JPH06508131A - 豚の奇病の原因体であるレリスタドエイジェント、それを含むワクチン組成物、豚の奇病の診断キット及び診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 豚の奇病の原因物質、ワクチン組成物および診断器具 発明の分野 本発明は、豚の奇病（Ｍｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ：にＯ３） の原因物質の単離、特性調査および利用に関する０本発明は、この病気の原因物 質の発見およびゲノム組織とゲノムヌクレオチド配列とゲノムによってコード化 された蛋白質の決定に伝染病、特にＭＳＤの予防と診断およびワクチン組成物と 診断器具の準備、ＭＳＤまたは他の病原菌による病気に利用される。

技術の背景 １９９１年の冬と早春に、オランダの養豚業は、子を産む雌豚の間で新しい病気 の驚くべき発生に出会った。多くの雌豚は食欲不振を示した。あるものは妊娠中 〈１１０日の期間）に流産、死産またはミイラ化した胎児を生んだ、またあるも のは、発熱した０時々青みががっな耳をもった雌豚が見付かった。このため、こ の病気は一般に゛「流産前」と名付けられた。雌豚におけるこの病気は、しばし ば呼吸困難と生んだばかりの子豚の死とを伴った。そして、呼吸困難と加齢子豚 と肥育豚との生育遅延を引き起こした。

この家畜流行病の原因は知られていなかったが、症状は１９９０年以後ドイツで 起こった奇妙な病気に似ており、アメリカの中西部やカナダで１９８７年に見ら れたいわゆるＭＳＤに似ている（ｔ（ｉｌｌ、１９９０）、他の種々な名前がこ の病気のために用いられ、ドイツでは「豚の流行性手遅れ流産」として知られ、 北米では「豚の奇病」、「奇妙な繁殖症候群」、「豚のやせた呼吸器症候群」と して知られている。北米でＬｏｕｉａは１９９０年に一般には臨床表示次で次の ように述べている。

１）親も子も病気の家畜は食物を食べない２）流産、死産、病弱豚、ミイラ化し た胎児３）分娩後の呼吸の問題 ４）生殖の問題 原因物質は、まだ同定されていないが、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）、豚のパ ルボウイルス（ＰＲＶ）、疑似狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）、豚インフルエンザウ ィルス（ＳＩＶ）、牛ウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）、雌豚コレラウィル ス（ＨＣＶ）、豚腸内ウィルス（ＲＥＶ）、インフルエンザ様ウィルス、クラミ ジア菌、レプトスピラ菌が全て原因物質として挙げられる（Ｌｏｕｌａ。

１９９０　；　ｌｌｅｎｇｅｌｉｏｇ　ａｎｄ　Ｌａｇｌｅｒ、１９９０；その 他）。

発明の概要 本発明は、ＭＳＤの原因物質である単離されたレリスタドエイジエンド（Ｌｅｌ ｙｓｔａｄ　Ａｇｅｎｔ　；　Ｌ　Ａ）から成る組成物を得ることである。前記 ＬＡは、単離Ｌ　Ａ　（ＣＤＩ−ＭＬ−２，９１）に本質的に相当し、寄託番号 １−１１０２でフランス国パリのパスツール研究所で１９９１年６月５日に寄託 された。ここに「本質的に相当する」という語は、特にＬＡ！ｌのＤＮＡまたは 抗体のようなＬＡ種物質を用いてＰＣＲとＥＬＩＳＡとの雑種を得るような技術 によって検出することが許され、自然に生じる変形物と人工的な変形物とに関す るＬＡの変形物に相当するという意味である。

組成物は、生きた、殺されたまたは弱体化された単離ＬＡ、ＬＡがち誘導された 再結合ベタターのＬＡの単離部分または成分、単離されまたは合成された蛋白質 またはポリペプチドまたはＬＡから誘導された核酸、ＬＡゲノムがら誘導された ヌクレオチド配列を構成する再結合核酸ＬＡの蛋白質から誘導されるアミノ酸配 列を有するポリペプチド、固有の再結合ＤＮＡを持った遺伝子工学のための生産 をし得る組胞によって生産されたポリペプチド、ＬＡの一部または成分を特別に 認める単離されまたは合成された抗体、またはＬＡがら誘導される蛋白質または 抗原ペプチドのためのヌクレオチド配列コードから成る核酸を含んでいる再結合 ベクターから構成される。

ＤＮＡ水準に関して、本発明は特に再結合核酸、さらに再結合ＤＮＡを与える。

それは図１で示されるＬＡ種のヌクレオチド配列から成っている。

むしろ前記ＬＡ種のヌクレオチド配列は、図１に示される塩基の読取り枠（ＯＲ Ｆ）の１つから選ばれる。

ペプチド／蛋白質水準に関して、本発明は、図１に示すＬＡ種のアミノ酸配列か ら成るペプチドを与える。

本発明は、さらにＭＳＤに対して予防するために予防接種をすべき動物、好まし くは哺乳動物、より好ましくは豚のために、生きた、殺されたまたは弱体化した ＬＡまたはＬＡから誘導された蛋白質または抗原ペプチドのためのヌクレオチド 配列コードから成る核酸を含む再結合ベクター、ＬＡの抗原部分または成分、Ｌ Ａから誘導された蛋白質または抗原ポリペプチド、ＬＡの抗原成分を模倣するペ プチド、ＬＡの抗原部分または成分、ＬＡから誘導された蛋白質または抗原ポリ ペプチドまたはＬＡの抗原成分に類似のペプチド、およびそれに適した担体また は免疫助成剤のワクチン組成物を与える。

本発明はまた、予防すべき動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは豚に用い る病原菌によって起こされる病気に対して予防するために、ＬＡから誘導される 再結合ベクターがら成り、病原菌から誘導される蛋白質または抗原ペプチドのた めのヌクレオチド配列コードから成る再結合ベクターの核酸から成り、そして適 した担体または免疫助成剤のワクチン組成物を与える。

本発明はさらに試料、特にＬＡゲノムから誘導されるヌクレオチド配列から成る 核１！１Ｍ験体を含む動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から採取 される血液や血清、喀痰、唾液または組織のような生体試料中で、ＬＡからの核 酸を検出するための診断器具と核酸検出の分析に適する検出方法を与える。

また本発明は、ＬＡの部分または成分を特に確認する抗体から成る試料、特に動 物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から採取される血液や血清、喀痰 、唾液または組織のような生体試料中で、ＬＡから抗原を検出するための診断器 具と抗原検出の分析に適する検出方法を与える。

また本発明は、ＬＡ、ＬＡの抗原部分または成分、ＬＡから誘導される蛋白質ま たは抗原ポリペプチド、またはＬＡの抗原成分に類似の蛋白質から成る試料、特 に動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から採取される血液や血清、 喀痰、唾液または組織のような生体試料中で、ＬＡを特別に認める抗体を検出す るための診断器具と抗体検出の分析に適する検出方法を与える。

また本発明は、動物から誘導された試料、特に血液や血清、喀痰、唾液または組 織のような生体サンプルから成り、それがＭＳＤの原因物質であり、本質的に寄 託番号ｌ−１１０２としてフランスのパスツール研究所に１９９１年６月５日に 寄託された単離Ｌ　Ａ　（ＣＤＩ−ＮＬ−２，９１＞に本質的に相当するＬＡの 核酸、抗原、ＬＡを特別に確認した抗体を含むかどうかを試験するＭＳＤの原因 物質に、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚が感染しているかどう かを診断する方法に関する。

発明の詳細な説明 本発明は、中央獣医研究所（ＣＶＩ）とオランダにおける地方動物健康サービス 所（ＲＡＨ３）との新しいＭＳＤの原因を見付けるための共同研究の成果である 。新しい病気によって影響を受けた養豚家は、ＲＡＨ３の獣医を訪れた。病気の 豚、その標体、急性の病気で回復期に得られた雌豚の血清が、ＲＡＨ８とＣＶＩ とにウィルスを単離するために送られた。影響を受けた雌豚の１組の血清が、１ ０個の知られた豚ウィルスに対する抗体のためにテストされた。３つの異なった ウィルス、脳心臓炎ウィルス、２型豚腸内ウイルスおよび７型豚膓内ウイルスと 知られていないＬＡが単離された。病気になったと思われる雌豚は、たいていＬ Ａに、そして他のウィルスまたはよく知られたウィルス性病原菌に血清変成され ていた。ＭＳＤを実験的に増殖するために、８頭の妊娠豚が妊娠８４日にＬＡを 接種された。１匹の豚は、妊娠１０９日で７匹の子豚と４匹の非常に弱い子豚を 出産した。しかし４匹の子豚は出産後１日で死んだ。

第２の雌豚は、１１６日で３匹のミイラ化した胎児と６匹の死んだ子豚と３匹の 生きた子豚を出産した。そのうちの２匹は出産後１日以内に死んだ。

第３の雌豚は、１１７日で２匹のミイラ化した胎児と８匹の死んだ子豚と７匹の 生きた子豚を出産した。他の雌豚は、１１５日で分べんしたが、繁殖損失を避け られなかった。出産時における８匹の雌豚から出産した生きた子豚の平均数は、 ７゜３匹であり、死産子豚の平均数は４．６匹であった。ＬＡに対して処理され た抗体は、出産後授乳前の子豚の１０〜４２血清試料で検出された。ＬＡは、出 産後短時間で死んだ３匹の子豚から単離された。これらの結果、ＬＡがＭＳＤの 原因となる物質であると結論された。

Ｌ　Ａは、豚の肺のマクロファージ中で細胞変成効果で生育し、免疫パーオキシ ターゼ単層検索法（ＩＰＭＡ）中で、傷をつけることによって、豚Ｃ８２９とｂ ８２２の後感染血清または表５でリストされるＳＰＦ豚の他の後感染血清で、同 定され得る。ＬＡに対する抗体は、Ｉ　ＰＭＡ中で間接的に傷をつけられる処理 によって同定され得る。

ＬＡは、テストされた細胞組織中では生育しない。

ＬＡは一致した血清によって、または知られたウィルス（表３）のセットに対し 処理された血清によって無効にされない、ＬＡは、テストされた赤血球細胞で血 球凝集しない、ＬＡは２００ｎｍより小さく、この大きさの孔径を有するフィル ターで透過する。ＬＡはクロロホルムに鋭敏である。

上の結果からＬＡは、あるウィルスグループまたは他の微生物に属するものとし てまだ同定されていない、それはフランスのパスツール研究所に１９９１年６月 ５日に寄託番号ｌ−１１０２で寄託された。

ＬＡのゲノム組織ヌクレオチド配列とそれらがら誘導されたポリペプチドとは、 ここに発見された。他のこれらを集めたデータは、ＬＡの分類を正常化したく以 後レリスタドウイルスをＬＶと呼ぶ）、これらは新しい動脈留つィルス属のメン バーである。この新しい属の原型ウィルスとして、我々は、ゲノムとゲノム組織 の転写に関するデータが利用できるようになった新属の最初のメンバーである馬 動脈留ウィルス（ＥＡＶ）を提案する（　ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９９０およびその他文献）、乳酸脱水素酵素活性化ウィルス（Ｌ　Ｄ　Ｖ　；　 Ｇｏｄｅｎｙｅｔ　ａｌ、、　１９９０）のためにこれを利用することによって 我々の配列データの比較の基礎として、我々はＬＤＶが動脈留つィルス属のメン バーであることを提案する。

動脈留ウィルスのゲノム組織と転写方法が与えられて、この新しいウィルス属を コロナウィルスの玉料におくことが認められた（　５ｎｉｊｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、　。

１９９０ａ）。

動脈留ウィルスの第１の攻撃目標は、宿主のマクロファージ細胞であることは普 通である。ＬＤＶの模倣物の宿主は、マウス中のマクロファージ細胞に限定され ることが示される。マクロファージ細胞のためのこの厳格な性質が、ＥＡＶとＬ Ｖのためにまだ解決されない。

動脈留ウィルスは、直径４５〜６０ｎｍの球状粒子であり、２０面体のヌクレオ キャプシドを含む（Ｂｒｉｎｔｏｎ−Ｄａｒｎｅｌｌ　ａｎｄ　Ｐｌａｇｅｍａ ｎｎ、１９７５；Ｈｏｒｇｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９７１；Ｂｙｌｌｓｅｔ ｈ、１９７３）　。

動脈留ウィルスのゲノムは、約１２〜１３キロベース（ｋｂ）の大きさを有する 正のより合わされたポリアゾリル化されたＲＮＡ分子から成る（Ｂｒｉｎｔｏｎ −Ｄａｒｎｅｌｌ　ａｎｄ　Ｐｌａｇｅｍａｎ、１９７５　；　ｖａｎ　ｄｅｒ Ｚｅｔｊｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９７５）　。

ＥＶＡは６個のサブゲノムｍ−ＲＮＡの３セツトを介して複製され、ソーダ配列 から成る０、８〜３．６ｋｂの大きさで、３つの端末配列に結合されたゲノムＲ ＮＡの５つの端末から誘導されて並ぶ（ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｆ９ ９０）　＊ここで我々は、ゲノム組織とＬＶの複製方法がＥＶＡ、すなわちコロ ナウィルスとトロウィルスとに類似であることを示す、しかるに、後者のウィル スのゲノムの大きさがＬＶとＥＶＡのサイズから完全に異なっている。

ＬＶのゲノムは、（天然のアガローズゲルの上に見積もられて）長さで約１４． ５〜１５．５ｋｂのゲノムＲＮＡ分子から構成される。それはサブゲノムＲＮＡ の３セツトを介して複製される。

サブゲノムＲＮＡは、まだ知られていない長さでゲノムＲＮＡの５つの端末がら 誘導され、ゲノムＲＮＡの３つの端末から誘導される体配列に融合されるリーグ 配列を構成する（図２）。

ＬＶのゲノムＲＮＡのヌクレオチド配列は、重なったｃ−ＤＮＡクローンから決 定される。１５゜０８８ｂｐ連続配列は、ＬＶの完全なゲノムを近似的に覆って 得られる（図１）、この配列で８つの開放読取り枠は、０ＲＦＩＡ、０ＲＦＩＢ およびＯＲ，Ｆ　２〜７に同定される。

０ＲＦＩＡとＯＲＦ　Ｉ　Ｂは、ウィルス複製またはポリメラーゼでコード化し て予言される。０ＲＦ２〜６は、蛋白質を結合したウィルス団の構成をコード化 して予言される。０ＲＦ７は、ウィルス・ヌクレオキャプシド蛋白質の構成をコ ード化して予言される。

ＬＶのＯＲＦ６と０ＲＦ７の生産は、各ＬＤＶのＶｐＸとＶｐｌで重大な類似点 を示しているので、０ＲＦ６と７との配列はよたＬＶの抗原ウィルス中で高く保 存される。

図１の完全なヌクレオチド配列と、ＯＲＦ　１〜７によってコード化された配列 と蛋白質産物と、図１の配列中に位置する可能性のある他のＯＲＦとは、ワクチ ンの製造のためと診断器具の製造のために適合される。すべての可能なやり方は 、当業者によく知られている。

ＬＡすなわちＭＳＤの原因物質を明確に同定することは可能であるので、豚がＬ Ａで汚染されているかどうかがテストされ得る。このような診断テストは今まで 用いられなかった。

このテストは、マクロファージ中、また４１　Ｌ　Ａが生育するであろう他の細 胞の培養システム中でウィルス同定によって（伝染後の血清Ｃ８２９またはｂ８ ２２のような）ＬＡに対して処理される抗体で汚染された培養器に植付けて行わ れ得る。

しかし診断テストの他の型のものを製造して用〜）ることは実行できる。

たとえば、直接または間接に免疫組織学的汚染技術、すなわちイソシアネイトの ような蛍光化合物で、またはホースラデイシュ・ノ（−オキシダーゼのような酵 素で標識をつけられたＬ　Ａ　！二処理された抗体を用いることは可能である。

これらの技術は、ＭＳＤを有する疑いのある豚から組織断面または他の試料中に ＬＡ抗原体を支配させて用１）られ得る。このテストのために必要な抗体もよ、 Ｃ８２９もしくはｂ８２２またはＬＡＧこ対し処理されるポリクロナル抗体であ る。しかし、ＬＡ４こ対し処理されるモノクロナル抗体もまた用いられる。

天然とＬＡのゲノムの組織とこのゲノムのヌクレオチド配列とは、決定されるの で、ＬＡ種のヌクレオチド配列は同定され、オリゴヌクレオチド配列を作るため に、また異種混合と、ポリメラーゼ連鎖反応と、ヌクレオチド酸配列とを特別に 支配して製造されるその他の技術のような診断技術中の試料として用いられる。

ＬＡに対して処理された抗体のためにテストすることは可能である０表５はＬＡ に対する抗体を、速やかに作った実験的に汚染された豚を示す０表４はＬＡに対 応する強い抗体を有する飼育の豚を示す、豚がこれまでにＬＡで汚染されたかど うかを決定することがまたできる。このようなテストは、豚または豚の群または 豚の集団またはすべての地域もしくは国における豚が、ＬＡに感染していないか どうかを決定するのに最も重要なことである。テストは、前記のようにＩ　ＰＭ Ａを用いて行われる。しかしＬＡに対して処理された抗体の検出のために診断テ ストの他の型式を用いることは可能である。

ＬＡ種の蛋白質、ポリペプチドおよびＬＡの抗原に類似のペプチドまたはペプチ ド配列は、このようなテストで用いられる。このような蛋白質は、ＬＡそれ自身 から誘導されるが、再結合ＤＮＡまたはペプチド合成技術によってこのような蛋 白質を作ることはまた可能である。これらのテストは、ＬＡに対して処理された 特別のポリクロナールおよび／またはモノクロナール抗体またはＬＡの特別の成 分を用いることができる。また、ＬＡで汚染された細胞組織またはＬＡ抗原を表 す細胞組織も用いることができる。抗体は、たとえば（ＬＡ抗原が抗体によって 束縛された後に、固体表面が抗体で覆われて）ＬＡ抗原を同定する方法として用 いられる。そしてＬＡ抗原はテストのより高ｂ１特性を導き、（試料中の標識を 付された抗体と未知の抗体が利用し得るＬＡの抗原のために比較する）比較分析 計に用いられる。

さらに上述の診断の可能性は、哺乳動物、鳥類、昆虫類もしくは魚類のような他 の動物またζよ植物や他の生物が、ＬＡまたは関連のある物質で将来汚染される か、現に汚染されるか、過去に汚染されたかをテストするのに利用される。

ＬＡは今やＭＳＤの原因物質として同定されているので、この病気に対して豚を 保護するワクチンを作ることができる。このようなワクチン番よ、豚の肺のマク ロファージまたはＬＡが生育する他の細胞組織で、ＬＡを培養することによって 作られる。ＬＡは、精製されまたはそのままで、ホルマリンまたは紫外線で不活 性化されるような従来技術で殺される。不活性化ＬＡは、フロイントの免疫助成 剤、水酸化アルミニウムなどのような免疫助成剤と結合され、この組成物は豚に 注射される。

不活性ワクチンは、また培養器で汚染されたＬＡから誘導され、またはＤＮＡ再 結合を介してＬＡ蛋白質を特別に表現した細胞組織から誘導されるＬＡ蛋白質調 整品で作られる。このようなＬＡのサブユニットは上述のように取扱われ、サブ ユニットワクチンとして効果がある。

ポリペプチド、ペプチド、ＬＡの抗原成分に類似したペプチドのような、ＬＡの より少ない成分を用いるワクチンは、また不活性ワクチンとして使用が有効であ る。

ＭＳＤに対する不活性ワクチンは、ＬＡのゲノムまたはＬＡの部分が牛痘ウィル ス、ヘルペスウィルス、疑似狂犬病ウィルス、アデノウィルス。

バキュロウィルスまたは適当な細胞組織中でＬＡ抗原を表すことができるような 他の適当なベクタ組織中に組み入れるような再結合ＤＮＡ技術によっても作られ る。これらの組織からのＬＡ抗原番よ、上述のワクチンを作るために用いられ、 この製品で予防接種された豚は、ＬＡ抗原に対して予防免疫を発揮する。

ＭＳＤに対するワクチンは、またＬＡの生体標本に基づく、子豚と妊娠した雌豚 は、ＬＡの汚染によって本気で恐れられているように思える。より加齢した子豚 または授精したことのない雌豚のためのワクチンとして、豚の肺のマクロファー ジ中で培養した弱体化しないＬＡを用いることが可能である。この方法で雌豚は 妊娠する前にＭＳＤに対して保護され得る。その結果流産と死産に対して、また 子豚の先天的な汚染に対して保護する。

またこれらの予防接種された雌豚が彼らの子孫に与える抗体物質は、この病気に 対しその子孫を保護する。

ＭＳＤに対する弱体化されたワクチン（弱毒性ワクチン）は、豚の肺のマクロフ ァージ中で、または他の細胞組織中で、または兎のような他の動物中で連続的に 変化させることで製造される。

ＭＳＤに対する生ワクチンは、ＬＡのゲノムまたはＬＡの部分が牛痘ウィルス、 ヘルペスウィルス、疑似狂犬病ウィルス、アデノウィルスまたは適当な細胞組織 中でＬＡ抗原を表すことができるような他の適当なベクタ組織中に組み入れるよ うな再結合ＤＮＡ技術によって作られる。このような生ワクチン組織で予防接種 された豚は、ＬＡに対して予防免疫を発揮する。

ＬＡはそれ自身、生ワクチン用ベクタ組織として用いることが特に適している。

外国の遺伝子は、ＬＡのゲノムの中に挿入され、マクロファージの汚染の間に対 応する蛋白質を表すことができる。

抗原が存在する細胞は、外国の抗原を加工処理し、適当な免疫反応で応答するＢ −リンパ球とＴ−リンパ球にそれを変える。

ＬＡは非常に特殊な細胞で、また非常に特殊な穫であるのでこのベクタ組織は非 常に安全な組織であり、他の細胞または種に害を与えることはない。

図面の簡単な説明 図１は、ＬＶゲノムのヌクレオチド配列を示す。

同定されたＯＲＦの推論されるアミノ酸配列を示す、（推定される）ＡＴＧの出 発位置によってコード化されたメチオニンを太字で示し、推定上のＮ−グリコシ ド化の位置は下線が付されている。

異なったｃ−ＤＮＡクローンを配列することによって同定されるようにヌクレオ チドとアミノ酸配列中に相違が示される。雑種の表現（図２と結果の項とを参照 ）で用いられるプライマ２５のヌクレオチド配列もまた下線が付されている。

図２は、ＬＶゲノムの組織を示している。ヌクレオチド配列の決定に用いられる ｃ−ＤＮＡクローンは、図の上の部分で示される。配列されたクローンの部分は 、黒く示される９図の下の部分で、ヌクレオチド配列で同定されたＯＲＦとこれ らのＯＲＦをコード化したｍ−ＲＮＡのサブゲノムセットとが示される。ＯＲＦ 中のダッシュは、これらのＯＲＦの種々の最初の位置を示す、ゲノムまたはサブ ゲノムＲＮＡのリーグ配列は、黒四角で示される。

図３は、ＬＡ成長の下記の特性を示す。

白四角は、細胞フリーのウィルス 黒四角は、＃＠と結合したウィルス 実線は、細胞変成効果（ＣＰＥ）の百分率物質と方法 試料収集 試料となる豚は、ＭＳＤに感染した群が存在すると思われる養豚場から収集され る。ＭＳＤで汚染されている養豚場を選択するための重要な基準は、雌豚が餌を 食べない、流産と死産が生じている弱い子孫、呼吸器病、そして生まれたばかり の子豚の死である。豚の４グループからの試料は、次のように調整される９ （１）野性の汚染された子豚がらの組織試料と口のまわりを拭き取った唾液（表 ＩＡ） （２）野性の汚染された雌豚がらの血液試料と口のまわりを拭き取った唾液（表 ＩＢと４）（３）組織試料、鼻を拭き取った鼻水および血液試料と原野で汚染さ れな雌豚と接触することによって実験的に汚染された元来は、病原菌を持ってい ない（ＳＰＦ）豚から集めた組織試料、鼻を拭き取った鼻水および血液試料（表 ２と５）（４）原野で汚染された雌豚の血液試料を接種することによって実験的 に汚染された元来は病原菌を持っていない（ＳＰＦ）豚から集めた組織試料、鼻 を拭き取った鼻水および血液試料（表２と５）試料標本 ウィルス同定のための試料は、ＭＳＤを持っていることが憶測される実験地の子 豚と雌豚とがら、および実験的に汚染されたＳＰＦ豚と雌豚およびその子豚とか ら得られる。

組織試料は、クリオスタット、ミクロトームの上で切断し、種々の豚の病原菌に 対して処理された処理物で直接免疫蛍光テスト（Ｉ　ＦＴ）のためにその断面が 提供される。

組織試料の１０％懸濁液は、抗生物質を補われたＲａｎｋ′ｓ　ＢＳＳ中へ入れ られる。また口と鼻を拭き取った唾液と鼻水とは、抗生物質を補われたＲａｎｋ ’ｓ　ＢＳＳに浸される。室温で１時間放置した後、懸濁物は、１０分間６００ ０Ｇで遠心分離され、表面に浮かんだものは、さらに先で用いるために＝７０℃ で貯蔵される。白血球分離物はＥＤＴＡで単離され、ペバリン血は、従来に記さ れているように（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ａｎｄ　Ｔｅｒｐｓｔｒａ、１９８１１ ）分離され、そして−７０℃で貯蔵される。血漿とウィルスを単離するための血 清はまた一７０℃で貯蔵される。

血清免疫のための血清は、ＭＳＤの激しい病状にあると憶測される雌豚かち得ら れる。一対の血清は３〜９週問後に取出される。さらに血清は、実験的に汚染さ れたＳＰＦから一定の間隔で取出され、乳汁と血清は実験的に汚染された雌豚と その子豚から取出される。血清は、血清学のために一２０℃で貯蔵される。

細胞 豚の肺のマクロファージは、５〜６週のＳＰＦ豚の肺からまたは中央獣医学研究 所自身の家畜群から成長したＳＰＦ雌豚の肺から得られる。肺は、５〜８回、塩 でＭＩＩされたリン酸（ＰＢＳ）で洗浄される。洗浄液の各部分は、集められ、 １０分閘３００Ｇで遠心分離される。この結果できた細胞のペレットは、再度Ｐ ＢＳで洗浄され、細胞培養（２０ｍｌの２．９５％トリプトーズリン酸、２０ｍ １の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）と４．５ｍｌの１．４％炭酸ナトリウムから成る 溶媒１９９の１６０ｍｇ）中で４Ｘ１０’細胞／　ｍ　１の濃度で再度懸濁させ られる。細胞懸濁液は、ＤＭＳＯ混合物（上記媒体の６．７ｍｌ、１．３ｍｌの ＦＢＳ、９７％デメチルスルホオキシドの２ｍ１）の同容積とゆっくりと混ぜら れ、２ｍｌのアンプル中に分割され、液体窒素中で貯蔵される。

１つのアンプルからのマクロファージは、Ｅａｒｌｅ’ｓ　ＩＩＥＩＩ中で２回 洗浄することで細胞培養に準備され、３０ｍ１の培養液（１０％のＦＢＳ。

２００単位／ｍｌのペニシリン、０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ ０単位／　ｍ　＋のマイコスタチンおよび０．３ｍｇ／ｍｌのグルタミンを懸濁 させたＥａｒｌｅ’ｓ　ＩＥＩＩ）中で再懸濁させる。

ＰＫ−１５細胞くアメリカ型培養為団ＣＣＬ３３）と５Ｋ−６細胞（［ａｓｇａ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９７２）は、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、によっ て記述されているように培養される（Ｉｌｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８９）　、第２の豚の腎臓（ＰＫ２＞細胞は、Ｒａｒｌｅ’ｓ　１１１１１ Ｉ中で培養され、１０％ＦＢＳと上記抗生物質とで懸濁化される。すべての細胞 は、３７℃と５％ｃｏ２雰囲気の細胞培養器中で培養される。

ウィルス単離の手順 ウィルス単離は、ＰＫ２．ＰＫ−１５および５Ｋ−６細胞と豚の肺のマクロファ ージを用いてすでに確立されている技術に従って行われる。前者の３種の細胞は 、２５ｍ１のフラスコ中で培養され（Ｇｒｅｉｎｅｒ）単分子層が７０〜８０％ の密集成長に達すれば、テスト試料を植え付ける。マクロファージは、９６−ミ クロタイタープレート中に１００μｍづつ分取して（Ｇｒｅｉｎｅｒ）　、また は適当なフラスコ中でより大容量に培養され、培養後１時間以内にテスト試料を 植え付ける。培養器は、細胞変成効果（ＣＰＥ）のために毎日観察され、５０〜 ７０％ＣＰＥが達せられ、または培養の５〜１０日後まで一７０℃に冷凍する。

さらに継代物は、継代２および３またはそれ以上の冷凍を融解した物質で作られ る。試料はまた９〜１２日の雛化鶏卵中に植え付けられる。尿嚢液は、３日の培 養間隔で２回定期的に植え付けされ、第３の継代の収穫は、雌鶏の赤血球を用い て４℃で血球凝集反応によってまたインフルエンザＡウィルスの核蛋白を特別に 検出するＥＬＳＡによって試験される（　Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ９０）　。

血清学 血清は、脳炎ウィルス（ＲＥＶ）とｌ１ａｓｕｒｅｌの処方に従った豚インフル エンザウィルスＨＩＮＩ。

Ｈ３Ｎ３との血球凝集に対する抗体の製造を研究するための血球凝集阻止反応（ ＩＡＩ）テスト中にテストされた（１９７０）、ＩＡＩ中の血清の最初の希釈は 、１：９であり、その後２倍に希釈される。

血清は、疑似狂犬病ウィルス（ＰＲＶ；ＶａｎＯｉｒｓｃｈｏｔ　ｅｔ　ａｌ、 、１９８８）　、豚のボルボウイルス（Ｐ　Ｐ　Ｖ　；　Ｉｅｓｔｅｎｂｒｉｎ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ｇ９）　、牛のウィルス性下痢ウィルス（Ｂ　Ｖ　Ｄ 　Ｖ　；　ｌ１ｅｓｔｅｎｂｒｉｎｋ　ｅｔａｌ、、　１９１１６）および雌豚 コレラウィルス（ＨＣＶ；　ｌ１ｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１ １）の糖蛋白質に対する抗体のための確立された酵素結合イムノソルベント検定 法（ＥＬＩＳＡ）中でテストされた。ＥＬＩＳＡ中の最初の希釈は、１：５であ り、その後血清は２倍に希釈された。

血清は、Ｔｅｒｐｓｔｒａ（１９７１１）の処方に従って脳心筋ウィルス（ＥＭ ＣＶ）　、豚の腸内ウィルス（ＰＥｖ）およびＬ　Ａ　ノ３０〜３００　Ｔ　Ｃ Ｉ　Ｄ　ｓｏニ対ｔる抗体を中和するためにテストされた。血清中和テスト（Ｓ ＮＴ）中の血清の最初の希釈は１：５であり、その後血清は２倍に希釈された。

血清は、免疫バーオキシターゼ単層検定法（ＩＰＭＡ）でＬＡと結合するための テストがされる。

ＬＡ（コードＣＤＩ−ＮＬ−２，９１）は、新たに植え付けられた肺マクロファ ージを含むミクロタイタープレートの穴に１００　Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｓ。ＬＡを含 む培養液５０ｒｎｌを加えることによってミクロタイタープレート中に植え付け られる。細胞は２日問培養されその後、述べたように＜　ｌ１ｅｎｓｖｏｏｒｔ 　。

１９１１６）同定される。テスト血清は、０．１５ＭＮａＣ＋、０．０５％トワ イーン界面活性剤、８０．４％馬血清中で１＝１０に希釈され、さらに４倍に希 釈され、穴に加え、３７℃で１時間恒温にされる。羊対豚の免疫グロブリン（Ｉ ｇ）は、ホースラディツシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ。

ＤＡＫＯ）に接合され、同じ緩衝液中で希釈され、３７℃で１時間恒温にして用 いられ、その後プレートは記述された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８６）ように染色される。汚染されたマクロファージの細胞質の強い着色赤 は、ＬＡに血清が結合したことを示す。

ウィルス同定の手順 単離された細胞変成の同定は、、ＣｓＣ１中で浮揚性比重を定めることによって 電子顕微鏡検査で負に荷電された調整物中で判断することによって、クロロホル ムに鋭敏に分離するものを定量することで、また知られた特性（表３）で血清を 分離するＣＰＥの中和によって研究された。単離物は、いつでも知られたウィル スに対して処理された血清によって特別に中和され、単離物はこの知られたウィ ルスの呈示量であると考えられる。

マクロファージ培養上のＣＰＥを示す単離物は、また豚ｃ８２９かｂ８２２の後 汚染された血清でＩ　ＰＭＡ中で染色されることによって研究される。

単離物は、マクロファージ培養上で再接種され、接種後同定物がＣＰＥを示す前 に１日同定される。

単離物は、いつでも豚ｃ８２９とｂ８２２の後汚染血清でＩＰＭＡ中で再活性を 示し、ＬＡの典型であると考えられる。マクロファージ中で培養された他の単離 物の典型または汚染されていないマクロファージは、また血清の特性を調べるた めにこれらの血清で染色される。

ＬＡの同定 ＬＡはさらに雌鶏１モルモット、豚、羊、大のＯ型赤血球で４℃と３７℃で血球 凝縮反応によって研究された。ＳＩＶ、サブタイプ８３Ｎ２は、血球凝縮反応の 研究中に正の制御剤として用いられた。

疑似狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）、透過性腸内ウィルス（ＴＧＥ）、豚流行性下痢 ウィルス（ＰＥＤ）、血球凝集反応性脳炎ウィルス（ＨＥＶ）。

アフリカ豚熱ウィルス（ＡＳＦＶ）、雌豚コレラウィルス（ＨＣＶ）および豚イ ンフルエンザウィルス（ＳＩＶ）のＨＩＮＩとＨ３Ｎ２に対して特に処理される 豚の抗血清と、１型と４型の牛庖疹ウィルス（ＢＨＶＩ、４）悪性カタル熱（Ｍ ＣＦ）、パラインフルエンザウィルス３（ＰＩ３）、牛呼吸シンシチアルウイル ス（ＢＲＳＶ）および牛白血病ウィルス（ＢＬＶ）に対して特別に処理される中 杭血清と、鳥白血病ウィルス（ＡＬＶ）および伝染性気管支炎ウィルス（Ｉ　Ｂ Ｖ）に対して特別に処理される鳥抗血清とが、上述のような豚の肺のマクロファ ージで汚染されまたは汚染されないＬＡ上にＩＰＭＡ中でＩｇ種の特別なＨＲＰ Ｏ接合するものとして研究された。

我々は、またＩ　ＰＭＡ中で流行性耳下腺炎ウィルス、センダイウィルス、犬デ イステンパウイルス、牛疫ウィルス、麻疹ウィルス、マウスの肺炎ウィルス、牛 呼吸シンシチアルウイルス、狂犬病ウィルス、泡沫ウィルス、メディビスナウイ ルス、牛とマウスの白血病ウィルス、人、猫、猿の免疫不全ウィルス、リンパ球 性脈絡髄膜炎ウィルス、猫感染性腹膜炎ウィルス、マウス肝炎ウィルス、プレダ ウイルス、ハンターンウイルス、ナイロビ羊病ウィルス、東西ベネズエラ馬を椎 膜炎ウィルス、風疹ウィルス、馬動脈炎ウィルス、孔膜ヒドロゲナーゼウィルス 、黄熱病ウィルス、先天性脳炎ウィルスおよび肝炎Ｃウィルスに対して処理され た各種の抗血清をテストした。

ＬＡは、ＰＸ３．ＰＫ〜１５および５Ｋ−６細胞中でならびに雛化した鶏卵中で 自由に変化する。

２つの変化の後に、再単離のために豚の肺マクロファージ培養器に再度接種され る。

ＬＡは、０．２ミクロンのが過に先だってまたは後で、豚の肺マクロファージ中 で滴定される（Ｓｃｈｌｅｉｃｂｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）　、　Ｌ　Ａ はＩ　ＰＭＡ中でそのＣＰＥによって検出される０滴定はＲｅｅｄおよびＭｕｅ ｎｃｈに従って計算される（１９３ｇ）　。

我々は、さらにＬＡに対して処理された豚の抗血清を準備した。２つのＳＰＦ豚 （２１および２３）は、第５の細胞培養継代の１０　’Ｔ　、ＣＩ　Ｄ　ｓ。

で鼻の周辺に感染される。２つの他の豚（２５および２９）は、１０’ＴＣＩＤ Ｓ。ＬＡを含むＬＡで汚染されたＳＰＦ子豚の肺の新鮮な懸濁物で鼻の周辺に感 染される。血液試料は、０．１４．２８および４２日の後感染（ｄｐｉ）で得ら れる。

我々は、豚肺胞マクロファージ中でＬＡの時間による培養パターンを決定するた めに、ＬＡを培養した。豚の肺胞マクロファージは、Ｆ２５フラスコ中で植え付 けられ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）　、１細胞当り、０．０ＩＴＣＩＤｓｏの感染増殖を もつＬＡで汚染された。汚染後８，１６，２４，３２．４０，４８．５６および ６４時間で、１つのフラスコは試験され、非感染制御培養に関してＣＰＥの百分 率が決定される。培養液は、収穫され、同容積のリン酸緩衝塩で置換される。培 養液とフラスコとは、−７０℃で貯蔵される。すべての培養器の収穫が終わった 後、ＬＡの力価はＴＣＩ　Ｄｉ。ｍｌ−１の対数として決定され表現される。

ＬＡの形態は、電子原微鏡によって研究された。

ＬＡは、上述のように培養され４８時間後、培養器は凍結融解され、６０００Ｇ で１０分間遠心分離された。３０ｍ１の上澄液は、０．３ｍｌのしＡ種豚血清と 混ぜられ、３７℃で１．５時間定温に保たれた。３０分間１２５，０ＯＯＧで遠 心分離後、生じたベレットを１％シーケンアガロースのＭＥ中へ４０℃でリン酸 緩衝塩中で懸濁された。

凝固後、アガロース塊を０．８％グルタルアルデヒドと０，８％オスミウムテト ラオキサイド中でＰＨ７，４のベロナール／アセテート緩衝液（２３０腸Ｏｓｓ ／ｊ！ｇＨｚＯ）中へ浸し、そしてマイクロウェーブを照射して固化した。この 手順は新しい同定液でもう一度繰り返した。試料は水で洗浄され、１％ウラニル アセテート中へ浸され、マイクロウェーブ照射によってじみをつけられた。すべ てのステップ中、試料は０℃に保たれ、マイクロウェーブ（Ｓａｍｓｕｎｇ　Ｒ Ｆ、２＋１０　）は、５分間溶融してセットされる。薄膜は標準技術で準備され 、クエン酸鉛でじみを付け（Ｖｅｎａｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、＋９６５）　、Ｐ ｈｉｌｉｐｓＣＭｌｏを子顕微鏡で試験される。

我々は、さらにＭＳＤの原因の源となる豚の血清からＬＡを単離することを続け た。オランダ（野性、オランダ２）、ドイツ（野性、ドイツ１およびドイツ２　 ：ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒｓ、Ｂｅｒｎｅｒ、１ｌｔｉｎｃｈｅｎ　ａｎｄＮｉ ｅｎｈｏｆｆ、１ｌｔｉｎｓｔｅｎ　）　、および米国〔実験ＵＳＩ（ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２で前もって行われた実験；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒｓ、Ｃｏｆ ｆ１ｎｓ、　５ｔ−Ｐａｕｌ　ａｎｄ　Ｃｈｌａｄｅｋ、Ｓｔ、Ｊｏｓｅｐｈ） 　、および野性ＵＳ２とＵ　Ｓ　３　（ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒｓ、　ｖａｎ　 Ａｌ５ｔｉｎｓ、ｌ１ｅｓｔＬａｆａｙｅｔｔｅ　ａｎｄ　５ｌｉｆｅ、Ｇａｌ ｅｓｂｕｒｇ））のすべての試料は、中央獣医学研究所のＬＡ研究部門へＬＡの 診断のために送られた。すべての試料は、上記のように豚の肺胞マクロファージ でウィルスの単離のために用いられた。細胞変成単離物は、３代に継代され、後 感染血清ｂ８２２と０８２９の抗ＬＡで特別に免疫汚染することによってＬＡと して同定された。

我々はまた、ＮＬＩ（最初の単離ＬＡ；コードＣＤＩ−ＮＬ−２，９１＞、Ｎｌ ２．ＧＥＬ、ＧＥ２．０ＳＩ、ＵＳ２およびＵＳ３の単離の抗原関係を研究した 。単離物は上述のようにマクロファージ中で培養され、Ｉ　ＰＭＡ中で野性の血 清のセットと実験的な血清の２つのセットとをテストされた。血清はまたＩＰＭ Ａ中で非感染マクロファージでテストされた。

野性の血清、すなわちＬＶのための正の２つの血清（ＴＨ−４８７とＴＯ１６） は、ＬＡ陽性のオランダの野性血清のセットから選択された。２つの血清は、血 清学的診断のためのＬＡ部門に海外から送られた野性血清から選択された。ドイ ツ（ＢＥ−３５２，ＢＥ−３９２およびＮ１ｆ２；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒ、 Ｂｅｒｎｅｒ、口ｎｃｈｅｎａｎｄ　Ｄｒ、Ｎ１ｅｎｂｏｆｆｊｌｔｉｎｓｔｅ ｒ）　、英国（ＰＡ−１４１６１５゜ＰＡ−１４１６１７およびＰＡ−＋４２４ ４０　；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒ、ＰａＬｏｎ。

Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）　、ベルギー（ＰＲ−＋９６０　；　ｃｏｕｒｔｅｓｙＰ ｒｏｆ、Ｐｅｎ５ａｅｒｔ、Ｇｅｕｔ　）フランス（ＥＡ−２９７５およびＥＡ −２９＋１５　；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ、Ｄｒ、Ａｌｂｉｎａ、Ｐｌｏｕｆｒａｇ ａｎ）　。

アメリカ（ＳＬ−４４１，５Ｌ−４５１，ＡＬ−ＲＰ９５７７、　ＡＬ−Ｐ１０ Ｓ目＋３３．　ＡＬ−４９９４Ａ、　ＡＬ−７５２５，ＪＣ−ＭＮ４１．　ＪＣ −１１Ｎ４４オよびＪＣ−ＭＮ４５　；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒ、５ｌｉｆｅ 、　Ｇａｌｅｓｂｕｒｇ。

Ｄｒ、ｖａｎ　Ａｌ５ｔｉｎｅ、Ｗｅｓｔ　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ　ａｎｄ　Ｄｒ 、Ｃｏ１１ｉｎｓ。

Ｓｔ、Ｐａｎ１）およびカナダ（ＲＢ−１６，ＲＢ−１９，ＲＢ−２２およびＲ Ｂ−２３；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｑｕｅｂｅｃ）がら ２２の血清が送られた。

実験血清は、　ｄｐｉ　０．１４．２８および４２で得られた豚２１．２３．２ ５および２９の血清の上述のセットである。　（Ｄｒｓ、ｃｈｌａｄｅｋ、　Ｓ Ｌ。

ＪｏｓｅｐｂおよびＣｏ１１ｔｎｓ、　Ｓｔ、Ｐａｕｌの承認によって得られた ）実験血清のセットは、単離ＡＴＣＣＶＲ−２３３２ノ１０’・ＩＴｃ　Ｉ　Ｄ 、、　テ鼻水４．：抗体試験された生後６ケ月の４匹の未妊娠豚がら採取された 。血液試料は、０，２０．３６および６３ｄｐｉで２Ｂの未妊娠豚と、０，３０ ．４４および６８ｄｐ　ｉで９Ｇの未妊娠豚と、０．２５．４０および６４ｄｐ ｉで１６Ｗの未妊娠豚と、０゜３６および６４ｄｐｉで１６Ｙの未妊娠豚とから 得られた。

放射性免疫沈降試験管（ＲＩ　Ｐ　Ｈｄｅ　Ｍａｇａｎｃｏｕｒｔｅｔ　ａｌ、 、＋９１１６）による汚染豚の肺胞マクロファージ中のＬＡの蛋白質の研究につ いて、我々はｓｓｓ−システインを含む標識を付された媒体の存在中で１６時間 ＬＡで汚染され、または汚染されないマクロファージを培養した。標識を付され た細胞は、豚ｂ８２２と豚２３の４２ｄｐｆ後汚染血清と、単離ＡＴＣＣＶＲ− ２３３２で汚染した豚の２６日後の血清ＭＮ８とで標準の方法に従って沈澱され た（　ｃｏｕｔｅｓｙ　Ｄｒ、Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｓｔ、Ｐａｎ１　）　、沈澱し た蛋白質は、１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動によって、分析され、蛍 光光度法によって可視化された。

ＬＡゲノムの特性を明らかにするために、我々はＬＡで汚染され、２４時間培養 されたマクロファージまたは汚染されないマクロファージ培養器からの核ＤＮＡ と細胞質ＲＮＡとを抽出した。細胞培養液は、不要なものを捨てられ、細胞はリ ン酸緩衝塩で２回洗浄される。ＤＮＡは、上述のように抽出される（Ｓｔｒａｕ ｓｓ、＋９１ｔ７）　、細胞質ＲＮＡは、上述のように抽出され（Ｆａｖａｌｏ ｒｏ　ｃｔ、　ａｌ、　、　１９８０）、５．７Ｍ　ＣｓＣｌをクッションとし て遠心分離で精製され、（５ｅｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０）　、　ＲＮ アーゼを含まないＤＮアーゼで処理され（Ｐｈａｉｍａｃｉａ）、そして０．８ ％中性アガロースゲル中で分析される（　Ｍｏｏｒｓａｎｎ　ａｎｄ　Ｈｕｌｓ ｔ、１９１１ｇ＞　。

クローニングと配列決定 ＬＶ　ＲＮＡを増殖するために、ＬＶで汚染された豚の肺胞マクロファージの＃ ｌ胞内ＲＮＡ（１０Ｈｇ）は、室内で１０分間１０ｍＭ水酸化メチル水銀で培養 された。変成されなＲＮＡは、５０ｍ、　Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７，８）と１０ ｍＭＭｇＣ１，，７０ｍＭ　ＫＣＩ、０．５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ およびｄＴＴＰ。

０．６μｇの子牛の脚線オリゴヌクレオチド・プライマｐｄ　（Ｎ）６で増殖さ れ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マウス、のモロニー白血病ウィルスの３重０単位が １００μｌの全容積中で転写酵素で変化させられた（　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＞　、　２０　ｍ　ＭＥＤＴＡは１時 間後に加えられ、反応混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され、セファデ ックス０５０カラムを通して一過されエタノールで沈澱させられた。

第２のＣ−ＤＮＡ鎖の合成のために、ＤＮＡ逆転写酵素Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎ’ ｇｅｒ）およびＲ，Ｎ−アーゼＨ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が使われた（Ｇｊｉｂ ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ。

１９８３）　、端末における平滑末端を作るために２重螺旋ｃ−ＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって０．０５ｍＭデオキシヌクレ オチド３リン酸を含む反応混合物中で増殖された１次いでｃ−ＤＮＡは、０．８ ％アガロースゲル中で分別された（Ｍｏｏｒｍａｎｎ　ａｎｄ　ｌ！ｕｌｓｔ、 １９８８）　。

１〜４ｋｂの断片は、電気溶出され、ｐＧＥＮ−４Ｚ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳ ｍａ　１位置へ結合され、変形ＤＨ５αに大腸菌を変質するために用いられる（ Ｈａｎａｈａｎ、１９１１５）　、コロニー濾過は、”ｐＴ漂識を付けられた単 鎖ｃ−ＤＮＡ７０−ブで雑種化された。プローブは、中性のアガローゼゲル中で 分割されたＬＶ　ＲＮＡがら逆転写された（　ｌｌｏｏｒｍａｎｎａｎｄ　Ｈｕ ｌｓｔ、　１９＋１８）　、単鎖ＤＮＡを用いる前にプローブは、細胞質ＲＮＡ で模倣汚染肺胞マクロファージから増殖された。

ＬＶｃ−ＤＮＡクローン間の関係は、制限酵素分析によってよたニックトランス レーションＣ−ＤＮＡ７０−ブを有する消化されたＤＮＡのサウザンプロットの 雑種化によって定量される（Ｓａｓｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）　。

ウィルスのゲノムの３′端末を得るなめは、我々はオリゴ（ｄＴ）＋ｚ−４と第 １の鎖反応中のプライマとしての負鎖ウィルスゲノムに補充する３′ＬＶ種のオ リゴヌクレオチドを使って第２のＣ−ＤＮＡライブラリーを構成しな、第１およ び第２厘合成のための反応条件は、上に述べたものと同一である。このライブラ リーは、３一端末オリゴヌクレオチドプローブのウィルス種で覆われた。

ｃ−ＤＮＡ配列の大部分（９５％以上）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ１３によ って自動化されたレーザ蛍光ＤＮＡ配列決定装置（Ａ、Ｌ、Ｆ商標）で決定され る。

配列決定された蛍光オリゴヌクレオチドプライマは、自動読取配列決定器具（＾ ｕｔｏＲｅａｄ商標：Ｐｈａｒ■ａｃｉａ）の説明書に記述された手続ＣとＤと に本質的に従う自動読取配列決定装置を使って貫層ＤＮＡ上に作られる。蛍光を 発するプライマは、蛍光プライマ装置（Ｐｈａｒｍａｃｊａ）で作られる。配列 の残存する部分は、配列決定に基づ（Ｔｆ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） とａ−”Ｓ　−ｄ　ＡＴ　Ｐ　（＾ｓｅｒｓｈａｍ）とを結合したオリゴヌクレ オチドを使って貫層螺旋ＤＮＡ配列を介して決定される。配列データは、Ｐ　Ｃ Ｇ　Ｅ　Ｎ　Ｅ　（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ。

１１ｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、ＵＳＡ）およびＦ　Ａ　Ｓ　Ｔ　Ａ　（Ｐｅａ ｒｓｏｎａｎｄ　Ｌｉｐ■ａｎ、１９Ｈ）の配列分析プログラムを使って分析さ れる。

ＭＳＤの実験的再生産 妊娠後１０〜１１週を経た１４群の飼育された雌豚は、Ｉ　ＰＭＡ中でＬＡに対 する抗体のなめにテストされた。全ては陰性であった。４匹の豚の２群が形成さ れＣＶＩに買われた。妊娠後１２週閏でこれらの豚は、２ｍｌ　ＬＡ（継代水準 ３、力価１０　’１Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｇｏ／　ｍ　ｌ　）を鼻孔内に接種した。血 清とＥＤＴＡ血清試料は接種後１ｏ日して採取された０食物摂取量、体温、その 他の臨床上の徴候は毎日観察された０分娩に際し、出産日と雌豚当りの産まれた 子豚の生死が記録され、試料はウィルスの分離と血清のために採取された。

結果 免疫蛍光法 ＭＤＳを持った豚の組織の断面は、ＩＦ７中でアフリカ豚熱ウィルス、雌豚コレ ラウィルス、疑似狂犬病ウィルス、豚パルボウィルス、豚インフルエンザウィル ス、脳心筋ウィルスおよびオウム病クラミジアに対して処理されたＦＩＴＣ接種 物で感染された。感染された断面は蛍光顕微鏡検査によって調べられ、陰性であ った。

養豚場でＭＳＤの影響を受けた子豚からのウィルス単離 細胞変成の単離物は、ＭＳＤで影響を受けた生ｔ１１２〜１０日の子豚の組織試 料で接種されたマクロファージ培養中で検出された。５箇所の異なりた養豚場を 起源とする１９匹の子豚からの１６匹が陽性であった（表ＩＡ）、これらのすべ ての単離物は、Ｉ　ＰＭＡ中で豚ｃ８２９の後汚染血清と反応した。非汚染制御 培養器は、反応しなかった。

したがって単離物は、ＬＡの典型であった０組織変成単離物は、第６の養豚場（ ｆａｒｍ　ＶＥ）がらの子豚の口のまわりを拭って得た懸濁物で接種された５Ｋ −６細胞培養中で検出されたく表１４）、この単離物は、ピコルナ類ウィルスの 性状を示し、ＲＥＶ２種の血清によって中和された。したがって単離物はＲＥＶ ２として同定された（表３）。

ＰＫ２．ＰＫ−１５細胞と鶏卵は陰性を残し、このグループからの試料で接種さ れた。

養豚場でＭＳＤによって影響を受けた雌豚からのウィルス単離 細胞変成の単離物は、ＭＳＤによって影響を受けた豚の試料で接種されたマクロ ファージ培養器中で検出された。１１の養豚場起源の４１〜６３匹の豚は、陽性 であった（表ＩＢ）、これらのすべての単離物は、Ｉ　ＰＭＡ中で豚ｂ８２２の 後汚染血清と反応し、ＬＡの存在を示した。必要なときに細胞変成の単離物は、 養豚場ＨＵからの豚の白血球を分離した懸濁物で接種されたＰＫ２細胞中で検出 されたく表ＩＢ〉、この単離物は、ピコルナ類のウィルスの性状を示し、ＥＭＣ Ｖ種の血清によって中和された。したがって単離物は、ＥＭＣＶとして同定され たく表３）　、５Ｋ−６，ＰＫ−１５細胞と鶏卵は陰性を残し、このグループか らの試料で接種された。

ＭＳＤで影響を受けた雌豚と接触を保ったＳＰＦ豚からのウィルスの単離 細胞変成の単離物は、ＭＳＤで影響を受けた雌豚と接触を保ったＳＰＦ豚の試料 で接種されたマクロファージ培養中で検出された。１２匹の豚中４匹は陽性であ った（表２）、これらのすべての単離物は、Ｉ　ＰＭＡ中で豚Ｃ８２９と豚ｂ８ ２２の後汚染血清と反応し、ＬＡの存在を示した。細で接種されたＰＫ２．ＰＫ −１５８に一６細胞培養中で検出された。また１２匹の豚中７匹が陽性で（表２ ）、これらの単離物はすべてＰＥＶ７に対して処理された血清によって中和され た。これらの７個の単離物の１つはさらに研究され、他の特性がまたＰＥＶ７と して同定された（表３）。

ＭＳＤで影響を受けた雌豚の血液で接種されたＳＰＦ豚からのウィルスの単離 細胞変成の単離物は、ＭＳＤで影響を受けた雌豚の血液で接種されたＳＰＦ豚の 試料で接種されたマクロファージ培養器中で検出された。８匹の豚中２匹は、陽 性であった（表２）、これらの単離物は、すべてＩ　ＰＭＡ中で豚ｃ８２９と豚 ｂ８２２の後汚染血清と反応し、ＬＡの存在を示した。

このグループからの試料で接種されたＰＫ２，５Ｋ−６およびＰＫ−１５細胞が 陰性のまま残った。

ＭＳＤと関連することのできる物質の存在を確認するためにテストされた豚の４ つのグループの概要 第１のグループでは、子豚に影響を与えるＭＳＤ中でＬＡが１６〜２０匹の子豚 からＰＥＶ２として単離された。

第２のグループでは、雌豚に影響を与えるＭＳＤ中でＬＡが、４１〜６３匹の雌 豚からＥＭＣｖとして単離された。さらに１２３〜１６５匹のＭＳＤで影響を受 けた雌豚は、ＬＡに血清変成したことがＩ　ＰＭＡ中でテストされた。このよう な大量の血清変成は、テストされた他のウィルス性病原体のいずれに対しても実 証されなかった。

第３のグループでは、ＭＳＤの影響を受けた雌豚と接触を保ったＳＰＦ豚中で、 ＬＡは４〜１２匹の豚から単離され、ＰＲＶ７は７匹の豚から単離された。すべ ての豚は、ＬＡとＰＲＶ７に血清変成した。

第４のグループでは、ＭＳＤで影響を受けた雌豚の血液を接種されたＳＰＦ豚中 で、ＬＡは２匹の豚から単離反された。すべての８匹の豚はＬＡに血清変成した 。

ＭＳＤで影響を受けた養豚場からの雌豚の血清学 ＭＳＤで影響を受けた雌豚からの対の血清は、種々なウィルス性病原菌とこの研 究の期間中に得られた単離物とに対するテストが行われた（表４）、ＬＡに対し て処理された過剰抗体応答は、ＩＰＭＡ（２３〜２６の養豚場で見付かった血清 変成された雌豚の７５％）中で測定され、血清変成の明確なパターンは、他のウ ィルス性病原菌で１つも見付からなかった。ＬＡに対して処理された中性抗体は 、検出されなかった。

ＭＳＤで影響を受けた雌豚と接触を保ったＳＰＦ豚の血清学 ８匹すべてのＳＰＦ豚は、Ｉ　ＰＭＡ中でＬＡに対して抗体応答を示した（表５ ）、非汚染マクロファージで実行されたＩＰＭＡ中で、これらの血清は１つも陽 性でなかった。またＬＡのためのＳＮＴ中でも陽性でなかった。接触後２週間で 採取された血清は、ＰＲＶ７に対して高い中性抗体力価（＞１２８０＞を有し、 前汚染血清は陰性（く１０）であった、これはすべての豚がＰＲＶ７で汚染され ていることを示す。

ＭＳＤで影響を受けた雌豚の血液を接種したＳＰＦ豚の血清学 すべての８匹のＳＰＦ豚は、ＩＰＭＡ中でＬＡに対して抗体応答を示した（表５ ）、非汚染マクロファージで実行されたＩ　ＰＭＡ中で、これらの血清は１つも 陽性ではながった。またＬＡのためのＳＮＴ中でも陽性でなかった。前および２ 週間後の接種血清は、ＰＲＶ７に対して陰性（＜１０）であった。

ＬＡの同定 ＬＡは、雌鶏、モルモット、豚、羊または人の０型赤血球細胞で血球凝集反応を 起こさながった。

ＬＡはＩ　ＰＭＡ中でＰＲＶ、ＴＧＥ、ＰＥＤ。

ＡＳＦＶなどに対して処理された血清と反応しなかった。

２継代後、ＬＡは、ＰＫ２．ＰＫ−１５もしくは５Ｋ−６細胞中またはアラント イツク経路を通って接種された雛化鶏卵中では、生育しなかった。

ＬＡは、０．２ミクロンフィルタを通して濾過された後でも感染し得て、力価は 濾過の前後で工ＰＭＡで検出されるように、それぞれ１０ｓ、ｏｓと１０５コＴ 　ＣＩ　Ｄ　ｓ。であった。

ＬＡの生育曲線（図３を見よ）、細胞のないウィルスの最大力価は、接種後３２ 〜４８時間で約１０　”Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｓｏｍ　ｌ−’である。この時間の後マ クロファージは、ＬＡの細胞変成効果によって殺される。

電子顕微鏡検査０球型のＬＡ粒子の房が見られる。粒子は直径４５〜５５ｎｍと 測定され、脂質の２層膜で覆われた３０〜３５ｎｍのヌクレオキャプシドを含ん でいた。ＬＡ粒子は、陰性の血清で処理された培養器または陰性に制御された調 整器中では見付からなかった。

オランダ、ドイツ、アメリカ合衆国からの単離物。７つの全単離物は、豚の肺胞 マクロファージ中で３〜４継代を経て単離された。すべての単離物は、マクロフ ァージ中で細胞変成効果を起し、抗ＬＡ血清ｂ８２２と４２ｄｐｉ血清２３で特 別に免疫感染されることができた。単離物は、ＮＬｌ、Ｎｌ２．ＧＥＬ、ＧＥ２ ．ＵＳＩ、ＵＳ２およびＵＳ３と名付けられた。

単離物ＮＬＩ、ＮＬ２．ＧＥＬ、ＧＥ２．ＵＳｌ、ＵＳ２およびＵＳ３の抗原関 係、ＩＰＭＡ中で非汚染マクロファージと１つの野性種の血清も反応しなかった が、すべての血清は７つの単離物の１つより多くに対して処理された抗体を含ん でイタ（表７）、ＩＰＭＡ中で非汚染マクロファージと実験種の血清も１つも反 応しなかった。そしてｏａｐｔ実験血清は、Ｉ　ＰＭＡ中で７つの単離物の１つ とも反応しながった（表８）、ＬＡ単離物の７つの全ては、０ｄｐｉ後に採取さ れた豚２１．２３．２５および２９の実験血清のセットからの血清のほとんどす べてと反応した。単離物ＵＳｌ、ＵＳ２およびＵｓ３のみが、０ｄｐｉ後に採取 した未妊娠の豚２Ｂ、９Ｇ、１６Ｗおよび１６Ｙの実験血清のセットがらの血清 のほとんどすべてと反応した。

放射線免疫沈澱の研究、７つのＬＡ種蛋白質は、ＬＡ汚染マクロファージ中で検 出されたが、豚ｂ８２２および２３の４２ｄｐＬ血清で沈澱された非汚染マクロ ファージ中では検出されながった。

この蛋白質は、６５，３９，３５，２６．１６および１５キロダルトンの分子量 であると概算された。これらのＬＡ種蛋白質の１５と１６キロダルトンの２つは 、２６ｄｐ　Ｌ血清ＭＮ８によってまた沈澱した。

ＬＶゲノムの配列と体制 ＬＶゲノムの性質は、汚染された豚の肺胞マクロファージからのＤＮＡとＲＮＡ とを分析することによって決定された。ＬＶ種ＤＮＡは、検出されなかったが、 ［，７種ＲＮＡを検出した。０．８％中性アガロースゲル中でＬＶ　ＲＮＡは、 雌豚コレラウィルスの１２．３ｋｂの長さのＲＮＡが泳動するよりも僅かにゆっ くりと泳動した（１１ｏｏｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、＋９９０）　、正確な大 きさの決定は、中性アガロースゲル中ではできないが、ＬＶ種ＲＮＡは約１４． ５〜１５．５ｋｂの長さであることが概算された。

汚染細胞中でＬＶ種ＲＮＡの複雑度を決定するためとＬＶゲノムのヌクレオチド 配列を確立するためとに、我々は、ＬＶで汚染された豚の肺胞マクロファージの ＲＮＡからのｃ−ＤＮＡを準備し、物質と方法の項で記したように、ＬＶ種ｃ− ＤＮＡクローンを選びマツピングした。ｃ−ＤＮＡクローンの特性は、種クロー ンの雑種化によって再限定され、ＬＶ汚染および非汚染のＲＮＡを担うノーザン プロットに重複ｃ−ＤＮＡ配列の至る処に位置した。注目すべきは、ｃ−ＤＮＡ クローンのあるものは、汚染されたマクロファージ中で検出される１４．５〜１ ５．５ｋｂのＲＮＡと雑種化し、他のものは（概算大きさ１〜４ｋｂの）より低 い分子量の４また５ＲＮＡのパネルと同様に１４．５〜１５．５ｋｂのＲＮＡと 雑種化した。

後者のクローンは、ｃ−ＤＮＡマツプの一端にすべて固化された。これらのデー タは、ＬＶのゲノム体制がコロナウィルス科（５ｐａａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８１り、ベルンウイルス（Ｂ　Ｅ　Ｖ　；　５ａｉｊｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

＋９９０ｂ）　、ｔ−ロウイルスとＥ　Ａ　Ｖ　（ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　ｅｔ　ａ ｌ。

、　＋９９０）のそれに似ている。すなわちさらにゲノ＾の３′端末に位１する 巣作りされたセットを形乍るサブゲノムｍ−ＲＮＡであるゲノムＲＮＡに似てい る。この仮定は、ｃ−ＤＮＡクローンの配列が役立ち特別のプライマがじみを持 ったプローブに選ばれるときに確かなものになる。雑種化データの編集は、ｃ− ＤＮＡクローンで得られ、ＬＶ汚染と非汚染マクロファージのＲＮＡを担うノー ザンプロットによって雑種化された特別のプライマは、図２に示される。５′部 に位置するクローン１２と２０および配列の中央は、ＬＡ汚染細胸中で検出され る１４．５〜１５．５ｋｂゲノムＲＮＡに各々雑種化した。しかしクローン４１ と３９とは、１４，５〜１５．５ｋｂのゲノムＲＮＡとより低い分子量の４と５ とのＲＮＡのセットとをそれぞれ認めた。しかし最も有効な確定的な雑種化パタ ーンは、ＬＶ配列中で決定的な５′端末に位置するプライマ２５で得られた（図 １と比較せよ）、プライマ２５は、７ＲＮＡのパネルにゲノムＲＮＡと同様に０ ．７〜３．３ｋｂの大きさに相当する分子量でもって雑種化された（サブゲノム ｍ−ＲＮＡ）、プライマ２５の雑種化パターンのための最も好ましい説明は、ま だ知られていない長さの５′端末ゲノム配列が、ゲノムの３′端末から転写され たｍ−ＲＮＡの本体に融合することでなされた。実際にプライマ２５で得られた 雑種化パターンは、５′端末ゲノム配列がいわゆる「リーグ配列」としてサブゲ ノムｍ−ＲＮＡとして存在することを暗示した。このような転写パターンは、コ ロナ科ウィルス（Ｓｐａａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９１１８）およびＥ　Ａ　Ｖ　 （ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）の複製のホールマークである。

上のデータから抽出し得るＬＶとＥＡＶとの間の注目すべき相違点は、ＬＶのゲ ノムサイズか約２．５ｋｂの長さでＥＡＶの長さより長いことである。

重複したｃ−ＤＮＡクローンの合意できるヌクレオチド配列は、図１に示される 。配列の長さは、１５．０８８の塩基対からなるその塩基対は、ゲノムＬＶ　Ｒ ＮＡの概要サイズとよく一致する。

ＬＶのｃ−ＤＮＡライブラリは、子豚の脚線ｐｄ（Ｎ）６プライマで逆転写反応 のランダムプライマで作られるので、ｃ−ＤＮＡクローンは、いずれもそれらの ３′端末でポリ（Ａ）（ポリアデニル酸）を引き伸ばして得られなかった。ウィ ルスゲノムの３′端末を作るために、我々は、オリゴ（ｄＴ）と逆転写反応で得 るプライマ３９Ｕ１８３Ｒを用いて、第２のｃ−ＤＮＡライブラリを組み立てた 。プライマ３９Ｕ１８３Ｒは、ＬＶ汚染細胞から単離されたＲＮＡ１ｌ整物中に 好ましくは存在するＬＶマイナスｇＲＮＡを補充した。このライブラリは、ウィ ルス特異性プローブにツクトランレーションされたｃ−ＤＮＡクローン１１９と オリゴヌクレオチド１１９Ｒ６４Ｒ）で選り分けられ、その結果５つの添加ｃ− ＤＮＡクローン（たとえばｃ−ＤＮＡクローン１５１２図２）の単離物が得られ る。これらのｃ−ＤＮＡクローンの配列は、ＬＡが３′ポリ（Ａ）端末を含むと いうことを知らせた。ポリ（Ａ）端末の長さは、種々のｃ−ＤＮＡクローンの間 で変化するが、その最大長さは、２０ヌクレオチドであった。さらにクローン２ ５と１５５（図２）と、４つの添加ｃ−ＤＮＡクローンとは、ゲノムの５′端末 で単離された。そのゲノムは、図１に示される５′端末ヌクレオチドよりも短い ２〜３ヌクレオチドであった。この発見とｃ−ＤＮＡが合成される方法が与えら れれば、我々は、ＬＶゲノムＲＮＡの配列の５′端末に非常に類似すると仮定す る。

ＬＶのゲノム配列の約７５％は、０ＲＦＩＡとＯＲＦ　Ｉ　Ｂをコート化する。

０ＲＦＩＡ４１、ＬＶ配列中で出会った第１ＡＵＧ（ヌクレオチド２１２の位置 、図１）で開始する。　ＯＲＦ　Ｉ　Ａｌ）Ｃ一端末は、１６個のヌクレオチド の小さい距離を超えて、ＯＲＦ　Ｉ　Ｂの推定上のＮ一端末と重なる。

ＯＲＦ　Ｉ　Ｂの転位は、リポソームのフレームシフト、ポリメラーゼの転位の 様式のホールマーク、またはコロナウィルスのレプリカーゼ（Ｂｏｕｒｓｎｅｌ ｌｅｔ　ａｌ、、１９８７　；　Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９９ ０）およびトロウィルスＢ　Ｅ　Ｖ　（Ｓｎｉｇｊｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ９０ａ）を経て進む、リポソームのフレームシフトの位置で形作られることを予 言される特性ＲＮＡ擬結節構造は、ＬＡの配列中のこの位置にまた見付けられる （結果は示されない）。

ＯＲＦ　Ｉ　Ｂは、コロナウィルス類のＭＨＶおよびＩＢＶ（約３，７００のア ミノ酸残基；　Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋｅｔ　ａｌ、、１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅ ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９＋１７）およびＢＥＶ（約２，３００のアミノ酸残基 ；　５ｎｉｊｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０ａ）のＯＲＦ　Ｉ　Ｂよりずっと小さい約１４００のアミノ酸配列の残 基でコード化される。レプリカーゼに似たコロナウィルス玉料のメンバーの０Ｒ ＦＩＢ産物の特性、および亜鉛フィンガー領域は、またＬＶのＯＲＦ　ＩＢ中で 見付けられる（結果は示されない）。

０ＲＦＩＡとＯＲＦ　Ｉ　Ｂとは、ポリメラーゼウィルスをコード化し、したが って非構造性ウィルス蛋白質をコード化するために考えられ、０ＲＦ２〜７は非 構造性ウィルス蛋白質をコード化すると信じられる。

０ＲＦ２〜６の産物は、すべて蛋白質を構成する膜を想像する特性を示す、０Ｒ Ｆ２では、２つの予言されたＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含んだ２４９アミ ノ酸の蛋白質をコード化する（表９）、疎水性の配列のＮ一端末において、その 配列は、いわゆるシグナル配列の機能をし、同定される。Ｃ一端末は疎水配列の 端末を形成し、この場合に貫層領域として機能をし、ウィルスを含む膜中にＯＲ Ｆで産物を固くつなぎ止める。

０ＲＦ３は、ヌクレオチド位置１２３９４で出発するＡＵＧまたはヌクレオチド 位置１２５５６で出発するＡｔＪＧで開始する。そして２６５と２１１アミノ酸 の蛋白質をそれぞれコード化する。

２６５残基の蛋白質は、７つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含む、 したがって、２１１残基の蛋白質は４つを含む（表９）、２６５残基の蛋白質の Ｎ一端末で疎水配列は同定される。

もしも０ＲＦ４の産物がヌクレオチド位置１２９３６で出発するＡＵＧで開始さ れるならば、そして疎水分析によって判断されるならば、０ＲＦ４によってコー ド化された蛋白質のトポロジーは、ＯＲＦ　２によってコード化されたそれに類 似である。しかし０ＲＦ４は、また配列中でそれぞれ１２９８１と１３０６８の 位置で出発する他のＡＵＧコードで開始し得る（図１と図２との比較）。

現在までどの出発コードが用いられるのかは明白でない、用いられる出発コード によって、０ＲＦ４は、４つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含む１ ８３アミノ酸、４つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含む１６８アミ ノ酸または３つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含む１３９アミノ酸 の蛋白質をコード化できる（表９）。

０ＲＦ５は、２つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を有する２０１アミ ノ酸の蛋白質をコード化するために予言される（表９）、０ＲＰ５産物の特性は 、アミノ酸１０８〜アミノ酸１３２閏の疎水配列の内部にある。

セグメントを測る膜と０ＲＦ６の産物の疎水性のための分析は、その配列のＮ一 端末９０アミノ酸でセグメントを測る３つの貫層を含むことを示す、この注目す べき特性は、またいくつかのコロナウィルス類すなわち伝染性気管支炎ウィルス （Ｉ　Ｂ　Ｖ　；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、＋９８４）とマウス肝炎 ウィルス（Ｍ　ＨＶ　；Ｒｏｔｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）の小さく包 まれた糖蛋白質のＭまたはＥｌの特質である。

０ＲＦ６によってコード化された蛋白質は、コロナウィルス類のＭまたはＥｌの それにトポロジー類似の膜を有する（Ｒｏｔｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９＋１ ６）、　ＭまたはＥ１蛋白質の第２の特性は、推定された第３の貫層領域に、た しかに近似して位置するいわゆる螺旋である。コロナウィルス類中で非常によく 保存された約２５のアミノ酸のこの配列は、ＬＶ中でより多く退化しているが認 められる。また我々は、コロナウィルスＭまたはＥ１蛋白質のような機能を有す る類似の膜を有するＬＶ　０ＲＦ６の産物を予言している。さらに０ＲＦ６によ ってコード化された蛋白質は、ＬＶのＶ　ｐ　Ｘ　（Ｇｏｄｅｎｙｅｔ　ａｌ、 、１９９０＞と非常によく似た特性（５３％の一致したアミノ酸）を示す。

０ＲＦ７によってコード化された蛋白質は、ＬＤＶのＶｐｌより長い１３個アミ ノ酸がある１２８個のアミノ酸残基（表９）を有する（Ｇｏｄｅｎｙ　ｅｔａｌ 、　、　ｌ９９０）、すでに重要な類似物（４３％の一致し、たアミノ酸）は、 ０ＲＦ７とＶｐｌとによってコード化された蛋白質の間で観測された。Ｏ，ＲＦ ７とＶｐｌとの生産物の間のもう１つの共有された特性は、蛋白質のＮ一端末の 半分の中にアルカリ残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ　および旧Ｓ）の高濃度があることで ある。アミノ酸５５までにＬＶ配列はＡｒｇ。

ＬｙｓおよびＨｉｓの２６％を含む、この発見は、０ＲＦ７の生産物またはＶｐ ｌの提案された機能すなわちウィルスゲノムＲＮＡの色層で一致して満たされて いる（　Ｇｏｄｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９９０　）　、上述のデータに基 づいて、我々はウィルスのヌクレオキャグシド蛋白質ＮであるＬＶ　０ＲＦ７生 産物を提案する。

ＬＶゲノムの組織の図表による表現は、図２で示される。ＬＶの配列を決定する ために用いられる重複したクローンのマツプは、最上段のパネルで示される。Ｌ Ｖのヌクレオチド配列の５′と３′との端末を示すこのマツプの直線状マツプは 、図１の中で示され、キロベースでの分割を含み、Ｃ−ＤＮＡのマツプの下部に 示され、配列中のこれらのクローンの位置決めをする。ＬＶゲノム中で同定され たＯＲＦの位置は、ＬＶ配列の直線状マツプの下部を示す、パネル最低部は、サ ブゲノムｍ−ＲＮＡの巣状セットを示し、これらのＲＮＡの位置は、ＬＶ配列に 関係する。

コロナウィルス、トロウィルスおよび動脈留ウィルスのサブゲノムｍ−ＲＮＡの 転写戦略に従って、ＯＲＦ　１〜６はそれらのゲノムまたはｍ−ＲＮＡの特異な ５′端末から転写される。ｍ−ＲＮＡのこの特異な部分は、線中で次にあるより 高い分子量のＲＮＡがち、より低い分子量のＲＮＡが差し引かれるときに、得ら れるＲＮＡのその部分であるべきと考えられる。ＲＮＡ７は、他のゲノムとサブ ゲノムＲＮＡのすべての３′端末を形成し、特異な領域を有していない、０ＲＦ ７は、この最小サイズのｍ−ＲＮＡがらのみ転写されると信じられている。サブ ゲノムＲＮＡの５′端末でｒリーグ配列」は、固形ボックスで示される。この配 列の長さは、約２００ベースであるが、ゲノムＲＮＡスチルの本体の溶解物の正 確な位置は、決定された。

ＭＳＤの実験的再生 ８匹の妊娠豚は、ＬＡを接種され、食欲不振と繁殖力の欠如のようなＭＳＤの臨 床上の徴候がこれらの豚で表現された。接種後（ｐ、ｉ、）　４日から１０〜１ ２日の間ですべての豚は、食欲不振を示した。どの豚も体温の上昇はなかった。

２匹の豚は、９〜１０ｐ、ｉ、で青味を帯びた耳となった０表６中で出産日にお ける１匹の豚当りの生きた子豚と死んだ子豚の数が与えられる。ＬＡは、生まれ た子豚の１３匹から単離された。

表１７−ルド試料のウィルス単離の結果Ａ、ＭＳＤ感染の疑いのある子豚の試料 場　豚の　生　いられた　＊ ＲＢ　５　２　肺、扁桃腺、脳髄　５ＸＬＡＤＶ　４　３　肺、脳髄、腎臓、胛 ’ＩＩ　３ＸＬＡＴＨ３３〜５　肺、腎臓、扁桃腺　３ＸＬＡＤＯ３１０肺、扁 桃腺　２ＸＬＡ ＺＡ４１　肺、扁桃腺　３ＸＬＡ ＶＥ　１　？　唾液　１ｘＰＥＶ２ −一肚−２０１６Ｘ　ＬＡ　Ｉ　Ｘ　ＰＥＶ２Ｂ、ＭＳＤ感染の疑いのある雌豚 の試料１豚４」枚重−」見ｑ或鴛１−−藍」Ｌ−ｍ−ＴＨ２Ｍ、白血球ＩＸＬＡ ＨＵ　５　血漿、白血球　２ｘＬＡ、　ＩＸＥＭＣＶＴＳ　１０　血漿、白血球 　６ＸＬ＾ ＨＫ　５　血漿、白血球　２ＸＬＡ ＬＡ　６　血漿、白血球　２ＸＬ＾ ＶＬ　６　血清、白血球　５ＸＬＡ ＴＡ　１５　血清　ＪＩＸＬＡ ＬＯ４血漿、白血球　２ＸＬ＾ ＪＡ　Ｓ　血漿、白血球　＋ＩＸＬＡ ＶＤ　ｌ　血漿、白血球　ＩＸＬＡ ｖｗ　１　血清　ＩＸＬ＾ −上−Δロー　４堕呈」ヱ暉Ｌ ＊結果は、単離ができた豚の数として与えられる。単離は豚１匹あたりの１試料 より多く検出されたこともある。

ＬＡ；レリスタドエイジエンド ＰＥＶ２　、豚腸内ウィルス２型 ＥＭＣＶ、脳内心筋炎ウイルス 表２　実験室的に感染された豚試料のウィルス単離の結果雌豚−一一旦旦旦鰺勲 」ＮφもなＵ−一−−−荀ＬＪ！−−−−−。

Ａ（ＬＯ）＃　Ｃ８３５肺、扁桃腺　２ｘｌ＾Ｃ８３６鼻水　２ＸＰＥＶ７ ０８３７　鼻水 Ｂ　（ＪＡ）　Ｃ８２５肺、扁桃腺 Ｃ８２１鼻水　１ｘＰＥＶ？ Ｃ８２３鼻水４×ＰＥＶ７ ｃ　（ＪＡ）　Ｃ８３３肺、扁桃腺　ＩＸＬＡ、　１×ＰＥＶ７Ｃ８３２鼻水　 ２ＸＰＥＶ Ｃ８２９鼻水、血漿、白血球　３Ｘ１．Ａ、　２ｘＰＥＶ７Ｄ（ＶＤ）　Ｃ８１ ６肺、扁桃腺 Ｃ８１３鼻水　Ｉ　ＸＬＡ Ｃ８１５鼻水　ＩＸＰ［１Ｖ７ −フーーーーーーーーーーー計−−−−−−（韮膨秘めり単基、Ｌ」伏配−１上 匹Ｖ７−Ａ　ｂ８０９　鼻水 ｂ８］７　鼻水 Ｂ　ｂ８１．８　鼻水、血漿、白血球　ＩＸＬＡｂ８２０　鼻水 Ｃｂ８２２　鼻水 ｂ８２６　鼻水 Ｄ　ｂ８３０　鼻水　１×Ｌ＾ ｂ８３４　鼻水 一−−−−−−２−−−−−１−−−−−羨ｍ煕−ら一＠仰１県−−−−※ＳＰ Ｆ豚は、ＭＳＤに感染している疑いのある雌豚と接触を保つ（Ｃ）か、実験場の ０日で筋肉内にＭＳＤに感染している疑いのある雌豚のＥＤＴＡ血液１０ｍ１を 接種した（ｂ）、１匹の雌豚と３匹の５ＰＦ１＠（ｃ）とのグループは、１つの 囲いの中に保持され、これらのグループの４匹の豚は１つの小屋で飼育された。

６日たってグループ中のＳＰＦ豚の１匹が殺され、扁桃腺と肺とがウィルスの単 離に用いられた。血液を接種されたＳＰＦ豚（ｂ）の４つのグループは、４つの 他の囲いの中の隔った小屋で飼育された。ＳＰＦ豚の鼻水は、実験の２．５．７ および９日に採取され、血漿と白血球からのウィルス単離のために、ＥＤＴＡ血 液は豚が発熱したときに採取された８傘結果は、豚４匹あたりの単離数どして与 えられる。

ＬＡ：レリスタドエイジェント ＰＥＷ７　：豚腸内ウィルス７型 ＃：１つの層の中では、メス豚の出所の養豚場の頭文字が１ノ〜えられる。

表３　単膠ウィルスの同定 細胞培養　ＣｓＣ１中の１）龍の粒子２＋　クロロホルム３′　抵抗処理された ４１ゴ１燵Ｕ道性比重−径Ａ旦恵り一仁対丈ゑ吠欧１１舛和り舅真り養豚場ＨＵ ＰＫ−１５，ＰＥ２．３に６　１４３ｇ／■Ｉ　２１１〜３０　なし　ＥＭＣＶ （１２１１０＞（匪の団結り一　−−一一一−−□−□養豚堝ＶＥ ＳＫ６子豚の　ＮＤ　２１１〜３０　なし　ＰＥＷ２　（＞＋２８０）」１Ｌ− −一□−−−−−−−−−−−−−−−−ＳＰＦ豚ＣＶＩ ＰＫ−１５，ＰＥ２．Ｓ罠６ＮＤ２８〜３０　なし　ＰＥＷ７（＞１２１１０） 工鼻本、１−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一一一−−−−一種々 な試料 種々な養豚場　１゜１９ｇ／ｌ　多変態　あり　なしく〈５）」杵ケ閘ψワーε −−−−−−−−−−−一。−□−−−１）ＰＢＳ中でＣｓＣｌの前もって作ら れた直線状勾配における浮遊比重は、基準の技術に従って決められる（Ｂｒａｋ ｋｅ　；　１９６７）　、与えられたものは、伝染性のピークを見付ける比重で ある。

２）研究下で感染されまたは感染されない細胞培養の単Ｉ物は、凍結−融解処理 された。溶菌液は、３０分閏１３０，０ＯＯＧで遠心分離され、ソノ結果生じた ペレットは、基準技術（Ｂｒｅｎｎｅｒ　ａｎｄ　Ｂｏｒｎｅ；１９５９）に従 ってマイナス感染され、Ｐｈ１ｌｉｐｓ　ＣＭ　１０電子顕微鏡で研究された。

与えられたものは感染培養器に存在し、非感染培養器には存在しない粒子の大き さである。

３）クロロホルムに対する鋭敏性は、基準技術（Ｇｒｉｇｔ、Ｒｏｓｓ　ａｎｄ 　Ｂｅ１１．１９７４）に従って決定された。

４）単離物の１００〜３ＱＱ　ＴＣＩＤ％。は、特異抗血清の種々な稀釈物で混 合され、完全ＣＰＥが観測されるまで適当な細胞システム中で培養される。５以 上の力価を６つ血清は再テストされ、高し＼力価でＣＰＥを妨害する血清は、単 離のために特別であると考えられるやクロロホルムに鋭敏でない単離物は、豚腸 内ウィルス（ＰＥＷ）１−１０に対して（ｃｏｕｒｔｅｓｙ口ｒ　、Ｋｔｉｏｗ ｌｅｓ　ｊ’ｉｒｂｒｉｇｈｔ　、υＫ）、脳内心筋ウィルスに対して（ＥＭＣ Ｖ　；　ｃｏｕｒｔｅｓｙ　Ｄｒ、Ａｈｌ、Ｔｊｉｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ ｙ）　、豚バルボウイルスに対して、および豚肺胞病に対して特別に処理された 血清でテストされる。

クロロホルムに対して鋭敏な単離物〈コード、ＣＤＩ−ＮＬ−２，９１）は、疑 似狂犬病ウィルス、１型牛ヘルペスウイルス、千型牛ベルベルウィルス４、悪性 カタル性ウィルス、牛ウィルス性下痢ウィルス、豚コレラウィルス、豚インフル エンザウィルスＨＩＮ１．豚インフルエンザウィルス８３Ｎ２．３型バラインフ ルエンザ３ウイルス、牛呼吸器シンシティアルウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス 、豚流行性下痢ウィルス、血球醍集性脳炎ウィルス、感染性気管支炎ウィルス、 牛白血病ウィルス、鳥白血病ウィルスおよびメデイビイスナウイルスに対して特 別に処理された抗血清ならびにＳＰＦ豚から得られた実験室的血清でテストされ たく表５を見よ）。

表４ Ｍ５Ｄを有すると疑わしいメス豚から採取された対の野生豚の血清の血清学的結 果、血清は、病気の激しい状態中またはその３〜９週問後に採取された。結果は 、４倍またはそれ以上の力価を示す雌豚の数／テストされた全雌豚の数で与えら れる。

ＲＢ　５　０／１３　１／１３　０／１３　１／９　０／７　Ｇ／６　０／９ｎ ｕ　４　０１５　０１５　３１５　０１５　０１５　０１５　０１５ＴＳ　３　 １／１０　０／１０　０／１０　０／１０　０／１０　０／４　０／１０ＶＬ　 ３　０１５　０１５　０１５　０１５　１１５　０１５　０１５Ｊ＾　３　０／ １１　１／１１　３／ＩＩ　Ｏ／１１　２／ｌｌ　Ｏ／１１．　０／ｌ１１１Ｅ 　４　ｌ／６　１／６　１／６　３／７　３／７　Ｇ／７　０／７Ｇｌ　４　０ ／４　１／４　０／４　０／４　０／４　０／４　０／４ＳＥ　５　０／ｇ　Ｏ ／８　０／８　０／８　０／６　０／３　０／８ＫＡ　５　０／１　０／Ｉ　Ｏ ／Ｉ　Ｏ／ｌ　Ｏ／Ｉ　ＮＤ　Ｏ／１ＮＹ　４　０１５　１１５　１１５　０／ ３　０／４　０／２　０／４ＪＮ　３　０／１０　５／＋０　０／１０　０／Ｉ ｎ　＋／＋０　０／１０　０／１０ＫＯ’　３　１／＋０　０／＋０　０／１０ 　０／１０　２／＋０　０／＋０　０／１００Ｒ９ＮＤ　ＨＤ　ＮＯＯ／６　０ ／６　０／６　０／６ＬＯ６ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／３　０／３　０／２　０／ ３胃［４ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／Ｉ　ｌ／１．　０／１　０／３ＲＲ３ＮＤ　Ｎ Ｄ　ＮＤ　ｌ／１１　０１８　０／＋１　０／１ｌＲＹ　４　ＮＯＮＯＮＤ　Ｏ ／３　０／４　０／３　０／４ＢＥ　５　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／１０　０／＋ ０　０／１０　０／１０Ｂ１　３　ＮＤ　ＮＯＮＤ　ｌ／６　０／６　０／６　 ０／６ＫＲ３ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ｌ／４　０／４　０／４　Ｑ／４ＫＷ　５　Ｎ Ｄ　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／１０　０／ｌｏ　Ｏ／１０　０／１０ＶＲ５ＮＤ　ＮＤ　 ＮＤ　ｌ／６　０／６　０／６　０／６ＨＵ　４　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　］ｌ／４ ０／３　０／３　０／４ＭＥ　３　ＮＤ　ＮＤ　ＮＯＯ１５１１５０１５０１５ 計（陰性）”　＋９　４１　２９　９７　１６　１４０　１６５計（陽性）ｐ７ ７　４８　６２　５５　１３１　１　０計（血清変成）ゝ　４　１０　９　９　 １＋　０　０−−ｌ−タトム−１００９１００１６１１５１１１４１６５血清は 、血球凝集性脳炎ウィルス（ＲＥＶ）　、豚インフルエンザウィルスＨＩＮＩお よび同Ｈ３Ｎ２に対する抗体の検出のために、血球凝集抑制（ＨＡＩ）法が用い られ、疑似狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）　、豚パルボウイルス（ＰＰＶ）　、牛ウ ィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）　、および雌豚コレラウィルス（ＨＣＶ）に 対する抗体の検出のために酸素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が用 いられた。

表４−続き ＴＨ３０／６　０／６　０１５　０１５　０／６　０１５　０／６　６／６１１ Ｂ　５　１／７　１／９　０／６　２／６　１／８　０／６　０／１３　７／９ ＨＵ　４　Ｎ口　０１５　０１５　０１５　ＮＤ　Ｏ１５０１５５１５ＴＳ　３ 　０／１０　０／１０　０／７　０／４　０／＋０　０／７　ＮＯ１０／１０Ｖ Ｌ　３　ＮＤ　ＮＤ　＋１５　０１５　ＮＤ　Ｏ１５ＮＤ　５１５Ｊ＾　３　０ ／１１　０／ＩＩ　Ｏ／１１　０／Ｉ！　１／１１　２／ＩＩ　Ｏ１５１１／１ １胃Ｅ　４　１／７　１／６　ｌ／６　１／７　１／７　１／７　０／７　７／ ７ａＩ４　０／４　０／４　０／４　０／４　０／４　０／４　０／４　４／４ ＳＥ　５　０／＋１　０／ｌｔ　Ｏ／６　１／１１　０／＋１　１１５　０７８ 　６／＋１にＡ　５　０／Ｉ　Ｏ／１　Ｇ／Ｉ　Ｏ／Ｉ　Ｏ／１　０／ｌ　Ｏ／ １　０／１ＮＹ　４　０／４　０／４　０／２　０／２　０／４　０／３　０／ ４　４／４ＪＮ　３　０／＋０　０／＋０　１／１０　０／９　０／１０　０／ ！ＯＯ／１０　５／１０ＫＯゞ　３　０／１０　０／＋０　２／１０　２／１０ 　１／１０　３／１０　ＮＤ　８／１００Ｅ　９　０／６　０／６　１／６　１ １５　ＮＤ　ｌ／６　ＮＤ　４／６１．０　６　０／３　０／３　０／３　０／ ３　０／３　０／３　ＮＤ　３／３ＩＩ　４　ＮＤ　ＮＯＯ／１’　０／Ｉ　Ｎ Ｄ　Ｏ／ｌ　ＮＤ　Ｏ／３ＲＲ３０／８　１／８　０／１１　０／８　０／８　 ０７８　ＮＤ　８／８ＲＹ　４　０／４　ＮＤ　Ｏ／４　０／Ｉ　ＮＤ　ｌ／４ 　ＮＤ　ｌ／４ＢＥ　５　ＮＤ　ＮＯＯ／１０　０／１０　ＮＤ　ｌ／１０　Ｎ Ｄ　Ｏ／１０Ｂｌｌ　３　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／６　０／６　ＮＯＯ／６　ＮＤ　６ ／６ＫＲ３ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／４　０／４　ＮＤ　Ｏ／４　ＮＤ　ｌ／４Ｋｌｌ　 ５　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／１０　０／ＩＯＮＤ　ｌ／１０　ＮＤ　１０／１０Ｖ［Ｉ 　５　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／６　１／６　ＮＤ　Ｏ／６　Ｎ［ｌ　６／６ＨＵ　４　 ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／３　０／４　ＮＤ　Ｏ／３　ＮＤ　３／４にＥ　３　ＮＤ　Ｎ Ｄ　Ｏ１５０１５ＮＤ　Ｏ１５ＮＤ　２１５計（陰性）″　１５　２９　０　０ 　２　１　６９　１５計（陽性）’　ｔｉｌｌ　７４　１４４　１３ｇ　９０　 ＋３６　０　２７計く血清変成）”２　３　６　８　４　１０　０１２３テスト ム　１０５　１０７　１５０　＋４６　９６　１４７　６９　１６５血清は、脳 内心筋ウィルス（ＥＭＣＶ）　、単離された（ｉ）ＥＭＣＶ、（ＥＭＣＶｉ）　 、豚腸内ウィルス２（ｐＥＶ２＞、同７　（ＰＲＶ７）、単離されたＲＥＶ　（ ＰＥＶｉ）およびレリスタドエイジエンド（ＬＡ）に対して処理された抗体の中 和の検出のために、血清中和法（ＳＮＴ）が用いられ、またレリスタドエイジエ ンド（ＬＡ）に対し処理された抗体の検出のために免疫パーオキシダーゼ単層検 定法（ＩＰＭＡ）が用いられた。

ｆは肥育豚を、ｉは第１と第２の血清の採取間隔を、ｎは第１血清が本研究のテ ストで陰性であり、第２血清がまた陰性であるが力価が４倍以下を示す豚の全数 を、ｐは第１血清が陽性で第２血清が力価で４倍以下を示す豚の全数を、Ｓは第 ２血清が本研究のテストで第１血清よりも４倍以上高い力価を有する豚の全数を それぞれ示す、ＮＤは検出されないものである。

表５ ＩＰＭＡによって測定されたレリスタドエイジエンドに対して処理された抗体の 展開 Ａ、接触豚 ｃ８３７　０　１０　６４０　６４０　６４０ｃ８１５　０　１６０　６４０　 ６４０　６４０Ｂ、血液を接種された豚 ｂ８１７　０　１６０　６４０　６４０　６４０ｂ８１８　０　１６０　６４０ 　６４０　６４０ｂ８２０　０　１６０　６４０　６４０　６４０ｂ８２２　０ 　６４０　２５６０　２５６０　１０２４０ｂ８２６　０　６４０　６４０　６ ４０　１０２４０ｂ８３０　０　６４０　６４０　６４０　２５６０ｂ８３４　 ０　１６０　６４０　２５６０　６４０実駿の記述は表２を見よ。すべての豚は 、一定の間隔で採血され、すべての血清は、ＬＡに対して処理された抗体の検出 のためにＩＰＭＡでテス）−された。

表６ Ｍ２Ｃの実験室的再生 １、　）　’Ｌ、Ａは、肺、肝臓、胛臓、腎ＩＩまたは腹水から単離される。

２１Ａに対して処理された抗体は２子豚が吸乳する前に採取された血清試料中に 検出されるか、死産子豚の腹水中から検出された。

オランダ（ＮＬＩとＮ１−５２）、ドイツ（ＧＥｌとＧＥ２）およびアメリカ合 衆国（ＵＳＩ、ＵＳ２とＵＳ３）で単離されたＬＡでテストされたヨーロｌパと 北米からのフィールド血清のＩＰＭＡ中における反応性ＥＡ−２９７５４，０３ ，５３，０３，０２，０−−ＲＲ−２２１，５−２，０２，５２，５３，５−表 ８ オランダ（ＮＬＩとＮｌ２）、ドイツ（ＧＥＬとＧＥ２）およびアメリカ合衆国 （ＴＪＳｌ、ＵＳ２とｔＪｓ３）で単離されたＬＡでテストされたＬＡと５ＩＲ ３Ｖとに対して有効な実験室的血清のＩＰＭＡ中における反応性 ２ｇｄｐｉ　３．５　３．５　３．０　３．５　−　２．５　２．０２Ｂ　２Ｑ ｄｐｉ　−−−−２，０２，０−３６ｄｐｉ　−−−−１，５２，０− ６３ｃｌｐｉ　−−−−１，０１，０−９Ｇ　３０ｄｐｔ　−−−−２，５３， ０〜４４ｄｐｉ　−−−−２，５３，５− ６８ｄｐｉ　−−−−２，０３，５１，５１６１１２５ｄｐｉ　−−−−２，０ ３，０−４０６ｐｉ　−−−−２，０３，０− ６４ｄｐｉ　−−−−２゜５　２．５　１．５１６Ｙ　３６ｄｐｉ　−−−−１ ，０３，０１，０−一一一一方Ａｌ１Ｐｉ−−−−−−−、ニ−−−一−−二− −、−−−−二一−−一−−−二−−２，＋計７−−−１４更−−−−−−−| ｔ−負対数で表現される力優：−一一陰性表９　レリスタドウイルスのＯＲＦ特 性ＯＲＦ　ヌクレオチド　アミノ酸　非修正蛋白質の　糖鎖形成（最初−最後） 　番号　された　きさ　の０ＲＰＩ＾　２１２−７３９９　２３９６　２６０． ０　３０ＲＦＩＢ　７３１１４−１１７７７２　１４６３　１６１．ｇ　３０Ｒ Ｆ２　１！７１１６−１２５３２　２４９　２８．４　２０１Ｆ３　１２３９４ −１３１８８　２６５　３０．６　７１２５５６−１３１８１１　２１１　２４ ．５　４０ＲＦ４　１２９３６−１３４１１４　１８３　２０．０　４１２９１ １１−１３４８４　１６８　１８．４　４１３０６１１−１３４１１４　１３９ 　１５．４　３０ＲＦ５　１３４１１４−１４０８６　２０１　２２．４　．２ ０ＲＦ６　１４０７７−１４５９５　１７３　１８．９　２０ＲＦ７　１４５１ １１１−１４９７１　１２８　１１８　１参考文献 Ｂｏｅｒ、　Ｇ、Ｆ、　ｄｅ、　Ｂａｃｋ、　Ｉｌ、、　ａｎｄ　０ｓｔｅｒｈ ａｕｓ、　Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｅ、、　（１９９０）Ａｎ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　１ｎｆｌｕｅ ｎｚａ　Ａｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｈ＋ｎ５ａｎ　ａｎｄ　ｖａｒ ｉｏｕｓ　ａｎｉｍａｌ　５ｐｅｃｉｅｓ、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ。

１１５、４７−６１゜ Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ、　Ｍ、Ｒ，Ｇ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｔ、Ｄ、に、、　ａｎ ｄ　Ｂ１ｎｎ５．　ｉｌ、ｌ１１．、　（１９８４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ａｖｉａｎ 　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ＩＢu。

Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、　１．３０３−３１４゜Ｂｏｕｒｓｎｅｌ、Ｉ、　ｉｌ、 Ｅ、Ｇ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｔ、Ｄ、に、、　Ｆｏｕｌｄｓ、　ＩＪ、、　Ｇｒ ｅｅｎ、　Ｐ、Ｐ、。

Ｔｏｍｌｅｙ　Ｆｉｌ、、　ａｎｄ　Ｂ１ｎｎ５．１１．Ｍ、、　（１９ｇ？） 　Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅ ｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ａｖｉａｎ　１ｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ　ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓｖｉｒｕｓ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　ｖｉｒｏｌ、 　６８．５７−７７゜Ｂｒａｋｋｅ、　Ｍ、に、、　（１９６７）　Ｌｏ：　１ ｌｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌｕｍｅ　ＩＩ、　ｐｐ。

９３−１１７　（Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙに、　ｌｌａｒａｍｏｒｏｓｃｈ　ａｎｄ 　［１，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ、　ＰＪ、、　Ｐａｃｈｕｋ、　Ｃ，Ｊ、、　Ｎｏｔｅｎ 、　Ｊ、Ｆ、Ｈ，、Ｃｈａｒｉｔｙ、　Ｊ、。

Ｌｕｙｔｊｅｓ、　１１．、　ｌ１ｅｉｓｓ、　Ｓ、Ｒ，、ａｎｄ　５ｐａａｎ 、　１１．Ｊ、１１．、　（１９９０）　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍ≠窒■ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｃｏ ｎｄ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓ ｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ＭＨＶ−Ａ５９．　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ｇ。

Ｂ２５−１１１３２゜ Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｈｏｒｎｅ、Ｒ，１１，、（＋９５９）　Ａ　 ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓ ｏｌｕｔｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ ｅｓ。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　３４．１０３ −１１０゜Ｂｒ１ｎｔｏｎ−Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｐｌａ、ｇｅｗａ ｎｎ、Ｐ、Ｇ、、（１９７５）　５ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ −ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　１ａｃｔａｔｅ 　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｉ ｔｓ　ＲＮＡ、　Ｊ、　ＶｉｒｏＬ　１６．４２０−４３３゜Ｆａｖａｌｏｒｏ 、　Ｊ、、　Ｔｒｅｉｓｍａｎ、　Ｒ，＆　Ｋａｍｅｎ、　Ｒ，、（１９８０） 　Ｉｎ：　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、６５．７１ ８−７４９　（ｅｄｓ、　Ｇｒｏｓｓｓａｎ、　Ｌ、　＆　ｌ！ｏｌｄａｖｅ、 　Ｋ。

）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｇｏｄｅｎｙ、　Ｅ、に、、　５ｐｅｉｃｈｅｒ、　０．１１．、　ａｎｄ　Ｂ ｒ１ｎｔｏｎ、　Ｉｌ、Ａ、、　（１９９０）　ｋ［ａｐｌｏｃａｔ、ｉｏｎ　 ｏｆ　Ｉａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ　ｖ ｉｒｕｓ　（ＬＤＶ）　ｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｖｐｌ）　ｇｅｎｅ、 　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１７７、７６８−７７１゜Ｇｒｉｓｔ、　Ｎ、Ｒ，、Ｒ ｏｓｓ、　Ｃ，Ａ、、　ａｎｄ　Ｂｅ１ｌ、　Ｅ、Ｊ、、　（１９７４＞　Ｉｎ ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ、Ｐ、１２０，０ｘｆｏｒｄ。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｇｔｉｂｌｅｒ、Ｕ、、ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、、（１９１１３）　 Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｖｅｒｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ ｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｃＤＮＡ　Ｈｂｒａｒｉｅｓ、　Ｇｅｎｅ　２５． ２６３−２６９゜Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、、　（１９１ｔ５）　Ｉｎ＋　ＤＮＡ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｉ；　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

Ｃｈａｐｔｅｒ　６．　＋０９−１３５゜Ｈｉｌｌ、　Ｈ，、（１９９０）　Ｏ ｖｅｒｖｉｅｗ　ａｎｄ　Ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ　（Ｓｗｉｎｅ　Ｔｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏ ｒｙ　５ｙｎｄｒｏｓｅ）、　Ｉｎ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ■■ ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｍ＋１ｉｔ ｔｅｅ　Ｉｌｅｅｔｉｎｇ、０ｃｔｏｂｅｒ　６．　１９９O゜ Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ、Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ　Ｃｏｎ５ｅｒｖａｔ ｉｏｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｉ［ａｄｉｓｏｎ　Ｍｌ。

ｔｌｓＡ。

［１ｉｒｓｃｈ、　Ｊ、Ｇ、　＆　Ｆｅｄｏｒｋｏ、　ｉｌ、Ｅ、、　（１９６ ｇ）　［ＩＩｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｉｍｕｌｔａｎｏｕｓ　ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｇｌ ｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ａｎｄｏｓｌＩｉｕｍｔｅｔｒｏｘｉｄｅ　ａｎｄ 　ｐｏｓｔｆｉｘａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ、　Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３ｇ、　６１５゜Ｈｏｒｚｉ ｎｅｋ、　Ｍ、Ｃ，、Ｍａｅｓｓ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｌａｕｆｓ、　Ｒ，、（ １９７１）　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎｔｈｅ　５ｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　 ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ　Ｉｌ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｑｕｉｎｅ　ａ ｒｔｅｒｉｔｉ刀B ｒｕｂｅｌｌａ、　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｊｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ａｎｄ　ｈ ｏｇ　ｃｈｏｌｅｒａ　ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ａｒｃｈ。

Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　３３．３０６−３１８゜Ｈｙｌｌ ｓｅｔｈ、　Ｂ、、　（＋９７３）　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ 　ｏｆ　ｅｑｕｉｎｅ　ａｒｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ、　Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓ ａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　４０．１７７−１８８゜Ｋａｓｚａ、　 Ｌ、、　５ｈａｄｄｕｃｋ、　Ｊ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｉｎｉ ｓ、　Ｇ、Ｊ、、　（１９７２）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ、　ｖｉｒａｌ　 ５ｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｓｔ奄モ■ ｏｆ　ａ　５ｗ１ｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　Ｓに−６，Ｒｅｓ 、　Ｖｅｔ、　Ｓｃｉ、　１３．４６−５１゜Ｌｏｕｌａ、　Ｔ、、　（１９９ ０）　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＰｒｅｓｅｒＵｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｓｔｅｒｙ 　ＰｔｇＤｉｓｅａｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｈｅｒｄ　ａｎｄ 　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｐｉｇｌｅｔｓ、　Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　１ｌｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅ ｅ　Ｍｅｅｔｉｎｇ。

０ｃｔｏｂｅｒ　６．１９９０．　Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ、　Ｌｉ ｖｅｓｔｏｃｋ　Ｃｏｎ５ｅｒｖａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｍａｄｉｓ ｏｎ　ＩＩＩ、　ＵＳＡ。

１１ａｓｕｒｅｌ、　Ｎ、、　（１９７６＞　５ｗ１ｎｅ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ 　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｙｃｌｉｎｇｏｆ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ 　Ａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｍａｎ、　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｆ、　２４４−２４ ７゜Ｍａｚａｎｃｏｕｒｔ、Ａ、ｄｅ、Ｗａｘｈａｍ、１１．Ｎ、、Ｎ１ｃｈｏ ｌａｓ、Ｊ、Ｃ，、＆　ｌ１ｏｌｉｎｓｋｙ。

Ｊ、Ｓ、、（１９ｆｔ６）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｔｈ ｅ　ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉ ｎ　１ｎｆａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｇｅｎｆｔａｌ　ｒｕｂｅｌｌ ａ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｊ、）ｌｅｄB Ｖｉｒｏｌ、　１９．１１１−１２２゜１１ｅｎｇｅｌｉｎｇ、Ｗ、Ｌ、、ａｎ ｄ　Ｌａｇｅｒ、Ｋ、）１．、（１９９０）　菖ｙｓｔｅｒｙ　ＰｉｇＤｉｓｅ Ｌ５ｅ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ 　ｉｔｓ　ｅｔｉｏｌｏｇｙ、　Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　１ｌｌｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　Ｍ ｅｅｔｉｎｇ。

０ｃｔｏｂｅｒ　６．１９９０．　Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ、　Ｌｔ ｖｅｓｔｏｃｋ　ＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｄｉｓｏ ｎ　ＩＩＩ、ＵＳＡ。

Ｍｏｏｒｍａｎｎ、　ＲＪ、）１．、　ａｎｄ　［Ｉｕｌｓｔ、　ＬＬ、　（１ ９８ｇ）　）ｌｏｇ　ｃｈｏｌｅｒａ　ｖｉｒｕｓ：１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｉｒａｌ 　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｚｅｄ　ｉｎ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　５ｗ１ｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ、　 ＶｉｒｕｓＲｅｓ、　１１．２８１−２９１゜ Ｍｏｏｒｍａｎｎ、　ＲＪ、Ｍ、、　ＩＩａｒ層ｅｒｄａｍ、　Ｐ、ＡＪｌ、、 　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ、　Ｂ、。

５ｃｈａａｐｅｒ、１１．ＬＬ、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｈｕｌｓ ｔ、Ｍ、１１．、（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　 ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｏｇｃｈｏｌｅｒａ　ｖｉ ｒｕｓｓｔｒａｉｎ　Ｂｒｅｓｃｉａ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎ＠　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ　ｅｎｃｏｄｉｎｇｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｅｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１７７、１８４−１９８゜０４ｒｓｃ ｈｏｔ、　Ｊ、Ｔ、　ｖａｎ、　）Ｉｏｕｗｅｒｓ、　Ｄ、Ｊ、、　Ｒｚｉｈａ 、　１１．Ｊ、、　ａｎｄ　１ｌｏｏｎｅｎ。

ＰＪ、ＬＪｌ、、　（１９８８）　Ｄｅｖｅｌｏｐｓｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ＥＬ ＩＳＡ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｇｌ ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ　ｏｆ　Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖ ｔｒｕｓ：　ａｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉ ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ａｎｄｖａ ｃｃｉｎａｔｅｄ　ｐｉｇｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　２２．１９ １−２０６゜Ｐｅａｒｓｏｎ、　！１．１１．．　ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ 、Ｊ、、　（１９８８）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５゜２４４４〜２４４８゜ Ｒｅｅｄ、　ＬＪ、、　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈ、　Ｈ，、（１９３８＞　Ａ　ｓ ｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ　ｆｉｆｔｙ　ｐｅｒｃ ｅｎｔ　ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ、　Ａｔ　Ｊ、　Ｈｙｇ、　２７．４９３−４９７ ゜Ｒｏｔｔｉｅｒ、　ＰＪ、Ｍ、、　ｌｌｅｌｌｉｎｇ、　Ｇ、Ｉｌ、、　ｌｌ ｅｌｌｉｎｇ−１１ｅｓｔｅｒ、　Ｓ、。

Ｎ１ｅｓｔｅｒｓ、　Ｈ，Ｇ、Ｍ、、　Ｌｅｎｓｔｒａ、　Ｊ、Ｍ、、　ａｎｄ 　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｚｅｉｊｓｔ、　Ｂ、ＡＪ、。

（１９８６）　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｏｐｏｌｏｇｙ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ戟B Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５．１３３５−１３３９゜Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　 Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　！：、Ｆ、、　ａｎｄ　１ｌａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、、　（１９ｇ９）１［ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ A。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ。

５ｅｔｈｎａ、　Ｐ、Ｂ、、　Ｈｕｎｇ、　Ｓ−Ｌ、、　ａｎｄ　Ｂｒ１ａｏ、 　Ｄ、Ａ、、　（１９８９）Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ　 ｍ１ｎｕｓ−ｓｔｒａｎｄ　ＲＮＡ５　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　 ｆｏｒｍＲＮＡ　ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．５６２６−５６３０゜５ｅｔｚｅｒ、　Ｄ、Ｒ， 、ＩｌｃＧｒｏｇａｎ、　Ｍ、、　Ｎｕｏｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｈ，＆　Ｓｃｈｉｍ ｋｅ、　Ｒ，Ｔ、。

（１９８０）　５ｉｚｅ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　３’　 −ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｍ ｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ’ｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｃｅｌｌｓ、Ｃｅ１ｌ　２ ２．　３６１−３７０゜５ｎｉｊｄｅｒ、　Ｅ、Ｊ、、　ｄｅｎ　Ｂｏｏｎ、　 Ｊ、Ａ、、　Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｈｏｒｚｉｎｅｋ。

Ｍ、Ｃ，、Ｒｉｊｎｂｒａｎｄ、　Ｒ，、ａｎｄ　５ｐａａｎ、　Ｉｌ、Ｊ、１ １．、　（１９９０ａ）　Ｔｈｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐａ ｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ｂｅｒｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｌｙｍ ｅｒａｓｅ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ■■ ｂｙ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｔａ ｉｎｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆｓ　ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｌ ｘａｔ　ｔｏｒｏ−ａｎｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｒｅ　ｅｖｏｌｕ ｔｉｏｎａｒｙ　ｒｅｌａｔｅｄ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｔｇ、　４５３５−４５４２゜５ｎｉ ｊｄｅｒ、　Ｅ、Ｊ、、　Ｈｏｒｚｉｎｅｋ、　１１．ｃ、、　ａｎｄ　５ｐａ ａｎ、　Ｉｌ、Ｊ、）１．、　（１９９０ｂ）　Ａ３’　−ｃｏｔｅｒｗｉｎａ ｌ　ｎｅｓｔｅｄ　ｓｅｔ　ｏｆ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｃ ｒｉｂｅｄ　ｍｅｓｓｅｎｇｅ■ ＲＮＡｓ　ｉｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｂｅｒｎｅ　ｖｉｒｕｓ 　ｒｅｐｌｔｃａｆｔｏｎ、　Ｊ、ｖｉｒｏｌ、　６４゜３５５−３６３゜ ５ｐａａｎ、　１１．Ｊ、）１．、　Ｃａｖａｎａｇｈ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｈ ｏｒｚｉｎｅｋ、　Ｍ、Ｃ，、＜１９８８）Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ：　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ｊ、　Ｇ ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

６９、２９３９−２９５２゜ ５ｔｒａｕｓｓ、　Ｔ１．Ｍ、、　（１９８７）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍｍａ＋ｕａｌｉａｎ　ｔｉｓｓｕｅ、Ｉ ｎ：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏ七ｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉ ｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）　２．２． ｌ　Ｊｏｈｎ　１ｌｌｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｔｅｒｐｓｔｒａ、　Ｃ，、（１９７８）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｒ ｄｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　１ｎｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ａｆｆ ｅｃｔｅｄ　５ｈｅｅｐ　ａｎｄ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｂｙ　 ｉｗｎｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、　Ｒｅｓ、　Ｖｅｔ、　Ｓｃｉ、　 ２５．３５０−３５５゜Ｖｅｎａｂｌｅ、　Ｊ、Ｈ，＆　Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ 、　Ｒ，、（１９６５）　Ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　１ｅａｄｃｉｔｒａｔｅ 　５ｔａｉｎ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｉｃｒｏｓｃｏｐｙ 、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａ■ Ｂｉｏｌｏｇｙ’　２５．４０７゜ Ｖｒｉｅｓ、　Ａ、Ａ、Ｆ、　ｄｅ、　Ｃｈｉｒｎｓｉｄｅ、　Ｅ、Ｄ、、　Ｂ ｒｅｄｅｎｂｅｅｋ、　Ｐ、Ｊ、。

Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ａ、、　Ｈｏｒｚｉｎｅｋ、　Ｍ、Ｃ，、ａｎｄ 　５ｐａａｎ、　Ｉｌ、Ｊ、１１．、　（１９９０）　Ａｌ■ ｓｕｂｇＡｌ１５ｕｂ　ｍＲＮＡ５　ｏｆ　ｅｑｕｉｎｅ　ａｒｔｅｒｉｔｉｓ 　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｔａｉｎ　ａ　ｃｏｍｓｏｎｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．３２４１−３２４７゜ １１ｅｎｓｖｏｏｒｔ、　Ｇ、、　ａｎｄ　Ｔｅｒｐｓｔｒａ、　Ｃ，、（１９ ８ｇ）　Ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｏｅａ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ 　ｉｎ　ｐｉｇｌｅｔｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｗｓ　ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ　ａｇａ ｉｎｓｔｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｖａ ｃｃｉｎｅ、　Ｒｅｓ、　Ｖｅｔ、　Ｓｃｉ、　４５．１４３−１４W゜ １１ｅｎｓｖｏｏｒｔ、　Ｇ、、　Ｔｅｒｐｓｔｒａ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｂｌｏ ｅｍｒａａｄ、　Ｍ、、　（１９＄８）　Ａｎｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ、ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｍｏａｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　 ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｎ■ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｌａｓ ｓｉｃａｌ　５ｗ１ｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ、ＹｅｔB １１ｉｃｒｏｂｉｏ１．１７．１２９−１４０゜！１ｅｎｓｖｏｏｒｔ、　Ｇ、 、　Ｔｅｒｐｓｔｒａ、　Ｃ，、Ｂｏｏｎｓｔａ、　Ｊ、、　Ｂｌｏｅｗｒａａ ｄ、　Ｍ、、ａｎｄＺａａｎｅ、Ｄ、ｖａｎ、（１９８６）　Ｐｒｏｄｕｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　５ｏｎｏｃｌｏｎａ１　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔｓ ｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　１ａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、　Ｖｅｔ。

１１ｉｃｒｏｂｉｏｌ　１２．１０１−１０８゜１１ｅｎｓｖｏｏｒｔ、　Ｇ、 、　Ｔｅｒｐｓｔｒａ　Ｃ，、ａｎｄ　Ｋｌｕｙｖｅｒ、　Ｅ、Ｐ、　ｄｅ、　 （１９８９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ａｎ ｄ　ｓｏｍｅ　ｒ＋ｒｓｉｎａｎｔ　ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ　ｂｙｃｒｏｓ ｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ、　Ｖｅｔ、　１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．２０ ．２９１−３０６゜１１ｅｓｔｅｎｂｒｉｎｋ、　Ｆ、、　！１ｉｄｄｅｌ、　 Ｉｌ、ＧＪ、、　５ｔｒａｖｅｒ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ｌｅｅｕｗ。

Ｐ、胃、ｄｅ、（１９８６）　Ａ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋ ｅｄ　１ｍ５ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）　ｆｏｒ　ｂｏ ｖｉｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉａｒｒｈｏｅａ　ｖｉｒｕｓ　ｓｅｒｏｌｏｇｙ、 　Ｊ、　Ｖｅｔ、　ｌｅｄ。

８３３、３５４−３６１゜ Ｗｅｓｔｅｎｂｒｉｎｋ、　Ｆ、、　Ｖｅｌｄｈｕｉｓ、　Ｍ、Ａ、、　ａｎｄ 　Ｂｒ１ｎｋｈｏｆ、　Ｊ、Ｍ、Ａ、。

（１９ｇ９）　Ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｎｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ ｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔ ｏ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｐａｒｖｏ　ｖｉｒｕｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔ ｈ、　２３．１６９−１７８゜Ｚｅｉｊｓｔ、　Ｂ、Ａ、Ｍ、　ｖａｎ　ｄｅｒ 、　Ｈｏｒｚｉｎｅｋ、　１１．ｃ、、　ａｎｄ　ｌｌｏｅｎｎｉｇ、　Ｖ、。

（１９７５）　Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｅｑｕｉｎｅ　ａｒｔｅｒｉｔｉ ｓ　ｖｉｒｕｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　６１１．４１８−４２５゜ Ｆｉｇ、よ（１） Ｆｉｇ、　上（２） Ｆｉｇ、Ｌ（１１ ２１ｇ、Ｌ（４１ ＷＲＣＴＳＱＦＱＡＧＲ工　ＬＡＳＬＫＦＬＰ　よ０工ＯＶ　Ｔ　Ｐ　Ｓ　Ｄ　 Ｇ　Ｐ　Ｐ　ＨＡ　Ｐ　Ｄ　Ｆ　Ｐ　Ｓ　ＲＶ　Ｓ　Ｔ　Ｇ　ＬＯ９０Ｃ’ＦＩ ’ＡＴＧ！　３５４０ Ｇ　Ｓ　Ｗ　Ｋ　Ｇ　Ｌ　Ｍ　Ｌ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　ＲＬ　Ａ　Ｇ　Ｓ　Ｍ　Ｓ　Ｑ 　Ｒ１１１０ＣＣＴＴＡ　ＣＴＣＣＣＡＩＸコ−−〒　”　３６００Ｌ　Ｍ　Ｔ 　Ｗ　Ｖ　Ｆ　Ｅ　Ｖ　Ｆ　Ｓ　ＨＬ　Ｐ　Ａ　Ｆ　Ｍ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｆ　１１ ３０σｆ’ｃＧｃｃ’ＧｃＧＧＧｃ−ＣＴＣＴＡｅｆｆｉ　！　３６６０Ｓ　Ｐ 　ＲＧ　Ｓ　Ｍ　Ａ　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｉｆ　Ｌ　Ｆ　Ａ　Ｇ　Ｖ　Ｖ　Ｌ　Ｌ　Ａ 　１１５０Ｇ　Ｓ　Ｌ　ＲＲＶ　ＲＬ　Ｇ　Ｖ　Ｆ　Ｇ　Ｓ　Ｗ　Ｍ　Ａ　Ｆ　 Ａ　Ｖ　Ｆ　１１９０Ｆｉｇ、工（５） Ｖ　Ｖ　Ｓ　Ｑ　Ｇ　ＲＣＨＫ　ＣＷ　Ｇ　Ｋ　ＣＸ　ＲＴ　Ａ　Ｐ　Ａ　１２ ９０人閣℃τ　ｆｆ１ｃＡｃｃ　ＡＴＣＣ’ＴＴ　４１４０Ｅ　Ｖ　Ａ　Ｌ　Ｎ 　Ｖ　Ｆ　Ｐ　Ｆ　Ｓ　ＲＡ　Ｔ　ＲＶ　Ｓ　Ｌ　Ｖ　Ｓ　Ｌ　１３１０＝ｉＯ 〜υ（コＣ４２００ ＣＤ　ＲＦ　Ｑ　Ｔ　Ｐ　Ｋ　Ｇ　Ｖ　Ｄ　Ｐ　Ｖ　ＨＬ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｗ　Ｒ １３３０ＣＧＧＧ　ＣＣ０１１１ＴＣｆｆｌＣＡＣＡＣｒＡＧＣＴＴＡ？ＧＣ４ ２６０Ｇ　ＣＷ　ＲＧ　Ｅ　Ｓ　Ｐ　ｘＨＱ　Ｐ　ＨＱ　Ｋ　Ｐ　Ｘ　Ａ　Ｙ　 Ａ　１３５０ＣＡＡ　Ｃ４３２Ｏ Ｎ　Ｌ　Ｄ　Ｅ　Ｋ　Ｋ　Ｍ　Ｓ　Ａ　Ｑ　Ｔ　Ｖ　Ｖ　Ａ　Ｖ　Ｐ　Ｙ　Ｄ　 Ｐ　Ｓ　１３７０↑ＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡ’ｌｌ＆　ＴαγｘｔＡＣＣＡＧ ＯＣＴＡＣ４３ＢＯＱ　Ａ　Ｘ　Ｋ　ＣＬ　Ｋ　Ｖ　Ｌ　Ｑ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　 Ｘ　Ｖ　Ｄ　Ｑ　Ｐ　Ｔ　１３９０ＡＣＣＣｎＣＣＣＡ　Ｃ４４４０ ＰＥＶＶＲＶＳＩ！　工　Ｐ　Ｆ　Ｓ　Ａ　Ｐ　Ｆ　Ｆ　Ｐ　Ｋ　Ｖ　Ｐ　１４ １０ＡＧＴＣＡＡＣ４５ＱＱ Ｖ　Ｎ　Ｐ　Ｄ　ＣＲＶ　Ｖ　Ｖ　Ｄ　Ｓ　Ｄ　Ｔ　Ｆ　Ｖ　Ａ　Ａ　Ｖ　ＲＣ １４３０ｒ　４５６０ Ｇ　Ｙ　Ｓ　Ｔ　Ａ　Ｑ　Ｌ　Ｖ　Ｌ　Ｇ　ＲＧ　Ｎ　Ｆ　Ａ　Ｋ　Ｌ　Ｎ　Ｑ 　Ｔ　１４５０ＣＣＣＣＣＣｍ〒Ａ＋ｒ１ｃｗ！１ＣＣＡＣＣＴＣＴ’！’ＡＣ ＡＣＣＣ’ＦＩＩ（に！　４ｇ２０Ｐ　Ｐ　ＲＮ　Ｓ　Ｘ　Ｓ　Ｔ　Ｋ　Ｔ　Ｔ 　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｓ　Ｙ　Ｔ　Ｌ　Ａ　Ｖ　１４７０ｒ　Ｔｒｒｌ　Ｃ４６８０ ＡＱＶＳＡ　１１　τ　ＬＶＨＦ　工　Ｌ、ＧＬＷＦＴ！ｊＰ１４９０ｘｃｃｘ コＩＣｃｋｒＧＧ、！シＬＴＡＴＣＣＴＡＣ４７４０Ｑ　Ｖ　ＣＧ　ＲＧ　Ｔ　 Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｗ　ＣＳ　Ｎ　Ｐ　Ｆ　Ｓ　Ｙ　Ｐ　Ｔ　１５１０Ｆｉｇ、　工（ ６） Ｆｉｇ、１（７１ Ｆｉｇ、ｌ（８１ Ｆｉｇ、Ｌ［９１ Ａ　Ｇ　Ｎ　Ｍ　Ｇ　Ｖ　Ｄ　Ｇ　Ｓ　Ｘ　Ｗ　Ｄ　Ｆ　Ｅ　Ｔ　Ａ　Ｐ　Ｔ　 Ｋ　Ａ　１１９−　ＣＧ　７８００ ＥＬｉ！ＬＳＫＱ　エ　エ　Ｑ　Ａ、ＣＥ　Ｖ　ＲＲＧ　Ｄ　Ａ　Ｐ　Ｌ３９Ａ ＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣα＝τλコυＣＣｒ＝りα℃　７８６ＯＮ　Ｌ　Ｑ　Ｌ 　Ｐ　Ｙ　Ｋ　Ｌ　Ｙ　Ｐ　Ｖ　ＲＧ　Ｄ　Ｐ　Ｅ　ＲＨＩＣＧ　１５９ＣＧＣ Ｃｎ’ＡＴＯ’１ＡＴＮ：　Ｎニリυすｆｆ℃　Ｃ７９２０ＲＬＺＮＴＲＦＧＤ ＬＰＹＫ’！’ＰＱＤ　τ　ＫＳ１７９ＧＣＡＡＴＣＣＡＣＧ　ｃ′ｙ３ｃＡｃ ＣＣｃ〜ｕＩＫＫ心ＣＣＣｚ　ＴＣＣ７９８０Ａ　工　ＨＡ　Ａ　ＣＣＬ　ＨＰ 　Ｎ　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｖ　Ｓ　Ｄ　Ｇ　Ｋ　Ｓ　１９９Ｆ　Ｐ　Ｔ　Ｋ　Ｄ　Ｖ　 Ｑ　Ｓ　工　Ｐ　Ｅ　Ｘ　Ｄ　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　ＲＡ　Ｖ　３１．９Ｆｉｑ、ｌｆ ｌｏ） Ｆｉｇ、工（１１） Ｆｉｇ、工（１２） ７Ｌｇ、ｌ（１１１１ Ｐｉｇ、　Ｌｆ１４１ Ｆｉｇ、よＣＣ１５ ）Ｆｉ、ｉｆ工６） Ｆｉｇ、ｌ（エフ） ＣＧＡＡＡＴ！’　、５０８８ 時間（ｈｒ） Ｆ工ｑ、３ フロントページの続き く５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１００　９ ２８１−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０ −２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＧＡ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　 ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ポール、ヨアネス　マリア　アントニスオランダ国　８２４３ 　ハーアー　レリシュタット　ヨル　３０−０５ （７２）発明者　ムールマン、ロベルトゥス　ヤコブス　マリア オランダ国　８２５２　ニーバー　ドロンテンプ　チルガング　１２ （７２）発明者　ミューレンベルク、ヨハンナ　ヤコバ　マリア オランダ国　１０５３　イクスペー　アムステルダム　ポトギエテルシュトラー ト１７■

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離レリスタドエイジェント（単離ＬＡ：ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２．９１）に本質的に相当する豚の奇病（ＭＳＤ）の原因物質である単離さ れたレリスタドエイジェント（ＬＡ）から成る組成物。
2. ２．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質である殺され車離されたＬＡから成る組成物。
3. ３．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー．パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質である弱体化され単離されたＬＡから成る組成物。
4. ４．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質であるＬＡから誘導された再結合ベクタから成る祖数物。
5. ５．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー．パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質であるＬＡの単離された部分または成分から成る組成物。
6. ６．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質であるＬＡから誘導された単離もしくは合成蛋白質、ポリ ペプチドまたは核酸から成る組成物。
7. ７．寄託各号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー．パスツール研究所に１９９ １年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当 するＭＳＤの原因物質であるＬＡのゲノムによって誘導されたヌクレオチド配列 から構成される再結合核酸から成る組成物。
8. ８．図１で示されるＬＡ種のヌクレオチド配列を構成する再結合核酸から成る組 成物。
9. ９．図１で示される開放読取り枠の１つから選ばれたＬＡ種のヌクレオチド配列 を構成する再結合核酸から成る組成物。
10. １０．寄託各号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー．パスツール研究所に１９ ９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎし−２．９１）に本質的に相 当するＭＳＤの原因物質であるＬＡの蛋白質から誘導されるアミノ酸配列を有す るポリペプチド、固有の再結合ＤＮＡから遺伝子工学を用いて生産される細胞に よって生産されるポリペプチドから成る組成物。
11. １１．図１に示されるＬＡ種アミノ酸配列で構成されるポリペプチドから成る組 成物。
12. １２．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９ ９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相 当するＭＳＤの原因物質であるＬＡの部分または成分を特別に再確認した単離物 または合成抗体から成る組成物。
13. １３．寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー．パスツール研究所に１９ ９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相 当するＭＳＤの原因物質であるＬＡから誘導された蛋白質または抗原蛋白質のた めのヌクレオチド配列コードを構成する核酸を含む再結合ベクタから成る組成物 。
14. １４．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡから成るワクチ ン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
15. １５．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質である殺されたＬＡから成 るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
16. １６．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス、パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２，９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質である弱体化されたＬＡか ら成るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
17. １７．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２，９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡから誘導された 蛋白質または抗原のためのヌクレオチド配列コードを構成する核酸を含む再結合 ベクタから成るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
18. １８．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡの抗原部分また は成分から成るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
19. １９．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚をＭＳＤから保護するた めに、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリ ー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−Ｎ Ｌ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡから誘導される 蛋白質もしくは抗原ポリペプチドまたはＬＡの抗原成分に類似するペプチドから 成るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
20. ２０．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚を病原菌によって起こる 病気から保護するために、これらの動物に予防接種する寄託番号Ｉ−１１０２と してフランス，パリー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単 離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質である ＬＡから誘導される再結合ベクタと、病原菌から誘導される蛋白質または抗原ペ プチドのためのヌクレオチド配列コードを構成する再結合ベクタの核酸とから成 るワクチン組成物およびそれに適する担体と免疫助成剤。
21. ２１．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から誘導され、ＬＡから 誘導される蛋白質または抗原ポリペプチドまたはＬＡの抗原成分に類似するペプ チドから成る試料中、特に血液もしくは血清、喀痰、唾液または組織のような生 物試料中、寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス．パリー，パスツール研究所に １９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２，９１）に本質的 に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡから核酸を検出する診断器具および核酸 検出に適する検出方法。
22. ２２．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から誘導され、ＬＡの部 分または成分を特に再確認する抗体から成る試料中、特に血液もしくは血清、喀 痰、唾液または組織のような生物試料中、寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス ，パリー，パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤ Ｉ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡからの抗 原を検出する診断器具および抗原検出に適する検出方法。
23. ２３．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から誘導され、ＬＡの抗 原部分または成分から成る試料中、特に血液もしくは血清、喀痰、唾液または組 織のような生物試料中、寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス．パリー，パスツ ール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９ １）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡを特に再確認する抗体を検 出する診断器具および抗体検出に適する検出方法。
24. ２４．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から誘導され、ＬＡから 誘導される蛋白質もしくは抗原ポリペプチドまたはＬＡの抗原成分に類似のペプ チドから成る試料中、特に血液もしくは血清、喀痰、唾液または組織のような生 物試料中、寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に １９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的 に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡを特に再確認する抗体を検出する診断器 具および抗体検出に適する方法。
25. ２５．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚から誘導され、殺された 、生きたまたは弱体化されたＬＡから成る試料中、特に血液もしくは血清、喀痰 、唾液または組織のような生物試料中、寄託番号Ｉ−１１０２としてフランス， パリー．パスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ −ＮＬ−２．９１）に本質的に相当するＭＳＤの原因物質であるＬＡを特に再確 認する抗体を検出する診断器具および抗体検出に適する方法。
26. ２６．動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは豚が、ＭＳＤの原因物質で 汚染されているかどうかを診断するための、動物から誘導された試料、待に血液 もしくは血清、喀痰、唾液または組織のような生物試料を準備することと、寄託 番号Ｉ−１１０２としてフランス，パリー，パスツール研究所に１９９１年６月 ５日に寄託された単離ＬＡ（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）に本質的に相当するＭＳ Ｄの原因物質であるＬＡ核酸、ＬＡ抗原またはＬＡを特別に再確認する抗体を含 むかどうかを試験することとから成る方法。