JPH02448A - Ｈｉｖ−２ウィルスの蛋白質を発現させるためのベクターおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、エイズ予防用ワクチンに関する。

後天性免疫不全症候群（エイズ）は、今日北米、ヨーロ
ッパおよびアフリカにおいて、極めて重大な問題となっ
ているウィルス性の症状である。

最近の推定によれば、既に百万人乃至二百万人が、エイ
ズウィルスを保有しているものと考えられている。発病
した患者は、著しい免疫不全を呈し、その症状は一般に
致命的なものである。

エイズの感染は、性的接触によるものが最も多いが、麻
薬の静脈注射常用者も、高危険グループに属する。さら
に、汚染された血液または血液製剤を投与された多くの
人達も、このウィルスに感染している。

エイズ症状の原因因子は、一種のレトロウィルスである
。多くの動物の病気の原因がレトロウィルスによるもの
とされているが、ヒトに影響するレトロウィルスが解明
されはじめたのは、極く最近のことにすぎない。

ヒトＴ細胞レトロウィルスのタイプＩおよびタイプ■は
、ある種の成人Ｔ細胞白血病の原因因子（ＨＴＬＶ：ヒ
トＴ細胞ウィルス）であるとされているが、ヒト免疫不
全症ウィルス（ＨＩ　Ｖウィルス）は、エイズの原因因
子であることが確認されている。

ＨＩＶ−ルートロウィルスのゲノムは、極く最近完全に
解明されており（ウェインーホブソンら、１９８５年；
ラットナーら、１９８５年；ミュージングら、１９８５
年；サンチェスーペスカドールら、１９８５年）、ゲノ
ム配列に関する情報は、レンチウィルスグループとの近
い関係を示している。ヒツジのヴイスナウィルスをプロ
トタイプとするレンチウィルス類は、典型的に長い生育
期間を示す緩慢進行性の因子である。ＨＩＶとヴイスナ
ウィルスは、多くの類似点を共有しており、特に神経組
織に対する同性においてそうである。

最近、ＨＩＶファミリーに類縁のものであるがＨＩＶ−
１とは異なるウィルスが、特に西アフリカで発生したエ
イズ患者から分離されている。ＨＩＶ−２と呼ばれるこ
のウィルスは、クローン化され、その遺伝子配列も知ら
れている（ギアデら、１９８７年）ニゲツム配列に関す
るこの情報は、若干の相違点にもかかわらず、ＨＩＶ−
１ウィルスとＨＩＶ−２ウィルスとが同一グループに属
しており、同一タイプのゲノムマツプと組織とを有して
いることを裏付げている。

この新しいウィルスに感染している患者の数は、今のと
ころ少数であるように思われる。それにもかかわらず、
ＨＩＶ−１ウィルスとＨＩ　Ｖ−２ウィルスのワクチン
形成蛋白質を使用する対エイズ予防接種を今から考慮し
ておくことが重要である。

何故ならば、ＨＩＶ−２の疫学的重要性は、ＨＩＶ−１
のそれに匹敵することになるかも知れないからである。

ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２とは、国際公開公報ＷＯ８７１
０２，８９２号に記述されているＨＴＬＶ−４とは異な
って、ともに病原性を示す。

しかし、ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１の蛋白質の配列とは
異なる蛋白質配列を存しているので、ＨＩＶ−２に対し
て血清陽性であるヒトは、ある種のＨＩＶ−１蛋白質と
は反応しない抗体を育している。

ＨＩＶ−２の配列は、ＨＩＶ−１の遺伝的構造に極めて
近似した遺伝的構造を明らかにしている。

事実、ＧＡＧＳＰＯＬおよびＥＮＶ蛋白質を除けば、両
ウィルスは、レトロウィルス中でも特異的なＱ、Ｆ、Ｒ
ＳＴＡＴおよびＡＲＴ蛋白質をコードする。ＨＩＶ−２
は、さらに、推定されるＸ蛋白質をもコードする。

ｅｎｖ遺伝子生成物の配列は、トランスメンブレン　エ
ンベロープ糖蛋白質が有しているものと考えられている
特徴を示している。プレカーサーは、ＨＩＶ−１の場合
と同様に、１６０　ｋ　Ｄ　ａ領域の分子量を有してお
り、１２０と４０ｋＤａの２つの蛋白質に切断される。

ｇｐ１６０　　ＥＮＶ　　蛋白質に対する抗体ならびに
ある条件下でのそのｇｐ１２０．ｇｐ４０およびｇｐ３
２切断生成物は（ｇｐ３２については、モンタニエら、
１９８７年を参照）、ＨＩＶ−２に感染した患者の血清
中に一般的に認められ、ＥＮＶ　　糖蛋白質は、エイズ
　ウィルスの主たる表面抗原を占めるものである。

かくして、ＥＮＶ　　蛋白質は、ウィルスの表面に露出
しているので、予防接種戦略を発展させるための有望な
候補者である様に思われる。従って、この蛋白質および
そのコード配列に注意が向けられている。

ｇａｇ　　遺伝子は、ピリオンの内部構造蛋白質をコー
ドする。その転写から得られたメツセンジャーは、５７
ｋＤａ蛋白質（Ｐ５５−５７）の形態で翻訳され、この
プレカーサーが、次いでｐｏｌ　　遺伝子によりエンコ
ードされた特異的プロテアーゼの作用により、成熟せし
められる。最初の蛋白質内開裂（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏ
ｌｙｔｉｃ　ｃｌｅａｖａｇｅ）により、４Ｏ−ｋＤａ
　（Ｐ２Ｏ）および１２−ｋＤａ　（ＰＩ３）蛋白質が
得られ、２回目の開裂により、１６−ｋＤａ　（ＰＩ３
）および２６−ｋＤａ　（Ｐ２６）蛋白質が得られる。

リーディング　フレームのオーダーは、Ｈ２Ｎ−ＰＩ３
−Ｐ２６−Ｐ　１２−Ｃ０ＯＨである。ＰＩ３のＮＨ２
末端と符合するＰ５５のＮＨ２末端は、ＨＩＶ−１のＰ
Ｉ３と同様にして、ミリスチン酸によりアシル化され得
る。このことは、ＰＩ３が、ウィルス粒子におけるゲノ
ムのリボ核酸とヌクレオキャプシドとの間のリンクとし
て機能し得るという仮説を裏付けるものである。Ｐ２６
は、ピリオンのキャプシドの主な構成部分である。ＰＩ
３の強い塩基性特性は、ＨＩＶ−１のＰｌＢについて示
唆されている様に（ウエインーホブソンら、１９８５年
）、ウィルスのリボ核酸との緊密な結合を示唆している
。

ＨＩ　Ｖ−２に感染したヒトの血清中のｇａｇ遺伝子に
よりエンコードされた蛋白質に対する抗体の検出は、容
易である。この免疫応答は、これらの異なる蛋白質の強
い免疫原性特性を明らかにしている。さらに、成るヒト
が、ＨＩ　Ｖ−２に対して血清陽性である場合には、抗
体の大部分がＰ２６に向けられることも、注目すべきで
ある。

この観察は、ＨＩＶ−１の場合と同様に、ｇａｇ遺伝子
によりエンコードされた蛋白質が、ウィルス感染に対し
てより優れた保護を与えるために発動さるべき免疫応答
のターゲットの一つであることを示唆している。

事実、幾つかの文献は、細胞性免疫のメカニズムの誘導
に際してのピリオンの構造蛋白質の重要性を強調してい
る。これらに開示された研究の中で、インフルエンザ　
ウィルスについて触れておく必要があろう。このウィル
スでは、核蛋白質（ピリオンのキャプシドの主要構成成
分）に向けられたＣＴＬ　（細胞毒性１９２８球）反応
が、ウィルスの異なるサブタイプに対して起こり得るの
に対し、表面糖蛋白質（血球凝集素およびノイラミニダ
ーゼ）により誘導された抗体については、サブタイプ間
に免疫交差反応（ｉｍｍｕｎｅ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃ
ｔｉｏ　）は、生じない。これら糖蛋白質類の一次構造
は、ペプチド配列が各サブタイプについて特異的である
可変領域を示している。この相違（ｄｆｖｅｒｇｅｎｃ
ｅ）が、免疫交差反応が生じないことの原因となる特性
である。この様な相違は、ＨＩＶの種々の分離物間にも
、存在する；これは、ＥＮＶ　　糖蛋白質の配列につい
て最大であり（２５％まで）　％　ｇ　ａ　ｇ遺伝の配
列について最少（５〜１０％）である（ストラーキック
ら、１９８６年）。従って、ＨＩＶによる感染に対する
免疫応答を刺激するために、ｇａｇ遺伝子によりエンコ
ードされた蛋白質の使用が、本発明において採用されて
いる戦略の一つである。

ＨＩＶ−１のＦ蛋白質は、ミリスチル化された蛋白質で
あり、幾つかの分離物では、蛋白質キナーゼＣによりホ
スホリル化されている。さらに、Ｆ蛋白質は、Ｔ４抗原
の発現を制御しており、かくしてＨＩＶにより引起こさ
れる感染の確立および維持に重要な役割を果たし得るこ
とが知られている。従って、Ｆ抗原に関する免疫応答の
誘発が、重要であるように思われる。）（ＩＶ−２のゲ
ノム配列から推定されたＦ蛋白質の一次構造は、ＨＩＶ
−１の対応する蛋白質（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）と実質的な類似性を示している。特に、膜へ
の固定に必要なミリスチル化され得る部位があり、Ｎ−
末端には蛋白質キナーゼＣによるホスホリル化のための
部位がある。さらに、Ｃ−末端部分、恐らく免疫系に最
も晒される部分には、実質的な配列の相同性が存在し、
Ｎ−末端部分は、疎水性のミリスチン酸を介して膜に固
定されている。従って、ＨＩＶ−２ウィルスのＦ蛋白質
に対する免疫応答を誘発させることが好ましいものと推
考される。

本発明は、従って、ＨＩＶ−２ウィルスに対するワクチ
ンを開発するために有用な手段を提供することを目的と
する。本願明細書においては、ＨＩＶ−２ウィルスとは
、ギアデら（１９８７年）による文献に記載されたウィ
ルス、このウィルスの点突然変異体または部分欠失体、
ならびに関連するウィルス、特にヒトにエイズを起こし
得るＨＩＶ−１とは異なるハイブリッド　ウィルスおよ
びＨＩ　Ｖ−２とハイブリッドを形成し得るウィルスを
指称するものと理解すべきである。典型的なＨＩ　Ｖ−
２ウィルスは、下記の各実施例に示すプラスミドに対応
する。

本発明は、一般に、ＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質の一つ
をコードするヌクレオチド配列を含み、真核または原核
細胞中でこの蛋白質の発現を指示し得るウィルスベクタ
ーまたはプラスミドベクターに関する。

換言すれば、本発明の対象は、感染若しくは形質変換さ
れた細胞内でＨＩ　Ｖ−２ウィルスの蛋白質を発現させ
るためのウィルスベクターまたはプラスミドベクターに
あり、これは下記の部分を含むニ ー異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ウィルスまたはプ
ラスミドのゲノムの一部、 −ＨＩ　Ｖ−２ウィルスの蛋白質の一つをコードするヌ
クレオチド配列、および 一真核または原核細胞中でこの蛋白質の発現を指示する
要素。

使用し得るウィルスベクターには、異種ウィルス、すな
わちＨＩ　Ｖ−２とは異なるウィルスが当然挙げられる
；より具体的には、ボックスウィルス、およびアデノウ
ィルス、ヘルペスウィルス、バキュロウィルスなどのウ
ィルス類を挙げることが出来る。

しかしながら、ボックスウィルスのゲノムの一部を使用
することが好ましく、ワクシニアウィルス（ＶＶ）ゲノ
ムの一部を使用することがより好ましい。

ワクシニアウィルスは、二本鎖のＤＮＡウィルスであり
、天然痘予防および撲滅のために世界中で広く使用され
てきた。最近の技術的発展により、このウィルスをクロ
ーニングベクターとして使用することが可能となり（パ
ニカリおよびパオレッティ、１９８２年）、また、生き
た組換ウィルスは、外来抗原の発現を可能とし、異種の
ウィルス性または寄生的疾患に対抗する免疫を得ること
をさえも可能としている。

かくして、幾つかの研究グループが、インフルエンザお
よびＢ型肝炎抗原ならびに狂犬病糖蛋白質の発現のため
にこのタイプの組換体を使用して、これらの疾患に対す
る免疫を得ることを示している（スミスら、１９８３年
；パニカリら、１９８３年；キー：−ら、１９８４年）
。ワクシニアウィルス中でのＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子
の発現も、チャクラパーティら、１９８６年；ツーら、
１９８６年；キー：−ら、１９８６年などにより、示さ
れている。

ワクシニアウィルス（ＶＶ）により外来蛋白質をコード
する配列は、必然的に下記の３つの段階を含む： １）コード化配列をＶＶプロモーターと一列に並べ、Ｖ
Ｖ　　ＤＮＡの非必須セグメント中に挿入し、適当な細
菌性のプラスミド中でクローン化させなければならない
、 ２）コード化配列の両側に位置するＶＶ　　ＤＮＡ配列
は、プラスミドと受容細胞のウィルス性ゲノムとの間の
相同組換を可能としなければならない：二重相互的組換
現象は、プラスミドからウィルスゲノムへのＤＮＡイン
サートの移行を生じさせ、ＤＮＡインサートは、ウィル
スゲノム内で増殖し、発現される（パニカリおよびパオ
レッティ、１９８２年：マケットら、１９８２年；スミ
スら、１９８３年；パニカリら、１９８３年）、３）適
当な細胞中での組換ＶＶゲノムに導入されたＤＮＡ配列
の発現。

当然のことながら、このタイプのベクターの使用は、し
ばしばベクターウィルスのゲノムの部分的変化を伴う。

本発明は、より詳しくは、ベクターにより感染または形
質変換された細胞内でＨＩ　Ｖ−２の蛋白質を発現する
ためのベクターに関し、該ベクター内では、ＨＩＶ−２
ウィルスの蛋白質の一つをコードするヌクレオチド配列
が、ＨＩＶ−２ウィルスのエンベロープ　糖蛋白質（ｇ
　ｐ）の一つをコードするヌクレオチド配列である。

ここで注意すべきは、ＨＩＶ−２ウィルスのエンベロー
プ　糖蛋白質（ｇｐ）には、それらの質量（ｋＤａ）に
よって命名された３種のもの、すなわち、ｇｐ１６０、
ｇ　ｐ　１２．０およびｇｐ４０（またはｇｐ３２）が
存在するということである。

第１のもの、ｇｐ１６０は、実際は、後の２つの蛋白質
のプレカーサーである。

これら３種の蛋白質を発現することが望ましい。

全体のＥＮＶ蛋白質をコードする遺伝子をクローンさせ
たウィルスベクターを使用して行なった最初のテストの
結果から、発現産物の免疫原性を改善するために、この
遺伝子を改良することが提案された。

ＨＩＶ−１の場合と同様に、培地上澄液へのＥＮＶ蛋白
質の実質的な放出（恐らく生体内では、循環する体液中
で生じている放出）が、観察された。これは、細胞膜へ
の付着が不十分であるためと推測される。さらに、細胞
表面での抗原の存在が、ワクシニア系での免疫反応の誘
導に非常に重要であることが知られている。従って、細
胞膜への糖蛋白質の固定性改善のために、ｅｎｖ遺伝子
を修正することが提案されている。

これは、ｇｐ１２０とｇｐ４０との間での酵素による開
裂部位、特にＫＥＫＲ部位（アミノ酸５０１〜５０４）
を除去する様に、ｇｐ１２０とｇｐ４０（又はｇｐ３２
）のコード化配列の間でｅｎ■遺伝子を修正することに
より、達成される。

本発明は、さらにＧＡＰ蛋白質、特にｐ５７、ｐ２６お
よびｐ１６蛋白質の発現に関する。

従って、本発明は、感染または形質変換された細胞内で
ＨＩ　Ｖ−２ウィルスの蛋白質を発現するためのウィル
ス性ベクターまたはプラスミドベクターであって、ＨＩ
Ｖ−２ウィルスの蛋白質の一種をコードするヌクレオチ
ド配列が、ＨＩＶ−２ウィルスのＧＡＰ蛋白質の少なく
とも一種をコードするヌクレオチド配列であるベクター
に関する。

最後に、本発明は、Ｆ遺伝子の発現にも関する。

すなわち、本発明は、より詳細には、感染または形質変
換された細胞内でＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質を発現す
るためのウィルス性ベクターまたはプラスミドベクター
であって、ＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質の一種をコード
するヌクレオチド配列が、ＨＩＶ−２ウィルスのＦ蛋白
質をコードするヌクレオチド配列であるベクターに関す
る。

Ｆ蛋白質の免疫原性を増大させるために、Ｆ蛋白質を細
胞膜内に固定することが好ましい。本発明の一つの特徴
とするところでは、Ｆ蛋白質をコードする配列は、ハシ
力　ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）蛋白質と同様にＮ−
末端固定配列と同−川内に融合されている（ｆｕｓｅｄ
　ｉｎ　ｐｈａｓｅ　ｗｉｔｈ　ａｎＮ−ｔｅｒｍｉｎ
ａｌ　ａｎｃｈｏｒａｇｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　。

一般に、当該遺伝子を発現させるためにワクシニア　ウ
ィルスを使用する場合には、遺伝子がワクシニア　ウィ
ルス　プロモーターの制御下にあり、且つ７．５に蛋白
質プロモーターを選択することが好ましい。さらに、コ
ード化配列が、ワクシニア　ウィルスの非必須遺伝子内
にクローン化される。多くの場合、これは、Ｔ　Ｋ遺伝
子であり、必要ならば、マーカー（Ｔ　Ｋ−″）として
使用される。

従って、本発明は、主に、ＨＩＶ−２ウィルスのｅｎｖ
ＳｇａｇおよびＦ遺伝子によりエンコードされる蛋白質
ならびにこれらの開裂生成物を細胞培地内で得るための
ウィルスベクターまたはプラスミドベクターの使用に関
する。本発明は、さらに、上記の本発明のウィルスベク
ターにより感染されたまたはプラスミドにより形質変換
された細胞、あるいは対応する組換ＤＮＡを含むことが
ある細胞にも、関する。これらの細胞中でも、ヒ。

トニ倍体細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞または初代培養な
どの哺乳類細胞が、特に挙げられる。勿論、昆虫細胞、
酵母、細菌などの他のタイプのものを使用することも可
能である。

この様にして得られた蛋白質は、精製後、ワクチンの製
造に使用され得る。

特にＥＮＶ　　糖蛋白質の場合には、可溶性のｇｐ１６
０、すなわち、膜固定領域を失ったものを発現すること
が可能であり、これは、“サブユニット　ワクチン″を
作成するために、感染細胞の上澄液中に集められる。

さらに、ワクチン接種を行なうために、本発明のウィル
ス性ベクターを直接使用することも、考えられ、この場
合には、糖蛋白質は、投与箇所の生体内で生成される。

数種のワクチン剤、特にＥＮＶ蛋白質とＧＡＰ蛋白質お
よびＦ蛋白質の一方とを発現するベクターに対応するワ
クチン剤を同時または別々に投与する組合わせ使用を考
慮することも、有利である。

ＨＩＶ−１およびＨＩ　Ｖ−２に対する保護剤を併用す
るワクチンを使用することも、有利である。

これらのワクチンは、上述の対応する組換ウィルス（生
きたまたは不活性）を使用するか、或いは感染した細胞
の培養生成物またはこれらの培養物の成る種の成分を使
用することにより、得られる。

この様なワクチンは、公知の手法に従って、特に細胞培
地の生成物の免疫原性を改善する補助薬とともに使用さ
れる。

投与経路は、選択されたワクチンのタイプに応じて定め
られる。

最後に、本発明は、前述のウィルスベクターによる生体
の感染および所定時間後に誘発される抗体の回収により
得られる、ＨＩＶ−２の蛋白質に対する抗体にも関する
。

対応する抗体と同様に、得られた抗原は、対応するウィ
ルスによる感染の検出を可能ならしめる診断キットにお
いて使用され得る。

かくして得られた組換蛋白質は、ウィルスと接触した患
者の血液中に存在する可能性のある抗体の検出用キット
において使用され得る。これらのテストは、当業者に知
られた方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＰＡ、’ウェス
ターン　ブロッティング（免疫プロッティング）″など
により行われる。

これらの蛋白質は、サンプル中のウィルスの存在を検知
する様にデザインされたハイブリドーマおよびモノクロ
ーナル抗体の製造にも使用され得る。

これらの蛋白質、細胞培養物およびワクチン製造技術な
どは、公知のワクチンについて現在行われているものと
同様であるので、詳しくは説明しない。

方　　法 クローニング マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、１９８２の方
法による。

酵素 販売会社の指示書に従い使用する。

局在的突然変異（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ　）シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）及びスミス（Ｓ　
ｍ１ｔｈ）、１９８３の方法による。

ワクニシアへの移入 キーニ（Ｋｉｅｎｙ）ら、１９８４の方法に従う。

但し、ＬＭＴＫ−細胞を１４３Ｂヒト細胞で置き換える
。

ストックウィルスの調製 無菌ひな一次細胞（ｃｈｉｃｋ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅ
ｌｌ）を、３７℃にて４日間（培地Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋　５
％ＮＣ３）０．１ｐｆｕ／細胞にて感染させる。

ウィルスの精製 上記ストックウィルスの遠、心分離を２５０Ｏｒ。

ｐｏｍにて１５分間行なう（ツルパル　ローター（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ　ｒｏｔｏｒ）　ＧＳＡ）　ｏ上清を分離し
、ペレットを、ＲＢＳ緩衝液（１０ｍＭ　　ＴＲｌ５−
ＨＣＪＬ　ｐＨ７，４，１０ｍＭ　　ＫＣＩ、１ｍＭＭ
ｇＣｆ２）中に４℃で１５分間入れる。ボッター（ｐｏ
ｔｔｅｒ）中で磨砕し、２５０Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で１５分間遠心分離を行なう。得られた上清を前記上清
に添加し、次いで第二の磨砕を同様に行なつ。

全ての上清を１０ＩＴ１１２の３６％（ｗ／ｖ　）スク
ロースクツション（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８）上
に付着させる。遠心分離を１４００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて
２時間行なう（ベックマンローター（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ
ｒｏｔｏｒ　　５Ｗ２８）。ペレットを採取し、第二の
同クツション上に分散、置換する。第二のペレ・ノドを
５軛のＰＢＳ中に入れ、２０〜４０％のスクロース勾配
（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８）にかける（同上のロ
ーター）。遠心分離は、１２００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で４５
分間行なう。

ウィルスのバンドを回収し、２０００Ｏｒ、ｐ。

ｍ、で１時間遠心分離することによりペレット化する。

得られるペレットは、１０ｍＭ　　ＴｒｉｓｐＨ８に入
れる。

免疫沈降 ＢＨＫ２１細胞（直径３ｃｍのデイツシュ、デイツシュ
当り１０６細胞、Ｇ−ＭＥＭ＋１０％ＦＣ３中で培養）
の感染を、Ｑ、２ｐｆｕ／細胞にて１８時間行なう。培
地をデカントし、デイ・ソシュ当り、メチオニンを含ま
ない培地１軛及び［３５Ｓ］メチオニン（アメルシャム （Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　）　１０　ｔｔ　ｌで置換す
る。

２時間後、過剰の非放射性メチオニンを添加する。

標識化終了後、次の行程を行なう。即ち、感染細胞をは
がし取り、エペンドルフ（Ｅ　ｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心
分離機中で１分間遠心分離し、上清画分とペレットの分
離を行ない、該ペレットをＰＢＳ緩衝液中で一回洗浄し
、次いで免疫沈降とゲル電気泳動を行なう（ラス（Ｌ　
ａｔｈｅ）ら、１９８０による）ウェスタンブロッティ
ング ＨＩ　Ｖ−２ウィルスの蛋白質に向けられた抗体を検出
するこの手法は、ディアグノスティックスパストウール
（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　　Ｐａ５ｔｅｕｒ）により
販売されているＬＡＶ−ＢＬＯＴ　（登録商標）のウェ
スタンブロッティングに記載された方法に準するもので
ある。

以下に実施例を掲げて本発明の特徴と利点を説明する。

実施例１　　ｅｎｖ配列を有するバタテリオファージＭ
１３の構築 ７５０１５　　パリ　リュ　デュ　トクチュールル−２
８に住所を有するアンスティトウーパトゥールのコレク
シオン　ナシオナル　ド　クルチュール　ド　ミクロオ
ルガニスムス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　ｄｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅＭ　ｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｓ）に寄託されているプラスミドｐＲＯ
Ｄ３５は、ＨＩＶ−２ゲノムの４．３ｋｂの右側末端を
含んでおり、従って、ｅｎｖ遺伝子のコーディング配列
の全てを含んでいる。（このプラスミドは、寄託番号ｌ
−６３３を有する。）ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ制限フラグメ
ント（位置５３０４〜９２４３）を、バタテリオファー
ジＭ１３ＴＧ１３１のＫｐｎＩサイトに、転写の方向が
Ｍ１３により保有されているβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の転写方向であるようなオリエンテーションで、挿入
する（Ｍ１３ＴＧ１１６２）。

実施例２　ｅｎｖ遺伝子を有するワクニシアウィルス中
への転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）用プラスミドの構築 ファージＭ１３ＴＧ１１６２の構築に用いた、ｅｎｖの
コーディング配列から上流に位置するＫｐｎＩサイトは
、ｅｎｖの開始ＡＴＧから８４３ｂｐの距離にある。従
って、該ＡＴＧの近傍に一つの制限部位を創造する必要
がある。これは、オリゴヌクレオチド ５’　　ＣＡＴＣＡ丁ＡＣＴＣＡＣＡＧＡ丁ＣＴＧＧＴ
ＧＴＡＧＧ　　３’ｇＬＩＩ を用いて行なった。

こうして、ＢｇｌＩＩサイトをバタテリオファージＭ１
３７Ｇ１１６２中に導入し、ファージＭ１３ＴＧ１１６
３を得た。次いで、Ｍ１３ＴＧ１１６３のＢｇｌｎ−Ｂ
ｇｌｌＩ制限フラグメントを、プラスミドｐＴＧ１８６
ＰＯＬＹのＢａｍＨＩサイトに挿入する。これはワクニ
シアウィルス（ｐＴＧ２１５１）中へのｅｎｖ遺伝子の
転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を可能とする。

実施例３　　ｇｐ４０のコーディング配列中に存在する
停止シグナルの除去 プラスミドｐＲＯＤ３５のｅｎｖ遺伝子のコーディング
配列は、位置８３０４に翻訳停止コドンを含んでいる（
これは、プラスミドｐＲＯＤ３５の特徴であるが、他の
単離物も停止シグナルを含んでいる）。実際のところ、
ヌクレオチドＴはこの位置でコドンＴＡＧを発生させる
。この領域に対応する配列は、他のクローン上で完成さ
れ、ヌクレオチドＴがＣによって置換されなければなら
ないことが確立された。従って、全ｅｎｖ遺伝子をコー
ドする配列を得るためには、停止コドンを突然変異させ
ることが適切である。

これは、下記オリゴヌクレオチド ５’　　ＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡ丁ＡＴ　　３’
ＴＡＴＴ ［＊は、非相同位置］ を用いる局在的突然変異により行なう。

得られたバタテリオファージを、Ｍ１３ＴＧ１１６４と
呼ぶ。

次いで、Ｍ１３ＴＧ１１６４のＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ
制限フラグメントを、プラスミドｐＴＧ１８６ＰＯＬＹ
のＢａｍＨＩサイトに導入することにより、プラスミド
ｐＴＧ２１５２を作成した。

実施例４　非開裂ｅｎｖ遺伝子を有するプラスミドの構
築 ｇｐ１２０蛋白質及びｇｐ４０蛋白質が、ｇｐ１６０の
蛋白分解的開裂により生成する。該ｇｐ１２０は、培養
培地中に急速に遊離される。従って非開裂ＥＮＶ蛋白質
を得るのが有利である。実際、可溶性蛋白質は、ワクニ
シア発現系中では免疫原性が乏しい。

この目的のため、ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド配列を、
Ｍ１３ＴＧ１１６４中で、下記オリゴヌクレオチド ５’　　ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＧＡ丁ＡＴ
ＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＧＣＧＡＡ　　３’。

を用いて、開裂部位（位置７６３５〜７６４８）に対応
する部分に関し、変異させる。

この突然変異は、ＥｃｏＲＶ制限部位を導入し、これは
変異クローンの同定を可能とする。新しい配列は、次の
通りである。

Ｔ　　　に　　　ＥＫＲ 当初のクローン：　ＣＣＴ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　
ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＡＣ変異後　　　　：　ＣＣＴ　Ａ
ＣＡ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＡＣ丁ＡＣＱＤＱＮ 生成したバクテリオファージを、Ｍ１３ＴＧ１１６５と
呼ぶ。

次いでＢｇｌＩＩ制限フラグメントを、転移プラスミド
ｐＴＧ１８６Ｉ’ＯＬＹのＢａｍＨＩ部位中でクローン
化し、プラスミドｐＴＧ２１５８を得る。

実施例５　　ｇａｇ遺伝子のコーディング配列を含むバ
クテリオファージＭ１３の構築 パリ　７５０１５　　リュ　デュ　ドクチュールル−２
８に住所を有するアンスティトゥーパトウールのコレク
シオン　ナシオナル　ド　クルチュール　ミクロオルガ
ニスムスに寄託されているプラスミドｐＲＯＤ２７−５
’　は、ＨＩＶ−２ウィルスゲノムの左側末端を含むＥ
ｃｏＲｒ制限フラグメントを含む。（このプラスミドは
、寄託番号ｌ−６２６を有する。） ＢｇｌＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（位置５０２〜
２６５８）を、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼ
でＢｇｌＩ端及びＢａｍＨＩ端を補充した後、バクテリ
オファージＭ１３ＴＧ１３１のＢａｍＨＩサイトとＥｃ
ｏＲＩサイトとの間に挿入する。

こうして、ｇａｇ遺伝子の全配列を含むファージＭ１３
ＴＧ１１５５を生成させる。

実施例６　　ｇａｇ遺伝子によりコードされる蛋白質の
発現を可能とするプラスミドの構 築 ファージＭ１３ＴＧ１１５５のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ
制限フラグメントを、転移プラスミドｐＴＧ１８６ＰＯ
ＬＹのＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトとの間でク
ローン化して、ｐＴＧ２１１２を得る。Ｍ１３ＴＧ１１
５５中の８ｇｌｎサイトは、ベクターバクテリオファー
ジのポリリンカーに由来するものである。

実施例７　Ｐ２６の発現を可能とするプラスミドの構築 バクテリオファージＭ１３７Ｇ１１５５のＰｓ　ｔ　Ｉ
−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、バクテリオファージ
Ｍ１３ＴＧ１３０のＰｓｔＩサイトとＥｃｏＲＩサイト
との間でクローン化する。

２つのオリゴヌクレオチドを用いて行なった局在的突然
変異により、Ｐ２６をコードする配列の５′末端（位置
９５１）におけるＡＴＧコドン及びＢｇｌＩＩ制限部位
と、３′末端（位置１６４１）におけるストップコドン
及び５ｓｔＩ制限部位とが同時に導入される。上記２つ
のオリゴヌクレオチドは、次のものである。

☆★嚢倉嚢☆嚢★★に★裔に★ ［＊は、親配列と相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）でない
位置である。］ こうして、ファージＭ１３ＴＧ１１５７からＭ１３７Ｇ
１１５８が生成される。

次いでＭ１３ＴＧ１１５８のＢｇｌＩＩ−８ｓｔ工制限
フラグメントを、転移プラスミドｐＴＧ１８６ＰＯＬＹ
のＢａｍＨＩサイトとＳｓｔサイトとの間でクローン化
する（ｐＴＧ２１１１）。

実施例８　ＰＩ３の発現を可能とするプラスミドの構築 バクテリオファージＭ１３７Ｇ１１５５において、８ｇ
ｌｎサイトが、ｇａｇ遺伝子の（従ってＰＩ３をコード
する配列の）開始ＡＴＧから下流に位置している。

従って、ＰＩ３をコードする配列の３′末端にストップ
コドンと制限部位を導入すべく、局在的突然変異を行な
う必要がある。これは、下記ヌクレオチド （ＡＧＴ） ５’　　ＣＣＧＣＣＴＡＣ丁ＧＴ丁ＧＡＡＴＴＣＡＧ丁
ＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣ３’εｃｏＲＩ を用いて行なわれる。

こうしてバクテリオファージＭ１３７Ｇ１１５６を得る
。

次いで、Ｍ１３ＴＧ１１５６のＢａ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ
制限フラグメントを、転移プラスミドｐＴＧ１８６ＰＯ
ＬＹのＢａｍＨＩ制限サイトとＥｃｏＲＩ制限サイトと
の間に挿入し、プラスミドｐＴＧ２１１０を得る。

実施例　９ Ｆ遺伝子を有するプラスミドｐＴＧ１１９８の構築 ＨＩＶ−２のＦ蛋白質をコードする配列は、プラスミド
ＰＳＰＥ　（アンスティトウー　バストウール、パリ）
に組込まれクローン化されたｃＤＮＡに由来する。酵素
ＰｖｕＩＩを用いる開裂により得られ且つＦ遺伝子（ヌ
クレオチド８４２９−９３７８）を有する９５０−ｂｐ
フラグメントをＳｍａＩサイトで開いたファージＭ１３
ＭＰＢ内にクローン化する。得られたファージをＭ１３
ＴＧ１１５２と呼ぶ。Ｆ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧ
の上流にＢｇｌＩＩサイトを設けるために、下記配列 ５’　　ＡＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＡ丁ＴＡＧＡＴＣＴ
ＡＧＧＣＴＧＴ丁ＣＴＡＡＧ丁Ｃ３’９ＬＩＩ を持つオリゴヌクレオチドを用いて、突然変異誘発を実
施した。

得られるファージをＭ１３ＴＧ１１５３とする。

Ｍ１３ＴＧ１１５３のＢｇｌＩＩ−８ａｉｌフラグメン
トはＦ遺伝子のコード配列を有し、上述のワクシニアウ
ィルスへの移入を遂げるために、伝達プラスミド、ｐＴ
Ｇ１８６ＰＯＬＹに組込まれクローン化される。得られ
るプラスミドをｐＴＧ１１９８と呼ぶ。

実施例　１０ 麻疹ウィルスのＨＡ蛋白質の固定領域をコードする配列
の後方にあるＦ遺伝子を持つプラスミドｐＴＧ２１５７
の構築 プラスミドｐＴＧ１１６９は、アンスティトウバストウ
ールのコレクシオン　ナシオナルド　クルチュール　ド
　ミクロオルガニスムスに寄託番号ｌ−６５７にて、１
９８７年４月３日に寄託された。

麻疹ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）をコードする配列を
持つプラスミドｐＴＧ１１６９　（フランス国特許第８
７１０９，６２９号参照）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラ
グメントを同じサイトで開裂したファージＭ１３７Ｇ１
３１　（同特許）内にクローン化する。得られるファー
ジをＭ１３７Ｇ１１５つと呼ぶ。

下記のオリゴヌクレオチド ５’　　Ｃ丁ＣＴＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＧＡ丁ＣＣ
ＣＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＡＡＴ　　３’ＢａｍＨ！ を用い、Ｍ１３７Ｇ１１５９において、麻疹のＨＡの疎
水性固定領域をコードする配列のすぐ下流にＢａｍＨＩ
サイトを設ける。

得られるファージをＭ１３ＴＧ１１６０と呼ぶ。

Ｍ１３ＴＧ１１６０の２００ｂｐのＰｓｔＩ−ＢａｍＨ
ＩフラグメントはＨＡ（疎水性固定領域）をコードする
配列のフラグメントを有し、同じサイトで開裂されたｐ
ＴＧ１８６ＰＯＬＹ内にクローン化される。得られるプ
ラスミドがｐＴＧ２１５５である。このプラスミドは、
ＨＡの固定領域より下流に位置するＢａｍＨＩサイトへ
の、ＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩサイトを同一相に（ｉｎ
　ｐｈａｓｅ）持つ異種遺伝子（ｆｏｒｅｉｇｉｎ　ｇ
ｅｎｅ）のクローン化を可能にする（下図参照、この場
合ＧＧＡ又はＡＧＡコドンはコード化している）。

Ｎ−末端フラグメント 麻疹ＨＡ ＨＩ　Ｖ−２のＦ遺伝子を有するＭ１３ＴＧ１１５３（
上述）のＢｇｌｌＩフラグメントを、ＢａｍＨｌで開裂
されたｐＴＧ２１５５内にコーディング方向にてクロー
ン化する。ＨＡの固定領域と融合されたＦ遺伝子を有す
る得られたプラスミドをｐＴＧ２１５７と呼ぶ。

ハイブリッドＦ蛋白質をコードする配列をワクシニアウ
ィルス内に移入する。上記により作成された組換えウィ
ルスをＶＶ、ＴＧ、Ｆ、ＨＩＶ−２，２１５７とする。

実施例　１１ ＨＩＶ−２の蛋白質をコードする遺伝子のワクシニアウ
ィルスのゲノムへの導入及び組換えウィルスの単離 スミス（Ｓｍｉｔｈ）らによる方法（１９８３）は、感
染された細胞におけるワクシニアウィルスのゲノムの相
同配列間でインビボで起こる遺伝子組換えに基く。この
現象は、プラスミドに組込まれりローン化されたＤＮＡ
フラグメントのウィルスゲノムへの移入を可能にする。

ワクシニアウィルスのチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）遺伝
子の使用は、この遺伝子の遺伝子座における異種ＤＮＡ
の組込みを引起こすだけでなく、ＴＫ−となった組換え
ウィルスの選択のための表現型マーカーを有することを
可能とする。

ＴＫ−ウィルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５Ｂ
ＵＤＲ）の存在下に、ＴＫ−株化細胞上にブレーティン
グ（Ｐｌａｔｉｎｇ）することにより選択できる（マケ
ット（Ｍａｅｋｅｔｔ）ら、１９８２）、そこにおいて
、ＴＫ−ウィルスはそのＤＮＡを正常に複製し、眼に見
えるプラークを形成することができる。

ワクシニアウィルスは、感染された細胞の核よりむしろ
細胞質において増殖する。このため、ＤＮＡ複製及び転
写のための宿主の機構を利用することができず、ウィル
ス粒子がそのゲノムの発現のための成分を持つことが必
要である。精製されたＶＶＤＮＡは非感染性である。

組換え体を誘発するために、ＶＶウィルス粒子による細
胞感染と、ワクシニアＤＮＡに相同する領域を担うクロ
ーン化された異種ＤＮＡセグメントによる形質移入を同
時に実施することが必要である。それにもかかわらず、
組換え体の誘発は、ＤＮＡによる形質移入能力がある細
胞のほんの一部に限定される。

感染生菌ウィルスとして、３９．５℃の非許容温度では
増殖できないワクシニアの感温性（ｔ　ｓ）変異体（ド
リリアンとスペーナー（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　ｅｔＳｐｅ
ｈｎｅｒ　、　１９８３）を用いる場合、非組換えウィ
ルスからなるバックグラウンドを減する。細胞を非許容
条件下にｔｓ変異体で感染し、野生型ウィルスのＤＮＡ
で形質移入する場合、ウィルスの増殖は、形質移入能力
があり、且つ、そこで野生型ウィルスＤＮＡとｔｓウィ
ルスゲノム間の組換えが行われた細胞においてのみ進行
し、感染された細胞であるという事実にもかかわらず他
の細胞ではウィルスは全く増殖しないであろう。もし、
ワクシニアＤＮＡのフラグメントを持つ組換えプラスミ
ドが、適当な濃度で野生型ＤＮＡと共に移入混合物に含
まれる場合には、コンピテント細胞においてワクシニア
ＤＮＡとの相同組換えににおいでこれが関与することも
又可能である。

鶏胚線維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）の初期細胞（ｐｒｉｍａｒ
ｙ　ｃｅｌｌ）の単層を３３℃にてＶＶ−：ＩＩペンハ
ーゲン（ＶＶ−Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）　ｔ　ｓ　７　
（０，１ｐ　ｆＵ／細胞）で感染させ、野生型ＶＶ−コ
ペン／＼−ゲンウィルスのＤＮＡのリン酸カルシウム共
沈澱物（５０ｎｇ／１０６細胞）及び組換えプラスミド
（５０ｎｇ／１０６細胞）により形質移入させる。

３３°Ｃで２時間のインキュベーションの後、細胞を３
９．５℃にて４８時間インキュベートする。

この温度はｔｓウィルスの発育を許容しない。

ｔｓ＋ウィルスの希釈溶液は、５ＢＵＤＲ（１５０μｇ
／ｍｌ）の存在下に３７℃でヒト１４３Ｂ−ＴＫ−″細
胞の単層を感染させるのに用いられる。

種々のＴＫ−ウィルスプラークが、組換えプラスミドを
組込んだこれらの細胞から得られる。一方、対照である
プラスミドが存在しない培養液は、目に見えるプラーク
を産出しない。次いで、ＴＫ−ウィルスを５ＢＵＤＲの
存在下に二次選択（ｓｅｃｏｎｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ
）することにより、サブクローン化する。

伝達プラスミドとＶＶゲノムとの間の二重相互組換え（
ｄｏｕｂｌｅ　ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎ）の結果、インサートを担うＴＫ遺伝子と
ウィルスのＴＫ遺伝子とを交換させ、従って、組換え体
はＴＫ−となる。

種々のＴ　Ｋ−組換えウィルスから得られた精製ＤＮＡ
をＨｉｎｄｍで消化し、アガロースゲル電気泳動に供す
る。ＤＮＡフラグメントをサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）
による方法（１９７５）に従って、ニトロセルロース膜
に移す。次いで、予め同位体３２ｐでラベルされた移入
に用いられるプラスミドと共に膜をインキュベートする
。膜を洗浄し、オートラジオグラフィーにかける。現像
後、ワクシニアゲノム内へのＴＫ遺伝子の移入を証明す
る大きさのフラグメントの存在が膜上に観察される。

各々のプラスミドについて、組換えウィルスを選択し、
プラスミドと同じ番号を持つＶＶ、ＴＧ。

ＨＩＶ−２とした。従って、下記の組換えウィルスが得
られた： ＶＶ、ＴＧ、ＨＩＶ−２−２１５１ ＶＶ、ＴＧ、１ＩＩＶ−２−２１５２ ＶＶ、ＴＧ、１ＩＩＶ−２−２１５８ ＶＶ、ＴＧ、ＨＩＶ−２−２１１２ ＶＶ、ＴＧ、１ｌＩＶ−２−２１１１ ＶＶ、ＴＧ、旧Ｖ−２−２１１０ ＶＶ、ＴＧ、ｌ１ｌＶ−２−１１９８ （ＥＮＶ　ｇｐ１２０−ｇｐ３２） （ＥＮＶ　ｇｐ１２０−ｇｐ４０） （非開裂ＥＮＶ） （ＧＡＧ） （Ｐ２６） （ＰＩ３） （Ｆ） ＶＶ、ＴＧ、１ＩＩＶ−２−２１５７（膜Ｆ）実施例　
１２ 組換えウィルスＶＶ、ＴＧ、Ｆ、ＨＩＶ−２−１１９８
により合成された蛋白質の免疫沈降組換えワクシニアウ
ィルスを用いてＨＩＶ−２のＦ遺伝子の発現を証明する
ために、ＢＨＫ２１げっ肉類細胞（５％牛脂児血清を含
有するＧ−ＭＥＭ培地において培養される）を数組換え
体ＶＶ、　ＴＧ、Ｆ、ＨＩＶ−２−１１９８と共に培養
する。

半融合性単層（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎ
ｏｌａｙｅｒ）（１０６細胞）をＱ、２ｐｆｕ／細胞で
感染し、１８時間インキュベートする。

次いで、培地を除き、ＭＥＭ培地において１０μｌの［
３５Ｓ］メチオニン（５ｍＣｉ／３００μｍ）を補充さ
れた低濃度のメチオニン（１０６細胞について１ｍ１）
またはトリチウム（３Ｈ）で標識されたミリスチン酸（
アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））１００μＣｉ　／
　ｍｌのどちらかを含有する培地を加える。

細胞を３７℃でインキュベートし、標識蛋白質を遠心分
離により回収する。ペレットと上清みに分離した後、Ｈ
ＩＶ−２抗原について血清反応陽性の患者の血清と共に
この蛋白質をインキュベートする。

血清と反応する蛋白質を蛋白質Ａ−セファロース樹脂（
ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ
）に吸着させることにより回収し、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルを使用する電気泳動により展開し、ラテ（
Ｌａｔｈｅ）らによる方法（１９８０）に従ってオート
ラジオグラフィーにかける。試験した４種のＨＩＶ−２
（＋）血清のうち、１種のみがＨＩＶ−２のＦ蛋白質を
特異的に免疫沈降させうる。得られた免疫沈降物を第１
図のオートラジオグラフに示す。第１図において： Ｍ＝　［３Ｈ］　　ミリスチン酸による標識Ｓ及びＰ＝
［３５Ｓ］メチオニンによる標識Ｓ＝上漬み Ｐ−細胞ペレット 分子量はキロダルトンで表わす。

免疫沈降の結果は、［３５Ｓ］メチオニンで標識する場
合、２種の特異的蛋白質が細胞ペレットでも培養上清で
も３１及び３３ｋＤａに移動することを明らかにしてい
る。トリチウム標識ミリスチン酸で標識する場合、僅か
１種の蛋白質が３１ｋＤａに移動する。ＨＩ　Ｖ−２の
Ｆ蛋白質の理論分子ｆｌ（２８ｋＤａ）と観察された分
子量の相違は、ＨＩＶ−１のＦ蛋白質でも既に観察され
ていた。

後者の場合の如く、低いほうの分子量のバンドがミリス
チン酸で標識された形に相当する。

実施例　１３ 大腸菌クローンによるＨ　Ｉ　Ｖ−２のｐ１６の製造Ｍ
１３ＴＧ１１５６のＧＡＧの蛋白質ｐ２６およびｐ１２
の読み枠を含むＥｃｏＲＩ制限フラグメントの欠失によ
り、Ｍ１３ＴＧ１９９１プラスミドが得られる。

合成オリゴヌクレオチド５−−ＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡ
ＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＢＧＣＴＡＣＣ−３”は、Ｍ
１３ＴＧ１９９１の定方向突然変異によるｐ１６のＡＴ
Ｇ開始コドンの直ぐ上流に一つの制限サイトＢｇｌＩＩ
を導入することを可能とする。突然変異後に得られるＭ
１３ＴＧ１９９１のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグ
メントは、酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより消化
された原核細胞性の発現ベクターｐＴＧ９５９内でクロ
ーン化される。このクローニングにより得られたプラス
ミドｐＴＧ３９４７は、クローン大腸菌ＴＧＥ９０１の
形質転換に使用され、大腸菌培地の温度を４２℃に保持
することにより、ｐ１６の生産を誘発することが可能で
あった。

実施例　１４ 大腸菌によるＨＩＶ−２のＴ）２６の製造合成オリゴヌ
クレオチド５　′−ＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡ
ＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴ−３
−は、Ｍ１３ＴＧ１１５８のｐ２６の読み枠のＮＨ２末
端に制限酵素ＢｇｌＩＩサイト、およびメチオニンおよ
びアラニン、アミノ酸の導入を可能とし、Ｍｌ　３ＴＧ
１９９４を与える。合成オリゴヌクレオチド５′−ＴＡ
ＡＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡ−３＝によ
る新たな突然変異は、ｐ２６・の読み枠のＣ０ＯＨ末端
に停止コドンおよび制限酵素ＥｃｏＲＩのサイトを位置
せしめ、Ｍ１３７Ｇ１９９５を与える。ｐ２６の読み枠
を含むＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、酵素Ｂ
ａ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩにより処理された原核細胞性
の発現ベクターｐＴＧ９５９内でクローン化され、プラ
スミドｐＴＧ３９４８を与える。

クローン大腸菌ＴＧＥ９０１は、このプスミドにより形
質転換され、ｐ２６の生産は、培地の温度を４２°Ｃに
保持することにより、大腸菌内で誘発される。

実施例　１５ 大腸菌によるＨＩＶ−２のｐ５７の製造合成オリゴヌク
レオチド５　＝　ＴＣＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＡＧＡＴＣ
ＴＣＡＡＴＣＧＧＣＴＡＣＣ−３＝は、Ｍ１３ＴＧ１１
５５の定方向突然変異によるｐ５７の読み枠のＡＴＧ開
始コドンの直ぐ上流に一つのＢｇｌＩＩ制限サイトを導
入することを可能とする。この突然変異から生成したＭ
１３ＴＧ９９３を酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩによ
り処理（部分消化）する。ｐ５７の読み枠を含む制限フ
ラグメントを、酵素Ｂａｌ■およびＥｃｏＲＩにより処
理された原核細胞性の発現ベクターｐＴＧ９５９内でク
ローン化し、プラスミドｐＴＧ３９４９を得る。クロー
ン大腸菌ＴＧＥ９０１は、このプスミドにより形質転換
され、Ｉ）５７の生産は、４２℃の培地により、誘発さ
れる。

実施例　１６ ワクシニア　ウィルス内でのＱ蛋白質の発現プラスミド
ｐＲＯＤ３５　（ギアデら、１９８７年）の制限フラグ
メントＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ［を同じサイトで開か
れたバクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１内でクローン
化する。ＥｃｏＲＩサイトをＱ遺伝子の翻訳開始サイト
の上流側に作り出す。これは、５　＝　ＣＴＣＣＡＴＡ
ＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３
−という配列のオリゴヌクレオチドＴＧ１６７９を除く
ことにより、行われる。ＨＩ　Ｖ−２のＱ遺伝子を含む
得られたＥｃｏＲＩフラグメントは、プラスミドｐＴＧ
１８６内でサブクローンされ、公知の方法（キー：−ら
、１９８４年）にしたがって、ワクシニア　ウィルスに
移される。

得られた組換体をＶＶ、ＴＯ，ＱＨＩＶ２−３１４２と
ヨフ。我々は、ＨＩ　Ｖ−２のＱ蛋白質の特異的抗体を
使用しなかったので、ウィルス　ゲノムへのＱ遺伝子の
組み込みは、サザン　プロットによりテストされた。得
られた結果は、正しい組み込みを示している。

チャクラパーティ、ニス、　　（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ
ｉ、Ｓ、）。

ロバートーグロフ、エム（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆ　
ｆ　、　Ｍ、　）、　　ウオンースタール、エフ、　　
（Ｗｏｎｇ−８ｔａａ１．Ｆ）、ギヤ口。

アール、シー、　　（Ｇａｌｌｏ、Ｒ，Ｃ，）及びモス
、ビー（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、　３２０．５３５−５４０（１９８Ｂ） ドリリアン、アール、　　（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、Ｒ，）
　、スベーナー、デイ−、（Ｓｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、）、
ヴ（Ｄロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　　１３１，３８
５−３９３　（１９８３）。

ギアデ、エム、　　（Ｇｕｙａｄｅｒ、Ｍ、）、エマ−
マン、エム、　　（Ｅｍｅｒｍａｎ、Ｍ、）、　　ソ：
−ゴ、ピー、　　（Ｓｏｎｉｇｏ、Ｐ。

）、クラヴエル、エフ、　（Ｃｌａｖｅｌ、Ｐ、）　、
モンタニ工、エル、　　（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、
）及びアリシン、エム。

（Ａｌｉｚｏｎ、Ｍ、）　、　　Ｎａｔｕｒｅ　３２６
，６６２−６６９　（１９８７）フ、ニス、エル、　　
（Ｈｕ、Ｓ、Ｌ、）　、　　コシウスキイ。

ニス、ジー、　（Ｋｏｓｏｗｓｋｉ、Ｓ、Ｇ、）及びダ
ブリンプル。

ジエイ、エム、（Ｄａｂｒｙｍｐｌｅ、Ｊ、Ｍ、）、　
Ｎａｔｕｒｅ　３２０．５３７−５４０　（１９８Ｂ） キー：−、エム、ビー、　　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）
、　　ラテ。

アール、　　（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、　　ドリリアン、
アール。

（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、Ｒ，）　、スペーナー、ディー−
（Ｓｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、）、スコリー、ニス、　　（Ｓ
ｋｏｒｙ、Ｓ）　、　　シュミット。

デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）、　　ヴイクター、ティ
（Ｗｉｋｔｏｒ、Ｔ。

）、コブロウスキ、エイチ、　　（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ
、Ｈ）及びルコック、ジエイ、ピー、　（Ｌｅｃｏｃｑ
、Ｊ、Ｐ、）　。

Ｎａｔｕｒｅ　３１２．１６３−１８６　（１９８４）
キー：−、エム、ビー、　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、
ラウドマン、ジー、　　（Ｒａｕｔｍａｎｎ、Ｇ、）　
、　　シュミット、デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）、　
　ドツト、ケイ（Ｄｏｔｔ、に、）　、　　ウエインー
ホブソン、ニス、　（Ｖｅｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、）
、アリシン、エム、（Ａｌｉｚｏｎ、Ｍ、）　、　ジラ
ール、エム２（Ｇｉｒａｒｄ、Ｍ、）　、　　シー？７
し、ニス（Ｃｈａｍａｒｅｔ、Ｓ、）　。

ローレン、：−、　　（Ｌａｕｒｅｎｔ、Ａ、）、モン
タニエ、エル、　　（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、）及
びルコック、ジェイ、ビ（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　
、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　４．７９０−７９５　（１９８６）ラテ、アール、（
Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、　ハース、ビー（Ｈｌ　ｒｔｈ　
、　Ｐ、　）、　　デウィルド、エム、　　（Ｄｅｗｌ
ｌｄｅ、Ｍ、）。

ハーフオード、エフ、　　（Ｉｌａｒｆｏｒｄ、Ｎ、）
及びルコック。

ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、　
Ｎａｔｕｒｅ　２ｇ４．４７３マケット、エム、　　（
Ｍａｅｋｅｔｔ、Ｍ、）、　スミス、ジーエル、　　（
Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、）及びモス、ビー　（Ｍｏｓｓ、
Ｂ、）　。

プロシーデインゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ
−オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイ
ツ　オブ　アメリカ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ）、　７９
．７４１５−７４１９（１９８２）モンタニエ、エル、
　　（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、）及びアリシン、エ
ム、　　（ＡＩｉｚｏｎ、Ｍ、）　＋　アナル　トウー
　アンスティトウー　バストウール（Ａｎｎ、　Ｉｎ５
ｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ）　１３８．３−１２　（１９８７）ミ
ュージング、エム、エイ、　　（Ｍｕｅｓｉｎｇ、Ｍ、
Ａ、）。

スミス、デイ、エイチ、　　（Ｓｗｉｔｈ、Ｄ、Ｈ，）
、　カブラシラ、シー、デイ、　　（Ｃａｂｒａｄｉｌ
ｌａ、Ｃ，Ｄ、）　、ベントン。

シー、ケイ、　　（Ｂｅｎｔｏｎ、Ｃ，Ｖ、）　、　　
ラスキー、エル。

エイ、　　（Ｌａｓｋｙ、Ｌ、Ａ、）及びカポン、デイ
、ジエイ。

（Ｃａｐｏｎ、Ｄ、Ｊ、）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３
．４５０−４５８　（１９８５）バニカリ、デイ、　　
（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、）及びパオレッテイ、イー、
　（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７９．４９２７−４９３１　（
１９８２）パニカリ、デイ、　　（Ｐａｎ１ｃａｌｉ、
Ｉ５．）　、デイヴイス。

ニス、ダブリュ、　　（Ｄａｖｉｓ、Ｓ、Ｗ、）、　　
ワインバーブ。

アール、エル、　　（Ｗｅｌｎｂｅｒｇ、Ｉ？、Ｌ、）
　、パオレッテイ。

、イー、　　（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、）　、　　Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８０．５３６４−５３６８ ラトナー、エル、　　（Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ、）　、ヘイ
ゼルタイン、ダブリュ、　　（Ｉｌａｓｅｌｔｉｎｅ、
Ｗ、）、パター力、アール、　　（Ｐａｔａｒｃａ、Ｒ
，）、　　リヴ７　ツク、ケイ、ジエイ。

（Ｌｉｖａｋ、に、Ｊ、）、スターチッヒ、ビー、　　
（Ｓｔａｒｃｉｃｈ。

Ｂ、）、ジョセフス、ニス、エフ、　　（Ｊｏｓｅｐｈ
ｓ、Ｓ、Ｐ、）。

トラン、イー、アール、　　（Ｄｏｒａｎ、Ｅ、Ｒ，）
、　ラフアルスキ、ジエイ、エイ、　　（Ｒａｆａｌｓ
ｋｉ、Ｊ、Ａ、）　、ホワイトホーン、イー、エイ、　
　（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ、Ｅ、Ａ、）、バウマイスター
、ケイ、　　（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ、に、）　、イワ
ノフ。

エル、　　（Ｉｖａｎｏｆｆ、Ｌ、）、ペターウェイ　
ジュニア。

ニス、アール、　　（Ｐｅｔｔｅｒｗａｙ　Ｊｒ、、Ｓ
、Ｒ，）、　　ピアソン。

エム、エル、　（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍ、Ｌ、）　　、ラ
ウテンベルガジエイ、エイ、　（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇ
ｅｒ、Ｊ、Ａ、）　、ババス、ティ、ニス、　　（Ｐａ
ｐａｓ、Ｔ、Ｓ、）、グライエブ、ジエイ、　　（Ｇｈ
ｒａｙｅｂ、Ｊ、）、　　チャ：／、　工、ｌｊ　　テ
ィ。

（Ｃｈａｎｇ、Ｎ、Ｔ、）、ギヤ口、アール、シー、　
（Ｇａｌｌｏ、Ｒ９Ｃ１）及びウオンースタール、エフ
、　（Ｗｏｎｇ−ｓｔａａｌ　Ｉ　。

Ｐ、）　、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３１３，２７７−２
８４　（１９８５）サンチェスーペスカドール（Ｓａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ）等、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）　、　２２７，４８４−４９２　（１９８５
）スミス、ジー、エル、　（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｌ、）、
　７ケツト。

エム、　　（Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ、）、モス、ブイ、　
　（Ｍｏｓｓ：Ｖ、）　。

Ｎａｔｕｒｅ、　　３０２．４９０−４９５　　（１９
８３）スミス、ジー、エル、　（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｌ、
）、マーブイ。

ビー、アール、　　（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｂ、Ｒ，）　、モ
ス、ビー（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　８０．７
スターチッヒ、ビー、　　（Ｓｔａｒｃｉｃｈ、Ｂ、）
　、　バーン。

ビー、エイチ、　　（Ｈａｈｎ、Ｂ、Ｈ，）　、　　シ
ョウ、ジー、エム（Ｓｈａｗ、Ｇ、Ｍ、）　、マック：
−リー、ピー、デイ。

（ＨｃＮｅｅｌｙ、Ｐ、Ｄ、）、モトロウ、ニス、　　
（Ｍｏｄｒｏｗ、Ｓ、）　。

ウォルフ、エイチ（Ｗｏｌｆ、Ｈ）、パークス、イー、
ニス、　　（Ｐａｒｋｓ、Ｅ、Ｓ、）、パークス、ダブ
リュ６　ビー（Ｐａｒｋｓ、Ｗ、Ｐ、）、　　ジョセフ
ス、ニス、エフ。

（Ｊｏｓｅｐｈｓ、Ｓ、Ｐ、）、ギヤ口、アール、シー
、　　（Ｇａｌｌ。

、Ｒ，Ｃ，）及びウオンースタール、エフ、　　（Ｗｏ
ｎｇ−ｓｔａａｌ、Ｐ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　４５
．６３７−６４８　（１９８（ｉ）ウエインーホブソン
、ニス、　　（Ｖａｉｎ−１１ｏｂｓｏｎ、Ｓ、）。

ソ：−ゴ、ピー、　　（Ｓｏｎｌｇｏ、Ｐ、）　、　　
ダノス、オウ９（Ｄａｎｏｓ、Ｏ，）、コール、ニス、
　（Ｃｏｌｅ、Ｓ、）及びアリシン、エム、　　（ＡＩ
ｉｚｏｎ、Ｍ、）　、　　Ｃｅ１１．４０．９−１７

【図面の簡単な説明】

第１図は、 組換えウィルスＶＶ。 ＴＧ。 Ｆ。 ■ Ｖ−２−１９９８により合成された蛋白質の免疫沈降を
示すオートラジオグラフである。 （以 上） Ｐ ガ− 第１ ■ 手続補正書動式） 平成１年３月３０８ 事件の表示 昭和６３年特許願第２２５５２３号 発明の名称 ＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質を発現させるためのベクタ
ー及びその用途 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 トランスジーン　ソシエテ　アノニム （ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］感染若しくは形質変換された細胞内でＨＩＶ−２
   ウィルスの蛋白質を発現させるためのウィルスベクター
   またはプラスミドベクターであって、下記の部分を含む
   ベクター：−異種ウィルスまたはプラスミドのゲノムの
   一部、 −ＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質の一つをコードするヌク
   レオチド配列、および −真核または原核細胞中でこの蛋白質の発現を指示する
   要素。 ［２］異種ウィルスのゲノムの一部が、ボックスウィル
   ス、アデノウィルス、ヘルペスウィルスおよびバキュロ
   ウィルスから選ばれたウィルスのゲノムの一部である第
   １請求項に記載のベクター。 ［３］ボックスウィルスが、ワクシニアウィルスである
   第２請求項に記載のベクター。 ［４］ＨＩＶ−２ウィルスのエンベロープ糖蛋白質（エ
   ンベロープｇｐ）をコードするヌクレオチド配列を含む
   第１請求項乃至第３請求項のいずれかに記載のベクター
   。 ［５］エンベロープｇｐの一つをコードする配列が、ｇ
   ｐ１６０をコードする配列である第４請求項に記載のベ
   クター。 ［６］ｇｐの一つをコードする配列が、ｇｐ１２０をコ
   ードする配列である第４請求項に記載のベクター。 ［７］ｇｐの一つをコードする配列が、ｇｐ４０または
   ｇｐ３２をコードする配列である第４請求項に記載のベ
   クター。 ［８］ｇｐ１２０とｇｐ４０の間にあるプロテアーゼに
   よる開裂部位を取り除く様に、ｅｎｖ遺伝子が変異され
   ている第４請求項乃至第６請求項のいずれかに記載のベ
   クター。 ［９］ＨＩＶ−２ウィルスのｇａｇ遺伝子によりエンコ
   ードされる蛋白質の少なくとも一つをコードするヌクレ
   オチド配列を含む第１請求項乃至第３請求項のいずれか
   に記載のベクター。 ［１０］ｇａｇ遺伝子の蛋白質の少なくとも一種をコド
   する配列が、ｐ５７、ｐ２６またはｐ１６をコードする
   配列である第９請求項に記載のベクター。 ［１１］ＨＩＶ−２ウィルスのＦ蛋白質をコードするヌ
   クレオチド配列を含む第１請求項乃至第３請求項のいず
   れかに記載のベクター。 ［１２］Ｆ蛋白質をコードする配列が、Ｎ−末端固定配
   列と同一相に融合されている第１１請求項に記載のベク
   ター。 ［１３］ＨＩＶ−２ウィルスの一又は二以上の蛋白質を
   コードするＤＮＡ配列が、ボックスウィルスプロモータ
   ーの制御下にある第１請求項乃至第１２請求項のいずれ
   かに記載のベクター。 ［１４］プロモーターが、ワクシニアウィルス遺伝子の
   プロモーターである第３請求項乃至第１３請求項のいず
   れかに記載のベクター。 ［１５］ＨＩＶ−２ウィルスの一又は二以上の蛋白質を
   コードするＤＮＡ配列が、ワクシニアの７．５に蛋白質
   の遺伝子のプロモーターの制御下にある第３請求項乃至
   第１４請求項のいずれかに記載のベクター。 ［１６］ＨＩＶ−２ウィルスの一又は二以上の蛋白質を
   コードする配列が、ワクシニアのＴＫ遺伝子内にクロー
   ン化されている第３請求項乃至第１５請求項のいずれか
   に記載のベクター。 ［１７］第１請求項乃至第１６請求項のいずれかに記載
   のベクターに対応する組換ＤＮＡ。 ［１８］第１請求項乃至第１６請求項のいずれかに記載
   のウィルスベクターまたはプラスミドベクター或いは第
   １７請求項に記載のＤＮＡにより感染若しくは形質変換
   された細胞。 ［１９］第１請求項乃至第１６請求項のいずれかに記載
   のウィルスベクターにより感染された哺乳動物細胞の培
   養物。 ［２０］第１８請求項または第１９請求項に記載の細胞
   を培養し、得られた蛋白質を回収することを特徴とする
   ＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質の製造方法。 ［２１］第２０請求項に記載の方法により得られたＨＩ
   Ｖ−２ウィルスの蛋白質またはエンベロープ糖蛋白質。 ［２２］第１請求項乃至第１６請求項のいずれかに記載
   の生若しくは不活性ウィルスベクターおよび／または第
   ２１請求項に記載の蛋白質を含むワクチン。 ［２３］ＨＩＶ−１に対する適格なワクチンをさらに含
   む第２２請求項に記載のワクチン。 ［２４］生きた生物体に第１請求項乃至第１６請求項の
   いずれかに記載のベクターまたは第２１請求項に記載の
   蛋白質或いは糖蛋白質を接種し、所定時間経過後に形成
   された抗体を回収してなるＨＩＶ−２ウィルスの蛋白質
   および／または糖蛋白質に対する抗体。 ［２５］第２１請求項に記載の蛋白質または糖蛋白質お
   よび／または第２４請求項に記載の抗体を含む診断キッ
   ト。