JPH06508780A - 移植片材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 移植片材料 本発明は、骨格系の修復および回復に有用な新規材料、それらの製法、ならびに それらを利用した骨格修復のための新規方法に関するものである。

ヒトおよび動物において骨格を修復するためには多様な外科的方法か採用される 。これらには、骨折部を安定化し、かつ治癒を促進するための移植片の挿入、特 に本来低い治癒傾向を示す身体領域においては前桟用材料の移植、および支持組 織を再生させるための膜として作用する移植片の挿入による、骨折の治癒か含ま れる。移植片として用いられる材料は、理想的には生物適合性であり、かつ骨の 成長を促進する性質のものである。

骨の石灰化を促進するに際して酵素アルカリホスファターゼが役割をもつ可能性 があると長年推定されている。ビールセンおよびファン・デン・ホス（Ｂｅｅｒ ｔｓｅｎＪａｎ　Ｄｅｎ　Ｂｏｓ）　（ｌ［ａｔｒｉｘ　Ｖｏｌ、９１９８９　 ｐ１５９−１７１）が報告した最近の注目すべきインヒドロ研究は、アルカリホ スファターゼか恐らくリン酸イオンの局所濃度を高める作用により石灰化過程の 開始に関与している可能性かあるという仮説を支持する傾向を示した。

しかしインビトロ研究において用いられたリン酸エステルの濃度がかなり高いと いう点からみて、また生理的ｐＨ水準におけるリン酸エステルの加水分解速度は 鉱化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）過程に関与するには低すぎると考えられ るので、このようなインビトロ鉱化の研究かインビボでの状況に関連かあるとい うこと（ヰ疑問視されている。

米国特許第４．３９４．３７０号明細書には、再生コラーゲンと、鉱物質除去（ ｄピｍ１ｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）した骨粒子または可溶化した骨性形態発生 期蛋白質との、スポンジ状に加工された複合材料からなる骨用移植材料が記載さ れている。これらのスポンジをウシ腸アルカリホスファターゼとコンプレックス 形成させることかできる。１５ｍｇ／ｇ濃度のコラーゲンの分散によりこの移植 材料に対する炎症反応かすへて除かれ、移植材料中における類骨の形成か促進さ れ、移植片か徐々に吸収されてより完全に皮質化するのか助成されると述べられ ている。鉱化が起こったことについては言及されていない。米国特許第４．４０ ９．３３２号明細書には、体内に導入された場合に生じる炎症反応を減少させる ためにアルカリホスファターゼとのコンプレックスを形成させたコラ−ケン質材 料に基づく多孔質膜構造体か記載されている。

本発明者らは、生物適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）キャリヤー材料と鉱 化を促進する量のホスファターゼ酵素とを結合させることにより、骨格の修復に 有用な新規材料が得られることを今回見出した。酵素活性の水準は、好ましくは ヒドロキシプロリン１．０μｇ当たり少なくとも０５ミリ単位（ｍＵ）のＡＰａ ｓｅである（ここでＩＵは、ヒールセンおよびファン・デン・ボス（Ｂｅｅｒｔ ｓｅｎ、　Ｙａｎ　Ｄｅｎ　Ｂｏｓ）　Ｍａｔｒｉｘ　Ｙｏｌ、　９／１９８９ ．　ｐ１６Ｌに報告された方法を用いて、ｐ−ニトロフェニルホスフェートから ３７℃およびｐＨ１０，５において１分につき１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノー ルを放出させるものであると定義される）。

生物適合性キャリヤー材料は、骨格の修復に用いた場合それ自体が少なくともあ る程度鉱化され、その場に長期間留まることができると思われる。本発明材料は ７日以内に容易に検知することかできるほど移植片の鉱化を促進し、骨格の修復 における実用性を備えている。

これらの新規材料は安定な製品であり、骨格の修復に用いた場合に鉱化され、新 たな骨の成長を促進する作用をもつ。従って本発明の１観点によれば、生物適合 性キャリヤー材料と結合させたホスファターゼ酵素からなり、鉱化を促進する量 の酵素水準をもつ、骨格の修復に有用な新規材料か提供される。

ホスファターゼ酵素は好ましくはアルカリホスファターゼ酵素（以下、便宜上“ ＡＰａｓｅ“）である。ＡＰａｓｅは普通はヒトまたは動物組織からの抽出によ り得られる。この酵素は、多様な１リン酸エステルを加水分解しうる細胞表面糖 蛋白質である。３ｆｌｊの主要な形態のＡＰａｓｅが区別される。肝ＩＩ／骨／ 腎臓：胎盤、および腸。これらの形態すべてが本発明に有用である。

キャリヤー材料は、上記の酵素と結合しうるいかなる生物適合性キャリヤー材料 からなるものであってもよい。好ましくは結合は、キャリヤーおよび上記の酵素 と共有結合しうる結合剤の存在下で、キャリヤーを酵素と共にインキュベートす ることにより行われる。適切な結合剤は、酵素の生物学的活性を著しく低下させ ることなく上記の酵素に結合しうるちのである。多様な多官能性化合物を用いる ことができる。本発明の好ましい材料を形成するために用いられる結合剤は、キ ャリヤー材料に結合しうるちのであろう。使用しうる可能性のある結合剤の例に は、ビオチンーアビンン：グルタルアルデヒドおよび１−エチル−３（３−ジメ チルアミノプロピル）カルボンイミド・ＨＣＩか含まれる。好ましい結合剤は特 に、本発明による材料の一部として体内へ導入された際に不都合な反応を生じな いものである。極めて好ましい結合剤はカルボジイミド類、特に上記の化合物で ある。

特に好ましい結合剤はＳＡＴＡ−ＭＨＳとして知られているものであり、これは スクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）とマレイミドヘキ サノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨＳ）の組み合わせを用いるもの である。好ましくはキャリヤーを５ＡＴＡと共に、酵素をＭＨＳと共にインキュ ベートする。これら２種類のインキュベーション処理の生成物を混和し、反応さ せて、移植片材料を製造する。

キャリヤー材料は天然または合成のいずれに由来するものであってもよい。多様 な合成ポリマーを使用しうる可能性がある。有用な特定の群の合成材料は、生物 吸収性（ｂ　１ｏａｂｓｏｒｂａｂ　ｌｅ）であることが知られているポリマー である。合成材料の使用は、それらか柔軟であり、かつ特定の用途のために設計 された造形片に成形することができる限り、有利でもある。

多様な天然材料をキャリヤーとして使用することもできる。特にヒトまたは動物 の組織、たとえば骨および歯が有用である。石灰化した組織、たとえば骨および 歯は、それらをキャリヤーとして使用する前に鉱物質除去しなければならない。

鉱物質除去により得られた材料は実質的な割合の原線雄性コラーゲン（ｆｉｂｒ ｉｌｌａｒ　ｃｏｌｌａｇｅｎ）からなる。コラーゲンは多くの動物の主要な線 維質蛋白質であり、ヒトまたは動物の体の多くの部分から抽出することができる 。

原線雄性コラーケンは本発明においてその実質的な割合を構成する材料として使 用するのに好ましいキャリヤー材料である。この材料の例はヒトまたは動物の硬 膜である。キャリヤー材料は造形片に成形するのに十分なほど柔軟な材料である ことか好ましい。多孔質であるか、または原線維質もしくは線維質材料のメ・ｌ ンユからなる材料も、酵素を結合しうる比較的大きな表面をそれらか備えている とし）う点て有利である。有用なキャリヤー材料は、常に線維の表面か露出した 状態を維持するならば、適切な支持材の内部または上にコラーゲン線維を取り込 ませることにより形成することもてきる。支持材の例は天然または合成のリン酸 カルシウムであり、これらの物質は本発明の材料の一部を構成するのに使用しう る。

キャリヤー材料は移植片材料として有用であるのに十分なほど柔軟であり、かつ 十分なほど強靭であることか好ましい。柔軟度または強度の程度はその材料につ き意図される個々の用途に従って異なるであろう。好ましくはその材料は、移植 手術の前または途中に取り扱いおよび操作しうるちのである。好ましい移植片材 料は、少なくともホスファター七２００Ｕ／ｃｍ３を含む。好ましいキャリヤー 材料は、この量の酵素と結合しうるちのである。有用な材料は、キャリヤーの、 またはキャリヤーとホスファターゼ酵素の組み合わせにより製造された材料の圧 縮により製造しうる。

好まし件ヤリャー材料は、比較的平滑な表面および密に構成された線維質構造を もつものである。これらの材料は骨伝導性（ｏｓ　ｔｅｏｃｏｎｄｕｃ　ｔ　ｉ ｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を示すであろう。すなわちそれらは骨芽細胞の移 動を誘導し、これにより新たな骨の成長を促進すると思われる。

キャリヤーか小管状（ｔｕｂｕｌａｒ）構造をもつこと、すなわち一連の亀裂ま たは微小な割れをもつものであることも好ましい。酵素はこれらの小管内に結合 し、その中で鉱化か起こるであろう。鉱化の進行に伴って材料の強度が増大する 限り、これは有利である。生理的濃度のカルシウムおよび有機ホスフェート（た とえばβ−グリセロホスフェート溶液）または無機ホスフェートを含有する溶液 中でキャリヤー（またはキャリヤー−ＡＰａｓｅ結合材料）をプレインキユヘー ノヨノすることにより、鉱化を促進することかできる。プレインキュヘーショノ によりキャリヤー内にＩｌｉ′！核中心か形成され、これか体内に移植されたの ち急速に成長して、鉱化速度を増大させると思われる。

キャリヤー材料は、その鉱化を阻害する作用を示す物質を含まないものであるこ とか好ましい。天然材料である場合、阻害物質の量を許容値にまで低下させるた めに、その材料を十分に抽出することが必要であろう。石灰化した組織の鉱物質 除去処理は、清浄な組織を洗浄し、それを酸溶液、たとえば酢酸または塩酸の溶 液に長期間装入しておくことによって行うのが好都合である。好ましくは、得ら れた鉱物質除去された材料をさらにキレート剤の存在下でカオトロピック物質（ ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）により抽出する。

鉱物質除去された材料は、残量の非コラーゲン性蛋白質および不溶性リン蛋白質 またはぞうげ質ホスホホリン（ｄｅｎｊｉｎａｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｎ ｓ）を含有する可能性がある。結合したリン蛋白質またはぞうげ質ホスホホリン の存在は再鉱化を促進するのに有効であることが見出された。好ましいキャリヤ ー材料は、これらのリン蛋白質またはホスホホリンを本来含むもの、またはこれ らのリン蛋白質またはホスホホリンが導入され、好ましくはキャリヤーに共有結 合したものである。好ましくは本発明の材料は、ヒドロキシプロリンのμｇ当た り少なくとも０．０３μｇのホスフェートを、極めて好ましくはリン蛋白質また はホスホホリンの形で含む。

本発明の新規材料は、キャリヤーをＡＰａｓ　ｅと共に結合剤の存在下で、カリ 所望により有機リン化合物の存在下で、インキュベートすることにより調製しつ る。

結合反応は、キャリヤーおよびＡＰａｓｅを結合剤の溶液中に導入することによ り実施するのか好都合である。反応はＡＰａｓｅを不活性化しない条件下で実施 すべきである。簡便には周囲温度より高くない温度、好ましくは１０℃以下に、 一般に少なくとも１時間、簡便にはそれより長時間、たとえば２４時間、反応体 を放置しておくことで本発明の生成物を調製するのに十分であろう。

新規材料中に存在するＡＰａｓｅの量は広範に変更しうる。好ましくは目的とす る用途において再鉱化を促進するのに十分な材料は、特にヒドロキシプロリン１ ．０μｇ当たり少なくともり、ＯｍＵのＡＰａｓｅの酵素活性水準を示すものて あろう。取り込ませる酵素の最適量は、構成材料の性質、その材料を用いる用途 、それを移植すべきヒトまたは動物の年齢、およびそのヒトまたは動物の血清中 に存在する無機ホスフェートの濃度に応じて異なるであろう。

比較的急速な成長期にある動物においては、これより低い量を含む材料が有用で あろう。成熟した動物においては、好ましくは移植片はこれより高い濃度の酵素 を、極めて好ましくはリン蛋白質またはホスホホリンとの組み合わせにおいて含 有する。

あるいは、たとえば有機ホスフェートまたは無機ホスフェートを経皮または皮内 投与することにより移植片付近のホスフェート濃度を高めることによって、鉱化 を促進することができる。上記移植片材料の導入よりなる、骨格をその修復のた めに治療する方法は、本発明の他の観点をなす。好ましい観点からは、治療法は さらに移植片付近のホスフェート水準を高めることよりなる。

結合剤の使用量は、単に目的量のＡＰａｓｅを結合させるのに要する量である。

一般に結合剤は、化学量論によって要求される量より大過剰に溶液中に存在する であろう。このように過剰量の結合剤か存在することは、キャリヤーの表面を架 橋させる作用をすると思われる。このような架橋はキャリヤー材料の機械的特性 を改善するのに有用であろう。これは移植片の生物分解性を調節するのにも有用 であろう。移植片は鉱化中はその機械的完全性を保持しなければならないか、そ の後分解することが有用であろう。

本発明材料は多様な外科処置に利用しうる。キャリヤー材料はＡＰａｓｅに結合 させる前に適宜な形状に銭形されることか好ましいであろう。

特に本発明材料は骨格の破損または欠損部位を安定化し、かつその治癒を促進す るための内部創傷装着用品として利用される。移Ｍ後にそれは鉱化し、硬化する 。新規材料は代用骨としても利用することかでき、この材料を適所に固定し、そ の場で鉱化させ、そして硬化させることにより、骨折の修復に用いることもでき る。これらの方法による骨折の治療は、本発明の他の観点を提供する。

本発明材料は′誘導式組織再生（ｇｕｉｄｅｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｇｅｎｅｒ ａｔｉｏｎ）’と呼ばれているものを伴う治療法にも用いられる。これらの方法 は、疾病により損傷を受けた身体領域において支持性結合組織の再生を補助する ための膜の挿入によるものである。この用途に現在用いられている膜は、生物分 解性でない場合かしばしばあり、２日間の外科手術において摘出しなければなら ない。本発明材料は生物適合性であり、その場に残留してもよく、従ってさらに 外科的介入の必要性が避けられるという点で、この用途において有利である。

本発明を以下の実施例により説明する。

に採取しく１−３歳）、−８０℃で使用時まで凍結した。解凍後に歯肉および歯 周靭帯を除去し、歯根をそれらの縦軸に平行に、頂端がら歯頚部まで、水道水を 絶えず潅水しながらダイヤモンドディスクで切断し、たがねで分解した。次いで 歯根を清浄にし、歯髄およびセメント質を除去した。それらをプロティナーセ阻 害剤の存在下に水冷ＰＢＳで洗浄し、水道水で冷却しながら外側ぞうげ質（外套 そうげ貫層を含む）をダイヤモンドディスクで取り出した。

０．５Ｍ酢酸または０．６Ｍ塩酸に４週間浸漬することにより、鉱物質除去した ぞうげ質スライス（ＤＤＳ）を調製した６　３０μｍに設定されたクリオトーム （ｃ　ｒ　ｙｏ　ｔ　ｏｍｅ）により切片を切り取った。次いでそれらをさらに ４Ｍグアニジノ・ＨＣＩおよび０６４Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）により４℃ で３日間抽出した。使用前にＤＤＳを２回蒸留水中で１時間洗浄し、抗生物質を 補充した２回蒸苗水に４℃で一夜装入した。ＤＤＳはヒドロキシプロリンのμｇ 当たり０．０４ＭｇのＰＯ＋を含有していた。

ＡＰａｓｅの結合　ウシ腸ＡＰａｓｅを結合剤グルタルアルデヒドまたはカルボ ジイミドの使用によりぞうげ質コラーケンシートに共有結合させた。

グルタルアルデヒド粒食０．　１％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳ中で、 ＤＤＳを２５℃で２時間、ＡＰａｓｅ　（７００Ｕ／ｍｌ）の存在下にインキュ ベートした。次いでこの材料をＰＢＳで十分に洗浄し、４°Ｃで１ｍＭ　Ｍｇ” および０．１ｍＭ　Ｚｎ”を含有するＯ、ＬＭグリシン緩衝Ｍ（ｐＨ１０，５） 中に保存した。

カルホンイミド結合　０．１３Ｍ　ｉ−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミド・ＨＣＩ　（ｐＨ４，５）中において、ＤＤＳを４℃で２日 間、ＡＰａｓｅ　（７００Ｕ／ｍｌ）の存在下にインキュベートした。次いでそ れらを蒸留水、０．ＩＭ　酢酸ナトリウム中のＬＭ　ＮａＣ１（ｐＨ４，０）、 ０．１Ｍ　ＮａＨＣＯｘ　Ｌｐ）（８，３）　、最後に蒸留水で十分に洗浄した 。この材料を４°Ｃのグリンノ緩衝液（上記の節を参照されたい）中に保存した 。酵素はこれらの保存条件下で少なくとも１０力月間はその活性を保持した。

の関数として調へるために、ＡＰ　ａ　ｓ　ｅ処理ＤＤＳ　（厚さ３０℃１ｍ） およびそれらの対照（架橋剤のみ、または熱不活性化酵素で処理）を、１０％熱 不活性化正常ウサギ血清（ＮＲ８）および抗生物質を補充したイスコブ（［５ｃ ｏｖｅ）改良ダルヘノコ培地（ＩＭＤＭ）中で３７°Ｃにおいて種々の期間イン キュベートした。放射性標識カルシウム（ウェル当たり１μＣｉ　［４５Ｃａ］ Ｃ１２）を添加し、コラーゲンシートを標識の取り込みにつき監視した。ホスフ ェート源であるβ−グリセロホスフェート（β−ＧＰ）を１０ｍＭ濃度で添加し た。実験終了時に検体を０．５ｍｌのＬＭ　ＨＣＩ中で３７°Ｃにおいて１時間 、脱灰した。３００ａＬの試料をオブチフルオル（Ｏｐｔ　ｉ　ｆ　１ｕｏｒ） シンチレーションカクテル＜／Ｚ１カート・インスツルメント社）に添加し、パ ラカード・トリカード４５３０ノンチレーン３ン係数計で係数した。

インビボ実験　ＡＰａｓｅ処理ＤＤＳを、それかインビボ条件下で石灰化する能 力につき下記に従って試験した。雌ウィスター（Ｗｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ）ラット （それぞれ約２００ｇ）をバイブノルム（Ｈｙｐｎｏｒｍ）で麻酔し、矢状縫含 に続く頭蓋を覆う皮膚を切開した。この皮膚を後方へ引っ張って右および左の側 頚筋を露出させた。次いで露出した筋肉の着点に切り込みを入れることにより、 それぞれの側にポケットを形成した。厚さ３０μｍ１幅１ｃｍ、長さ２ｃｍのＤ ＤＳスライスをポケｙトに挿入した　ＡＰａｓｅ処理したものは右側、対照は左 側。筋肉と接触するのは移植片の狭い縁のみてあり、その大部分く９０％）は真 皮と接触するように汀意を払った。皮膚の傷口はナイロン日台糸で閉じ、１週間 から４遍間までの種々の期間治癒させた。次いて動物を再度麻酔し、創傷領域を 再度切開し、移植片を切採した。各移植片の７１価分を周囲の結合組織と共に摘 出し、組織学的検査用に調製した。残りの部分は周囲組織を取り除き、化学的分 析に用いへ一トした際に放射性＆！カルシウムを蓄槽した。モノホスフェートエ ステルの不在下では、ぞうげ雪中に見出された［＋５Ｃａ］はごくわずかであっ た。カルボッイミド処理検体中の１ｆｉ３ｉｔの取り込みを時間の関数として追 跡したところ、１日間に急速な［”Ｃａｌの流入か観察された。その後はより緩 慢な増加が認められた。酵素を含まないカルボジイミドで処理した対照シートは 、はとんど放射能を含まないままであった。ＡＰａｓｅ含有スライスは急速に硬 化し、７オン・コッサ（Ｙｏｎ　Ｋｏｓｓａ）法によって陽性に染色された。こ の鉱物は針状微結晶の形てキャリヤーのコラーゲン原線維と密に結合して沈着し 、　（Ｘｉ１口折によれば）ヒドロキシアパタイト様の特性を示した。

インビボ実憩　皮膚の創傷の治癒は重大ではなかった。再侵入処置に際して移植 部位を検査したところ、特にカルボジイミド処理移植片については周囲の組織が コラーゲンに冨み、炎症していないことか認められた。しかしグルタルアルデヒ ド処理移植片は、著しく血管化された、やや浮腫性の結合組織に囲まれている場 合が多かった。両方の種類の移植片とも、（ＡＰａｓｅ結合）ＤＤＳは１週間以 内で硬化し、不透明な外観を呈した。対照検体は軟雪であり、肉眼検査に際して 透明であった。

化学的分析により、ＡＰａｓｅ処理ＤＤＳによる鉱物の取り込みは移植後の初期 の段階で極めて急速であることが証明された。カルボソイミド処理検体について は経時的にさらに増加か起こった。線形回帰分析によれば、この増ｎ口はホスフ ェートについては統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。４週間後にカルボ ジイミド結合検体においては、ヒドロキシプロリンのμｇ当たりのカルシウム含 量は正常なつ／そうげ質に見られるものの約８０％であり、一方ホスフエート含 量は約６０％であった。

モルａ度で表すと、再鉱化されたぞうげ宵におけるＣ　ａ　／　Ｐ比は、カルボ ジイミド処理検体については約２．００、グルタルアルデヒド処理検体について は約１．８０であることが認められた。正常なウシぞうげ質においてはこの比は １７実施例１に記載した材料および方法を用いて、一連の移植片材料を調製した 。

結合剤は１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロビル）カルボンイミドであっ た。

雌ウィスターラット（それぞれ約２００ｇ）４０匹をバイブノルムで麻酔した。

来状縫合に平行に皮膚を切開した。右および左の頭頂骨を覆う皮膚を反転させて 、前頭から後頭頭載までの頭蓋を露出させた。来状、前頭および後頭縫合に沿っ て切開したのち、骨膜弁をいずれかの側へ持ち上げた。歯科用ハンドピースに取 り付けた低速回転トレフィンバ−（直径１．８ｍｍ）を用いて、頭頂骨それぞれ に約１．０−１５ｍｍの距離を置いて徹底的な骨折を２カ所形成した。外科処置 に際しての過熱を防ぐために、組織を生理食塩液で湿った状態に維持した。下部 の硬膜を物理的に損なわないように特別の注意を払った。

頭蓋のそれぞれの側の創傷１カ所を、それぞれ幅領　５ｃｍ、長さ０．８ｃｍの 大きさの移植片で覆った。右側にはＡＰａｓｅを含有するもの、左側には対照の もの（酵素を含有しない）を移植した。骨膜および皮膚を閉じた。動物を手術後 ３週間、６遍間、９遇問および１２週間の間隔で断頭により層殺した。頭蓋冠を 摘出し、Ｏ，１ｍｏｌ／Ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，４）中の４％バラホ ルムアルデヒドおよび】−％グルタルアルデヒドの溶液に２４時間浸漬した。検 体を１％　Ｏｓ　Ｏｎ中で後続固定し、エポキシ樹脂に包埋した。

頭蓋の各半分を、２カ所の創傷を同一平面で切断するように、頭蓋に対して直角 にミクロドーム上に配胃した。切片をメチレンブルーで、またはフォノ・コッサ 法に従って染色した。各検体より、２カ所の骨折の中心領域から１個のメチレン ブルー染色切片を採取し、組織形態測定分析に用いた。

ダイヤモンドナイフによって超薄形切片を切り取り、酢酸ウラニルおよびクエン 酸鉛で染色し、ツァイスＥＭＩＯＣ電子顕微鏡で検査した。

Ｗｔｌｉｆｆ−３Ｍａ’叫附近　選ばれた切片それぞれにつき、倍率×１７３の サインプリズムＣｓ１ｇｒ、ｐｒｉｓｍ）を用いてトレース試験を行った。Ｘ− Ｙデバイスを用いて各移植片の鉱化された領域を測定し、切断面において占める 全面積の％として表した。同様に移植片の厚さを評価し、新たに形成された骨と 直接に接触する長さを測定した。両方とも移植片の内面（頭蓋に面した側）およ び外面（皮膚に面したｍｑ）に沿ってなされた。

精麦 組織化学的検査により示されるように、酵素処理移植片のＡＰａｓｅ活性はそう げ質小管の壁およびシートの外面に結合していた。シートの全長に沿って同し染 色パターンが見られたという点で、活性の分布は均一であった。ＡＰａｓｅの不 在下で架橋剤と共にインキュベートされた対照シートの切片は、組織化学的染色 を示さなかった。ｐ−ニトロフェニルホスフェートの転化率に基づけば、酵素処 理コラーゲンシートはヒドロキシプロリンのμｇ当たり０．９５±０．２４ｍＵ の酵素を含有していた。

外科処置部位の治癒は、鏡検により評価して移植片を囲む組織の炎症反応が無視 しうる程度であったという点で、重大ではなかった。より詳細には、浮腫、赤変 および膨潤の徴候が見られなかった。固定後の移植片の鏡検およびビンセットに よる慎重な触診により、ＡＰａｓｅ含有移植片は硬化していたが、対照は柔軟な ままであることが明らかになった。

光学および電子顕微鏡検査により、被験移植片が実験の経過中に鉱物を蓄積した ことが証明された。移植後の最初の３週間以内に、それらの切断面の約５５％か 鉱物で占められた。その後鉱物の量はさらに約７０−８０％にまで、わずかな増 加を示した。鉱物を含まない状態のままであった領域は、移植片がそれを覆う骨 膜の結合組織と接触している縁であることが多かった。骨折を覆う部分の移植片 と無傷の骨を覆う部分の移植片との間には、鉱物密麿に顕著な差は認められなか った。

対照移植片には、９週間までは実質的な鉱化は検知されなかった。しかし外科処 置の１２週間後には、若干の対照検体か移植片に沿って多少ランダムに分布した 鉱化領域を含んでいた。平均してこれらの領域は移植材料の約２０％を占めてい た。

すへての場合、鉱物は移植片を構成するコラーケン笛原線維と密に結合した小さ な結晶として沈着していた。ぞうげ質小管は開放された状態のままであり、移植 片の縁に２台っだ部分では隣接する骨膜に鉱化物質の層は沈着していなかった。

軟骨形成の徴候も見られなかった。

移植片か鉱化されるのに伴って、多量のゴルシ体および粗面小胞体を含む骨芽細 胞か出現した。骨芽細胞層と移植片の鉱化部分との間に類骨および骨が沈着して いた。移植片と骨との結合強度については１１定を行わなかったが、鉱化した基 質中の切断性アーティファクトにより生した亀裂の向きが、ある程度の示唆を与 えた。それらは両者の境界線に沿ってはほとんと見られなかった。通常それらは 骨−移植片境界を通過していた。

これらの現象はすへて、頭蓋冠骨に面した酵素処理コラ−ケンシート内面に沿っ て特に顕著であった。頭蓋外骨膜層に面した外面に沿った部分には、骨が形成さ れたとしでもごくわずかであった。相関分析によれば、移植片の鉱化が増加する のに伴って内面に沿って骨と直接に接触する長さも増加する傾向にあることが示 された（相関係数ｒ＝０．５３．ｎ＝３７　；　ｐ＜０．００５）。

対照移植片の場合も、それらの鉱化度と新たに形成された骨に直接接触する長さ との間に正の相関が見られた（ｒ＝０．４５．ｎ＝３７；ｌ）＜０．ＯＬ＞。し かし移植片か骨と結合する程度は、頭蓋骨の実験側におけるものよりはるかに低 かった。これら両側間の差は、統計学的に有意であることが証明された（ｐぐ０ ０１）。

移植材料を囲む組織に炎症反応はほとんと見られなかった。より詳細には、０買 細胞か実雷的に存在せず、多形核白血球およびリンパ球はごく稀であった。しか し、移植片か新たに形成された骨に直接接触している部分以外は、移植片の表面 に沿ってマクロファーンおよび多核巨細胞が存在していたという点て、すへての 移植片か緩和な異物反応の証拠を示した。これは対照側についても実験側につい でもそうであった。移植片に沿った巨細胞の数は、実験側および対照側について ほぼ同しであり　（ウィルコクソン徴候ランク試験（Ｗｉ　Ｉｃｏｘｏｎ−ｓ　 ｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ　ｔｅｓｔ）、ｐ＞Ｑ、０５）、それらは移植片の鉱化 部分または非鉱化部分のいずれかに特異的に付随するものではなかった。

移植片に関連して多核巨細胞が存在するにもがかわらず、非鉱化領域または鉱化 部分のいずれにおいても移植片の著しい吸収は起こってぃなかった。これの証拠 は、移植片が実験中にそれらの全幅を保持しく３２μｍ）、吸収細胞力吠幅に侵 入してはいないという所見により得られた。ただし、ぞうげ買小管内へ深く貫入 した細胞質突起を伴う細胞が各所で見られた。鉱化した移植片のいずれにも、ひ たのある縁を示す破骨細胞は観察されず、またハウンップ凹窩は見られなかった 。

害奥刑旦 移植材料の鉱化を年齢、性別、移植部位、およびリン蛋白雪含量の関数として調 べたう 雄および雌のウィスターラント（５または２０週齢）を麻酔し、それらの体重を 測定した。次いで材料のシートを下記部位の皮下に移植した・頭蓋骨上（頭頂骨 および前頭骨）、背部下側領域、腹壁。対照スライスはＡＰａｓｅを含有しない か、または熱不活性化ＡＰａｓｅを含有していた。２週間後に動物を再秤量し、 断頭により層殺しく前進麻酔下に）、シートを取り出し、リン含量を分析した。

血清試料を無機ホスフェートにつきアクセイした。

林料」　２種類の材料につき試験した　一方は鉱物質除去し、かつグアニジン抽 出したウシそうげ貿がら作成され（これはなお若干の共有結合したぞうげ質ホス ホホリンを含有していた：０．０３５＝０．０１９μｇホスフェート／μｇバイ ブロ）、他方は鉱物質除去し、がっグアニジン抽出したウシ皮質（ｃａｒｔｉｃ ａｌ　ｂｏｎｅ）がら作成され（０，Ｏ０５＋０．００２５ａｇボスフェート／ μｇハイブロン。実施例１の記載に従ってスライスを調製した。

ＡＰａｓｅをＳＡＴＡ−ＭＨ５Ｍ合法に従ってコラーゲン實キャリヤー（主とし てタイプ■コラーゲノ）に結合させた。

Ａ：５ＡＴＡ（スクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート、／＜−ス（Ｐ ｉｅｒｃｅ’））をキャリヤーに結合させた１７５ｍｇのコラーゲンを５ｍｌの ０．０５Ｍホスフェート（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡおよび５００μｌのＳ ＡＴＡ（１５ｍｇ／ｍｌシメチルスルホキシド）中において室温で３０分間イン キュベートした。次いでコラーゲンシートをリン酸緩衝液で４回洗浄した。コラ −ケン−５ＡＴＡスライスをＡＰａｓｅ−ＶＨＳ（下記を参照されたい）に結合 させる直前に、スライスを５ｍｌの００５Ｍホスフェ　ｈ　（ｐＨ７，５）　、 １ｍＭ　ＥＤＴＡおよび５００μｌの脱アセチル化溶ｉ’ｌｌ［（１，７５ｇの ヒドロキシルアミン・ＨＣＩおよび０．４７５ｇのＥＤＴＡ、５０ｍ１の領　０ ５Ｍホスフェ　ｈ　（ｐＨ７，５）中）中において室温でインキュベートするこ とにより脱アセチル化した。２時間のインキュベーション後に溶液をデカントし た。

Ｂ：ＶＨＳ（マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ −スクシンイミシル−６−マレイトカプロエート、フル力（Ｆｌｕｋａ））をピ ーターズ（Ｐｅｅｔｅｒｓ）ら、（Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｉ［ｅｔｈｏｄｓ　１２ ０．１３３−１４３．１９８９）が述べた方法によりＡＰａｓｅに結合させた１ ０ｍｇのＡＰａｓｅ／ｍ１　０．０５Ｍホスフェート（ｐＨ８，０）に、１．５ ４ｍｇのＭＨ８／４０μｍツメチルホルムアミドを添加した。室温で５分間のイ ン本ユヘーション後に１ｍｌの０．０５Ｍホスフェート（ｐＨ６，０）を添加し 、マレイミド化されたＡＰａｓｅをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２ ５カラム（ｌｏｘｌｃｍ）によって、より小さな有機分子から分離した。カラム を０．０５Ｍホスフェート（ｐＨ６，０）で溶離し、１．５ｍｌずつの両分を採 取した。ＡＰａｓｅ活性を含有する画分（ホイト容量、ｖｏ　ｉｄ　ｖｏ　ｆｕ ｍｅ）をプールした（約４ｍ１）。

Ｃコラーゲン−３ＡＴＡスライスとＡＰ　ａ　ｓ　ｅ−ＶＨＳの反応脱アセチル 化コラーゲン−５ＡＴＡスライスに、０．０５Ｍホスフェート（ｐＨ６，０）中 のＡＰａｓｅ−ＶＨＳ　４ｍｌを添加し、スライスを室温で４時間インキュベー トした。次いでこの溶液をデカントし、スライスを実施例１の記載に従って洗浄 した。スライスを４℃のグリシン緩衝液中に保存した。ぞうげ質コラーゲンスラ イスは１，３６±０．２８ｍＵ　ＡＰａｓｅ／μｇ”イブ口、骨コラーゲンスラ イスは２．３９±０．４１ｍＵ　ＡＰａｓｅ／μｇノ１イプ口を含有この実験の 結果を図１にまとめる。用いたｇ己号は下記のとおりであった一〇−ぞうげ質／ 頭蓋骨　ＯＦ　高齢の雌−−ぞうげ質／腹　ＯＭ　高齢の雄 −△−骨／Ｉｌｌ　ＹＦ　若い雌 −＋−骨／頭蓋骨　ＹＭ　若い雄 結果は、コラ−ケンスライスの鉱化（Ｙ軸）か性別、年齢およびリン蛋白質（Ｐ Ｐ〕含量によって大幅に影響されたことを示す。特に骨由来のスライス（ＰＰ含 量か低い）はぞうげ百由来のスライス（ＰＰ含量が比較的高い）と比較してそれ らの鉱化度か著しく低いことが証明された。雄ラットは雌より高い鉱物取り込み を示した（ホスフェート含量により測定）。若い動物は高齢の動物より多量の鉱 物取り込みを示した。移植片の鉱化と血清中の無機ホスフェート濃度（Ｘ軸）と の間には高い相関が認められた。

種々の移植部位間にはわずかな差しか見られず、頭蓋骨におけるぞうげ質由来の スライスは、背および腹の場合よりわずかに高い鉱化度を示した。背部下側領域 と腹壁の間には差が見られなかった。

対照スライスはすべて、２週間の実験期間内では鉱物を含有しないままであった 。

ＩＧ　７ Ｐ；　、＝４　？（１７１１１０１八）補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年　１月７日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１２４７ ２、発明の名称 移植片材料 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドン、ニスイード６ビーユー。

ニューイントン・コーズウエイ　１０１名　称　ブリティッシュ・テクノロジー ・グループ・リミテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話　３２７０−６６４１〜６６４６ 氏名（２７７０）弁理士湯浅恭三 ５、補正書の提出日 ３４条補正 請求の節回 １、　材料の鉱化を促進するのに十分な量のホスファターゼ酵素と組み合わせた 、密にＷ４成された線維性Ｗ４造を有する生物適合性キャリヤー材料からなる、 骨格の修復に有用な材料。

２、ヒドロキシプロリン１．　Ｏμｇ当たり少なくとも０．５ｍＵのホスファタ ーゼの酵素活性を示すことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の材料。

３、ヒドロキシプロリン１．０μｇ当たり少なくとも１．０ｍＵのホスファター ゼの酵素活性を示すことを特徴とする請求の範囲第２項に記載の材料。

４　ホスファターゼ酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求 の範囲第１項、第２項または第３項に記載の材料。

５　さらに、結合した有機もしくは無機のホスフェート、リン蛋白質および、／ またはぞうげ雷ホスホホリンを含むことを特徴とする請求の範囲第１１項ないし 第４項のいずれかに記載の材料。

６、　キャリヤー材料がヒドロキシプロリンのμｇ当たり少なくとも０．０３μ ｇのホスフェートを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいず れかに記載の材料。

７、　生物適合性キャリヤー材料が、石灰化したヒトまたは動物組織の鉱物質除 去により調製されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項 のいずれかに記載の材料。

８、キャリヤーが少なくとも実質的割合の原線雄性コラーゲンからなることを特 徴とする請求の範囲第７項に記載の材料。

９、　キャリヤーが鉱物質除去されたぞうげ雷または鉱物質除去された骨からな ることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の材料。

１０、少なくとも２００Ｕのホスファターゼ／ｃｍ’を含むことを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第９項のいずれか項に記載の材料。

１１　ホスファターゼ酵素がキャリヤーに共有結合していることを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載の材料。

１２、生物適合性キャリヤーおよび酵素を多官能性結合剤の溶液中で、所望によ り有機リン化合物の存在下に、かつ／またはカルシウムおよび無機ホスフェート イオンの存在下にインキュベートし、それぞれの場合キャリヤー材料中に存在し うるいずれかに追加されることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の材料の 製造方法。

１３、材料の鉱化を促進するのに十分な量のホスファターゼ酵素と組み合わせた 、密に構成された線維性Ｗ４造を有する生物適合性キャリヤー材料からなる、骨 格の修復に用いられる造形された移植用材料。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．材料の鉱化を促進するのに十分な量のホスファターゼ酵素と組み合わせた生 物適合性キャリヤー材料からなる、骨格の修復に有用な材料。
2. ２．ヒドロキシプロリン１．０μｇ当たり少なくとも０．５ｍＵのホスファター ゼの酵素活性水準を示すことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の材料。
3. ３．ヒドロキシプロリン１．０μｇ当たり少なくとも１．０ｍＵのホスファター ゼの酵素活性水準を示すことを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の材料。
4. ４．ホスファターゼ酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする、請 求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の材料。
5. ５．ホスファターゼ酵素がキャリヤーに共有結合していることを特徴とする、請 求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の材料。
6. ６．結合が多官能性結合剤を用いて行われることを特徴とする、請求の範囲第５ 項に記載の材料。
7. ７．結合剤がグルタルアルデヒド、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミドおよびＳＡＴＡ−ＭＨＳ（スクシンイミジル−Ｓ−アセチル チオアセテートおよびマレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニド）よ りなる群かり選ばれることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の材料。
8. ８．結合剤がＳＡＴＡ−ＭＨＳであることを特徴とする、請求の範囲第７項に記 載の材料。
9. ９．さらに、結合した有機もしくは無機のホスフェート、リン蛋白質および／ま たはぞうげ質ホスホホリンを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第 ８項のいずれかに記載の材料。
10. １０．ヒドロキシプロリンのμｇ当たり少なくとも０．０３μｇのホスフェート を含むことを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の材料。
11. １１．キャリヤー材料がヒドロキシプロリンのμｇ当たり少なくとも０．０３μ ｇのホスフェートを本来含むことを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の材料 。
12. １２．追加量の有機ホスフェート、リン蛋白質またはぞうげ質ホスホホリンがキ ャリヤー材料と結合していることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の材料 。
13. １３．追加量のカルシウムイオンおよび無機ホスフェートがキャリヤー材料と結 合していることを特徴とする、請求の範囲第９項ないし第１１項のいずれかに記 載の材料。
14. １４．生物適合性キャリヤー材料が、石灰化したヒトまたは動物組織の鉱物質除 去により調製されたものであることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第１ ３項のいずれかに記載の材料。
15. １５．キャリヤーが少なくとも実質的割合の原線維性コラーゲンからなることを 特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の材料。
16. １６．キャリヤーが鉱物質除去したぞうげ質からなることを特徴とする、請求の 範囲第１項ないし第１５項のいずれかに記載の材料。
17. １７．キャリヤーが鉱物質除去した骨からなることを特徴とする、請求の範囲第 １項ないし第１５項のいずれか項に記載の材料。
18. １８．少なくとも２００Ｕのホスファターゼ／ｃｍ３を含むことを特徴とする、 請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれか項に記載の材料。
19. １９．生物適合性キャリヤーおよび酵素を多官能性結合剤の溶液中でインキュベ ートすることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第１８項のいずれかに記載 の材料の製造方法。
20. ２０．多官能性結合剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする、請求の範 囲第１９項に記載の方法。
21. ２１．多官能性結合剤が１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミドであることを特徴とする、請求の範囲第１９項に記載の方法。
22. ２２．生物適合性キャリヤーをスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート の溶液中でインキュベートし、かつ酵素をマレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドと共にインキュベートし、そしてこのキャリヤーと酵素を反 応させることを特徴とする、請求の範囲第１９項に記載の方法。
23. ２３．インキュベーションが追加量の有機ホスフェート化合物の存在下で実施さ れることを特徴とする、請求の範囲第８項ないし第２２項のいずれかに記載の方 法。
24. ２４．有機ホスフェート化合物がリン蛋白質またはぞうげ質ホスホホリンである ことを特徴とする、請求の範囲第２２項に記載の方法。
25. ２５．インキュベーションがカルシウムおよび無機ホスフェートイオンの存在下 で実施されることを特徴とする、請求の範囲第８項ないし第２３項のいずれかに 記載の方法。
26. ２６．請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれかに記載の材料からなる移植片 を挿入することよりなる、骨の鉱化および成長を促進するために動物の骨格を処 直する方法。
27. ２７．移植片を挿入する付近の有機リン化合物濃度を体外の供給源から補充する ことを特徴とする、請求の範囲第２６項に記載の方法。