビキチンー依存性経路全体を遮断する性能をテスト する。この研究にはモデル放射性基質と出現した遊離チロシンを測定することで 分解を容易に追跡できる内因性細胞蛋白質を用いることができる。１．　Ｃ，Ｋ ｅｔｔｅｌｈｕｔなど、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂ、、Ｒｅｖ、、４．７５ １〜７７２　（１９８８）、Ｍ、Ｔｉ５ｃｈｌｅｒなど、Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１． Ｃｈ　ｅｍ、　、２５７．１６１３〜１６２１　（１９８２）。有望な試薬は次 に無処置ラット筋肉と培養細胞についてテストして細胞間蛋白質分解に対する効 果、哺乳類細胞への浸透能、および細胞のパイアビリティ−に対する効果を評価 する。

医薬の候補をＡＴＰ−ユビキチンー依存性分解過程を阻害する性能についてテス トすることは殊に有用な方法はユビキチン依存性で分解する寿命の短い蛋白質が 生産される培養細胞中で行うものである。この過程の阻害はサイドシルに蛋白質 の蓄積をもたらす。サイドシルに蛋白質が蓄積する程度は公知方法を用いて測定 できる。例えば、この過程の潜在的な阻害剤を寿命の短い蛋白質を生産する培養 細胞に導入し、潜在的阻害剤の存在下にサイドシルに存在する酵素量の範囲を不 在下での範囲と比較する。潜在的な阻害剤存在下の酵素蓄積は被検潜在的阻害剤 によるＡＴＰ−ユビキチンー依存性過程の阻害の指標である。分解がユビキチン ー依存性である寿命の短い蛋白質（たとえば、異常なアミノ端を持ちこれが迅速 なエビキチン−依存性分解を示す突然変異β−ガラクトシダーゼのような寿命の 短い酵素）をコードする遺伝子を安定的にトランスフオームしたＣＯ８細胞のよ うな培養細胞はこの目的に利用できる。例えば、半減期が約１５分で、エビキチ ン−依存性分解を示す大腸菌から得た突然変異または組換え型β−ガラクトンダ ーゼをコードする遺伝子で安定的にトランスフオームしたＣＯ８細胞を用いるこ とができる（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ、Ａ、など、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、２３４．１ ７９〜１８６　（１９８６）；Ｇｏｎｄａ、Ｄ、に、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、　、２６４　＋１６７００〜１６７１２　（１９８９）’）。迅速に分解 される他の突然変異型酵素も使うことができる。この過程を阻害する性能を評価 すべき物質（潜在的阻害剤）の存在下の突然変異β−ガラクトシダーゼのＣＯＳ サイドシルへの蓄積はこの過程の阻害の指標である。適切な対照は潜在的阻害剤 不在下同一条件下のＣＯ８細胞である。この方法は微生物培養物または化学標本 から効果的阻害剤をめるスクリーニングに用いることができる。

蛋白質合成を遮断する物質を細胞に加えると酵素活性と抗原（蛋白質）が同様な 迅速さで消滅し、蛋白質分解への潜在的阻害剤の作用を確かめることを可能にす る。細胞成育、ＡＴＰ含量および蛋白質合成の測定は高閲に有毒な物質を確認（ または排除）するが、これは細胞からＡＴＰを除（試薬は蛋白質分解の潜在的阻 害剤であると思われるので有用である。

阻害剤処置細胞ではパルスチェイス同位元素法を用いるのが内因性の寿命の短い 蛋白質および寿命の長い蛋白質、特に寿命の長いもの、特にユビキチン依存性経 路によって分解されると知られているもの（たとえば、オンコゲン生成物ｍｙＣ またはｆｏｓ）の分解速度を追跡するのに有益であろう。

効果のあった阻害剤は次に試験管内でインキュベートしたラットでテストする。

この実験では、一方の脚のヒラメ筋または長指伸筋を阻害剤とインキュベートし 、一方、反対側の同じ筋肉を対照に用いる。この方式の大きな利点は感度が高く 、安価で、動物の同位元素標識が不要な点にある。１．Ｃ，Ｋｅｔｔｅｌｂｕｔ など、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂ、、Ｒｅｖ、　、４：　７５１〜７７２　 （１９８８）　、Ｋ、Ｆｕｒｕｎｏなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６５ ：８５５０〜８５５７　（１９９０）。経験では動物６匹で総蛋白質分解または 合成における１０〜１５％位の統計的に有意な変化を証明することは容易である 。これは筋肉蛋白質の平均代謝回転時間から計算でき、この大きさの蛋白質分解 の大きさの変化でも治療的利益があろう；もし２週間維持すれば、蛋白質分解の 削減１５％はそれ自体で脱神経筋肉の重量を少な（とも倍加するに至る。また、 筋肉重量の６０％を占め、主な生物内置白質貯蔵を代表する筋原繊維蛋白質分解 への阻害剤の効果を追跡するのも興味がある。これらの蛋白質は脱神経または絶 食で差別的に喪失する。Ｋ、Ｆｕｒｕｎｏなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、 ２６５：８５５０〜８５５７　（１９９０）。筋原繊維の構成要素の分解は筋肉 蛋白質からの３−メチルヒスチジンの放出を測定して特異的に追跡でき、これは アクチン分解のための特異的な検定法である。Ｋ、Ｆｕｒｕｎｏなど、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５　：８５５０〜８５５７　（１９９０）：　Ｂ、Ｂ、 Ｌｏｗｅ　］　］など、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、Ｊ、２３４　（１９８６）。脱神経（不使用）で萎縮進行中または絶 食またはエンドトキシン処置（発熱）動物からの筋肉をこのように研究すること は特に重要である。このような組織では総蛋白質分解は強化され、人の病気によ く似ているがよく制御された試験管内条件下で研究できる。このような標本での 効果の証明は医薬の開発過程を大いに加速するであろう。

蛋白質分解過程の阻害は筋肉るいそうが起き、背景状況を悪化させ、患者をさら に衰弱させている広範な状況に有用であろう。この状況は癌、エイズ、外科手術 または外傷後の筋肉るいそう（個体または骨格の運動不足）、感染症、あらゆる 原因による悪液質、副腎ステロイド処置および窒素収支を活性化するかまたは負 に至らせる状況を含む。

マルチパイン阻害剤は動物に起きる重量損失に対処するためにまたは成長促進剤 として作用させるために投与できる。蛋白質分解を阻害するように働くので、全 蛋白質蓄積を促進し、成長促進における蛋白質合成をより効率的にする。例えば 、それらを動物に投与して羊や牛を輸送する時のように固定するか監禁する時に 起きる輸送熱と呼ばれる筋肉量の流行病的な損失（全蛋白質分解）を防ぐ。

本発明のマルチパイン阻害剤は種々の経路（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内） で投与でき、一般に生理学的に許容し得る担体（たとえば、生理食塩水）と組合 わせて投与されよう。投与すべきマルチパイン阻害剤の量は実験的に決め、また 、用いる特定の阻害剤、個体の状況および個体の大きさおよび重量のようなもの への考慮に基づくであろう。それらは単独にまたは他のマルチパイン阻害剤また は筋肉量の損失の原因である他の経路（たとえば、リゾソーム性またはＣａ”＋ 依存性経路）の阻害剤と組合わせて投与することもできる。

本発明を以下の実施例により説明するが、これにはいかなる意味でも限定的な意 図はない。

ＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）はＷｈａｔｍａｎ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 （Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、英国）から購入した。Ｕｂ、カゼイン・アン モニウム・サルフェート（１級）、ヌクレオチドおよびＮ−サクシニル−Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（ｓＬＬＶＴ− ＭＣＡ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）からである。

記載された他のペプチドはＢａｃｈｅｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　（Ｐｈｉｌ’ ａｄｅＩｐｈｉａ、ＰＡ）からまたはＥｎｚｙｍｅ−８ｙｓｔｅ’ｍ５−Ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ　（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）からである。新たに精製したヒトヘ モグロビン（１ｍＭ）を製造し、Ｆａｇａｎ、Ｊ、Ｍ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、、２６１　：５７０５〜５７１３　（１９８６）　、ＲｉｃｅおよびＭ ｅａｎｓが記載したようにして＋４０−ホルムアルデヒドで標識した。Ｒｉｃｅ 、Ｒ，Ｈ，およびＭｅａｎｓ、Ｇ、Ｅ　ＳＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４６＋８ ３１〜８３２　（１９７２）。酸化剤−損傷ヘモグロビンを造るためにはＩ４０ −メチルヘモグロビンを蛋白質ｎｍｏ　Ｉ当り５０ｎｍｏｌの酸素ラジカル濃度 で６ｏＣＯ照射によって発生させたＯＨおよびＯ，ラジカルに曝した。Ｄａｖｉ ｓ、に、Ｊ、Ａ、　、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、２６２　：　９８９５〜 ９９０１　（１９８７）　。カゼインおよびリゾチームは以前に記載されたよう に各々１４Ｃ−ホルムアルデヒドおよび＋４１１１で放射標識した。Ｗａｘｍａ ｎなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２：２４５１〜２４５７　（１９８ ７）。

抽出物および新酵素の製造 ニューシーラント白ウサギ（４〜５ｋｇ）をＣＯ２で窒息させて屠殺、直ちに腰 筋を取出した。筋肉から脂肪と結合組織を除き、冷やしておいた肉グラインダー で潰した。筋肉量２５０ｇ　（湿重量）を２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８ ゜０）　、］、ｍＭ−ＭｇＣ＋２．０．１ｍＭ−ＥＤＴＡおよび１ｍＭ−ＤＴＴ を含む水冷緩衝液（３ｍＬ／ｇ組織）に懸濁し、ＩＬ−ワーリングブレンダーで 最高速度で１分間ホモゲナイズした。以下の処理は全て４℃で行った。ＮａＯＨ でｐＨ７，０に調整後、１１００００Ｘで３０分間遠心分離後、上澄液を１００ ０００×ｇで６０分間超遠心分離して粗製抽出物を調製した。

超遠心分離後、抽出物を２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）および１ｍ Ｍ−ＤＤＴ　（緩衝液Ａ）の中で平衡化したＤＥ−５２の１００ｍＬカラムにか けた。カラムを溶出液に蛋白質が検出されなくなるまで洗い、ＡＴＰ依存性蛋白 質分解活性の大部分を含む結合した蛋白質（画分ＩＩ）を０．５Ｍ−ＮａＣ１を 含む緩衝液Ａで展開した。溶出した蛋白質（画分ＩＩ）を硫酸アンモニウム分別 に付した。

遊離のプロテアソームを他の活性から分けるために、筋肉画分ＩＩを３８％飽和 とし、４５分間撹拌した。不溶性蛋白質を１１００００ｘで２０分間遠心分離に よって単離し、次に０〜３８％ペレットを２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７ ゜０）　、１ｍＭ−ＤＤＴに懸濁した。同一緩衝液で完全に透析後、この両分を 濃縮し、２０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）で平衡化したＰｈａｒｍａ ｃｉａモノＱカラム（ＦＰＬＣ）にかけた。Ｕｂ　１２５１−リゾチームを分解 した画分（図ＩＡ、ピーク１および２参照）を集め、濃縮し、モノ０分別に用い たのと同じ緩衝液に１５０ｍＭ−ＮａＣ１を含むもので平衡化したＰｈａｒｍａ ｃｉａスペロース６ゲル濾過カラムにかけた。新酵素の一回の製造にはモノＱカ ラム処理３回分を含み、これらからの活性画分をゲル濾過まで集めておいた。ス ペロース６カラムからの活性画分を集め、濃縮し、以下に記載するように次の実 験に使用した。

塊！ 指摘した所（下記参照）を除き、全ての酵素的検定には直線性があった。検定に ＡＴＰが存在する時は２ｍＭであった。特段の記載がない限り、全検定でカラム からの両分５０μＬまたは精製プロテアーゼ（１０μｇ）を５０ｍＭ−トリス− ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ−ＭｇＣ１２，１ｍＭ−ＤＴＴおよび放射 性蛋白質５μｇ、Ｕｂ−抱合体０．５μｇ、またはフルオロゲン性ペプチド０． 　５ｍＭを含む２００μＬ中でインキュベートした。蛋白質分解の検定では、反 応混合物はＵｂ−リゾチームまたは標識蛋白質的１５０００ｃｐｍを含んでいた 。＋２５１−リゾチーム、Ｕｂ　１２５Ｉ−リゾチーム、１４Ｃ−カゼイン、１ ４Ｃ−ヘモグロビンおよびＯＨ／　０２−処理１４Ｃ−ヘモグロビンの分解は３ ７℃で６０分間インキュベーション後、酸溶解性放射能の生成を測定して検定し た。Ｕｂ−＋２５１−リゾチームは肝画分ＩＩを用い、ＨｏｕｇｈとＲｅｃｈｓ ｔｅｉｎｅｒの方法に従って製造した。Ｈｏｕｇｈなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、２６１＋２４００〜２４０８　（１９８６）　。Ｈｏｕｇｈ、Ｒ，および Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ、、Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１．　Ｃｈｅｍ、、　２６１ 　：　２３９１〜２３９９　（１９８６）　、”’１リゾチームとＵｂは以前に 記載されている方法に従って製造した。Ｗａｘｍａｎなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、　、２６２　＋２４５１〜２４５７　（１９８７）、Ｆａｇａｎなど、旧 ｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４３：３３５〜３４３　（１９８７）。

抱合体の濃度は抱合体合成に用いた１２６１−リスキソチームの特性放射能に基 づＬ＼て算出した。１単位のｓＬＬＶＴ−ＭＣＡは３０分間に生成する１０ｎｍ ｏｌのＭＣＡを表す。

蛋白質はＬａｅｍｍｌｉが記載したように５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％ポリアク リルアミドゲル）によって分析した。Ｌａｅｍｍｌ　ｔ、Ｕ、に、Ｎａｔｕｒｅ 　（Ｌｏｎｄｏｎ）、２２７：６８０−６８５　（１９７０）、ゲルはクーマシ ーブリリアントブルーＲ−２５０で着色した。非変性ゲルを以前に記載されてい るように処理した。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ　とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、 Ｊ、Ｂｉ。

］、Ｃｈｅｍ、　、２６５　：　４７８９〜４７９２　（１９９０）。

免疫学的方法 免疫沈殿は抗プロテアソームＩｇＧ（１００μｇ）と蛋白質Ａ−セファロースを 以前の記載のようにインキュベートして行った。Ｍａ　ｔ　ｔｈｅｗｓなど、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ｉ、ＵＳＡ、８６：２５９７〜２６０ １　（１９８９）。対照免疫沈殿はＨｙｃｌｏｎｅおよび抗ゴルジーモノクロナ ル５３ＦＣ３を用いて行った。精製ヒト肝プロテアソームに対するモノクロナル 抗体２−２４　（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、Ｕ、に、Ｎａ　ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ ）２２７　：６８０〜６８５　（１９７０）’）はに、ＴａｎａｋａとＡ、Ｉｃ ｈｉｈａｒａ　（徳島大学、日本）の厚意により提供された。精製ヒト肝プロテ アソームに対するポリクロナル抗体はＴ、ＥｄｍｕｎｄｓとＡ、Ｌ、Ｇｏｌｄｂ ｅｒｇによってウサギ中に生成した。Ｍａｔｔｈｅｗｓなど、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：２５９７〜２６０１　（１９８９）。免 疫プロッティング用には蛋白質を１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上電気 泳動させた。蛋白質をニトロセルロース紙（Ｈｅｒｓｈｋｏなど、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７　：１７８３〜１７８６　（１９８０ ）。に写した後、以前の記載のように免疫プロッティングを行った。Ｈｏｕｇｈ など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：　８３０３〜８３１３　（１９８ ７）　、Ｈｏｕｇｈなど、ユビキチン（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ　編）中、 １０１〜１３４頁、Ｐｌｅｎｕｍ−Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ　（１９８８ ）。

本実験では、使用した基質はＵｂに抱合したＩＨ■−リゾチームであり、肝臓抽 出物を用いてＨｏｕｇｈとＲｅＣｈＳｔｅｉｎｅｒによって記載されたように（ Ｈｏｕｇｈなど、Ｊ、Ｂ　ｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、２６１　：　２４００〜２ ４０８　（１９８６）　、Ｈｏｕｇｈ、Ｒ，およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ 、　、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、　、２６１　＋　２３９１〜２３９９　（１９８６））　して製 造した。このユビキチン化蛋白質は粗製抽出物中では低速で分解されたが、画分 ＩＩ（ＤＥＡＥ−セルロースに結合し、ＡＴＰ依存性分解系を含む両分）はこの 基質を迅速に加水分解して酸−溶解性生成物とした（表Ｉ）。この過程は２時間 直線的であり３ｍＭ−ＡＴＰの添加により２〜３倍に加速された。対照的に、非 加水分解性ＡＴＰ類似体であるＡＭＰ−ＣＰＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰ、またはＭ ｇ！７在時のＡＴＰ　（および１ｍＭ−ＥＤＴＡ存在下）はＵｂ−抱合蛋白質の 分解を刺激しウサギ骨格筋から得たユビキチン化リゾチームを分解する５００ｋ Ｄａのプロテアーゼの精製方式 ％式％ モノＱカラムの容量が小さいので、ＤＥ５２から得た物質の独立な製造が３回必 要であった。実施例１記載の通り、各製造からの活性成分をゲル濾過前に集めた 。

Ｕｂ−抱合体を分解する活性を単離するために、画分ＩＩを硫酸アンモニウム沈 殿に付した。３８％（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和ではプロテアソーム複合体は大部分 可溶のままであった。Ｗａｘｍａｎなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２ ＋２４５１〜２４５７　（１９８７）　、Ｄｒ　ｉ　ｓ　ｃｏ　Ｉ　］、Ｊ、と Ｇｏｌｄｂｅｒｇ。

、Ａ、Ｌ、、Ｊ、Ｂ　ｉｏ　］、Ｃｈｅｍ、　、２６５　：　４７８９〜４７９ ２（１９９０）。

蛋白質ベレットは再呼濁し、透析し、モノＱ−Ｆ　ＰＬＣ（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　 ｃ　ｉ　ａ）を用いたカラム上クロマトグラフした。Ｕｂ　１２５Ｉ−リゾチー ム分解活性のピーク２個を見出した。小さいピークが約１００ｍＭ−ＮａＣＩで 、また、活性がより大きい第２のピークは２４０ｍＭで溶出した。ピーク１はリ ゾチームとカゼインに対するかなりの分解活性も示し、この過程もＡＴＰによっ て５倍近くも加速された（図１）。スベロース６　（ＦＰＬＣ）上のゲル濾過で 、見掛けの分子量１０００と１５００ｋＤａの分子量を示した。それで、これは 解離していないＵＣＤＥＮかメガパイン複合体に対応するであろう。しかし、こ の構造は非ユビキチン化すクソチームを多分Ｕｂ−抱合体蛋白質を分解するのと 同様な容易さで分解することは注目に値する。

Ｕｂ−リゾチームの加水分解に加えて、ピーク２はＡＴＰ−刺激性のりゾチーム 分解を示したが、後者の活性はピーク１のそれよりも小さかった。ピーク２は６ ０Ｃｏｕ射により発生する０Ｔ−１および０２ラジカルとの接触により損傷され たヘモグロビン（Ｈｂ）に対して強い蛋白質分解活性も示した。この酸化剤−損 傷へモグロビンは天ｉＨｂのそれよりもずっと速かった。さらに、酸化剤−損傷 Ｈｂの分解はＡＴＰには非依存性であった。以前に、赤血球では、酸化剤−損傷 へモグロビンもＡ　Ｔ　Ｐまたはプロテアソームも必要ない過程で迅速に分解さ れることが見つかっていた。しかし、ピーク２はいずれもプロテアソームの基質 であるＩＣ−カゼインまたはサクンニルーＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｙｒ− ＭＮＡ。

ザク／ニル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＭＮＡ　（ＭＮＡはメチルナフチルアミ ンの略号である）　、Ｚ−Ｇａｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ、Ｚ−Ａｈａ−Ａｒｇ−Ａｒ ｇ−ＭＮＡ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−βＮＡ、グルタリルーＡｈａ−Ａｌ ａ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−ＭＮＡ、　Ａ　ｒ　ｇ−Ａ　ｒ　ｇ−ＭＮＡおよびＺ−Ｇ 　Ｉ　ｙ−Ｇ　］　ｙ−Ａ　ｒ　ｇ　−ＭＮＡを含む幾つかのオリゴペプチドに 対して殆どまたは全（活性を示さなかった。

ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡに対してＡＴＰ＝刺激性活性を持つピーク二個が見出された 。ピーク３は３２０ｍＭ−で溶出され、ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ、リゾチームおよび カゼインに対してＡＴＰ−刺激性活性を、また天然または０Ｈ１０”処理ヘモグ ロビンのＡＴＰ非依存性分解を示した。スペロース６　（ＦＰＬＣ）上のゲル濾 過で、このピークは見掛けの分子量約３ＱＱｋＤａで溶出された。この活性は新 プロテアーゼまたはより確からしくはプロテアソームのフラグメントを示すであ ろう。ピーク４は普通は３８〜８０に硫酸アンモニウムで沈殿する画分を同じモ ノＱカラムで展開するとプロテアソームが溶出される所である４３０ｍＭに見出 された。それて、そのＭｒ　（６００ｋＤａ）およびｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ分解能 の点でピーク４はプロテアソームに類似しているが、理由は不明であるが蛋白質 （リゾチーム、カゼインまたはヘモグロビン）を分解しない。

後続する研究をピーク２に集中したのは、ＡＴＰ−刺激性ユビキチン化リゾチー ム分解の殆どを占め、酸化剤−損傷ヘモグロビンに対して強い活性を持つが、プ ロテアソームに対する特徴的な基質であるｓＬＬＶＴ−ＭＣＡには殆ど活性を示 さなかったからである。この活性をさらにスペロース６ゲル濾過カラムを用いる ゲル濾過で精製して、分子量約４４００００の単一の活性ピーク（図２）が得ら れた。セファロース３００上の分析用ゲル濾過では、見掛けの分子量５４０ｋＤ ａを示した。

Ｕｂ−抱合体分解活性を持つ主プロテアーゼの迅速な単離のために用いる段階を 表１にまとめた。純度を評価するために、ＡＴＰ−刺激性ピークを非変性条件下 のＰＡＧＥに付した。非変性ゲル上で単一バンドとして精製プロテアソームより も有意に遠くまで（１０〜１５ｍｍ）移動した（実施例２参照）。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ分析では、精製プロテアーゼはＭｒ値が５００００と１５００００の間の主 すブユニットバンド少なくとも５個の組合せを示しく図３）、プロテアソームに 特徴的な２０〜３０ｋＤａバンドをどれも含まなかった。以前に、Ｈａ　ｕ　ｇ ｈなどは網状赤血球からの巨大な抱合体−分解性複合体の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 が高分子量サブユニット少なくとも６から１０個（４５と１１５ｋＤａとの間） を示したと報告し、Ｗａｘｍａｎなども部分的に精製した標品では４３と１１０ ｋＤａの間の領域にある王ポリペプチド１０がら１２個を観察した。そこで、こ の新プロテアーゼは非常に大きなｃｏｍｐｌｅｓの中に含まれるサブユニットを 持つと思われる（実施例２参照）。

５００ｋＤａの酵素の触媒的性質 ゲル濾過後（図２）　、５００ｋＤａのピークはモノＱクロマトグラフィー後と 同じ活性を示した。Ｕｂ−リゾチームの加水分解は２ｍＭ−ＡＴＰの添加で５倍 に、リゾチームの分解は３倍に刺激された。一方、天然および酸化剤−損傷ヘモ グロビンは共にＡＴＰには非依存性（粗製抽出物中と同様）であり、酸化剤−処 置基質は天然ヘモグロビンよりも１５倍速く分解された。これらの基質では、Ｕ ｂ１２ｆｉｌ−リゾチームと１２５Ｉ−リゾチームでと同様に、この酵素は鋭い 至適ｐＨ７８を示した。この活性はｐＨ７，０または１０．０では約５０％に減 少し、ｐＨ５，０以下または１２０以上では明確な活性はなかった。

ｕｂ−抱合蛋白質の多量調製が困難なため、標準検定で用いたユビキチン化リゾ チームの濃度はｉｎ離リゾチームのそれよりも約１０倍（＋２Ｊ−リゾチームと モル量を比較しこ時）低かった。けれども、この新プロテアーゼはユビキチン化 したりゾチームをユビキチン化しないものと殆ど同じ位速く分解した（表ＩＩ） 。

表１１ プロテアソームおよび新プロテアーゼによる異なる基質の分解に関する抗プロテ アソームモノクロナール抗体との免疫沈殿の効果ユビキチン化 リゾチーム　リゾチーム　カゼイン −ＡＴＰ　＋ＡＴＰ　−ＡＴＰ　＋ＡＴＰ　−ＡＴＰ　＋＾ＴＰ対照抗体　６１ ２　１８７２　７　８　２１７　８５６抗プロテアソ一ム抗体　４１　１０５　 ０　Ｑ　３２　７４新プロテアーゼ 対照抗体　７９２９２　４１１９０　０　０抗プロテアソ一ム抗体　７０２８１ 　３６１７９　０　００Ｈ１０２処理 ヘモグロビン　ヘモグロビン　ＳＬＬＶＴ−ＭＣＡ−ＡＴＰ　＋＾ＴＰ　−ＡＴ Ｐ　＋＾ＴＰ　−ＡＴＰ　＋＾ＴＰ対照抗体　４５　５１　９２７　８ｇ６　０ ．８　３．７抗プロテアソ一ム抗体　０　０　３１　３６　０．１　０．１新プ ロテアーゼ 対照抗体　１９　１７　２６３　２７０　０．１　０．２抗プロテアソ一ム抗体 　１５　２２　２６７　２５６　０．１　０．１リゾチームの二つの型が同じ濃 度で存在する時、１２５Ｉ−リゾチームよりＵｂ−１２Ｊ−リゾチームは約３倍 速（分解される（図５）。これらの知見はユビキチン化基質に対する新プロテア ーゼの明瞭な優先性を示すが、プロテアソームとは対照的に、ｔＪｂ−抱合体に 対しては、あるとしても掻く僅かの活性しか示さなかった。この蛋白質分解反応 の性質を解明するために、このプロテアーゼによってＵｂ　０５１−リゾチーム から発生する酸溶解性生成物の大きさを測定した。Ｇ２５ゲル濾過カラム（０， ２Ｍ−酢酸Ｎａと０．１Ｍ−ＮａＣ１で平衡化）上のクロマトグラフィーＩこよ り、酸溶解性断片は標準ペプチドである物質Ｐにより決めると概略分子量１３０ ０Ｄになる単一の鋭いピークとして溶出した。それで、この酵素はエンドペプチ ダーゼであり、エキソペプチダーゼ活性を欠くと思われる。

この新プロテアーゼがプロテアソームと共通の構成要素を持つがどうかをテスト するために、ヒト肝粒子に対するモノクロナール抗体（Ｍａｔｔｈｅｗｓなど、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：２５９７〜２６０１ 　（１９８９）表ＩＩ）またはラット肝プロテアソームに対するポリクロナール 抗体を用いた。両抗体との免疫沈殿はリゾチーム、Ｕｂ−リゾチームまたは酸化 剤−処置ヘモグロビンに対して検定した場合は新酵素の活性に影響しながったが 、これらの処理は精製したウサギ筋肉プロテアソームを１４ｃ−カゼインまたは ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ　（表ＩＩ）で検定した場合は定量的に沈殿した。（これら の種々のプロテアソーム活性は抗体によって直接阻害されないが、こレラの実験 では、これらの活性は共に蛋白１ｆｔＡ−セファロースとの沈殿によって除去し た）。交差活性がこれらの多重体プロテアーゼの間にないことはウェスターンプ ロットにより確認したが、モノクロナールまたはポリクロナール抗体はこの新プ ロテアーゼとは反応しなかった。

ヌクレオチド効果 表ＩＩＩはｌＪｂ　１２Ｊ−リゾチームの骨格筋から得たこの新活性による分解 に対するヌクレオチドの効果を示す。この検定では、セファロース６クロマトグ ラフイーから得た活性ピークをＵｂ　１２Ｊ−リゾチームと３７℃で１時間イン キュベートした。反応混合物はヌクレオチド２ｍＭまたはＰＰ１１ｍＭを含有し ていた。表ＩＩＩに示すように、Ｕｂ＋２５４−リゾチームの精製酵素による加 水分解はＡＴＰにより７倍まで加速された。対照的に、ＡＤＰまたはＡＭＰまた は無機燐酸塩はこの過程に有意な効果を持たなかった。非加水分解性ＡＴＰ類似 体であるアデニル−５°−オイル−イミドジホスフェート（ＡＭＰ−ＰＮＰ）お よびアデノノン５゛−〇−チオトリホスフエート（ＡＴＰ−γ−８）では刺激性 は見られなかった。故に、この反応はＡＴＰの加水分解を要求し、ＡＴＰ開裂プ ロテアーゼである大腸菌からのＬａ　（］ｏｎ）およびＴｉ（ｃｌｐ）およびミ トコンドリアならびにプロテアソームの迅速単離型について知られているのと同 様である。

表ＩＩＩ 骨格筋からの新活性によるＵｂ−′２５１−リゾチームの分解に関するナン　１ ００　ＡＴＰ−γ−８１０３ ＡＴＰ　７４３　ＣＴＰ　３７３ ＡＤＰ　１１３　ＧＴＰ　４３５ ＡＭＰ　１３０　ＵＴＰ　１０８ ＡＭＰ１０８Ａ　９０　ＰＰｉ　１１８反応反応物はヌクレオチド２ｍＭまたは ＰＰ１１０ｍＭを含んでいた。

ＡＴＰ不在時には、精製酵素によるＵｂ−抱合体の加水分解は少なくとも２時間 直線的てあり、ＡＴＰを加えると何倍も促進された（図５）。故に、この効果は ＡＴＰ加水分解を経る真の活性化を含み、単なる酵素の安定化ではない。また、 ＡＴＰによるユビキチン化および非ユビキチン化リゾチーム分解の活性化には約 ２０分の誘導期が先行するのは注目に値する（図５）。この面白い誘導期は明ら かにＡＴＰの刺激性効果に関する、何故なら直線的過程であるこれらの基質また は酸化剤−損傷ヘモグロビンのＡＴＰ−非依存性分解にはラグタイムは見られな い。この興味をそそる時間依存性の根拠は不明であるが、ある別の構成要素の喪 失によると思われる。同様な効果は真核細胞または原核細胞にある他のＡＴＰ− 依存性蛋白質分解酵素では観察されていない。

ＡＴＰ要求性はＣＴＰまたはＧＴＰでも部分的に満たすことができ、蛋白質分解 には大体４倍の刺激が起きる（表１１１）。それで、このヌクレオチド要求性は １５００ｋＤａの複合体によるＵｂ−抱合体分解のヌクレオチド特異性に関する 前記知見に似ている。このヌクレオチド効果もプロテアソームのＡＴＰ依存型に より必要とする効果とは異なり、そこでは非加水分解性類似体を含むヌクレオチ ドトリホスフェートはどれもペプチド基質の加水分解を活性化できたが、この蛋 白質分解の刺激性はＡＴＰのみで見られた。

異なるＡＴＰ濃度を研究した時、抱合体分解の最高の刺激性は１ｍＭで観察され た。このデータはＡＴＰのに、は０．５ｍＭまたはそれ以下であり、これは細胞 間のＡＴＰ濃度より十分に低い。それで、この活性化は生理学的であり、このに 、は培養細胞での以前の観察に符合して、細胞ＡＴＰの枯渇は蛋白質分解を阻害 するが、これはＡＴＰ濃度が極端に低下（〉７５％）した時にのみ見られる。

この酵素自身は全く不安定である。ＡＴＰ不在下に４０℃で貯蔵する時、Ｕｂ− 抱合体に対する蛋白質分解活性が進行的に喪失する。−７０℃でも、Ｕｂ抱合体 リゾチーム、非ユビキチン化リゾチームまたは酸化剤−損傷ヘモグロビンを分解 する性能は全て３〜４日に５０％まで減少した。この迅速な不活性化はＡＴＰま たは非加水分解性類似体ＡＭＰ−ＰＮＰの存在により予防できた。グリセロール の添加は粗製抽出物とプロテアソームのＡＴＰ−依存性分解系を安定化するが、 この活性の進行性損失も予防して６日後にも酵素の完全な機能を残した。ヌクレ オチドとグリセロールがこの酵素を安定化させる性能は４０℃でも観察されたが 、不活性化はもっと速かった。プロテアソームのＡＴＰ−依存型も不安定でヌク レオチドで安定化される；しかし、これらのプロテアーゼ複合体２個の不安定性 は全（異なる。プロテアソームは時間とともにＡＴＰ依存性を失い、すぐに活性 になるが、この新酵素はＡＴＰ不在下には活性を失うだけである。加えるに、Ｓ ＤＳや脂肪酸のような洗剤は、プロテアソームを刺激するが、この新酵素は不活 性化（表ＩＶ）Ｌ、これはずっと不安定な構造であると思われる。

表ＩＶ 新プロテアーゼの種々の活性および骨格筋からのプロテアソームに対する添加Ｕ 　ｂ　−１，１リゾチ０１１１０！−処理　５ＬＬＶＴゾチーム　−ム　へモグ ロビン　−ＭＣＡ相対活性（％） なし　１００　１００　１００　１００１００ＤＦＰ（１９６９２９１１８ ンスタチンＡ（４ｕｊｌ）　３０　２４　２７　９３ヘミン（０，１ｍＭ）　Ｏ ロ　７Ｏ Ｎ　Ｅ　Ｍ（１ｍＭ）　２９　２７　３０　３７０イペブチン（０１園Ｍ）　６ ９　７２　７３　８３Ｅ　６４　（０，１ｍＭ）　１００　１００　１００　１ ００オレイン酸Ｎａ（０，１２５ｍ１ｌ）　２９　３４　４０　１７９Ｓ　Ｄ　 Ｓ　（０，０１ｉ＋ｌｌ）　４４　４６　４２　１２５０−フェナントロリン（ ０，１ｍＭ）　４８　５５　５４　６０新プロテアーゼは３７℃で１時間蛋白質 基質および２ｍＭ−ＡＴＰとインキュベートした。スベロース６クロマトグラフ イーにより得たプロテアソームはｓＬＬＶＴ−ＭＣＡとインキュベートした。基 質を加える前に混合物を１０分間２０℃でブレインキュベートした。ＤＦＰはＤ ＭＳＯに溶かし、その最終濃度（１％）は酵素活性には影響がなかった。

新ＡＴＰ−依存性プロチアーゼをさらに特徴付けるために、種々の型の酵素阻害 剤をテストした（表ＩＶ）。セリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤であるジイソ プロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）は抱合体分解に影響しなかった。

重金属をキレートする０−フェナントロリンはい（らかの阻害を示した。対照的 に、チオール閉鎖剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）および多数のパパイ ン様チオールプロテイナーゼの強力な阻害剤である卵白シスタチン（シスタチン Ａ）はこの活性を強く阻害した。同様な阻害は関連するヒトのポリペプチドであ るステフィンＡでも観察された。シスタチンの同様な効果は以前にウサギ筋肉か らの巨大なＵＣＤＥＮ複合体に対するＡＴＰ＋Ｕｂ−依存性蛋白質分解について 報告された。ステフィンＡによる阻害に生理学的な興味があるというのは、多数 の哺乳類組織には同族的蛋白質阻害剤が存在するからである。同様な濃度で、シ スタチンＢは５５％阻害を示し、シスタチンＣでは有意な効果は検出されなかっ た。この新活性はチオールプロテアーゼであると思われるが、共に多数のチオー ル型プロテイナーゼ（たとえばリソソームの酵素またはカルパイン類）の阻害剤 であるリューペブチンの存在で３０％程が阻害され、Ｅ６４では全くなかった。

しかし、リューペブチンとＥ６４の感受性は定着結合に先行する配列に強く影響 され、それらが感受性であるのはチオールプロテアーゼの全てではない。ＡＴＰ −Ｕｂ−依存性蛋白質分解系を完全に阻害できるヘミンおよびプロテアソームも この新プロテアーゼによる抱合体−分解活性を阻害する（表ＩＶ）。

これらの知見はこの新酵素はその活性部位にチオール残基を持つことを示唆する 。従って、ノチオスレイトールはその活性を促進し、酵素機能の維持に必要であ る。効果的阻害剤のパターンは明らかにこの活性をプロテアソームのものと区別 し、後者では活性化された時多重の触媒部位（必須のスルフヒドリル基も持つが ）を持つセリンプロテアーゼとして働（（表ＩＶ）。表ＩＶに示すように、１２ ５Ｉ−リゾチームおよび０Ｈ１０Ｙ２−一処理＋４（−ヘモグロビンの分解につ いて異なる阻害剤の効果も比較した。これらの物質についてはよく似た阻害プロ ファイルが得られたのは、Ｕｂ−リゾチームと同様であった。それで、これら異 なる型の蛋白質の加水分解には単一な型の活性部位が含まれていると思われる。

酸化剤−損傷ヘモグロビンの分解はＡＴＰに非依存的であり、一方ユビキチン化 および非ユビキチン化リゾチームはヌクレオチド加水分解を要求するが、単一の 酵素複合体がこれら三基質の分解を司っていると見えるのにはい（つかの理由が ある：ａ）三活性は同時に精製された（図１および２）、ｂ）ＡＴＰおよびグリ セロールが３つの全てを同様な仕方で安定化した。Ｃ）これらの異なる活性が同 様な至適ｐＨを持っていた。ｄ）シスタチンおよび他の阻害剤がＵｂ−抱合体の 分解を削減する性能が他の蛋白質の分解を阻害する性能に関連付けられた。これ らのデータの最も簡単な解釈はこれらの３基質は単一の活性部位または単一な型 の部位によって分解されることであろうと思われるが、ＡＴＰがあるものの分解 を促進するのになぜ全部の基質はしないのかが理解し難い。

ユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質が同一の部位に結合されるかどうかテ ストするため、リゾチーム、ヘモグロビンまたは酸化剤−処理ヘモグロビンの飽 和濃度（５から２５μｇ）の存在下に精製酵素を３７℃で１時間インキュベート した。これらの基質はどれもＵｂ−Ｉ２ＳＩ−リゾチーム（リゾチーム領　５μ ｇを含有）の分解を削減しなかったが、非標識リゾチームおよび酸化したヘモグ ロビンは類似体の放射性蛋白質の分解を直線的に減らした。加えるに、この濃度 ではりゾチームと酸化剤処理ヘモグロビンとの間には競合は検出されなかった。

これら三基質の間に競合を証明できなかったことはこのプロテアーゼが特有の結 合領域を持ち、これらの異なる蛋白質基質を認識し、さらにＵｂ−リゾチームの 分解には遊離のりゾチームの発生を含まないことを示唆する。

プロテアソームとの会合 Ｕｂ−抱合リゾチームを分解する性能があるので、この酵素は１５００ｋＤａの ＵＣＤＥＮ複合体の構成要素であろう。事実、この新酵素はその大きさとクロマ トグラフィー的挙動が網状赤血球からの成分子ＣＦ−ＩＪと似ている。もしそう なら、ＡＴＰの存在下にプロテアソームと複合体を形成する筈である。この仮説 を試すために、マルチパインと十分に精製した筋肉からのプロテアソーム略等量 をＭｇ２’″−ＡＴＰの存在または不在下に３７℃でインキュベートした。スベ ロース６ゲル濾過後に得た活性ピーク（各１ｍｇ蛋白質）を１ｍＭ−Ｍｇ−ＡＴ Ｐ存在下に３０分間インキュベートした後、同じスペロース６カラムにかけた。

流速領　１ｍＬ／分で１．ＱｍＬ画分を集めた。標品をＵｂ−Ｉ２ｓ■−リゾチ ームについて測定した。

図５に示すように、Ｍｇ”−ＡＴｐ存在下のプレインキュベーションは１３０Ｑ ｋＤａの複合体を形成させ、これもユビキチン化リゾチームを分解した。ＡＴＰ またはＭ　ｇ　２’を除くか（図５）　、ＡＴＰを類似体ＡＭＰ−ＰＮＰで置き 換えると複合体は形成せず、５００および７００ｋＤａの酵素の分解が起きた。

もしプロテアソームが含まれないとＭｇ”−ＡＴＰとインキュベーションしても マルチパイン活性の大きさは変化しなかった（データは示してない）。この観察 は５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンプロット分析で示唆されたようにマルチ パイン標品がプロテアソームを含まない筈であることを確認し、ＡＴＰによる活 性化の誘導期（図４）は分子間会合ではないことを示す）。最後に、試験管内で 形成したｔＪｂ−抱合体−分解活性は抗プロテアソーム抗体との免疫沈殿によっ て阻止できたのは天然複合体についての前記研究と同様である。

基質（＋２Ｊ−リゾチーム、ユビキチン化＋２５１−リゾチーム、＋４（−メチ ルヘモグロビンおよびＯＨおよび０□ラジカルで損傷した＋４０−メチルヘモグ ロビン）は実施例１に記載のように製造した。

筋肉抽出物の分別−ニュージ−ランドホワイト（４〜５ｋｇ）雄ウサギ（Ｍｉｌ 　１ｂｒｏｏｋ−Ｆａｒｍｓ、ＭＡ）からの大腰筋を処理し、ボスト−ミトコン ドリア抽出物を作製、実施例１のようにＤＥＡＥ−セルロースで分別した。ＤＥ ＡＥセルロースに吸着し、０．５Ｍ−ＮａＣ１（画分ＩＩ）で溶出した蛋白質を （ＮＨ４）２ＳＯ，で分別して遊離のプロテアソーム（３８〜８０％）を他の活 性（０〜３８％）から分離した。両面性を濃縮し、別々にファルマシアのモノＱ カラム（ＦＰＬＣ）にかけた。プロテアソームとマルチパイン画分をさらにＰｈ ａｒｍａ　ｃ　ｉ　ａのスペロース６ゲル濾過カラムにかけ、活性画分を集めて 以下の実験に用いた。

暫 １２５１−リゾチーム、ｕｂ　１２５１−リゾチーム、１４Ｃ−カゼイン、＋４ ０−へモグロピンおよび０Ｈ１０２−処理１４Ｃ−ヘモグロビンの分解は実施例 １およびＴａｎａｋａと協力者の記載のように検定した。Ｔａｎａｋａ、に、な ど、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、、２６１　：　１５１９７〜１５２０３　（１９８６）　。検定 は全て２時間の間直線的であった。特段の記載がない限り、検定には５０μＬづ つのカラム画分または精製プロテアーゼ（５μｇ）を５ＱｍＭ−トリスＨＣＩ　 （ｐＨ７゜８）　、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２．１ｍＭ−ＤＴＴおよび放射性蛋白質 ５μｇ、１２５Ｉ−リゾチーム抱合体０．５μｇまたはＱ、５ｍＭ−フルオロゲ ンペプチドであるサクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｔｒｙ−７−アミド −４−メチルクマリン（ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ）２００μＬ中でインキュベートし た。Ｕｂ−抱合体の量はＵｂに結合した１２５Ｉ−リゾチームの放射能に基づい て算出した。ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡ１単位は３０分間に生成するＭＣＡｌｏｎｍｏ 　ｌを示す。

電気泳動 蛋白質はＢｒａｄｆｏｒｄの方法で検定した。（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、７２：２４８〜２５４　（１９７６））、蛋白 質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％ポリアクリルアミド）によりＬａｅｍｍｌｉの 方法（Ｐｉｃｋａｒｔ、Ｃ，Ｍ、など、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、、２７２：１１４〜１２１　（１９８９）　）を用いて分析し、クーマジ ーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。４％ポリアクリルアミドゲル非変 性電気泳動を前記実施例１とＤｒｉｓｃｏｌｌとＧｏｌｂｅｒｇに記載のように 行った。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ、とＡ、Ｌ、Ｇｏｌｂｅｒｇ、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈ ｅｍ、、２６５：４７８９〜４７９２　（１９９０）。

墾 プロテアソームとマルチパインとの間の複合体形成これら二つのＡＴＰ−活性化 プロテアーゼがｕｂ−抱合体を分解する大きし１複合体を形成する性能を以下の ように検討した。マルチノくインをスペロース６ゲル濾過で得、これをプロテア ソーム画分と共にＡＴＰとＭｇ２４の存在または不在下に３０分間３７℃でイン キュベート後、同じゲル濾過カラムにかけた。この条件ではプロテアソーム（７ ００ｋＤａ）およびマルチパイン（５００ｋＤａ）活性の大部分を１５００ｋＤ ａで溶出する大きい型への変換に導いた。大きいピークは”Ｉ−Ｕｂ−リゾチー ム、１２５Ｉ−リゾチーム、ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡおよび”Ｃ−カゼインのＡＴＰ −活性化加水分解を示した。

Ａ　Ｔ　ＰとＭｇ２＋を除くか非ＡＴＰ類似体であるＡＭＰ−ＰＮＰをＡＴＰの 代わりに加えると複合体形成は完全に阻止された。この知見はヌクレオチド加水 分解が二酵素の会合に必要であることを示唆する。プロテアソームとマルチパイ ン双方が１３００ｋＤａの複合体の形成に必要であった：事実、これらの酵素の どちらも単独にインキュベーションした時はＡＴＰとＭｇ”の存在下でも大きい 複合体を形成する傾向は示さなかった。ここで単離されるように、プロテアソー ムとマルチパインの両プロテアーゼは貯蔵するにはとても不安定であったが、Ａ ＴＰとグリセロールは幾分かの安定化を起こさせた。ＡＴＰとＭ　ｇ２−の不在 下では、プロテアーゼおよびペプチダーゼ活性が減少してカラムから回収され、 ＡＴＰ非依存性のものの増加が観察された。常法通り、スペロース６ゲル濾過カ ラムにかけて、へＴＰを含まない緩衝液中で大きい複合体を単離した：しかじ、 ゲル濾過を反復した時にも複合体は明確には解離しなかった。そこで、４℃では 、ＡＴＰはプロテアソームとマルチパインの会合を維持するために必要であるに 違いない。

種々の観察は、マルチパインとプロテアソームが複合体中に等量含まれているこ とを示唆する。例えば、会合反応では、もしマルチパインまたはプロテアソーム 画分が半減すると、特定の組成を持っている複合体から予期されるように複合体 形成も大体半分に減少した。１・１会合は複合体（７００ｋＤａプラス５００ｋ Ｄａ）のゲル濾過およびＳＤＳゲルパターンから得られた分子量（１３００〜１ ５００ｋＤａ）を満足する。

１、５００　ｋ　Ｄ　ａの複合体のポリペプチド構成要素マルチパインは５ＤＳ −ＰＡＧＥで分析した時、プロテアソームの２０〜３０ｋＤａのサブユニットと は異なる７０〜１５０ｋＤａの大きいポリペプチド少なくとも６個を含む。プロ テアソーム−マルチパイン複合体を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図６）で分析した時、 精製マルチパインに存在するポリペプチド（すなわち、７０〜２００ｋＤａのバ ンド５個）、精製プロテアソームに知られたサブユニツト（すなわち、２０〜３ ＱｋＤａの間のバンド）ならびに４０〜１１０ｋＤａの多数のポリペプチド全て が見出された。後者のポリペプチドは部分的に精製したプロテアソーム画分（図 ６）にも存在し、複合体の形成により１５００ｋＤａのピークに取り込まれた。

これらの実験はＤＥＡＥクロマトグラフィー、Ｎ　Ｈ４Ｓ　Ｏ４沈殿、モノＱク ロマトグラフィーおよびスペロース６ゲル濾過を含む過程の長い組合せによって 生成したプロテアソームを用いた。故に、４０〜１１０ｋＤａのポリペプチドは プロテアソームにかなり強く会合していて、少なくとも濾過段階の間は７００ｋ Ｄａ粒子と共精製していた。

プロテアソーム画分をさらにＡｆ　ｆ　ｉｇｅｌ−ｂｌｕｅクロマトグラフィー により精製した時に、５ＤＳ−ＰＡＧＥで２０〜３０ｋＤａのサブユニツトを含 むが、得られるプロテアソームはＡＴＰおよびＭｇ”の存在下にマルトくインと 複合体を形成できなかったのは重要な観察である。それで、Ａｆ　ｆ　ｊｇｅｌ −ｂｌｕｅ段階は複合体形成に必須な構成要素のいくつか、おそらく４０〜１１ ０ｋＤａのポリペプチド１個またはそれ以上の構成要素のいくつかを除去したと 思われる。

１５００ｋＤａの複合体の蛋白質分解活性Ｕｂ−リゾチームの分解に加えて、１ ５００ｋＤａ複合体は各種の非抱合蛋白質基質をマルチパインおよびプロテアソ ームと同様に分解した（表■、図７）。

プロテアソーム　領　３　５６　２４ マルチパイン　５　６　０ 複合体　１１　９２　３１ ０ｆＩ１０□処理　５ＬＬＶＴ 活性　ヘモグロビン　へモグロビン　−ＭＣＡプロテアソーム　１　３０　１３ ３ マルチパイン　０．　４　７　５ 複合体　０．　７　２９　１６２ 本蛋白質基質は全て２５μｇ／ｍＬであったが、Ｕｂ　１２５）−リゾチームは ２．５μｇ／ｍＬであった。（＋２５１−Ｕｂ−リゾチームについては、この濃 度は＋２３１−リゾチームの存在量を意味する）ＡＴＰ２ｍＭ存在下の分解速度 は酵素ナノモル当りで計算しプロテアソームの分子量として６７０ｋＤａ、マル チパインには５００ｋＤａ、複合体には１３００ｋＤａを用いた。

ＡＴＰ加水分解は複合体形成に必要だったのみでなく、殆どの基質に対する最高 活性のためにも必要であった。複合体によるＵｂ−＋２５Ｉ−リゾチーム、１２ ＢＩ−リゾチーム、ｓＬＬＶＴ−ＭＣＡまたはカゼインの分解は直線的速度で起 き、ＡＴＰによって３から５倍に刺激された（図７）または未公開データ）。複 合体によるカゼインとりゾチームの分解はＡＴＰによって刺激されるが、ヘモグ ロビン（劣った基質）または酸化剤−損傷ヘモグロビン（ずっと優れた基質）の 分解はＡＴＰによっては影響されたかった。プロテアソームおよびマルチパイン も酸化剤−損傷ヘモグロビン（他の基質とは対照的に）を未知の理由によりエネ ルギー−非依存性過程によって分解することが分かった。それで、複合体はＡＴ Ｐによる活性化も含めて、プロテアソームおよびマルチパインの両者に特徴的な 全ての酵素活性を示す。

Ｕｂ−抱合体の多量製造が困難なので、検定で常法通りに用いたＵｂ　１１５１ −リゾチームの濃度は１２！（−リゾチームのものよりも、モル量で約１０倍低 かった（リゾチームのモル量で定義した場合）。リゾチームの遊離型および抱合 型が等モル濃度で存在する時、マルチパインはＵｂ−リゾチームをその非抱合体 基質を加水分解するよりも２〜４倍迅速に加水分解した。

リゾチームとユビキチン化リゾチームが複合体によって等モル量のマルチパイン またはプロテアソームによるよりも約２倍も速く分解することは注目に値する（ 表Ｖ）。事実、複合体によるこれらの基質の分解速度は明らかにプロテアソーム とマルチパインが別々に作用する速度の合計よりも明瞭に大きい（表Ｖ）。それ で、この複合体では、これらの酵素はリゾチームとユビキチン化リゾチームに対 して相乗的に機能している（表Ｖｌ）。

（ｎ　ｇ）　（ｎ　ｇ） マルチパイン　８０　なし　７４ プロテアソーム　１５６ シスタチン　４ プロテアソーム＋シスタチン　１２ プロテアソーム　９　なし　５ 複合体　７１　なし　６５ 表Ｖｌに示したデータは以下の条件下に得られた：酵素は見掛けの分子量６７０ ｋＤａ、５００ｋＤａおよび１３００ｋＤａに基づいて等モル量を加えた。反応 混合物は２ｍＭ−ＡＴＰおよび放射能活性基質５００ｎｇを含有していた。記載 した所では、マルチパインを不活化する卵白シスタチンは４μＭであった。３７ ℃で６０分または１２０分インキュベーションしてＵｂ−抱合体の分解を酸溶解 性放射能の生成を測定して検定した。さらに、プロテアソーム画分をＡＴＰの存 在下にマルチパインに加えて複合体の形成をさせた時（表ｖＩ）、あるいはマル チパインとそれに続いてプロテアソーム画分を順次この基質に作用する時（表Ｖ ■）、マルチパイン単独よりもずっと速（ユビキチン化リゾチームを分解した。

この実験ては、複合体の形成はマルチパイン単独よりも２倍分解した。また、も しプロテアソームをマルチパインに加えても、マルチパインをシスタチンで不活 化すると、マルチパインによって触媒された前の時間を超える酸溶解性カウント は起きなかった。それで、５００ｋＤａと７ＱＱｋＤａの酵素の相乗作用は複合 体の形成が起きた時だけに証明された。

プロテアソーム画分のマルチパインへの添加がＵｂ−リゾチームのマルチノくイ ン単独よりもさらに大きい分解を起こしたが（表Ｖｌ）　、ＤＦＰ−不活性化プ ロテアソームの添加はこの条件下ではゲル濾過で示されたように複合体形成は起 きていたにも係わらず、Ｕｂ　１２３１−リゾチームの分解は強化しなかった。

それで、蛋白質分解作用は複合体の形成に必要であるとは思えず、複合体内では マルチノくイノとプロテアソームは、両成分が酵素的に活性である限り、相乗的 に働く。単離した複合体（すなわち、７００および１５００ｋＤａ粒子の等モル 量）への過料のプロテアソームの添加でＵｂ−抱合体の分解はそれ以上強化され なかった（表〜ｌ）のは注目に値する。それで、プロテアソームに関するペプチ ダーゼはマルチパインと一定の量的関係になければ、ｕｂ−抱合体もマルチパイ ン活性の生成物も有！に分解するとは思えない。

Ｕｂ−リゾチームの分解産物 Ｕｂ　１２５ｉ−リゾチーム分解のペプチド生成物も分析してマルチノくインに よる複合体形成が蛋白質分解の程度（速度に加えて）を変えるかを検討した。基 質をマルチパインまたは複合体てインキュベーションした後、酸溶解性放射能生 成物をセファ０−スＧ−２５上でゲル濾過に付した。図７に示すように、マルチ パインはＵｂ　１１５Ｉ−リゾチームの加水分解において単一の鋭い放射能のピ ークを生成した。ゲル濾過では、それは１３４７Ｄａの分子量を持つ直線状ペプ チドである物質Ｐと共に溶出した。けれども、１５００ｋＤａの複合体がＵｂ− リゾチーム分解を触媒する時は、１２５Ｉはこの大きさでは溶出しなかった。代 わりに、全放射能は約６００および４００ｋＤａの二つのより小さいピーク（す なわち、約５および３残基を含むペプチド）に見出された。この知見はマルチパ インによって開始されたＵｂ−リゾチームの分解を完了するにはプロテアソーム のペプチダーゼ機能が必須であることを強く示唆する。さらに、表Ｖｌに示すよ うに、量酵素はそれらの共働の機能をするには同時に存在しなければならない。

それで、マルチパインをＵｂ　１２５１−リゾチームとインキュベーションし、 次にその活性をンスタチンで阻害した（表ＶＩに示すように）時、プロテアソー ムの添加はマルチパインによって造られた酸溶解性ペプチドの追加的な分解を起 こさなかった。

それで、マルチパインで生産されたペプチドを分解するのに効果的であるために は、プロテアソームはそれとの複合体内に存在しなければならない。

阻害剤の効果 以下に示すデータから明かなように、１５００ｋＤａの複合体はプロテアソーム とマルチパイン両機能の阻害剤に感受性である。１５００ｋＤａの複合体の特性 をさらに解析するために、構成要素酵素の種々の阻害剤の効果をテストした。

これは以下の条件下に行った。酵素をＵｂ　１２５■−リゾチーム（複合体また はマルチパイン）またはＳＬＬＶＴ−ＭＣＡ　（プロテアソーム）を表Ｖｌｌに 示した化合物の存在下にインキュベーションした。検定物はＡＴＰ２ｍＭを含ん でいた。

反応混合物を基質を加える前に１０分間２０℃でインキュベーションした。ＤＦ ＰはＤＭＳＯに溶かした。ＤＭＳＯの最終濃度は１．０％で、ここでは抱合体の 分解には影響がなかった。マルチパインとプロテアソームのデータは同一の実験 条件下に得られた。表ＶＩＩに示すように、単離された複合体はプロテアソーム とマルチパインの両機能の阻害剤に感受性であった。セリンプロテアーゼおよび プロテアソームの不可逆阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート（Ｄ ＦＰ）および重金属をキレートする０−フェナントロリンは抱合体の分解を約６ ０％阻害した。後者の観察はメタロブロティナーゼもこの大きい複合体の中に存 在するであろうことを示唆する。

表Ｖｌｌ 複合体、マルチパインおよびプロテアソームの蛋白質分解活性に対する阻害剤の 効果の比較 相対活性（％） なし　１００　１００　１００ ＤＦＰ　（１ｍＭ）　３８　９６　１８ノスタチン（４μＭ）　３５　３０　９ ３ＮＥＭ　（１ｍＭ）　３３　２９　３７リユーペブチン（１０μＭ）　７５　 ６９　８３Ｅ−６４（１００μＭ）　９６　１００　１００オレイン酸Ｎａ　（ １２５ｕＭ）　３８　２９　１７９ＳＤＳ　（０，０１％）　４６　４４　１２ ５０−フェナントロリン（１００μＭ）５７４８　６０阻害剤の複合体に対する 効果をマルチパインおよびプロテアソーム各々に対する効果と比較した（表Ｖ［ Ｉ参照）。チオール閉鎖剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）およびパパイ ン様チオールプロテイナーゼ多数に対する強力な阻害剤である卵白シスタチン（ シスタチンＡ）は複合体の活性を６５％減速した。同様なシスタチンによるＡＴ Ｐ−Ｕｂ−依存性蛋白質分解はウサギ筋肉から単離されたＵＣＤＥＮ複合体につ いて以前に報告されている。Ｆａｇａｎ、Ｊ、Ｍ、など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　 、２４３　：　３３５〜３４３　（１９８７）　。リューベブチンまたはＥ６４ のようなチオールプロテアーゼへの他の阻害剤は複合体には有意な効果を示さな かったのは、それらのプロテアソームまたはマルチパインへの阻害不能性から期 待し得たことである。

複合体がプロテアソーム（たとえば、ＤＦＰ）およびマルチパイン（たとえば、 シスタチンＡ）両者への阻害剤に感受性であることは注目に値する。それで、こ れはセリンプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼの双方のように振舞う。Ｓ ＤＳまたは脂肪酸（オレエート）のような洗剤は、プロテアソームを活性化する と以前に指摘され（Ｈｏｕｇｈ、Ｒ，など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２ ；８３０３〜８３１３　（１９８７））ており、マルチパインを阻害することも 示された。これら両薬剤は複合体の機能を阻害した。それで、複合体によるＵｂ −抱合体の分解は画構成要素プロテアーゼの機能を必要とする。その上、これら の種々の知見はまとめるとマルチパインはＵｂ−抱合体の分解を開始し、一方プ ロテアソームはそれを完成する（表ＶＩと図７）ことを示唆する。

マルチパインおよび／またはプロテアソームの活性部位の阻害が複合体を形成す る性能に影響するかどうかもテストした。プロテアソーム画分を１ｍＭ−ＤＦＰ と１０分間ブレインキュベーションした時、１３００ｋＤａの構造の形成はまだ 可能だったが、この処理はプロテアソーム機能の主な阻害を起こした（表ＶＩＩ ）。対照的に、マルチパインをシスタチン（４μＭ）の存在下に１０分間ブレイ ンキュベーションした時は、複合体の形成は起きなかったＣ表Ｖｌ）。あるいは ンスタチンー感受性プロテイナーゼが複合体形成に必須であるか、シスタチン− 結合が立体的に会合反応を阻止するのかもしれない。

ヌクレオチドの効果 １５００ｋＤａの複合体の機能に対するヌクレオチド要求性はマルチパインのヌ クレオチド要求性と似ている（表ＶＩ　Ｉ　Ｉ、図７）。

表Ｖｌｌｌに示すように、複合体による［Ｊｂ＋２ＩＩ■−リゾチームの加水分 解はＡＴＰによって５倍まで刺激される。対照的に、ＡＤＰまたはＡＭＰはこの 過程に有意な効果を持たない。非代謝性ＡＴＰ類似体であるＡＭＰ−ＰＮＰおよ びＡＴＰ−γ−８では刺激は見られない。故に、この反応はＵＣＤＥＮで示した のと同様にＡＴＰの加水分解を要求すると思われる。複合体によるＵｂ−抱合体 の加水分解はＡＴＰの存在または不在下に少なくとも２時間直線的で（図７）　 、ＡＴＰを添加すると何倍も刺激されるので、この過程はＡＴＰ加水分解による 真の酵素活性化を含むと思われる。

表Ｖｌｌｌ 複合体またはマルチパインによるＵｂ−リゾチーム分解に対する相対活性（％） なし　１００　１００ ＡＴＰ　４５８　７４３ ＡＤＰ　１４６　１１３ 八ＬｉＰ　９９　１３０ ＡＭＰ−ＰＮＰ　１０９　９０ 八ＴＰ−γ−５１３５１０３ ＣＴＰ　４１０　３７３ ＧＴＰ　３２６　４３５ ＵＴＰ　１７４　１０８ ＰＰｉ　１１３　１１８ 反応反応物は２ｍＭのヌクレオチドまたは１０ｍＭのＰＰｉを含んでいた。

前記実施例に記載したように、ＡＴＰはマルチパインの活性を未知の理由から２ ０分間の誘導期後にのみ強化する。この遅延が複合体では認められないのは注目 に値する。、へＴＰはＵｂ−リゾチームとりゾチーム双方に対する活性を誘導期 なしに刺激した（図７）。

ＡＴＰに対する要求性はＣＴＰまたはＧＴＰによって部分的に充足され、蛋白質 分解に約３から４倍の刺激を起こした（表Ｖｌｌ）。この複合体のヌクレオチド 特異性は網状赤血球の抽出物、ＵＣＤＥＮおよび精製マルチパイン（表ＶＩＩＩ ）によるＵＢ−抱合体分解に対するヌクレオチド特異性についての以前の知見と 似ている。この効果はＡＴＰでのみ起こる単離プロテアソームの活性化と対照的 であり、それで多分明白なヌクレオチド結合蛋白質を含むであろう。

異なるＡＴＰ濃度を研究した時、ｕｂ−抱合体分解への最高の刺激は約０．７ｍ Ｍで観察された。同様な結果はマルチパインおよび１５００ｋＤａの複合体の両 方で観察されている（図８）。データは両酵素でＡＴＰについて０．３ｍＭまた はそれ以下のＫｍを示唆し、これは細胞間ＡＴＰ濃度よりはるかに低い。それで 、ＡＴＰによる両酵素の活性化は生理学的に適当であると思われる。さらに、こ のＫｍは無傷の繊維芽細胞での蛋白分解へのエネルギー要求性に関する以前の観 察（Ｇｒｏｎｏｓｔａｊｓｋｉ、Ｒ，、Ｐａｒｄｅｅ、Ａ、Ｂ、とＧｏｌｄｂｅ ｒｇ、Ａ、Ｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０　：　３３４４〜３３４ ９　（１９８５））と符合し、非すリゾーム性蛋白分解がＡＴＰ細胞濃度が７０ ％以上（すなわち、約３ｍＭから１ｍＭ以下に）減少した時にのみ低下する。

これらの研究が複合体形成をマルチパインとプロテアソームとの間の会合として 強調しているが、明らかにこの複合体は６５〜１ｌＱｋＤａの未確認ポリペプチ ド４〜５個および約４０ｋＤａの主なバンドも含んでおり、これは前記プロテア ソーム阻害剤に対応する。これらの種々のバンドは部分的に精製したプロテアソ ームにも存在する。これらは硫酸アンモニウム沈殿およびＤＥＡＥモノＱモノび ゲル濾過クロマトグラフィーを通じて同時精製されているのでおそらく、これら のポリペプチドはプロテアソームに強固に会合しているであろう。けれども、そ れらの多くはよく研究され、クローニングされ、配列が決定され、また互いによ （類似している２０〜３０ｋＤａのサブユニットには対応しない。Ｆｕｊｊｗａ ｒａ、Ｔ、など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８４３３２〜７３４０　（１９ ８９）。さらに精製したプロテアソーム製品はＡＴＰ存在下にもマルチパインと 会合しなかったので、少なくともこれらの大きいポリペプチドのどれかは複合体 形成に必須である。

これらポリペプチドの性質と大きい複合体中での機能は明らかではない。５ＤＳ −ＰＡＧＥで明白に目立つ構成要素の一つは４０ｋＤａのポリペプチドで、Ｍｕ ｒａｋａｍｉなどが記載した高分子量プロテアーゼに対する２５ＱｋＤａの阻害 剤のサブユニットに対応することを我々が証明した。Ｍｕｒａｋａｍｉなど、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　］、Ａｃａ　ｄ、Ｓｃ　ｊ、、　８３　二　７５８８〜７５ ９２　（１９８６）。加えるに、網状赤血球で得られた証拠はこの阻害剤は１５ ００ｋＤａの複合体の構成要素３個の中の一つ（ＣＦ−２）に対応することを示 す。最近９５〜１０５ｋＤａのプロテアソーム−関連蛋白の一つに対応し複合体 内部でプロテアソーム活性を調節するらしいＡＴＰアーゼが精製された。マルチ パインおよび大きい複合体はボリュビキチン鎖の解体（イソペプチダーゼ活性） のためおよびシスタチン−感受性蛋白分解活性のためにＵｂ−抱合体を認識する 部位を含む筈である。それで、ユビキチン化リゾチームを分解して小さいペプチ ドに分解することに加えて、単離したマルチパインは多重にユビキチン化した蛋 白を迅速に解体して遊離のユビキチンと蛋白を放出する。

１５００ｋＤａの複合体の内部で、プロテアソームおよびマルチパインはＵｂ− 抱合蛋白の分解に相乗的に働いていると思われる。抱合分解の速度も程度も複合 体ではマルチパイン単独の等しい役割よりも大きい。さらに、この相乗作用はマ ルチパインおよびプロテアソームが互いに会合している時にのみ見られる。基質 をまずマルチパインに、次にプロテアソームに逐次触れさせるか、１５００ｋＤ ａの複合体を過剰のプロテアソームと混合（表Ｖｌ）しても、ｕｂ−リゾチーム のさらに速い分解には至らなかった。プロテアソームはそれ自身この基質を消化 しないので、最初の攻撃はマルチパインにより、その生成物のさらなる消化がプ ロテアソームを含むに違いない。プロテアソームがマルチパインの後に加えられ た時には、それはマルチパインによって発生した放射性ペプチドを複合体内で起 こすようにはさらなる分解をせず（図７）、ここではこれらのプロテアーゼが統 合された、おそらく進行過程的方法で機能していると思われるのは注目に値する 。複合体は短いオリゴペプチドを与えるが、生体内および網状赤血球抽出物内で は、蛋白はずっと遊離のアミノ酸まで消化される。おそらく他のエキソペプチダ ーゼがこの加水分解経路の完了を触媒するのであろう。

それはマルチパイン（シスタチン、脂肪酸、５ＤＳ）およびプロテアソーム（Ｄ ＦＰ）の阻害剤に感受性であるから、複合体の機能化には明らかに各構成要素の プロテアーゼの蛋白質分解活性を必要とする。リゾチームおよびｕｂ〜リゾチー ムの分解は両酵素の相乗的機能化を含むように見えるけれども、プロテアソーム −特異性の活性（ペプチドまたはカゼイン分解）は複合体形成後も変わらないと 思われる。複合体およびマルチパインは同様な濃度のＡＴＰを最高活性のために 必要とし、両者はＧＴＰおよびＣＴＰによっても活性化されるのは興味深い。そ れで、マルチパインと共存するＡＴＰアーゼは複合体の活性のために律速的であ ると思われるが、追加的ＡＴＰ加水分解過程はおそらく明瞭なＡＴＰアーゼを含 むにもかかわらず、複合体形成のためおよびプロテアソームの活性化のための経 路において重要である。複合体形成の興味深い影響の〜つはマルチパインのＡＴ Ｐ−活性化には見られる長い誘導期が消失することである。もし生体内でも誘導 相が起きるとすると、もしマルチパイン分子自身がユビキチンー抱合体を結合す るなら、蛋白質分解はマルチパインがプロテアソームと相互作用してより大きく より活性の分解複合体を形成するまで非常に緩慢に進行することを意味する。

実施例３　脱神経（不使用）による骨格筋の萎縮におけるＡＴＰ依存性のサイド シル性の蛋白質分解経路の活性化の証明実施例３および４に記載するように、非 すリゾーム性（サイドシルの）ＡＴＰ依存性蛋白質分解経路の活性化は横絞（骨 格）筋肉で脱神経萎縮と絶食中に証明され、両状況下に起きる蛋白質分解増加の 大部分の原因であることが示された。

材料 材料は特段の記載がない限り全てＳｌｇｍａ−Ｃｈｅｍｒｃａｌ・Ｃｏ、（Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｅ−６４ｃおよびリューペブチンはＨ０Ｈ ａｎａｄａ博士（大正製薬・東京、日本）から恵与された。

筋肉インキュベーション これらの実験には水とＰｕｒｉｎａ−Ｌａｂ−Ｃｈｏｗを自由摂取させた若い（ ６０〜８０ｇ）雄のＣｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒラットを用いた。ヒラメ筋を以 前に記載されたように脱神経しくＦｕｒｕｎｏ、に、など、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈ ｅｍ　、２６５　：　８５５０〜８５５７　（１９９０））　、ジャム手術をし たラットを対照に用いた。坐骨神経を切断後あるいは食餌撒去後の異なる時間に 、ラットを層殺し、ヒラメ筋または長指伸筋（ＥＤＬ）筋を切開して以前に記載 されたように試験管内でインキュベーションした。Ｆｕｒｕｎｏ、に、など、Ｊ 、Ｂｊｏ　］、Ｃｈｅｍ、　、２６５　：８５５０−８５５７　（１９９０）　 、Ｂａｒａｃｏｓ。

ｖＥ、など、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏ　１．．２５１　：Ｃ５８８〜５９６お よびＫｅｔ　ｔ　１ｅｈｕｔ、１．Ｃ，、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、　、印 刷中（１９９１）。１時間ブレインキュベーション後に、筋肉を新鮮な培地に移 し、チロシン放出を２時間後に測定した。殆どの実験で使用したＣａ２４不含の クレブス−リンゲル重炭酸塩緩衝液は５ｍＭ−グルコース、０．５ｍＭ−シクロ ヘキシイミド、イン／ニリン４μｇ／ｍＬ、０．１７ｍＭ−ｏイシン、０．１ｍ Ｍ−イソロイシン、０．２ｍＭ−バリン、１０μＭ−メチルアミンおよび５０ｔ ｔＭ−Ｅ−６４を含んでいた。筋肉からＡＴＰを除去するために、培地からグル コースを除去した後にそれらをジニトロフェノール（０，１および０．５ｍＭ） および２デオキシグルコース（５ｍＭ）とインキュベーションした。

総蛋白質分解を測定するために、細胞蛋白質からのチロシン放出を蛋白質合成が 閉塞された条件下で追跡した。３−メチルヒスチジンの蓄積を測定して筋原繊維 蛋白質の分解を追跡した。３−メチルヒスチジンはアクチンおよびミオシンの特 異的構成要素であるＧｏｏｄｍａｎ、Ｍ、Ｎ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２ ４１　：１２１〜１２７　（１９８７）およびＬｏｗｅ　］　Ｉ、　Ｂ、　Ｂ、 など、Ｍｅｔａｂｏ　］　ｉ　ｓｍ、３５：１１２１〜１１２゜蛋白質分解速度 の計算のために、培地中のチロノンまたは３−メチルヒスチジンの全蓄積をこれ らのアミノ酸の細胞内プールに起きた変化を合算した。この変化は無視できるか 以前に指摘されたように培地に放出された量に比べて小さい。Ｆｕｒｕｎｏ、Ｋ 　など、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２５６　：８５５（１−８５５７（１９９０）　、Ｌｉ、Ｊ、Ｂ 、とＧ。

Ｉｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、２３１　：４４１ 〜４４８　（１９７６）　、Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ 、Ｌ、　、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏｎ、　、２５１　：Ｃ５８８〜５９６　（ １９８６）およびＴｉ５ｃｈｌｅｒ、Ｍ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、 ２５７＋１６１３〜１６２１　（１９８２）。

この筋肉のＡＴＰ含量は代謝阻害剤の存在または不在下のプレインキュベーンコ ン後に以前に記載されたようにして測定した。Ｇｒｏｎｏｓｔａ　ｊｓｋｉ、Ｒ 。

など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０：３３４４〜３３４９　（１９８５ ）およびＢａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、　とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ａｍ、 Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏ　１．．２５１　：Ｃ５８８〜５９６　（１９８６）。

結果 骨格筋内の蛋白質分解についてのＡＴＰ除去の測定試験管内で無傷の筋肉内での ＡＴＰ依存性系を信頼性よく測定する簡単な実験法を開発した。

筋肉抽出物がＡＴＰ−Ｕｂ−依存性の系、Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ、　Ｗ、な ど、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：２５９７〜２６ ０１　（１９８９）およびＦａｇａｎ、Ｊ、Ｍ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、 ２４３　＋３３５〜３４３　（１９８７）　、およびＡＴＰ−活性化プロテアー ゼ複合体、Ｄｒｉｓｃ。

＋１．Ｊ　とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ 、ＳＣｉ、ＵＳＡ、８６　：　７８７−７９１　（１９８９）およびＦａｇａｎ 、Ｊ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４　＋１７８６８〜１７８７２　（１９８９）　、 を含んでいる事実にも係わらず、代謝性阻害剤を用いて無傷な筋肉からＡＴＰを 除去することによる蛋白質分解における低下を証明しようとする努力は繰返し失 敗して来た。Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｍ、Ｎ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４１　：　 １２１〜１２７　（１９８７）。繊維芽細胞、肝細胞、網状赤血球または大腸菌 を含む研究された他の細胞では、Ｅｔｌｉｎｇｅｒ、Ｊ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、 Ａ、Ｌ、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７４：５４ 〜５８　（１９７７）；Ｇｒｏｎｏｓｔａｊｓｋｉ、Ｒなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、　、２６０：３３４４〜３３４９　（１９８５）およびＧｏｌｄｂｅｒ ｇ、Ａ、Ｌ　とＳｔ、Ｊ。

ｈｈ、、Ａ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４５　：　７４７〜８０３ 　（１９７６）　、ＡＴＰ生成を阻害する試薬は蛋白質分解を５０〜９０％削減 することが見出された。けれども、ラットの脚の筋肉をシクロヘキシイミド、ジ ニトロフェノール（ＤＮＰ）および２−デオキシグルコースを含む正常な培地（ Ｃａ”含有）の中でインキュベーションした時には、筋肉ＡＴＰ含量が９０％も 減少したが、全蛋白質分解は８０〜２００％増加した。Ｆｕｌｋｓ、Ｒ，など、 Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２５０　：２９０−２９８　（１９７５）、暗色のヒラメ筋と淡 色のＥＤＬ筋は共にＡＴＰ除去で同様な蛋白質分解活性化を示し、脱神経または 絶食２日後のヒラメ筋も同様であった。この蛋白質分解の上昇は筋肉が全蛋白質 分解を減少する条件下に筋肉をインキュベーションした時にさえ見られた（すな わち、存在するインツユリンとアミノ酸による緊張の下でのインキュベーション ）。Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ａｍ、Ｊ、Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、　、２５１　：Ｃ５８８〜５９６　（１９８６）、この条件下、 ＡＴＰ−除去に典型的であるが筋肉は硬直した。種々の証拠（下記参照）はこの 異常な蛋白質分解の活性化の原因は筋肉内のＡＴＰ枯渇がサイドシルへのＣａ” 進入とＣａ”依存性プロテアーゼの活性化をもたらすことおよびそれに起因する 総蛋白質分解の刺激が同時に進行するＡＴＰ依存性分解過程の阻害を隠すことを 示した（表ＩＸおよび図１０）。

表ＴＸ 脱神経されたヒラメ筋向の筋原繊維蛋白質および総蛋白質の分解に対する異なる 細胞プロテアーゼおよびＡＴＰ生成の阻害剤の効果（ｐｍｏｌ／ｍｇ／２ｈ）　 （％）　（ｐｍｏｌ／ｍｇ／２ｈ）　（％）なし　３２８±１０　１００　５． １１±０．２１１００リソソーム　３３０±１１　１００　５．０５±０．１９ 　９９十Ｃａ”″依存性十 リソソーム　３２４±１０　９９　５．２３±０．　２２　１００ＡＴＰ依存性 経路 ＋Ｃａ”依存性十 リソソーム　１１２±１４本　３４　２．２４±０．１７　４４各測定値は坐骨 神経の切断後３日目の筋肉５個からの平均値±ＳＥＭである。有意差は＊ｐ＜０ ．０１゜蛋白質分解は静止長の筋肉内でインシュリンとアミノ酸含有Ｃａ”不含 クレブス−リンゲル重炭酸塩緩衝液中で測定した。メチルアミン（１０μＭ）は リゾソーム性蛋白質分解の阻害剤であるＥ−６４（５０μＭ）はリゾソーム性チ オールプロテアーゼおよびカルパインの両者を阻害し、ＡＴＰ依存性経路を阻害 するためにジニトロフェノール（０，１ｍＭ）と２−デオキシグルコース（２Ｄ Ｇ）（５ｍＭ）を加えた。ＤＮＰと２−デオキシグルコースを含む培地からはグ ルコースを除いた。

インキュベーションした筋肉中のＡＴＰ依存性蛋白質分解測定の条件ＡＴＰ依存 性およびエネルギー非依存性非すリゾーム性分解過程を選択的に測定するインキ ュベーション条件を設定できた。ＡＴＰ依存性過程を測定するためにはＡＴＰ枯 渇時にＣａ”“−依存性プロテアーゼの活性化を防ぐ必要があった（前記参照） 。カルパインの強力な阻害剤であるＥ−６４ｃを含むＣａ２４不含培地の中で筋 肉を静止長に保った（Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ。

Ｌ、　、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、２５１：Ｃ５８８〜５９６　（１９８ ６））。

Ｈａｎａｄａ、に、など、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４２：５２３〜 ５２８　（１９７８）。以前の研究はこれらの条件が無酸素の（縮んだ）筋肉内 で（Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、とＡ、Ｌ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙ ｓｉｏｌ　、２５１　：Ｃ５８８〜５９６　（１９８６）：およびＫｅｔｔｅｌ ｈｕｔ。

１、Ｃなど、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、（１９９１）印刷中）またはＣａ” イオノホアでの処理時（Ｚｅｍａｎ、Ｒ，Ｊ　など、Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｍ　 、２６０　：１３６１９〜１３６２４　（１９８５）；Ｂａｒａｃｏｓ、ＶＥ　 とＡ、Ｌ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、２５１：Ｃ５８ ８〜５９６　（１９８６）：およびＢａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、など、Ａｍ、Ｊ。

Ｐｈｙｓ　ｉ　ｏ　］　、１３　：　Ｅ７０２〜７１−　（１９８６））に蛋白 質分解の活性化を阻害することを示した。以前に記載されたように、この培地で はＡＴＰ生成の阻害剤は筋肉内でも他の細胞でもするように蛋白質分解を減らす ことを見出した（図９）。Ｇｒｏｎｏｓｔａｊｓｋｉ、Ｒなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２６０　：　３３４４〜３３４９　（１９８５）およびＧｏｌｄｂ ｅｒｇ、Ａ、Ｌ、とＳｔ、Ｊｏｈｎ、Ａ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、４５　：　７４７〜８０３　（１９７６）。これらの筋肉内でリソソーム性蛋 白質分解を防ぐために（ＦＬｌｒｌｊｎＯ，Ｋ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、 　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２３７：８５’１ｌ−８６４（１９８６）、Ｚｅｍ ａｎ、Ｒ，Ｊ　など、Ｊ、Ｂｊｏｌ。

Ｃｈｅｍ　、２６０　：　１３６１９〜１３６２４　（１９８５）およびＦｕｒ ｕｎｏ。

Ｋ　など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、２６５：８５５Ｃ１〜８５５７（１９９ ０））、インキュベーション培地は自己消化を抑制するインシュリンおよびアミ ノ酸（Ｄｉ　ｃｅｍ、Ｊ、Ｆ、　、ＦＡＳＥＢ−Ｊ、、１　：３４９〜３５６　 （１９８７）およびＬａｒｄｅｕｘ、Ｂ、Ｒ，とＭｏｒｔｉｍｏｒｅ、Ｇ、Ｆｏ 、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ　、２６２　：　１４５１４〜１４５１９　（１９８７））およびリソ ソーム性酸性化の阻害剤であるメチルアミンも含んでいた。（Ｐｏｏｌｅ、Ｂ、 とＯｋｈｕｍａ、Ｓ、、Ｊ、Ｃｅｌ　１．Ｂｊｏｌ　、９０：６６５〜６６９　 （１９８１）。

加えるに、Ｅ　６４ｃは無傷の筋肉内でリゾソーム性チオールプロテアーゼ（カ テブンンＢ、ＨおよびＬ）を不活化する。Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、など、　Ａ ｍ。

Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏ　１．　．１３　：Ｅ７０２〜７１０　（１９８６）、これ らのインキュベーション条件は組織内ＡＴＰまたはクレアチン燐酸塩の水準また は蛋白質合成速度に影響しない。Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、など、Ａｍ、Ｊ、Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、、２５１　：Ｃ５８８〜５９６およびＫｅｔｔｅｌｈｕｔ、１． Ｃ，、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、印刷中（１９９１）。

リゾソーム性およびＣａ”−依存性蛋白質分解系が阻害されても、筋肉は直線的 な速度の蛋白質分解（図１０）を示した。これらの速度は阻害剤不含の完全な培 地中で維持されている筋肉内でのと同様であった。Ｂａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ。

など、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、　、２５１　：Ｃ５８８〜５９６　（１９ ８６）；Ｋｅｔｔｅｌｈｕｔ、１．Ｃ，、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、印刷 中（１９９１）およびＢａｒａｃｏｓ、Ｖ、Ｅ、など、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、、１３：Ｅ７０２〜７１０　（１９８６）。この知見はリゾソーム性および Ｃａ”−依存性過程は「基礎的」蛋白質分解では非常に小さい寄与をすることを 示す以前の研究と一致する。Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ　、３　：　１〜３０　（１９８７）；Ｄｉｃｅ、Ｊ、Ｇ 、　、ＦＡＳＥＢ−Ｊ、、１　：　３４９〜３５６　（１９８７）；Ｇｒｏｎｏ ｓ　ｔａ　ｊ　ｓｋ　ｉ、Ｒ，など、Ｊ。

Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、１２１：１８９〜１９８　（１９８４）＋Ｆｕ ｒｕｎｏ、に、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２ ３７：８５９〜８６４　（１９８６）　、Ｚｅｍａｎ、Ｒ，Ｊ、　など、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、２６０　：　１３６１９〜１３６２４　（１９８５）およ びＢａｒａｃｏｓ、Ｖ。

Ｅ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、　、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、　、２５ １　：Ｃ５８８〜５９６　（１９８６）。この培地中で正常なヒラメ筋またはＥ ＤＬ筋がＡＴＰの９６％を除去されると（′）ニトロフェノールおよび２−デオ キシグルコースで）、筋原繊維内でＡＴＰ−依存性である蛋白質分解の画分と似 た蛋白質分解には５０〜７０％の減少があった（図１０）ｏＧｒｏｎｏｓｔａｊ ｓｋｉ、Ｒ。

など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６０：３３４４〜３３４９　（１９８５） 。

このＡＴＰ依存性構成要素を定量化するために、一つの脚の筋肉をＡＴＰ枯渇し 、対側性の筋肉を対照とした。二脚内の蛋白質分解速度を比較した。総蛋白質分 解中の減少の合計はＡＴＰ依存性構成要素からなりそれで再現性高く異なる生理 的状況中の筋肉内で測定できた（図９および１０）。Ｋｅｔｔｅｌｈｕｔ、１． Ｃ。

など、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＴＲｅｖｉｅｗｓ、４ニア５１ −７７２　（１９８８）；Ｈａｎ、Ｈ，Ｑ、　など、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ−Ｐ ｒ。

ｃ、、２　：Ａ３６４　（１９８８）およびＫｅｔｔｅｌｈｕｔ、ｌ　Ｃなど、 Ｆｅｄｅｒａ　ｔ　ｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、　、２　：Ａ３６４　（１，９８８）。

筋肉のＡＴＰを除くために、それらを２．４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）お よび２−デオキシグルコースと１時間ブレインキュベーションして酸化性燐酸化 およびグリコリシスの双方を阻害した。筋原繊維では（Ｇｒｏｎｏｓｔａｊｓｋ ｉ、Ｒなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０：３３４４〜３３４９　（１ ９８５））および肝細胞Ｈｅｒｓｈｋｏ、Ａ、とＴｏｍｋｉｎｓ、Ｇ、Ｍ、　、 Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２４６：７１０−７１４　（１９７１）では、これら の試薬はＡＴＰの生成および蛋白質の分解を可逆的に阻害する。両阻害剤とも筋 肉の無細胞抽出物内のＡＴＰ依存性またはエネルギー非依存性蛋白質分解系には 影響しなかった。典型的には、ＤＮＰ　（０，１ｍＭ）および２−デオキシグル コース（５ｍＭ）との１時間のプレインキュベーションは正常筋肉のＡＴＰ含量 を〉８５％減らし、０．５ｍＭ−ＤＮＰとデオキシグルコース（５ｍＭ）はＡＴ Ｐを〉９６％減らした。これらの処理はＡＴＰ貯蔵の初期値が対照筋肉のと同様 であった脱神経筋肉および絶食動物からの筋肉の中のＡＴＰ含量に同様な減少を 起こした。これらの異なるＤＮＰ濃度は蛋白質分解に同様な減少を起こした。こ れらのＡＴＰ枯渇組繊では、残りの（エネルギー非依存性）蛋白質分解は数時間 直線的に進行し、チロシンの細胞内プールは対側性（未処置）筋肉でのと同様で あった。

脱神経萎縮時の蛋白質分解における変化ラットの坐骨神経を切断した時、その脚 の不使用ヒラメ筋は迅速に萎縮し、３日間に重量と蛋白質含量の約３０％を失う 。Ｆｕｒｕｎｏ、に、など、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、２６５　：　８５ ５０〜８５５７　（１９９０）およびＧｏｌｄｓｐｉｎｋ、Ｄ、Ｆ、　、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｊ、１５６　ニア１〜８０　（１９７６）。

この期間に、総蛋白質分解は増加し３日間で対側対照ヒラメ筋よりも２〜３倍に なる。Ｆｕｒｕｎｏ、に、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５：８５５０ 〜８５５７　（１９９０）。総蛋白質分解の同様な上昇は脱神経および対照筋肉 を正常なタレブスーリンゲル重炭酸塩中またはリゾソーム性またはＣａ２＋依存 性蛋白質分解を阻害する条件下でインキュベーションした時にも見られる。Ｆｕ ｒｕｎｏ、に、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５　＋８５５０〜８５５ ７　（１９９０）。

ＡＴＰ依存性経路が蛋白質分解の強化のための原因であるかどうかをテストする ために、萎縮中のおよび対照のヒラメ筋のＡＴＰを神経切断後の異なる時間に前 述のように除去した。対照実験は３日間の脱神経も絶食も筋肉の初期ＡＴＰ含量 またはＤＮＰとデオキシグルコースで誘導されたＡＴＰ減少にも影響しなかった ことを示した（表ＩＸ）。けれども、細胞ＡＴＰの枯渇は蛋白質分解の合計に脱 神経筋肉内では対照内より大きい減少を起こした（図９）。例えば、典型的な実 験でこれらの阻害剤は蛋白質分解を対照のヒラメ筋では５３±５ｐｍｏｌ／ｍｇ ／２ｈ（４３％）に減らし、３日間脱神経のヒラメ筋では１４６±１３ｐｍ。

１　／ｍｇ／　２　ｈ　（６４％）に減らした（ｐ＜０．０１）、ＡＴＰの除去 後、脱神経および対照組織における蛋白質分解の残余の速度は違わなかった（図 ９）。それで、萎縮中の筋肉では非すリゾーム性ＡＴＰ−依存性蛋白質分解過程 は活性化されていると思われるが、残余のエネルギー非依存性過程には変化は起 きなかった。

ヒラメ筋肉における総蛋白質分解は神経切断１日後に強化され、次に続く３日間 は進行的に上昇した（図９）。ＡＴＰ依存性構成要素はこの期間にわたって総蛋 白質分解に並行して増加した。対照的に、エネルギー−非依存性過程はずっと一 定のままであった。それで、エネルギー−非依存性過程は別種の過程に違いなく 、ＡＴＰ依存性経路を完全に阻害することに失敗したための人工物に過ぎないも のではない。ＡＴＰ−依存性過程の上昇はこのように維持した脱神経筋肉内の増 加した蛋白質分解の全ての原因である（図９）。

絶食ラントの筋肉を研究してこの分解過程が筋肉蛋白質が上昇する他の生理学的 条件下で活性化されるかどうかをテストした。餌を除かれた動物では、糖質新生 のためのアミノ酸をその動物に提供するに必須と思われる筋肉蛋白質分解の迅速 な増加がある。Ｌｉ、Ｊ、Ｂ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ　ＳＡｍ、Ｊ、Ｐｈ ｙｓｉｏｌ　、２３１：４４１〜４４８　（１９７６）；Ｌｏｗｅｌｌ、Ｂ、Ｂ 。

など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　、２３４　：２３７〜２４０　（１９８６）；Ｇｏ ｌｄｂｅｒｇ、、Ａ、Ｌ　など、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｃ、　、３９： ３１〜３６（１９８０）およびＬｏｗｅ　ｌ　Ｉ、　Ｂ、　Ｂ、など、Ｍｅｔａ ｂｏｌ　ｉｓｍ、３５：１１２１〜１１２　（１９８６）。絶食動物からのＥＤ Ｌ筋肉をリゾソーム性およびＣａ”−依存性分解過程を阻害する条件下にインキ ュベーションした時に、それらは３−メチルヒスチジン生成での観察と符合して 、総蛋白質分解の大きい増加を示した（図１０）　。Ｌｏｗｅ　ｌ　］、Ｂ、Ｂ 、など、Ｍｅ　ｔａｂｏ　］　ｉ　ｓｍ、３５：１１２１〜１１２　（１９８６ ）。しかし、絶食または給餌動物からの筋肉をＡ　Ｔ　Ｐ要求性過程を防ぐため に代謝阻害剤とインキュベーションした時に、これらの蛋白質分解の速度の差は 除かれた。それで、絶食での筋肉蛋白質分解の増加はエネルギー要求性非すリゾ ーム性過程の強化に起因すると思われる。　このＡ　Ｔ　Ｐ要求性過程の上昇は 食餌の除去後１日目には明らかであり、このインキュベーション条件下のＥＤＬ 筋肉に見られる増加した蛋白質分解全ての原因であろう（１１２）。絶食時には 、ＥＤＬのような淡色の筋肉では濃色のヒラメ筋よりも総蛋白質分解の強化が大 きいｃＬｉ、Ｊ、Ｂ、とＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、。

、へｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓ　ｉｏ　］　、２３１　：　４４１〜４４８　（１９７６ ）　。従って、ヒラメ筋は同様な、しかし、より小さいＡＴＰ依存性過程に上昇 を示した。平均では、絶食時ヒラメ筋肉の蛋白分解の上昇は淡色ＥＤＬのよりも ２０〜ｂさい（ｐ＜０．０１）。

ラットの再給餌により、ＥＤＬ内の蛋白質分解は減少して１日以内に基礎的水準 に戻る（図１０）。この反応はＡＴＰ依存性過程内の変化に起因するがエネルギ ー非依存性経路の変化はない。

脱神経萎縮の主な特徴の一つは独特な筋原繊維蛋白質の喪失であるが、しかしそ の加速された分解の原因である系は未確認である。ＦｕｒｕｎＯ，に、など、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５：８５５０〜８５５７　（１９９０）、これら の蛋白質の分解はアアクチンと成る筋肉ではミオシンに特異的な構成要素である ３−メチルヒスチジン生成を測定して追跡できる。Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｍ、Ｎ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２４１　＋１２１〜１２７　（１９８７）およびＬｏ ｗｅｌｌ、Ｂ、Ｂ、　など、Ｍｅｔａｂｏｌ　ｉｓｍ、３５：１１２１〜１１２ 　（１９８６）。

これらの蛋白質が加水分解された時、このアミノ酸は蛋白質合成には再利用され ることができず、それでその出現は筋原繊維蛋白質分解の指標である。Ｇｏｏｄ ｍａｎ、Ｍ、Ｎ、　など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４１　＋１２１〜１２７　 （１９８７）およびＬｏｗｅ　ｌ　１．　Ｂ、　Ｂ、など、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ ｍ、３５：１１２１〜１１２　（１９８６）。脱神経後の３−メチルヒスチジン のこの増加した生成はＡＴＰ生成を阻害することによって著しく阻害されるが、 リゾソーム性およびＣａ”−依存性蛋白質分解を防ぐ処理によっては影響されな い。Ｆｕｒｕｎｏ。

Ｋ　など、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５　：　８５５０〜８５５７　（１ ９９０）。

これらの知見および総蛋白質分解に関する知見（図１１）は非すリゾーム性ＡＴ Ｐ−依存性過程の強化が筋肉萎縮の一次的な原因であることを示す。

実施例５　細胞−不含抽出物中のＡＴＰ−ｕｂ依存性系の活性化を評価する研究 筋肉抽出物中の蛋白分解の測定 給餌および絶食ウサギからの腰筋を細胞−不含の抽出物中のＡＴＰ−依存性系の 検定のために十分な材料を得るために用いた。絶食ウサギは体重約２０％喪失を 起こすに十分な期間（ラットで１日間と同様な）食餌を止められた。動物を麻酔 し、それらの腰筋を切開して以前に記載されたようにしてホモゲナイズした。

Ｆａｇａｎ、Ｊ、Ｍ、　など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６１＋５７０５ 〜５７１３　（１９８６）。

１１００００ｘと次ｔ、ニー１１０００００ｘで遠心分離後、筋肉抽出物をＤＥ ５２セルロースで分別してユビキチンおよび殆どの細胞蛋白質を以前に記載され たようにして除いた。Ｈａｎ、　Ｈ，Ｑ、など、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ−Ｐｒｏ ｃ、、２：Ａ３６４　（１９８８）およびＷａｘｍａｎ、Ｌ、など、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２　＋　２４５１〜２４５７　（１９８７）、ＡＴＰ− ユビキチンー依存性蛋白質分解系（Ｈｅｒｓｋｈｏ、Ａ、Ｊ、　、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、　、２６３　＋１５２３７〜１５２４０　（１９８８）　、Ｒｅｃｈｓ 　ｔ　ｅ　ｉｎｅ　ｒ、Ｍ、　、ＡｎｎＲｅｖ、Ｃｅ　Ｉ　Ｉ−Ｂｉｏ　１．． ３　：　１〜３０　（１９８７）およびＦａｇａｎ。

Ｊ、Ｍ、など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４３　：３３５〜３４３　（１９８７ ））を含む画分を０．５Ｍ−ＮａＣ］　（ｒ画分１１Ｊ）で溶出しトリス（５０ ｍＭ、ｐＨ７，８）、ジチオスレイトール（１ｍＭ）および２０％グリセロール を含む緩衝液で透析し、活性検定前に濃縮した。内因性筋肉蛋白質の分解は遊離 チロシンの生成を蛋白質をトリフルオロ酢酸で沈殿後に螢光分析することによっ て測定して検定した。Ｔｉ５ｈｌｅｒ、Ｍ、　など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、２５７；１６１３〜１６２１　（１９８２）およびＦｕｌｋｓ、Ｒ，など、Ｊ 、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２５０　：　２９０−２９８　（１９７５）、加えるに、酸溶解 性放射能の生成を測定して１４０−カゼインの分解を検定した。Ｗａｘｍａｎ、 Ｌ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２：２４５１−２４５７　（１９ ８７）およびＦａｇａｎ、Ｊ、Ｍ　など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２４３　： ３３５〜３４３　（１９８７）。

実施例３および４からのこれらの知見はユビキチンを含む溶解性Ａ丁Ｐ−要求性 蛋白質分解系は絶食または脱神経萎縮の間に活性化されることを強く示唆した。

けれども、無傷の筋肉でのそのような測定はこれらの異化状況下で可能な他種の 変化を区別できない。それ故、給餌および絶食ウサギからの筋肉の溶解性細胞− 不含抽出物を絶食時の増加した蛋白質分解がＡＴＰ−Ｕｂ−依存性系の活性化に 起因するかどうかをテストするために用いた。ＡＴＰ−ｔＪｂ−依存性蛋白質分 解を示す細胞−不含標本はウサギ筋肉抽出物について記載されている。Ｆａｇａ ｎ。

Ｊ、Ｍ、など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２４３：３３５〜３４３　（１９８７ ）。

ウサギ筋肉からの蛋白質分解系は筋原繊維および膜構成要素を除去するために高 速遠心分離および超遠心分離により部分的に精製され、つぎに遊離ユビキチンを 含む溶解性蛋白質の大部分（〉９０％）を除くためにＤＥＡＥクロマトグラフィ ーに付した。得られた両分はＵｂ−抱合およびＵｂ−蛋白質抱合体の加水分解の ための酵素全部を含んでおり、Ｈｅｒｓｋｈｏ、Ａ、　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、２６３：１５２３７〜１５２４０　（１９８８）；Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅ ｒ、Ｍ、。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ　ｌ　ｌ　−Ｂｉｏ　１．．３−１〜３０　（１９８７） ；Ｗａｘｍａｎ、Ｌ　など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：２４５１〜２ ４５７　（１９８７）；Ｆａｇａｎ、Ｊ、Ｍ、など、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、 ２４３：３３−３４３　（１９８７）；Ｈｏｕｇｈ、Ｒ，など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、　、２６１：２４４０〜２４１５　（１９８６）　、プロテアソーム のＡＴＰ−活性型（多重触媒性蛋白質分解複合体）も同様である。Ｗａｘｍａｎ 、Ｌ、など、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ　、２６２　：　２４５ｉ〜２４５７　（１９８７）。

これらの抽出物のうち、内因性蛋白質の加水分解（チロシン生成で示される）は ＡＴＰの添加で５から９倍、さらにＡＴＰとユビキチンの添加ではさらに増加し た（表Ｘ）。このＡＴＰ−活性化過程は絶食動物からの抽出物では対照動物から のものよりも２倍大きい。ユビキチンの添加は両標本でさらに蛋白質分解を強化 するが、絶食に見られる相対的増加は減らすように見える。加えるに、添加ＡＴ Ｐ不在下に見られる少量の蛋白質分解も絶食動物からの抽出物ではより大きかっ た。

表Ｘ １４Ｃ−カゼイン加水分解 ％変化　４６％　５６％　５３％ 数値はウサギ７匹の平均値±ＳＥＭである。有意差本ｐ＜０．０５および林ｐ＜ ０．０１５これらの検定は実施例に詳記されたように部分的に精製した蛋白質分 解性画分（「画分１１ｊ）について行われた。内因性蛋白質の分解（チロノン生 成）は画分■１蛋白質５ｍｇと２時間３７℃で測定した。＋４ｃｍカゼインの分 解は画分ＩＩ蛋白質４００ｕｇおよび＋４（−カゼイン２Ｑｕｇで１時間３７℃ で検定した。検定はトリス（５０ｍＭ、ｐＨ７，８）　、ジチオスレイトール（ １ｍＭ）およびＭｇＣ］（１１０ｍＭ、最終容積２０ＯｕＬ中で行い、指定した 所ではＡＴＰ（５ｍＭ）またはユビキチン（１５％Ｍ）を加えた。

基質として用いた内因性細胞蛋白質の変更というよりも、ＡＴＰ−依存性分解系 の活性化をさらにテストするため、１４Ｃ−メチルカゼインを基質として用いた （表Ｘ）。この蛋白質もＡＴＰ−非依存性酵素によって迅速に分解され、このＡ ＴＰ−非依存性過程は絶食で増加する（この傾向は鳩尾な大きさには達しなかっ たが）と思われる。ＡＴＰまたはＡＴＰとＵｂの添加はカゼイン分解の明白な増 加を起こし、このＡＴＰ−依存性カゼイン加水分解は、Ｕｂも存在するか否かに 係わらず、６日間絶食後のウサギでは殆ど２倍大きかった。そのような標本にお ける困難およびウサギが多量の食物を胃腸に蓄積する傾向のために詳細な時間経 過は追随できなかった。けれども、６日間より短期の絶食をしたウサギからの筋 肉の抽出物にはそのような蛋白質分解の増加は見られず、体重減少もなく、小腸 にはまだかなりの食物が残っていた。いずれにしても、外因性または内因性基質 の研究はインキュベーションした筋肉の測定が示唆するように（図１０）絶食時 にはＡＴＰ−依存性分解系の容量増加を明白に示す。

ＡＴＰ−ユビキチンー依存性蛋白質分解過程の活性化は脱神経萎縮、絶食および 発熱性感染症の間に骨格筋における増加した蛋白質分解の大部分の原因であるこ とが以下に記載するように示された。加えるに、ポリュビキチンのｍＲＮＡおよ びプロテアソームユニットのｍＲＮＡの水準は脱神経萎縮、絶食および発熱性感 染症の間に骨格筋内で増加することが以下に記載するようζこ示された。同様な データは代謝性アチドーンスを持つか（塩化アンモニウムの注射によって起こさ れた）または癌悪液質（腹水に成育する移植できるヘノクトーマζこよって起こ された）に罹患しているラットでも得られている。

若い雄のラット（６０−８０ｇ、Ｃｈａｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ−ＣＤ株）をＰｕｒ ｉｎａ−Ｌａｂ−Ｃｈｏｗおよび水を自由摂取させて飼育した。全実験１ま実施 例３に記載したように実施した。後肢一つのヒラメ筋を脱神経するためＩこ、動 物をエーテル麻酔下に坐骨神経を膝裏のｌ（ｍ上で切断した。Ｆｕｒｕｎｏ、Ｋ 。

など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６５　：８５５０〜８５５２　（１９９ ０）。

全ての場合、動物は断固で層殺し、前記実施例におけるようにＥＤＬおよびヒラ メ筋を切開した。

筋肉からの総ＲＮＡをグアニジニウムイソシアネート／ＣｓＣｌ法で単離し、Ｒ ＮＡの電気泳動を０．２Ｍ−ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲル中で行っ た。Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　など、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ −ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏＭａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ−５ｐｒｊｎｇ−Ｈａｒｂｏ ｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ、Ｙ、（１９８２）、ＲＮＡをゲルから２０Ｘ− ３ＳＣ（３Ｍ−塩化ナトリウム１０．３Ｍ−クエン酸ナトリウム）中のナイロン 膜（Ｇｅｎｅ−８ｃｒｅｅｎ−Ｄｕｐｏｎｔ、ＮＥＮ・Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４’ ｒｏ、）に移した。ＲＮＡを１２００フイクロジユールのＵＶ光で５ｔｒａｔａ ｌｉｎｋｅｒ装置Ｃ５ｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、ＣＡ）上で膜に架橋した。膜を６ ５℃でランダム−プライマー法で製造した３２Ｐ標識−ｃＤＮＡプローブとハイ ブリダイゼーションさせた。Ｆｅｒｎｈｅｒｇ、Ａ、Ｐ、とＢ、Ｖｏｇｅ　］　 ｓ　ｔ　ｅ　ｉｎ。

Ａｎａ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ　、１３２　：　６〜１３　（１９８３）ｏハイブ リダイゼーション用緩衝液はポリビニルピロリドン−４００００（０，２％）、 Ｆｉｃ。

１１−４０００００　（０，２％）　、牛血清アルブミン（ＢｓＡ、０．２％） 、トリｘ−ＨＣＩ　（０，０５Ｍ、ｐＨ７，５）　、ＮａＣ１（ＩＭ）　、ビロ リン酸ナトリウム（０１％）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、１％）および 鮭精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）を含んでいた。ハイブリダイゼーション後、 漏斗を４２℃または６５℃の領　５Ｘ−３ＳＣ／１％ＳＤＳで洗った。膜をＸＡ Ｒ−２フイルム（Ｋｏｄａｋ）に密着させてオートラジオグラフィーを行った。

ドツトプロット分析用にヒラメ筋またはＥＤＬ筋肉からの全変性ＲＮＡを４種の 異なる濃度（１，５μｇからの２倍希釈）でＧｅｎｅ−８ｃｒｅｅｎ膜にスポッ トした。各ドツトに適用したＲＮＡの量は大腸菌ｔＲＮＡ（ラット筋肉ＲＮＡの 不在下にはハイブリダイゼーションを示さない）を加えて１．５μｇに維持した 。

ハイブリダイゼーション用プローブはＩＪｂ−ｃＤＮＡ断片であり（Ａｇｅｌｌ 。

Ｎ　など、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：３６９３ 〜３６９７　（１９８８））　、他のＨ８Ｐ−ｃＤＮＡプローブおよび全ＲＮＡ 含量ＲＮＡを測定するためのオリゴｄＴ　（Ｈａ　ｒ　］　ｅｙ、　Ｃ，Ｂ、　 、Ｇｅｎｅ−Ａｎａ　１．Ｔｅｃｈ、　、４　：　１７〜２２　（１９９７）で あった。Ｕｂ−ｃＤＮＡはＭ。

５ｃｈｌｅｓ　ｉｎｇｅｒ博士（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎｊＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ・Ｍｅｄｉｃａｌ−８ｃｈｏｏｌ）により、Ｈ３Ｐ７Ｏ−ｃＤＮＡはＲ，Ｖｏｅ ｌＩｍｙ博士により、Ｈ３Ｐ９Ｏ−ｃＤＮＡはり、Ａ、Ｗｅｂｅｒ博士（ＴＪｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ・ｏｆ−Ｍｉａｍｉ−５ｃｈｏｏｌ　・ｏｆ−Ｍｅｄｉｃｊｎ ｅ）によって恵与された。プロットをｕｂ−プローブと６５℃でおよびオリゴ− ｄＴと室温でハイブリダイゼーションし、これらと同じ温度で洗浄した。ポリＵ ｂ−ＲＮＡおよび全ｍＲＮＡの水準をオートラジオダラムのドツト吸光度から自 動化濃度計でスキャンして測定した。非線形スチューデントーを一検定を給餌お よび絶食動物の筋肉を比較をするための統計的分析に用い、線形を一検定を対側 性脱神経および対照筋肉の比較をするために用いた。

全エビキチン含量（遊離のＵｂと蛋白質にリガンドしたＵｂとの双方を含む）の 測定はＲ１１ｅｙ−Ｄ、Ａ、など、Ｊ、Ｈｒｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｂｅｍ 、３６：６２１〜６３２　（１９８８）によって記載された免疫化学的方法を用 いて行った。

【　筋肉蛋白質分解が上昇している時にＵｂ−ｍＲＮＡの水準が増加するかどう かをテストするために、ラット筋肉内のポリｕｂ−トランスクリプトの水準を食 餌除去後の異なる時間に測定した。図１１に示すようにヒラメ筋は２．４および １３Ｋｂのトランスクリプト２ｆＩＡを含み、他の種におけるポリＵｂ遺伝子の 大きさに対応する（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ、Ｊ、とＢｏｎｄ、Ｕ、、０ｘ ｆｏｒｄ−８ｕｒｖｅｙｓ−ｏｎｌＥｕｋａｒｙｏｔ　１ｃ−Ｇｅｎｅｓ　（Ｍ ａｃｌｅａｎ、Ｎ、！り４　：　７６〜９１　（１９８７））　。両トランスク リプトの水準は絶食動物の筋肉内では進行的に増加した。絶食ラットのこれらの 器官内のＵｂ−ｍＲＮＡの相対的水準はドツト−プロット分析およびオートラジ オグラフィーで測定した（図１２）。食餌除去４８時間後、長指伸筋（ＥＤＬ） 筋肉の全Ｕｂ−ｍＲＮＡの水準は対照動物の筋肉よりも４倍の増加を示した（図 １３、上図）。絶食でＥＤＬよりも萎縮の少ないヒラメ筋はＵｂ−ｍＲＮＡに２ 倍の増加を示した。

第三の小さい０．９ＫｂのＵｂ−トランスクリプトもオートラジオグラフィーを 過剰に露光して検出できた。これは大きさの点でＵｂ−拡張遺伝子の生成物に対 応しくＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ、Ｊ　とＢｏｎｄ、Ｕ、　、０ｘｆｏｒｄ− ３ｕｒｖｅｙｓ　・ｏｎｏＥｕｋａｒｙｏｔ　ｉｃ　ＩＧｅｎｅｓ　（Ｍａｃｌ ｅａｎ、Ｎ。

編）４７６〜９１　（１９８７）　）、その発現はリポソームの生合成に関連す る（Ｆｉｎｌｅｙ、Ｄ　など、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：３９４〜４０１　（１９ ８９）；Ｒｅｄｍａｎ、に、とＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ、　、Ｎａｔｕｒｅ 、３３８：４３８〜４４０　（１９８９））。このトランスクリプトは絶食では 増加せず、ポリｔＪｂ−ｍＲＮＡは選択的に増加するものと思われる。

このポリＵｂ−ｍＲＮＡの増加が可逆的であるかどうかテストするため、つぎに 絶食ラットの何匹かに２４時間給給餌た。２４時間の再給餌により、これらの筋 肉内のポリｔＪｂ−ｍＲＮＡの水準は正常動物の水準に戻った。それでこのポリ Ｕｂ−ｍＲＮＡ量の上昇と下降は総蛋白質分解速度（図１０）およびＡＴＰ依存 性分解過程（図１０）における変化に平行する。

もし絶食時にポリＵｂ−ｍＲＮＡが特異的な方法で制御されるなら、これらの筋 肉内のＲＮＡまたはｍＲＮＡの全量も食餌の除去後にポリＵｂ−ｍＲＮＡと同様 に変化するかどうかを検討した。全ＲＮＡ含量は吸光スペクトロフォトメトリー で測定し、ポリー八−含有ＲＮＡの全量はドツトプロット上で３２ｐ−オリゴｄ Ｔプローブを用いて測定した。ポリＵｂ−ｍＲＮＡとは対照的に、ヒラメ筋およ びＥＤＬ内の全ＲＮＡ含量及びｍＲＮＡ（すなわち、ポリー八−含有ＲＮＡ）の 量は給餌動物筋肉内の水準の約５０％減少した。絶食中のヒラメ筋では全ＲＮＡ は７２±３．５から３５±１．６μｇ／筋肉に、全ｍＲＮＡ　（適当な濃度計の 単位で現す）は２１３３±３７６から１００４±２０単位／筋肉に低下した。絶 食中のＥＤＬでは全ＲＮＡは６８±６から３８，５±ｌｕｇ／筋肉に、全ｍ　Ｒ Ｎ　Ａは７１０±７３から４１３±１１単位／筋肉に減少した。全ｍＲＮＡと全 ＲＮＡとの比率は、ｔＪｂ−ｍＲＮＡとは異なり、食餌除去４８時間の間または 再給餌の間に有意には変化しなかった（図１２）。

他の組織中のＵｂ−ｍＲＮＡ 次の実験は絶食中のポリＵｂ−ｍＲＮＡの増加は骨格筋に特有であるか、ラット の他の組織が食事除去２日後に同様な反応を示すかどうかをテストした。絶食中 に強化される蛋白質分解は一次的にリソンーム性過程の活性化が原因であると考 えられてきた。絶食中のラットの心臓（心室）ではＥＤＬ筋に見られるのと同様 にポリＴＪｂ−ｍＲＮＡの上昇が起きた。対照的に、肝臓、牌臓、脂肪組織、脳 、精巣および腎臓を含むテストした他のどの組織にもそのような変化は見られな かった。肝臓、腎臓および脂肪組織では絶食で重量と蛋白質の顕著な減少が起き たが、予期の通りに精巣も脳もこれらの条件下には有意の重量減少は示さなかっ た。それで、絶食の間におけるＵｂ−ｍＲＮＡの上昇は横紋筋に特異的な適応で あると思われ、他の組織には見られない。

脱神経萎縮中のユビキチン＝ｍＲＮＡ水準同様な２から３倍の加速がＡＴＰ依存 性蛋白質分解過程の脱神経萎縮の間に筋肉で起きている。この状況でポリＵｂ− 遺伝子の発現も活性化されているかどうかをテストするために、脱神経１日およ び３日後のヒラメ筋からのＵｂ−ｍＲＮＡの水準を分析した（表ＸＩ）。脱神経 後１日および３日目に、ポリＵｂ−トランスクリプトの水準は対側性対照筋肉内 の水準を超えて顕著に増加した。この筋肉のドツトプロット分析は脱神経後の全 ｍＲＮＡのｐｒｏｐｏｒａｔＩｏｎとしてのポリＵｂ−ｍＲＮＡ含量に２から３ 倍の増加を示した（表ＸＩ）。対照筋肉のＵｂ−ｍＲＮＡ水準の大きさはこの研 究の経過の間には変化しなかったが、対照的に脱神経ヒラメ筋向の全ＲＮＡは３ 日間に４０％減少した（表ＸＩ）。

ユビキチンのためのｍＲＮＡのこの増加は筋肉内の加速された蛋白質分解と相関 する。

表ＸＩ ラットヒラメ筋の片側性脱神経がポリＵｂ−ｍＲＮＡ、　全ＲＮＡ１１ＲＮ＾／ ｐｇ総ＲＮＡ　２３．８±１．４　２３．１±１．４　２２．７±０．８　２３ ．７±１．４総ＲＮ＾（ｌ１ｇ）／ヒラメ筋　４２．３±２．２　３６．７±１ ．３林　５４．０±６．５　３２．５±４．２本筋肉重量（ｍｇ）　２８．８± ０．７　２６．３±０．８＊＊　３０．７±１．１　２３．５±２．１本重量損 失（対照の％）　−９駐車　−２３９数値は動物６匹の平均値±ＳＥＭを示す。

対照値からの有意差本ｐ＜Ｑ、００５、本＊ｐ＜０．　０５゜ポリＵｂ−ｍＲＮ Ａの増加が実際にＵｂの生産を増加するに至っているかどうか決定するため、筋 肉内のこの蛋白質の全量を免疫検定により定量化した（表ＸＩＩ）。この実験で は遊離Ｕｂおよび細胞蛋白質に縫合したＵｂの双方を測定した。（Ｒｉｌｅｙ− Ｄ、Ａ、など、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。

３６・６２１〜６３２　（１９８８）。２日間絶食した動物からのＥＤＬ筋では 、給餌された対照での水準と比べてＵｂ水準に６３％の増加が観察された。坐骨 神経切断２日後のヒラメ筋のＵｂ含量にはさらに大きい９１％もの増加が見られ た。

それで、全ｕｂ含量はＡＴＰ−依存性蛋白質分解およびＵｂ−ｍＲＮＡの増加と 相関していた。

Ｕｂの細胞蛋白質への共有結合は迅速な分解のための標識であることが知られて いる。故に、正常および脱神経筋肉内のユビキチンー蛋白質抱合体の筋肉内含量 を測定した。表ＸＩＩＩに示す通り、ユビキチン化蛋白質の水準は脱神経２日後 に１５８％増加した。同様なユビキチン化蛋白質の増加はラットの絶食でも見ら れ（データ未掲載）およびこの差は動物を１日間再給餌すると消滅した。これら の知見はさらに萎縮筋肉内でのユビキチン依存性過程の活性化を示す。

脱神経筋肉および絶食動物では、プロテアソームの種々のサブユニットのための ｍＲＮＡの２〜３倍の増加として示されるプロテアソーム合成速度の増加も見出 された（表ＸＩ　Ｉ　Ｉ）。そこに示されるのはＣ−３およびＣ−９サブユニツ トのためのｍＲＮＡであり、また関連する実験では、他の三サブユニットのため のｍＲＮＡにおける同様な増加が見られた。それで、萎縮筋肉はこの分解経路の 多角的構成要素の水準を増加している。

検討 脱神経、絶食または再給餌に伴うＵｂ−ｍＲＮＡにおけるこれらの変化はインキ ュベーションした筋肉において測定した総蛋白質分解および筋原繊維蛋白質の分 解の変化と平行して起きおよび連環していると思われる。萎縮筋肉内に見られる Ｕｂ−ｍＲＮＡの上昇はそのＵｂ含量の増加に起因すると思われ（表ＸＩ　Ｉ） 、これは筋肉蛋白質合計の損失にも係わらず起きている。さらに、前記実施例が 総蛋白質分解におけるこれらの変化は非すリゾーム性ＡＴＰ＝依存性過程の活性 化に起因することおよび絶食が筋肉の溶解性抽出物内のＡＴＰ−ｔＪｂに刺激さ れた蛋白質分解の強化に導くことを証明した。

もっと最近の幾つかの観察もＵｂ−依存性蛋白質分解系はこれらの条件下で強化 されるという結論を強く支持する。本文に記載するように、絶食動物からの筋肉 および脱神経筋肉Ｕｂ−抱合蛋白質およびユビキチン化蛋白質の分解に必須なプ ロテアソームをコードするｍＲＮＡの高水準をも示すことが観察された。この結 果は共に筋肉内のＵｂ−依存性の系が収縮活動と食事摂取によって厳密に調節さ れていることを示している。絶食に対するこの反応には副腎ステロイドを要求し くＫｅｔｔｅｌｈｕｔ、１．Ｃ，など、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂｏｌ　ｉ ｓｍ−Ｒｅｖｉｅｗｓ、４　：　７５１〜７７２　（１９８８）；Ｇｏｌｄｂｅ ｒｇ。

Ａ、Ｌ、など、Ｆｅｄｅｒａｔ　１ｏｎ−Ｐｒｏｃ、、３９：３１〜３６　（１ ９８０））、グルココルチコイドは増加したＡＴＰ−依存性蛋白質分解および絶 食に伴うＵｂ−ｍＲＮＡの増加の双方に必要であることが見出された。

ここに示すＵｂ−ｍＲＮＡ水準の変化は総蛋白質分解および筋原繊維蛋白質の分 解における変化に正確に平行するが、両分解とも先行実施例でＡＴＰ依存性非リ ソす−ム性過程によって起きることが示されたものである。それでデータは多分 寿命の長い筋原繊維構成要素を含む正常筋肉蛋白質の分解におけるこの系のため のより一般的な役割を示唆する。

ポリＵｂ遺伝子は萎縮筋肉内に特異的に誘導される遺伝子の例であると思われる 。絶食または視神経萎縮では、筋肉量と総ＲＮＡが減少する時、ポリＵｂ−ｍＲ ＮＡおよびＵｂ濃度の水準は上昇する。対照的に、ｕｂ−拡張ｍＲＮＡの水準は 変化しないか低下しうるのは、このトランスクリプトが新しいリポソームの生産 に関わるから予期の通りであろう（Ｆ　ｉｎ　Ｉ　ｅｙ、Ｄ、など、Ｎａｔｕｒ ｅ。

３３８：３９４〜４０１　（１９８９）；Ｒｅｄｍａｎ、に、とＲｅｃｈｓｔｅ ｉｎｅｒ、Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３８　：　４３８〜４４０　（１９８９）） 、それで、ポリＵｂ−ｍＲＮＡ水準およびＵｂ生産は全ＲＮＡまたはＵｂ−拡張 蛋白質に対するｍＲＮＡに対して逆向きに調節されていると思われる。

特別な生理学的興味はＵｂ−ｍＲＮＡ（およびそれ故、おそら＜Ｕｂ）の増加が 横紋筋に限られるとの知見である。そのような変化はラットの心臓にも起き、絶 食でかなりの重量減少を起こす。これらの知見はＡＴＰ依存性蛋白質分解は、組 織的な研究はまだ報告されていないが、そのような条件下の心筋でも、おそらく 骨格筋のと同様な機構により、上昇することを示唆する。精巣または脳内でのＵ ｂ＊準に変化がないことはこれらの器官の蛋白質含量および大きさは絶食の間維 持されるので、予期されたとおりである。けれども、Ｕｂ−ｍＲＮＡの水準は肝 臓では変化しなかったのは注目に値し、ここでは総蛋白質分解は低インシュリン 状態ではリゾソーム性自己消化機構によって明かに上昇する（Ｄｉｃｅ、Ｊ。

Ｆ、、ＦＡＳＥＢ−Ｊ、　、１　：３４９〜３５６　（１９８７）；Ｌａｒｄｅ ｕｘ。

Ｂ、ＲとＭｏｒｔ　ｉｍｏｒｅ、Ｇ、Ｆ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２ ：１４５１４〜１４５１９　（１９８７）：Ｍｏｒｔｉｍｏｒｅ、Ｇ、Ｅ、など 、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ書Ｒｅｖｉｅｗｓ、５：４９〜７０ 　（１９８９））。そこでこれらの知見は異なる蛋白分解過程の相対的重要性が 組織によって異なることおよびＡＴＰ−Ｕｂ−依存性経路は横絞筋向、特に異化 状態は特別の意義があることを示唆する。

（ａ＋ｇ／筋肉）　（ｐｍｏｌ／筋肉）　（ｐｍｏｌ／ｍｇ筋肉）ヒラメ筋 神経支配　３，５士領　４　８９±　５　２７±２脱神経　２．７±０．２　１ ３７±１２　５１±２差　−０，８士領　３本本　＋４７±１１本本　＋２４± ３本零％変化　−２３％　＋５３％　＋９１％ＥＤＬ筋 給餌　４．５±０３　７１±　６　１６±１２日絶食　３．１±０．４　７９± 　７　２６±２差　−１，４士領　５本　＋７±　９　＋１０±２木本％変化　 −３２％　＋１０％　＋６３％値は給餌または絶食動物４匹からの長指伸筋（Ｅ ＤＬ）および坐骨神経の一つを切断して２日後のヒラメ筋７対に対する平均値± ＳＥＭである。有意差、ネｐ＜０．０５、林ｐｒ０．０１゜（ｐｅａｌ　ｔｒｙ ／ｍｇ／２ｈ）　（ｐｍｏｌ　Ｕｂ／ｍｇ蛋白）対照　６３０±１　１７．０± １．３　１０．０±０．７　２７±１．９脱神経　２０１．０±１　２５．０± １．２　２６．０±１３　５１±２．２％増加　２３２％＊５２騨　１５８に　 ９２％＊零７検体の平均値±ＳＥＭ　＊ｐ＜、０１゜表ＸＩＶ （適宜な単位） ポリュビキチン　３６．４±３．５８　６３．４±３．６３＊本Ｃ３−プロテア ソームサブユニソ　３２．６±４．４１　６７、２±４．２９＊本Ｃ９−プロテ アソームサブユニツ　２５．２±７．７９　７４．４±７．７８＊本本　（ｐ＞ ０．　０１）　本　（ｐ＜０．　０５）蛋白質分解（ｎｍｏＩチロシン／ｒｎｇ ／２ｈ）注射　ＮａＣｌ水　処置　差 Ｌ　Ｐ　Ｓ　Ｏ，２１４±０．０１３　０．２＋１１（１＋０．０１５　＋３１ ％　ｐ＜ｏ、０１添加　蛋白質分解（ｎｍｏ　Ｉチロシン／ｍｇ／２ｈ）非すリ ゾーム性蛋白質分解＊　０．１４５±０．００９　０．１９０±０．０１７　＋ ３１％ｐｒｏ、　０ｆＡＴＰ除去ｆｆｌ　０．０９４＋０．００４　０．１０２ ±０．００４　Ｎ５（ＡＴＰ依存性の部分）　０．０５１＋０．００９　０．０ ８８＋０．０１４　＋１３％　ｐ＜０．０１１リゾーム性およびＣａ”−依存性 過程はこれらの条件下では変わらない。若い（６０〜８０ｇ）雄性Ｃｈａｒｌｅ ｓ−Ｒｉｖｅｒラットに水とＰｕｒｉｎａ−Ｌａｂ−Ｃｈｏｕを自由摂取させた 。

それらに７時と８時の間に無菌食塩水（０，９％ＮａＣＩ）および大腸菌ＬＰＳ 　（４０ｍｇ／１００ｇ体重の食塩水溶液を注射し、６時間後に層殺した。

筋肉蛋白質分解が顕著に増加するもう一つの状況は細菌、ウィルスまたは寄生生 物起源の全身性感染症の期間である。敗血症の患者はしばしば外傷を伴うが、主 として加速された筋肉蛋白質分解のために窒素収支が著しく負である傾向がある 。この反応は発熱を伴い、体の急性相の反応の部分である。これは動物ではエン ドトキシンまたは生きているバクテリアの注射によってモデル化できる（Ｇ。

ｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、など、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖ、　、（１９８９））。

各種の実験はこの蛋白質分解の強化は活性化されたマクロファージによって放出 された循環する因子によって合図されていることを示した。表Ｘｖに示すように 、エンドトキシン注射６時間後に動物を層殺し、その足の筋肉を試験管内で調べ た。

ＥＤＬは総蛋白質分解の迅速な増加を示した。この反応はリゾソーム性またはカ ルチウム活性化プロテアーゼによるものではない。ＡＴＰ−依存性分解系を測定 した時、それは７０％増加し、その動物での蛋白質分解の総増加の原因であった 。

ラットをエンドトキシンで処理すると６〜７時間以内にこれらの筋肉内にポリＵ ｂ−ｍＲＮＡ水準の２〜３倍の増加を起こした。このポリＵｂ−ｍＲＮＡの上昇 は絶食または脱神経に見られる反応に似ており、他の組織には見られなかった。

腓腋筋のノーザン分析は、大腸菌エンドトキシン（４０μｇ／１００ｇ体重）注 射後にポリュビキチン遺伝子のｃＤＮＡプローブを用いて行い、ＲＮＡ中にユビ キチンの誘導を示した（データ未掲載）。それでこれらの知見はＹｏｃｈｉｄａ ヘパトーマを腹水に持つラットに誘発された癌悪液賞および塩化アンモニウムの 注射でラントに誘発された代謝性アチドーンスを含むこれら３種の異化状況下な どに強化された蛋白質分解を導くような筋肉内に共通の生化学的プログラムを示 す（データ未掲載）。

びホスホセルロース（ｐＨ）はＷｈａｔｍａｎから入手した。ｕｂ−抱合酵素（ Ｅｌ、Ｅ２およびＥ３）はＵｂ−セファロースのアフィニティーカラムクロマト グラフィーを用いて単離しくＨｅｒｓｈｋｏ、Ａ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　、２５８　：８２０６〜８２１４　（１９８３））　、これをＵｂ−”’ Ｉ−リゾチーム抱合体を製造するために用いた（Ｈｅｒｓｈｋｏ、Ａ、とＨ，Ｈ ｅ１ｌｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　、１２８ ：１０７９〜１０８６　（１９８５））。使用した他の材料は全て先行実施例に 記載した通りである。

精製 フェニルヒドラジンの注射で誘導されたウサギ網状赤血球を調製した（前記のと おりにまたはＧｒｅｅｎ−Ｈｅｃｔａｒｅｓ　（Ｏｒｅｇｏｎ、Ｗ？）から購入 した）。それらを文献記載（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａ、など、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｊｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、８１　：１１００〜１１０５　（１ ９７８））の方法により２．４−ジニトロフェノールと２−デオキシグルコース とインキュベーションしてＡＴＰを除いた。分解物を処理し、ＤＥ−５２クロマ トグラフイーにかけた。０．５Ｍ−ＫＣＩで溶出した蛋白質（Ｈｅｒｓｈｋｏ、 Ａ。

など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２５８　：８２０６〜８２１４　（１９８ ３））を硫酸アンモニウムを用いて８０％飽和に濃縮し、１１００００Ｘで２０ 分間遠心分離し、２０ｍＭ−１リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　、１ｍＭ−ＤＴ Ｔ　（緩衝液、へ）に呼局した。同緩衝液に対して十分に透析した後に、蛋白質 （画分ＩＩ）を０．５ｍＭ−ＡＴＰ中て一８０℃で貯蔵するか、さらに分別した 。

画分ＩＩ（〜２００ｍｇ）はＵｂ−セファロースカラムにかけ、Ｕｂ−抱合酵素 を特異的に溶出しくＨｅｒｓｈｋｏ、Ａ　など、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２ ５８　：　８２０６〜８２１４　（１９８３））　、モしてＵｂ−リゾチームを 作製するために用いた（Ｈｅｒｓｈｋｏ、Ａ、およびＨｌＨｅ　ｌ　ＩｅｒＳＢ ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ　、１２８：１０７９〜１０ ８６　（１９８５））。吸着しなかった画分をＧａｎｏｔｈなどが記載したよう に硫酸アンモニウムを用いて３８％飽和とし、２０分間混合した。（Ｇａｎｏｔ ｈ、Ｄ、など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６３：１２４１２〜１２４１９ 　（１９８９））。

沈殿した蛋白質は１１００００Ｘで１５分間遠心分離して集めた。ベレットを緩 衝液Ａに再懸濁し、再び硫酸アンモニウムで３８％飽和とした。沈殿した材料を 上記のように集め、次に１０％グリセロールを含む緩衝液Ａに懸濁した。この緩 衝液に対して透析後、０〜３８％ペレットを１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ と平衡化させたモノＱアニオン交換カラム上でクロマトグラフした。蛋白質を６ ０ｍＬ直線状ＮａＣ］傾斜２０から４００ｍＭまでを用いて溶出した。プロテア ソームのペプチダーゼ活性を阻害した画分を集め、濃縮し、１００ｍＭ−ＮａＣ １および０．２ｍＭ−ＡＴＰを含む緩衝液Ａと平衡化させたスペロース６　（Ｈ Ｒｌ　０／３０）ゲル濾過カラム上クロマトグラフした。カラムは流速０．２ｍ Ｌ／分で展開し、各１ｍＬの画分を集めた。ＣＦ−２の性能を分析する成る実験 では（結果参照）、２回目の狭いモノＱクロマトグラフィー傾斜（５０から３０ ０ｍＭ−ＮａＣ１）によって阻害剤の追加的精製を行い、５ＤＳ−ＰＡＧＥとク ーマジー染色では４０ｋＤａのバンドのみが見える阻害剤の鋭いピークを得た。

プロテアソームに対して阻害活性を持つ両分を集め、２０ｍＭ　ＫＨｚＰＯ４（ ｐＨ６゜５）、１０％グリセロール、１ｍＭ−ＤＴＴと１ｍＭ−ＡＴＰを含む緩 衝液Ｂに対して透析した。標本を緩衝液Ｂと平衡化した２ｍＬホスホセルロース カラムにかけた。カラムをこの緩衝液４ｍＬで、続いてこの緩衝液４ｍＬで、続 いて２０．５０．１００．４００または６００ｍＭ−ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ４ ｍＬで洗った。

部分的に純粋なＣＦ−１を得るために、１００から２４０ｍＭ−ＮａＣｌで溶出 したモノ０画分を集め、１ｍＬに濃縮し、１００ｍＭ−ＮａＣ１および領　２ｍ Ｍ−ＡＴＰを含む緩衝液Ａで平衡化したスペロース６カラムにかけた。約６００ ｋＤａで溶出する画分をＣＦ−１含有画分として用いた。

プロテアソームを３８％硫酸アンモニウム沈殿２回の上清液から単離した。上清 液を硫酸アンモニウムで８０％飽和として２０分間混合した。沈殿した蛋白質を 遠心分離で集め、緩衝液Ａに再懸濁し、この緩衝液に対して十分に透析した。

プロテアソームをモノＱアニオン交換クロマトグラフィーと続いてスベロース６ ゲル濾過により前記のようにして単離した（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ、　とＡ、Ｌ 。

Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：７ ８９〜７９］、（１９８９）。

１５００ｋＤａの蛋白質分解複合体は網状赤血球画分ＩＴを３７℃で３０分間２ ｍＭ−ＡＴＰ、５ｍＭ−ＭｇＣ１，の存在下に５０ｍＭ−）−リス−ＭＣＩ（ｐ Ｈ７，６）中でインキュベーションして生成させた。３８％飽和硫酸アンモニウ ムで沈殿さた後、ペレットを１．　ＯＯＯＯｘ　ｇで１０分間に集め、緩衝液Ａ に懸濁し、モノＱアニオン交換およびスペロース６クロマトグラフィーによって 単離した。

検定 プロテアソームの阻害はカラムの各画分をプロテアソームと１ｍＭ−ＡＴＰの存 在下３７℃で１０分間ブレインキュベーションして測定した。プレインキュベー ション後、反応管を水冷し、１２５■−リゾチームまたはＳｕｅ−ＬＬＶＹ−Ｍ ＣＡを加えた。１２５Ｉ−リゾチームについては反応を３７℃で６０分間または Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについては１０分間行った。蛋白質の加水分解は１０ ％トリクロロ酢酸に可溶の放射能の生産を測定して検定し、そしてペプチドの加 水分解はメチルクマリル−７−アミドの放出によった（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ、 とＡ。

Ｌ、ＧｏｌｄｂｅｒｇＳＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８ ６７８９〜７９１　（１９８９））。Ｕｂ−抱合１２６１−リゾチームの分解は ２７℃で６０分間に検定した。反応は５ｍＭ−ＥＤＴＡまたは２ｍＭ−ＡＴＰお よび５ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含み、１０％トリクロロ酢酸の添加で停止させた。

筋肉蛋白質分解が上昇している時にＵｂ−ｍＲＮＡの水準が増加するかどうかを テストするために、ラット筋肉内のポリｕｂ−トランスクリプトの水準を食餌除 去後の異なる時間に測定した。図１１に示すようにヒラメ筋は２，４および１゜ ３Ｋｂのトランスクリプト２個を含み、他の種におけるポリＵｂ遺伝子の大きさ に対応する（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ、Ｊ、　とＢｏｎｄ、Ｕ、　、０ｘｆ ｏｒｄ−３ｕｒｖｅｙｓＬＩｏｎｅＥｕｋａｒｙｏｔ　ｉｃ＋Ｇｅｎｅｓ　（Ｍ ａｃｌｅａｎ、　Ｎ、編）４ニア６〜９１　（１９８７））。両トランスクリプ トの水準は絶食動物の筋肉内では進行的に増加した。絶食ラットのこれらの器官 内のＵｂ−ｍＲＮＡの相対的水準はドツト−プロット分析およびオートラジオグ ラフィーで測定した（図１２）。食餌除去４８時間後、長指伸筋（ＥＤＬ）筋肉 の全Ｕ　ｂ　−ｍＲＮＡの水準は対照動物の筋肉よりも４倍の増加を示した（図 １３、上図）。絶食でＥＤＬよりも萎縮の少ないヒラメ筋はＵｂ−ｍＲＮＡに２ 倍の増加を示した。

第三の小さい０．９ＫｂのＵｂ−トランスクリプトもオートラジオグラフィーを 過剰に露光して検出できた。これは大きさの点でＵｂ−拡張遺伝子の生成物に対 応しくＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ、Ｊ、とＢｏｎｄ、Ｕ、、０ｘｆｏｒｄ−８ ｕｒｖｅｙｓ　０ｏｎ−Ｅｕｋａｒｙｏｔ　１ｃ−Ｇｅｎｅｓ　（Ｍａｃｌｅａ ｎ、Ｎ。

＆ｉ）４ニア６〜９１　（１９８７）　）、その発現はリポソームの生合成に関 連する（Ｆｉｎｌｅｙ、Ｄ、など、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：３９４〜４０１　（ １９８９）；Ｒｅｄｍａｎ、に、　とＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、Ｍ、　、Ｎａｔ ｕｒｅ、３３８：４３８〜４４０　（１９８９））。このトランスクリプトは絶 食では増加せず、ポリＵｂ−ｍＲＮＡは選択的に増加するものと思われる。

このポリＵｂ−ｍＲＮＡの増加が可逆的であるかどうかテストするため、つぎに 絶食ラットの何匹かに２４時間給餌した。２４時間の再給餌により、これらの筋 肉内のポリＵｂ−ｍＲＮＡの水準は正常動物の水準に戻った。それでこのポリＵ ｂ−ｍＲＮＡ量の上昇と下降は総蛋白質分解速度（図１０）およびＡＴＰ依存性 分解過程（図１０）における変化に平行する。

もし絶食時にポリＵｂ−ｍＲＮＡが特異的な方法で制御されるなら、これらの筋 肉内のＲＮＡまたはｍＲＮＡの全量も食餌の除去後にポリＵｂ−ｍＲＮＡと同様 に変化するかどうかを検討した。全ＲＮＡ含量は吸光スペクトロフォトメトリー で測定し、ポリーＡ−含有ＲＮＡの全量はドツトプロット上でＵｐ−オリゴｄＴ プローブを用いて測定した。ポリＵｂ−ｍＲＮＡとは対照的に、ヒラメ筋および ＥＤＬ内の全ＲＮＡ含量及びｍＲＮＡ　（すなわち、ポリーＡ−含有ＲＮＡ）の 量は給餌動物筋肉内の水準の約５０％減少した。絶食中のヒラメ筋では全ＲＮＡ は７２±３５から３５±１．６ｕｇ／筋肉に、全ｍＲＮＡ　（適当な濃度計の単 位で現す）は２１３３±３７６から１００４±２０単位／筋肉に低下した。絶食 中のＥＤＬでは全ＲＮＡは６８±６から３８．５±ｌｕｇ／筋肉に、全ｍＲＮＡ は７１０±７３から４１３±１１単位／筋肉に減少した。全ｍＲＮＡと全ＲＮＡ との比率は、Ｕｂ−ｍＲＮＡとは異なり、食餌除去４８時間の間または再給餌の 間に有意には変化しなかった（図１２）。

他の組織中のＵ　ｂ　−ｍＲＮＡ 次の実験は絶食中のポリＵｂ−ｍＲＮＡの増加は骨格筋に特有であるか、ラット の他の組織が食事除去２日後に同様な反応を示すかどうかをテストした。絶食中 に強化される蛋白質分解は一次的にリソソーム性過程の活性化が原因であると考 えられてきた。絶食中のラットの心臓（心室）ではＥＤＬ筋に見られるのと同様 にポリＵｂ−ｍＲＮＡの上昇が起きた。対照的に、肝臓、牌臓、脂肪組織、脳、 精巣および腎臓を含むテストした他のどの組織にもそのような変化は見られなか った。肝臓、腎臓および脂肪組織では絶食で重量と蛋白質の顕著な減少が起きた が、予期の通りに精巣も脳もこれらの条件下には有意の重量減少は示さなかった 。それて、絶食の間におけるＵｂ−ｍＲＮＡの上昇は横絞筋に特異的な適応であ ると思われ、他の組織には見られない。

脱神経萎縮中のユビキチン−ｍＲＮＡ水準同様な２から３倍の加速がＡＴＰ依存 性蛋白質分解過程の脱神経萎縮の間に筋肉で起きている。この状況でポリＵｂ− 遺伝子応するかをさらにテストするため、精製阻害剤をＡＴＰまたは非加水分解 性類似体ＡＭＰＰＮＰの存在または不在下に４２℃でプレインキュベーションし た。プロテアソームを加えて１０分後、ペプチダーゼ活性を検定した。阻害の程 度はヌクレオチドを加えないプレインキュベーションの間に迅速に減った。ＡＴ ＰかＡＭＰＰＮＰの存在はこの活性喪失を防いだ。さらに、この物質のＵｂ−抱 合リゾチームの分解を再構築する性能も４２℃でのインキュベーションの間に迅 速に減り、ＡＴＰまたはＡＭＰＰＮＰ　（詳記せず）の添加はこの活性化を防い だ。この阻害およびＵｂ−抱合体分解の再構築は同様な不活性化機構を示しそし てＡＴＰにより同様に安定化されるので、これら二機能は多分ＡＴＰに結合する と思われる一つの分子内に存在する。

ＡＴＰは阻害性因子を安定化するが、それはプロテアソームの阻害には必須では ない。プロテアソームと阻害剤とのＡＴＰの存在または不在下の２０分迄のプレ インキュベーンコン後に、同様な程度の阻害が観測された。しかしながら、ＡＴ Ｐによる安定化のために、このヌクレオチドを全てのインキュベーションにいつ も加えた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、阻害剤標本は〜４ＱｋＤａの主バンドを示 した。この４０ｋＤａのサブユニットが１５００ｋＤａの複合体のサブユニット のどれかに対応するかどうかをテストするため、画分ＩＩとＭｇ”−ＡＴｐのイ ンキュベーションで１５００ｋＤａの複合体を形成してアニオン交換とゲル濾過 クロマトグラフィーにより単離した。この活性画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥはこの複 合体に関して以前に報告されたものと似た多数のポリペプチドを示した（Ｈ。

ｕｇｈ、Ｒ，など、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６２＋８３０３〜８３１３ 　（１９８７）；Ｇａｎｏｔｈ、Ｄ、など、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６ ３：１２４１２−１２４１９　（１９８８）：Ｅｙｔａｎ、Ｅ、　など、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６　：　７７５１〜７７５５　（１９８９）） 、けれども、この両分には容易に現れる４ＱｋＤａのバンドはこの画分中には明 白である。

さらにプロテアソームに関連する蛋白質の問題を解決するために、画分ＩＩを抗 −プロテアソームモノクロナール抗体を用いる免疫沈殿をし、また５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析した。Ｕｂ−抱合体分解活性は以前に画分ＩＩの免疫沈殿により 除かれることが示されている（Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ、　Ｗ、など、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　８６　：　２５９７〜２ ６０１　（１９８９）　）、免疫沈殿の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、２０から３４ ｋＤａにわたるプロテアソームサブユニットの特徴的な組合せを、他のより高分 子量のバンドと共に観察した。

重要なことに、阻害剤のものに類似したものおよび部分的に精製した複合体に見 られるものに似ている４０ｋＤａバンドは免疫沈殿の中にも検出された。

曳應惣 当業者は通例以上の実験を用いずともここに記載された本発明の特定の態様につ いての多数の均等物を認識するであろうし、また確信できるであろう。そのよう な均等物は下記請求項によって包含されることが意図されている。

画分番号 ＦＩＧ、　１ 画分番号 ＦＩＧ、　２ 分 ＦＩＧ、　４ ＡＴＰ＋Ｍｇと 画分番号 画分番号 ＦＩＧ、　７ 脱神経後の日数 巳　数 ＦＩＧ、　ｌ。

ｂｃｄ 給餌　絶食　再給餌　給餌　絶食　再給餌ＦＩＧ、　Ｉ２ 国際調査報告　。ｒＴｎｌｃ０１／。、。、□フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１／３７　６ ８０７−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ Ｉ

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．活性化のためにＡＴＰ加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先 的に分解する概略分子量５００ｋＤａの単離された多量体チオールプロテアーゼ 、または実質的に同じアミノ酸配列を持つ酵素。
2. ２．エンドペプチダーゼである、請求項１の単離された多量体チオールプロテア ーゼ。
3. ３．筋肉から単離された、請求項１の多量体チオールプロテアーゼ。
4. ４．概略分子量７００ｋＤａのプロテアソームとともに概略分子量１５００ｋＤ ａの複合体を形成する、概略分子量５００ｋＤａの単離されたＡＴＰ−依存性チ オールプロテアーゼ。
5. ５．本質的に純粋なマルチパイン。
6. ６．活性化のためにＡＴＰ加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先 的に分解する、概略分子量５００ｋＤａの遺伝子組換え的に製造された多量体チ オールプロテアーゼ。
7. ７．ａ）ユビキチン化リゾチームのＡＴＰ−刺激性分解に参与する；ｂ）酸化剤 −揖傷ヘモグロビンに対して強い蛋白質分解活性を示す；そしてｃ）ｓＬＬＶＴ −ＭＣＡに対しては殆ど蛋白質分解活性を示さない、概略分子量５００ｋＤａの 多量体チオールプロテアーゼ。
8. ８．活性化のためにＡＴＰ加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先 的に分解する、概略分子量５００ｋＤａの多量体チオールプロテアーゼをコード するＤＮＡ。
9. ９．活性化のためにＡＴＰ加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先 的に分解する、概略分子量５００ｋＤａの精製された多量体チオールプロテアー ゼを発現する宿主細胞。
10. １０．ａ）物質、マルチパイン、ユビキチン化蛋白質、ＡＴＰおよびＭｇ２＋を 混合する； ｂ）（ａ）で調製した混合物をユビキチン化蛋白質のＡＴＰ−刺激性分解のため の適当な条件下に保つ；そして ｃ）ユビキチン化蛋白質のＡＴＰ−刺激性分解が起きるかどうか測定する、の各 段階からなる、マルチパインを阻害する該物質の性能を測定する方法。
11. １１．段階（ｃ）でさらにユビキチン化蛋白質のＡＴＰ−刺激性分解が起きる程 度を測定し、そして結果を適当な対照と比較することを含む請求項１０の方法。
12. １２．ａ）物質をマルチパイン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋と混合する；そしてｂ） マルチパインとプロテアソームの間で複合体を形成するかどうかを測定する（こ こでは複合体形成の欠如は物質がマルチパインを阻害することの指標である） の各段階からなるマルチパインを阻害するための物質の性能を測定する方法。
13. １３．段階（ａ）ではユビキチン化蛋白質も存在し、段階（ｂ）では活性マルチ パイン−プロテアソーム複合体の存在をユビキチン化蛋白質のＡＴＰ−刺激性分 解が起きるかどうかを測定することによって評価する、請求項１２の方法。
14. １４．ａ）ユビキチン−依存性分解を受けうる寿命の短い蛋白質を製造する培養 細胞を準荒する； ｂ）培養された細胞をＡＴＰ−ユビキチン−依存性分解過程を阻害する性能を評 価すべき物質とその物質が培養された細胞に入るために適当な条件下に接触させ る； ｃ）および培養された細胞のサイトゾル内に寿命の短い蛋白質が存在する程度を 測定する（ここではサイトゾル内の寿命の短い蛋白質の蓄積はＡＴＰ−ユビキチ ン−依存性分解過程の阻害の指標である）の各段階からなる細胞内のＡＴＰ−ユ ビキチン−依存性分解過程の阻害剤のための迅速なスクリーニングの方法。
15. １５．培養された細胞が寿命の短い突然変異型の酵素を生産するＣＯＳ細胞であ る、請求項１４の方法。
16. １６．酵素が大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼの突然変異型である、請求項１ ５の方法。
17. １７．ａ）脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物 から得られたヒラメ筋または長指伸筋をＡＴＰ−ユビキチン−依存性過程の潜在 的な阻害剤とユビキチン化蛋白質の分解に適当な条件下にインキュベーションす る； ｂ）筋肉蛋白質の分解産物の放出を潜在的阻害剤の存在下に測定する；およびｃ ）（ｂ）で行った測定を脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシス を受けた動物から得られたヒラメ筋または長指伸筋での筋肉蛋白質の分解産物の 潜在的阻害剤の不在下の放出と比較する、の各段階からなる筋肉細胞内のＡＴＰ −ユビキチン−依存性過程の阻害剤を確認する方法（ここでは筋肉蛋白質の分解 産物放出の減少はＡＴＰ−ユビキチン−依存性過程の阻害の指標である）。
18. １８．筋肉蛋白質の分解産物が３−メチルヒスチジンである、請求項１７の方法 。
19. １９．ａ）脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物 を準備する； ｂ）その動物にＡＴＰ−ユビキチン−依存性過程の潜在的阻害剤を投与する；ｃ ）動物による３−メチルヒスチジンの排泄を測定する；およびｄ）（ｃ）で行っ た測定を（ａ）で準備した動物と同様にして脱神経、絶食、発熱性感染症または 代謝性アチドーシスを受けた動物による３−メチルヒスチジンの排泄と比較する ； 各段階からなる動物内のＡＴＰ−ユビキチン−依存性過程の阻害剤を確認する方 法（ここでは３−メチルヒスチジン排泄の減少はＡＴＰ−ユビキチン依存性過程 の阻害の指標である）。
20. ２０．マルチパインとマルチパインの活性部位と結合する物質とを、その物質と マルチパインの結合に適当な条件下に接触させてマルチパイン−物質複合体を形 成させることからなるマルチパインを阻害する方法。
21. ２１．１５００ｋＤａのマルチパイン−プロテアソーム複合体の機能を阻害する 物質を細胞に導入することからなる細胞内マルチパインの阻害のための迅速なス クリーニング法。
22. ２２．マルチパイン阻害剤とマルチパインの結合のために適当な条件下に十分な 量のマルチパイン阻害剤を細胞に導入することからなる細胞内ＡＴＰ−ユビキチ ン−依存性経路の活性化を阻害する方法（ここではマルチパインとマルチパイン 阻害剤の結合がその経路の機能を阻害する）。
23. ２３．マルチパインおよびプロテアソームを含む概略分子量１５００ｋＤａの複 合体の形成を阻害する物質を筋肉細胞に導入することからなる、筋肉細胞内のＡ ＴＰ−ユビキチン−依存性経路を阻害する方法。
24. ２４．筋肉細胞内の非リソソーム性ＡＴＰ−要求性蛋白質分解過程の機能を妨害 することからなる筋肉量の損失を防ぐ方法。
25. ２５．筋肉細胞内の非リソソーム性ＡＴＰ−要求性蛋白質分解過程の活性化を、 活性化にＡＴＰの加水分解を要求し、かつユビキチン化蛋白質を優先的に分解す る概略分子量５００ｋＤａの多量体チオールプロテアーゼの活性化を妨害するこ とによって、筋肉細胞内で阻害することからなる請求項２４の方法。
26. ２６．非リソソーム性ＡＴＰ−要求性蛋白質分解過程の活性化が、筋肉細胞内で マルチパイン−プロテアソーム複合体の機能を妨害することにより阻害されるこ とからなる、請求項２４の方法。
27. ２７．個体にマルチパイン阻害剤をマルチパイン阻害剤の筋肉細胞への導入およ び筋肉細胞内でのマルチパインとマルチパイン阻害剤との結合に適する条件下に その個体にマルチパイン阻害剤を投与することからなる、個体の筋肉量の損失を 防ぐ方法（ここでは結合によりＡＴＰ−ユビキチン−依存性経路の阻害が起きる ）。
28. ２８．哺乳類細胞をＡＴＰ−ユビキチン−依存性蛋白質分解経路の活性をＡＴＰ −依存性チオールプロテアーゼの活性部位と結合することによって減少させるこ とのできる物質と接触させることからなる、概略分子量５００ｋＤａのＡＴＰ− 活性化チオールプロテアーゼが関与するシストゾル性ＡＴＰ−ユビキチン−依存 性蛋白質分解過程の哺乳類細胞内の活性化を防ぐ方法。
29. ２９．物質がパパイン−様酵素の阻害剤である、請求項２８の方法。
30. ３０．物質がシスタチンＡの類似体または誘導体である、請求項２８の方法。
31. ３１．合成プロテアソーム阻害剤。
32. ３２．筋肉細胞から単離した４０ｋＤａのプロテアソーム阻害剤の活性を模した 合成ペプチド。
33. ３３．７００ｋＤａのプロテアソームを阻害し分子量が４０ｋＤａまたはそれ以 下のペプチド。