JPH06509231A - カラーゼに関連したｄｎａおよび人工的な雄性不稔化におけるこれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物に関する雄性不稔化システムにおいて有用な組換え、単離および 他の合成りＮＡに関するものである。特に、本発明は、回復可能な雄性不稔化シ ステムに関するものである。雄性不稔性植物は、有性雑種形成によるハイブリッ ド植物の生産にａ用である。

ハイブリッド植物は、ヘテロシス（ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ）若しくは雑種強勢（ｈ ｙｂｒｉｄ　ｖｉｇｏｕｒ）のため、親株より高い収率および良好な病気に対す る耐性という長所を何する。親株が非常に同型接合である際には、穀物の均一性 はハイブリッド植物のもう一つの長所である；これによって、穀物の管理が向− ヒされる。したがって、ハイブリッド形成した種は商業に重要であり、非常に高 価で売られる。

ハイブリッド植物を生産することによって、雌性の親株が自家受精しなくなる。

自家受粉を防止するために、従来、多くの物理的、化学的および遺伝学的な提案 が成された。

遺伝学的な方法のうち、朽に特異的な遺伝子またはこれらのプロモーターを花粉 粒の正常な生産を妨げるのに使用することが挙げられる。例えば、朽に特異的な プロモーターを、好ましい時期に目的とする場所で１雄性不稔ＤＮＡＪを誘導す るのに使用できる。雄性不稔ＤＮＡとしては、溶菌酵素をコードするものが挙げ られ、さらに、溶菌酵素をコードするものとしては、タンパク質、核酸および炭 水化物を分解するものが挙げられる。グルカナーゼは炭水化物を分解する酵素で ある。

ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号（プラント　ジェネティック　システムズ（Ｐｌａ ｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　（ＰＧＳ）　）およびＷＯ−Ａ−９ ２１１３７９号にッカーソン　インターナショナル　ンード　カンパニー　リミ テッド（ｌＪｉ（ｋｅｔｓｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｅｅｄ　Ｃｏ ｍｐａｎ７　Ｌｉｍ１ｔｅｄ））は、可能な雄性不稔ＤＮＡのうちグルカナーゼ をコードするＤＮＡの特徴を記載している。多（の植物のグルカナーゼの特徴が 明らかになり、場合によってはクローニングされた遺伝子（例えば、防御−関連 ｒＰＲＪグルカナーゼ（ｄｅｆｅｎｃｅ−「ｅｌａｔｅｄ　’ＰＲ’　ｇｌｕｃ ａｎａｇｅｌ）も特徴が明らかになってきたが、今日までに、小胞子の放出の役 割と調和する特性を有するグルカナーゼは報告されていない。小胞子の放出は、 未成熟な小胞子がこれによって減数分裂前の小胞子形成細胞（ｍｉｃｒｏｓｐｏ ｒｏｇｅｎｏｕｇ　ｃｅｌｌ）によって貯蔵されたβ（１，３）ポリ−グリカン （力ロース）の保護被膜から遊離されるプロセスである（ロウリ−（Ｒｏｗｌｅ ｙ）、グラナ　パリノル（Ｇｒａｎａ　Ｐａ１ｙｎｏ１．）、２巻、ページ３〜 ３１（１９５９年）；およびヘスロソプーハリソン（Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉ ｓｏｎ）　、カン　ジ工−ボット（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｏｊ、　）、４６巻、ペ ージ１１８５〜１１９１　（１９６８年）およびニュー　フィトル（Ｎｅｗ　Ｐ ｈ７１ｏ１．）　、５７巻、ページ７７９〜７８６　（１９６８年））。

このカロース被膜の分解を行う朽−発現（ｉｎｔｈｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ） グルカナーゼは、カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）として知られている。カラーゼ（ ｃａｌｌａｓｅ）は、タベータムの細胞によって合成され、室中に分泌される。

酵素活性化は小胞子の発育の特定の段階と正確に一致するように発育段階上で調 節される。

不稔ＤＮＡとしてのグルカナーゼの使用は、カラーゼ（Ｃａｌｌａｓｅ）の活性 化の時期を逸することは雄性不稔のタイプによっては関連があるという事実に基 づいている（ワームケ（Ｗａｒｍｋｅ）およびオヴアーマン（Ｏｖｅｒｍａｎ） 　、ジエー　ヘレド（Ｊ、　１ｌｅｒｅｄ、）　、６３巻、ページ１０３〜１０ ８　（１９７２年））。グルカナーゼの活性化が成熟前または遅いかによって、 ２タイプが認識されている。両方のタイプが自然界で見付かっているため、強力 な不稔ＤＮＡとしてのグルカナーゼの重要な魅力の一つとしては自然のシステム の中ですでに存在するということがある。活性カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）の産 生のできない植物は自然界では報告されていないが、このタイプの突然変異体は ほとんど得られている。カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）が産生できないことによっ て小胞子の放出が阻害され、これによって花粉の発育の停止および雄性不稔化が 起こる。したがって、カラーゼ（ｃａｌｌａｓｅ）の発現を阻害することによっ て雄性不稔化システムの基礎が形成される。

様々な研究によって、カラーゼは、おそら＜　ｒＰＲＪグルカナーゼ等の、他の タイプのグルカナーゼとは異なることが指摘されている。例えば、カラーゼ活性 は転写および転写後の両方の制御を受ける。これは、室のｐＨ、カラーゼ活性お よび小胞子の放出時期の間には強い関係があるという事実によって支持されてい る（イツハール（ｌｘｈｘｒ）およびフランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）　、セオル 　アンド　アップルジェネット（Ｔｈｅｏｒ、ａｎｄ　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ 、）　、４１巻、ページ１０４〜１０８　（１９７１年））。室のｐＨおよびカ ラーゼ活性は発育上調節されて同じように変化する。繁殖能力のあるペチュニア 　ハイブリダ（Ｐｅｆｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄｓ）の朽において、減数分裂時の ｐＨは６．８〜７．０であり、カラーゼ活性は検出不能である。減数分裂後、四 分子の段階では、室のｐＨは５．９〜６．２まで素早く低下し、カラーゼ活性が 鋭く増加し、これによって小胞子が放出する。

雄性不稔性のペチュニア（Ｐｅｆｕｎｉａ１株によっては、ｐＨの低下およびカ ラーゼの活性化が早熟であり、このため明らかに小胞子形成（ｍｉｃｒｏｓｐｏ ｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）の崩壊が起こる。

同様にして、他のクラスの突然変異体では、室のｐＨの低下およびカラーゼの活 性化が両方とも遅く、このため明らかに小胞子の発育の停止が生じる。

したがって、以下のことが考えられる：（１）カラーゼの活性化の時期は正常な 小胞子の発育にとって重要である。（未成熟で放出された小胞子の発育の停止は 、小胞子がカロースの被膜の保護なしで生存できるようになる前にある発育段階 に到達しなければならないことを示していると考えられる）； （２）室のｐＨの低下はカラーゼの活性化と平行である；および （３）２つの事項（カラーゼ活性の生産およびｐＨの低下）はある種の様式で同 等に調節される。

カラーゼ活性とｐＨの同等な調節の正確なことは不明である。ｐＨの低下は他は 十分に機能的な酵素を活性化する（受動的な活性化）。または、酵素が、むしろ プロテアーゼのチモーゲンのように不活性の形態で合成され、Ｎ−末端の除去あ るいはＣ−末端の付加等のある種のｐＨに依存性の事項の結果活性化される（能 動的な活性化）。カラーセ、およびＰＲ−グルカナーゼを自む、おそらくすべて のグルカナーゼは、小胞子の放出前の間中の状態であるより十分低い、ｐＨが６ ．３を超えると検出不能な活性を有するという事実は受動的な活性化の理論を承 認する。

しかしながら、カラーゼの現行のアッセイは未完成であり、活性の測定によって いるため、酵素が：ｉ）小胞子の放出前であるが、より遅い活性化のために非機 能的な形態で産生される；　ｉ　ｉ）必要な特にのみ正確に活性状態で合成され る。またはｉ　ｉ　ｉ）予め活性状態で合成され、ある種の小嚢中のタペータム 細胞内に貯蔵され、小胞子の放出時に室中に放出されるのいずれかであることを いうことはできない。カラーゼ活性が小胞子の放出の正常な時期の前に検出され る際でも、ｐＨの低下およびカラーゼ活性が同様に相関するという事実によって 、酵素は必要となる前に予め不活性状態で合成され、ｐＨの低下によって何等か の様式で活性化されることが示される。または、ｐＨの低下がタペータム細胞に おけるカラーゼの合成の引き金となっている。どちらが事実であるかは分からな いが、カラーゼではないグルカナーゼの発現によって雄性不稔性が生じるかどう かを予測することができないことは、重要な点である。

カラーゼが従来特徴が明らかになったグルカナーゼとある点で異なると思われる という事実は、以下の３つの重要な結果を有する： （１）防御−関連ｒＰＲＪグルカナーゼ（ｄｅｆｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　’ ＰＲ’　ｇｌｕｃａｎａｓｅ）等の、グルカナーゼは室中の条件下では効果的に 機能せず、このため雄性不稔ＤＮＡの成分としては十分有用ではない； （２）このようなグルカナーゼが室内で活性を有する場合であっても、最大の野 生（ｍａｘｉｍｕｍ　ｎａｊｕｒａｌｎｅｓｓ）は、現行のタイプの雄性不稔性 植物を模倣するという意味において、本来のカラーゼ遺伝子を使用する必要があ る。この意味では、カラーゼ遺伝子の使用を基礎とした雄性不稔化システムは従 来報告されたシステムのいずれよりも優れている；さらに、 （３）抗カラーゼｍＲＮＡ、リボザイムまたはカラーゼのアンチセンスＲＮＡを 用いてカラーゼｍＲＮＡを破壊することによるカラーゼの発現を阻害することを 元にしたシステムは、カラーゼのｒｎＲＮＡのヌクレオチド配列の詳細な知志が 必要である。

本発明は、アブラナ科（Ｉａｍｉｌｙ　Ｂｒａｇｓｉｃａｃｅａｅ）の植物中の カラーゼ遺伝子の発見および同定に基づくものである。

フラッシカ　ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）中の上記遺伝子由来のｃ ＤＮＡおよびアラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｇｔｈａｌｉｉ ｎｉ）由来の遺伝子のゲノムバージョン（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｖｅｒ日ｏｎｌ　を クローニングした。これらおよびこれらに関連したＤＮＡ　（カラーゼ遺伝子の プロモーターを含む）を人工的な雄性不稔化システムの構築において使用できる 。繁殖能力はアンチセンスＲＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡ結合タンパク質を用 いてＦ１世代において回復できる。

本発明の第一の概念によると、カラーゼ酵素、特にフラッシカ　ナブス（Ｂｒａ ｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｇ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａ ｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質の活性を 有する酵素をエンコードする組換えまたは単離ＤＮＡを提供するものである。

本明細書において、フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラ ーゼ酵素をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（ｌａｍｉｌｙ　Ｂｒａｇｓ ｉｃａｃｅａｅ）の他の植物における同様の遺伝子はＡ６遺伝子と称する。

本発明の上記概念の好ましい実施態様としては、フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａ ｐｕｓ）自身の５３ｋＤａのカラーゼ酵素およびアラビドプシス　タリアナ（Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の同様の酵素をエンコードする 遺伝子およびこれらのｃＤＮＡが挙げられる。

上記で引用された分子量は推定されたものであり、ＤＮＡ配列から引き出した、 存在すると考えられるアミノ酸の数から算定している。フラッシカ　ナプス（Ｂ 、ｎａｐｕｓ）のＡ６遺伝子によってエンコードされる５３ｋＤａのタンパク質 は４７４アミノ酸を有する。したがって、この分子量は配糖化されていないタン パク質に関するものであると考えられる。さらに、部分的なタンパク質分解等の 他の翻訳後プロセッシングに関する効果は割引いて考えられる。

上記で示された図式はフラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のタンパク質に関 するもののみであるが、当業者はアブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａ＋５ｉｃａ ｃｅａｅ）の他の植物の同様なタンパク質を容易に同定することができる。例え ば、アラビドプシスタリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）の同様のＡ６遺伝子は、 ５３゜７ｋＤａの算定された分子量を有する４７９アミノ酸長の推定タンパク質 をエンコードする。このような同様な遺伝子は、ハイブリッド形成に関する研究 、制限断片長条型（ｒｅｓｔ＋１ｃｌｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ 　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　（ＲＦＬＰ）及び他の既知の方法によって同定 される。はとんど等価のタンパク質をエンコードする遺伝子または他のＤＮＡ配 列は、天然のもの、遺伝子操作されたものまたは合成されたものであっても、例 えば、厳しい条件下（約０．９モルの食塩水中で約３５℃から６５℃等）でフラ ツシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ６遺伝子、またはこれらの断片、例えば １０．２０．５０若しくは１００ヌクレオチドに対して／’％イブリッドを形成 する。１５〜２０ヌクレオチドのプローブが多くの環境下で好ましい。

修飾されあるいは天然のアブラナ科（Ｂｒａｇｓｉｃａｃｅａｅ）　の植物のＡ ６配列とは異なるＤＮＡ配列は、例えば、これらが」二記ハイブリッド形成の基 準を満たしている、または遺伝暗号の縮重がなかったならば基準を満たしている と考えられる場合には、本発明の概念に含まれる。

本明細書において記載されている好ましいＡ６のコーディング配列（ｃｏｄｉｎ ｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は、フラツシカ　ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕ ｓ）またはアラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄ。

ｐｓｉｓ　ｆｈａｌｉａｎａ）由来のものであり、例えば、（ａ）ブラ’７シカ 　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓｌまたはアラビドプシス　タリアナ（Ａ、Ｉｈａｌｉ ａｎａ）の雄すいから単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、（ｂ）このｃ ＤＮＡを単離し、（Ｃ）このｃＤＮＡをプローブとして用いて雄ずいに特異的な ｍＲＮＡをエンコードするアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｇｓｉｃａｃｅａ ｅ）の選ばれたものの植物のゲノム領域を同定し、さらに、（ｄ）このＤＮＡの プロモーターを含む（５′）上流の調節領域を同定することによる等、既知の方 法によって単離できる。

また、この方法は、植物のある一種の雄ずいに特異的なりＮＡのコーディング領 域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を基礎とする、またはこれ由来のプローブを 用いて他の種の雄ずいに特異的なｍＲＮＡをエンコードするＤＮＡ配列を単離で きることをも示している。

特に好ましいコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は、以下の 実施例において記載されているように、図１（フラッシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａ ｐｕｓ）のＡ６遺伝子に関する）および図４（アラビドプシス　タリアナ（Ａ、 ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子に関する）中に示される。当業者は、本明細書 に記載された情報によって、コーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ） を十分正確に同定し、さらにこれらを含むＤＮＡを単離するおよび／または組換 えることが可能である。

本発明の第一の概念によるＤＮＡは、雄性不稔化システムを得る上で有用である 。このＤＮＡに適当なプロモーターを操作して連結する（ｏｐｅｒａｊｉｙｅｌ ｙ　１ｉｎｋ）ことによって、例えば早期すぎる等、自然界では不適当な時期に 発現させることができる。適当なプロモーターとしては、天然のＡ６プロモータ ー以外のタベータムに特異的なプロモーターが挙げられる。これらのうち、ＷＯ −Ａ−９２１１３７９号において記載され、請求され、Ａ３およびＡ９と称され たものが好ましいプロモーターである。ＷＯ−Ａ−９２１１３７９号において、 アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌ１ａｎａ）の１２．９ｋＤａのタンパ ク質をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（ｆｘｍｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃ ａｃｅａｃ）の他の植物における同様の遺伝子はＡ３遺伝子と称する；アラビド プシス　タリアナ（Ａ、ｆｈａｌｉａｎａ）の１１．６ｋＤａのタンパク質をエ ンコードする遺伝子およびアブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａ ｅ）の他の植物における同様の遺伝子は、ブラ・ノシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕ ｓ）における１０．３ｋＤａのタンパク質をエンコードする遺伝子を含めて、Ａ ９遺伝子と称する。ＷＯ−Ａ−９２１１３７９号の内容はここに参考のため引用 する。

本発明による発見は、雄性不稔化システムを得るために多くの他の方法に利用で きる。Ａ６プロモーターは、例えば、詳しく述べる必要はないが、雄性不稔ＤＮ Ａを誘導するために用いられる。

本発明の第二の概念によると、カラーゼ酵素、特にフラッンカ　ナプス（Ｂｒａ ｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａ ｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様なタンパク質の発現を そのまま誘導するプロモーターを有する組換えまたは単離ＤＮＡ配列を提供する ものである。

Ａ６遺伝子の発現の調節の自然の特異性によって、へ６プロモーターが有用な雄 性不稔化システムを得るために必ずしも特異的なディスラブター（ｄｉｓｒｕｐ ｔｅｒ）　ＤＮＡに（連結できるが）連結される必要はない；非特異的なディス ラブター（ｄｉｓｒｕｐＨｔ）　Ｄ　Ｎ　Ａを使用できる。

アブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の植物のＡ６プロ モーターおよび修飾されたＡ６プロモーターを使用してもよく、必要であれば、 必要な変更を加えて（ｍｕｔａ目ｓ　ｍｕｔａｎｄｉｓ）、Ａ６コーデイング配 列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に関して上記で記載したように、位置を 決定しあるいは同定し、さらには単離してもよい。繰り返していうが、好ましい プロモーターはフラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）およびアラビドプシス　 タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）由来であり、以下に記載するように、図１お よび４において示されたコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ） を誘導するためにそのまま用いられる。

本発明によるＡ６プロモーターを含むＤＮＡは、上記したように、以下に記載す る様々な方法で、植物、特にアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｇｓｉｃａｃｅ ａｅ）に属するものに雄性不稔性を供与するために使用できる。したがって、本 発明の重要な実施態様においては、」二記したプロモーターを発現すると雄性不 稔性を引き起こすＤＮＡに操作して連結する（ｏｐｅｒａｊｉｖｅｌｙ　１ｉｎ ｋ）。

効果的な不稔化システムが完成したため、種籾の繁殖は、無性の方法によってま たは雄性稔性の同質遺伝子系統による雄性不稔の受粉を経て、さらに、子孫のう ちから雄性不稔性植物を同定若しくは選択することによって行われなければなら ない。栄養成長による繁殖が行われれば、本発明はハイブリッドを生産するのに 完璧なシステムを形成する。

種子穀物を生産するために稔性の回復が必要である際には、本発明は新たな雄性 不稔化システムの基礎を形成する。異花受粉レベルが高い種子穀物によっては、 種子を混合することによって回復を回避できる。雄性不稔は、稔性の回復が必要 でない作物、例えば、アブラナ亜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｓｐｐ。

）の野菜等、及びレタス、はうれんそうやたまねぎ等の他の食用の植物等におい て特に有用である。

Ａ６プロモーターを導入した本発明によるＤＮＡは、雄性不稔ＤＮＡを誘導でき るので、ハイブリッド生産において使用できる雄性不稔性植物を生産できる。こ のプロモーターは、非常にタペータムに特異的であるため、不稔ＤＮＡはタペー タム内でのみ発現する。発現の制御は非常に強力であり、このＤＮＡは植物の他 の細胞では発現しない。

このシステムは生育できる花粉粒の生産を阻害する。すべての形質転換植物およ びそれらの子孫は雄性不稔性である；減数分裂による分離（ｍｅｉｏｆｉｃ　ｓ ｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）に関する問題は生じない。

雄性不稔ＤＮＡに操作して連結されたプロモーターからなる構築物を、よく知ら れている方法によって植物（特にアブラナ属ｆｇｅｎｕｓ　Ｂ＋ａｓｓ、１ｃａ ）、さらにはニコチアナ（Ｎ　ｉ　ｃ　ｏ　ｔｉａｎａｌ及びホルデウム（Ｈｏ ｒｄｅｕｍ）等の他の属のもの）に形質転換できる。この形質転換によって、細 胞がプロモーター及び雄性不稔ＤＮＡからなる外来のキメラＤＮＡを有する、植 物が生産できる。雄性不稔ＤＮＡは、植物の雄ずい細胞で生産または過剰生産さ れると、雄ずい細胞の正常な発育を阻害する、ＲＮＡ、タンパク質若しくはポリ ペプチドをエンコードする。

Ａ６プロモーターは、生育できる雄性配偶子を生産するメカニズムの欠損を引き 起こすＲＮＡ、タンパク質若しくはポリペプチドをコードする様々な雄性不稔Ｄ ＮＡ配列を誘導するのに用いる。本発明は、誘導される配列に限られないが、雄 性不稔プロモーターを誘導できる配列の多くのクラス、特にこれらの実施例が好 ましい。

例えば、誘導できる雄性不稔ＤＮＡは溶菌酵素をエンコードする。この溶菌酵素 は、核酸、タンパク質（若しくは糖タンパク質）、炭水化物および（場合によっ ては）脂質等の高分子等の、１つまたはそれ以上生物学的に重要な分子の分解を 引き起こす。

リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ　Ｔ１およびバーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）等） は、ＲＮＡの分解を引き起こす酵素の例である。ＤＮＡを分解する酵素の例とし ては、ＥｃｏＲＩ等の部位特異的若しくは部位非特異的である、エキソヌクレア ーゼおよびエンドヌクレアーゼが挙げられる。

そのコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に本発明のプロモー ターがそのまま連結するカラーゼ以外のグルカナーゼは、炭水化物の分解を引き 起こす酵素の例である。グルカナーゼ（カラーゼ）酵素は、減数分裂前に作製さ れたポリグルカンの保護膜から若い小胞子を放出する機能を有する、杓内で自然 に生産される。この酵素活性化は、小胞子の発育の正しい段階に一致するように 発育段階上で調節される。強力な不稔ＤＮＡとしてのグルカナーゼの重要な魅力 の一つとしては、カラーゼの発現の時機を逸し、小胞子の破壊を引き起こす突然 変異によって雄性不稔性である植物が自然界で知られていることである。カラー ゼの活性化が成熟前または遅いかによって、２タイプが認識されている。朽内で 発現するもの等の、多くの遺伝子の発現によって様々なパターンの時間的な調節 （ｔｅｍｐｏＩａｌ　ｒｅｇｕｌａｌｉｏｎｌがある。したがって、カラーゼを 不稔ＤＮＡとして用いるために、遺伝子の発現を誘導するように選択されたプロ モーターによって、好ましくは自然の雄性不稔に関して見付かった発現のパター ンを擬態することによって、グルカナーゼ活性を発育段階で好ましく調節できる 。雄性不稔を得る一つの方法としては、雄性不稔性の突然変異植物内でグルカナ ーゼ活性を発見したのと同様の発現パターンを有するタペータムに特異的な遺伝 子からプロモーターを単離することがある。グルカナーゼの発現が遅いと機能的 な杓のグルカナーセ遺伝子を有する植物において不稔性が生じにくいので、不稔 性因子には、正常なグルカナーゼの活性化の前に転写を誘導できるプロモーター が必要である。ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）のＲＭｃｍｓ　突然変異体（イツ ハール、ニス（Ｉｘｈａ＋、Ｓ、）およびフランケル　アール（Ｆ＋ａｎｋｅｔ 、Ｒ，）、セオル　アプル　ジエネット（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ ｌ、）、４１巻、ページ１０４〜１０８　（１９７１年））において、朽内のカ ラーゼの発現はまず減数分裂前期の終りに起こり、さらに、減数分裂の完了によ って最高まで増加する。この発現パターンは正常なペチュニア（Ｐｃｔｕｎｉａ ）の植物のものとは対照的であり、朽内のグルカナーゼは四分子の破壊および若 い小胞子の放出に付随して活性化される。

このｃｍｓ変異体において見つかったカラーゼ活性の異常なパターンは、小胞子 の破壊および雄性不稔に応答すると考えられる。したがって、グルカナーゼ酵素 をエンコードする不稔ＤＮＡを用いてこの変異を擬態するには、減数分裂前期と 小胞子の四分子の出現との間の朽の発育期間中に、朽内、好ましくはタペータム 内の雄性不稔ＤＮＡの転写を誘導できるプロモーターが必要である；したがって 、上記の八３およびＡ９プロモーターはこの遺伝子を誘導するのに非常に適して いる。β（１，３）−グルカンが必須な機能をしていると考えられる植物内のど こか、例えば篩部の篩要素において見付かっているので、タペータムに特異的な （または少なくとも杓に特異的な）プロモーターもまた好ましい。

また、この酵素の空間的な調節（ｓｐａｊｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によ って標的細胞に接近できる。室部分への分泌は、好ましい実施態様においては、 グルカナーゼのコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　との翻 訳融合（ｔ＋ａｎｌａｔｉｏｎｘｌ　Ｉｕｓｉｏｎ）における天然のあるいは他 の適当なシグナル配列を提供することによって得られる。

グルカナーゼをエンコードするＤＮＡは、標的細胞の外が細胞毒性である生成物 を有さないので、雄性不稔ＤＮＡとして好ましい。雄性不稔ＤＮＡとしてのグル カナーゼは自然のシステムを擬態し、例えばリボヌクレアーゼに比べて本質的に 破壊的でないので、「漏れ」が他の細胞に生じる等の問題が存在しない。

アクチニジンは、プロテアーゼの一例であり、これをコードするＤＮＡは適当な 雄性不稔ＤＮＡとなりうる。他の例としては、パパインのチモーゲンおよびパパ インの活性タンパク質が挙げられる。

相当する核酸が雄性不稔ＤＮＡとして有用であるリパーゼとしては、ホスホリパ ーゼ　Ａ２が挙げられる。

雄性不稔ＤＮＡが溶菌酵素をエンコードする必要はない。

雄性不稔ＤＮＡの他の例では、サイトカイニンの合成に含まれる、イソペンチル トランスフェラーゼ（ｉｓｏｐｅｎｔｙｌ　ｔｒａｎｓｌｅ＋ａ＋ｅ）等の、植 物ホルモンの合成を触媒する酵素、およびオーキシンの合成に含まれる１つまた はそれ以上の酵素をエンコードするものかある。リポキシゲナーゼまたはａ害な 効果を有する池の酵素をコードするＤＮＡもまた用いられる。

他の雄性不稔ＤＮＡとしてはアンチセンス配列が挙げられる。自然界で発見され たものとは反対の配向の遺伝子のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏ ｎ）を誘導することによって、遺伝子のダウンレギュレーションが生じ、これに よって、遺伝子生成物がより少量しか生産されないまたは全く生産されない。ア ンチセンスＤＮＡから転写されたＲＮＡは、細胞において一般的に発見される配 列のセンスＲＮＡバージョン（ｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ｖｅｒｓｉｏｎ）に結合で き、さらに上記の機能を破壊でき、これによって機能を欠損させることができる 。このようなアンチセンスＤＮＡの例としては、Ａ６プロモーターの制御下で間 中で生産されるＡ６遺伝子のアンチセンスＤＮＡがある。この遺伝子は一般的に タペータム内で発現するため、上記遺伝子に対するアンチセンスはタペータムの 機能を破壊し、これによって雄性不稔が起こると考えられる。

アンチセンスＤＮＡが自然のセンス転写生成物（ｎ　ａ　ｔ　ｕ　ｒ　ａ　１ｓ ｅｎｓｅ　Ｈａｎ＋ｃｒｉｐｌｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）が生産されている時に 転写されることのみが決定的な要因ではない。アンチセンスＲＮＡは、通常、そ のセンス相補鎖（ｓｅｎｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｕｒａｎｄ＞である 時に結合するのみであるため、センスＲＮＡが転写される際にのみ毒性効果を有 する。したがって、Ａ６遺伝子生成物をエンコードする幾つかの若しくはすべて のＤＮＡに相当するアンチセンスＤＮＡは、Ａ６遺伝子が発現している間のみ生 産されるわけではない。このようなアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター の制御下で構成的に発現する。

したがって、本発明のさらなる概念によると、フラッシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａ ｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉ１７　Ｂｒａ ｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質等の、カラーゼ酵素をエン コードする遺伝子においてそのまま転写されるＤＮＡ鎖の少なくとの一部に相補 的である転写可能なりＮＡ鎖を有するアンチセンス核酸を提供するものである。

本発明の上記概念によるアンチセンスＤＮＡは、必ずしも以下の間に限られない が、タペータムの発育の間に転写できる適当なプロモーターの制御下にある。し たがって、上述したように、このプロモーターは構成性であるが、本発明の第二 の概念に関する上記のＡ３及びＡ９等のタペータムに特異的なプロモーターを使 用してもよく、これらはより大きな制御に対しては好ましい。このようなアンチ センスＤＮＡは、通常、アブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｇｓｉｃａｃｅａｅ ）の植物の雄性不稔を得るのに有用である。

雄性不稔ＤＮＡのさらなる例としては、得られた標的配列に対して非常に特異的 に切断できるＲＮＡ酵素（リボザイムとして知られている）をエンコードするも のがある（ハセロフ（Ｌｅｌｏｆｆ）およびガーラツク（Ｇｅｒｌａｃｈ）　、 ネイチ−？　−（Ｎａｊｕｒｅ）、３３４巻、ページ５８５〜５９１　（１９８ ８年））。アンチセンスＤＮＡと同様、リボザイムＤＮＡ（例えば、Ａ６遺伝子 によってエンコードされるＲＮＡに対して標的にされたりボザイムをコードする ）は、Ａ６遺伝子の発現の時にのみ発現するとは限らない。また、構成性発現（ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用されるもの等、リボ ザイムをエンコードするＤＮＡを誘導するのに好ましいプロモーターを使用する ことも可能である。

したがって、本発明のさらなる概念によると、フラッシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａ ｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａ ｓｓｉｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質等の、カラーゼ酵素をエン コードする遺伝子によってエンコードされたＲＮＡを特異的に切断できるリボザ イムをエンコードするＤＮＡを提供するものである。このようなりボザイムをエ ンコードするＤＮＡは、通常、アブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃ ｅａｅ）の植物を雄性不稔化するのに有用である。

本発明のＤＮＡ配列の好ましい実施態様においては、Ａ６プロモーターー雄性不 稔ＤＮＡ構築物からなるものを含むが、ポリアデニル化シグナル（ｐａｌｙａｄ ｅｎ７１ａｊｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）等の３−転写調節シグナルが提供される。

３′転写調節シグナルは、好ましくは、カリフラワー　モザイク　ウィルスｆｃ ａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）　３５　Ｓ遺伝子由来であ る。

他の３−転写調節シグナルも使用できることを認識しなければならない。

上記のアンチセンス核酸およびリボザイムをエンコードする核酸は、さらに一般 的な原則の例であるニしたがって、本発明のさらなる概念によると、カラーゼ遺 伝子、または好ましい実施態様においてはＡ６遺伝子の適当な発現を選択的に破 壊する（例えば発現に関して）ＤＮＡを提供するものである。

本発明による組換ＤＮＡは、ベクターの形態を有する。

このベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージである。ベクタ ーは、しばしば、これらの感染した（または形質転換した：これらの言葉は本明 細書において交互に用いられる）細胞を選択でき、好ましくは、異種のＤＮＡを 導入したベクターを有する細胞を選択できるような１つまたはそれ以上の選択マ ーカーを有する。適当な開始シグナル（ｓｆａＮ　ｓｉｇｎａｌ）および停止シ グナル（ｓｔｏｐ　ｓｉｇｎａｌ）が通常存在する。さらに、ベクターが発現し ようとすると、発現を誘導するのに十分は調節配列（ｒｅｇｕｌａｉｏｒｙＳｅ ｑｕｅｎｃｅ）が存在する；しかしながら、本発明によるＤＮＡは通常植物細胞 において発現するため、微生物を宿主とする発現は、本発明の初期の目的の中に 含まれないが、使用してもよい。調節配列（ｒｅｇｕｌａ＋ｏｒｙ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ）を含まないベクターはクローニングベクターとして用いられる。

クローニングベクターを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）または操作が容易である他の適 当な宿主に導入できる。したがって、本発明のさらなる概念によると、上記した ＤＮＡを感染または形質転換した宿主細胞を提供するものである。

本発明によるＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのプロセス等、さらに続くヌクレオチ ドを一緒に連結する（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、および／またはオリゴ−および／ま たはポリ−ヌクレオチドを連結する（ｌｉｇａｊｉｎｇ）等の従来の方法によっ て調製できるが、組換ＤＮＡ技術も選択できる。

最後に、本発明によるＤＮＡ　（（ｉ）Ａ６プロモーターに雄性不稔遺伝子を加 えたもの、（ｉ　ｉ）　Ａ　６遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ若しくはＡ６ のＲＮＡに標的にされたりボザイムＤＮＡのどちらであっても）は、適当な方法 によって植物細胞に導入できる。本発明のさらなる概念によると、上記した本発 明によるＤＮＡを含む植物細胞を提供するものである。

好ましくは、例えば、ＥＰ−Ａ−０１１６７１８号およびＥＰ−Ａ−０２７０８ ２２号に記載されているもの等、既知の方法によってアグロバクテリウム（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅ「ｉｕｍ）によって運ばれ不活化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　 Ｔ　ｉ−プラスミドベクターを用いて、ＤＮＡを植物細胞中に形質転換する。

または、電気排出装置（ｅｌｅｃＨｉｃａｌ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅ　ａｐｐａｒ ａｔｕｓ）を用いて外来ＤＮＡを直接植物細胞に導入してもよい。上記方法は、 例えば、受容植物が単子葉植物である等、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ ！ｅｒｉｕｍ）が効果的でない時に好ましい。いずれかの種の植物細胞の核ＤＮ Ａ内でＤＮＡを安定して導入できる他の方法も好ましい。上記植物としては、遺 伝的形質転換が一般的に可能でない植物種が挙げられる。

また、本発明によるＤＮＡは、好ましくは、外来のＤＮＡを何する形質転換植物 が外来のＤＮＡを含まない他の植物と容易に区別できる第二のキメラ遺伝子（「 マーカー」遺伝子）を有している。このようなマーカー遺伝子の例としては、抗 生物質耐性（ヘレラーエストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら、エ ンボ　ジエ−（ＥＭＢＯＪ、）　、２巻、ページ９８７〜９９５　（１９８３年 ））、除草剤耐性（ＥＰ−Ａ−０２４２２４６号）およびグルクロニダーゼ（Ｇ ＵＳ）の発現（ＥＰ−Ａ−０３４４０２９号）等が挙げられる。マーカー遺伝子 の発現は、好ましくは、タペータム以外の細胞において発現できる第二のプロモ ーターによって制御され、これによって植物の再生のいずれかの段階でマーカー を有する細胞若しくは組織を選択できる。好ましい第二のプロモーターは、カリ フラワー　モザイク　ウィルス（Ｃａｕｌｉｌｌｏｖｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉ ｒｕｓ）　（ＣａＭＶ）の３５８サブユニツトのコートタンパク質をエンコード する遺伝子由来である。しかしながら、他の適当な第二のプロモーターを使用し てもよい。

植物全体は、１つの形質転換植物細胞から再生でき、したがって、本発明は、上 記した本発明によるＤＮＡを有する形質転換植物（または増殖材料等の、これら の部分）を提供するものである。再生は既知の方法によって行える。

形質転換された植物の花の場合では、生育できる花粉を生産できないことによる 雄性不稔であると考えられる。花粉が生産できる際には、受容植物の種子を得る ことができないことによって生育できないと考えられる。

本発明の方法によって剥奪された雄性の繁殖能力は、植物の雄性−不稔化に用い た特殊な方法に相当する性質を有する、適当な回復システムによって回復される 。以下に記載した特殊なおよび好ましい回復システムは、異なるメカニズム：ア ンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを基礎としている。

アンチセンスＲＮＡ　：ディスラブター（ｄｉｓｒｕｐｊｅｒ）遺伝子がアクチ ニジンタンパク質に関するｍＲＮＡ等の、朽でないｍＲＮＡをエンコードする際 には、適当に時間的な調節（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をしな がらタベータムに特異的なプロモーターによって誘導されるディスラブター（ｄ ｉｓｒｕｐｔｅｒ）　ｍＲＮＡに特異的なアンチセンスＲＮＡをエンコードする 遺伝子を雄性不稔性植物中にクロスする（ｃｒｏｓｓ）ことによって回復が得ら れる。これによって、センスＲＮＡの破壊および繁殖能力の回復が起こる。この 方法は、カラーゼのアンチセンスＲＮＡの発現によってターゲットとなるディス ラブター（ｄｉｓｒｕｐｆｅｒ）カラーセｍＲＮＡおよび小胞子の放出に必要で ある正常なカラーゼｍＲＮＡの両方が破壊され、生育できる花粉粒が生産される ため、ディスラブター（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）が未成熟な状態で発現するカラー ゼである場合には、使用できない。したがって、繁殖力は回復されない。

リボザイム：リボザイムのターゲット部位が小さく、このためどんなｍＲＮＡ中 にも操作できるため、この方法はさらに一般的に用いられる。これによって、原 則的には、導入されたｍＲＮＡが特異的に破壊される。したがって、アクチニジ ン等の非特異的なディスラブター（ｄｉｓｒｕｐｆｅｒ）機能をエンコードする ｍＲＮＡは破壊され、アクチニジンｍＲＮＡに特異的なりボザイムをエンコード する遺伝子中にクロスする（ｃｒｏｓｓ）　ことによって繁殖能力が回復する。

ディスラブター（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）がカラーゼである際には、未成熟な段階 で発現したディスラブター（ｄｉｓｒｕｐＨｒ）カラーゼｍＲＮＡの非翻訳リー ダー（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　１ｅａｄｅｒ）中に導入された短い合成 配列に特異的なりボザイムをエンコードする遺伝子中にクロスする（ｃｒｏｓｓ ）　ことによって、回復が行われる。この配列は正常な修飾されないカラー上ｍ ＲＮＡ中には存在しないため、正常な時期に起こるカラーゼの活性化に影響がな （、繁殖能力が回復される。

本発明の好ましい態様は一概念に関してのみ記載されてきた。好ましい態様は、 必要であれば適宜変更して（ｍｕｆａｊｉｓｍυｔａｎｄｉｓ）、本発明のすべ ての概念に用いられると考えられる。

本発明を、以下の添付した図を参照しながら、多くの制限のない実施例によって 詳細に説明する；図１は、Ａ６内に含まれるＯＲＦの推定のタンパク質の配列と 共にフラワシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡ　Ａ６のＤＮＡ配列を示 すものである； 図２は、前記したグルカナーゼの一次構造と共にブラ・ソシカ　ナプス（Ｂ、ｎ ａｐｕｓ）およびアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｆｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺 伝子の推定の一次構造のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示す；キーワ ードを以下に示す；Ｂｎ　Ａ６：　フラワシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の５ ３ｋＤａの朽に特異的なタンパク質 Ａｔ　Ｇ６２：アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈｉｌｉａｎｉ）の相当する Ａ６タンパク質 ＮＰＧＬＵＣ：タバコのβ−１，３グルカナーゼ（基本）（デルース（Ｄｅ　Ｌ ｏｏｓｅｌら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、７０巻、ページ１３〜２３、（１９８８年 ）） ＢＥＡＮ：　マメのβ−１，３グルカナーゼ（ニブイントン（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ ）ら、プラント　モルパイオル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）、１６巻 、ページ８１〜９４、（１９９１年）） ＰＲ−Ｑ　：タバコのβ−１，３グルカナーゼ（細胞外）（パイネ（Ｐａｙｎｅ ）　ら、プラント　モル　パイオル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１ ５巻、ページ７９７〜８０８、（１９９０年）） ＢＡＲＬＥＹ　：ホジ（Ｈｏｉ）　ら、プラント　モル　パイオル（Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１３巻、ページ３１〜４２、（１９８９年）； 図３は、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のゲツムクローン 　６６．２の制限酵素地図を示すものである。

関連した部位のみを示し、これらは６６．２にのみ有るものではない。八６のコ ーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｔｅｇｉｏｎ）の部分を黒塗りの箱として示す 。また、プラスミドｐＤＩＨ９中にクローニングされた挿入部分の範囲をも示す ；図４は、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子の ＤＮＡ配列および推定の一次構造を示す。下線部分の配列はＴＡＴＡボックスの モチーフ（ＴＡＴＡ　ｂｏｘ　ｍｏｔｉｆ）に適合している； 図５ａは、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子と のフラッシカ　ナブス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡＡ６のＤＮＡ配列の比較 を示すものである。下線部のトリヌクレオチドは、Ａ６のコーディング配列（ｃ ｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｌ　の出発部位および停止部位を示している；図 ５ｂは、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子によ ってエンコードされた推定のポリペプチドとのフラッシカ　ナブス（Ｂ、　ｎｘ ｐｕｓ）のｃＤＮＡ　Ａ６によってエンコードされた推定のポリペプチドの比較 を示すものである； 図６は、Ａ６プロモーターとβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）遺伝子との間の転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐ目ｏｎａｌ　ｆｕ ｓｉｏｎ）を有するキメラ遺伝子の構築を示す； 図７ａは実施例３ａに関するものであり、Ａ６プロモーターと成熟したバーナー ゼ（ｂａｒｎａｓｅ）をエンコードする配列との間の転写融合物（ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｊｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を有するキメラ遺伝子の構築を示す； 図７ｂは実施例３ｂに関するものであり、Ａ６プロモーターとアクチニジンをエ ンコードする配列との間の転写融合物（ｆｒａｎｓｃｒｉｐｊｉｏｎａｌ　ｆｕ ｓｉｏｎ）を有するキメラ遺伝子の構築を示す； 図８は、タペータムに特異的なプロモーターとアラビドプシス　タリアナ（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｇｉｇ　ｊｈａｌｉａｎａ）のカラーゼとの間のキメラ遺伝子の構 築を示し：ａ）は、Ａ９プロモーターとカラーゼとの間の転写融合物（Ｈａｎｓ ｃｒｉｐｆｉｏｎａｌ　１ｕｓｉ。

ｎ）；ｂ）は、Ａ９およびＡ６プロモーターとタンパク質のＣ末端の拡張（ｅｘ Ｈｎｓｉｏｎ）をエンコードする配列が欠損しているカラーゼとの翻訳融合物（ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を示す；および 図９は、プラスミドｐｗｐｓｏ、ｐＷＰ８３およびｐｗＰ８８の構築を示す。

図の中の制限酵素に関して用いられた略称は以下の通りである： Ｂ、ＢａｍＨＩ　；Ｂｇ、ＢｇｌＩ　Ｉ　；Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｈｄ、Ｈｉｎｄｌ ｌｌ；に、Ｋｐｎｌ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｎｃ、Ｎｃｏｌ　；Ｎｐ、Ｎ５ｐｌ　；Ｎ ｒ、Ｎｒｕｌ　；Ｐ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ　；ＲＩ、ＥｃｏＲＩ　；ＲＶ、ＥｃｏＲＶ ；Ｓ、Ｓｓ　ｔ　Ｉ　；Ｓａ、Ｓａ　Ｉ　Ｉ　；Ｓｐ、５ｐｈｌ　；Ｓｍ、Ｓｍ ａｌ；Ｓｌｌ、５ａｃＩＩ　；Ｘ、Ｘｈｏｌ；Ｘｂ、Ｘｂａｌｏ 実施例１−フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）からの杓に特異的なβ（１， ３）グルカナーゼ（カラーゼ）をエンコードするｃＤＮＡの単離およびアラビド プシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）からの相当す る遺伝子の単離以下に記載した（スコツト（Ｓｃｏｔ）　ら、プラント　モルパ イオル（Ｐｌａｎｊ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ。）、印刷中）ようにして、切開した 朽から抽出されたＲＮＡから構築されたフラッシカナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　 ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡライブラリーを分画スクリーニングｆｄｉｌｌｅｒｅｎ ｊｉａｌ　ｓｃｔｅｅｎｉｎｇ）することによって、朽に特異的なｃＤＮＡを単 離した。ｃＤＮＡクローンであるＡ６を１．８〜２．０ｍｍの長さである杓から 構築したライブラリーから単離した。このライブラリーを、ベクター　ラムダ　 ザップｒ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　２ａｐＨ）　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｊａ ｇｅｎｅｌ製）中に構築した。このＡ６ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ベク ター　ラムダ　ダッシュ（Ｌａｍｂｄａ　Ｄａｓｈ）　（ストラタジーン（Ｓｔ ｒａｊａｇｅｎｅ）製）中に構築さらたアラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａ ｌｉａｎａ）のゲノムライブラリーから相同性のある遺伝子を単離した。

４°Ｃで１８時間の光周期で環境が制御された生育キャビネットの中で生育した ２〜３週令の植物から寿た。分画スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　 ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）およびノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ） 分析のための苗木のＲＮＡは、フラッシカ　ナプス　オレイフエラ　変種　「ト パーズ」（Ｂ。

ｎａｐｕｓ　ｏｌｅｉｆｅｔａ　ｗａｒ、　’Ｔｏｐａｘ’）より得た。雄性稔 性の芽は、フラッシカ　ナプス　オレイフエラ　変種　「リフター」（Ｂ、ｎａ ｐｕｓ　ｏｌｅ百ｅｒａ　ｖａｒ、　’Ｌｉｃｔｏｒ’）　にツカーソンズシー ズ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｓ　５ｅｅｄｓ）製、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ）、英国）の野外で生育させた（ｆｉｅｌｄ　ｇｒｏｗｎ）植物から収集した 。雄性不稔性の芽は、野外で生育させた（ｆｉｅｌｄ　ｇｒｏｗｎ）フラッシカ 　ナプス　オレイフエラ　変種　シーエムニス［オグラＪ　（Ｂ、ｎａｐｕｓ　 ｏｌｅｉｆｅｒａ　ｗａｒ、ＣＭＳ　’ｏｇｕｒａ’）　（−ッカーソンズ　シ ーズ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｓ　５ｅｅｄｓｌ製、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ）　、英国）の植物から得た。

朽の切開：ｃＤＮＡライブラリーの構築のために、花序を素早く集め、最大５時 間、必要になるまで４℃で保存した。

鋭いピンセットを用いて適当な大きさの芽から杓を切開し、直ぐに液体窒素中で 凍結した。

芽の収集：最初の花が開く直前の段階の、芽の完全な輪生体の大きなサンプルを 液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯トーオルセイン（ａｃｅｔｏ−ｏｒｃｅｉｎ ）若しくはアクリジンオレンジの存在下でつぶした全豹から押し出された胞子形 成細胞（ｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ　ｃｅｌｌ）、小胞子若しくは花粉粒を光学顕 微鏡で調べることによって、予め決められた長さの芽の発育段階を評価した。目 盛のついた接眼レンズの格子を備えた低電力の光学顕微鏡を用いて、芽の長さを 正確に測定した。

芽の長さは、小花梗の底から最も高いがく片の先までを測ンドットプロット（Ｎ ｏｒｔｈｅｒｎ　ｄｏｔ　ｂｌｏｊ）分析またはｍＲＮＡの単離のために使用す る材料を、液体窒素で冷却した乳ばちの中で微粉末になるまで粉砕した。従来記 載されている（ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）ら、［プラント　ジェネティックト ランスフォーメーション　アンド　ジーン　エックスプレッンヨン：ア　ラボラ トリ−マニュアル（ＰＩ口ｆ　Ｇｅｎｅｌｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ７　Ｍ ａｎｕａｌｌ　Ｊ　、ブラックウェル　サイエンティフィックパブリッシャーズ （Ｂｒａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、オッ クスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）　（１９８８年））ようなフェノールを基礎とし た方法を用いて、粉末から全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）　ＲＮＡを、本質的 にはマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのマニュアルにおいて記載されている ようにしてオリゴ（ｄＴ）−セルロース　クロマトグラフィーを２回行うことに よって精製した。高分解（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ドツトプロット（ ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）用のＲＮＡを、ヴアーウオード（Ｖｅｒｗｏｅ＋ｄｌら、ヌ ク　アンツズ　レス（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１７巻、ページ２３ ６２　（１９８９年）の方法にしたがつて単離した。

ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング：製造会社の指示にしたがっ て、（アマジャム（Ａｍｅｒｇｈａｍ）製の）若しくは（ファルマシア（Ｐｈａ ＋ｍａｃｉａｌ製の）ｃＤＮＡ合成キットを用いてポリ（Ａ）　ＲＮＡから、ｃ ＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断した脱リン酸化されたラムダ 　ザップ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　２ａｐ　ｌ）　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅｌ製）（「胞子形成」ライブラリー（’　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓｉｔ ’　１ｉｂｒａｒｙ））またはラムダ　ザップ　Ｉ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　１ａ ｐ１１）　（ストラタジーン（Ｓｌｒａｊａｇｅｎｅ）製）（「小胞子−発育」 ライブラリー（’ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｌ’　１ｉｂｒａ ｒｙ））に連結し、アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製のｉｎ　ｖｉｔｒｏのパ ッケージングエクストラクツ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘＨａｃｊｓ）を用いて パッケージングした。（ラムダ　ザップ　Ｉ　Ｉ　（Ｌａｍｂｄａ　２ａｐＨＪ 中にクローニングする際には、ＥｃｏＲＩリンカ−（ファルマシア　リミテッド （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ）製の）を用いた；ｃＤＮＡが内部にＮｏｔ１部 位を有していなければ、全ｃＤＮＡをＮｏｔｌ断片として回収できるように、こ れらのリンカ−は内部にＮｏｔ１部位をも有している。）サージェント（Ｓａｌ ｇｅｎｌ）　、メソツズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎＢｍｏｌ、）　、１５２巻、ページ４２３〜４３２　（１９８７年）にしたが って適当な杓のポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは苗木のポリ（Ａ）　ＲＮＡのいずかよ り調製された［３２Ｐ］で標識された１本鎖のｃＤＮＡプローブを含んだ２枚の ハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）フィルター（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ）製）上で、クローンを分画してスクリーニングした。（）１イボンドーエ ヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）という表現は登録商標である。）ＲＮＡドツトおよびゲ ルプロット：ドツト−プロット（ｄａｔ−ｂｌｏｔｌ用の全ＲＮＡを、製造会社 の指示にしたがって、）＼イボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）（アマジャム（ Ａｍｅｒｇｈａｍ）製）４−にスポットした。ノーザンゲル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 　ｇｅｌ）をランニングさせ、フオーニイ（Ｆｏｕｒｎｅｙ）　（ピーアールエ ル　）十−カス（ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ）　、１０巻、ページ５〜７（１９８８年 ））にしたがって、ＲＮＡをノ＼イボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）上に移し た。ハイブリッド形成およびハイボンドーエヌ（ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ）フィルター の洗浄は製造会社の指示にしたがって行った。

切片上ハイブリッド形成法（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）　 ：包埋および薄断片の作製のために、ブラ・ソシカ　ナプス（Ｂ。

ｎａｐｕｓ）の芽をシーアールワイオーーエムーベ・ンド（ＣＲＹＯ−Ｍ−ＢＥ Ｄ）（ティニーニービー　ラボラトリーズイクイップメント　エルティディ（Ｔ ＡＡＢ　ＬａｂｏｒＮｏ＋ｉｅｓ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｌ　Ｌｔｄ、）製）中に凍 結した。（シーアールワイオーーエムーベッド（ＣＲＹＯ−Ｍ−ＢＥＤ）という 表現は登録商標である。）薄断片を公称１０μｍの厚さに切断し、サブベッドス ライドｆ＋ｕｂｂｅｄ　５ｌｉｄｅ）−ヒにのせ（ファン　プロオイジエンーネ ット（ｖａｎ　？ｏｏｉｉｅｎ−Ｋｎｅｇｌ）ら、ヒストケミカル　ジエ−（Ｈ ｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊ、）、１４巻、ページ３３３〜３３４　（１９８ ３年））、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水した。［３５Ｓコ　ｒＵ ＴＰ　（＞１０００Ｃｉ／ミリモル、アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製、ＳＪ 、１３０３）で標識されたセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブを、ｃＤＮ Ａがクローニングされている、ブルースクリプトエスケーマイナス（ＢＬＵＥＳ ＣＲＩＰＴ　５Ｋ−）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）のＴ３お よびＴ７プロモーターから転写した。（ブルースクリプト　エスケーマイナス（ ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　ＳＫ’−）という表現は登録商標である。）転写後、プ ローブをアルカリによる加水分解によって切断し、約１５０ｂｐ長のプローブ断 片を得た。

ハイブリッド形成用溶液（ｈｙｂｒｉｄｉｌ＋ａｔｉｏｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ） は、５０％ホルムアルデヒド、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ　Ｎａ　Ｈ ＰＯ４ｐＨ６，８，１０ｍＭ）−リス−塩酸　ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニル ピロリドン、１０ｍＭジチオトレイトール、１０％硫酸デキストラン、０．７ｍ ｇ／ｍ１　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｔＲＮＡ、５０〜１００ｎ　ｇ／ｍ　１の プローブストック（６゜７Ｘ１０５ｃｐｍ／ｎｇプローブ）であった。薄断片を ３０μｍのハイブリッド形成用溶液（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ　ｇｏｌｕｔ ｉ。

ｎ）において５０℃で１６時間ハイブリッド形成した。スライドを５０％ホルム アルデヒド、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ　Ｎａ２　ＨＰＯ４ｐＨ６， ８，１０ｍＭトリス−塩酸　ｐＨ７，５で５０℃で１時間ずつ計３回洗浄し、さ らに、ＲＮアーゼ　Ａバッファーですすぎ、ホルムアルデヒドを除去した。ＲＮ アーゼ　Ａによる処理（５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リス塩酸　ｐＨ ７，５にＲＮアーゼ　Ａを１５０μｇ　／　ｍ　１で溶解したもの）を３７℃で １時間行った。さらに、スライドを２ＸＳＳＣ（０，３Ｍ塩化ナトリウム、０． ０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）において６５℃で３０分間を２回洗浄 し、濃度勾配のついたアルコール（ｇｒａｄｅｄ　ａｌｃｏｈｏｌ）を通スこと によって脱水し、乾燥した。オートラジオグラフィーを目的として、スライドを 、アイエルエフオーアールディ　ケ−５（ＩＬＦＯＲＤ　Ｋ５）の核酸の飛跡用 エマルジョン（ｎｕｃｌｅｘｒ　Ｉｒａｃｋ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ）　（１：　５ ９の割合のグリセロール：水の混合物においてＩｇ／ｍｌ）中に４５℃で漬けた 。

（アイエルエフオーアールディ　ケ−５（ＩＬＦＯＲＤＫ５）という表現は登録 商標である。）被爆時間は２から１４日であった。現像は、コダック　ディ１９ 　（ＫＯＤＡＫ　Ｄ１９）において行った。（コダック　ディ１９（ＫＯＤＡＫ 　Ｄ１９）という表現は登録商標である。）さらに、現像された薄断片をメチレ ンブルーで染色し、浸透させた。

ａ）フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ６　ｃＤＮＡの分析 フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の杓、花粉、雄ずい葉および苗木から抽 出されたＲＮＡを用いたノーザンハイブリダイゼーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　 ｈｙｂｒｉｄｉｘａｔｉｏｎ）分析によって、Ａ６は長さが１．５〜２．０ｍｍ の朽においてしか発現せず、約１．８ｍｍで発現が最高になることが示された。

このようにして、Ａ６の時間的な発現（ｆｅｍｐｏ【ａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ）は、小胞子母細胞が減数分裂する時から初期の小胞子の開期までの杓の発育 期間中にわたる。Ａ６のｃＤＮＡは、１５３２ｂｐの長さで、１〜１４２４ｂｐ にわたる読み取り枠（ｏｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）　（ＯＲＦ）を 有する（図１）ことからこのクローンは全長でないことが分かる。ノーザンゲル プロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｇｅｌ　ｂｌｏｔ）からフラッシカ　ナプス（Ｂ 、　ｎａｐｕｓ）のＡ６のｍＲＮＡの推定の大きさは約１７００ｂｐであり、こ れによってもこのクローンが全長でないことが指摘される。ＯＲＦは５３ｋＤａ の分子量を有する４７４個のアミノ酸のポリペプチドをエンコードしており、こ れは病因に関連した（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｃｄ）　（Ｐ　Ｒ ）、他で以前に特性が明らかになっているβ（１，３）−グルカナーゼと相同性 がある（図２）ことから、Ａ６が朽に特異的なβ（１，３）グルカナーゼ（カラ ーゼ）をエンコードすることが強く指摘される。以下の実施例６において記載さ れているように、形質転換植物の朽におけるＡ６転写物に対するアンチセンスＲ ＮＡの産生によって、雄性不稔性植物が得られる。これらの植物は、生化学的お よび細胞学的なレベルで、Ａ６がカラーゼをエンコードするという主張と一致す る表現型を有する。

Ａ６とβ（１，３）グルカナーゼとを並記すること（ａｌｉｇｎｍｅｎ＋）によ って、Ａ６が長いＣ−末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の存在によってかなり より大きく、また、この拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の始まりが成熟したβ（１ ，３）グルカナーゼ酵素のＣ−末端に相当することが示される。しかしながら、 他のグルカナーゼに対するＡ６の相同性のレベルは、非常に注目に値するもので ある（相同性の領域にわたって３３％の一致）が、最も離れている従来単離され たβ（１，３）グルカナーゼ間で見られたレベル（５１％の一致）に比べると低 いものである。したがって、Ａ６タンパク質はトマトの酸性ＰＲグルカナーゼま たはタバコの塩基性のホルモンで誘導されたβ（１，３）グルカナーゼに対して 得られた抗体によっては認識されない。３２Ｐで標激された、アラビドプシス　 タリアナ（Ａ、ｆｈａｌｉａｎａ）のゲノムのグルカナーゼ配列（エフ　アラス ペル（Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ）によって提供された）を用いることによってまた はニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｔｏｂａｃｕｍ）の塩基性β（１，３）グルカナ ーゼを含むクローン（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）　ら、ブロック　ナショル　ア カデ　サイ　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ 、Ｓ、Ａ、ｌ、８５巻、ページ５５４１〜５５４５　（１９８８年））である、 ｐＧＬ４３を用いることによって、フラッシカ　ナプスｔＢ、ｎａｐｕｓ）の朽 のＲＮＡまたはフラソシカ　ナブスＦＢ。

ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリッド形成は観察されない 。したがって、市販のβ（１，３）グルカナーゼ配列あるいは抗体を用いること によって朽に特異的なカラーゼをクローニングすることはできない。しかしなが ら、図２に示されたＡ６と他のグルカナーゼとの並記（ａＩｉｇｎｍｅｌ）によ って、すべてのグルカナーゼに保存されていると考えられるアミノ酸の同定が可 能である。これによって、β（１，３）グルカナーゼに対して特異的なプローブ であるオリゴヌクレオチドの設計ができ、これにより朽に特異的なグルカナーゼ ｃＤＮＡまたは他の種の遺伝子のクローニングが可能となる。カラーゼは、他の β（１，３）グルカナーゼより長いＣ−末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を有 していることに関連した独特な空間的な（ｓｐａｊｉａｌ）および時間的な（ｔ ｅｍｐｏｒａｌ）発現のパターンによって他のβ（１，３）グルカナーゼとは区 別できる。

ｂ）アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａＪのＡ６に相同性のある 遺伝子の単離および特性の評価フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ６　 ｃＤＮＡにハイブリッド形成する２つのゲノムクローンをアラビドプシスタリア ナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のゲノムライブラリーから単離した。そのうちの一 つである、６６．２を詳細に分析した（図３）、３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＺ１８Ｕ　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａｌ製 ）にサブクローニングし、ｐＤＩＨ９を形成しく図３）、さらに、Ａ６のコーデ ィング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）および８８１ｂｐの上流部分の配列 を決定した（図４）。フラッシカ　ナプス（ｌｌ、ｎａｐｕｓ）およびアラビド プシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６の配列を比較することによっ て、これらはコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）においてヌクレ オチドレベルで８５％の一致（図５ａ）およびタンパク質レベルで８３％の一致 （図５ｂ）であることが示された。この配列の並：ｉ己（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ） 　ｌこよって、フラッシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡによってエン コードされたＯＲＦがほとんど全長であり、Ｎ−末端で約５残基が欠損している と考えることが示される。アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ） のＡ６遺伝ｆは５３．７ｋＤａの推定の分量を有する４７９アミノ酸の産生物を エンコードする。Ａ６タンパク質は、シグナル配列に関してフォノ　へイン（ｖ ｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）（ジエー　モル　パイオル（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 ）　、１８４巻、ページ９９〜１０５　（１９８５年））によって規定されたル ールに準じた疎水性のＮ−末端配列を有する。カラーゼは、タペータムから朽の 室中に分泌されるため、上記配列を有するはずである。

単離されたもう一つのゲノムクローン（Ｇ６．１）の一部の配列を決定したとこ ろ、Ａ６のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｊ内および推定の八 ６のプロモーター領域内の両方において６６．２とほとんど一致していることが 分かった。

実施例２−アンチセンス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｊｈａｌｉＡ６ の推定のプロモーター領域がアラビドプシス　タリアナｆＡ、１ｈａｌｉａｎａ ）　、ブラ・ノシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）、ホルデウム　ブアルガレ（） １．　ｙｕ１ｇａ＋ｅ）およびニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｔｏｂａｃｕｍ）に おいて外来遺伝子の発現を誘導することができることを示すために、プロモータ ーの転写融合（Ｈａｎｇｃｒｉｐｌｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）をβ−グルクロ ニダーゼ（ＧＵＳ）をエンコードする大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ）遺伝子について行った。推定のＡ６プロモーターを含む８４４ｂｐのＥｃｏ Ｒｉ−ＮｓｐＩ断片（図４において１〜８８４ｂｐの位置）をｐＤ　ＩＨ９から 切り出し、末端をフレノウ（ＫＩｅｎｏｗ）によってプラントエンドにした。こ の断片をビープルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のＳｍａ　１部位に クローニングし、ｐＤＩＨｌｏを形成した（図６）。

次に、Ａ６プロモーターをＳａ　Ｉ　Ｉ、ＢａｍＨＩ断片としてｐＢｌｌｏｌ、 １　（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｌ　ら、エンボ　ジャーナル（ＥＭ ＢＯＪ、）　、６巻、ページ３９０１〜３９０７　（１９８７年））にクローニ ングし、ｐＤＩＨｌｌを形成した（図６）。このプラスミドは、ＧＵＳに転写融 合した（ｔｒａｎｃ＋ｉｐ＋１ｏｎａｌｌｙ　ｆｕｓｅｄ）Ａ６プロモーターを 含む。

さらに、ｐＤＩＨｌｌを、標準的な形質転換技術を用いてニコチアナ　タバカム （Ｎ、ＩＯｂａｃｕｍ）、アラビドプシス　タリアナ（Ａ、Ｉｈａｌｉａｎａ） 　、フラツシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）、ホルデウム　ブアルガレ（Ｈｏｖ ｕｌｇａｒｅ）およびジー　メイズ（ｌｅａ　ｍａｙｓ）中に形質転換した。ホ ルデウム　ブアルガレ（ｌＴｖｕｌｇａｒｅ）の形質転換は、マイクロプロジエ クテイル　ガン（ｍｉｃｒｏｐ＋ｏｉｅｃｔｉｌｅ　ｇｕｎ）を用いて行−〕た 。形質転換された植物を分析することによって、ＧＵＳ活性が朽の組織、特にタ ペータム細胞に局在していることが示された。ＧＵＳ活性の時間的な調節（ｔｅ ｍｐｏｒａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、実施例１に記載されたようにＡ６遺 伝子で観察された時間的な発現（Ｉｅｍｐａｔａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　 と一致した。Ａ６プロモーターが、減数分裂をしている細胞の発育段階で始まり 、初期の小胞子の開明の間に終わる期間を通してタベータム細胞内で転写を誘導 する。

雄性不稔性植物を作製するためのＡ６プロモーターの使用タベータムに特異的な プロモーターを様々な方法で用いて雄性不稔性植物が得られる。例えば、タベー タムに特異的なプロモーターを用いてタペータムのメツセージ（ｔａｐｅｌａｌ 　ｍｅｓｓａｇｅ）に相当するアンチセンスおよびセンス転写物を発現させ（実 施例６を参照）、グルカナーゼ活性の未成熟な発現を誘導しく実施例４を参照） 、プロテアーゼやヌクレアーゼ等の細胞毒性のある物質の発現を誘導することに よって、雄性不稔化を行うことができる。

実施例３−キメラのＡ６−パーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子およびキメラの Ａ６−アクチニジン遺伝子の構築および形質転換植物におけるこれらの発現 Ａ６プロモーターの利用能を示すために、これを用いてタペータム細胞において ＲＮアーゼである、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）　、およびプロテアーゼであ る、アクチニジンの発現を誘導する。

実施例３Ａ−タペータムに特異的なＡ６プロモーターとバーナーゼ（ｂａｒｎａ ｓｅ）とのキメラ遺伝子融合物の構築および形質転換植物におけるこの発現 Ａ６プロモーターの利用能を示すために、これを用いてタペータム細胞における ＲＮアーゼである、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）の発現を誘導する。雄性不稔 性植物を作製するためのバーナーゼ（ｔ＋ａｒｎａｓｅ）遺伝子の利用は、ＥＰ −Ａ−０３４４０２９号（プラント　ジエネティック　システムズ（Ｐｌａｎｔ 　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓｌ　）に記載されており、マリアニｆＭａｒ ｉａｎｉ）　ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３４７巻、ページ７３７〜７ ４１で公表されている。

以下のオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒ ａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（ＰＣＲ）において用いて、プラス ミドｐＴＧ２　（ホロビッツ（Ｈｏｒｏｖｉ＋ｚ）ら、ジエー　モル　パイオル （Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、２１６巻、ページ１０３１〜１０４４　（ １９９０年））からバースター（ｂｚｒｇｔａｒ）および成熟したバーナーゼ（ ｂａｒｎａｓｅ）生成物をエンコードする断片を得る： ５−　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ ＴＴＴＧＡＣＧＧＧ　３−　および ５−　ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣ３”第一のプライマーは、ハ ートレイ　アール　ダブル（ＷａｒＮｅ７　Ｒ，Ｗ、ｌのジエー　モル　パイオ ル（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）、２０２巻、ページ９１３〜９１５　（１ ９８８年）における図１の１９５〜２２１ｂｐのヌクレオチドと相同性を有する 。第二のプライマーは、ｐＴＺ１８Ｕ　（ファルマシア（Ｐｂａｒｍａｃｉａｌ 製）のＨｉｎｄＩ１１部位の直ぐ次ぎの配列と相同性がある。ＰＣＲ断片をＸｂ ａＩで消化し、Ｘｂａｌで切断したｐＤＩＨ１２中にクローニングし、Ａ６プロ モーターが成熟したバーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）配列に転写融合した（ｔｒａ ｎｃｒｉｐｊｉｏｎａｌ１７　ｆｕｓｅｄ）　ｐ　Ｄ　Ｉ　Ｈ１３を形成する（ 図７）。（ｐＤＩＨ１２は、ｐＤＩＨｌｏ　（図６）のＫｐｎＩ、ＸｂａＩ断片 をＫｐｎｌ、Ｘｂａｌで切断したｐＷＰｓｏ（以下およびＷＯ−１−９２１１３ ７９号を参照）中にクローニングすることによって構築される。）ｐＤＩＨ１３ のＥｃｏＲＶ断片をＳｍａ　Ｉで切断したｐＢｉｎ１９（ベヴアン（Ｂｅｖａｎ Ｊ　ら、１９８４年）に連結することによって、この遺伝子融合物をｐＢｉｎ１ ９に転移した。このｐＢｉｎ１９誘導体プラスミドをニコチアナ　タバカム（Ｎ 、ｉｏｌ）ｉｃｕｍｌ、フラッシカ　ナプス（Ｂ、　ｎａｐｕｓｌ、ホルデウム ブアルガレ（Ｈｌｖｕｌｇｇｒｅ）およびジー　メイズ（ｚ、　Ｉｌｌ！ＦＳｌ 中に形質転換したところ、形質転換植物におけるバーナーゼ（ｂａｒｎａｓ、ｅ ）の発現によって釣のタペータム細胞および小胞子母細胞が分解し、雄性不稔性 が生じた。

プラスミドｐＷＰ８０、ｐＷＰ８３およびｐｗｐｓｓｐｗｐ８０は、アラビドプ シス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎｘ）のタペータムに特異的なＡ９プロモー ターを用いてセンスおよびアンチセンスＲＮＡを発現するように設計された中間 ベクターであるが、これを以下のようにして構築した。

アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のタベータムに特異的なＡ ９プロモーターの単離はＷＯ−Ａ−９２１１３７９号に記載されている通りであ る。ｐＷＰｓｏを構築するために、ｐＷＰ７２　（ＷＯ−Ａ−９２１１３７９号 ）をＸｂａｌで消化し、再結合することによって、ポリリンカー中のＢａｍＨ１ 部位を除去し、ｐＷＰ７８を形成する（図９）　。ｐＷＰ７８のＫｐｎｌ、５ｓ ｔｌ　（Ｓｓｔｌの末端はフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗｌによってプラントエンドに なっている）のＡ９プロモーター断片をＫｐｎｌＳＳｍａＩで切断したｐＪＩＴ ６０中に連結し、ｐｗｐｓｏを形成する（図９）。この中間ベクターは、３５Ｓ 　ＣａＭＶポリアデニル化シグナルを有するピーブルースクリプト（ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ）由来のポリリンカーに融合した９３６ｂｐのＡ９プロモーター断 片から構成される。ｐＪＩＴ６０は、ｐＪＩＴ３０のＣａＭＶ　３５Ｓプロモー ターが２本鎖の３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターに置き代わっている以外はｐＪＩ Ｔ３０（グエリノウ（ＧｕｅｒｉｎｅａｕＪ　ら、プラント　モル　パイオル（ ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ。）、１５巻、ページ１２７〜１３６　（１９ ９０年））と同じものである。

ｐＷＰ８３は、構成性の（ｃｏｎｓｊｉｊｕｔｉｖｅ）　Ｃａ　ＭＶ　３５Ｓプ ロモーターを用いてセンスおよびアンチセンスＲＮＡを発現する中間ベクターで あるが、これを以下のようにして構築した。ｐＪＩＴ６０の７８５ｂｐのＫｐｎ ｌ、ｘｂａｌ断片をＫｐｎＩ、ＸｂａＩで切断したｐｗｐ８０中にクローニング することによって、ｐＷＰｓｏのＡ９プロモーターを「２本鎖」のＣａＭＶ　３ ５Ｓプロモーターに置き換え、ｐｗｐ８３を形成する（図９）。

ｐＷＰ８８は、Ａ３プロモーターを用いてセンスおよびアンチセンスＲＮＡを発 現する中間ベクターであるが、これを以下のようにして構築した。アラビドプシ ス　タリアナ（Ａ、ｊｈａｌｉａｎａ）のタペータムに特異的なＡ３プロモータ ーの単離はＷＯ−Ａ−９２１１３７９号に記載されている通りである。ｐＷＰ８ ７の７４５ｂｐのＫｐｎＩＳＨｉｎｄｌｌｌ断片（ＷＯ−Ａ−９２１１３７９号 ）をＫｐｎｌ、ＨｉｎｄｌＩＩで切断したｐＷＰ８３中にクローニングすること によって、ｐＷＰ８３のＣａ　Ｍ　ＶプロモーターをＡ３プロモーターと置き換 え、ｐＷＰ８８を形成する（図９）したがって、ｐＷＰｓｏ、ｐＷＰ８３および ｐＷＰ８８は、プロモーター領域および周りの制限酵素部位以外は同アクチニジ ンをエンコードする全ｃＤＮＡクローンをｐＫＩＷ１４５０　（ポディヴインス キ−（Ｐｏｄｉｖｉｎｓｋｙ）ら、ヌクレイツク　アシッズ　レス（Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１７巻、ページ８３６３　（１９８９年））か らＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ断片として単離し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断し たビーブルースクリプト　ケーエスマイナス（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ” ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）に再クローニングし、ｐｗｐ 　１００を形成する。以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応におい て用いて、遺伝子の開始ｒＡＴＧＪの直前の配列が５ｐｅ１部位に突然変異して いる、アクチニジンの全コーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を含 むＤＮＡ断片を得る：５−　ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＣＣＣ ＡＡＡＴＣＣ３−および ５′　ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ　１第一のプライマーは、図１（ポ ディヴインスキー（ＰｏｄｉｖｉｎｓｋｙＪら、１９８９年）の３８〜５５ｂｐ の位置と相補しており、第二のプライマーは、ビープルースクリプト　ケ−ニス マイナス（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−）のＫｐｎＩ部位の直ぐ次ぎの配列 と相同性がある。このＰＣＲ断片を５ｐｅｌおよび５ｓｔＩＩで消化し、Ｘｂａ ｌＳＳｓｔｉｒで切断したｐＤＩＨ１２中にクローニングし、ｐＡ、６ａｃｔを 形成する（図７Ｂ）。次に、ｐＡ６ａｃｔのＥｃｏＲＶによる部分消化によって 得られたＥｃｏＲＶ断片として、へ６−アクチニジンキメラ遺伝子を回収し、さ らにこれをＳｍａ　Ｉで切断したｐＢｉｎ１９　（ベヴアン（Ｂｅｖａｎ）　ら 、１９８４年）中にクローニングした。このｐＢｉｎ１９誘導体プラスミドをニ コチアナ　タバカム（Ｎ、ｔ。

ｂａｃｕｍ）、フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）およびホルデウムブアル ガレ（Ｈ，ｖｕｌｇａｒｅ）中に形質転換したところ、形質転換植物におけるア クチニジンの発現によって雄性不稔が生じた。

実施例４〜９−雄性不稔性間物を作製するためのＡ６遺伝子のコーディング配列 （ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の使用実施例４Ａ−タベータムに特異的な プロモーターＡ９とＡ６遺伝子とのキメラ遺伝子融合物の構築および形質転換植 物におけるこの発現 ノーザーン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析によって決定されたタペータムに特異的な Ａ３及びＡ９遺伝子およびプロモーター−ＧＵＳ融合物の発現の時間的なパター ン（Ｈｍｐｏ＋ａｌ　ｐａＮｅｔｎｌによって、両方のプロモーターとも、四分 子からの小胞子の放出前の朽の発育段階で活性を有することが示される（ＷＯ− Ａ−９２１１３７９号を参照）。したがって、いずれのプロモーターも、朽にお いてβ（１，３）グルカナーゼの未成熟な発現を誘導することによって雄性不稔 を得るのに適している（明細書の前記を参照）。これらのプロモーターとフラッ シカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ６　ｃＤＮＡまたはアラビドプシス　タリ アナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ 　ｒｅｇｉｏｎ）のいずれかとのキメラ融合物を構築できる。図８ａに、アラビ ドプシスタリアナ（Ａ、ｆｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子へのＡ９プロモーター の融合物の構築を示す。完全なＡ６遺伝子がｐＤＩＨ９からポリメラーゼ連鎖反 応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いることによ って得られるように、オリゴヌクレオチドプライマーをアラビドプシス　タリア ナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）遺伝子の５′側の非翻訳のリーダー配列およびこの 遺伝子の３′末端に設計する。ＰＣＲによって得られたＡ６遺伝子をタペータム に特異的なプロモーターを含むベクター中にクローニングするために、このプラ イマーを５ｐｅＩおよび５ｓｔＩＩの制限部位を用いて遺伝子操作する。この５ ′側のプライマーもまた、ＲＮＡでは、実施ρ１５に記載したりボザイムによる 切断の標的となるＧＴＣ配列（下線）を含む。

５′側のオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：５”　ＧＧＧＡＣＴＡＧ ＴＧＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴＣ３′ ３−側の配列は以下の通りであるニー ５−　ＣＣＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣＧＣＴＣＧＧＡＡＡＣＴＴＧ Ｃ３− Ａ６のＰＣＲによる断片を、１５４８ｂｐの５ｐｅｌ。

５ｓｔＩＩ断片としてＸｂａｌ、５ｓｔｌｌで切断したｐＷＰ８０　（ＷＯ−Ａ −９２１１３７９号を参照）中にクローニングし、Ａ９とＡ６遺伝子との間の転 写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｆｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を形成する（図８ ａ）。この構築物を５ｓｔＩＩ、ＸｈｏＩ断片としてｐＢｉｎ１９に転移する。

実施例４Ｂ−ｎに特異的なグルカナーゼのＣ末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ） をエンコードする配列が欠損しているＡ６遺伝へのＡ９またはＡ６プロモーター のキメラ遺伝子融合物の構築および形質転換植物におけるこれらの発現Ａ６タン パク質は、並記すると、他の従来の配列が決定された植物のグルカナーゼに比べ て長いＣ−末端の拡張（ｅｘｌｅｎｓｉｏｎ）を有している（図２）。細胞外の グルカナーゼは、植物の室に局在していることが知られているものとは反対にＣ 〜末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を持たない。したがって、朽に特異的なグ ルカナーゼにおけるＣ末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は室中に放出される前 に細胞内貯蔵体（ｉｎｔｅｒｃｅｌｔｕｌａｒ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｂｏｄｙ）を 標的にする（ｔａｒｇｅｔ）のに必要である。

Ａ６のＣ末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を除去すると、即座に室中にグルカ ナーゼが放出されるため、このような構築物が発現するとＡ６プロモーター、さ らにはＡ３及びＡ９プロモーターによって雄性不稔性が生じる。図８ｂは、Ａ９ 及びＡ６プロモーターとＣ末端の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）が欠損する巧に特 異的なグルカナーゼとの間のキメラ遺伝子の構築を示すものである。以下のオリ ゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲに用いて、ｐＤＩＨ９から１２０８ｂｐの断 片を得る： ５−　ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＣＴＣ ＴＴＣ３−および５−　ＣＣＣＣＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＡ ＧＡＴＴＧＧ　３− これを、５ｐｅｌＳＳｓｔＩＩ断片としてｐｗｐｓｏ中または５ｐｅｌＳＳｓｔ ＩＩ断片としてｐＤＩＨ１２中のいずれかにクローニングする。両方のキメラ遺 伝子をｐＢｉｎ１９に転移する。

すべてのｐＢｉｎ１９構築物をニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｆｏｂａｃｕｍ）、 フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）およびホルデウム　ブアルガレ（Ｈ，ｖ ｕｌｇａｒｅ）中に形質転換する。この形質転換植物は雄性不稔性である。

実施例５一実施例４において記載された植物の繁殖能の回復 ＰＣＨによって得られたＡ６遺伝子の５′側のリーダー中に導入された配列を認 議し、切断するりボザイムをタイ−タム中で発現する形質転換植物と雄性不稔性 植物を交配させることによって、繁殖能の回復を行う（自然のＡ６のｍＲＮＡは この配列を欠損しているので切断されない）。

リーダーの切断（配列ＧＵＣの３゛側、っまりＡ６遺伝子のＡＴＧの開始コドン の５′側の１４ｂｐ）によって、ＰＣＨによって得られたＡ６転写物のキャップ 部位が除去され、これによってＰＣＨによって得られたＡ６のｍＲＮＡが迅速に 分解され、最終的にはＦｌの子孫において繁殖能が回復する。

実施例６−形質転換植物において杓に特異的なグルカナーゼに対するセンス及び アンチセンスＲＮＡを産生ずるキメラ遺伝子の構築 Ａ３およびＡ９プロモーターは、朽に特異的なグルカナーゼを発現する期間中は 転写活性を有する（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｌｌＦ　ａｃｌｉｖｅｌ。し たがって、これらのプロモーター、さらには構成性の（ｃｏｎｓｌｉｔｕｌｉｖ ｅ）プロモーター（ＣａＭＶプロモーター）およびＡ６プロモーターを用いて、 朽に特異的なグルカナーゼに対するアンチセンス及びセンスＲＮＡを発現できる 。上記およびＷＯ−Ａ−９２１１３７９号で示したように、杓のライブラリーか ら単離されたｃＤＮＡは、ｃＤＮＡをＮｏｔｌ断片として回収できる末端アダプ ターを有する。したがって、フラッシカ　ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のｃＤＮＡ をＮｏｔｌで消化し、両方の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）においてｐＷＰ８ ０、ｐＷＰ８３、ｐＷＰ８８　（これら３つのプラスミドに関してはＷＯ−Ａ− ９２１１３７９号を参照）およびｐＤＩＨ１２（図１２）のＮｏｔＩ部位中にク ローニングする。これらのキメラ遺伝子をｐＢｉｎ１９に転移し、ニコチアナ　 タバカム（Ｎ、ｔｏｂａｃｕｍＬブラッシカ　ナフラ（Ｂ、　ｎａｐｕｇ）、ホ ルデウム　ブアルガレ（１１，ｙｕｌｌａｒｅ）およびジー　メイズ（２，ｍａ ７ｇ）中に形質転換する。これらの形質転換植物は雄性不稔性である。アンチセ ンスＡ６　ＲＮＡを発現する雄性不稔性植物の細胞学的な試験によって、カロー スの分解に必要である、四分子からの小胞子の放出は野生型の植物にくらべて遅 延するまたは完全に無くなることが示された。生化学的には、これらの雄性不稔 性植物の朽の室の液体中のカラーゼ量は減少しているあるいは検出不能である。

両観察によって、Ａ６がカラーゼをエンコードすることが確認される。

実施例７−実施例６に記載されたアンチセンスＡ６　ＲＮＡを発現する形質転換 植物の繁殖能の回復２方法で繁殖能の回復を行う。第一には、雄性不稔性植物を アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６遺伝子のさらなるコ ピーを有する植物（ｐＤＩＨ９の３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＢｉｎ１９に 転移し、このようにして得られた構築物を植物に形質転換する）と交配させる。

このさらなる遺伝子のコピーは、アンチセンスＡ６　ＲＮＡの発現によって誘導 されるカラーゼ産生物のダウンレギュレーションを克服し、これによって雄性に 繁殖能力のあるＦｌの子孫が得られる。第二には、アンチセンスＡ６ＲＮＡを発 現する植物における繁殖能の回復を、Ａ３、Ａ６またはＡ９等のタペータムに特 異的なプロモーターと例えば７８７〜７９０ｂｐの位置（図１）のアンチセンス Ａ６　ＲＮＡ転写物内のＧＵＣ配列に対するリボザイムとの間のキメラ遺伝子融 合物に対して同型接合である植物とこれらの植物を交配させることによって行う 。Ｆｌの子孫において、アンチセンスＡ６転写物の切断によって、アンチセンス ＲＮＡが不安定化し、その結果、繁殖能が回復する。

実施例８−形質転換植物におけるカラーゼ転写物に対するリボザイムの発現 フラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）のＡ６　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と アラビドプシス　タリアナ（Ａ、ｔｈａｌｉａｎａ）のＡ６ゲノム配列との比較 （図５ａ）によって、両方の配列によって分割され、強力なりボザイムのターゲ ット配列（ｔａｒｇｅｔ　Ｅｅｑｕｅｎｃｅ）である１２個のＧＵＣトリヌクレ オチドが明らかになった。特定部位の突然変異誘発によって、２つのりボザイム をフラッシカ　ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｇ）のＡ６ｃＤＮＡ配列中に挿入する。ブ ルースリブト（登録商標）エスケー−（ＢＬＵＥＳＲｒＰＴＴＭ　５Ｋ−）（ス トラタジーン（ＳｊｒＮｊｇｅｎｅＪ製）のＥＣｏＲｌ部位中にクローニングさ れたＡ６　ｃＤＮＡを有する、プラスミドＡ６の１本鎖のＤＮＡを以下に示され たリン酸化オゴヌクレオチドブライマーにアニーリングさせるニー ５−　ＣＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＡ ＧＧＧＣＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣ３＝　および 第一のプライマーは図１の１０２ｂｐの位置のＧＵＣを切断するためのターゲッ トとなるリボザイムをエンコードし、第二のプライマーは１１６９ｂｐの位置の ＧＵＣを切断するためのターゲットとなるリボザイムをエンコードする。プライ マーの下線部分はりボザイムをエンコードする。

アニーリング後、第二のＤＮＡ鎖をヌクレオチドおよびフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ）によって完了する。両方のりボザイムの挿入物を有するプラスミドを、プロー ブとしてリボザイムのプライマー（末端を標識した）を用いた重複コロニーハイ ブリッド形成（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｊｉｏ ｎ）によって検出し、これをＮｏｔＩ断片として、アンチセンスの配向ｆｏｒｉ ｅｒｕａｆｉｏｎ）でｐＷＰ８０、ｐｗｐ　８３、ｐ　Ｗ　Ｐ　８８およびｐＤ ＩＨ１２中にクローニングする。このキメラＡ３、ＣａＭＶ　３５ＳＳＡ９およ びＡ６プロモーターーカラーゼ　リボザイム遺伝子を実施例６のプラスミドにお いて記載したようにしてｐＢｉｎ１９に転移する。このキメラ遺伝子をｐＢｉｎ １９に転移し、ニコチアナ　タバカム（Ｎ、ｔｏｂａｃｕｍ）、フラッシカ　ナ ブス（Ｂ、　ｒ＋ａｐｕｓ）およびホルデウム　ブアルガレ（■、　ｖｕ１ｇａ ｒｅｊ中に形質転換する。これらの形質転換植物は雄性不稔性である。

実施例９一実施例８に記載された植物の繁殖能の回復力ラーゼ（ｍ　ＲＮ　Ａ　 ）に特異的なりボザイム中のＧＵＳ配列を切断するりボザイムを（Ａ３、Ａ６、 Ａ９若しくはＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターから）発現する同型接合の形質転換 植物と雄性不稔性植物を交配することによって、雄性に繁殖能のある子孫が得ら れる。切断によってキャップ（ＣＡＰ）若しくはポリアデニル化シグナルのいず れかの除去によってターゲットとなるｍＲＮＡが不安定化されるように、レスド ラ−（＋ｅａｆｏｒｅｅｒ）　−リボザイムに関するターゲットとなるＧＵＣ配 列は局在化される。これによって、細胞質中のカラーゼ（ｍＲＮＡ）に特異的な りボザイムの濃度が迅速に減少し、これにより繁殖能が回復する。

このレスドラ−（ｒｅ＋ｔｏｒｅｅｒ）　−リボザイムは実施例８に記載された 方法と同様にしてプラスミドＡ６から構成される装ＦＩＧ、　３ 日１）−ｋｌ　日１ｌ−ｋｌ）ｋｆ）−ｋｉ）−ｋｌ　ｍ日Ｉ　Ｘｂ　１−ｋｌ 　日１ □　アラビドプシス（Ａ＋ａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＮＡ配列に　δＳ交谷Ｓラム ９’　タラシュ（ｌａｍｂｄａ　Ｄａｓｈ）関するキー　！１１１１１！ｐ工。

□８＜、ツー■■■■■　Ａ６のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏ ｎ）ＦＩＧ　６ ｐＢｌｌｏｌ、　１ 誘導体 ＤＮＡ配列に　■■■■■　Ａ６のコーディング領域ｆｃｏｄｉｏｇ　ｒ！ｇｉ ｏｎ）ＦＩＧ、７ａ Ｘｂｕｌの成熟し！ニバーナーゼ（ｂａ＋ｎａｔｅｌ　ｉ片＋　誘導体 ｐＤＩ）１１４ ＦＩＧ、　７ｂ Ｓｐｅｌ、Ｓ＋ｊｌｌのアクチニノ＞ｅＲｉＤＮＡ配列に　口＝＝コ　プロモー ター関するキー　■ポリＡシグナル（ｐｏｌＹＡ　ｓｉｇｎａｌ）ＤＮＡ配列に 　口＝＝コ　プロゞ−ター関するキー　■■■　ポリＡシグナル（ｐｏ１７　Ａ 　ｓｉｇｎｘｌｌ吊　腔　ｉＩｌ　ネト　親　生、 馴−一１−Ｎ、ＰＣＴ／Ｇ８９２１０１３５４１ｍ＋＋＋−１ム一−ＰＣＴ／Ｇ Ｂ　９２１０１３５４フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１１ （７２）発明者　ボウル、ワイアット イギリス国、レスター　エルイー２２イービー、スタウトン　ロード　７４．フ ラット　５ Ｉ

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．カラーゼ酵素をエンコードする組換えまたは単離ＤＮＡ。
2. ２．該酵素がブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の５３ｋＤａ のカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ） の他の植物の同級のタンパク質の活性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. ３．ブラッシカナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはア ラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）の同様の 酵素をエンコードする、請求項２に記載のＤＮＡ。
4. ４．図１または図４に示された配列の少なくとも一部を有する、請求項２に記載 のＤＮＡ。
5. ５．コーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がプロモーターに操 作して連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋｉ）、請求項１から４の いずれかに記載のＤＮＡ。
6. ６．該プロモーターがタペータムに特異的である、請求項５に記載のＤＮＡ。
7. ７．該プロモーターがアブラナ科の植物の（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）Ａ３ま たはＡ９プロモーターである、請求項６に記載のＤＮＡ。
8. ８．カラーゼ酵素をエンコードする遺伝子の発現を自然に誘導するプロモーター を有する組換えまたは単離ＤＮＡ。
9. ９．該カラーゼ酵素がブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の５ ３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙＢｒａｓｓｉｃａｃｅ ａｅ）の他の植物の同様のタンパク質である、請求項８に記載のＤＮＡ。
10. １０．ブラッシカナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素または アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）の同様 の酵素の発現を誘導するプロモーターを有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
11. １１．図１に示される配列のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ） の５′側に自然にプロモーター配列を有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
12. １２．図４に示される配列のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ） の５′側にプロモーターを有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
13. １３．該プロモーターが、発現すると、植物に雄性不稔を引き起こすＤＮＡに操 作して連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋ）、請求項８から１２の いずれかに記載のＤＮＡ。
14. １４．雄性不稔ＤＮＡが溶菌酵素をエンコードする、請求項１３に記載のＤＮＡ 。
15. １５．該溶菌酵素が核酸、タンパク質、炭水化物または脂質の分解を引き起こす 、請求項１４に記載のＤＮＡ。
16. １６．該溶菌酵素がリボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼである、 請求項１５に記載のＤＮＡ。
17. １７．該溶菌酵素が炭水化物の分解を引き起こす、請求項１４に記載のＤＮＡ。
18. １８．該溶菌酵素がグルカナーゼである、請求項１７に記載のＤＮＡ。
19. １９．グルカナーゼのコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と の転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）中にシグナル 配列を有する、請求項１８に記載のＤＮＡ。
20. ２０．該溶菌酵素がタンパク質の分解を引き起こす、請求項１５に記載のＤＮＡ 。
21. ２１．タンパク質分解酵素がアクチニジンまたはパパインである、請求項２０に 記載のＤＮＡ。
22. ２２．雄性不稔ＤＮＡが植物のタペータム細胞において一般的に発見されるＲＮ Ａに対してアンチセンスであるＲＮＡをコードする、請求項１３に記載のＤＮＡ 。
23. ２３．該雄性不稔ＤＮＡが、ブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉ ｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質をエンコードするＲＮＡに対して アンチセンスであるＲＮＡをコードする、請求項２２に記載のＤＮＡ。
24. ２４．カラーゼ酵素をエンコードする遺伝子において自然に転写されるＤＮＡ鎖 の少なくとも一部に対して相補的である転写可能なＤＮＡ鎖を有するアンチセン ス核酸。
25. ２５．該カラーゼ酵素がブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の ５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質である、請求項２４に記載のアンチセ ンス核酸。
26. ２６．転写が構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ ）の制御下にある、請求項２４または２５に記載のアンチセンス核酸。
27. ２７．転写がタペータムに特異的なプロモーターの制御下にある、請求項２４ま たは２５に記載のアンチセンス核酸。
28. ２８．雄性不稔ＤＮＡが植物のタペータム細胞において一般的に発見されるＲＮ Ａを切断できるＲＮＡをコードする、請求項１３に記載のＤＮＡ。
29. ２９．該雄性不稔ＤＮＡが、ブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ ）の５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉ ｃａｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質等の、カラーゼ酵素をエンコード するＲＮＡを切断できるＲＮＡをコードする、請求項２８に記載のＤＮＡ。
30. ３０．カラーゼ遺伝子によってエンコードされるＲＮＡを特異的に切断できるリ ボザイムをエンコードするＤＮＡ。
31. ３１．該カラーゼ遺伝子がブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）の ５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質をエンコードする、請求項３０に記載 のリボザイムをエンコードするＤＮＡ。
32. ３２．転写が構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ ）の制御下にある、請求項３０または３１に記載のリボザイムをエンコードする ＤＮＡ。
33. ３３．転写がタペータムに特異的なプロモーターの制御下にある、請求項３０ま たは３１に記載のリボザイムをエンコードするＤＮＡ。
34. ３４．カラーゼ遺伝子の適当な発現を特異的に破壊することができるＤＮＡ。
35. ３５．該カラーゼ遺伝子がブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）の ５３ｋＤａのカラーゼ酵素またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｙ　Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｅａｅ）の他の植物の同様のタンパク質をエンコードする、請求項３４に記載 のＤＮＡ。
36. ３６．３′転写調節配列を有する請求項１から３５のいずれかに記載のＤＮＡ。
37. ３７．該３′転写調節シグナルがカリフラワーモザイクウィルス（Ｃａｕｌｉｆ ｌｏｗｅｒ　Ｍｏｓａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）３５Ｓ遺伝子由来である、請求項３６ に記載のＤＮＡ。
38. ３８．組換体であり、ベクターの形態を有する、請求項１から３７のいずれかに 記載のＤＮＡ。
39. ３９．該ベクターがクローニングベクターであり、１つまたはそれ以上の選択マ ーカーを有する、請求項３８に記載のＤＮＡ。
40. ４０．請求項３８または３９に記載のベクターを感染または形質転換した微生物 の宿主細胞。
41. ４１．ＤＮＡを形質転換された植物が形質転換されない植物と区別できるマーカ ー配列を有する、請求項１から３９のいずれかに記載のＤＮＡ。
42. ４２．該マーカー配列によって抗生物質若しくは除草剤耐性が得られるまたは該 マーカー配列がグルクロニダーゼをコードする、請求項４１に記載のＤＮＡ。
43. ４３．該マーカー配列がタペータムに特異的でない第二のプロモーターの制御下 にある、請求項４１または４２に記載のＤＮＡ。
44. ４４．該第二のプロモーターがカリフラワーモザイクウィルス（Ｃａｕｌｉｆｌ ｏｗｅｒ　Ｍｏｓａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子由来である、 請求項４３に記載のＤＮＡ。
45. ４５．請求項１から３９および４１から４４のいずれかに記載のＤＮＡを有する 植物細胞。
46. ４６．少なくとも幾つかの細胞が請求項４５に記載されるものである植物または 植物の一部。
47. ４７．請求項４６に記載の植物からの増殖材料。