BRPI0807573A2 - Composições e métodos úteis para recombinação sítio-dirigida em plantas. - Google Patents

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS ÚTEIS PARA RECOMBINAÇÃO SÍTIO ESPECÍFICA EM PLANTAS

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos 60/891.302, depositado em 23 de fevereiro de 2007 e Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos 60/986.097, depositado em 7 de novembro de 2007.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO Ã PESQUISA COM FUNDOS DA FEDERAÇÃO

Duas concessões do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, de número 2006/635319174 62 e de número 033043-1, foram usadas para financiar pesquisa associada a esse pedido; o Governo Federal pode ter certos direitos sobre o mesmo.

CAMPO DA INVENÇÃO

Essa invenção se refere de forma geral às composições e métodos úteis relacionados à recombinação sítio específica em plantas. Particularmente, a invenção se refere às seqüências de ácido nucléico novas, exclusivas para uma porção da região NBS-LRR de sorgo, assim como vetores, sementes, frações de plantas e plantas compreendendo essas seqüências. Os métodos para investigar cofatores de recombinação, e os métodos para investigar potenciais herbicidas estão dentro do escopo. A invenção também se refere aos patógenos fúngicos de sorgo, particularmente Periconia circinata.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Dano de patógeno de planta, seja no campo de cultivo ou jardim de flores, tem sido um problema dispendioso e quase insuperável desde o início da agricultura. A evolução em conjunto de planta e patógeno define duas soluções: vencer o patógeno ou ajudar a planta. A nossa abordagem moderna tem sido de realizar os dois, enquanto simultaneamente garantindo que os ecossistemas associados não sejam permanentemente danificados.

Várias abordagens tratam da luta de força em andamento entre a planta e o patógeno de planta. Como muitos patógenos importantes estão compreendidos na categoria de patógenos "biotróficos" ou necessitando de tecido saudável, a maior parte das pesquisas é dirigida ao entendimento dos mesmos. Outra classe de patógenos, os "necrotrófos" florescem quando as plantas estão enfraquecidas. A presente invenção tem origem no estudo de uma relação necrotrófica entre o patógeno e a planta.

Embora as plantas não tenham sistemas imunes no sentido de mamífero de células secretórias especializadas, elas possuem a capacidade de evitar ou minimizar dano e/ou doença induzida por patógeno. Antes da presente invenção, pensava-se que a rota mais freqüente para uma espécie evitar a "extinção por patógenos" era aquela de duas vias: morte programada das células em um local de invasão do patógeno, e mutação aleatória durante meiose para alterar a especificidade de reconhecimento de patógeno.

A morte programada das células (ou "apoptose") no local de invasão é um fenômeno bem caracterizado nas plantas, com grupos de genes específicos, especialmente o "NBS-LRR" (local de ligação de nucleotídeo, repetição rica em leucina) , sendo conhecida como uma fonte rica de genes de resistência. Em genomas de plantas que foram estudados em relação à presença de regiões NBS-LRR (aproximadamente 45), descobriu-se que todos continham as mesmas. A presente invenção provê um gene de resistência previamente nãocaracterizada a partir do sorgo.

O segundo tipo de evitar a extinção, eventos de cruzamento e mutações de pontos durante meiose, resulta em plantas que têm especificidades de genes de resistência à doença nova. Qualquer nova peculiaridade possibilita que qualquer ambiente determinado possa selecionar essa peculiaridade conforme preferido. Muita pesquisa se refere à aceleração desse processo normal por intermédio de programas de produção de plantas e biologia molecular. Projetar e/ou selecionar peculiaridades preferidas nas plantas é uma aplicação mundial de bilhões de dólares, com pressões por parte dos consumidores e/ou pressões legislativas favorecendo a produção de plantas em relação a programas que resultam em programas "OGM". A presente invenção provê métodos proveitosos para acelerar os processos tradicionais de produção de plantas.

No outro lado da equação, fisiologia de patógeno e pesquisa genética são fontes de conhecimento que podem levar a novos herbicidas, inseticidas e fungicidas. Em uma mudança repentina na abordagem comum, alguns agrônomos estudam o uso de patógenos (principalmente insetos e fungos) para exterminar as ervas daninhas. Isolados fúngicos foram revelados no passado os quais exterminam seletivamente as espécies invasoras.

A especificidade alvo para espécies de plantas especificas é um atributo desejado de qualquer herbicida; contudo, herbicidas que são excessivamente específicos têm mercados que são muito pequenos para justificar o investimento. Ferramentas que diminuem o custo de trazer um herbicida muito específico para o mercado beneficiariam os investidores assim como o meio ambiente. A presente invenção provê métodos para identificar tais herbicidas ambientalmente favoráveis e economicamente exeqüíveis.

Como um exemplo para os princípios anteriormente descritos, Sorghum bicolor é uma alimento básico dietético de mais de 500 milhões de pessoas pelo mundo todo. Nos Estados Unidos, o sorgo provê uma alternativa econômica para o milho para uso como biomassa de etanol. Além disso, o sorgo não produz glúten, tornando-o particularmente útil como uma alternativa para o trigo na elaboração de alimentos e bebidas para indivíduos intolerantes ao glúten.

0 sorgo, como outras culturas de grãos, é um alvo para uma variedade de patógenos. Alguns patógenos de sorgo entram na planta de forma não reconhecida, e prejudicam a planta. Algumas plantas de sorgo em particular, contudo, reconhecem os patógenos biotróficos (por intermédio de substâncias químicas secretadas ou de superfície distinta), e preparam uma resposta hipersensitiva bem-sucedida, fazendo com que o local da infecção definhe e morra. A morte da célula localizada priva o agente biotrófico de alimento, impede dano adicional e salva a planta. Desse modo, plantas em particular, bem-sucedidas sobrevivem e passam as suas peculiaridades de salvar vida para as gerações futuras. Contudo, o mesmo é verdadeiro para os patógenos individuais; alguns deles evitam ser reconhecidos por essas plantas recentemente sensitivas. Esse processo de reconhecimento/não-reconhecimento é uma "corrida

ãrmamentista" entre o patógeno e a planta. Mudanças dramáticas nas populações de plantas e patógenos aparecem em um espaço de tempo tão pequeno quanto dez anos.

A doença de sorgo, milo, é um exemplo de uma doença de planta causada por um necrotrófo. Uma planta com infecção por Periconia tem descoloração vermelho escuro nas raízes e na parte superior. As folhas se tornam cloróticas e eventualmente morrem. As plantas infectadas produzem pouco ou nenhum grão.

Contudo, algumas plantas individuais de sorgo não respondem à Periconia. Essas plantas não-reativas crescem normalmente, mesmo se expostas ao fungo Periconia. Em outras palavras, essas plantas não-reativas de sorgo são resistentes à doença de miIo pelo fato de não responder às sugestões químicas da Periconia.

Suseetibilidade à peritoxina de Periconia e doença de milo é provida por um único gene semi-dominante, Pc. 0 Pc naturalmente realiza mutação para o alelo de Pc resistente em uma taxa de aproximadamente 1 por 8000 gametos. Esse alto nível de instabilidade é unidirecional: mutações de pc para Pc não foram observadas.

Entender os fenômenos de suscetibilidade à doença de milo e resistência no sorgo acrescenta valor à pesquisa agrícola, desenvolvimento e comercialização em uma ampla variedade de plantas, e para o benefício de uma ampla variedade de consumidores.

Além disso, a batalha evolutiva de patógenos versus plantas se desdobrará indefinidamente porque as plantas e os patógenos têm individualmente seus próprios mecanismos para evitar a extinção. Portanto, qualquer meio novo para: 1. acelerar desenvolvimento de planta nova; 2. acelerar desenvolvimento de herbicida novo e/ou 3. acelerar nosso conhecimento comum em qualquer desses campos, é útil e necessário. A presente invenção provê instrumentos e métodos relacionados a todos os três objetivos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê polinucleotídeos isolados compreendendo pelo menos 20 bases contíguas de bases 3062-3622 de uma região LRR de Sorghum bicolor. Preferidos são aqueles polinucleotídeos os quais estão em pelo menos 40 bases contíguas. Também são preferidos aqueles que são selecionados do grupo consistindo nas seguintes bases contíguas: 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, e qualquer outro incremento de 5, continuando até 560 bases. Particularmente, aqueles polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo em: SEQ ID N°: 2; SEQ ID N°: 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N0:6 são os mais preferidos.

Também são providos vetores compreendendo pelo menos dois polinucleotídeos tendo pelo menos 20 bases contíguas, embora números previamente mencionados de bases contíguas também sejam providos. Vetores que compreendem os polinucleotídeos descritos e os quais compreendem adicionalmente um polinucleotídeo de controle de expressão e um polinucleotídeo de interesse também são providos. Preferidos são aqueles vetores agora descritos, os quais compreendem adicionalmente um polinucleotídeo marcador.

Também são providas células cultivadas compreendendo os vetores aqui descritos. Sementes, plantas, as frações de plantas, raízes, os calos e as folhas compreendendo pelo menos dois polinucleotídeos da presente invenção são preferidos, embora essas frações de planta que compreendem um polinucleotídeos, ou múltiplos

polinucleotídeos, também sejam providas.

Também são providos polinucleotídeos isolados compreendendo pelo menos 70% de identidade para bases 3062- 3622 de uma região LRR de Sorghum bicolor. São preferidos aqueles polinucleotídeos compreendendo pelo menos 90% de identidade, embora aqueles polinucleotídeos que compreendem 75, 80, 85, 95, 96, 97 e 98 por cento de identidade também sejam providos.

Também são providos vetores compreendendo pelo menos dois polinucleotídeos descritos acima, embora esses vetores compreendendo um ou múltiplos polinucleotídeos descritos acima também sejam providos. Aqueles vetores que compreendem adicionalmente um polinucleotídeo de controle de expressão e um polinucleotídeo de interesse são preferidos. Mais preferidos são aqueles vetores, conforme descrito, que compreendem adicionalmente um polinucleotideo marcador.

Células cultivadas compreendendo os vetores aqui descritos são providas, assim como as culturas de células compreendendo uma mistura de células e/ou uma biblioteca de

polinucleotideos em vetores aqui descritos.

Sementes, plantas, frações de plantas, raizes, calos e folhas compreendendo pelo menos dois polinucleotideos da presente invenção são preferidos, embora aquelas frações de plantas que compreendem um

polinucleotideo, ou múltiplos polinucleotideos, também sejam providas.

Também são providos métodos para identificar um polinucleotideo que contribui para a recombinação, compreendendo: cultivar uma célula aqui descrita, sob

condições adequadas para expressão do polinucleotideo de interesse e determinar se ocorre a recombinação. Quaisquer métodos aceitáveis são incluídos, especificamente, métodos preferidos são aqueles em que a identificação é selecionada do grupo consistindo em: identificação de marcador;

mudanças fenotípicas; mudanças genotipicas.

Também são providos polinucleotideos isolados compreendendo pelo menos 7 0% de identidade com o polinucleotideo de SEQ ID N0:1. Aqueles em que o polinucleotideo é 90% idêntico à SEQ ID N0:1 são

preferidos; contudo, aqueles polinucleotideos que compreendem 75, 80, 85, 95, 96, 97 e 98 por cento de identidade também são providos.

Vetor compreendendo esses polinucleotideos são providos, particularmente preferidos são os vetores de

expressão compreendendo um polinucleotideo de controle de expressão vinculado operativamente a um polinucleotideo aqui descrito. Além disso, células cultivadas compreendendo os vetores aqui descritos são providas, como são as culturas de células compreendendo uma mistura de células e/ou uma biblioteca de polinucleotideos nos vetores aqui descritos.

Sementes, plantas, frações de plantas, raízes, os calos e as folhas compreendendo pelo menos dois polinucleotideos da presente invenção são preferidos, embora também sejam providas aquelas frações de planta que compreendem um polinucleotideo, ou múltiplos

polinucleotideos.

Também são providos métodos para identificar se um composto de teste interage com um produto de expressão de pelo menos um polinucleotideo da presente invenção, compreendendo contatar um composto de teste com um produto de expressão de uma seqüência de genes Pc, e determinar se o composto de teste interage com o produto de expressão.

Essas e outras características e vantagens dessa invenção se tornarão mais evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada.

DEFINIÇÕES

"Polinucleotideo marcador" tem o mesmo significado que "marcador", conforme esse termo é usado na técnica.

"Polinucleotideo de controle de expressão" significa qualquer polinucleotideo que afeta a expressão.

"Interage" significa causar qualquer mudança quimica, mudança fenotípica ou mudança genotipica incluindo, por exemplo, apenas: ligação ou regulação.

"Vetor" significa qualquer construção de ácido nucléico que é capaz de entrar em uma célula de planta, incluindo os ácidos nucléicos, circulares ou lineares, e/ou ácidos nucléicos bacterianos, virais, fúngicos, de plantas e sintetizados, assim como construções de ácido nucléico homólogas ou heterólogas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

Figura 1. Eventos de recombinação desigual entre parálogos AeCe mutantes-Pc M1-M7.

Figura 2. Desenho esquemático de métodos

exemplificados da presente invenção.

Figura 3. Localização dos pontos de ruptura de recombinação desigual entre parálogos A e C ao longo de sua seqüência de consenso (3737 bp) . 0 grau de similaridade entre parálogos A e C é mostrado com um código de cor. Três

recombinações desiguais (em mutantes M8-M10) ocorreram seja nas regiões intergênicas a montante ou nas regiões 5' que são idênticas entre os parálogos A e C. Nove das recombinações A-C (uma em cada M1-M7, duas em M13) foram localizadas em um segmento 560 bp menos conservado da

região LRR (para mais detalhes vide Tabela 1).

Figura 4. Anotação de gene da região-Pc no cultivar de sorgo Colby conforme demonstrado pelo software, Apollo. As duas faixas azuis horizontais representam as duas cepas complementares de DNA. Os resultados da anotação

são mostrados nos campos pretos. Os blocos amarelos representam as homologias de genes encontradas com o programa BLASTX, os blocos de cor púrpura são para os resultados de predição de gene (FGENESH) . A familia de genes NBS-LRR na cepa adicional incluiu o gene Pc.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A elucidação dos presentes materiais e dos mecanismos de ação dos materiais in situ oferece outros materiais similares, assim como métodos de produção de plantas e métodos de investigação de novos herbicidas.

No sentido mais amplo, a presente invenção provê materiais e métodos genéticos de plantas. Os materiais estão compreendidos em uma variedade de categorias, incluindo: polinucleotideos; polipeptídeos; vetores; sementes; plantas e frações de plantas. Os métodos podem ser descritos genericamente como: métodos para construir e utilizar vetores; métodos para identificar e expressar genes; métodos para transfectar e/ou transformar sementes, plantas e/ou frações de plantas; métodos para fazer com que os polipeptídeos recombinem; métodos para causar recombinação de sítio específica de polipeptídeos; métodos para analisar compostos e métodos para localizar cofatores de recombinação.

O termo planta inclui células de planta, protoplastos de planta, culturas de tecido de células de plantas a partir das quais as plantas podem se regeneradas, calos de planta, cepas de planta e células de planta que estão intactas nas plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, flores, grãos, espigas, sabugos, cascas, talo, raízes, pontas de raízes, anteras, e semelhantes.

O relatório descritivo e as reivindicações utilizam as formas singulares "um", "algum" e "o". Esses termos não pretendem excluir uma interpretação plural, e podem incluir preferivelmente uma interpretação plural, dependendo do contexto. Assim, por exemplo, referência a "um composto" pode incluir uma variedade de tais compostos, ou vários daqueles mesmos compostos, a menos que a interpretação seja contrária ao contexto na qual ela é usada.

Com relação aos polinucleotideos aqui revelados, os polinucleotideos preferidos são exemplificados pelos parálogos A, B e C da região NBS-LRR de sorgo.

0 termo polinucleotideo abrange os termos, "ácido nucléico", "seqüência de ácidos nucléicos" ou "oligonucleotídeo" conforme esses termos são geralmente entendidos na técnica.

Adicionalmente, o termo polinucleotideo inclui DNAs ou RNAs conforme descritos acima que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, DNAs ou RNAs com estruturas principais modificadas para estabilidade ou por outras razões são "polinucleotideos" conforme esse termo é aqui empregado. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, tal como inosina, ou bases modificadas, tal como bases tratadas com tritila, apenas para citar dois exemplos, são polinucleotideos conforme o termo é aqui utilizado. Será considerado qüe uma grande variedade de modificações foi feita em DNA e RNA que servem a muitos propósitos úteis conhecidos daqueles versados na técnica. 0 termo polinucleotideo conforme é aqui empregado abrange tais formas quimicamente, enzimaticamente ou

metabolicamente modificadas de polinucleotideos, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo células simples e complexas, entre outros.

Vários métodos de introduzir genes estranhos em plantas são conhecidos e podem ser utilizados para inserir seqüências de ácido nucléico em um hospedeiro de planta, incluindo protocolos de transformação biológica e física de plantas. Vide, por exemplo, Miki e outros (1993) "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ed. Glick and Thompson (CRC Press, Inc., Boca Raton) , páginas 67-88. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira, e incluem métodos de transfecção química, tal como fosfato de cálcio, transferência de gene mediada por microorganismo, tal como Agrobacterium (Horsch e outros (1985) Science 227:1229-1231), eletroporação, microinjeção e bombardeio biolístico. Cassetes e vetores de expressão e métodos de cultivo in vitro para transformação de tecido ou célula de planta e regeneração de plantas são conhecidos e disponíveis. Vide, por exemplo, Gruber e outros (1993) "Vectors for Plant Transformation", em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ed. Glick and Thompson (CRC Press, Inc., Boca Raton), páginas 89-119.

0 método mais amplamente utilizado para introduzir um vetor de expressão em plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênico de planta que geneticamente transformam as células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética das plantas. Vide, por exemplo, Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sei. 10:1. Descrições dos sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium são fornecidas em Gruber e outros (1993), supra; Miki e outros (1993), supra and Moloney e outros (1989) Plant Cell Reports 8:238.

Apesar do fato de que é ampla a gama de hospedeiros para transformação mediada por Agrobacterium, algumas espécies de culturas e gimnospermas de cereais principais têm sido geralmente recalcitrantes para esse modo de transferência de gene, embora algum sucesso tenha sido obtido recentemente em arroz (Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282) e milho (Ishida et al. (1996) Nature/Biotechnology 14:745-750). Vários métodos de transformação de· planta, referidos coletivamente como transferência direta de genes, foram desenvolvidos como uma alternativa para a transformação mediada por Agrobacterium. Um método geralmente aplicável de transformação de planta é a transformação mediada por microprojétil, onde o DNA é carregado na superfície de microprojéteis medindo aproximadamente 1 a 4 μπι. O DNA geralmente contido em um vetor de expressão é introduzido nos tecidos da planta com um dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis até velocidades de 300 a 600 m/s, que é suficiente para penetrar nas paredes e membranas das células de planta (Sanford et al. (1987) Part. Sei. Technol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6:299; Sanford (1990) Physiol. Plant. 79:206; Klein et al. (1992) Biotechnology 10:268).

Outro método para entrega física de DNA às plantas é a sonicação de células alvo conforme descrito em Zang e outros (1991) Bio/Technology 9:996. Alternativamente, lipossomas ou fusões de esferoplasto têm sido usados para introduzir vetores de expressão nas plantas. Vide, por exemplo, Deshayes e outros (1985) EMBO J. 4:2731; and Christou et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3962. Admissão direta de DNA em protoplastos utilizando precipitação de CaCl2, álcool polivinílico ou poli-L-ornitina também foi reportada. Vide, por exemplo, Hains e outros (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; e Draper, e outros (1982); Plant Cell Physiol. 23:451.

A eletroporação de protoplastos e de células e tecidos inteiros também foi descrita. Vide, por exemplo, Donn e outros (1990) em Abstracts of the VIIth Int'1. Congress on Plant Cell and Tissue Culture (IAPTC) A2-38, página 53; D'Halluin e outros (1992) Plant Cell 4:1495- 1505; e Spencer e outros (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61. A microinjeção de DNA em células inteiras de planta também foi descrita como tendo microinjeção em protoplastos. Vide, por exemplo, em células inteiras, Neuhaus e outros (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30-36; e em protoplastos, Crossway e outros (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185; e Reich e outros (1986) Biotechnology 4:1001-1004.

Outro protocolo de transformação básica útil envolve uma combinação de dano mediante bombardeio de partículas, seguido pelo uso de Agrobacterium para entrega

de DNA, conforme descrito por Bidney e outros (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313. Plasmideos úteis para transformação de plantas incluem PHP97 62. A estrutura principal binária para PHP97 62 é bin 19. Vide Bevan e outros (1984) Nucleic Acids Res. 12:8711-8721.

Em geral, o método de transformação de meristema intacto envolve embeber a semente por 24 horas no escuro, remover os cotilédones e o radical de raiz, seguido pelo cultivo das ex-plantas de meristema. Vinte e quatro horas após, as folhas principais são removidas para expor a

meristema apical. As ex-plantas são colocadas com o lado do domo apical para cima e bombardeadas, por exemplo, duas vezes com partículas, seguido pela co-cultivação com Agrobacterium. Para iniciar a co-cultivação para meristemas intactos, Agrobacterium é colocado no meristema. Após um

período de aproximadamente três dias de co-cultivação os meristemas são transferidos para o meio de cultivo com cefotaxima (mais canamicina para a seleção de NPTII). A seleção também pode ser feita utilizando-se canamicina.

0 método de meristema dividido envolve embeber a

semente, romper os cotilédones para produzir uma fratura limpa no plano do eixo embriônico, cortar a ponta da raiz, e então dividir em duas partes iguais às ex-plantas longitudinalmente entre as folhas primordiais. As duas metades são colocadas com a superfície cortada para cima no

meio e então bombardeadas duas vezes com partículas, seguido pela co-cultivação com Agrobacterium. Para os meristemas divididos, após bombardeio, os meristemas são colocados em uma suspensão de Agrobacterium por 30 minutos. Elas são então removidas da suspensão para o meio sólido de cultivo para co-cultivação de 3 dias. Após esse período, os meristemas são transferidos para meio fresco com cefotaxima (mais canamicina para seleção).

Quando uma única planta transformada tiver sido obtida pelo método de DNA recombinante anteriormente mencionado, por exemplo, uma planta transformada com um gene desejado, métodos convencionais de produção de plantas podem ser usados para transferir o gene estrutural e as seqüências reguladoras associadas por intermédio de cruzamento e retro-cruzamento. Em geral, tais técnicas de produção de plantas são usadas para transferir um gene desejado para uma planta de cultura especifica. Na presente invenção, tais métodos incluem as etapas adicionais: (1) cruzar sexualmente uma planta transformada compreendendo as seqüências presentes com uma segunda planta transformada de co-fator; (2) recuperar o material reprodutivo a partir da progênie do cruzamento; e (3) desenvolver as plantas transformadas duplamente a partir do material reprodutivo.

Os presentes polinucleotídeos podem ser usados para vantajosamente cortar um gene a partir de um genoma de planta. Por exemplo, um gene marcador pode ser inserido em um genoma de planta junto com um gene de interesse. 0 gene marcador é inicialmente útil na demonstração de transformação efetiva das plantas, mas não é desejado no produto final. Mediante indução de expressão, transitoriamente ou a partir do genoma da planta, o gene marcador indesejado é cortado.

Em outras palavras, um local alvo é construído para ter múltiplos conjuntos funcionais de locais de recombinação diferentes e não recombinogênicos. Assim, múltiplos genes ou polinucleotídeos podem ser empilhados ou ordenados. Em exemplos específicos, esse método permite o empilhamento de seqüências de interesse em locais precisos no genoma de uma célula ou de um organismo. Similarmente, quando um local alvo tiver sido estabelecido dentro de uma célula ou de um organismo, locais adicionais de recombinação podem ser introduzidos mediante incorporação de tais locais dentro do cassete de transferência. Assim, quando um local alvo tiver sido estabelecido, é possível subsequentemente acrescentar locais ou alterar locais através de recombinação. Tais métodos são descritos em detalhe na WO 99/25821.

Em um exemplo, métodos para combinar múltiplos cassetes de transferência são providos. 0 método compreende prover um local alvo compreendendo pelo menos um iniciadoriro e um segundo local de recombinação funcional, em que o iniciadoriro e o segundo local de recombinação são diferentes e não recombinogênicos com relação um ao outro. Um iniciadoriro cassete de transferência compreendendo na seguinte ordem pelo menos o iniciadoriro, um terceiro, e o segundo local de recombinação funcional é provido em que o iniciadoriro e o terceiro local de recombinação do iniciadoriro cassete de transferência flanqueiam um iniciadoriro polinucleotídeo de interesse e em que o iniciadoriro, o segundo e o terceiro local de recombinação são diferentes e não recombinogênicos com relação um ao outro e uma iniciadorira recombinase é provida, pelo que o iniciadoriro cassete de transferência é integral no local alvo. Pelo menos um do iniciadoriro, segundo ou terceiro local de recombinação compreende um local de recombinação modificado funcional aqui provido.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são conhecidos na técnica. Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; por intermédio de algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch (197 0) J. Mol. Biol. 48:443; por intermédio de pesquisa para o método de similaridade de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nad. Acad. Sei. USA 85:2444; mediante implementações computadorizadas desses algoritmos, incluindo, mas não limitadas a: CLÜSTAL no programa de PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis.; o programa CLUSTAL é bem descrito em Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244; Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151- 153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Computer Applications in the Bioscienees 8:155-65, and Person et al. (1994) Meth. Mol. Bio. 24:307-331; métodos preferidos de alinhamento por computador incluem também os algoritmos BLASTP, BLASTN e BLASTX. Vide Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. 0 alinhamento também é realizado frequentemente mediante inspeção e alinhamento manual.

"Identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de polipeptideo ou de ácido nucléico inclui referência aos resíduos nas duas seqüências que são idênticos quando alinhados para correspondência máxima através de uma janela de comparação especificada. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada com referência às proteínas, é reconhecido que as posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem mediante substituição de aminoácido conservador, onde resíduos de aminoácido são substitutos de outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservadoras, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada ascendentemente para corrigir a natureza conservadora da substituição. Seqüências que diferem mediante tais substituições conservadoras são ditas como tendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios para fazer esse ajuste são conhecidos daqueles versados na técnica. Tipicamente isso envolve contagem de uma substituição conservadora como uma correspondência errônea parcial mais propriamente do que total, desse modo aumentando a percentagem de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe uma contagem de 1, e uma substituição não conservadora recebe uma contagem de zero, uma substituição conservadora recebe uma contagem entre zero e 1. As contagens das substituições conservadoras são calculadas, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

Aqueles versados na técnica reconhecem que o valor determinado mediante comparação de duas seqüências otimamente alinhadas através de uma janela de comparação, em que a porção da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou anulações (isto é, lacunas) em comparação com a seqüência de referência (a qual não compreende adições ou anulações) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada mediante determinação do número de posições nas quais base de ácido nucléico ou resíduo de aminoácido idênticos ocorre em ambas as seqüências para produzir o número de posições equivalentes, dividindo o número de posições equivalentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem da identidade de seqüência.

Além disso, aqueles versados na técnica reconhecerão que os valores de identidade de seqüência podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente das proteínas codificadas por duas seqüências de nucleotídeo mediante consideração da degeneração de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura, e semelhante. Identidade substancial de seqüências de aminoácido para essas finalidades normalmente significa identidade de seqüência de pelo menos 60%, mais preferivelmente de pelo menos 70%, 80%, 90%, e mais preferivelmente de pelo menos 95%. Os polipeptídeos que são "substancialmente similares" compartilham seqüências conforme observado acima exceto que as posições de resíduo, que. não são idênticas, podem diferir mediante mudanças de aminoácido, conservadoras.

Outra indicação de que as seqüências de nucleotídeo são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizarem mutuamente sob condições severas. Geralmente, condições severas são selecionadas para ser de aproximadamente 5 0C a aproximadamente 20 0C inferior ao ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob intensidade iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente combinada. Tipicamente, condições severas de lavagem são aquelas nas quais a concentração de sal é de aproximadamente 0,02 molar em pH 7 e a temperatura é de pelo menos aproximadamente 50, 55 ou 60 °C. Contudo, ácidos nucléicos que não hibridizam mutuamente sob condições severas ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam forem substancialmente idênticos. Isso pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada utilizando a degeneração de códon máximo permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênticas é que o polipeptideo codificado pelo iniciadoriro ácido nucléico é imunologicamente de reação cruzada com o polipeptideo codificado pelo segundo ácido nucléico.

Para uma descrição das várias bibliotecas, vetores, ácidos nucléicos, etc., vide, por exemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1999 (La Jolla, Calif.); e, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog '99 (Arlington Heights, III.).

As proteínas isoladas da presente invenção compreendem um polipeptideo tendo pelo menos 10 aminoácidos a partir de um polipeptideo da presente invenção (ou suas variantes conservadoras) tais como aquelas codificadas por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção. As proteínas da presente invenção ou suas variantes podem compreender qualquer número de resíduos de aminoácidos contíguos a partir de um polipeptideo da presente invenção, em que aquele número é selecionado do grupo de números inteiros a partir de 10 até o número de resíduos em um polipeptideo de cominiciadornto total da presente invenção. Opcionalmente, essa subseqüência de aminoácidos contíguos é de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 aminoácidos de cominiciadornto, frequentemente de pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90 aminoácidos de cominiciadornto. Adicionalmente, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado do número a partir de 1 a 20, tal como 2, 3, 4 ou 5.

A presente invenção provê adicionalmente uma proteína compreendendo um polipeptideo tendo uma identidade/similaridade de seqüência especificada com um polipeptideo da presente invenção. A percentagem de identidade/similaridade de seqüência é um número inteiro selecionado do grupo a partir de 50 a 99. Valores exemplares de identidade/similaridade de seqüência incluem 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95%. A identidade de seqüência pode ser determinada utilizando, por exemplo, os algoritmos GAP, CLUSTALW ou BLAST, preferivelmente BLAST.

Como aqueles versados na técnica considerarão, a presente invenção inclui, mas não é limitada aos polipeptídeos cataliticamente ativos da presente invenção (por exemplo, SEQ ID N0:1). Polipeptídeos cataliticamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20%, 30% ou 40%, e preferivelmente de pelo menos 50%, 60% ou 70%, e mais preferivelmente pelo menos 80%, 90% ou 95% daquela do polipeptideo endógeno nativo (não sintético) .

Adicionalmente, a especificidade de substrato (kcat/Km) é opcionalmente substancialmente similar a do polipeptideo endógeno nativo (não-sintético) . Tipicamente, o Km será de pelo menos 30%, 40% ou 50%, daquele do polipeptideo endógeno nativo (não-sintético) , e mais preferivelmente de pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%. Métodos de analisar e de quantificar medidas de atividade enzimática e especificidade de substrato (kcat/Km) são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

Geralmente, as proteínas da presente invenção induzirão, quando apresentadas como imunógeno, a produção de um anticorpo especificamente reativo a um polipeptideo da presente invenção. Adicionalmente, as proteínas da presente invenção não se ligarão aos antissoros promovidos contra um polipeptideo da presente invenção o qual foi completamente imunossorvido com o mesmo polipeptideo. Imunoensaios para determinar a ligação são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Um imunoensaio preferido é um imunoensaio competitivo. Assim, as proteínas da presente invenção podem ser empregadas como imunógenos para construção de anticorpos imunorreativos para uma proteína da presente invenção para tais utilidades exemplares como imunoensaios ou técnicas de purificação de proteína.

Utilizando os ácidos nucléicos da presente invenção, pode-se expressar uma proteína da presente invenção em uma célula construída de forma recombinante tal como bactérias, levedura, insetos, mamífero ou preferivelmente células de plantas.

Espera-se que aqueles versados na técnica tenham conhecimento dos vários sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína da presente invenção. Aqueles versados na técnica reconhecem que certas variações não resultam em experimento indevido, e aquelas variações são incluídas no escopo da presente invenção.

Resumidamente, a expressão de ácidos nucléicos isolados codificando uma proteína da presente invenção será obtida tipicamente mediante ligação operativa, por exemplo, do DNA ou cDNA a um promotor (o qual é constitutivo ou ajustável), seguido pela incorporação em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração em procariotes ou em eucariotes. Vetores de expressão típicos contêm terminadores de transcrição e translação, seqüências de iniciação e promotores úteis para regulação da expressão do DNA codificando uma proteína da presente invenção. Para obter expressão de alto nível de um gene clonado, é desejável construir vetores de expressão que contêm, no mínimo, um forte promotor para dirigir a transcrição, um local de ligação de ribossomo para iniciação translacional e um terminador de transcrição/translação. Aqueles versados na técnica reconhecerão que modificações podem ser feitas em uma proteína da presente invenção sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão ou incorporação da molécula visada em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas daqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada no terminal amino para prover um local de iniciação, ou aminoácidos adicionais (por exemplo, poli His) colocados em qualquer um dos terminais para criar seqüências de purificação convenientemente localizadas. Locais de restrição ou códons de terminação também podem ser introduzidos.

Alternativamente, as seqüências da invenção podem ser usadas para isolar seqüências correspondentes em outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente, outras monocotiledôneas. Dessa maneira, métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências tendo similaridade substancial de seqüência com as seqüências da invenção. Vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). e Innis e outros (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York). Seqüências de codificação isoladas com base em suas identidades de seqüência para as seqüências de codificação inventivas completas aqui apresentadas ou aos seus segmentos são abrangidos pela presente invenção.

Preferidas são aquelas seqüências isoladas e usadas nos presentes métodos, a partir das seguintes plantas:

Exemplos de gêneros e espécies de planta de interesse para localizar cofatores das presentes seqüências recombinatórias incluem, mas não são limitados às monocotiledôneas e dicotiledôneas, tal como milho (Zea mays) , Brassica sp., Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fonte de óleo de sementes, alfafa (Medieago sativa), arroz (Oryza sativa) , centeio (Seeale eereale), sorgo, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, milheto (Pennisetum glaueum), milheto "proso" (Panieum miliaeeum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusine eoraeana) , girassol (Helianthus annuus) , cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Tritieum aestivum), soja (Glyeine max), tabaco (Nieotiana tabaeum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense), Gossypium hirsutum, batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta) , café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), planta citrica (Citrus spp.), cacau (Theobroma cação), chá (Camellia sinensis), bananeira (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifólia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena) , cevada (Hordeum) , palma, legumes incluindo vagens e ervilhas como guar, alfarroba, fenogrego, feijões de horta, feijão de vaca, vigna radiata, feijão de lima, feijão de fava, lentilhas, grão de bico, mamona, Arabidopsis, vegetais, plantas ornamentais, gramineas, coníferas, plantas de cultivo que proporcionam sementes de interesse, plantas de grão que proporcionam sementes de interesse, plantas de semente-óleo, plantas leguminosas. Vegetais incluindo tomate (Lycopersicon esculentum) r alface (Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis) , ervilhas (Lathyrus spp.), um membro do gênero Cucumis, pepino (Cueumis sativus), melão (Cueumis eantalupensis) , melão amarelo (Cueumis melo), azaléa (Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophylla hydrangea), hibisco (Hibiseus rosasanensis), roseira {Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.), narciso (Nareissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus earyophyllus), copo de leite (Euphorbia puleherrima) e crisântemo. Coníferas incluindo, por exemplo, pinheiros, Pinus taeda, Pinus elliotil, Pinus ponderosa, Pinus eontorta, Pinus radiata, Pseudotsuga menziesil, Tsuga eanadensis, Pieea glauca, sequoia (Sequoia sempervirens), abeto genuíno, Abies amabilis, Abies balsamed; e cedros, como Thuja plicata e cedro amarelo colado (Chamaecyparis nootkatensis).

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção também podem ser preparados mediante síntese química direta por intermédio de métodos tais como o método de fosfotriéster de Narang e outros, Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); o método de fosfodiéster de Brown e outros, Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); o método dietilfosforamidita de Beaucage e outros, Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); o método de fosforamidita triéster de fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers, Tetra. Letts. 22 (20) :1859-1862 (1981), por exemplo, utilizando um sintetizador automatizado, por exemplo, conforme descrito em NeedhamVanDevanter e outros, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984); e, o método de suporte sólido da Patente dos Estados Unidos 4.458.066. Síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo de cepa única. Esse pode ser convertido em DNA de cepa dupla mediante hibridização com uma seqüência complementar, ou mediante polimerização com uma polimerase de DNA utilizando a cepa única como um gabarito. Aqueles versados na técnica reconhecerão que embora a síntese química de DNA seja limitada às seqüências de aproximadamente 100 bases, seqüências mais longas podem ser obtidas por intermédio de ligação de estruturas mais curtas.

Os ácidos nucléicos da presente invenção incluem aqueles amplificados utilizando os seguintes pares de iniciadores: SEQ ID N0: 5 e 6.

Em outra modalidade cassetes de expressão compreendendo ácidos nucléicos isolados da presente invenção são providos. Um cassete de expressão tipicamente compreenderá um polinucleotídeo da presente invenção ligado operativamente às seqüências reguladoras de iniciação transcripcional as quais orientarão a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida, tais como tecidos de uma planta transformada.

A construção de tais cassetes de expressão que podem ser empregados em conjunto com a presente invenção é bem conhecida daqueles versados na técnica à luz da presente revelação. Vide, por exemplo, Sambrook e outros; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Gelvin e outros; Plant Molecular Biology Manual (1990); Plant Biotechnology: Commercial Prospects and Problems, eds. Prakash e outros; Oxford & IBH Publishing Co.; New Delhi, índia; (1993); e Heslot e outros; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts; CRC Press, Inc., USA; (1992).

Por exemplo, vetores de expressão de planta podem incluir (1) um gene de planta clonado sob o controle transcripcional de seqüências reguladoras 5' e 3' e (2) um marcador selecionável dominante. Tais vetores de expressão de planta também podem conter se desejado, uma região reguladora de promotor (por exemplo, aquela conferindo expressão seletiva/especifica que se pode induzir, constitutiva, regulada de forma ambiental ou de desenvolvimento ou de célula ou tecido), um local inicial de iniciação de transcrição, um local de ligação de ribossoma, um sinal de processamento de RNA, um local de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

Promotores de tecido preferido, ou que se podem induzir, constitutivos podem ser empregados. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição 35S do vírus mosaico de couve-flor (CaMV), o promotor 1'- ou 2'- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor de actina, o promotor de ubictina, o promotor de H2B de histona (Nakayama et al., 1992, FEBS Lett 30:167-17 0, o promotor de Smas, o promotor de desidrogenase de cinamil álcool (Patente dos Estados Unidos 5.683.439), o promotor Nos, o promotor pEmu, o promotor rubisco, o promotor GRP1-8 e outras regiões de iniciação de transcrição a partir de vários genes de plantas conhecidos na técnica.

Exemplos de promotores que se podem induzir são os promotores Adhl que é que se pode induzir mediante hipoxia ou tensão a frio, o promotor Hsp70 o qual se pode induzir mediante tensão a calor, o promotor PPDK o qual se pode induzir pela luz, o promotor In2 que é induzido por protetor, o promotor ERE que é induzido por estrógeno e o promotor de Pepcarboxilase que é induzido pela luz.

Exemplos de promotores sob controle desenvolvente incluem promotores que iniciam a transcripção preferencialmente em certos tecidos, tais como folhas, raízes, frutas, sementes ou flores. Um promotor exemplar é o promotor de antera específica 5126 (Patente dos Estados Unidos 5.689.049 e 5.689.051). Exemplos de promotores de sementes preferidas incluem, mas não são limitados ao promotor de gama-zeina 27 kD e promotor ceroso, Boronat,

A., Martinez, M. C., Reina, M., Puigdomenech, P. e Palau, J.; Isolamento e sequenciação do gene de glutelina-2 28 kD de milho: Elementos comuns nas regiões de flanqueamento 5' entre genes de zeína e glutelina; Plant Sei. 47:95-102 (1986) e Reina, M., Ponte, I., Guillen, P., Boronat, A. e Palau, J., Análise de seqüência de um clone genômico codificando uma proteína Zc2 de Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res. 18(21):6426 (1990). Vide o seguinte local relacionado ao promotor ceroso: Kloesgen, R.

B., Gierl, A., Schwarz-Sommer, Z. S. and Saedler, H., Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203:237-244 (1986). As revelações de cada um dos mesmos são aqui incorporadas integralmente mediante referência.

Vetores podem ser construídos utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Vide, por exemplo, Sambrook, e outros, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Os plasmídeos se baseiam em pUC18. Os vetores preferidos contêm combinações dos mesmos elementos reguladores básicos. A seqüência Omega iniciador (0-) 5- iniciador é descrita por Gallie e outros (1987) Nucleic Acids Res. 15:3257-3273. A barra de gene marcador seletivo (Thompson e outros (1987) EMBO J. 6:2519-2523) pode ser usada em conjunto com seleção de bialafos para recuperar os transformantes. 0 promotor 35S de Vírus Mosaico de Couveflor com a região otimizadora duplicada é descrito por Gardner e outros (1981) Nucleie Aeid Res. 9:2871-2888. 0 líder de Vírus Mosaico de Tabaco 7 9-bp é descrito por Gallie e outros (1987) Nueleie Aeid Res. 15:3257-3273 e pode ser inserido a jusante do promotor seguido pelo iniciadoriro íntron do gene de desidrogenase de álcool de milho ADH1-S, descrito por Dennis e outros (1984) Nucleic Acid Res. 12:3983-3990. A seqüência de iniciador-3 pinll é descrita por An e outros (1989) Plant Cell 1:115-122.

Uma variedade de promotores que se podem induzir pode ser usada na presente invenção. Vide, Ward e outros (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Promotores que se podem induzir exemplares incluem aqueles a partir do sistema ACE1, que respondem ao cobre (Mett et al. (1993) Proe. Natl. Aead. Sei. USA 90:4567-4571); gene In2 a partir de milho, que respondem aos protetores de herbicida de benzenosulfonamida (Hershey e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 e Gatz e outros (1994) Mol. Gen. Genet. 243:32-38), ou o repressor Tet a partir de TnlO (Gatz e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237. Um promotor que se pode induzir particularmente preferido é um promotor que responde a um agente de indução ao qual as plantas normalmente não respondem. Um promotor que se pode induzir exemplar é o promotor que se pode induzir a partir de um gene de hormônio esteróide cuja atividade transcripcional é induzida por um hormônio de glucocorticosteróide. Vide Schena et al. (1991) Proe. Natl. Aead. Sei. USA 88:10421.

O vetor de expressão compreende um promotor que se pode induzir ligado operativamente a uma seqüência de nucleotídeo codificando as seqüências presentes. O vetor de expressão é introduzido em células de planta e as células presumivelmente transformadas são expostas a um indutor do promotor que se pode induzir. As células passam por uma triagem em relação à presença das proteínas de seqüência mediante introdução de seqüências que a partir de divisão, promovem a expressão de um marcador que pode receber escore tal como GUS, GFP, luciferase ou produção de antocianina. Alguns promotores de tecido específico ou de tecido preferido podem ser utilizados na presente invenção. Promotores exemplares de tecido específico ou de tecido preferido incluem um promotor de raiz preferido tal como aquele a partir do gene de faseolina (Murai e outros (1983) Science 23:476-482 e Sengupta-Gopalan e outros (1985) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 82:3320-3324); um promotor de folha específica e induzido pela luz tal como aquele a partir de cab ou rubisco (Simpson e outros (1985) EMBO J. 4(11):2723- 2729 e Timko e outros (1985) Nature 318:57 9-582); um promotor de antera específico tal como aquele a partir de LAT52 (Twell e outros (1989) Mol. Gen. Genet. 217:240-245); um promotor de pólen específico tal como aquele a partir de Zml3 (Guerrero e outros (1993) Mol. Gen. Genet. 224:161- 168) ou um promotor de microesporo preferido tal como aquele a partir de apg (Twell e outros (1993) Sex. Plant Reprod. 6:217-224).

Muitos promotores constitutivos diferentes podem ser utilizados na presente invenção. Promotores constitutivos exemplares incluem os promotores a partir de vírus de planta tal como o promotor 35S a partir da CaMV (Odell e outros (1985) Nature 313:810-812) e os promotores a partir de genes tais como actina de arroz (McElroy e outros (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol 18:675-689); pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten e outros (1984) EMBO J. 3:2723-2730); e histona H3 de milho (Lepetit e outros (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285 e Atanassova, e outros, (1992), Plant J. 2(3):291- 300) .

0 promotor ALS, um iniciador-5 de fragmento Xbal/Ncol para o gene estrutural ALS3 Brassica napus (ou uma seqüência de nucleotídeo que tem similaridade de seqüência substancial com o fragmento Xbal/Ncol, representa um promotor constitutivo particularmente útil. Vide o Pedido dos Estados Unidos copendente Pioneer Hi-Bred International número de série 08/409.297.

Em uma modalidade da presente invenção, cofatores de expressão dos polinucleotideos presentemente descritos podem ser usados para modificar as seqüências transgênicas que foram previamente integradas no genoma de milho. De tal maneira, os genes estruturais cuja seqüência de DNA e/ou expressão de gene não são desejados no produto final podem ser removidos. Assim, os genes marcadores que têm utilidade na recuperação de eventos transgênicos em cultura (ou durante reprodução ou crescimento de planta) podem ser removidos a partir de um evento transgênico, deixando intactos os cassetes de expressão agronômica no produto final. No processo de cortar uma seqüência, um gene estrutural também pode ser removido em relação a um promotor para ativar o gene (isto é, simplesmente mediante remoção do gene estrutural próximo ao promotor, através da remoção de impedimentos transcripcionais tais como seqüências poliA ou códons de parada, ou através de deslocamentos de quadro).

Dependendo da estratégia de transformação e do produto final desejado, muitos dos genes relacionados abaixo poderiam ser candidatos para genes marcadores usados para recuperação de transgênicos durante a transformação que posteriormente seriam removidos do produto comercial final, e também para genes agronomicamente importantes a serem expressos no produto final (por exemplo, genes de herbicida).

Além disso, um gene marcador para identificar e selecionar as células, tecidos ou plantas transformados deve ser incluído na construção de transformação. Por gene marcador se pretende que sejam genes informadores ou genes marcadores selecionáveis.

Exemplos de genes informadores adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados, por exemplo,

em Jefferson e outros (1991) em Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin e outros (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet e outros (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff e outros (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain e outros (1995) BioTechniques 19:650-655 Chiu e outros (1996)

Current Biology 6:325-330.

Genes marcadores selecionáveis para seleção de células ou tecidos transformados podem incluir genes que conferem resistência a antibiótico ou resistência aos herbicidas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis

adequados incluem, mas não são limitados aos genes codificando resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella e outros (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella e outros (1983) Nature 303:209-213; Meijer e outros (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina

(Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian e outros (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones e outros (1987) Mol Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e outros (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille e outros

(1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau e outros (1990) Plant Mol. Bio. 15:127-136); bromoxinil (Stalker e outros (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw e outros (1986) Science 233:478-481); fosfinotricina (DeBlock e outros (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Outros genes que poderiam ter utilidade na recuperação de eventos transgênicos, mas poderiam não ser exigidos no produto final incluiriam, mas não são limitados a tais exemplos como GUS (β-glucoronidase; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387); GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfie e outros (1994) Science 263:802) e a codificação de genes de milho para produção de antocianina (Ludwig e outros (1990) Science 247:449). Para certas aplicações, por exemplo, a produção comercial de proteína que pode ser colhida a partir de plantas transgênicas conforme descrito abaixo, a expressão dos genes mencionados acima seria valiosa e desse modo permaneceria após o corte.

Vários tipos de genes estão compreendidos na categoria de genes potencialmente valiosos que permaneceriam no evento transgênico comercial final após corte de vários elementos transgênicos indesejados (ou simplesmente desnecessários). Exemplos são incluídos abaixo.

Com plantas transgênicas de acordo com a presente invenção, uma proteína estranha pode ser produzida em quantidades comerciais. Assim, as técnicas de seleção e propagação descritas acima produzem uma pluralidade de plantas transgênicas que são colhidas de uma maneira convencional, e uma proteína estranha é então extraída de um tecido de interesse ou a partir da biomassa total. A extração de proteína a partir de uma biomassa de planta pode ser realizada mediante métodos conhecidos, os quais são discutidos, por exemplo, por Heney e outros (1981) Anal. Biochem. 114: 92-6.

Similarmente, por intermédio da presente invenção, os genes agronômicos podem ser expressos em plantas transformadas. Mais particularmente, as plantas podem ser construídas geneticamente para expressar vários fenótipos de interesse agronômico. Os genes envolvidos nesse aspecto incluem, mas não são limitados àqueles categorizados abaixo. Genes de resistência às doenças das plantas. As defesas das plantas frequentemente são ativadas pela interação especifica entre o produto de um gene de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com um gene de resistência clonado para construir plantas que são resistentes às cepas de patógeno específico. Vide, por exemplo, Jones e outros (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 de tomate para resistência ao Cladosporium fulvum); Martin e outros (1993) Science 262:1432 (gene Pto de tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate codifica uma quinase de proteína); Mindrinos e outros (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae).

Proteína Bacillus thuringiensis, um seu derivado, ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. (Vide, por exemplo, Geiser e outros (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e seqüência de nucleotídeo de um gene de δendotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA codificando genes de δ-endotoxina podem ser compradas através da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob os números de Acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

Uma lectina. Vide, por exemplo, a revelação por Van Damme e outros (1994); Plant Mol. Biol. 24:825; que revela as seqüências de nucleotídeos de vários genes de lectina de ligação de manose de, Clivia miniata.

Uma proteína de ligação de vitamina tal como avidina. Vide o Pedido dos Estados Unidos número de série 07/911.8 64, cujo conteúdo é aqui incorporado mediante referência. 0 pedido ensina o uso de avidina e homólogos de avidina como larvicidas contra pestes de inseto. Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ou um inibidor de amilase. Vide, por exemplo, Abe e outros (1987) J. Biol. Chem. 262:16793 (seqüência de nucleotídeo de inibidor de proteinase de cisteina de arroz); Huub e outros (1993); Plant Mol. Biol. 21:985 (seqüência de nucleotideo de cDNA codificando inibidor I de proteinase de tabaco); e Sumitani, e outros (1993), Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (seqüência de nucleotídeo de inibidor de a-amilase de Streptomyces nitrosporeus) .

Um hormônio ou feromônio de inseto específico tal como um hormônio juvenil e ecdisteróide, uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo, ou um seu antagonista ou agonista. Vide, por exemplo, a revelação por Hammock et al. (1990) Nature 344:458, da expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil.

Um peptídeo ou neuropeptídeo de inseto específico, a partir da expressão, desarranja a fisiologia da peste afetada. Vide, por exemplo, as revelações de Regan (1994) J. Bio. Chem. 269:9 (clonagem de expressão produz codificação de DNA para receptor de hormônio diurético de inseto); e Pratt e outros (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata). Vide também a Patente dos Estados Unidos número de série 5.2 66.317, que revela genes codificando neurotoxinas paralíticas de inseto específico.

Um veneno de inseto específico produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc. Por exemplo, vide Pang e outros (1992), Gene 116:165, para revelação de expressão heteróloga em plantas de uma codificação de gene para um peptídeo de escorpião tóxico para insetos.

Uma enzima responsável por um hiper acúmulo de um monterpeno, um sesquiterpeno, um esteróide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanóide, ou outra molécula de não-proteína com atividade inseticida.

Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-translacional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolitica, uma enzima lipolitica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase, e uma glucanase, natural ou sintética. Vide, Pedido PCT WO 93/02197, o qual revela a seqüência de nucleotídeo de um gene de calase. Moléculas de DNA que contêm seqüências de codificação de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, a partir da ATCC sob números de Acesso 39637 e 67152. Vide também Kramer e outros (1993) Insect Biochem. Mol. Biol. 23:691, revelando a seqüência de nucleotídeo de um cDNA codificando quitinase de ancilóstomo de tabaco, e Kawalleck e outros (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, provendo a seqüência de nucleotídeo do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa.

Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, vide Botella e outros (1994) Plant Mol. Biol. 24:757, revelando seqüências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão alterado, e Griess e outros (1994) Plant Physiol. 104:1467, provendo a seqüência de um nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina de milho.

Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide, Pedido dos Estados Unidos número de série 08/168.809, que revela derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibem patógenos fúngicos de plantas, e Pedido dos Estados Unidos número de série 08/179.632, que ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência às doenças.

Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, vide Jaynes e outros (1993) Plant Sci. 89:43 que revela a expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-β para tornar as plantas transgênicas de tabaco resistentes a Pseudomonas solanacearum.

Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas transmite resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como pelos vírus relacionados. Vide Beachy e outros (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. A resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a partir de plantas transformadas contra o vírus mosaico de alfafa, vírus mosaico de pepino, vírus frisado de tabaco, vírus X de batata, vírus Y de batata, vírus gravado de tabaco, vírus pedicular de tabaco e vírus mosaico de tabaco. Id.

Um anticorpo de inseto específico ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo visado para uma função metabólica crucial no intestino de inseto inativaria uma enzima afetada, matando o intestino do inseto. Cf Taylor e outros (1994) Abstract #497, Seventh International Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (1994), revelando a inativação enzimática em tabaco transgênico via produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única.

Um anticorpo de vírus específico. Vide, por exemplo, Tavladoraki e outros (1993) Nature 366:469, mostrando que plantas transgênicas expressando genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra ataque por vírus.

Uma proteína de suspensão de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, endo-α-Ι,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes de plantas mediante solubilização de homo-α-Ι,4-D-galacturonase de parede de célula de planta. Vide, Lamb e outros (1992)

Bio/Technology 10:1436. A clonagem é a caracterização de um

gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart e outros (1992) Plant J. 2:367.

Uma proteína de suspensão de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann

e outros (1992) Bio/Technology 10:305, mostrou que plantas transgênicas expressando o gene de inativação de ribossoma de cevada têm uma resistência aumentada à doença fúngica.

Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazalinona ou uma sulfoniluréia.

Genes exemplares nessa categoria codificam enzima mutante ALS e AHAS conforme descrito, por exemplo, por Lee e outros

(1988) EMBO J. 7:241, e Miki e outros (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente.

Glifosato (resistência transmitida mediante

sintase EPSP mutante e genes aroA, respectivamente, e outros compostos fosfono tal como glufosinato (genes bar e PAT), e ácidos propiônicos de piridinoxi ou fenóxi e ciclo hexonas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 4.940.835, que

revela a seqüência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtida sob Acesso ATCC N0 39256 e a seqüência do nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente do Estados Unidos n° 4.769.061.

Pedido de Patente Européia N0 0 333 033 e Patente dos Estados Unidos n° 4.975.374 revelam seqüências de nucleotídeo de genes de sintetase de glutamina que conferem resistência aos herbicidas tal como L-fosfinotricina. A seqüência de nucleotídeo de um gene de fosfinotricinaacetil-transferase é provida no Pedido de Patente Européia N0 0 242 246. De Greef e outros (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam a codificação de genes bar quiméricos para atividade de transferase de fosfinotricina acetil. Exemplos de genes conferindo resistência aos ácidos fenoxi propiônicos e ciclo hexonas, tal como sethoxydim e haloxyfop, são os genes Accl-Sl, Accl-S2, e Accl-S3 descritos por Marshall e outros (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

Um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes de psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla e outros (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Clamidomonas com plasmídeos codificando genes psbA mutantes. Seqüências de nucleotídeo para genes de nitrilase são reveladas na Patente dos Estados Unidos n° 4.810.648, e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob N°s. de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando para uma S-transferase de glutationa é descrita por Hayes e outros (1992) Biochem. J. 285:173.

Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, mediante transformação de uma planta com um gene anti-senso de estearoil-ACP desaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Vide Knultzon e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2624.

Teor diminuído de ftato. A introdução de um gene de codificação de ftase otimizaria a decomposição de ftato, acrescentando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, vide Van Hartingsveldt e outros (1993) Gene 127:87, que revela a seqüência de nucleotídeo de um gene de ftase Aspergillus niger. Alternativamente, um gene poderia ser introduzido o qual reduz o teor de ftato. Em milho, isso, por exemplo, poderia ser realizado, mediante clonagem e então reintrodução de DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico. Vide See Raboy e outros (1990) Maydi ca 35:383.

Composição de carboidrato modificado realizada, por exemplo, mediante transformação de plantas com uma codificação de gene para uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Vide Shiroza e outros (1988) J. Bacteriol. 170:810 (seqüência de nucleotídeo de gene de fructosiltransferase de Streptococcus mutants); Steinmetz e outros (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (seqüência de nucleotídeo do gene de levansucrase Baeillus subtilis); Pen e outros (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam α-amilase de Bacillus licheniformis); Elliot e outros (1993) Plant Mol. Biol. 21:515 (seqüências de nucleotídeo de genes de invertase de tomate); Sogaard e outros (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio específica de gene de amilase de cevada); e Fisher e outros (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II de derivação de amido de endosperma de milho).

Bibliotecas são construídas preferivelmente a partir dos seguintes gêneros: Plantas de folhas largas sazonais: Abutilon theophrasti; amaranto (Amaranthus spp.); cabeça de velho (Borreria spp.); colza, canola, mostarda, etc. Brassica spp.; trapoeraba (Commelina spp.); bico de cegonha (Erodium spp.); girassol (Helianthus spp.); corda de viola (Ipomoea spp.); Kochia scoparia; malva (Malva spp.); fagópiro e grama selvagem, etc. (Polygonum spp.); Portulaca spp.; Salsola spp.; guanxumas (Sida spp.); Sinapis arvensis; Xanthium spp.. Plantas de folhas estreitas sazonais: Avena fatua; grama do serrado (Axonopus spp.); Bromus tectorurn; capim colchão (Digitaria spp.); capim arroz (Echinochloa crus-galli); capim pé de galinha (Eleusine indica); azevém (Lolium multiflorum); arroz (Oryza sativa); Ottochloa nodosa; grama batatais (Paspalum notatum); Phalaris spp.; capim rabo de raposa (Setaria spp.); Triticurn aestivum; milho (Zea mays); plantas perenes de folhas largas: Artemisia spp.; asclépias (Asclepias spp.); cardo rasteiro (Cirsium arvense); corriola (Convolvulus arvensis); kudzu (Pueraria spp.). Plantas perenes de folhas estreitas: braquiária (Brachiaria spp.); grama bermudas (Cynodon dactylon); tiririca (Cyperus esculentus); C. rotundus; Elymus repens; Imperata cylindrica; azevém anual (Lolium perenne); capim massai (Panicum maximum); grama comprida (Paspalum dilatatum); Phragmites spp.; capim massanbará (Sorghum halepense); Typha spp.. Outras plantas perenes: cavalinha (Equisetum spp.); samambaia (Pteridium aquilinum); amora preta (Rubus spp.); Ulex europaeus.

Também são providas pela presente invenção as sementes compreendendo pelo menos um polinucleotídeo aqui revelado. São preferidas aquelas sementes que compreendem um vetor de expressão tendo um gene operável, incluindo muitos dos genes funcionais previamente descritos assim como os genes que respondem a uma condição ambiental.

Também são providas pela presente invenção as plantas que ou são transformadas ou transfectadas por intermédio de quaisquer dos polinucleotídeos aqui revelados, ou desenvolvidas a partir de uma semente que compreende quaisquer dos polinucleotídeos aqui revelados. Preferivelmente, uma planta desenvolvida a partir de uma semente que compreende um polinucleotídeo aqui revelado conduz na planta um fenótipo diferente do fenótipo de uma planta desenvolvido a partir de uma semente geneticamente idêntica que não compreende o polinucleotídeo. Esse fenótipo pode ser um resultado de uma expressão constitutiva de um gene, anulação de um gene ou em resposta a uma sugestão ambiental. Particularmente preferidas são aquelas plantas em que o fenótipo é selecionado de um grupo consistindo em um: gene marcador, gene de resistência à doença; gene de otimização de nutriente; gene de otimização de cor; gene de tolerância á secura; gene de tolerância à putrefação; gene de otimização de processamento de etanol; gene de resistência fúngica; gene de resistência a inseto; gene de resistência a nematóide; gene de resistência a vírus; gene de composição de carboidrato alterado; gene de composição de óleo alterado; proteínas de armazenamento de semente com gene de composição de aminoácido alterado; gene de esterilidade masculina; gene de amadurecimento retardado de fruta; gene de resistência ao sal; gene de resistência aos herbicidas; e produção de gene de produto farmacêutico.

Células úteis na presente invenção são quaisquer células, particularmente células as quais podem ser facilmente cultivadas, tal como levedura e E. coli. Contudo, células de plantas úteis para encerrar os aspectos recombinatórios da presente invenção também são preferidas, particularmente células de plantas de cultivo comercial, tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada e qualquer outro grão.

Células procarióticas também são preferidas, particularmente para cultivo de células úteis para ensaios de herbicida da presente invenção. Procariotes incluem várias cepas de E. coli; contudo, outras cepas microbianas também podem ser usadas, incluindo, por exemplo, Bacillus sp, Salmonella e Agrobacterium. Cepas de Agrobacterium exemplares incluem C58cl (pGUSINT), Agtl21 (pBUSINT), EHAlOl (pMTCA23GUSINT), EHA105 (pMTl), LBA4404 (pTOK233), GU2260, BU3600, AGL-I and LBA4402. Tais cepas são descritas em detelhe em Chan et al. (1992) Plant Cell Physiol 33:577; Smith et al. (1995) Crop Sci 35:301; e Hiei et al. (1994) Plant J 6:271-282. Cepas bacterianas exemplars incluem, mas não são limitadas a C600 (ATCC 23724), C600hfl, DHl (ATCC 33849), DH5cc, DH5 aF1 , ER1727, GM31, GM119 (ATCC 53339), GM2163, HBlOl (ATCC 33694), JM83 (ATCC 35607), JMlOl (ATCC 33876), JM103 (ATCC 39403), JMl 05 (ATCC 47016), JM107 (ATCC 47014), JMl 08, JMl 09 (ATCC53323) , JM 110 (ATCC 47013), LE392 (ATCC 33572), K802 (ATCC 33526), NM522 (ATCC 47000), RRl (ATCC31343), X1997 (ATCC 31244) e Y1088 (ATCC 37195) . Vide também, Jendrisak et al. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, 359-371, Hanahan et al. (1983) J Mol Biol 166:557-580, Schatz et al.

(1989) Cell 59:1035, Bullock et al. (1987) BioTechniques 5:376-378, ATCC Bactéria and Bacteriophages (1996) 9 Edição, and Palmer et al. (1994) Gene 143:7-8.

Conforme aqui usado, transformação significa processos através dos quais células/tecidos/plantas adquirem propriedades codificadas em uma molécula de ácido nucléico que foi transferida para a célula/tecido/planta. Transfecção se refere aos métodos de transferir DNA para as células incluindo, mas não limitado a microinjeção, permeabilização da membrana de célula com vários tratamentos físicos (por exemplo, eletroporação) ou químicos (por exemplo, polietileno glicol, PEG), bombardeio com microprojéteis de alta velocidade também denominados biolísticos, ou infecção com Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes. Conforme aqui usado, transformante significa uma planta que adquiriu propriedades codificadas em uma molécula de ácido nucléico que foram transferidas para células durante o processo conhecido como transformação. Deve ser enfatizado que as modalidades descritas acima da presente revelação são apenas possíveis exemplos de implementações, e são apresentadas apenas para um entendimento claro dos princípios da revelação. Muitas variações e modificações podem ser feitas nas modalidades descritas acima da revelação sem se afastar substancialmente do espírito e dos princípios da revelação. Todas as tais modificações e variações pretendem ser incluídas aqui dentro do escopo dessa revelação.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Construção de biblioteca de fosmideo, análise de

seqüência

DNA genômico foi isolado a partir de uma linha suscetível de cultivar de sorgo Colby utilizando o método CTAB padrão (M. G. Murray, W. F. Thomson, Nucl. Acids Res. 8:4321 (1980)). Para construção de biblioteca de fosmídeo o Kit de Produção de Biblioteca de Fosmídeo CopyControl da Epicentre (Madison, WI, USA) foi usado mediante acompanhamento das instruções do fabricante. Triagem de biblioteca foi realizada utilizando os iniciadores PCR específicos para a família de genes NBS-LRR. Esses iniciadores foram projetados utilizando a região genômica correspondente na linha de sorgo BTx623 como um gabarito, que foi sequenciada em um trabalho anterior dos autores (E.

D. Nagy et al., Theor. Appl. Genet, (in press)) . Quatro clones positivos foram encontrados, eles foram subclonados utilizando o Kit de Clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e sequenciados.

Para montagem de seqüência e de calo básico, foram usados os programas Phred and Phrap, respectivamente (B. Ewing, L. Hillier, M. Wendl, P. Green, Genome Res. 8, 175 (1998)). Contigs foram visualizados e editados com o programa CONSED (D. Gordon, C. Abajian, P. Green, Genome Res. 8,195 (1998)). Pesquisa de homologia de seqüência foi realizada utilizando o pacote de programa BLAST (V. V. Solovyev, A. A. Salamov, Intel. Syst. Mol. Biol. 5, 294 (1997)). Para predição de gene o programa FGENESH (S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D.J. Lipman, J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)) foi aplicado. Os resultados de anotação foram editados no programa de software Apollo (S.

E. Lewis et al., Genome Biol. 3, research 0082.1 (2002)).

Quatro clones cobrindo os genes NBS-LRR foram isolados, sequenciados e montados em um único contig de 78.705 bp. Anotação revelou três parálogos de gene NBS-LRR (A, B e C) , arranjados em tandem em uma forma de cabeça para cauda. Os três parálogos são preditos para codificar proteína de 1277, 1194 e 1257 aminoácidos, respectivamente. Os parálogos foram separados mediante regiões intergênicas A-B e B-C respectivas de 12.638 e 13.713 bp. 0 terminal-N e regiões NBS (bp 1-1399) eram idênticos nos parálogos A e C, enquanto que o parálogo B era diferente dos outros dois por todo o gene. A similaridade global de nucleotídeo era consideravelmente elevada (acima de 90%) em comparações em pares entre esses três parálogos. A sequenciação dos produtos RT-PCR revelou que todos os três parálogos foram transcritos nas raízes de mudas de plantas Colby Pc/Pc nãoinfectadas.

Exemplo 2. Análise das configurações de genes nas linhas

isogênicas de mutante-Pc

Dois iniciadores, PallF (GAACATTTCTGCCGCCACATTTC) SEQ ID N°: 5 e PallR (AGCAGTTAGGCGTTGTATGGATTG) SEQ ID N0°:6, comuns para os terminais de todos os três parálogos foram usados para amplificar as unidades NBS-LRR nas isolinas de mutante-Pc. A mistura PCR de longa distância (LD) (50 μΐ) continha 150 ng de DNA genômico, 2,5 U de polimerase de DNA Otimizada com Herculase (Stratagene, La ÍJolla, CA, USA) , 100 ng, de cada iniciador e 200 μΜ de cada dNTP. O perfil de ciclos térmicos foi estabelecido de acordo com as instruções providas com a polimerase de DNA. Os produtos PCR foram isolados a partir de géis de agarose utilizando o Kit de Extração de Gel Qiaex II (Quiagen, Valencia, CA, USA) e clonados utilizando o Kit TOPO TA. Pelo menos 24 dos clones foram sequenciados a partir de cada genotipo para reconstituir suas configurações de genes. Alinhamentos de seqüência entre os parálogos mutantes-Pc e Colby suscetíveis foram realizados utilizando ClustalW (D. Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22, 4673

(1994)). Os alinhamentos foram vistos e editados com Mega 3.1 (S. Kumar, K. Tamura, M. Nei, Brief Bioinform 5, 50 (2004)).

PCR de longa distância foi usado para amplificar os parálogos nos genótipos mutantes-Pc. Sete dos treze mutantes (Ml-7) continham um único parálogo que era idêntico ao parálogo A na região 5', enquanto a extremidade 3' dos mesmos alinhou-se com o parálogo C. Esses são os produtos de eventos de recombinação desigual que ocorreram entre os parálogos AeC (Figura 1) . Estudos de RT-PCR indicaram que o parálogo A/C é expresso nas raízes de mudas de todos os sete mutantes.

Três dos mutantes (M8-10) exibiram um único parálogo que era indistinguível do parálogo C. Devido ao fato dos parálogos AeC serem idênticos em seqüência a partir de bp 1399 dentro dos genes de alguns dos 870 bp a montante dos genes, não podemos mapear precisamente onde ocorreram esses eventos de recombinação desigual. O único parálogo NBS-LRR nesses mutantes também se descobriu ser expresso pela análise RT-PCR.

O mutante Mll continha parálogos intactos A e C, mas não tinha o parálogo B. Um evento de recombinação desigual entre as regiões intergênicas A-B e B-C pode explicar esse resultado. Essas duas regiões intergênicas são altamente similares uma à outra (76%), incluindo muitas extensões longas (centenas de bp) de DNA idêntico que proporcionariam ampla homologia para recombinação desigual. Análise RT-PCR demonstrou que os parálogos A e C em Mll também foram transcritos. Portanto, a única mudança genética óbvia em Mll foi a perda de parálogo B, sugerindo que ele é o local Pc.

Descobriu-se que o mutante M12 contém parálogos intactos A e C, e um parálogo B que é truncado mediante uma anulação interna de 468 bp na região LRR. Os pontos de ruptura de anulação são flanqueados por motivos homólogos de 8 bp de comprimento sugestivos de recombinação ilegítima (13, 14, 15). Descobriu-se que todos os três parálogos em M12 foram transcritos. Esses resultados demonstram que anulação interna no parálogo B foi suficiente para causar uma mutação de Pc para pc desse modo provando que o parálogo B é o gene Pc.

0 mutante M13 carrega um parálogo intacto A, um recombinante A/C e outro parálogo B/C. Estudos RT-PCR, seguidos pela clonagem e sequenciação dos produtos PCR, demonstraram que o parálogo A/C nesse mutante é transcrito, mas os parálogos A e B/C são silenciados. A configuração de gene observada pode ser explicada por uma série de rearranjos consecutivos incluindo dois eventos de recombinação desigual. Não obstante, a ausência de um parálogo transcrito de comprimento total B em M13 é consistente com a descoberta de que o parálogo B é responsável pela suscetibilidade de peritoxina.

Quatorze rearranjos, 13 recombinações desiguais e uma anulação, foram detectados nas 13 mutações de Pc para pc (Tabela 1) . Nove dessas recombinações desiguais foram resolvidas dentro de um segmento de 560 bp da região LRR (bp 3062-3622). Esse segmento foi favorecido para recombinações desiguais, apesar do fato de que ele é menos homólogo do que as outras regiões (Figura 3). A anulação em M12 causada por recombinação ilegítima também ocorreu dentro desse segmento, sugerindo uma ruptura de fita dupla (19, 20) dentro dessa região de elevada recombinação.

Exemplo 3. Análise de expressão dos parálogos NBS-LRR

RNA total foi isolado a partir de radículas de 2- cm de sementes de sorgo germinadas em meio MS estéril em papel de filtro utilizando o reagente Trisol (Invitrogen). Subsequentemente, a fração de mRNA foi isolada com o Kit de isolamento de mRNA FastTrack 2.0 (Invitrogen). Para síntese de cDNA foi usado o Sistema de Síntese de primeira Fita SupersScript III (Invitrogen). Um par de iniciadores amplificando um fragmento 28 6 bp a partir de parálogo B e um fragmento de 425 bp a partir dos parálogos AeC foi usado em PCR. Os cDNAs e seus controles negativos correspondentes não tendo transcriptase reversa na mistura de reação foram usados como um gabarito. As faixas resultantes foram isoladas a partir do gel e clonadas com um Kit de Clonagem TOPO TA. Para ter pelo menos uma amostra a partir de cada tipo de transcritos expressos, pelo menos

24 clones foram sequenciados a partir de mutantes-Pc e Colby suscetíveis carregando múltiplos parálogos NBS-LRR. Doze clones foram sequenciados a partir de mutantes contendo um único parálogo.

Contudo, nesse estudo de Pc, apenas a perda de parálogo B foi exigida para criar o fenótipo de Pc para pc que foi selecionado. Portanto, esses resultados indicam uma direção de local preferencial da resolução de cruzamento de eventos de recombinação para uma pequena área dentro de um agrupamento LRR, e aquele que é particularmente baixo em homologia de seqüência. Esse fenótipo tem os sinais de identificação de recombinação sitio específica, um fenômeno eucariótico raro não previamente observado em plantas, mas que tem funções essenciais em outros domínios eucarióticos, incluindo na criação ou evasão de uma resposta de resistência à doença.

Tabela I. Rearranjo de tuna família de gene NBS-LRR (parálogos A, B e C) detectada em isolinas mutantes-pc. Pontos de ruptura de recombinação desigual foram atribuídos aos intervalos flanqueados por dois locais polimórficos

mais próximos entre os parálogos participantes.

mutante- Parálogo Rearranjo Local de Expressão pc recombinação ou de gene anulação (intervalos em bp) * Ml A/C recombinação 3062-3135 + desigual M2 A/C recombinação 3162-3220 + desigual M3 A/C recombinação 3258-3312 + desigual M4 A/C recombinação 3258-3312 + desigual M5 A/C recombinação 3312-3380 + desigual M6 A/C recombinação 3312-3380 + desigual M7 A/C recombinação 3473-3521 + desigual M8 C recombinação intergênico ou + desigual 1-1499 M9 C recombinação Intergênico ou + desigual 1-1499 MlO C recombinação Intergênico ou + desigual 1-1499 Mll A recombinação intergênico + desigual C recombinação intergênico + desigual M12 A - - + Bdel anulação 2764-3231 + C - - + M13 A - - A/C recombinação 3312-3380 + desigual B/C recombinação 3425-3622 desigual * conforme localizado em uma seqüência de consenso 3737 de parálogos A, B e C.

A invenção precedente foi descrita de acordo com os padrões legais relevantes, assim a descrição é de natureza exemplar mais propriamente do que de natureza limitadora. Variações e modificações na modalidade revelada podem se tornar evidentes para aqueles versados na técnica e estão dentro do escopo da invenção. Consequentemente, o escopo da proteção legal proporcionada a essa invenção pode ser determinado apenas mediante estudo das reivindicações a seguir.

Claims (22)

1. Sistema para identificar uma seqüência genética em um organismo associado à resistência à toxina no organismo, compreendendo: prover um polinucleotídeo isolado compreendendo SEQ ID N:1; prover uma amostra genética do organismo; analisar a amostra para a presença de uma primeira seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID N:l; e analisar a primeira seqüência de ácido nucléico para a presença ou ausência de uma segunda seqüência de ácido nucléico compreendendo pelo menos 7 0% de identidade de seqüência para bases 3062-3622 da região de repetição rica em leucina (LRR) de Sorghum bicolor, em que a ausência da segunda seqüência de ácido nucléico é indicativa de resistência à toxina no organismo.

2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, em que a resistência à toxina é resistência à peritoxina Periconia.

3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo é uma planta.

4. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, em que a planta é aquela selecionada do grupo consistindo em: milho (Zea mays) , Brassica sp., Brassica napus, Brassica rapa, Brassiea juneea, alfafa (Medieago sativa) , arroz (Oryza sativa), centeio (Seeale cereale), sorgo, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, milheto (Pennisetum glaucum), milheto "proso" (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusiríe coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabaeum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense), Gossypium hirsutum, batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus) , planta citrica (Citrus spp.), cacau (Theobroma cação), chá (Camellia sinensis), bananeira (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifólia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.)/ aveia (Avena spp.)» cevada (Hordeum spp.), palma, legumes, vagens, ervilhas, guar, alfarroba, fenogrego, feijões de horta, feijão de vaca, vigna radiata, feijão de lima, feijão de fava, lentilhas, grão de bico, mamona, Arabidopsis, vegetais, plantas ornamentais, gramíneas, coníferas, plantas de cultivo que proporcionam sementes de interesse, plantas de grão que proporcionam sementes de interesse, plantas de gemente-óleo, plantas leguminosas, tomate (Lycopersicon esculentum), alface, Laçtuca sativa, feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis), ereyilhas (Lathyrus spp.), um membro do gênero Cucumis, pepino (Cucumis sativus), melão (Cucumis cantalupensis), melão amarelo (Cucumis melo), azaléa (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis) , roseira (Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), copo de leite (Euphorbia pulcherrima), crisântemo, pinheiros, Pinus taeda, Pinus elliotil, Pinus ponderosa, Pinus contorta, Pinus radiata, Pseudotsuga menziesil, Tsuga canadensis, Picea glauca, sequoia (Sequoia sempervirens), abeto genuíno, Abies amabilis, Abies balsamed, cedro, Thuja plicata e cedro amarelo colado (Chamaecyparis nootkatensis).

5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra genética é analisada para uma seqüência tendo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID N°: 1 mediante algoritmo BLAST.

6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra genética é analisada para uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para SEQ ID N°:l.

7. 'Método para identificar uma seqüência genética em um organismo associado com resistência à toxina no organismo, compreendendo: prover um polinucleotídeo isolado compreendendo SEQ ID N0:1; prover uma amostra genética do organismo; analisar a amostra para identificar uma primeira seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID N0:1; e analisar a primeira seqüência de ácido nucléico para identificar a presença ou ausência de uma segunda seqüência de ácido nucléico compreendendo pelo menos 7 0% de identidade de seqüência para bases 3062-3622 da região de repetição rica em leucina (LRR) de Sorghum bicolor, em que a identificação da ausência da segunda seqüência de ácido nucléico é indicativa de resistência à toxina no organismo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a resistência à toxina é resistência à peritoxina Periconia.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o organismo é uma planta.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a planta é. aquela selecionada do grupo consistindo em: milho (Zea mays), Brassica sp., Brassica napus, Brassica rapa, Brassiea juneea, alfafa (Medieago sativa), arroz {Oryza sativa), centeio (Seeale eereale), sorgo, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, milheto (Pennisetum glaueum), milheto "proso" (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Tritieum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense), Gossypium hirsutum, batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas como sus), planta cítrica (citrus spp.), cacau (Theobroma cação), chá (Camellia sinensis), bananeira (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Fieus easica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya) , caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifólia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena spp.), cevada (Hordeum spp.), palma, legumes, vagens, ervilhas, guar, alfarroba, fenogrego, feijões de horta, feijão de vaca:, vigna radiata, feijão de lima, feijão de fava, lentilhas, grão de bico, raamona, Arabidopsis, vegetais, plantas ornamentais, gramíneas, coníferas, plantas de cul~ivo que proporcionam sementes de interesse, plantas de grão que proporcionam sementes de interesse, plantas de semente-óleo, plantas leguminosas, tomate (Lycopersicon esculentum), alface, Lactuca sativa, feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis), erevilhas (Lathyrus spp.), um membro do gênero Cucumis, pepino (Cucumis sativus), melão (Cucumis cantalupensis) , melão amarelo (Cuqumis melo) , azaléa (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis), roseira (Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), copo de leite (Euphorbia pulcherrima), crisântemo, pinheiros, Pinus taeda, Pinus elliotil, Pinus ponderosa, Pinus contorta, Pinus radiata, Pseudotsuga menziesil, Tsuga canadensis, Picea glauca, sequoia (Sequoia sempervirens), abeto genuíno, Abies amabilis, Abies balsamed, cedro, Thuja plicata e cedro amarelo colado (Chamaecyparis nootkatensis) .

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que amostra genética é analisada para uma seqüência tendo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID N0:1 por intermédio do algoritmo BLAST.

12. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que amostra genética é analisada para uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para SEQ ID N0:1.

13. Polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 20 bases contíguas de bases 3062-3622 de uma região LRR de Sorghum bicolor.

14. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 13, o qual é selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID N°::2; SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5 e SEQ ID N0:6.

15. ;Vetor compreendendo pelo menos dois polinucleotídeos da reivindicação 13.

16. Polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para bases 3062-3622 de uma região LRR de Sorghum bicolor.

17. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 16, compreendendo pelo menos 90% de identidade de seqüência das bases.

18. Vetor compreendendo pelo menos dois polinucleotídeos da reivindicação 16.

19. Polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 70% de identidade com o polinucleotídeo de SEQ ID N°:1.

20. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 19, em que o polinucleotídeo compreende pelo menos 90% de identidade de seqüência para SEQ ID N0: 1.

21. Vetor compreendendo um polinucleotídeo da reivindicação 19.

22. Método para identificar se um composto de teste interage com um produto de expressão de um polinucleotídeo conforme a reivindicação 19, compreendendo contatar um composto de teste com produto de expressão da reivindicação 19 e determinar se o composto de teste interage com o produto de expressão.