JPH06508529A - Ｄ−アミノ酸またはｄ−アミノ酸誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｄ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸誘導体の製造法枢鑑 本発明は、ゲル化天然重合体に包み込んで固定化したアゲロバクチ１功ム・ラジ オバクター細胞を用いる、適切なヒダントイン化合物のラセミ体混合物からのＤ −アミノ酸またはＤ−アミノ酸誘導体の新規製造法に関する。

固定化微生物を用いる生体触媒の使用には、連続的操作に対する重要な利点が存 在する。目的は、Ｄ−ヒダントイン化合物の立体選択的生化学的変換により適切 なアミノ酸−Ｄを得ることである。こうして得ることが出来る生成物は、例えば ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンなどの製薬工業にとって興味深いものである。

先行技術 ヒダントイン化合物の変換を目的とするヒダントイナーゼおよび／またはカルバ ミラーゼ酵素系の使用は、非常によく知られている。（バイオテクノロジー：ア ・コンブリヘンンブ・トリーティーズ、６ａ巻、エイチ・ジエイ・リーム、ジー ・リード・エディンヨンズ、ヴエルレーグ・ケミ−、ウィーンハイム、１９８４ 年）。

多数の微生物が、上記酵素系の生産者として提示されており、その中にンユード モナス、アグロバクテリウム、カンジダ、ハンセニュラ、アルスロバクタ−があ るが、中でもアグロバクテリウム・ラジオバクターは両方の活性を特徴とする完 全な酵素系が存在する事実から、特に興味深いものである。

本発明の主題に関連する特許の中でも、本発明のアグロバクテリウム・ラジオバ クターを使用し、Ｄ−フェニルグリジンまたは誘導体を得ることは、以下の技術 と同様、強調されるべきである（ドイツ公開２．６２１．０７６　；ドイツ公開 ２．９２０．９６３）二アール・オリビエリ等、“エンシマティック・コンバー ジョン・オブ・Ｎカルバミル−Ｄ−アミノアシッズ・トウ・Ｄ−アミノアシッズ 、エンザイム・アンド・ミクロバイアル・テクノロジー、１巻、２０１−２０４ 頁（１９７９年）およびアール・オリビエリ等、“ミクロバイアル・トランスフ ォーメーション・オア・ラセミツク・ヒダントインズ・トウ・Ｄ−アミノアンッ ズ、バイオチクノロノー・アンド・バイオエンジニアリング、２３巻、２１７３ −８３頁（１９８１年）。これらの技術は、遊離のバイオマスを用いる微生物的 製法を記載している。

他の微生物の酵素系の使用に関して、以下を言及すべきである：アグロバクテリ ウム・ツメファシェンス（ＥＰ　０３０９３１０）　、シュードモナス（ドイツ 公開３．０１ｇ、５８１）　、カンジダ（ＪＰ　６１．１７７、９９２）　、ハ ンセニュラ（ＪＰ　６１．１７７、９９１）。

固定化微生物の使用には、本発明の目的である操作および分離上の重要な利点が 存在する。ゲル化重合体で固定化されたアグロバクテリウム・ラジオバクター細 胞の使用が特許されている（ＥＳ　５２３．３６０）とはいえ、この生体触媒は 、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼ酵素活性の保持力について保留したま ま、農業目的に用いられた。

他方、ヒダントイン化合物の生物学的変換を目的とする他の固定化微生物の使用 は、−ＥＰ　０２６１８３６にバノラス・プレビスの固定化に関連するものとし て一記載されている。更に、ＵＳ特許４．０９４．７４１が言及されるべきであ る。該特許の特許請求の範囲には、一般に、広範囲の微生物の酵素活性の固定化 が含まれているが、アグロバクテリウム・ラジオバクターについても特定の固定 化法についても言及本発明の目的は、ゲル化天然重合体に包み込んで固定化した アグロバクテリウム・ラジオバクター細胞を用いる、適切なヒダントイン化合物 のラセミ体混合物からのＤ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸誘導体の新規製造法で ある。

固定化微生物の使用は、生体触媒の再利用を可能にし、こうして分離および連続 法の使用の両方の観点から重要な利点が得られる。

他方、アグロバクテリウム・ラジオバクター細胞の使用には、Ｄ−ヒダントイン 化合物から所望の生成物への定量的変形を可能にする完全かつ必須の酵素系が存 在するという利点がある。

酵素の立体選択性は、ラセミ混合物のＤ−Ｌ均衡を転置することにより作動する ヒダントイン化合物のＤ−型で起こり、ラセミ混合物からＤ−アミノ酸またはＤ −アミノ酸誘導体への定量的転化を可能にする。

アグロバクテリウム・ラジオバクター細胞（分裂段階に入っていないかまたは入 りかけている）の固定化は、イオンＣａ”の存在下および／または熱処理で形成 されるゲル化アルキネートまたはカラゲネートに封入して得られる。こうして得 られた規制の大きさの球状粒子は、機械的耐性を高めるために、必要に応じ、硬 化処理に付してもよい。

結果として、安定な生体触媒が得られ、Ｄ−Ｌ−ヒダントイン化合物から適切な り一アミノ酸誘導体への全転化を実行することが出来、同様にその少なくとも２ ２日周期の再利用も出来る。

本発明は、以下の実施例でより詳細に説明され得るが、本発明の範囲に関係する 限りでは、制限的な性質であると理解される可きでない。本実施例は、本明細書 の終わりに示した図に基づくものであり、その意味は以下である：図１は、ｐＨ の関数としてヒダントイナーゼ活性の変化を示している。

図２は、カルバミラーゼ活性の変化を示している。

図３および図４は、温度の関数として酵素活性の変化を示している。

図５および図６は、４５℃および５０℃での遊離バイオマスの安定性を示してい る。

図７は、４０℃、２２日周期で試験した２種の酵素活性の安定性を示している。

図８は、同条件下で試験した遊離バイオマスの性能を反映している。

実施例 １、アグロバクテリウム・ラジオバクター細胞を用いて、適切なヒダントイン化 合物からＤ−ｐヒドロキシフェニルグリシンを得た。得られた生成物は、以下に 示す図式に従う。

？ａ４２ Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン ２−活性試験 ２．１．−アグロバクテリウム・ラジオバクターバイオマスの酵素活性を以下の 様に測定した。生体触媒懸濁液１ｍｌをｐＨ８緩衝液中ヒダントイン化合物懸濁 液１１ｍ１に加え、基質最終濃度を０．０２Ｍにする。これを４０℃でＮ２雰囲 気下、２０分インキュベートし、得られたＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン をＨＰＬＣにより分析する。

カルバミラーゼ活性を測定するために、カルバミル誘導体による置換ヒダントイ ンに同様の活性試験を用いる。

固定化生体触媒の活性を同様の方法で生体触媒５ｍｌを用いて測定した。

２．２．−各酵素活性の最適ｐＨを測定するために、各１種の基質（ヒダントイ ンおよびカルバミル誘導体）の１０ｍＭ溶液をトリス−ＨＣｌ緩衝液またはカル ボン酸塩／カルボン酸緩衝液で所望のｐＨに従い、調製した。バイオマス１ｍｌ 懸濁液を基質溶液１０ｍ１に加え、２１に示したように４０℃で試験した。

２．３．−各活性の最適温度を測定するために、基質（１０ｍＭ）を各々に最適 のｐＨ（ヒダントイナーゼ活性ではｐＨ８およびカルバミラーゼでは８．５）で トリス−ＨＣＬ緩衝液に溶解した。活性試験を様々な温度で実行した。

２．４−ヒダントイナーゼ活性は、２０分の反応（生成物＋カルバミル誘導体の 添加）において転化したｍｍｏｌ／１で表される。カルバミラーゼ活性は、中間 生成物から２０分の反応後に得られるｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのｍモル ／１で表される。

３、−固定化 アグロバクテリウム・ラジオバクター細胞の懸濁液を以下の方法に従い、ゲル化 アルギネートで固定化した： 材料　アルギン酸ナトリウム（ブロタナルＬＦＩＯ／６０）　、最終容量の４０ ％。

アグロバクテリウム・ラジオバクターのバイオマスもまた最終容量の２１％。Ｃ ａｃ１２．１．５％。

バイオマス（０，７ｇ／ｍｌ）　２０ａ＋１を取り、アルギン酸ナトリウム溶液 （２，６ｇ／４６．６７ｍ１）で混合した。これを均一混合物が得られるまで、 磁気的に撹拌した。蛎動ポンプを通してゲルをＣａＣｌ２溶液３０ｃｍで針状（ 直径０．５ｍｍ）にし、これを磁気的に撹拌する。ゲルとＣａ”イオンを接触さ せて、凝固した滴状のものを生成する。固定化の全ての工程は、Ｎ２雰囲気下で 行った。

４、−安定性 ４．１．−遊離バイオマスの安定性 バイオマス２５ｍ１を試験温度に維持して、実験は全て窒素雰囲気下で行った。

予め決めておいた時間間隔で、活性試験を行うのに懸濁液１ａ＋１を使用した。

４．２−固定化バイオマスの安定性 得られた生体触媒の安定性を測定するために、活性試験を定期的に行った。固定 化生体触媒を所望の温度およびＮ２雰囲気下で、ヒダントイン化合物濃度３％（ ｐ／Ｖ）で密封容器内に保持した。生体触媒は、活性試験を行う前に、完璧な洗 浄工程にかけた。

５、−結果 ５．１．−各酵素活性の操作条件の測定ヒダントイナーゼ活性の変化は、ｐＨの 関数として図１に示し、ｐＨ＝８で極大変化を得ている。図２は、同様の方法に おける最適ｐＨ８，５でのカルバミラーゼの活性変化を表している。

図３および４は、温度の関数として酵素活性の変化を示している。極大活性は、 ヒダントイナーゼでは４５℃、カルバミラーゼでは５０℃で得られている。

４５℃および５０℃での遊離バイオマスの安定性は、図５および図６に示されて いる。いずれの酵素活性も、考慮中の１０日間、高い安定性を示すが、５０℃で のカルバミラーゼ活性は、約２０％の損失を被る。

活性および安定性に関連して得られたデータは、操作温度は４５°Ｃから５０℃ 、最適ｐＨは８から８５であるべきとの結論に達することを可能にしている。し かしながら、バイオマス中のカルバミラーゼ活性の損失−ヒダントイナーゼと比 較した場合−から、この活性には、最適ｐＨおよび温度（ｐＨ８，５および温度 ５０℃）に近似の値を使用することを提案するのが賢明であると分かる。

５．２．−固定化生体触媒の操作 固定化から得られた結果は、固定化触媒の活性の５０％から８０％の保持力を示 している（活性の測定は、本質的な酵素活性だけでなく、固定化生体触媒の場合 の普及的な限定もまた反映していると考慮されるべきである）。

得られた生体触媒粒子は、４０℃で２２日間周期で２度試験された酵素活性に関 する限りでは、１００％の安定性を示した（図７参照）。

この性能は、同様の条件で試験された遊離バイオマスの安定性と、同一である（ 図８参照）。

それゆえに、固定化生体触媒は、操作条件下で、アグロバクテリウム・ラジオバ クター細胞の酵素活性を保持し、Ｄ−ヒダントイン化合物からＤ−ｐ−ヒドロキ シフェニルグリノンへの特異的変形を実施することができる。

Ｈ 図１ ｐＨ 図２ 温度（Ｃ） 図３ 温度（Ｃ） 図４ 時間（日） 図５ 時間（日） 図６ 時間（日） 図７ 時間（日） 図８ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、Ｍ、　ＣＩ、　ＣＭ、　Ｇ Ａ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ。

（７２）発明者　ロペス・サンチン、ホヤスペイン０８００フバルセロナ、パセ オ・デ・グラシア、１１−ア番 （７２）発明者　セラート・フラド、ホセプ・マリアメペイン０８００フバルセ ロナ、パセオ・デ・グラシア、１１−ア番

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．適切なヒダントイン化合物を変換させてＤ−アミノ酸またはその誘導体を製 造するにあたり、当該変換をヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼ酵素活性を 持つ固定化微生物を用いて行うことを特徴とする、適切なヒダントイン化合物を 変換させてＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸誘導体の製造法。
2. ２．微生物がゲル化天然重合体（例えば、アルギネート、カラゲネート）に包み 込んで固定化されたものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. ３．徴生物がアグロバクテリウム・ラジオバクターであることを特徴とする、請 求項２記載の方法。
4. ４．ヒダントイン化合物のラセミ混合物を出発原料とし、生成物がＤ−ｐ−ヒド ロキシフェニルグリシンであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
5. ５．変換時の操作を還元剤雰囲気下、特に、Ｎ２雰囲気下またはＮａ２Ｓのよう な化学還元剤の存在下で行う、請求項１、２、３または４記載の方法。