JPH06505258A - 軟骨損傷の治療のための成長因子含有マトリックス - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 軟骨損傷の治療のための成長因子含有マトリックス発明の技術分野 本発明は、軟骨中の欠損あるいは損傷の治療および修復に関する。より詳細には 、本発明は、軟骨中の欠損あるいは損傷（本明細書中では互換可能な用語として 使用している）を治療する方法、および、新しい安定した軟骨組織を形成するた めに修復細胞の増殖を促進する１種類あるいはそれ以上の増殖因子を含む生分解 性マトリックスを含有する組成物に関する。

本発明の組成物および方法は特に、変形性関節症、並びに軟骨傷害を引き起こす 他の疾患および外傷の治療に有用である。

！基反恵 関節は、骨格中の複数の骨を連結する一般的な手段の−っである。正常な関節を 有する骨の末端は、関節軟骨組織で覆われており、これによって、複数の骨が互 いに他に対して実質的な摩擦無しに動くことができる［Ｌ、　ＷｅＩｓｓ！１Ｍ 、　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄＴｉｓｓｕｅ　Ｂｉｏｉｏ　（Ｍｕｎｃｈｅｎ：　Ｕｒｂ ａｎ　ａｎｄ　Ｓｃｈｖａｒｚｅｎｂｕｒｇ、　１９１１８＞　１）、　２４７ ］。

関節軟骨は、独特の構造組織で特徴付けられる。関節軟骨は、細胞間物質（文献 では、しばしば「軟骨マトリックス」とも呼ばれている）の内部に存在する特殊 化細胞（軟骨細胞）により構成される。細胞間物質は、プロテオグリカン、ＩＩ 型が主体のフラーゲン原線維、他のタンパク質および水を多く含有ｅ　Ｓｕｒｇ ｅｏｎｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、１９８７）中の、ｐ、４６５、Ｂｕｅｋｖａｌ 　ｔｅｒらの＋Ａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｃａｒｔｆｌａｇｅ：　Ｉｎｊｕｒｙ　ａ ｎｄ　Ｒｅｐａｉｒ−］。軟骨組織には、神経分布が無く、しかも血管系および リンパ系も通っていない。しかし、成人の成熟関節では、その下に存在する軟骨 下の骨組織が、骨組織と軟骨との間に狭い連続したプレートを形成し、この肋軟 骨下骨組轍には、神経および血管が分布している。この骨プレートの下で、骨組 織が、骨髄を包含する複数の小柱を形成している。未成熟関節では、関節軟骨の 下には、−次骨小柱のみが存在する。関節中の半月組織の一部もまた、関節軟骨 に類似し、た構造を有する軟骨により構成されている［Ｂｅａｕｐｒｅ、　Ａ、 ら、Ｃｌ１ｎ、　０ｒｔｈｏ　、　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、、　ｐｐ、　７２−７６ 　（１９８６）］。

軟骨組織には、２つの種類の欠損あるいは損傷が存在することが認めらでいれる 。即ち、全層性欠損および表層性欠損である。これらの欠損は、軟骨に対する物 理的な傷害の程度のみでな・（、各種類の損傷が誘起し得る修復反応の性質も異 なる。

全層性欠損は、軟骨下の骨にまで到達し、ひどい痛みを引き起こし得る。骨プレ ートが知覚神経末端を含んでいるためである。このような欠損は一般に、ひどい 外傷によって発生するか、あるいは、変形性関節症などの変性性関節疾患の後期 に発生する。全層性欠損は、場合によっては、出血および軟骨下の骨からの修復 反応を誘起し得る［Ａｒｔｆｃｕｌａｒ　Ｃａｒｔｉｌａｅ　ａｎｄ　Ｋｎｅｅ 　Ｊｏｉｎｔ　Ｐｕｎｃｔｔｏｎ：　Ｂａ５ｉｃ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ａ ｒｔｈｒｏｓｃｒ２Ｂ−（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９ ９０）中の、Ｉ）Ｉｌｌ、１９−５６、Ｂｕｃｋｗａｌ　ｔｅｒらの、−Ａｒｔ ｉｃｕｌａｒ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ：　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、５ｔｒｕｅｔ ｕｒｅ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｉｎｊｕｒｙ、　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ　Ｒｅｐａｉｒ”］。形成された修復組織は 、不十分な生体力学特性を有する血管の分布した線維性タイプの軟骨であり、長 期間存続するものではない［Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒら、（１９９０）、前出］。

関節軟骨組織中の表層性欠損は、軟骨組織自体内に限定されている。このような 欠損は、治癒することがなく、しかも修復反応を誘起する性質も示さないため、 たちが悪い。

これらの表層性欠損は軟骨表面に、裂は目、穴あるいは裂溝として出現し得るか 、あるいは傷害を受けた組織中で「カニ肉（ｃｒａｂ−＋ｗｅａｔ）　Ｊ様の外 観を有し得る。これらの表層性欠損は、全層性欠損で見られるような出血する血 管（血斑）を含有しない。表層性欠損は、原因不明の場合もあるが、多くの場合 、軟骨組織の摩滅をもたらす機械的障害から生じる。機械的障害は、関節への外 傷、例えば、剥離した半月組織の関節への変位、半月切除、剥離した靭帯による 関節の弛緩、関節の不整合、あるいは骨折によって、または、遺伝性疾患によっ て生じ得る。表層性欠損はまた、変形性関節症などの変性関節疾患の初期の特性 である。軟骨組織には神経分布が無く［Ｈａｌｓ　Ｈｉｓｔｏｌｏ　（第９版） （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：　Ｊ、Ｂ、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ、　１９８ ７）　ｐｐ、　２６６−２７２１、しかも血管分布も無いために、表層性欠損は 痛みを伴わない。しかし、無痛ではあっても、表層性欠損は治癒せず、そして多 くの場合、変性して全層性欠損となる。

関節軟骨は血管系を持たないので、傷害を受けた軟骨組織は、修復反応を誘起す るのに十分なあるいは適切な刺激を受けないと一般に考えられている［Ｗｅｂｂ ｅｒら、−Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　Ｒｅｐａｉｒ　Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏ ｆ　Ｒａｂｂｉｔ　Ｍｅｎｉｓｃａｌ　Ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ：　Ａ　 Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｏｄｅｌ”　（３０ｔｈ　Ａｎｎ、　０ｒｔｈｏ ｐ、　Ｒｅｓ、　Ｓｏｃ、、　Ａｔ１ａｎｔａ、１９８４年２月）　ＨＷｅｂｂ ｅｒら、Ｊ、Ｏｒｔ　ｏ　、Ｒｅｓ、、３−、ｐｐ、３６−４２　（１９８５） ］。軟骨組織中の軟骨細胞は、傷害を受けた血管分布組織中に典型的に存在する 増殖因子およびフィブリンクロット等の十分な量の修復刺激因子に、通常は曝さ れていないと理論付けて説明されている。

傷害を受けた軟骨組織を修復刺激に曝すために使用されてきた一つのアプローチ は、軟骨から軟骨下の骨の中まで穴を開けるかまたは削り、出血させる工程を含 む（Ｂｕｃｋｖａｌｔｅｒら、（１９９０）、前出］。残念ながら、このような 外科的処置による外傷に対する組織の修復反応は通常、出血を引き起こす全層性 欠損で自然に起こるのが観察される修復反応と同等の反応である。即ち、不十分 な生体力学特性を示し、かつ長期間存続しない線維性タイプの軟骨が形成される ［Ｂｕｃｋｖａｌｔｅｒら、（１９９０）、前出］。

種々の増殖因子が単離され、研究および生物医学用に現在入手可能である［例え ば、Ｒｉｚｚｉｎｏ、　Ａ、、Ｄｅｗ、　Ｂｉｏｌ、、　１３０．　Ｉ）ｐ、　 ４１１−２２　（１９８ｇ）を参照］。これらの成長因子のうちの幾つかは、例 えばトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の様な、インビトロのラッ ト胚間葉細胞中で、ＩＩ型コラーゲンおよび軟骨特有のプロテオグリカンなどの 軟骨特有の分子の形成を促進すると報告されている［例えば、５ｅｙｅｄｉｎら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８２．　ｐｐ、２２６７ −７１　（１９８５）；　５ｅｙｅｄｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、山、 ｐｐ、５６９３−９５　（１９８６）；　５ｅｙｅｄｉｎら、Ｌ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｌｌ、、　２６２．　ｐｐ、　１９４６−１９４９　（１９８７）］。

何百万人もの患者が、変形性関節症、即ち関節軟骨中に変性性欠損あるいは損傷 を有していると診断されている。しかし、傷害を受けた軟骨中に修復反応を誘起 するための種々の方法が主張されてたが、これらの治療法は何れも実質的には利 用されていない［Ｂｕｃｋｖａｌｔｅｒら（１９９０）、前出ＨＫｎｕｔｓｏｎ ら、Ｊ、　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒ　、、皿、ｐ、　７９５　（ １９８６）ＨＫｎｕｔｓｏｎら、ムーＢｏｎｅ　ａｎｄ　Ｊｏｉｎ上」エムり、 ６７−Ｂ、ｐ、４７　（１９８５）；　Ｋｎｕｔｓｏｎら、釦ニルー立已上剋り 、１９１．　ｐ、２０２　（１９８４）　；　Ｍａｒｑｕｅｔ、虹匂Ｌ」欣１垣 ルエ、■、ｐ、　１０２　（１９８０）］。そして、このような治療法は、一般 に、一時的な軽減をのみ提供していた。「軟骨保護剤」の全身投与もまた、変形 性関節症の進行を阻止し、痛みの軽減を誘起すると主張されている。しかし、こ のような薬剤が軟骨組織中の損傷あるいは欠損の修復を促進することは示されて いない。

現在まで、変形性関節症を患う患者の治療は、鎮痛薬および抗炎症薬の使用によ って症状を軽減することに主眼が置かれいる。関節軟骨の表層性欠損の修復を誘 起する治療を行わなければ、多くの場合、軟骨が、軟骨下の骨プレートまで摩滅 してしまう。この疾患のこの段階、即ち、重症の変形性関節症では、痛みは軽減 しない性質であり、そして顕著な機能低下によって、多くの場合関節全体を切除 し、金属および／またはプラスチックの人工関節に交換しなければならない。関 節を切除して人工関節に交換する処置は、膝および股関節部に関して現在年間約 ５０万件行われている［例えばＧｒａｖｅｓ、　Ｅ、Ｊｌ、ｒ１９８８　Ｓｕｍ ｍａｒｙ；　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ　５ｕ ｒｖｅｙＪ、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄａｔａ　Ｆｒｏｍ　Ｖｉｔａｌ　ａｎｄ　Ｈ ｅａｌｔｈ　５ｔａｔｉｓｔｉｃｓ、　１８５゜ｐｐ、　１−１２　（１９９０ 年６月１９日）参照Ｊ０したがって、安定した軟骨の修復および再生を誘導し、 かつ表在性軟骨欠損あるいは損傷が重症の変形性関節症へ進行することを防止す る、信頼性の高い軟骨欠損治療法が必要とされている。

産朋ｙ口Ｌｔ１ 本発明は、ヒトおよび他の動物の軟骨の損傷の修復を誘起するために有効な治療 方法および組成物を提供することによって、上記の問題を解決する。本発明の方 法および組成物を使用することによって、さらに、外傷性の損傷および初期の形 態の変形性関節症の進行が阻止される。これらは、その進行が阻止されない場合 には、軽減されない痛みと有効な関節機能の喪失を伴う重症の変形性関節症をも たらし、これによって、おそらくは関節の切除および交換を行うことになる。

一般的な概要として、軟骨欠損を修復する本発明の方法は、軟骨中の欠損に本発 明の組成物を充填するか、あるいは軟骨中の欠損を本発明の組成物で覆うことを 包含する。本発明の組成物は、（１）生分解性マトリックスあるいはマトリック ス形成物質、（２）マ）　ＩＪフックスよび欠損領域中の修復細胞の増殖を促進 する増殖因子、および、ある実施態様では、（３）修復細胞をマトリックスおよ び欠損領域に誘引するための化学遊走因子、および（４）適切な送達システム中 のトランスフォーミング因子を含有する。この送達システムによって、トランス フォーミング因子が適切な時点で放出され、これにより、マトリックスあるいは 欠損領域中の修復細胞の、軟骨細胞への分化（即ち形質転換）が促進される。こ の軟骨細胞が、新しい安定した軟骨組織を生産する。あるいは、トランスフォー ミング因子を、適切な時点で別個に欠損部位に添加し得る。

軟骨の治療は、本発明の方法を使用した単一の関節鏡検査手順あるいは外科手術 手順で行われ得る。本発明の特定の方法によれば、欠損を確認した後に、（１） 欠損領域に酵素を充填し、この酵素によって欠損表面に存在するプロテオグリカ ンを分解する工程、（２）酵素を除去する工程、および（３）マトリックス、増 殖因子および適切な送達システム中のトランスフォーミング因子を含有する組成 物で欠損を覆う工程によって、欠損の治療を行う。

及里ρＪ」１引ｌ吸 本発明に対してさらに十分な理解を得るために、以下に詳細な説明を行う。説明 において、以下の用語を使用する。

Ｋ靴旌墓ｌ一本明細書では、関節鏡を用いて関節を検査するかまたは関節に対し て外科的処置を施すことを指す。

■一本明細書では、細胞間物質（「軟骨マトリックス」と称することが多い）中 に存在する軟骨細胞を含有するあるタイプの結合組織を指す。この細胞間物質は 、コラーゲン（主に■■型コラーゲンであり、他の少数の型、例えばＸｌ型およ びＸｌ型を伴う）原線維、種々のプロテオグリカン（例えば、フンドロイチン硫 酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸プロ テオグリカン）、他のタンパク質および水を含有する。本明細書中で使用する用 語「軟骨」は、関節軟骨および半月軟骨を含む。関節軟骨は、骨の、関節内に存 在する部分の表面を覆い、骨と骨とが直接接触することなく関節内で動くことを 可能にし、そしてこれによって、対向する骨の表面の摩滅および傷害を防止する 。大部分の正常かつ健康な関節軟骨はまた、「ヒアリン」、即ち、くもりガラス のような特徴的な外観を有していると説明される。半月軟骨は、通常、運動に加 えて震動も受ける関節中に見られる。

半月軟骨のこのような位置には、顎関節、胸鎖関節、側鎖関節、撓骨手板関節お よび膝関節が含まれる［Ｇｒａ　’ｓ　Ａｎａｔｏ＋ａ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　 Ｂｏｕｎｔｙ　Ｂｏｏｋｓ、　１９７７）］。

１１艮豊促皇凰玉一本明細書では、フィブロネクチン、および、ト・リペプチド Ａｒｇ−Ｇｌｙ・Ａｓｐを含有するテｌ−ンベブ−デドと同じ大きさの他のペプ チドを含む任意の化合物あるいは組成物を指す。これは、細胞外物質に細胞を接 着さｌ−るための媒介となる［Ｒｕｏｓｌａｔｈｉら、如月１、口、ｐｐ、　５ １７−５１８　（１９１１６）］。

止主１１■ニ一本明細書では、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質およびグリ コサミノグリカン鎖を含む任意の化合物あるいは組成物を指（７、標準的なイン ビトロでの化学遊走アッセイで細胞を誘引することができる［例えば、Ｗａｈｌ ら、ｒｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ｔｌｓＡ、　８４．　ｐ ｐ、　５７８Ｂ−９２（１９８７）；　Ｐ。

５ｔｌｅｖａｉｔｅら、ム一旦ムＬ」１世、、１６５．　ｐｐ、２５１−５６　 （１９ｇ？）；　Ｍ。

ｏｒｅら、　Ｉｎｔ　Ｊ、Ｔｉ５ｓ、Ｒｅ　ｃ、、７．１．　ｐｐ、３０１−０ ７　（１９８９）］。

蚊１１一本明細書では、軟骨組織の成分、例えば、Ｉｌ型軟骨性原線維および線 維およびプロテオグリカンを生産することができる細胞を指す。

泉肌Ｗ掩息１里に−ｆ　（ＦＧＦ）−天然、合成あるいは組換え起源により得ら れる、ＦＧＦポリペブチｌ−′のファミリーの任意のメンバー［Ｇｉｍｅｎｅｚ −Ｇａｌｌｅｇｏら、Ｂｉｏｃｂｅｍ＝Ｗ訪ＬＬ−Ｒｅ−し−−ｑ卯鮭１．−れ は、種々の細胞のインビトロでのＤＮＡ合成および細胞分裂［アッセイに関して は、例えば、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌ　Ｉｅｇｏら、１９８６、前出；　Ｃａｎ ａｌｉｓら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８１．　ｐｐ、１５７２−１５７ ７　（１９８８）を参照］を刺激する能力を呈する。これらの種々の細胞には、 −次線維芽細胞、軟骨細胞、血管および角膜内皮細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、平 潮筋およびグリア′細胞が含まれる［■ｈｏｍａｓら、１９８６、前出］。１（ ｆｆＦは、その５１１点（ｐｉ）Ｅよッテ、酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）あるいは 塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）に分類され得る。

＝７１．　ｔユ！−４一本明細書では、多孔性複合体、即ち、細胞がこのマトリ ックス中（ζ集まるだ６）の十分な大きざの孔あるいは空間を持つ固体あるいは 半固体の生物分離性物質を指す。

用語マトリックスは、マトリックス形成物質、即ち、軟骨中の欠損部位内にマト リックスを形成することができる物質を包含する。マトリックス形成物質は、マ トリックスを形成するために重合剤の添加を必要とし得る。例えば、ブイプリン マトリックスを形成するために、フィブリノ−・ゲンを含有する溶液にトロンビ ンを添加することなどが必要となり得る。

ｉｔυ丙−ｉ一本明細書では、インビトロで細胞の増殖を刺激することができる 、ペプチド、タンパク質および糖タンパク質を含有する任意の化合物あるいは組 成物を指す。ペプチド、ポリペプチドおよび他の化合物の増殖（有糸分裂促進） 活性を決定するインビトロでのアッセイは、当該分野で周知のものである［例え ば、Ｃａｎａｌｉｓら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｇｔ、、ｐｐ、１５７２− ７７　０９８８）：　ＧｉＩＩＩｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏら、Ｂｉｏｅｈｅｍ 。

Ｂｔｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗ＋＋ｉｕｎ、、　ｕｉ、　ｐｐ、　５４１ −５４８　（１９８６）；　Ｍｅｔｈ部１」ｌｕｌ江、、■ｕ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７）中の、ｐｐ、３４１−５２、 　ＲｆｚｚｉｎｏのＩ”５ｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ａｓ５ａｙｓ　ｆ ｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍ ｔｔｏｇｅｎｉｅ　ＰｅｐｔｉｄｅｓＪ　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ 、、１４６Ａ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９ ８７）中の、Ｉ）＋１．　３２９−４０、ＤｆｃｋｓｏｎらのｒＡｓｓａｙ　ｏ ｆ　Ｍｉｔｏｇｅｎ−ｆｎｄｃ＋ｃｅｄ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　Ｃｅ１ｌｕｌ ａｒ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｆｏｒＳｃ ａｖｅｎｇｅｒｓ、　ｄｅ　Ｎｏｖｏ、　ａｎｄ　Ｎｅｔ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓＪ参照］。化合物あるいは組成物の増殖（有糸分裂促進性）活性を決定 するための一つの標準的な方法は、軟寒天中の非形質転換細胞の足場非依存性増 殖を誘起する能力を調べる７ノセイをこの化合物あるいは組成物に対して行うこ とである［例えばＲｉｚｚｉ、ｎｏ、１９８７、前出〕。他の有糸分裂促進活性 アッセイシステムもまた知られている［例えば、Ｇ　ｉ＋＊ｅｎｅｚ−Ｇａ　ｌ 　ｌｅｇｏら、１９８６、前出；Ｃａｎａｌｉｓら、１９８８、前出；　Ｄｉｃ ｋｓｏｎら、１９８７、前出］。

ｍ−一本明細書では、適切な刺激を受けると、分化し、そして形質転換されて軟 骨細胞となる細胞を指す。修復細胞には、開票細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様 細胞、マクロファージおよび脱分化軟骨細胞が含まれる。

トランスフォーミング　一本明細書では、修復細胞の軟骨細胞への分化を誘導す る、任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の任意の化合物あるい は組成物を指す。

細胞による軟骨特有のプロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの産生を誘起あ るいは刺激する化合物あるいは組成物の能力は、当該分野で既知のインビトロで のアッセイによって決定され得る［３６ｙｅｄｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２゜ｐｐ、２２６７−７１　（１９８５ ）；　５ｅｙｅｄｉｎら、Ｐａｔｈ、［ｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｓ、、Ｌｐｐ、　３ ｇ−４２（１９８７ンコ。

トランスフォーミング　囚　Ｗ−天然、合成あるいは組換え起源により得られる 、ＴＧＦ−βポリペプチドの〕ｙミＪ−（７）任意のメンバー［Ｄｅｒｙｎｃｋ 、　Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１１ｉ、　ｐｐ、　７０１−７０５　（１９８ ５）；　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　ｒｏｖｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎ　ｔｈｅｉｒ　ｒ ｅｆｉユ（Ｂｅｒｌｉｎ：　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、１９９０）中の 、ｐ、４１９、Ｒｏｂｅｒｔｓらのｒ　Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒ＋ｍｉｎｇ　 ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β′Ｓ」］あるいはその誘導体を指し、軟寒天ア ッセイで正常なラット腎臓（ＮＨＫ）細胞を成長させてコロニーを形成する特有 のＴＧＦ−β能力を示し［Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８４、前出］、しかも、修復 細胞の軟骨細胞への形質転換を誘導することができる。この形質転換の誘導は、 インビトロで細胞による軟骨特有のプロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの 生産を誘起あるいは刺激する能力によって証明されている通りである［５ｅｙｅ ｄｉｎら、１９８５、前出］。

本発明は、軟骨の欠損あるいは損傷を治療するための組成物および方法に関する 。本発明の組成物は、生分解性マトリックスを含有する。この生分解性マトリッ クスは、このマトリックス中に修復細胞が集まるだけの十分な大きさの孔を有す る。マトリックスは、さらに、このマトリックス中の修復細胞の増殖を刺激する 増殖因子を含有する。好ましくは、この増殖因子はまた、修復細胞をマトリック スに誘引する化学遁走因子としても作用する。あるいは、マトリックスは、増殖 因子に加えて化学遊走因子を含有し得る。本発明の好ましい一実施態様において 、マトリックスは、さらに、適切な濃度ノドランスフォーミング因子を含有する 。このトランスフォーミング因子は、送達システム内に、あるいはこの送達シス テムに組込んで含有される。送達システムは、適切な時点でトランスフォーミン グ因子を放出し、これによって、マトリックス中の増殖した修復細胞を軟骨細胞 に形質転換する。

軟骨細胞は、安定した軟骨組織を生産する。マトリックスは、さらに、細胞接着 促進因子を含有し得る。

軟骨中の欠損を満たすか、あるいはこれを覆うための本発明の方法および組成物 に有用なマトリックス物質には、フィブリノーゲン（トロンビンにより活性化さ れることによって、欠損あるいは損傷中にフィブリンを形成する）、コラーゲン 、セファロース、ゼラチン、および他の任意の生分解性物質が含まれる。但し、 この任意の生分解性物質は、修復細胞がマトリックス中に集まって増殖し得るだ けの十分な大きさの孔を有するマトリックスを形成し、かつ修復過程中で分解さ れて軟骨と入れ代わることができるものである。

本発明の組成物および方法に有用なマトリックスは、予め形成され得るか、ある いはｉｎ　５ｉｔｕで形成され得る。この形成は、例えば、フィブリノーゲンな どの化合物および組成物を重合してフィブリンマトリックスを形成することによ って、行われる。予め形成され得るマトリックスには、コラーゲン（例えばコラ ーゲンスポンジおよびコラーゲンフリース）、化学的に改変されたコラーゲン、 ゼラチンビーズあるいはゼラチンスポンジ、セファロースなどのゲル形成物質、 生分解性マトリックス物質により構成される他の任意のゲル形成あるいは複合物 質、またはこれらの混合物が含まれる。この生分解性マトリックス物質は、欠損 を満たし、そして修復細胞がこのマトリックス中に集まる。

本発明の好ましい実施態様では、マトリックス形成物質、好ましくはフィブリノ ーゲン溶液を用いてマトリックスを形成する。このフィブリノーゲン溶液には、 これを使用する少し前に、重合を開始させるためにトロンビンを添加する。水性 バ・ツファー溶液に溶解した０、５−５　ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン溶液を 用い得る。好ましくは、水性バッファー溶液に溶解した１冒ｇ／■ｌのフィブリ ノーゲン溶液を用いる。このフィブリノーゲン溶液を欠損領域中で重合すると、 十分な大きさく例えば約５ｏ−ｚｏｏμｌ）の孔を有するマトリックスが生産さ れ、これによって、修復細胞が、自由にマトリックス中に集まり、そして、増殖 してマトリックスが占める欠損体積を満たす。好ましくは、重合が完了する前に 外科医が欠損領域中にこの物質を堆積するだけの十分な時間を与えるために、十 分な量のトロンビンを使用の少し前にフィブリノーゲン溶液に添加する。

典型的には、トロンビン濃度を、重合が２−３分から数分（２−４分）以内に完 了するような濃度とするべきである。なぜならば、軟骨を長時間空気にさらすと 、傷害が生じることが明らかになっているからである［Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ 、　Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒ　、。

出、　Ｉ）Ｉ）、　８９−９５　（１９８９）］。過剰な量のトロンビンは使用 すべきではない。なぜならば、トロンビンは、成長因子の分子を開裂して、これ らを不活性化する能力を有しているからである。フィブリノーゲン溶液に添加す るために、水性バッファー溶液に溶解した１０−５００ユニット／ｍｌのトロン ビン溶液、好ましくは水性バッファー溶液に溶解した１００ユニツト／＋ｗｌの トロンビン溶液を調製し得る。本発明の好ましい実施態様では、１　ｍｌのフィ ブリノーゲン溶液（ｌ　ｍｇ／ｍｌ）に対してトロンビン（１ｏｏ　Ｕ／■ｌ） を約２０μｌの割合で、欠損に充填するより約２００秒前に混合する。より低濃 度のトロンビンを添加すると、生じる重合の速度はより遅くなる。２−４分以内 でフィブリン重合を行うために必要なトロンビン溶液の量は、環境温度、トロン ビン溶液の温度、フィブリノーゲン溶液の温度などに左右されるために、近似値 的な概数としてのみ提示され得ることは理解されるであろう。欠損を満たしてい る、トロンビンにより活性化されたマトリックス溶液の重合は、フィブリノーゲ ン溶液の外部試料の、トロンビンにより誘導された重合を観察することによって 、容易にモニターされ得る。本発明の組成物および方法では、フィブリンマトリ ックスを、オートロガスフィブリノーゲン分子、即ち、治療する種と同じ哺乳動 物種の血液由来のフィブリノーゲン分子から形成するのが好ましい。同じ種の非 免疫原性フィブリノーゲンもまた使用し得る。

コラーゲンをマトリックス物質として使用すると、十分に粘度の高い溶液を作る ことができる。その際には、例えばＣ。

１１ａｇｅｎ−１／１ｉｅｓｓ＠（ｒフリース」）あるいはゼラチンと血液との 混合物を使用し、重合剤を使用する必要はない。コラーゲンマトリ、クスを、重 合剤で活性化されたフィブリノーゲン溶液と共に用いて混合マトリックスを得る ことも可能である。

重合剤はまた、他の生分解性化合物を使用してマトリックスを形成する場合にも 、不要となり得る。例えば、セファロース溶液を選択し得る。セファロース溶液 は、３９−４２℃で液体マトリックス溶液となり、３５−３８℃で固体（例えば ゲル状）になる。さらに、セファロースの濃度を、軟骨欠損を満たしているゲル が、修復細胞が自由にマトリックスおよび欠損領域中に集まり得るメ・ｙシュサ イズを持つような濃度としなければならない。

本発明の組成物では、１種類あるいは複数種類の増殖（有糸分裂促進性）因子を マトリックス溶液に添加し得る。１種類あるいはそれ以上の増殖因子は、欠損を 満たしているマトリックス中の修復細胞に増殖効果をもたらすような濃度範囲で 存在していなければならない（実施例の項を参照）。好ましくは、この同じ因子 が、（ＴＧＦ−βの場合と同様に）細胞に対して化学遊走効果も与えなければな らない。しかし、増殖効果のみを有する因子を使用してもよい。あるいは、化学 遊走による細胞移入を生じさせて、次いで細胞増殖を誘導するためには、各々が これらの特異的効果のうちの一つのみ（化学遁走あるいは増殖性）を持つ２種類 の因子を使用し得る。

修復細胞の増殖を刺激するための本発明の組成物および方法に有用な増殖（有糸 分裂促進性）因子には、ＴＧＦ−α類およびＴＧＦ−β類などのトランスフォー ミング増殖因子（「ＴＧＦ類」）、インスリン様増殖因子（ｒｌＧＦ　ＩＪ　） 、酸性あるいは塩基性腺維芽細胞増殖因子（ｒＦＧＰ類」）、血小板由来の増殖 因子（ｒｒ’ＤＧＦｌ）、表皮細胞成長因子（ｒＥＧＦＪ）、およびインター口 ・イキン３（１’１Ｌ−３１）などの造血性増殖因子が含まれる［Ｒｔｚｚｊｎ ｏ、１９８７、前出ＨＣａｎａｌｉｓら、前出・、１９８＋１　；　Ｇｒｏｒｔ ｈ　ｊａｅｔｏｒｌ、１３ｉｊｏｌｏ−ｑｚ」Ｍ」９ｊ上山胆、Ｃｉ　ｂａ−ハ 迎Ａ社包、Ｌ力〃Δｊ　ｕｒｇ、１↓６　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｊｏｈｎ　Ｗ ｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、１９８５）；　Ｂａｓｅｒｇａ、Ｒ，ｍ、　色Ｕｉ− 、ヌエ９！ｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｖｉｓ’ｏｎ　（Ｏｘｆｏｒｄ：　ＩＲＬ　Ｐｒ ｅｓｓ、１９８５）　：　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ａ、およびＲｏｂｅｒｔｓ、＾、 Ｂ、ｉｌ、Ｐｅ　ｔｉｄｅ　ｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄユｈｅｔｒ、 −巳組ｕ里、第１巻および第１Ｉ巻（Ｂｅｒｌｉｎ：　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ ｒｌａｇ、１９９０）］。しかし、これらの特定の例は、限定を目的とするもの ではない。細胞増殖を調べるインビトロでのアッセイにより実証される、細胞の 増殖を刺激することができる任意の化合物あるいは組成物が、本発明の増殖因子 として有用である。

このようなアッセイは、当該分野で既知のものである［例えば、Ｃａｎａｌ　ｉ ｓら、１９８８、前出；　Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏら、１９８６、前出 ；Ｄｉｅｋｓｏｎら、１９８７、前出；　Ｒ４ｚｚｉｎｏ、　１９８７、前出］ 。

修復細胞を誘引するための本発明の組成物および方法に有用な化学遁走因子には 、例えば、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ　（酸性あるいは塩基性）、ＰＤＧＦ、腫瘍壊死 因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）７．およびグリコサミノグリカン鎖な どのプロテオグリカン分解産物が含まれるｔＲｏｂｅｒｔｓら、（１９９０）、 前出；　Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏ　ａｎｄ　ｅｄｉｃ ｉｎｅ、　Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕＩｌｌ、　ｕｉ （Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　１９８５）　 ；　Ｒ，Ｂａｓｅｒｇａ編、江ＩＩ　ｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄ’ｖｉｓｉｏｎ　 （Ｏｘｆｏｒｄ：　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８５）］。ポポリペブチおよび他 の化合物の化学遁走を調べる・）２、セイは、当該分野で既知のものである［例 えば、Ｐｏｓｔｌｅｗａｉｔ、ｅｌ；、１９８７、前出ＨＷａｈｌら、１９８７ 、前出ＨＭｏｏｒｅら、１９８９、前出］Ｑ本発明の好ま１．い実施態様では、 マトリックスは、増殖因子および化学遊走因子と１．てＴＧＦ−βを含有する。

特に、ＴＧＦ・β■あるいはＴＧＦ−βＩ＋を、増殖因子および化学遊走因子と じて使用し得る。他のＴＧＦ−βの形態（例えば、ＴＧＦ−βＩＩＩ％ＴＧＦ− β［Ｖ、　ＴＧＦ〜βＶなど）あるいはＴＧＦ−β活性を有するポリペプチド［ 前出のＲｏｂｅｒｔｓ、　１９９０、を参照］もまた、将来検出されるであろう この物質の他の型、および他の増殖因子と共に、この目的に対（７て有用であり 得る。増殖因子および化学遁走因子と１−で使用するために、ＴＧＦ−β分子を マトリックス中に溶解するかあるいは懸濁させる。その際には、ＴＧＦ−β濃度 を、好まり、　＜はマトリックス溶液に対し、て２−５０　ｎｇ／ｗ＋１、そし て最も好ましくはマトリックス溶液に対（、て２−１０１ｇ／ｍｌとなるように する。修復細胞の増殖を刺激するＴＧＦ−＝βの好ましい濃度は、治療する特定 の動物によって変化し得ることは、理解されるであろう。

１種類あるいは複数種類のトランスフォーミング因子もまたマトリックス溶液中 に存在し得る。これによって、修復細胞がマトリックス中に集まった後に、トラ ンスフォーミング因子が、修復細胞の軟骨細胞への分化（即ち形質転換）を促進 するために十分な濃度で欠損部位中に放出される。この軟骨細胞は、新しい安定 した軟骨組織を形成する。トランスフォーミング因子の放出の適切なタイミング は、このトランスフォーミング因子が増殖因子の効果を阻害あるいは妨害し得る 場合には、特に重要となる［前出のＲｏｂｅｒｔｓら、（１９９０）を参照］。

本発明の組成物および方法に有用なトランスフォーミング因子には、任意のペプ チド、ポリペプチド、タンパク質、または、修復細胞の軟骨細胞への分化を誘導 する他の任意の化合物あるいは組成物が含まれる。この軟骨細胞は、軟骨特異的 プロテオグリカンおよび１１型フラーゲンを生産する。細胞中での軟骨特異的プ ロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの生産を誘導あるいは刺激する化合物あ るいは組成物の能力は、当該分野で既知のアッセイを使用して決定され得る［例 えば、５ｅｙｅｄｉｎら、１９８５、前出；　５ｅｙｅｄｉｎら、１９１１７． 前出］。本発明の組成物および方法に有用なトランスフォーミング因子には、例 えば、ＴＧＦ−β類、ＴＧＦ−α類およびＦＧＦ類（酸性あるいは塩基性）が含 まれる。これらのトランスフォーミング因子は、単独で、または組み合わせて使 用され得る。さらに、ＴＧＦ−βはＥＧＦとの組み合わせで使用され得る。

適切な時点でのトランスフォーミング因子の放出は、適切な送達システム中に、 あるいはこれと共に、トランスフォーミング因子をパッケージングすることによ って行われ得る。

本発明の組成物および方法に有用な送達システムには、リポソーム、生物腐食性 ポリマー、炭水化物ベースの小体、トランスフォーミング因子が自動的に結合す るヘパリン硫酸プロテオグリカンあるいは他のこのような分子に化学的に結合し たコラーゲンなどの線維、および浸透圧ポンプが含まれる。

リポソーム、生物腐食性ポリマー、トランスフォーミンク因子が結合した線維、 およびトランスフォーミング因子を含有する炭水化物ベースの小体などの送達シ ステムは、欠損に充填するために使用されるマトリックス溶液と混合され得る。

これらのシステムは、当該分野で知られており、入手可能である［Ｐ、Ｊｏｈｎ ｓｏｎおよびＪ、Ｇ、　Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓｍ、　Ｄｒｕ　Ｄｅｌｉｖｅｒ １１７．；ｊｌ、）１！三：：、：！！、ｊ：！！！：１．；：Ｉ　（Ｃｈｉｃ ｈｅｓｔｅｒ、　Ｅｎｇｌａｎｄ　二　Ｅｌｌｉｓ　Ｈｏｒ翌盾盾п@Ｌｔｄ、 、　１９８ ７）参照］。リポソームは、ＫｉｎらのＢｉｏｃｈｅｎ＋、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、 　Ａｃｔａ。

ぢ！８．　ｐｐ、　３３９−３４８　（１９８３）に記載の手順に従って調製さ れ得る。

他のリポソーム調製手順もまた使用され得る。軟骨細胞を刺激して軟骨組織成分 を合成するための追加因子を、送達システム中にトランスフォーミング因子と共 に含有させてもよい。

本発明の好ましい実施態様では、マトリックスは、ＴＧＦ−βを増殖および化学 遁走因子として含有し、そして送達システム中にパッケージングされたＴＧＦ− βをトランスフォーミング因子として含有する。特に、ＴＧＦ−β１あるいは丁 ＧＦ−βＩ＋は、増殖および化学遁走因子、およびトランスフォーミング因子と して使用され得る。他のＴＧＦ−βの形態（例えば、ＴＧＦ−βＩＩＩ、ＴＧＦ −β＋Ｖ、ＴＧＦ−βＶなど）あるいはＴＧＦ−β活性を有するポリペプチド［ 前出のＲｏｂｅｒｔｓ、１９９０、を参照］もまた、将来検出されるであろうこ の物質の他の型、および他の成長因子と共に、この目的に対して有用であり得る 。

好ましい実施態様では、マトリックス溶液に対して好ましくは２−５０　ｎｇ／ ■ｌの濃度のＴＧＦ−β、そして最も好ましくはマトリックス溶液に対して２− １０　ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−βを、増殖因子および化学遊走因子として使 用する。これよりもかなり高い濃度のＴＧＦ−βもまた、この後に放出可能な形 態でマトリックス組成物中にトランスフォーミング因子として存在する。

好ましくは、後で放出されるＴＧＦ−βの濃度は、マトリックスに対して２００ 　ｎｇ／ａｌｌよりも高く、そして最も好ましくは、マトリックスに対して５０ ０　ｎｇ／＋ｗｌよりも高い。修復細胞の分化を誘導するための好ましいＴＧＦ −β濃度は、治療する特定の動物によって変化し得ることは理解されるであろう 。

どれらの二つの濃度範囲のＴＧＦ−βに修復細胞を接触させる際には、その時間 をずらすことが必要である。その理由は次の通りである。比較的高い濃度（例え ばマトリックス溶液に対してＺｏｏ　ｎｇ／ｍｌを超える濃度）のＴＧＦ−βは 、修復細胞を軟骨細胞に形質転換し得るだけではなく、化学遁走による修復細胞 の誘引を阻害する。これに対して、比較的低い濃度（例えば２−１０　ｎｇ／ｍ ｌ）では、ＴＧＦ−βは、修復細胞を誘引して、その増殖を刺激するが、しかし 、軟骨組織を生産する軟骨細胞への修復細胞の形質転換を誘導することはない。

本発明の好ましい実施態様では、化学遊走および増殖の次に形質転換が生じると いう順序となるように、ＴＧＦ−βは、遊離した、カプセル化していない形態と 、カプセル化あるいは隔離された形態との両方の形態で、マトリックス中に存在 する。好ましくは、マトリックスおよび欠損領域中で修復細胞を誘引して、その 増殖を誘導するために、ＴＧＦ−β分子をマトリックス中に、マトリックス溶液 に対して２−１０　ｎｇ／■ｌの濃度で溶解するかあるいは懸濁させる。マトリ ックス中の修復細胞の、軟骨細胞への形質転換を促進するために、ＴＧＦ−β分 子はまた、前出のＩ［ｉｍら（１９８３）の方法に従って多胞性リポソーム中に 隔離された状態でマトリックス中に存在する。この場合（７）　ＴＧＦ−β分子 の濃度は、マトリックス溶液に対して２００　ｎｇ／■ｌよりも高（、そして好 ましくは５００　ｎｇ／ｍｌよりも高い。誘引された修復細胞がマトリックス中 に集まり、マトリックスを分解し始めると、ＴＧＦ−βを包み込んだリポソーム が破裂する。

マトリックスの分解中に、修復細胞はリポソームを摂取し、そして／あるいは分 解する。その結果、ＴＧＦ−βが、修復細胞の軟骨細胞への形質転換を誘導する ために十分な濃度で放出される。

化学遁走および増殖のための濃度のＴＧＦ−βと、形質転換のための濃度のＴＧ Ｆ−βとの、必要な二段階の送達は、形質転換のための濃度のＴＧＦ−βを生物 腐食性ポリマーと組み合わせることによっても達成され得る。あるいは、ポンプ 、好ましくは移植された浸透圧ポンプが、欠損およびマトリックス中のＴＧＦ− β濃度を調節するために使用され得る。本発明の実施態様では、ポンプがマトリ ックス中のＴＧＦ−βの濃度を調節する。

即ち、ポンプは、最初に化学遊走および増殖促進のための濃度でＴＧＦ−βを放 出し、そしてその次に形質転換のための濃度でＴＧＦ−βを放出し得る。好まし くは、形質転換のための濃度のＴＧＦ−βは、術後的１−２週間目にポンプによ って送達される。

欠損体積中へのトランスフォーミング因子の送達は、好ましくは欠損部位中のマ トリックスに限定される。

本発明の組成物中の増殖因子、および使用されている場合には、トランスフォー ミング因子は、生分解性マトリックス内の欠損部位中に付与される。したがって 、これらの因子の存在は、非常に局所的な部位に限定される。これは、関節腔中 へのこれらの因子の自由な注入あるいは流入を防止するために行われる。このよ うな自由な流入が発生すると、溝膜細胞を刺激して関節滲出を引き起こすという 好ましくない結果が生じ得る。

フィブロネクチン、あるいは、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有する テトラペプチドと同じ大きさのペプチドを含む化合物は、細胞接着促進因子とし て使用され得る［Ｒｕｏｓｌａｔｈｉら、１９８６、前出］。これは、欠損部位 中に堆積されたマトリックスに対する修復細胞の初期の接着性を向上させるため に行われる。フィブリンおよびある種のコラーゲンマトリ・ツクスは、既にこの 配列を含有している［Ｒｕｏｓｌａｔｈｉら、１９８６、前出］。他の生分解性 マトリックスを使用する場合には、マトリックスを使用して欠損を覆う前に、こ のような細胞接着促進因子をマトリックス物質と混合し得る。Ａｒｇ−Ｇｌｙ− ＾ｓｐを含有するペプチドはまた、マトリックス物質（例えばその線維あるいは メツシュ）に、またはアルブミンなどの、マトリックスに添加された化合物に化 学的に結合され得る。

以上説明した組成物は、動物の軟骨組織中の欠損あるいは損傷の選択された部位 に軟骨形成を誘導する方法に育用である。

本発明の方法は、ヒトを含む動物の軟骨欠損の治療を可能にする。この治療では 、その投与形態が簡単であり、そして、傷害を受けた関節領域にその治療位置が 限定される。この治療全体は、単独の関節鏡検査手順あるいは切開手術手順で行 われ得る。

本発明による、軟骨中の欠損あるいは損傷を治療する方法を実施するために、欠 損あるいは損傷を確認し、調製し、そして本発明の生分解性マトリックス組成物 でこれを覆う。マトリックス組成物中には、増殖（有糸分裂促進性）因子が、こ のマトリックスおよび欠損あるいは損傷中の修復細胞の増殖を刺激するために適 切な濃度で存在する。この同じ因子はまた、この濃度で、修復細胞を誘引する化 学遁走因子としても作用する。ただし、これは、使用される因子が、（マトリッ クスに対して２−１ｏ　ｎｇ／ａ＋１の濃度のＴＧＦ−βと同様に）細胞増殖と 化学遊走とを組み合わせた効果を持つ場合である。あるいは、二つの異なる因子 、即ち、特異的増殖効果を持つ因子および特異的化学遊走効果を持つ因子が、マ ド１ルツクス中に存在し得る。別の実施態様では、欠損を生分解性マトリックス で覆った後に、増殖因子、および所望の場合には化学遊走因子が、マトリックス を充填した欠損領域中に直接注入され得る。

次の工程では、マトリックス中の修復細胞を、適切な時点でトランスフォーミン グ因子に接触させる。その際には、ｉ、ランスフォーミング因子の濃度を、修復 細胞を、安定した軟骨組織を生産する軟骨細胞に形質転換するために十分な濃度 とする。この工程は、上記のようにマトリックス組成物中に、トランスフォーミ ング因子を含む適切な送達システムを含有させることによって、達成され得る。

あるいは、トランスフォーミング因子を、マトリックスを充填した欠損領域中に 適切な時点で直接注入することによって送達し得る。生分解性マトリックスを欠 損領域中に最初に移植してから約１−２週間後に、形質転換のための濃度を、細 胞に対して提供可能となるようにしなければならない。この時点で、軟骨マトリ ックス成分の合成をさらに促進するために、追加因子を、送達システムに添加し 得るか、あるいは直接注入し得る。

（以下余白） 動物の軟骨欠損あるいは損傷は、関節の関節鏡検査時に、または、切開手術中の 損傷あるいは欠損の簡単な検査時に、視認により容易に確認される。軟骨欠損は また、計算機援用断層撮影（ＣＡＴスキャニング）、Ｘ線検査、核磁気共鳴画造 映（ＭＨＩ）、滑液あるいは血清マーカーの分析を使用することによって、また は当該分野で既知の他の任意の手順によって、推論的に確認され得る。

一旦欠損を確認すると、外科医は、その欠損を外科的処置により改変することに よって、本明細書に記載の治療方法で添加する溶液およびマトリ／ラス物質を物 理的に保持する欠損の能力を向上させることを選択し得る。好ましくは、本明細 書に記載の治療方法で添加される溶液およびマトリックス物質をより良く保持す るために、欠損は、平坦な、あるいは浅い凹状の外形を有する代わりに、その末 端部が垂直になっているかあるいは垂直となる様に成形されるか、または、その 底部が切り取られる。

欠損領域に対するマトリックスの接着性を向上させる上記の物理的な手段に加え て、化学的手段もまた、マトリックスの接着性を向上させ得る。このような手段 には、欠損表面上の軟骨プロテオグリカンの表在層を分解することにより軟骨の コラーゲン原線維を露出し、これによって、このコラーゲン原線維を、マトリッ クスのコラーゲン原線維（コラーゲンのマトリックスを使用の場合）あるいはマ トリックスのフィブリン原線維（フィブリンマトリックスを使用の場合）と、相 互に作用させる手段が含まれる。軟骨表面上のプロテオグリカンは、軟骨に対す るフィブリンあるいは他の生分解性マトリックスの接着を妨害するだけではなく 、局所的にトロンビン活性をも阻害する。有利なことには、プロテオグリカン分 解産物はまた、修復細胞に対して化学遁走効果を与え得る［Ｍｏｏｒｅ、Ａ、Ｒ ，ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｔｉ５ｓ、Ｒｅａｃ、ＸＩ　６　、ｐｐ、３０１−３０７　 （１９８９）］。

さらに、欠損軟骨に対するマトリックスの接着性は、フィブリン接着剤（即ち、 血液因子Ｘｌｌ＋あるいはフィブリン安定化因子）を用いることによっても向上 され得る。これによって、欠損表面上の軟骨コラーゲン原線維に対するマトリッ クスの原綿雑の化学結合（架橋）が促進される［Ｇｉｂｂｌｅら、シ］１１１１ ゜姐、υ山ひ、　ｐｐ、　７４１−４７　（１９９０）参照］。酵素トランスグ ルタミナーゼもまた、同じ効果を得るために使用され得る［例えば、１ｃｈｉｎ ｏｓｅら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、η」ン陳工、ｐＰ、１３４１１−１４　 （１９９０）　；　−Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、　−Ｖ、Ａ、　Ｎａ ｊｊａｒおよびり、Ｌｏｒａｎｄ編、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｕ ｂｌｉｓｈｅｒｓ　（Ｂｏｓｔｏｎ、　１９８４）参照］。細胞外物質の接着性 を促進し得る他の化合物もまた使用され得る。

本発明の方法の一実施態様では、無菌吸収紙を用いて欠損領域の水分を吸い取る ことによって、欠損の表面を乾燥し、そして、欠損体積中に無菌酵素溶液を２− １０分間充填することにより、軟骨表面上および局所的には欠損表面から深さ約 １−２μｍ以内に存在するプロテオグリカンを分解する。種々の酵素を、単独で あるいは組合わせて、プロテオグリカンを分解するために無菌バッファー水溶液 中で使用し得る。溶液のｐＢを、酵素活性を最適化するために調整しなければな らい。

本発明の方法でプロテオグリカンを分解するために有用な酵素には、コンドロイ チナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ。

ヒアルロニダーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プロナ ーゼ、ストロメリシンおよびスタフｖ８プロテアーゼが含まれる。特定の酵素あ るいは複数の酵素の組合わせの適切な濃度は、酵素溶液の活性に依存する。

本発明の好ましい実施態様では、Ｉ　Ｕ／＋＊ｌの濃度のコンドロイチナーゼＡ ＢＣの無菌溶液を欠損に充填し、そして、消化を４分間進行させる。フンドロイ チナーゼＡＢＣの好ましい濃度は、実施例１に記載のように、種々の濃度の酵素 で処理時間を種々に変えて処理したウサギの関節軟骨組織を電子顕微鏡で検査す ることによって、決定された。用いられる他の任意の酵素は、深さ約１−２μ謹 以内に存在する表在のプロテオグリカンのみが分解されるような濃度で、かつそ のような時間だけ使用されなければならない。

酵素溶液を塗布する時間は、主に修復領域中のプロテオグリカンを分解するため に、最小にしなければならない。Ｉ　Ｕ／１の濃度のコノドロイチナーゼＡＢＣ の場合は、消化時間が１０分を超えると、不必要でありかつ潜在的に有害な欠損 領域外のプロテオグリカンの分解が生じ得る。さらに、消化時間が１０分を超え ると、全処置時間に過大な影響を与える。全処置時間は、特に関節切開手術中に は、最小に抑えられなければならない。なぜならば、軟骨が空気にさらされて障 害を受け得るからであるＣＭｉｔｃｈｅｌｌら、（１９８９）、前出Ｊ０　これ らの理由により、酵素による消化によってプロテオグリカンを分解する工程を包 含する本発明の方法の実施態様では、１０分未満の消化時間が好ましく、そして ５分未満の消化時間が最も好ましい。

本発明の方法によれば、酵素が欠損表面のプロテオグリカンを分解した後に、酵 素溶液を欠損領域から除去しなければならない。酵素溶液の除去は、細い吸引端 を備えたアスピレータを使用し、次いで線質のもので吸い取ることによって、行 われる。あるいは、線質のものだけを用いて吸い取ることによって、酵素溶液を 除去し得る。

酵素溶液を除去した後に、欠損を、無菌生理食塩水（例えば、０．１５ＭのＭａ ｉｌ）で入念に、好ましくは３回、洗浄しなければならない。次に、洗浄された 欠損部位を乾燥させなければならない。無菌ガーゼあるいは線質のものを使用し て欠損部位を乾燥させ得る。

これに代わるものとして、あるいはこの酵素処理工程に加えて、欠損部位を、フ ィブリン接着剤あるいはトランスグルタミナーゼなどの化合物で覆い、これによ って、欠損部位に対するマトリックスの接着性を向上させ得る。好ましい実施態 様では、酵素処理に続いて欠損部位を洗浄し、乾燥した後に、フィブリン接着剤 あるいはトランスグルタミナーゼを欠損部位に塗布する。

本発明の方法によれば、次いで、欠損部位を、本明細書中に記載の本発明の組成 物で覆うことにより、欠損中にマトリックス組成物を、好ましくはその末端部ま で充填し、これによって、平坦な面を形成する。組成物は、マトリックス物質お よび増殖因子、さらに所望の場合には、化学遊走因子を含有する。この工程で使 用する組成物は、さらに、適切な送達システム中にパフケージングされたトラン スフォーミング因子を含有する。本発明の最も好ましい方法では、マトリックス は、増殖因子、化学遊走因子（増殖因子と同じものであり得る）およびトランス フォーミング因子を含有する。トランスフォーミング因子は、送達システム中に 、あるいは送達システムに組込んでパッケージングされている。送達システムは 、マトリックス中に集まった修復細胞が細胞間物質の再造形を行い始めた時点で 、しかも修復細胞を軟骨細胞に形質転換するような濃度で、トランスフォーミン グ因子を放出する。

マトリックスが増殖および化学遁走因子を含有していない場合には、この（これ らの）因子を、修復細胞の化学遊走および増殖を促進する好ましい濃度となるよ うに、マトリックスが充填された欠損領域中に直接注入する。好ましくは、本発 明の実施態様では、欠損をマトリックスで覆った後に、ＴＧＦ−βをマトリック ス中に、マトリックスに対してＺ−１０ｎｇ／諷ｌの濃度となるように局所的に 注入する。この注入は、マトリックスが充填された欠損領域に限定されなければ ならない。これは、溝膜の細胞が、細胞増殖および関節滲出をもたらす恐れのあ る増殖因子に接触することを回避するためである。

欠損部位をマトリックス組成物で覆った後に（そして、フィブリンマトリックス の場合には、一旦マトリックスが凝固すると）、そして、必要に応じて、マトリ ックスを充填した欠損部位中に増殖因子を注入した後に、関節包および皮膚切開 部を縫合し、関節鏡検査あるいは切開手術を終了し得る。

トランスフォーミング因子がマトリックス中で適切な送達システム中に存在して いない場合には、トランスフォーミング因子を、術後約１−２週間目に直接マト リックス中に添加し得る。その際には、例えば注射あるいは浸透圧ポンプによっ て、修復細胞を軟骨細胞に形質転換するために十分な濃度で添加する。好ましく は、本発明の実施態様では、術後約１週開目にＴＧＦ−βを直接マトリックス中 に添加して、これにより、マトリックスに対するＴＧＦ−β濃度を２０（ｌ　ｏ ｇ／ｍｌより高くなるように、そして最も好ましくは５００　ｎｇ／ｌａ１より 高くなるようにする。

関節軟骨中の欠損を修復するための本明細書中に記載の方法は、欠損が軟骨下の 骨まで達していない場合に最も有効である。本明細書中に記載の方法はまた、半 月軟骨組織中の欠損を修復するためにも使用され得る。

本明細書中に記載の本発明に対してさらに十分な理解を得るために、以下の実施 例を開示する。これらの実施例は、説明を目的とするものであり、如何なる意味 でも本発明を限定するとは解釈されないことは、理解されるであろう。

Ｋ嵐五上 プロテオグリカンの　を　べる 関節軟骨組織の表層性欠損の表面に対するマトリックスの接着性を促進し、向上 させるために、表層の軟骨マトリックス中のプロテオグリカン分子を酵素によっ て除去し得る。この除去は、コラーゲン原線維網を、外部から塗布されるマトリ ックスおよび移動して来る修復細胞に接触させるために、行われる。種々のプロ テアーゼおよびグリコサミノグリカン分解酵素が、この目的のための使用に適切 であるが、しかし、各酵素に最大の活性を提供するために、ｐＨ条件を調節しな ければならない。

本実施例では、発明者らは、コンドロイチナーゼＡＢＣ（０，５−５Ｕ／ｍｌ） およびトリプシン（０，５−４％）を試験して、これらのプロテオグリカン除去 能力を調べた。地元の屠殺業者から入手した、新たに屠殺された複数のウサギの 膝関節を使用した。物理的に生じさせた表層性の軟骨欠損を、酵素溶液に４分間 接触させた。次いで溶液を吸収紙で除去し、そして、欠損部位を入念に生理食塩 水で洗浄した。この処置の後に、即座に軟骨組織を、組織学的検査のために、０ ．７％（Ｗ／Ｖ）のルテニウムヘキサミントリクロライド（ＲＨＴ）を含有する ２％（Ｖ／Ｖ）のグルタルアルデヒド溶液（０，０５Ｍのカコジル酸ナトリウム で緩衝処理したもの、ｐＨ７，４）中で固定した。固定後の培養液は、１％のＲ ＨＴ−四酸化オスミウム溶液（０，１Ｍのカコジル酸ナトリウムで緩衝処理した もの）により構成されていた。組織を、段階的に連続してエタノールを用いて脱 水し、モしてエポン８１２中に包埋した。

複数の薄片を切断し、これらを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて染色し、 そして電子顕微鏡で検査した。これらの薄片中で、ＲＩＩＴによって固定した（ 即ち沈澱した）プロテオグリカンは、暗く染色された細粒として出現した。厚さ 僅か１−２μ謹のプロテオグリカン表在層を除去した酵素濃度を、最適であると 定義した（これよりも深く酵素が浸透すると、その下の軟骨細胞に影響を与える ことになり得る）。フンドロイチナーゼＡＢＣは、約Ｉ　Ｕ／ｍｌの濃度で最適 な活性を呈することが判明した。トリプシンは、約２．５％の濃度で最適な活性 を呈することが判明した。他のグリコサミノグリカナーゼあるいはプロテアーゼ の最適活性範囲は、類似の方法で決定され得る。任意のバッファーを酵素と共に 使用し得る。ただし、ノイ・ソファ−に毒性が無く、かつその最大緩衝能力が、 最大酵素活性に必要なｐＨ値に近いｐｔｉ値で得られる場合に限る。

Ｋ血立主 に、　るマド副ユｊ」肇ｌ支１住 表層の軟骨プロテオグリカンに対して、制御した酵素消化を行うことで欠損表面 へのマトリックス接着を促進する可能性を検討した。３体の成熟ウサギの膝関節 中に、平削りナイフを用いて傷つけることにより、欠損を生じさせた。これらの 欠損に対しては、酵素処理を行わなかった。欠損にフィブリンマトリックスを充 填した。欠損に充填する約２００秒前に、このフィブリンマトリックスを、１園 ｌのフィブリノーゲン溶液（１璽ｇ／ｖａ　ｌの濃度で水性バッファーに溶解し たもの）に対して、２０μｌの割合のトロンビン溶液（１００Ｕ／■ｌの濃度で 水性バッファーに溶解したもの）を混合することによって、形成した。これらの ウサギを１ケ月後に屠殺して、その膝関節を検査することにより、欠損部位に対 するフィブリンマトリックスの接着程度を決定Ｉ−た。これらの結果を、欠損に フィブリンマトリックスを充填する前にコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｉ　ＩＩ／ ｍｌで４分間）で欠損を処理したつづギによって得た結果（実施例３．４および ５参照）と比較した。

酵素で処理しない欠損領域中に堆積したフィブリンマトリックスでは、欠損表面 に接着するための親和力は低いものであった。酵素処理の後には、フィブリンマ トリックスの固１能力（接着するための機械的強度を測定すること、即ち、手を 使って鉗子の先でマトリックスを押して除去できる容易さを試験することによっ て、そして、実験を通じてマトリックスが良好に固着し続けていた欠損の数を確 認することによって、間接的に決定した）は、かなり増加した。酵素処理を行わ ない場合の欠損表面に対するマトリックスの低い親和力は、おそら（は、プロテ オグリカン分子によるマトリックス接着の局所的阻害、および、フィブリン重合 の阻害に起因する。これらの両方の影響は、欠損表面領域の表層のプロテオグリ カンを酵素により除去することによって、防止される。

Ｌ皿匹主 λ１厘二二、（７）　（λｉ五且１（エ　への　′のための　“および　復　の 　の 種々の増殖因子を試験して、欠損の治癒のために欠損領域への修復細胞の化学遊 走移動を刺激する際のこれらの増殖因子の有用性を調べた。

使用した増殖因子は、ａ）表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ｂ）塩基性線維芽細胞 増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｃ）インスリン様増殖因子＋（ＩＧＦ　Ｉ）、ｄ）ヒト 成長ホルモン（ｈＧＨ）、およびｅ）トランスフォー　ミング増殖因子−β（Ｔ ＧＦ−β）を、５−１０　ｎｇ／ｎ＋１の間の濃度で含有していた。

これらの各因子を、線中に生じさせた欠損に局所的に塗布した。、−の各因子の 塗布は、実施例２に記載のようにコンドロイチナーゼＡＢＣによる処理および洗 浄を行った後に、行った。

合計１０体の動物（各増殖因子に対！、て２体）を使用した。各増殖因子は、欠 損表面を完全に覆う捏十分に、修復細胞を化学遁走により欠損表面に誘引するか 、あるいは欠損表面での修復細胞の増殖を局所的に刺激することができた。しか し、これらの細胞は、欠損の表面にのみ存在しており、欠損の体積を充たす程十 分な修復細胞の増殖は一例も見られなかった。

（プロテオグリカン分解産物自体によって、即ち、他の何れの因子を添加するこ となく、欠損に修復細胞を誘引するだけの十分な化学遁走効果が得られると考え られている。Ｍｏｏｒｅ。

Ａ、　Ｒ，ら［［ｎｔ、　Ｊ、　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅａｃ、ＸＩ　ｂ　、　ｐｐ、 　３０１−１０７．１９８９］は、プロテオグリカン分解産物自体が化学遁走効 果を有することを明らかにしている。） 穴ＩＬ± 支分乳１工上ユニＬ五東Ｋｍ里忌めた　を　−皿、像にヱ」臼Ｌ（≦」ＬにＪ」 へゴ（ｌ朋〕１Σの　′　のた怜−へ化部および　′　の　の 実施例３の条件下で増殖因子を局所的に塗布した場合には、欠損体積を充たすだ けの十分な修復細胞増殖が誘導されることは決して無い。したがって、同じ増殖 因子を用いて実験を行ったが、ただし、今回は、増殖因子を生物分解性マトリッ クス中に閉じ込めた。使用した生分解性マトリックスは、フィブリン、コラーゲ ンおよびセファロースであった。増殖因子を含有する十分な量のマトリックスを 、欠損体積中に完全に充填するように塗布した。

１園ｌのフィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／＋ｍｌの濃度で水性ハ・ツファー溶液 に溶解したもの：水性バッファー溶液として、０．０５Ｍのトリス、ｐＨ７，４ 、Ｏ，１ＭのＮａＣ１）に対して、２０　μｌの割合のトロンビン溶液（１００ Ｕ／ｍｌの濃度で水性バッファー溶液に溶解したもの：水性バッファー溶液とし て、ベロナールアセテートバッファー、ｐＨ７，０）を混合することによって、 フィブリンマトリックスを形成した。この形成は、欠損に充填する約２００秒前 に行われた。コラーゲンマトリックスの場合には、十分に粘性を有する溶液を、 Ｃｏｌａｇｅｎ−Ｖｌｉｅｓ’Ｘ’あるいはゼラチンと血液との混合物を用いて 作った。セファロースマトリックスの場合には、欠損にセファロース溶液を３９ −４２°Ｃにて充填１゜た。これを冷却（３５−３８℃）すると、セファロース マトリックスが欠損中に形成された。

３０体のウサギ（各タイプのマトリックスおよび増殖因子に対して２体）を実験 に使用した。堆積されたマトリックスが欠損に接着し続けた全ての場合において 、線維芽細胞様修復細胞がマトリックス全体に集まった。この状態は、術後８− １００日目いう早い時期に生じることが見いだされた。術後４週間口までに、修 復組織の組織構造にはこれ以上の変化は生じなかったが、ただし、生物分解性マ トリックスは修復細胞によって再造形されて、これに代わって目の粗い結合組織 タイプの細胞外マトリックスが形成された。

この組織の軟骨組織への形質転換は、生じなかった。

Ｌ敷えｉ マトリックス　に　じ゛めた　を　。　にることによる、欠ｉｄ　への　′　の ための走　激および　′　の　の　、ならびにこれに　いて　２　で　日′にト ランスフォーミング　を。　・に　ることによる　ｅ′。　のヒアリン　ヘ９１ ｊ１１豫！母ｉ倣 増殖因子を塗布した後に、欠損体積中のマトリックスが完全に修復細胞によって 満たされたこと、および、これらの細胞が、堆積されたマトリックスを再造形で きたことを観察した〈実施例４参照）ことに着想を得て、トランスフォーミング 因子（ＴＧＦ−βなど）を、カプセル化形態（例えばリポソーム中）で導入した 場合の効果を検討した。マトリックス全体に修復細胞が集まり、これらの細胞が 細胞間構造の再造形を行い始めた時に、このカプセル化形態から、トランスフォ ーミング因子が放出されるのである。

ＴＧＦ−βをフィブリノーゲン溶液（１■ｇ／ｍｌ）中に低濃度で（例えば２− １０　ｎｇ／ｍｌ）混合した。これは、初期の化学遊走および増殖効果を促進す るためである。さらに、ＴＧＦ−βを、前出の［１■ら（１９８３）の方法に従 って、リポソーム中にカプセル化した。

これらのＴＧＦ−β含有リポソームを、同じフィブリノーゲン溶液に添加した。

その際には、ＴＧＦ−β含有リポソームの濃度を、リポソームが破裂してＴＧＦ −βが放出された時に、’　ｌ　ｗｉｌのフィブリノーゲンに対してｔｏｏ−１ ０００ｎｇの割合のＴＧＦ−βという、より高いＴＧＦ−β濃度が得られるよう な十分な濃度とした。これは、フィブリンマトリックス中に集まった修復細胞が 細胞間物質の再造形を行い始めた第２段階中に、修復細胞の軟骨細胞への形質転 換、およびマトリックスを充填した欠損の軟骨への形質転換を促進するためであ る。

１０体の成熟ウサギに対して、実施例２の場合と同様に、膝関節軟骨の表層性欠 損を生じさせて、そして、遊離したＴＧＦ−βおよびリポソーム中にカプセル化 したＴＧＦ−βを含有するフィブリノーゲンの混合物を欠損部位に塗布すること によって、これらのウサギを治療した。この一連の実験中の種々の実験では、遊 離ＴＧＦ−βの濃度を、フィブリノーゲンに対して２２−１Ｏｎ／■ｌの範囲で 維持した。一方、カプセル化したＴＧＦ−βの濃度を変化させて、（ＴＧＦ−β がリポソームから放出された時に）フィブリノーゲンに対するＴＧＦ−βの濃度 が１００　ｎｇ／■ｌとｔｏｏ。

ｎｇ／菖ｌとの間で１００　ｎｇ／ｍｌづつ段階的に興なる濃度となるようにし た。全ての場合に、ヒアリン様軟骨組織が治療部位に形成された。最も高い再現 性を示す結果は、フィブリノーゲン溶液に対するカプセル化したＴＧＦ−β濃度 がＺｏｏ　ｎｇ／園ｌより高い場合に得られ、好ましくはフィブリノーゲン溶液 に対するＴＧＦ−β濃度が５００　ｎｇ／ｍｌよりも高い場合に得られた。

支敷匠旦 七　〜　が生じる　１、の゛ 本実験では、６体の成熟ウサギのグループに対して、実施例２の場合と同様に、 これらの膝に手術を施すことにより、表層性欠損を生じさせた。表層性欠損修復 のための完全治療計画を提供した。即ち、コンドロイチナーゼＡＢＣで処理（Ｉ Ｕ／■ｌで４分間）した後に、遊離ＴＧＦ−β（−２−１０ｎｇ／ｍｌ）および リポソームに包み込まれたＴＧＦ−β（−８００ｎｇ／ｍｌ）を含有するフィブ リンマトリックス（ｌ　６７ｗ＋１のフィブリノーゲン溶液、１Ｉ■のフィブリ ノーゲン溶液に対して２０μＩの割合の１００　Ｕ／■１のトロンビン溶液）を 欠損部位に充填した。３体のウサギを、術後８日目、１０ａ目および１２ａ目に 層殺し、残りの３体を、２０ａ目、２４ａ目および２８ａ目に層殺した。原始的 な線維芽細胞様修復細胞組織のヒアリン様軟骨組織への形質転換は、この動物モ デルでは、１２ａ目と２０ａ目との間に生じた。これは、組織学的検査に基づい て決定された。８日目から１２ａ目までは、目の粗い線維性修復組織が依然とし て存在していた（塗布されたフィブリンマトリ、クスは、部分的あるいは完全に 再造形されていた）。これに対して、２０ａ目以降は、欠損空間は部分的あるい は完全にヒアリン様軟骨組織で満たされていた。

Ｋ嵐匠エ ミニプ　モデルでの　′　の ウサギモデルに使用した前出の実験手順を、より大きい動物モデル、即ちミニブ タに使用した。表層性欠損（幅０．６１１１％深さ０．６Ｉ■、および長さ約１ ０−１５　ｍｍ）を、４体の成熟ミニブタ（２−４歳、８０−１１０　ｌｂ）中 に生じさせた。これは、膝蓋骨溝中および内側顆上に平削りナイフで傷つけるこ とによって、行った。次いで、これらの欠損をフンドロイチナーゼＡＢＣで（前 出のウサギに使用したように、Ｉ　Ｕ／■ｌで４分間）処理した。酵素溶液を除 去し、欠損を乾燥し、生理食塩水で洗浄し、そして再度乾燥した。次に、欠損部 位にフィブリノーゲンマトリックス溶液を充填した。本実験で使用したフィブリ ノーゲンマトリックス溶液は、１　ｍｌのフィブリノーゲン溶液に対して２−６ 　ｎｇの割合でｉｌＭＴＧＦ−βを含有し、かつ１Ｉ■のフィブリノーゲン溶液 に対して１５００−２０００　ｎＨの割合で、リポソームにカプセル化したＴＧ Ｆ−βを含有していた。ウサギを用いた実験で上述したように、欠損に充填する 前に、マトリックス溶液にトロンビンを添加した。

術後６週間口にミニブタを層殺し、マトリックスを充填した欠損部位を組織学的 に検査した。全ての部位に治癒、即ち治療部位中のヒアリン様軟骨組織の形成が 認められた。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．軟骨の欠損あるいは損傷を、治療あるいは修復するための組成物であって： 該軟骨の欠損あるいは損傷の領域を覆うために使用される、生分解性マトリック スあるいはマトリックス形成物質；および 該マトリックス中および該欠損あるいは損傷の領域中の修復細胞の増殖を刺激す るのに適切な濃度の増殖因子；を含有する、組成物。
2. ２．送達システムと組合わされたトランスフォーミング因子をさらに含有し、そ して、該トランスフォーミング因子の濃度が、前記マトリックスおよび欠損中の 修復細胞に該トランスフォーミング因子が送達された時に、該修復細胞を、軟骨 組織を生産する軟骨細胞に形質転換するために適切な濃度である、請求項１に記 載の組成物。
3. ３．前記マトリックスおよび欠損領域に修復細胞を誘引するために、適切な濃度 で化学遊走因子をさらに含有する、請求項１あるいは２に記載の組成物。
4. ４．前記化学遊走因子が、ＴＧＦ−β類、ＦＧＦ類、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−α、Ｔ ＮＦ−βおよびプロテオグリカン分解産物からなる群より選択される、請求項３ に記載の組成物。
5. ５．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β類、ＦＣＰ類、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、 ＴＧＦ−α類、ヒト成長ホルモンおよび造血性増殖因子からなる群より選択され る、請求項１あるいは２に記載の組成物。
6. ６．前記トランスフォーミング因子が、ＴＧＦ−β類、ＴＧＦ−α類およびＦＧ Ｆ類からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
7. ７．前記欠損領域に充填するために使用される前記生分解性マトリックスが、フ ィブリン、コラーゲン、ゼラチン、セファロース、あるいはこれらの組み合わせ からなる群より選択される、請求項１あるいは２に記載の組成物。
8. ８．前記増殖因子、前記化学遊走因子および前記トランスフォーミング因子が、 ＴＧＦ−β類からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
9. ９．前記トランスフォーミング因子が、１種類あるいはそれ以上のトランスフォ ーミング因子の混合物である、請求項２に記載の組成物。
10. １０．前記増殖因子および化学遊走因子が、マトリックス中で２−５０ｎｇ／ｍ ｌの濃度のＴＧＦ−βである；そして前記トランスフォーミング因子が、適切な 送達システムに組込まれたＴＧＦ−βであり、該送達システムが、マトリックス 中で２００ｎｇ／ｍｌを超える濃度のＴＧＦ−βを提供する；請求項８に記載の 組成物。
11. １１．前記送達システムが、リボソーム、生物腐食性ポリマー、へパリン硫酸プ ロテオグリカン類に化学的に結合したコラーゲン線維、および炭水化物ベースの 小体からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
12. １２．軟骨の欠損あるいは損傷の、治療あるいは修復のための組成物であって： トロンビンをフィブリノーゲン溶液に添加することで形成したフィブリンマトリ ックス； 該フィブリノーゲン溶液１ｍｌ当り２−１０ｎｇの濃度で存在するＴＧＦ−β： および リボソーム中にカプセル化され、そして、該フィブリノーゲン溶液１ｍｌ当り２ ００ｎｇを超える濃度で存在するＴＧＦ−β；を含有する組成物。
13. １３．動物の軟骨組織の選択された部位に、軟骨形成を誘起する方法であって、 請求項２に記載の組成物で該部位を覆う工程、を包含する方法。
14. １４．動物の軟骨組織の選択された部位に、軟骨形成を誘起する方法であって、 請求項１２に記載の組成物で該部位を覆う工程、を包含する方法。
15. １５．動物の軟骨の欠損あるいは損傷を治療する方法であって： 修復細胞の増殖を刺激するために有効な量の増殖因子；マトリックスおよび欠損 へ、修復細胞を誘引するために有効な量の化学遊走因子；および 修復細胞を軟骨細胞に形質転換するために有効な量の、送達システムに組込まれ たトランスフォーミング因子；を含有する生物分解性マトリックスを、欠損へ充 填する工程、を包含する方法。
16. １６．動物の軟骨中の選択された部位の欠損あるいは損傷を治療する方法であっ て： マトリックスおよび欠損あるいは損傷へ修復細胞を誘引するために有効な量の化 学遊走因子、および修復細胞の増殖を刺激するために有効な量の増殖因子、を含 有する生物分解性マトリックスを、欠損あるいは損傷へ充填する工程；および該 欠損に該マトリックスを充填してから約１−２週間後に、修復細胞を軟骨細胞に 形質転換するために十分な濃度でトランスフォーミング因子を該マトリックス中 に送達する工程；を包含する方法。
17. １７．前記欠損へ生分解性マトリックスを充填する前に、核欠損の表面をフイブ リン接着剤あるいはトランスグルタミナーゼで覆う工程をさらに包含する、請求 項１５あるいは１６に記載の方法。
18. １８．動物の軟骨の欠損あるいは損傷を治療する方法であって： 該欠損の表面からプロテオグリカンを除去する薬剤を、欠損に充填する工程； 該薬剤を除去する工程；および 修復細胞の増殖を刺激するために有効な量の増殖因子を含有し、そして、修復細 胞を軟骨細胞に形質転換するために十分な濃度でトランスフォーミング因子を放 出する送達システムと組合わせたトランスフォーミング因子とを含有する、生物 分解性マトリックスで、該欠損を覆う工程；を包含する方法。
19. １９．動物の軟骨の欠損あるいは損傷を治療する方法であって： 該欠損の表面からプロテオグリカンを除去する薬剤を、欠損に充填する工程； 該薬剤を除去する工程； 修復細胞の増殖を刺激するために有効な量の増殖因子を含有する生分解性マトリ ックスで該欠損を覆う工程；および該欠損を充填してから約１−２週間後に、修 復細胞を軟骨細胞に形質転換するために十分な濃度でトランスフォーミング因子 を該マトリックス中に送達する工程；を包含する方法。
20. ２０．欠損あるいは損傷を前記生分解性マトリックスで覆う前に、該欠損あるい は損傷の表面をフィブリン接着剤あるいはトランスグルタミナーゼで覆う工程を さらに包含する、請求項１８あるいは１９に記載の方法。
21. ２１．前記生分解性マトリックスがさらに、該マトリックスおよび軟骨の欠損あ るいは損傷の領域へ修復細胞を誘引するために十分な濃度で化学遊走因子を含有 する、請求項１８あるいは１９に記載の方法。
22. ２２．欠損の表面からプロテオグリカンを除去する前記薬剤が、コンドロイチナ ーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、ヒアルロニダーゼ、ペプシン、ババイン 、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、ストロメリシンおよびスタフＶ８ プロテアーゼからなる群より選択される、請求項１８あるいは１９に記載の方法 。
23. ２３．前記増殖因子、前記化学遊走因子および前記トランスフォーミング因子が 、ＴＧＦ−βである、請求項２１に記載の方法。
24. ２４．トランスフォーミング因子を送達するための前記送達システムが、リボソ ーム、生物腐食性ポリマー、へパリン硫酸プロテオグリカンに化学的に結合した コラーゲン線維、および炭水化物ベースの小体からなる群より選択される、請求 項１８に記載の方法。
25. ２５．前記生分解性マトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、セフ ァロース、あるいはこれらの組合わせからなる群より選択される、請求項１５、 １６、１８あるいは１９に記載の方法。
26. ２６．前記生分解性マトリックスが、フィブリノーゲン溶液で前記欠損あるいは 損傷を充填する直前に、フィブリノーゲン溶液にトロンビンを添加することによ って形成された、フィブリンである、請求項１５、１６、１８あるいは１９に記 載の方法。
27. ２７．前記増殖因子および前記化学遊走因子が、１ｍｌのマトリックス当り２− １０ｎｇの濃度のＴＧＦ−βであり、そして、前記トランスフォーミング因子が 、リボソーム中にカプセル化され、１ｍｌのマトリックス当り２００ｎｇを超え る濃度で存在するＴＧＦ−βである、請求項２１に記載の方法。
28. ２８．欠損の表面からプロテオグリカンを除去する前記薬剤が、コンドロイチナ ーゼＡＢＣであり、そして、１単位／ｍｌの濃度のコンドロイチナーゼＡＢＣを 含有する溶液を４分間、該欠損に充填する、請求項１８あるいは１９に記載の方 法。
29. ２９．前記生分解性マトリックスがさらに、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐを含む細胞接着促進因子を含有する、請求項１５、１６、１８あるいは１９に 記載の方法。
30. ３０．動物の軟骨の欠損あるいは損傷を治療する方法であって： １単位／ｍｌの濃度のコンドロイチナーゼＡＢＣの無菌溶液を４分間、該欠損あ るいは損傷領域に充填する工程；該コンドロイチナーゼＡＢＣの溶液を除去する 工程；無菌生理食塩水で該欠損領域を洗浄する工程；該欠損領域を乾燥する工程 ； １ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを含有し、そして２−１０ｎｇ／ｍｌの濃度の ＴＧＦ−βと、２００ｎｇ／ｍｌを超える濃度のリボソーム中のＴＧＦ−βとを 含む、マトリックス形成溶液の１ｍｌ当り２単位のトロンビンを添加する工程； および 該トロンビンを添加した直後に、該マトリックス形成溶液を該欠損に充填する工 程； を包含する方法。
31. ３１．マトリックス形成溶液を前記欠損に充填する前に、フィブリン接着剤ある いはトランスグルタミナーゼで該欠損の表面を覆う工程をさらに包含する、請求 項３０に記載の方法。
32. ３２．リボソーム中の前記ＴＧＦ−βが、５００ｎｇ／ｍｌよりも高い濃度であ る、請求項３０に記載の方法。