JPH06509354A

JPH06509354A - プラズマロサイコシン類及びプラズマロセレブロシド類並びにそれらを用いた神経細胞疾患の治療方法

Info

Publication number: JPH06509354A
Application number: JP5503579A
Authority: JP
Inventors: ヌーデルマン　エドワード; センイチロウハコモリ; レベリー　ビー．スティーブン; ヤスユキイガラシ; サドザイ　カリド
Original assignee: オンコメンブレン　インコーポレーティッド
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 1994-10-20
Also published as: DE69225712D1; EP0596937B1; CA2111113A1; WO1993002685A1; EP0596937A1; EP0596937A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プラズマクサイコシン類及びプラズマロセレブロシド類並びにそれらを用いた神経細胞疾患の治療方法技術分野本発明は、新規に単離された、集合的に１プラズマロサイコシン類（ｐｌａｓｍａｌｏｐｓｙｃｈｏｓｉｎｅｓ　）　Ｊと名付けられた２つの化合物Ａ及びＢに関する。化合物Ａは、３，４環状アセタール（０１６又はＣｌ８）を有するサイコシンである。化合物Ｂは、Ｃ１６又はＣ１８アルデヒドの４．６環状アセタールを有するサイコシン（ガラクトシルスフィンゴシン）である。これらの化合物は、種々のニューロプラスドーマ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　）細胞に著しい神経突起形成活性（ｎｅｕｒｉｔｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を示す。

本発明はまた、新規に単離された、集合的に「プラズマロセレブロシド類（ｐｌａｓｍａｌｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ）　Ｊと名付けられた２つの化合物Ｃ及びＤに関する。化合物Ｃは、セレブロシドのガラクトピラノシル部分で３，４環状アセタ一ル結合を介して共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　した脂肪族アルデヒドを有する。化合物りは、セレブロシドのガラクトピラノシル部分で４，６環状アセタ一ル結合を介して共役した脂肪族アルデヒド（プラズマル（ｐ　ｌａｓｍａ　１）　）を有する。脂肪アルデヒドは、特にパルミタール（Ｃ１６：０）、ステアラール（Ｃ１８：０）またはオレフィン性ダブルベース（ｏｌｅｆｉｎｉｃ　ｄｏｕｂｌｅ　ｂａｓｅ）　（Ｃ１８：　１）であってもよい。

従来技術細胞の脂肪成分は、一般に酸性または中性である。酸性脂質は、ガングリオシド類、スルファチド（ｓｕｌｆａｔｉｄｅ）、ホスホイノシチド、およびホスファチジン酸を含む。

中性脂質は、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）及び中性グリセリド類を含む。スフィンゴシン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−スフィンゴシン及びリゾーグリコスフィンゴリピッドのようなアニオン性（塩基性）脂質は、膜内外のシグナリング（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）　（１−４）のような細胞機能を調節する少量成分として存在すると考えられる。

コチェコフ（Ｋｏｔｃｈｅｔｋｏｖ）ら（１３）は、脳においてクロマトグラフ的に速く移動するセレブロシドの少量成分として［スフィンゴプラズマローゲン（ｓｐｈｉｎｇｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅ＋１）　Ｊを記載した。該化合物は、赤外吸収スペクトル（エステル結合の１７５０ｃｍ’の吸収の欠如）に基づき不飽和エーテル結合を介してガラクトシルセレブロシドのＣ３ヒドロキシル基と結合した脂肪アルデヒド構造を有すると想定された；脂肪アルデヒドは、ライラテンバーブ条件（Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ’　ｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）　（１４）下にｐ−二トローフェニルヒドラジドとして同定された。以下に示され、［スフィンゴープラズマローゲン］と名付けられた構造が主張された。

しかしながら、グリコスフィンゴリピッド中のスフィンゴプラズマローゲンまたはあらゆる結合性脂肪族（脂肪）アルデヒド（プラズマル（ｐｌａｓｍａｌ）　）が、４つの引き続く詳細な研究により否定された（１８．４２．４３．４４）。さらに、クレンク（Ｋｌｅｎｋ　）及びレーア（Ｌ５ｈｒ）（１５）、タマゴ（Ｔａｍａｉ　）ら（１６，１７）、及びキシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）ら（１８）により広範に研究された多数の速く移動するセレブロシドの広範な研究により、これらすべての迅速−移動グリコスフィンゴリピッドが、異なる位置のヒドロキシ基で脂肪酸によりエステル化されたセレブロシドであると結論付けられた。これらの以前に報告された化合物は、スフィンゴプラズマローゲンであるか迅速−移動セレブロシドエステルであっても、本発明のプラズマクサイコシン類と比較して非常に異なった薄層クロマトグラフの移動度を示した。すなわち、本発明のプラズマクサイコシン類は、ずっと遅い移動度ヲ有し、２つの脂肪鎖（１つはスフィンゴシンで、１つはプラズマル）を有する；また、ガラクトピラノシル部分と結合した脂肪鎖の配向は、全く逆方向であるように見える。

脂肪アルデヒド（または長鎖脂肪族アルデヒド）は、「プラズマル」と名付けられ、最初にフユールゲン＆ボアト（Ｆｅｕｌｇｅｎ　＆　Ｖｏｉｔ）　ｌ：より１９２４年に発見サレ（１９）　、１９２９年にプラズマローゲンと名付けられたグリコスフィンゴリピッドの成分として認識された（６）。プラズマローゲンの構造は、最初は１，２−環状アセタールと主張されたが（３７）、つぃに１− アルケニル−２−アシル−３−ホスホリルコリンとして同定された（２０）。

脂肪酸エステル基を含有し、セレブロシドエステルと名付けられたセレブロシド類の集合（ｃＩａｓｓ）ハ、脳力らも単離された。これらの化合物は、通常のセレブロシドよりも薄層クロマトグラフ（Ｔ　Ｌ　Ｃ）の移動度がはるかに高いことか示された（３９．４０）。脂肪酸の位置はスフィンゴシンのＣ３ヒドロキシル基およびガラクトースの０３またはＣ６ヒドロキシル基であると同定された（１５；１６．１７．１８）。

ニューロプラスドーマ細胞株（Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）は、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で神経突起形成（ｎｅｕｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の適切な促進効果を有する物質のスクリーニングに広く用いられてきた。ある種のガングリオシドおよび合成シアロシル（ｓｉａｌｏｓｙｌ）化合物は、特に神経成長因子の存在下での神経突起形成の強力な刺激物質である。最近の研究では、ガングリオシド／神経成長因子（ＮＧＦ）混合物をアルツハイマー症候群の患者に投与すると臨床症状が改善されると報告された（２１）。同様に、種々の因子により誘発される、神経組織の損傷に続き、ガングリオシド混合物を投与すると部分的な回復が現れると報告された。

スフィンゴシンの可能な関与の観点から、Ｎ、Ｎ−ジメチルスフィンゴシンおよびリゾーグリコスフィンゴリピッドは、神経組織で自然に起きているこれら化合物の膜内外のシグナル伝達（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の調節（１−４）　、化学的特定、精製及び特徴付けに多大な興味がある。

発明の要約従って、本発明の１つの目的は、顕著な神経突起形成活性を示す４つの単離され、または合成された化合物を提供することである。

本発明の他の目的は、神経細胞疾患及び組織障害を治療する組成物及び方法を提供することである。

これら及び他の目的は、化合物Ａ及び化合物Ｂ：［式中、ｎは０より大きな数を示す］並びにその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、単離されまたは合成されたプラズマロサイコシンを提供することにより達成された。

本発明の目的は、化合物Ｃ及び化合物Ｄ：［式中、ｎ２およびｎ３は０より大きな数を示す］、並びにその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、単離されたプラズマロセレブロシドを提供することによっても達成された。

本発明は、上記のプラズマクサイコシン類及び／又はプラズマロセレブロシド類、及びその薬学的に許容される塩の１種又はそれ以上；並びに薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む神経細胞疾患及び組織障害を治療する組成物を提供することでもある。

さらに、本発明は神経細胞を上記のプラズマクサイコシン類及び／又はプラズマロセレブロシド類の１種又はそれ以上の有効量と接触させることを含む神経細胞から神経突起を形成させる方法を提供する。

さらにまた、本発明は、治療を必要としている宿主に上記のプラズマクサイコシン類及び／又はプラズマロセレブロシド類の１種又はそれ以上の生物学的有効量を投与することを含む神経細胞疾患及び組織障害の治療方法を提供する。

図面の簡単な説明図ＩＡ及びＩＢは、カルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸ上に吸着され、クロロホルム−メタノール中のトリエチルアミンで溶出される、アニオン性脂質の高分離能−薄層クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｔ　Ｌ　Ｃ）パターンテある。図ＩＡ：薄層クロマトグラフは、クロロホルム−メタノール−２８％ＮＨ０Ｈ（８０：２０：２）でＪｉｊ開された。バンドは、オルシノール−硫酸により検出された。

レーン１は、カルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸカラムから０．５Ｍトリエチルアミンを用いた全溶出物である：レーン２は、精製された化合物Ａである；レーン３は、精製された化合物Ｂである；レーン４は、精製された化合物Ｅである：レーン５はスフィンゴシンである。図ＩＢ二図ＩＡと同じクロマトグラフである。バンドは、０，０１％ＰＲＩＭＵＬＩＮＥをスプレーすることにより検出し、ＵＶ光を見た。

図２は、ヒト脳の種々の部位からのアニオン性脂質のＨＰＴＬＣパターンである。アニオン性脂質は、カルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸ上のクロマトグラフィーて単離され、０．５Ｍ）リエチルアミンを用いて溶出され、薄層クロマトグラフは、クロロホルム／メタノール／ＮＨ４ＯＨ（８０：　２０　：　２）　で展開された。レーン１及び１０、標準セラミドモノへキンシド（ＣＭＨ）；レーン２、白質下層（ｌｏｗｅｒ　ｐｈａｓｅ）　；レーン３、小脳下層；レーン４、脳幹下層；レーン５、灰白質下層；レーン６、白質のカルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸカラムからの０．５Ｍ）リエチルアミン溶出物；レーン７、小脳から調製された以外はレーン６と同じフラクション；レーン８、脳幹から調製された以外はレーン６と同じフラクション；レーン９、灰白質から調製された以外はＩ／−ン６と同じフラクション。

図３は、精製されたプラズマロサイコシンおよび弱酸及びアルカリ処理による分解産物のＨＰＴＬＣパターンである。レーン１、化合物Ａ；レーン２．０．３ＮＨＣ１のＭ　ｅ　ＯＨ溶液て８０°Ｃ１３０分間処理した化合物Ａ；レーン３、Ｑ、３Ｎ　ＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で８０°Ｃ１４０分間処理した化合物Ａ：レーン４、標準サイコシン（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｓｙｃｈｏｓｉｎｅ　）　；レーン５、化合物Ｂ；レーン６．０．３Ｎ　ＨＣＩのＭｅＯＨ溶液で８０℃、３０分間処理した化合物Ｂ：レーン７．０．３ＮＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で８０°Ｃ１４０分間処理した化合物Ｂ：レーン８、ＣＭＨｏ図４Ａ及び４Ｂは、長鎖メチルエノールエーテル類のガスクロマトグラフ−化学イオン化／マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＣＩ／ＭＳ）からのデータである：図４Ａは、中間の脂質バンド（ｍｉｄｄｌｅ　ｂａｎｄ　１ｉｐｉｄ）の加メタノール分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）に由来する；図４Ｂは、標準ｎ−１６：Ｏおよびｎ−１８：０アルデヒドの加メタノール分解に由来する。ピークは、１としてｎ−１６：０を同定し、２ａおよび２ｂとして異性体１８：１を同定し、３として１８：０メチルエノールエーテルを同定し、各々シュードモレキュラーイオン（ｐｓｅｕｄｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｏｎ　）の質量は２５５．２８１及び２８３ｕである。

アステリスクで標識されたピークは、両サンプルに共通する不純物であり、多分誘導化試薬に由来する。

図５Ａ〜５Ｄは、天然の脂質の高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）に由来するデータである二図５Ａは、３−ニトロベンジルアルコール（Ｎ　Ｂ　Ａ）マトリックス＋の上側の脂質バンド（ｕｐｐｅｒ　ｂａｎｄ　１ｉｐｉｄ）の　ＦＡＢｖススベクトル；図５Ｂは、ＮＢＡマトリックスの中間の＋脂質バンドの　ＦＡＢマススペクトル；図５０は、ＮＢＡ／酢酸ナトリウムマトリックスの中間の脂質バンドの”ＦＡＢマススペクトル：図５Ｄは、トリエチルアミン（ＴＥＡ）１５−クラウン−５マトリツクスの中間の脂質バンドの−ＦＡＢマススペクトル。

図６Ａ〜６Ｄは、ＨＣＩ／ＨｇＣｌ２で処理した生成物の＋ＦＡＢ−ＭＳに由来するデータ；マトリ・ソクス：ＮＢＡ０図６Ａは、上側の脂質バンド、続く短い酸処理により中間の脂質バンドに変化する；図６Ｂは、長い酸処理に続く上側の脂質バンド；図６Ｃは、長い酸処理に続く下側の脂質バンド、；図６Ｄは、ｄ１８：１ガラクトサイコシン標品。

図７Ａ〜７Ｄは、アセチル化／脱アセチル化生成物の＋ＦＡＢ−ＭＳに由来するデータ；図７Ａは、ＮＢＡマトリックスの過アセチル化された（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　）上側の脂質バンド；図７Ｂは、ＮＢＡマトリ・ソクスの過アセチル化された中間の脂質バンド；図７０は、ＮＢＡ／酢酸ナトリウムマトリックスの過アセチル化された中間の脂質バンド：図７Ｄは、ＮＢＡマド１ルックスの過アセチル化され且つ脱Ｏ−アセチル化された中間の脂質ノくンド（挿入：ＮＢＡ／酢酸ナトリウムマトリックスに同一の生成物があり、シュードモレキュラーイオンの質量は変化を示さない）。

図８Ａ〜８Ｄは、脂質の過メチル化、加水分解、還元及びアセチル化に由来する部分的にメチル化されたアルレジトールアセテート（ｐ　Ｍ　Ａ　Ａ　）のＧＣ −ＭＳ分析に由来するデータである；図８Ａは、上側の脂質／くンドに由来するＰＭＡＡ；図８Ｂは、中間の脂質ノくンドに由来するＰＭＡＡ　、図８Ｃは、短い酸処理に続く上側の脂質バンドに由来するＰＭＡＡ　、図８Ｄは、標品ガラクトースＰＭＡＡ類。ピークは、ＰＭＡＡ類の１：２．３．６−トリー０；２：３．４．６＋２．４．６−トリー０；３：２．３．１−トリー０．４・２，６−ジー０；５：４゜６−ジー０；６：３．６−ジー０；７：２．３−ジー０；８：６ −モノ−〇−１９・３，４−ジー０；１０：２−モノ−〇−；及び１．１：３（又は４）−モノ−〇−Ｍｅ−Ｇａｌ。

図９Ａ及び９Ｂは、５０μｇ　／　ｍ　１のプラズマロサイコシンの存在下のニュ　０　２Ａ細胞（Ｎｅｕｒｏ−２Ａ　ｅｅｌ］）の神経突起形成パターンである。図５Ａ及び５Ｂは、培養ディツシュ（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈ）の異なる領域を示す。

図１０は、ニューロ−２Ａ細胞の神経突起形成におけるプラズマロサイコシンの効果を示すグラフである。横軸はプラズマロサイコシンの濃度（μｇ／ｍｌ）。

縦軸は神経突起（５０μｍを超える長さ）を形成したニューロ−２Ａ細胞のパーセント。円（○および・）は、プラズマロサイコシンの上側及び中間のバンドの混合物、＋及び−神経成長因子（ＮＧＦ）の結果を示す；△は、ＮＧＦ存在下てのガングリオシドＧＭＩ、ＧＤｉａ、ＧＤｌｂ、およびＧＴを含むウシ脳ガングリオシド（ＢＢＧ）混合物の結果を示す。

図１１は、ヒト脳から調製したフオルヒ下層（Ｆｏｌｃｈ’ｓ　ｌｏｗｅｒ　ｐｈａｓｅ）由来の種々の非極性グリコスフィンゴリピッドの高分離能−薄層クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｔ　ＬＣ）パターンである。クロマトグラフは、クロロホルム−メタノール−２８％ＮＨ４ｏＨ（８０：２０：２容量比）の溶媒混合物で展開された。レーン１は、標準セレブロシド；レーン２は、フオルヒの分割（Ｆｏｌｃｈ’　ｓ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）て得られた下層である；レーン３は、カルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸによる全下層の未吸着通過物である；レーン４は、ジクロロエタン−アセトン（１：１　容量比）で溶出されたＦＬＯＲＩＳＩＬカラムから得られたＦｒ、ＶＩである；レーン５は、ＩＡＴＲＯＢＥＡＤクロマトグラフから溶出されたフラクション４７−５８である；レーン６は、フラクション４７−５８から精製されたプラズマルセレブロシド（ｐｌａｓｍａｌ　ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ　）である；レーン７は、精製された化合物Ｃ及びＤである。

図１２は、セレブロシド（ＣＭＨ）　、プラズマロセレブロシドＣ及びＤｌ及びエステルセレブロシドのＨＰＴＬＣパターン、並びに弱酸及び弱塩基を用いたその分解のＨＰＴＬＣパターンである：レーン１は、ＣＭＨ、レーン２は、０．３Ｎ　ＨＣＩのＭｅＯＨ溶液で分解されたＣＭＨ、レーン３は、０．３Ｎ　ＮａＯＨで処理されたＣＭＨ、レーン４は、プラズマロセレブロシド；レーン５は、０．３Ｎ　ＨＣＩのＭｅＯＨ溶液で処理されたプラズマロセレブロシド；レーン６は、Ｑ、３ＮＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で処理されたプラズマロセレブロシド：レーン７は、エステルセレブロシド１；レーン８は、０．３Ｎ　ＨＣＩのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシド１；レーン９は、０，３Ｎ　ＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシド１；レーン１０は、エステルセレブロシド２；レーン１１は、０゜３ＮＨＣ１のＭ　ｅ　ＯＨ溶液て処理されたエステルセレブロシド２；レーン１２は、０．３Ｎ　ＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシド２゜図１３は、未知の脂質成分の加メタノール分解に由来する長鎖脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）及びエノールメチルエーテル（ＥＭＥ）のガスクロマトグラフィー−電子衝撃／マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ）パターンである。ピークは標識されたものとして同定した。アステリスクで標識されたピークは、未同定の不純物である。

図１４は、３−ニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）マトリックス中の未知の脂質成分の陽イオン高速原子衝撃（＋ＦＡＢ）マススペクトルである。ピークは、名目上の、モノアイソトービック・マス（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｍａｓＳ）でラベルした。

図１５は、未知の脂質成分の過メチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙ　１ａｔｉｏｎ）　、加水分解、還元及びアセチル化に由来する部分的にメチル化されたアルジトールアセテート（ａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ　）　（ＰＭＡＡ）のガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）分析である。ピークはＰ　Ｍ　Ａ　Ａ類の１：２．３，４．６−チトラーＯ−；２：２，６−ジー〇−；及び３：４，６−ジー０−　Ｍ　ｅ−Ｇａ　］として同定された。

図１６は、プラズマロサイコシン化合物ＡおよびＢの合成スキームである。

図１７は、粗合成物（レーン１）およびヒト脳抽出物のＣＭ−セファデックスカラムクロマトグラフィーから得られるアニオン性脂質（レーン６）と比較したプラズマロサイコシン合成物（レーン２〜５）のＩ　ＡＴＲＯＢＥＡＤＳカラム上で得られるフラクションのＨＰＴＬＣパターンである。ＨＰＴＬＣは、クロロホルム／メタノール／　２８　％Ｎ　Ｈ４０Ｈ（８０：　２０　：　２　）　で展開され、オルシナール−硫酸でスプレーし、ホットプレート上で加熱（ｂａｋｉｎｇ）　して視覚化された。

図１８Ａ〜１８Ｃは、プラズマロサイコシン合成物の過メチル化、加水分解、還元及びアセチル化に由来する部分的にメチル化されたアルダトール／アセクールのＧＣ−ＭＳ分析のデータである。図１８Ａ二図１７レーン５産物のフラクションからのデータ；図１８Ｂ＝図１７レーン４産物のフラクションからのデータ；図Ｃ・標品クロロホルム−メタノール中のカチオン交換樹脂、次いでＦＬＯＲＩＳＩＬおよびＩ　ＡＴＲＯＢＥＡＤＳカラム上での一連のクロマトグラフィーを介したアニオン性脂質の系統的な単離と特徴付けの手順が開発された。主要なアニオン性脂質である化合物Ａ及びＢは、白質の抽出物中に独占的に存在し、サイコシンのガラクトシル残基の異なるヒドロキシル基に結合した環状プラズマル（ｃｙｃｌｉｃ　ｐｌａｓｍａｌ）として同定された。これら化合物の単離、化学的特徴付け、及び生物学的性質は、以下に記載される。

［式中、ｎｌは０より大きい数、好ましくは１４または１６を示す。］本発明によれば、ヒト脳の白質および灰白質は注意深く分離され、系統的な化学分析に供せられる。結果として、化合物Ａ及びＢと名付けられた２つの主要なアニオン性糖脂質が、各々サイコシンのガラクトシル残基の３゜４−環状アセタール及び６．４−環状アセタールを介してサイコシンに共役したプラズマル（脂肪アルデヒド）として同定された。比較的少量の化合物Ｅは、サイコシンに共役した４、６−環状プラズマルとして同定されたが、３−ヒドロキシスフィンゴシンを有していた。これら３つの化合物は、以下集合的に［プラズマロサイコシン類（ｐｌａｓｍａｌｏｐｓｙｃｈｏｓｉｎｅｓ　）　Ｊと呼ぶ。アセタール結合の位置に無関係に、プラズマロサイコシン類は、特に神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下にニューロプラスドーマ細胞に強力な神経突起形成効果（ｎｅｕｒｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）を有する。

より詳しくは、化合物Ａ及びＢは、ヒト脳からアニオン性脂質（ａｎｉｏｎｉｃ　１ｉｐｉｄｓ）及びアニオン性グリコスフィンゴリピッド（ａｎｉｏｎｉｃ　ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）を調製することにより単離される。該脂質は抽出され、下層が調製される。これは、次いでカルボキシメチル（ＣＭ）ＳＥＰＨＡＤＥＸクロマトグラフィーによるアニオン性脂質フラクションが分離される。単離された化合物Ａ及びＢは、さらに高分離能−薄層クロマトグラフィ −（ＨＰＴＬＣ）により精製され、次いで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳ）により精製される。

単離精製の手順は、以下にさらに詳細に記載され、実施例１に例示される。

（ｒａｚｏｒ　ｂｌａｄｅ　）を用いて解剖され、灰白質および白質に分離される。注意深くカミソリの刃を用いて皮質の外層を削り、成人ヒト脳から約５０ｇの重量の純粋に近い灰白質フラクションを得られる。白質は、垂直断面に脳を切り、白質の大きな領域を分離することにより相当容易に準備できる。これらの両方の場合において、組織は約５倍量（すなわち、湿組織の重量の５倍の容量）のイソプロパツール／ヘキサン／水（Ｉ　ＨＷ）　（５５：２５：２０　ｖ／ｖ／ｖ、上層は除去され；この溶媒溶液が調製されると、２つの層が形成され、主にヘキサンである上層が除去される）中でホモジナイズされ、ブフナー漏斗で濾過され、残渣が同じ溶媒で再度ホモジナイズされる（以下、すべての溶媒の比率は体積比である）。ブフナー漏斗で最初に濾過した後、残渣は、クロロホルム／メタノール／水（ＣＭＷ）（２：　１　：　０．１）で２回再ホモジナイズされる。濾液を集め、蒸発乾固し、フオルヒ分割のために適当な容量（例えば、最初の組織５００ｇｍ当たり約０゜５〜３Ｌ）のクロロホルム／メタノール（２：　１）中に入れる（５）。フオルヒ分割のために、１７６容量の脱イオン水を漏れ止め容器中、クロロホルム／メタノール（２：　１）抽出溶液に加え、内容物を繰り返し上下を逆にして（約２０回）混合する。層が分離した後（通常２〜３時間）、上層を捨て、等容量のクロロホルム／メタノール１０．２％ＫＣＩを含む水（１：１０：１０）で置換する。これをさらに２回繰り返し、得られた下層をロータリー・エバポレーターで蒸発乾固する。

アニオン性脂質フラクションは、ＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸクロマトグラフイーにより全下層脂質から調製される。ＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸは、注意深く洗浄され、以下のプロトコールを用いて平衡化される。５ＥＰＨＡＤＥＸは、アニオン性脂質の効果的な結合を達成するため適切に平衡化することが極めて重要である。

乾燥樹脂をブフナー漏斗上で０．２Ｎ　ＨＣＩを用いて十分に洗浄し、酸中に数時間浸す。樹脂は次いて脱イオン水を用いて断続的に浸しながら十分に洗浄し、次いで、メタノール／水（ＭＷ）２０　：　８０，５０　：　５０．７０　：　３０および９０　：　１０て段階的に洗浄する。次いで、５ＥＰＨＡＤＥＸカラムは、２．０Ｍ含水トリエチルアミン溶液（ＴＥＡ）−ＭＷ　（１：　１　：　１）に浸し、室温で一夜放置する。過剰のＴＥＡをＭＷ　（１：　１）で十分に洗浄することにより５ＥＰＨＡＤＥＸから除去する。平衡化したＣ　Ｍ　Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　Ｄ　Ｅ　Ｘは、次いで１００％メタノール、次にＣＭＷ　４０：６０：５（以下「５ｏｌＡＪという）で洗浄する。

脳油出物の乾燥した下層に、脳油出物が完全に溶解するまでｓ’ｏｌＡを加える。組織５００ｇｍ当たり約Ｌ　Ｌの溶媒が必要になる。この溶液は５０−５０− ２Ｏ０約１００　ｍ　ｌ　／　ｋ　ｇ湿組織）の容量の平衡化したＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸのベッドを通し、重力濾過により溶出する。追加量の５ｏｌＡでカラムを洗浄し、すべての通り抜けたフラクションを集めて保存する。次いでカラムはベッド容量（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）が平衡になるまで（ＳＥＰＨＡＤＥＸは僅かに減少する（　５ｈｒｉｎｋ）であろう）ＭＷ９０：１０で洗浄する。アニオン性脂質は、０．５ＭＴＥＡのＭＷ９０：１０溶液（溶媒を緩やかにＣＯ２でバブリングすることで、９．２５のｐＨで滴定される）で溶出される。５００　ｇｍの最初の組織光たり化合物Ａ１Ｂ及びＥ２並びにスフィンゴシンを定量的に溶出するために約０．５ＭのＴＥＡは約５００ｍ１で十分である。

この濃度のＴＥＡでまた標準サイコシンも定量的に溶出できるが、サイコシンは脳抽出物中には存在しない。さらに、ＴＥＡ濃度を２．０Ｍまで上昇させても他の検出可能な物質（５ｐｅｃｉｅｓ）は溶出されない。

ＨＰＬＣＩＡＴＲＯＢＥＡＤクロマトグラフィーを用いた化合物ＡＳＢ及びＥのさらなる精製クションは、ＴＥＡサンプルを除去するため無水エタノールを用いて数回蒸発乾固する。次いで、該フラクションは試験管に移され、適量のクロロホルム／メタノール（約２〜１０ｍ１）に溶解される。サンプル１０μｌを高分離能−薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート上、クロロホルム／メタノール−ＮＨ４０Ｈ（８０：２０：２）でクロマトグラフされる。観察は、８０％アセトン中の０．８％ＰＲＩＭＵＬＩＮまたは３０％ＦＬＵＯＲＥＳＣＡＭＩＮＥを用いた携帯用ＵＶ光（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ　ＵＶ　ｌｉｇｈｔ）で行うことができる。化合物ＡＳＢ及びＥの検出は、１０％硫酸中の０．５％オルシノール及び次の薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）のオーブン上での加熱によっても検出できる。

化合物Ａ、Ｂ及びＥをより極性の高いスフィンゴシンおよび汚染した中性の糖脂質から分離するには、数回の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）のグラジェント操作を行う必要がある。これは、非常に極性の低いＩＨＷグラジェントを用いて達成される。ＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳ　（シリカゲル；１０μＭ）で充填された長いカラム（例えば、約０．４Ｘ６０ｃｍ）が、最初に以下のようにカラムを洗浄することにより平衡化される。約２゜０ｍｌ／分で、最初の濃度はＩＨＷ　５５：４０：５；グラジェントは、次の約３０分間でＩＨＷ　５５：２５．２０まで増加させ、次いで約３０分間かけてＩＨＷ　５５：４０：５に減少させ、約３０分間かけてＩＨ６０：４０とし、最後に１００％のへキサンで約３０分間洗浄する。

０．５Ｍ　ＴＥＡフラクションを蒸発乾固し、１００％ヘキサンに溶解することで、以下のようにして注射用に調製する。２ｍｌの注射のために、１００μｌのクロロホルム／メタノール（２：　１）を加え、蓋を固く締め、サンプルを僅かに暖めて約５０℃にし、濃厚なオイルを形成するために超音波処理する。はとんどの場合、これにより脂質をほぼ完全に溶解できる。この濃厚溶液に、１００％ヘキサン２ｍｌを超音波処理をしながら加える。

いくつかの場合、非常に小さいオパールのような乳児の沈殿を形成するが、これは注射の妨げにはならない。

このサンプルをカラム上に載せ、約０．５ｍｌ／分でのグラジェント溶出にかける。グラジェント溶出は、ヘキサンから始まりＩＨＷ　１０：８９：１（約２５〜１５０分）とし、次いでｒＨＷ　２４・７４：２（約１５０〜４００分）、ＩＨＷ　５５：４０：５　（約４００〜５００分）、およびＩＨＷ　５５・２５：２０（約５００〜６００分）へと続ける。溶出物（約３ｍｌ／試験管）をフラクションコレクターで１００試験管集め、試験管をＨＰＴＬＣ分析（クロロホルム／メタノール／ＮＨ４ＯＨ，８０：　２０　：　２）にかける。フラクションは化合物Ａ、Ｂ及びＥに相当する３つの検出可能なバンドの分離に基づいて蓄えられる。しかしながら、スフィンゴシンの重なりのため、化合物Ａ、Ｂ及びＥを均一に精製するために、数回のＨＰＴＬＣ操作が必要である。この方法で、スフィンゴシンもより遅い移動度のスフィンゴシンアナログとともに都合よく精製される。

プラズマロサイコシン化合物Ａ及びＢの化学的特徴付は炭水化物分析は、メタツリシス（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）により製造されたメチルグリコシドのトリメチルシリル誘導体を用いてガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−Ｍ　Ｓ　）により行うことができる。天然の脂質の高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ− ＭＳ）分析は、陽イオンおよび陰イオンの両方の様式で得られる（７−９）。脂肪アルデヒドの予備的な分析は、脂質のメタツリシスで得られる脂肪酸メチルエステルフラクションを用いてなされる。しかしながら、多数の未知のピークが、脂肪酸メチルエステルとともにＣ１６−Ｃ１８の脂肪アルデヒドのエノールメチルエーテルとして同定されるであろう。これらのピークは、ＦＡＢ−ＭＳとともにＧＣ−ＭＳを用いて注意深く同定される。構造情報は、パー−Ｎ　−，０−アセチル化及び脱Ｏ−アセチル化脂質のＦＡＢ−ＭＳと、ＧＣ−ＭＳを用いた古典的メチル化分析により得られる。

プラスミドセレブロシド化合物Ｃ及びＤの単離と精製本研究において、ヒト脳に由来する（薄層クロマトグラフィー上での）速移動糖脂質を詳細に研究している間に、酸で標識された少量成分が、引き続＜ＦＬＯＲＩＳＩＬおよびＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳ　（シリカゲル）カラム上でのイソプロパツール／ヘキサン／水システムを用いたクロマトグラフィー、並びにプレパラティブ高分離能−薄層クロマトグラフィーにより検出及び分離された。

セレブロシドの脂肪酸エステルとして同定された速移動糖脂質の大部分に対し、酸に不安定な少量成分は、セレブロシドのガラクトピラノシル残基に３．４−または４゜６−環状アセタール結合を介してセレブロシドのプラズマル複合体として単離され特定された。

これら化合物の単離、化学的特徴付は及び生物活性は以下に記載される。

プラズマロセレブロシドの単離本発明によれば、化合物Ｃ及び化合物りと命名された２つの新規に単離されたプラズマロセレブロシド類及びその薬学的に許容される塩は以下に示される構造である：［式中、ｎ　およびｎ３は各々０を越える数である］。

好ましくはｎ２は１４または１６であり、ｎ３は１２．１４．１６．１８．２０．２１．２２．２３又は２４である。

化合物Ｃ及びＤを単離するために、ヒト脳セレブロシド抽出物のカラムクロマトグラフィーから速移動成分が最初に単離される。ヒト脳セレブロシドフラクションは、脳組織を５倍量の（即ち、５倍容量／湿組織の重量）イソプロパツール／ヘキサン／水（Ｉ　ＨＷ）５５　：　２５　：２０（ｖ／ｖ／ｖ）でホモジナイズし、ブフナー漏斗で濾過することにより得ることができる。残渣は、同一溶媒の同一容量を用いて再度ホモシナ、イズする。抽出物を蓄え、蒸発乾固し、もとの組織の湿重量Ｌｏｇ当たり１Ｌのクロロホルム／メタノール（ＣＭｅ）２：１および約１６６ｍ１の水を用いたフォルヒ分割に供する。下層はさらに３回フォルヒ分割に供し、「理論的上層」　（クロロホルム／メタノール１０．２％ＫＣＩを有する水１０：１０：１）を用いて再度分割する。得られた下層は完全に乾燥するまでエバポレートされる。ＦＬＯＲＩＳＩＬ　（酸化マグネシウムとケイ酸ゲルの混合物）（シグマから、６０−１００メツシユ）の大きなカラム（オリジナルの組織１ｋｇ当たりベッド容量的ＬＬ）を準備し、純粋なヘキサンで平衡化する。乾燥された下層はヘキサン（オリジナルの組織２００ｇ当たりＩＬ）中に懸濁し、ＦＬＯＲＩＳＩＬカラムを通し、４Ｌのヘキサンで徹底的に洗浄する。ＦＬＯＲＩＳＩＬカラムは、２Ｌのへキサン／ジクロロエタン（ＤＣＥ）２　：　Ｌ次いで２ＬのＤＣＥ、最後にＩＬのＤＣＥ／アセトン　１：１で溶出する。最終溶出物は、目的の酸に不安定な速移動成分を含有する。

酸に不安定な糖脂質の存在は、メタノール１０．　ＩＮ塩酸（１：１、ｖ　／　ｖ　）中、約９０℃で約１０分間サンプルを加水分解し、次いでフォルヒ分割及び下層の薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）試験により検出される。

この処理によりセレブロシドと同じ移動度に変化した高いＴＬＣ移動度を示す糖脂質は、酸に不安定なセレブロシドと見なされる。セレブロシドおよびセレブロシドエステルは、これらの条件下で異なるＴＬＣ移動度を示さ本発明によれば、酸に不安定な速移動グリコリピッド（ｆｉｒｓｔ−ｍｉｇｒａｔｉｎｇ　ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）の存在は、脳油出物の一貫した成分であり、フォルヒの下層のカルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸおよびジエチルアミノエチル−８ＥＰＨＡＤＥＸでの非吸着フラクション、並びにＦＬＯＲＩＳＩＬクロマトグラフィーでのＤＣＥ−アセトン１：１溶出液フラクシヨンで見出される。この速移動グリコリピッドフラクションは、純粋なヘキサンで充填され、ＩＨＷ５５：５０：５へのグラジェントで約１ｍｌ／分で約３時間溶出するＩ　ＡＴＲＯＢＥＡＤＳ上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製される。フラクションは、２００試験管集められる。酸に不安定なグリコリピッド成分は、試験管番号１３０−１５４に溶出される。蓄えられたフラクション（フラクションＶＩと呼ぶ）は、酸に不安定なグリコリピッドの大部分を含み、セレブロシドおよびセレブロシドエステルを含まない。フラクションＶＩは、純粋なヘキサンでカラムに充填され、イソプロパツール／ヘキサン（ＩＨ）３０ニア０までのグラジェントに供せられるＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳ上のクロマトグラフィーによりさらに精製される。この様にして得られたフラクションＶＩＡは、純粋なヘキサンで充填され、ＩＨＷ５０：４０：５へのグラジェント溶出を３時間行う浅いグラジェントでの長いＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳカラム（例えば、約０．５Ｘ１００ｃｍ）でさらに精製される。あるいは、該化合物は、プレパラティブＴＬＣにより精製することもできる。均一なバンドが、図１１のレーン６に示されるように得られる。

ＴＬＣ上で、該化合物はセレブロシドよりも速（移動するコレステロールよりも速く移動する。該化合物は酸に不安定であることが知られているサルフェートまたはシアル酸を含まない。

化合物Ｃ及びＤの化学的特徴付は化合物Ｃ及びＤの構造は、実施例７に詳細に記載するようにガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）分析及び高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）による脂肪アルデヒドに由来するエノールメチルエーテルを特定することによりメタツリシス後に決定される。

アセタール結合は、メチル化分析により決定できる。

天然の脂質のバーメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）　、酸加水分解、還元及びアセチル化に続き、得られた部分的にメチル化されたヘキシトールアセテートは実施例７に詳細に記載されるようにＧＣ−ＭＳにより分析される。

神経細胞からの神経突起の形成方法本発明のさらなる側面によれば、神経突起は神経細胞を化合物Ａ、ＢＳＣおよびＤの１種またはそれ以上の有効量と接触させることにより神経細胞から形成させることができる。ニューロプラスドーマ細胞株のような神経細胞は、公知の方法（１１，１２）によりゼラチンでコートされたプレート中で培養される。有効量は、化合物ＡＳＢＳＣおよびＤの１種またはそれ以上を種々の濃度（例えば５〜１５０μＭ）で加えることにより決定され、細胞を実施例８に詳細に記載したように神経突起の形成を観察するために培養する。

サイコシン化合物Ａ及びＢの両方とも種々のニューロプラスドーマ細胞に顕著な神経突起形成活性を示す。ニューロプラスドーマ及びレチノブラストーマ細胞における神経突起形成は、しばしば神経組織の損傷を修復する候補薬の可能性を評価する基準として使用される。化合物Ａ及びＢのニューロプラスドーマ細胞に対する神経突起形成の効果は、ガングリオシドの存在と比較して実施例８に詳細に示される。サイコシンは高度に溶血性で高い細胞毒性を有すると考えられるが、それは正常な脳組織（白質または灰白質）では実質的に存在しない。一方、白質の主要な成分であるプラズマロサイコシンはニューロプラスドーマ細胞に対し強力な神経突起形成活性を示す。これらの実験でコントロールとして使用されるサイコシンは、細胞毒性効果を示し、非常に低用量でさえ細胞の成長を阻害した。

プラズマロサイコシンは、サイコシンの強力な阻害効果と対照的にＰＫＣを阻害しない。

以下の仮説に結び付けられるのを望むものではないが、プラズマロサイコシンは、細胞に独特に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）取り込まれ、ゆっくりサイコシンに変換され、それによりＰＫＣ及び細胞成長の調節に必須の蛋白質キナーゼの活性を調節する。成長阻害は、次いで分化を誘導する。生成したサイコシンの量は、最小限ではあるが、分化と神経突起形成の刺激に最適である。

プラズマロセレブロシド化合物Ｃ及びＤも、種々のニューロプラスドーマ細胞に顕著な神経形成活性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。細胞培養の初期の段階において、明らかな効果は観察されないが、神経突起形成、すなわち神経突起〉長さ５０μｍは、１週間で明らかに増加する。培養２週間後、ニューロ−２Ａ細胞（Ｎｅｕｒｏ−２Ａ　ｃｅｌｌ）培養の神経突起形成は、非常に著しい。

従って、本発明は、化合物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ並びにその薬学的に許容される塩の１種またはそれ以上；及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む神経細胞疾患（ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び組織障害（ｔｉｓｓｕｅ　ｄａｍａｇｅ）の治療のための組成物を提供するものである。

さらに、本発明は治療を必要とする宿主に、化合物Ａ１ＢＳＣおよびＤ並びにその薬学的に許容される塩の１種またはそれ以上の生物学的有効量を投与することを含む神経細胞疾患及び組織障害の治療方法を提供するものである。

具体例としては、アルツハイマー疾患、完全麻痺のようなを髄障害、神経組織の損失を伴う脳血管の偶発事故、脳外傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化および多発硬化症を包含する。

化合物ＡＳＢ、ＣおよびＤの有効量は、適切な動物モデルまたは非ヒト霊長類での用量−反応曲線を確立し、ヒトに外挿すること；例えば、以下に記載するように適切なインビトロのデータから外挿すること；又は臨床治験で有効性を決定することなどの当業界で認識されている方法を用いて決定できる。

本発明の薬物の好適な用量は、疾患の激しさ、個体の体重、個体の年齢、循環における半減期などの特定の臨床適用に依存し、当業者により容易に決定できる。

投与回数、１日投与量及び治療方針は、個体により様々である。

化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤは、静脈注射または直接硬膜注射のような種々の方法で投与できる。本発明の薬物用の好適な薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤は、薬物の特定に臨床使用に依存し、当業者により容易に決定される。

薬物は、液剤、乳濁剤又は懸濁剤に製剤化できる。薬物は、当業者に認識される賦形剤、希釈剤、充填剤などを通常含む。そのような補助的な成分としては、崩壊剤、バインダー（リポソームを含む）、界面活性剤、乳化剤、緩衝剤、可溶化剤及び保存剤などが挙げられる。当業者は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤを含む製剤をｒＧｏｏｄｍａｎ　＆　Ｇｉ１ｍａｎ’　ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　Ｊ　（第６版、Ｇｏｏｄｍａｎら編集、ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、、　ＮＹ、　１９８０）などの多くの権威からのガイダンス及び参考文献を探すことにより形成できる。

プラズマロサイコシン化合物ＡおよびＢ並びにプラズマロセレブロシド化合物Ｃ及びＤは、実施例９のプラズマロサイコシン化合物の合成に記載されるような方法により化学的に容易に合成できる。

実施例本発明は、限定目的でない特定の実施例を参考にして以下に記載される。

成人ヒト脳（大脳）が解剖され、カミソリの刃で白質及び灰白質に分離された。

皮質の外層をカミソリの刃で注意深く削り落とし、５０ｇの重量のほぼ純粋な灰白質フラクションを得ることができた。白質は、垂直断面に脳を切り、白質の大きな領域を分離することにより、相当容易に調製できた。小脳全体も抽出源として使用した。

すべての場合において、組織は５倍量（即ち、湿組織の重量の５倍容量）のイソプロパツール／ヘキサン／水（Ｉ　ＨＷ）　（５５：２５：２０　ｖ／ｖ／ｖ、上層は除去される）中でホモジナイズされ、ブフナー漏斗で濾過され、残渣が同じ溶媒中で再度ホモジナイズされる（以下、すべての溶媒の比率は、他に指示がない限り、体積比である）。ブフナー漏斗で第１回の濾過をした後、残渣は、クロロホルム／メタノール／水（ＣＭＷ）（２：　１　：　０．１）で２回再ホモジナイズされる。すべての濾液を集め、蒸発乾固し、フオルヒ分割のために適当な容量（０，５〜３Ｌ）になるようにクロロホルム／メタノール（２：　１）中に再懸濁した（５）。フオルヒ分割のために、１／６容量の脱イオン水をねじぶた容器中、クロロホルム／メタノール（２：　１）抽出溶液に加え、内容物を約２０回上下を逆にした。層が分離した後（通常２〜３時間）、上層を捨て、等容量の“理論的上層”　（ＣＭＷ−０，２％ＫＣＩ、１・１０：１０）で置換する。これをさらに２回繰り返し、得られた下層をロータリー・エバポレーターで蒸発乾固する。

ＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸクロマトグラフイーによるアニオン性脂質フラクションの分離。

アニオン性脂質フラクションは、カルボキシメチル（ＣＭ）　５ＥＰＨＡＤＥＸクロマトグラフイーにより全下層脂質から調製された。ＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸ（シグマ、Ｃ−２５）は、注意深く洗浄され、以下のプロトコールを用いて平衡化された。５ＥＰＨＡＤＥＸは、衡化することが非常に重要である。乾燥樹脂をブフナー漏斗上で０．２Ｎ　ＨＣＩを用いて十分に洗浄し、該酸中に数時間浸した。樹脂は次いで脱イオン水で断続的に浸しながら十分に洗浄し、次いで、メタノール／水（ＭＷ）（２０：８０，５０：５０．７０：３０および９０：１０）で段階的に洗浄する。次いで、５ＥＰＨＡＤＥＸカラムは、２．０Ｍ含水トリエチルアミン（Ｔ　Ｅ　Ａ）（マリンクロット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）　）　−ＭＷ　（１：　１　：１）溶液に浸し、室温で一夜放置した。過剰のＴＥＡをＭＷ　（１：　１）で十分に洗浄することにより５ＥＰＨＡＤＥＸから除去した。平衡化したＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸは、次いで１００％メタノール、ＣＭＷ　（４０：６０：５）（以下［５ｏｌＡＪという）でこの順に洗浄した。

脳油出物の乾燥した下層に、溶液が完全に溶解性になるまで５ｏｌＡを加えた。

これは、組織５００　ｇｍ当たり通常的ＩＬの溶媒であった。この溶液は５０− ５０−２Ｏ０約１００　ｍ　Ｉ　／　ｋ　ｇ湿組織）の容量を有する平衡化したＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸのベッド（ｂｅｄ　）を通し、重力濾過により溶出した。さらに２Ｌの５ｏｌＡでカラムを洗浄し、すべての通り抜けたフラクションを集めて保存した。次いでカラムはベッド容量が平衡になるまで（ＳＥＰＨＡＤＥＸは僅かに縮小する）ＭＷ（９０：１０）で洗浄した。アニオン性脂質は、０．５Ｍ　ＴＥＡのＭＷ（９Ｑ：ＩＱ、溶媒を緩やかにＣＯ２ガスでバブリングすることで、９．２５のｐＨで滴定される）溶液で溶出された。５００ｇｍの最初の組織当たり、化合物ＡおよびＢ１並びにスフィンゴシン及び“化合物Ｅ”と名付けられた化合物を定量的に溶出するために０．５ＭＴＥＡは約５００ｍ１で十分である。別の試験で、この濃度のＴＥＡはまた標準サイコシンも定量的に溶出できたが、サイコシンは脳油出物中には存在しなかった。

ＴＥＡ濃度を２．０Ｍまで上昇させても他の検出可能な物質（５ｐｅｃｉｅｓ）は溶出されなかった。

結果は、図ＩＡ及びＩＢに示され、ＴＬＣはクロロホルム／メタノール／２８％ＮＨ４ＯＨ（８０：　２０　：　２）で展開された。バンドは、オルシノール− 硫酸により検出された。レーン１は、０．５Ｍ　ＴＥＡを用いたカルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸカラム由来の全溶出物である。レーン２は、精製された化合物Ａである；レーン３は、精製された化合物Ｂである；レーン４は、精製された化合物Ｃである；レーン５は、スフィンゴシンである。

図ＩＢは、図ＩＢと同じクロマトグラムであるが、バンドは０．０１％ＰＲＩＭＵＬＩＮＥでスプレーすることにより検出され、ＵＶ先光下観察された。

図ＩＡは、紫色に染色された化合物ＡＳＢ及びＥについてのオルシノール−硫酸のパターンを示し、炭水化物の存在を示している。他のバンドは、オルシノール −硫酸反応での着色が異なっていた。

ＨＰＬＣＩＡＴＲＯＢＥＡＤクロマトグラフィーを用いた化合物Ａ及びＢのさらなる精製ＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸからの０．５Ｍ　ＴＥＡフラクションは、ＴＥＡサンプルを除去するため無水エタノールを用いて数回蒸発乾固した。次いで、該フラクションはねじぶた試験管（ｓｃｒｅｗ−ｃａｐ　ｔｕｂｅ）に移され、クロロホルム／メタノール（２：　１）で最終容量２〜ＬＯｍｌに希釈され、１０μｌを高分離能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）（メルク）プレート上、クロロホルム／メタノール−ＮＨ４０Ｈ８０：２０：２でクロマトグラフされた。観察は、８０％アセトン中の０．８％ＰＲＩＭＵＬＩＮ（シグマ）または３０％ＦＬＵＯＲＥＳＣＡＭＩＮＥ　（シグマ）を用いた携帯用Ｕｖ光（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ　ＩＩＶ　ｌｉｇｈｔ）で行った。化合物Ａ及びＢの検出は、１０％硫酸中の０６５％オルシノール（シグマ、）及び次の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）オーブン上での加熱（ｂａｋｉｎｇ）によっても検出できた。

化合物Ａ、Ｂ及びＥをより極性の高いスフィンゴシンおよび汚染した中性の糖脂質から分離するには、数回のＨＰＬＣのグラジェント操作を行う必要があった。

これは、非常に極性の低いＩＨＷグラジェントを用いて達成された。ＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳ　（１０μＭ）で充填された長いカラム（０，４ｘ６０ｃｍ）が、最初に以下のスキームに従いカラムを洗浄することにより平衡化された＝２．０ｍｌ／分で、最初の濃度はＩＨＷ（５５：４０：５）であった；グラジェントは、次の約３０分間でＩＨＷ　（５５：　２５　：　２０）まで増加させ、次いで３０分間かけてＩＨＷ　（５５：４０　：　５）に減少させ、３０分間かけてＩＨ（６０：４０）とし、最後にヘキサン（１００％）で３０分間洗浄した。

０．５Ｍ　ＴＥＡフラクションを蒸発乾固し、１００％ヘキサンに溶解することで、以下のように注射用に調製した。２ｍｌの注射のために、１００μｌのクロロホルム／メタノール（２：　１）を加え、蓋を固く締め、サンプルを熱水道水の下で僅かに暖めて約５０℃にし、超音波処理した。大抵の場合、脂質はほぼ完全に溶解した。

この濃厚オイルに、超音波処理をしながら２ｍｌの１００％へキサンを加えた。

いくつかの場合、非常に小さいオパールのような乳光の沈殿を形成したが、これは注射の妨げにはならなかった。

このサンプルをカラム上に載せ、０．５ｍｌ／分でのグラジェント溶出にかけた。グラジェント溶出は、ヘキサンから始まり２５〜１５０分でＩＨＷ　１０：８９：１とし、１５０〜４００分でこの溶媒をＩＨＷ　２４ニア４：２とし、４００〜５００分でＩＨＷ　５５：４０．：５とし、５００〜６００分でＩＨＷ　５５：２５：２０へと続けた。溶出物（約３ｍｌ／試験管）をフラクションコレクターで１００試験管集め、試験管をＨＰＴＬＣ分析（クロロホルム／メタノール／ＮＨ４ＯＨ，８０：２０：２）にかけた。フラクションは、３つの検出可能な化合物Ａ、Ｂ及びＥバンドの分離に基づいて蓄えられた。しかしながら、スフィンゴシンの重なりのため、化合物Ａ、Ｂ及びＥを均一に精製するために、数回のＨＰＴＬＣ操作が必要であった。この方法で、スフィンゴシンは、より遅い移動度のスフィンゴシンアナログとともに都合よく精製される（図ＩＢ、レーン４．５）。

実施例２灰白質と白質並びに小脳と脳幹の比較大脳由来の灰白質と白質の等重量（１００’ｇｍ）を同じヒトの脳から集め、下層を集めるため並行して処理した。小脳と脳幹の等重量も得た。これらのサンプルは上記のようにＣＭ　５ＥＰＨＡＤＥＸ上を通し、０．５ＭＴＥＡで溶出した。図２は、灰白質と白質、小脳及び脳幹由来の種々のフラクションのオルシノール染色を示す。

図２中、各レーンは以下のものである：レーン１及び１０、標準ＣＭＨ、レーン２、白質由来の下層；レーン３、小脳由来の下層：レーン４、脳幹由来の下層；レーン５、灰白質由来の下層；レーン６、白質のカルボキシメチル５ＥＰ）（ＡＤＥＸカラムからの０．５トリエチルアミン溶出物；レーン７、小脳から調製された以外はレーン６と同じフラクション；レーン８、脳幹から調製された以外はレーン６と同じフラクション；レーン９、灰白質から調製された以外はレーン６と同じフラクション。

レーン６は化合物ＡおよびＢの主要な源は大脳の白質であることを明確に示している。大脳の灰白質には、検出できる量の化合物Ａ、Ｂ又はＥはなく、小脳には痕跡量であり、脳幹には（大脳白質と比較して）１０−１５％であった（図２、レーン６−９）。

さらに、化合物Ａ、Ｂ及びＥはヒト脳の白質中に存在するが、灰白質中ては検出できなかった。異なる年齢の６つの異なる脳での化合物Ａ、Ｂ及びＥの組成は、上記のように定量的に測定された。

実施例３化合物Ａ、Ｂ及びＥの化学分解ＨＰＴＬＣ上で分離された化合物ＡＳＢ及びＥは、全てオルシノール硫酸反応により中性のグリコスフィンゴリピッド（ＧＬＳ）に一般的な色で染色されたが、ガングリオシド類に特異的なレゾルシノール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）−ＨＣ１反応は全て陰性であった。弱い酸／塩基処理で予備的に化学分解がなされた。塩化第二水銀（０，ｌＮＨＣｌ中、０．１％ＨｇＣ１２）により触媒されるような弱酸処理が、フユールゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ　）ら（６）のオリジナルな方法に従い行われ、または糖脂質がＭｅＯＨ中０．３Ｎ　ＨＣＩ中、８０℃で３０分間処理された。

弱塩基加水分解は、Ｍ　ｅ　ＯＨ中０，３Ｎ　ＮａＯＨで、８０℃で４０分間行われた。

結果を図３に示す。図３は、純粋なプラスズマロサイコシンおよび弱酸及びアルカリによる分解産物のＨＰＴＬＣパターンである。

図３のレーンは、以下の通りである：レーン１、化合物Ａ；レーン２．０．３Ｎ　ＨＣＩのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で８０℃、３０分間処理した化合物Ａ；レーン３．０．３ＮＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で８０℃、４０分間処理した化合物Ａ；レーン４、標準（５ｔａｎｄａｒｄ）サイコシン；レーン５、化合物Ｂ；レーン６．０．３Ｎ　ＨＣＩのＭｅＯＨ溶液で８０℃、３０分間処理した化合物Ｂ；レーン７．０，３Ｎ　ＮａＯＨのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で８０℃、４０分間処理した化合物Ｂ；レーン８、セラミドモノヘキソシト（ＣＭＨ）。

該結果は、化合物ＡＳＢ及びＥ（化合物Ｅの結果は示されていない）は、０．ＩＮ　ＨＣＩ中のＨｇＣｌ２又は０．３Ｎ　ＨＣＩのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で触媒される弱酸加水分解後に、サイコシンと同じ位置に分解され得るが、塩基加水分解には抵抗性であったことを示す（図３、レール（ｎ−ヘキサデカノール及びｎ−オクタデカノール）は、アルドリッチ（ミルウオーキー、ＷＩ）から購入され、コーリー（Ｃｏｒｅｙ　）及びシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）　（２５）の方法に従い、ＣＨ２Ｃｌ２中のピリジニウム　ジクロメートを用いてアルデヒドに酸化された。生成物の同定と精製は、ＧＣ−ＭＳにより確かめられた。アルデヒドは０．５Ｎ　ＨＣ１１５Ｍ　Ｎ２０のメタノール溶液を用いて８０℃で５．５時間処理することによりエノールメチルエーテル（ＥＭＥｓ）に変換された。加メタノール分解物（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓａｔｅ）は冷却され、ヘキサンで３回抽出された。ヘキサン抽出物を合わせ、Ｎ２気流下に３７℃で約１０μｌになるまで留去し、以下に記載するようにＧＣ−ＭＳによる分析のためヘキサンで希釈した。これらの条件下でのＥＭＥ誘導体の製造は、長鎖ジメチルアセタールへの変換に関し有利であった。

長鎖アルデヒド分析　脂質サンプル（４００−５００μ）が、０．５Ｎ　ＨＣｌ１５Ｍ　Ｎ２０のＭ　ｅ　ＯＨ溶液２ｍｌを用いて８０℃で５，５時間加メタノール分解された。加メタノール分解物は冷却され、ヘキサンで３回抽出された。

ヘキサン抽出物を合わせ、Ｎ２気流下に３７℃で約１０μｌになるまで留去し、ＧＣ−ＭＳによる分析のための適切な希釈になるように１０〜５０μｌのへキサン中に取った。ヘキサンで抽出可能な物質のアリコートのＧＣ−ＭＳは、Ｅｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００四極子（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）マススペクトルメーターが連結されたヒユーレット−パラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）　５８９０　Ａクロマトグラフを用いて行われた。ガスクロマトグラフィーは、３０ｍＤＢ−５（Ｊ　＆　Ｗ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｒａｎｃｈ　Ｃｏｒｄｏｖａ、　ＣＡ）結合−フェーズ融合シリカキャピラリーカラム（ｂｏｎｄｅｄ −ｐｈａｓｅ　ｆｕｓｅｄ　５ｉｌｉｃａ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｃｏｌｕｍｎ）　（０，２５ｍｍ　ｏ、ｄ、、０．２５μｍのフィルム厚さ；スプリットレス　インジェクション（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）　；温度プログラム、１４０−２５０℃、４８Ｃ／分）を用いて行われた。マススペクトルメーターは、ＣＩ（イソブタン；質量範囲、１５０−５００ｕ、１秒当たり１回のスキャン）又はＥｌ（質量範囲、５Ｏ−５００ｕ、１秒当たり１回のスキャン）のモードで操作された。ＥＭＥ誘導体は、合成標品（以前の項参照）と比較した特徴的なイオン及び保持時間により同定され、必要な場合には同時注射（ｃｏ− ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により確認された。

モノサッカライド分析　脂質サンプル（５０−１００μｇ）が、無水ＭｅＯＨ中の０．５Ｎ　ＨＣＩ　（１ｍｌ）中、８０℃で２４時間加メタノール分解された。加メタノール分解物は冷却され、ヘキサンで３回抽出された。

下層の酸性ＭｅＯＨはＡｇ２ＣＯ３（約１０ｍｇ）を添加して中和し、無水酢酸（１００μｌ）を用いて室温で６時間処理した。次の遠心分離とＭ　ｅ　ＯＨの除去の後、沈殿を１ｍｌのＭｅＯＨで２回洗浄した。ＭｅＯＨ抽出物を合わせ、Ｎ２気流下に乾燥した。得られたモノサッカライドメチルグリコシドは、そのパーー〇−トリエチルシリルエーテルとして（２６，２７）上記のＥｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００システム（Ｄ　Ｂ　−５カラム；スプリットレス　インジェクション；温度プログラム、１４０−２７０℃、４℃／分、ＣＩ−ＭＳ（イソブタン）モード）を用いたＧＣ−ＭＳにより分析された。ヘキサン抽出物を合わせ、Ｎ２気流下に３７℃で約１０μｌになるまで留去し、次いで上記の項に記載された条件下でＧＣ−ＭＳによる分析のためにヘキサンで希釈された。

無傷の脂質の化学的誘導体　脂質サンプル（約５０μｇ）は、Ｍｅｌ及びＤＭＳＯを等量（各１００ｕｌ）用いた他は、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２９）により修飾されたようなＣ１ｕｋａｎｕ及びＫｅｒｅｋ　（２８）の方法によりパーメチル化された。反応時間は３０分であり、ＭｅＩはＣＨＣｌ　およびＨ２Ｏ間に分割する前に２５分間３７℃でＮ２を用いたフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）により除去した。

Ｈ２Ｏで３回洗浄した後、ＣＨＣｌ３はＮ２下に蒸発乾固した。

脂質サンプルは、２：１ピリジン−無水酢酸（０，５ｍｌ、２０時間、室温）でパーーＮ、０−アセチル化した。試薬は、無水トルエンを共沸物として加え、３７℃でＮ２気流を用いたフラッシングにより除去した。次いで、各サンプルの一部をＺｅｍｐＨｎの手順（無水ＭｅＯＨ中Ｎ　ａ　ＯＭ　ｅで短時間処理する）により脱−９−アセチル化した（３０）。

メチル化／結合分析　グリコジル残基の置換基の結合位置は、各サンプル約５０ μｇをパーメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）　Ｌ　（前のセクション参照）、次いで、分析を上記のＥｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００Ｇ　Ｃ−Ｍ　Ｓシステム（ＤＢ−５カラム；スプリットレス　インジェクション；温度プログラム、１４０−２５０℃、４℃／分、　Ｅ　Ｉ−ＭＳモード）上で、保持時間及び特徴的な電子衝撃マススペクトルによりなされる部分的にメチル化されたアルジトールアセテート（ＰＭＡＡ）誘導体の同定（３１，３２）とともに行うことを除いて、他で詳述された（２２）ように加水分解、還元、パーアセチル化及びＧＣ −ＭＳを行うことにより決定された。同定は、公知の標準混合物におけるＰＭＡＡｓとの比較により確認された。

高速原子衝撃質量分析法　ＦＡＢ−ＭＳは、最大の加速電圧（１０ｋＶ）、キセノンビーム、６ｋｖ：レゾリューション（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）　、３０００の蓄積モード（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ）て操作されるＪＥＯＬ（東京、日本）ＨＸ−１１０／ＤＡ−５０００マススペクトロメーター／データシステム上で行われた。Ｍ　ｅ　ＯＨ中のサンプルのアリコート（約２０μｇ）は、ＦＡＢターゲットに移され、適当なマトリックス中に懸濁された。ＦＡＢ−ＭＳで分析される天然の脂質サンプルのためのマトリックスはＴＥＡ／１５−クラウン−５（３３，３４）であり、質量範囲は１００−２０００ｕであった。各スペクトルについて３回のスキャンが蓄積された。グリセロール中のヨウ化ナトリウムは、較正標準（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　５ｔａｎｄａｒｄ）として使用された。

れた脂質のサンプルは、酢酸ナトリウムの存在下及び非＋存在下にＮＢＡマトリックスを用いた　ＦＡＢ−ＭＳにより分析された。他の条件は上記と同じであった。Ｋｌ／Ｃｓｌは、較正標準として使用した。

メタツリシス：モノサッカライド分析　未知の脂質はオルシノールで染色されいくつかの炭水化物成分の存在を示すため、それらは引き続く酸性メタツリシス（ａｃｉｄｉｃ　ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）で製造されたトリメチルシリルメチルグリコシドのＧＣ−ＭＳによるモノサッカライド分析に供せられた。各場合において、ガラクトースの通常のトリメチルシリル誘導体として明らかに観察された（データは示さない）。他のサツカライドのピークは、最も高い位置のバンドのメタツリシス分解物で検出された痕跡量（く１％）のグルコースを除いては観察されなかった。

メタツリシス：脂肪アルデヒドの分析　ヘキサン洗浄及びそれに続く酸性メタツリシスのＧＣ−ＭＳ分析は、メチルエステルとして、一般にスフィンゴシンに結合してセラミド部分を構成するグリコスフィンゴリピッドの脂肪アシル成分の決定に通常使用される。今回の場合、分析された脂質フラクションのいずれにも脂肪酸メチルエステルは検出されなかった。多数の未知のピークが観察された。無傷の脂質のＦＡＢ−ＭＳ分析（以下に記載する）の結果の評価に続き、これらのピークの同定は、注意深く行われ、いくつかの主要な成分は、長鎖エノールメチルエーテルに相当することが判明した。２つの成分は、標品の１６：０及び１８：０長鎖アルデヒドの酸性メタツリシスにより調製されたエノールメチルエーテルの保持時間及びマススペクトルと同一であることが見出された。１８：０アルデヒドから合成されたものより２ａｍｕ小さい分子量と僅かに速い保持時間を有する２つの他の成分は、異性体の不飽和１８：１化学種（５ｐｅｃｉｅｓ）に相当すると推測された。これら４つの成分は、図４Ａ及び４Ｂに再現されたＧＣ− ＭＳで同定される。

図４Ａ及び４Ｂは、長鎖メチルエノールエーテル類のガスクロマトグラフ−化学イオン化／マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＣＩ／ＭＳ）　の結果である；図４Ａは、中間の脂質バンド（ｍｉｄｄｌｅ　ｂａｎｄ　１ｉｐｉｄ）の加メタノール分解の結果を示す二面４Ｂは、標準ｎ−１６：　０および−ｉｓ：ｏアルデヒドの加メタノール分解の結果を示す。

ピークは、１として１６：ｏを同定し、２ａおよび２ｂとして異性体１８：１を同定し、３として１８：ｏメチルエノールエーテルを同定し、各々２５５．２８１及び２８３ｕのシュードモレキュラーイオン質量（ｐｓｅｕｄｏｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　ｉｏｎ　ｍａｓｓ）を有する。アステリスクで標識されたピークは、両サンプルに共通する不純物であり、多分誘導化試薬に由来する。

天然の脂質のＦＡＢ−ＭＳ分析　未知の天然脂質のＦＡＢ−ＭＳスペクトルは、陽性及び陰性の両方のイオンモードで得られ（７−９）、結果を図５Ａ〜５Ｄに示す。

図５は、天然の脂質のＦＡＢ−ＭＳを示す：［Ｎ５Ａは、３−ニトロベンジルアルコール（Ｎ　Ｂ　Ａ）マトリックスの上側の脂質バンドの　ＦＡＢマススペクトル；図５Ｂは、ＮＢＡマトリックスの中間の脂質バンドの　ＦＡＢマススペクトル；図５Ｃは、ＮＢＡ／酢酸ナトリウムマトリックスの中間の脂質バンドの　ＦＡＢマススペクトル：図５Ｄは、ＴＥＡ／１５−クラウン−５マトリツク上側及び中間（ＨＰＴＬＣ）のバンド（ｕｐｐｅｒ　ａｎｄｍｉｄｄｌｅ　（ＨＰＴＬＣ）　ｂａｎｄ）の陽イオンスペクトルは、図５Ａ及び図５Ｂに再現される。

ｍ／ｚ６８４．７１０及び７１２（名目的な、単一同位体質量（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｍａｓｓ））の突出したイオンが、両方のスペクトルで観察された。

シュードモレキュラーイオン［ＭＨ］　に相当するそれは、続いてマトリックスに酢酸ナトリウムを添加したスペクトルを得ることにより確認した。ナトリウム化された分子イオンは、ｍ／ｚ７０６．７３２及び７３４に観察された（図５０参照）。他の確認は、モード（ｍｏｄｅ）・シュードモレキュラーイオン［Ｍ− Ｈ］−がｍ　／　ｚ　６８２．７０８及び７１０に観察される陰イオンスペクトル（図ＩＤ参照）により提供された。これらのイオンは、奇数分子量６８３．７０９及び７１１　Ｄａに相当するため、各物質（５ｐｅｃｉｅｓ）は奇数の窒素原子を有していると結論できた。興味あることに、該陰イオンスペクトルは、シュードモレキュラーイオンに明らかに関連する余分のピークの存在により特徴付けられる。各シュードモレキュラーイオンは、ｍ／ｚ　［Ｍ−Ｈ＋４２］に加えて、ｍ／ｚ　［Ｍ−Ｈ＋２６］のより小さいピークを伴う。そのような付加イオンは、ＴＥＡをマトリックスとして使用したときにのみ半合成リゾ−及び脱−Ｎ −アセチルガングリオシドの陰イオンスペクトル中に以前に観察された（１．２）。それらは、遊離のアミノ基を含む化合物でのみ観察され、不純物の存在によるか、または高速原子衝撃の条件下でのＴＥＡの分解物により形成される、マトリックス中のある成分との付加反応に由来するものと信じられている。この場合、脂質が一級アミノ官能基を生じるという結論は、ＨＰＴＬＣプレート上でのフルオレスカミンによる検出と矛盾しない。

さらに興味のあることには、二量体イオンと矛盾しないピークが、陽イオンスペクトル中で観察された。これらは、単量体化学種の可能な組合せ、すなわちｍ／ｚ＋［Ｍ１十Ｍ２＋Ｈ］　及び［Ｍ１＋Ｍ２−Ｈ＋２Ｎａ］に相当する質量が１３００及び１５００ｕの間に見出された（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ参照）。陰イオンスペクトルにおいて、それらは、再度２６及び４２ｕ高い質量の付加イオンを伴っていた（図５Ｄ参照）。Ｂａ１ｌｏｕ及びＤｅＩＩ（２３）は長鎖アルキルトリメチルアンモニウムイオンとマイコバクテリウム・スメグマティティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｔｉｓ　）由来の天然の３−メチル− マンノースポリマーの間の相互作用を　ＦＡＢ−ＭＳにより研究したが、ＦＡＢスペクトルにおけるその様な糖脂質の非共有結合性の自己−会合性（ｓｅｉ　ｆ −ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、以前には報告されてぃなかった。陽イオンスペクトル中で、第２のイオンのセットは、１１００と１２００ｕの間で観察され（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ参照）、この時点、ではこの損失の正確な性質は明らかでないが、二量体化学種の１つの分子の一部の損失に対応するかもしれない。それらは、奇数のマスフラグメント（２５７ｕ）の損失を示すため、開裂される窒素原子を含むスフィンゴシン鎖の一部であると仮定できる。

観察されたシュードモレキュラーイオン（２６及び２８ｕ）間の質量の相違は、より重い同族体での優勢なモノ不飽和についての２個の炭素のアルキル鎖に相当する構造の相違を示唆する。上側及び中間のバンドは、質的に類似したスペクトルを与えるので、構造異性は、それらの間のＲｆの相違によるものと推定された。両方の場合において、ポジティブモードにおける主要なフラグメントイオンは、ｍ／ｚが２８２に観察され、より量の少ない関連するイオンは、ｍ／ｚが２５０．２６４．３００及び３１０であった。ｍ／ｚか３００．２８２及び２６４のイオンは、Ｈａｒａ及びＴａｋｅｔｏｍｉ　（２４）により以前に観察され、サイコシン（例えば、ガラクトサイコシンは、各々［Ｍ＋Ｈ−Ｇａ　１−ＨＯ］　、及びモードＦＡＢスペクトルでの不飽和ｄ１８：１スフィンゴシンのフラグメントを特徴付けた。サイコシン誘導体としての未知の脂質及びそれらの間の可能性のある異性体関係の確認は、ＦＡＢ−ＭＳによりモニターされる分解実験により提供された。

温和な酸加水分解の生成物のＦＡＢ−ＭＳ　上側の脂質バンドを、Ｏ，ＩＮ　ＨＣＩ／ＨｇＣｌ２で短時間処理してＲｏがＨＰＴＬＣ上で中間のバンドと同じである生成物を得た。この生成物の＋ＦＡＢマススペクトル（図６Ａ）は、天然の未処理の上側または中間の脂質バンドのそれと実質的に同一であり、上側のものは、酸触媒変換で中間の脂質バンドに変化することを示す。上側のバンドの継続的処理、または中間のバンドの処理により、新規な生成物が観察され、該生成物は、標品のガラ十クトサイコシンのＲｆと同一である。これら生成物のＦＡＢマススペクトルは、ガラクトサイコシンで得られたものと実質的に同一であった（図６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ参照）。

図６は、ＨＣｌ／ＨｇＣ］２　・マトリックス：　ＮＢＡ＋で処理した生成物の　ＦＡＢ−ＭＳを示す。Ａ１上側の脂質バンド、続く短い酸処理により中間の脂質バンドに変化する；Ｂは、長い酸処理に続く上側の脂質バンド；Ｃは、長い酸処理に続く下側の脂質バンド、；Ｄは、ｄ１８：１ガラクトサイコシン標品。

脂質は、新規に単離されたサイコシンの共有結合性の誘導体であるため、以下の結論に達することができる。

ｍ／ｚ３１０　（ｄ２０　：　１スフインゴシンを含有する同族体を示すかもしれない）と比較してｍ／ｚ２８２（図５Ａ及び５Ｂ）は相当多量にあることから、シュードモレキュラーイオンの質量の相違は、異なるスフィンゴシンの鎖長により起こるというよりもむしろ修飾基の質量の相違に大きく依存していることは明らかである。修飾基は、サイコシンに２２２．２４８、及び２５０ｕの追加の質量を加えるものに違いないであろう。質量における同じ相違が、量の少ないフラグメント（ｍ／ｚ４４４．４７０及び４７２）のシリーズにおいても観察され、天然の脂質のスペクトルでも見出された（図５Ａ及び５Ｂ）。該天然脂質は、サイコシンのＦＡＢマススペクトルのｍ／ｚ２２２に見出されるフラグメントのアナログであるかもしれないが（２２）（図６Ｄ参照）、同時に天然の修飾された脂質のスペクトルからは除外される。興味あることに、サイコシンのスペクトル中にｍ／ｚ２５０及び２５２で見出される１対のフラグメントは（２２）（図６Ｄ参照）、天然の修飾脂質のスペクトル中にも見出され（図５Ａ及び５Ｂ）、一方、ｍ／ｚ２２２フラグメントに見出されるような質量の付随的増加を伴って観察されるイオンのセットはなかった。同時に、ヘキサン可溶性のメタツリシス生成物のＧＣ−ＭＳにより見出されるエノールメチルエーテルの鎖長の相違に相当する質量の相違は、これらが問題となっている修飾基の化学的トランスフォーマント（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）であるかもしれないことを示唆している。以前に、プラズマローケン様の形態のグリコスフィンゴリピッドが、Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖらにより提案され（１３）、その中でサイコシンの３−ＯＨ基が長鎖エノールエーテルの結合により修飾された。しかしながら、ヘキソース部分の欠損に相当するすべてのフラグメントの完全不在は、グリコスフィンゴリピッド（例えば、サイコシン）のＦＡＢマススペクトルで普通に観察されることから、修飾基はスフィンゴシン部分よりは、むしろガラクトース残基に結合していなければならないように思われた。これらの修飾がエノールエーテルの形態を取っているであろうという考えは、ＦＡＢ−ＭＳに続く更なる誘導体化実験により誤っていることが示された。

順次パー−Ｎ、Ｏ−アセチル化及び脱−〇−アセチルリジンによるバーアセチル化（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）は、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに例示されるように、４つのアセチル基を組み込むことになった。

図７Ａは、ＮＢＡマトリックスの過アセチル化された上側の脂質バンドである：図７Ｂは、ＮＢＡマトリックスの過アセチル化された中間の脂質バンドである；図７０は、ＮＢＡ／ＢＡ／トリウムマトリックスの過アセチル化された中間の脂質バンドである；図７Ｄは、ＮＢＡマトリックス中の過アセチル化され且つ脱− 〇−アセチル化された中間の脂質バンドである（挿入：ＮＢＡ／酢酸ナ酢酸ナトリウムマトリック間中の生成物は、シュードモレキュラーイオンの質量の変化を示さない）。

上側の脂質のように（図７Ａ）、８７４．９００および９０２のシュードモレキュラーイオン［Ｍ＋Ｎａ］＋は、各々の天然の物質（ｓｐｅｃｉｅｓ）への４Ｘ４２ｕの付加に相当する。さらに、［ＭＨ−６０］　を表す、ＨＯＡＣが容易に中性損失したｍ／ｚ７９２．８１８、及び８２０のイオンが観察された。真のシュードモレキュラーイオン（ｔｒｕｅ　ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　１ｏｎ）であるより高い質量グループの確認は、過−アセチル化された中間の脂質バンドで示すように（図７Ｃ）、マトリック３中に酢酸ナトリウムを添加することにより行われた。［ＭＨ−６０］＋イオンの同時抑制は、この条件下に観察された。

スペクトルのより低い末端では、ｍ／ｚ２６４の三重に不飽和化（二重に脱水）されたイオンが、今度は主要なスフィンゴシンフラグメントであった。また、ｍ／ｚ３６６に観察されたイオンは、多分Ｎ−Ａｃ、０−Ａｃスフィンゴシンフラグメント（ｍ／ｚ３８４）の単一の脱水を示す。スフィンゴシンフラグメントは、１または２分子のＨＯＡｃを除去して、各々ｍ／ｚ３２４及び２６４のイオンを得ることができる。ＨＯＡｃをｍ／ｚ３６６のフラグメントから除くと、ｍ／ｚ３０６のイオンが得られる。奇数のマス・イオンのグループである、ｍ／ｚ４６９．４９５及び４９７の起源は、この時点では明らかでない。

中間の脂質バンドで示されているように（図７Ｄ）、Ｍ　ｅ　ＯＮ　ａ　／　Ｍ　ｅ　ＯＨでの脱−〇−アセチル化は、３つの０−Ａｃ基が欠損し、１つのＮ− Ａｃが保持される結果となり、再度、天然の脂質の反応性アミンの存在を確認することになる。ナトリウム化された分子イオンは、ｍ／ｚ７４８．７７４及び７７６に観察された。スフィンゴシンイオンは、再度ｍ／ｚ３２４．３０６及び２６４に観察され、各々１個脱水された七ノーＮ−アセチル化フラグメント、２個脱水されたモノ−Ｎ−アセチル化フラグメント、及び１個脱水されたフラグメントからのＨＯＡｃの除去を示す。ｍ／ｚ３６６の脱水されたＮ−Ａｃ、０−Ａｃイオンは観察されなかった。類似の結果が、上側の脂質バンドで得られた（示さない）。

これらの結果は、（ａ）スフィンゴシンの３−ＯＨ基は天然脂質で遊離であり、及び（ｂ）修飾基はガラクトース部分の２つのヒドロキシル位置を占めることを確立した。これは、タンデム（ｔａｎｄｅｍ）に２つのエノールエーテルを結合することには適合しない。それは、遊離のサイコシンに関係する質量増加が、２回観察されなければならないからである。ＦＡＢ−ＭＳと他のデータに一致する唯一の修飾は、環状アセタールとしての長鎖アルデヒドの結合であるように思われた。１６：０．１８：１及び１８：０脂肪アルデヒドを伴うｄ１８　：　１のスフィンゴシンのアセチル化は、新規脂質の観察された分子量を生ずるであろう。この結論は、以下に示すように、メチル化／結合分析により確認された。

Ｇ　Ｃ−Ｍ　Ｓによるメチル化分析　天然脂質のパーメチル化、酸加水分解、還元及びアセチル化に続き、得られた部分的にメチル化されたヘキシトールアセテートをＧＣ−ＭＳにより分析した（図８Ａ及び８Ｂ）。

図８Ａは、上側の脂質バンドに由来するＰＭＡＡである；図８Ｂは、中間の脂質バンドに由来するＰＭＡＡである；図８Ｃは、短い酸処理に続く上側の脂質バンドに由来するＰＭＡＡである；図８Ｄは、標準ガラクトースＰＭＡＡ類である。

ピークは、ＰＭＡＡ類として同定され、ＰＭＡＡ類の１：２．３．６−トリー〇 −，２：　３゜４．６＋２．４．６−トリー〇−；３：２．ａ、４−トリー〇− ；４：２．６−ジー０−；５：４．６−ジー〇−，６：３．６−ジー０−．７：２，３−ジー０−　；　８　：６−モノー〇−、９：３．４−ジー０−；１０：２−モノ−〇−；及び１１３（又は４）−モノ−〇−Ｍｅ−−Ｍｅ−Ｇａｌが得られた。これらは、３，４−及び４゜６−結合ガラクトース部分を各々示し、脂質がサイコシン由来の異性体環状アセタールでなければならないこと、上側のバンドでは５員環を形成すること、及び中間のバンドでは、６員環を形成することを明確に示している。

上側のバンドの限定された酸処理に由来する生成物も２゜いる。最後に、アセタールのＣ１位置でのキラリテイ−は、明゛確に決定できなかったが、長鎖は６員環アセタールのエカトリアル（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ）に配向し、この基は５員環ではシュードエカトリアル（ｐｓｅｕｄｏｅｑｕａｔｏｒｉａｌ）に配向すると考えられる。

実施例５化合物Ｃ及びＤの単離と精製本実施例で使用されるガラクトシルセレブロシド及びスルファチドはシグマ・ケミカル・カンパニーから購入された。脂肪アルデヒド（プラズマル）は、アルドリッチから購入された。

“速移動成分（Ｆａｓｔ　Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）　”の単離ヒト脳セレブロシドフラクションは、脳組織を５倍量の（即ち、５倍容量／湿組織の重量）イソプロパツール／ヘキサン／水（ＩＨＷ）５５　：　２５　：　２０　（ｖ／ｖ／Ｖ）でホモジナイズし、ブフナー漏斗（以下、すべての溶媒の比率は容量で表す）で濾過することにより得た。

残渣は、同一溶媒の同一容量を用いて再度ホモジナイズした。抽出物を蓄え、蒸発乾固し、もとの組織の湿重量１００ｇ当たりＩＬのクロロホルム／メタノール（ＣＭｅ）２：１および１６６ｍ１の水を用いたフォルヒ分割に供した。下層は「理論的上層」　（クロロホルム／メタノール１０．２％ＫＣＩを有する水　１０：１０：１）でさらに２回分割した。得られた下層を完全に蒸発乾固した。ＦＬＯＲＩＳＪＬ（酸化マグネシウムとケイ酸ゲルの混合物）（シグマから；６０ −１００メツシユ）の大きなカラム（オリジナルの組織１ｋｇ当たりベッド容量ＬＬ）を準備し、純粋なヘキサン（Ｂｕｒｄｉａｃｋ　＆　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）で平衡化した。乾燥された下層はヘキサン（オリジナルの組織２００ｇ当たりＩＬ）中に懸濁し、ＦＬＯＲＩＳＩＬカラムを通し、４Ｌのヘキサンで徹底的に洗浄した。次に、ＦＬＯＲＩＳＩＬカラムは、２Ｌのヘキサン／ジクロロエタン（ＤＣＥ）２　：　１、次いで２ＬのＤＣＥ１最後にＩＬのＤｃＥ／アセトン　１：１で溶出した。最終溶出物は、酸に不安定な速移動成分を含有した。

酸に不安定な糖脂質の検出酸に不安定な糖脂質は、メタノール−含水０．ＩＮＨＣＩ（１：１、ｖ　／　ｖ　）中、９０℃で１０分間サンプルを加水分解し、次いでフォルヒ分割及び下層のＴＬＣ試験により検出された。この処理により通常のセレブロシドと同じ移動度に変化した高いＴＬＣ移動度を示す糖脂質は、酸に不安定なセレブロシドと見なされた。セレブロシドおよびセレブロシドエステルは、これらの条件下で変化したＴＬＣ移動度を示さなかった。

速移動フラクション中に存在する酸に不安定なグリコスフィンゴリピッドの単離及び予備的な特徴付は酸に不安定な速移動グリコリピッド（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）は、フォルヒの下層のカルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸおよびジエチルアミノエチル−３ＥＰＨＡＤＥＸ上での脳油出物の非吸着フラクション、並びにＦＬＯＲＩ　Ｓ　ＩＬクロマトグラフィーでのＤＣＥ−アセトン　１：１溶出液フラクシヨンで見出された。この成分は、純粋なヘキサンで充填され、ＩＨＷ５５　：　４０　：　５へのグラジェントで１ｍｌ／分で３時間溶出するＩＡＴＲＯＢＥＡＤカラム上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）によりさらに精製された。フラクションは、２００試験管集められた。酸に不安定なグリコリピッド成分は、試験管番号１３０−１５４に溶出された。蓄えられたフラクション（フラクションＶＩと呼ぶ）は、酸に不安定なグリコリピッドの大部分を含み、セレブロシドおよびセレブロシドエステルを含まないと考えられた。フラクションＶＩは、純粋なヘキサンでカラムに充填され、インプロパツール／ヘキサン（ＩＨ）３０　：　７０までのグラジェントに供せられるＩＡＴＲＯＢＥＡＤＳクロマトグラフィーによりさらに精製された。この様にして得られたフラクションＶＩＡ　（図１１、レーン５）は、純粋なヘキサンで充填され、ＩＨＷ５０：４０：５へのグラジェント溶出を３時間行うグラジェントでの長いＩＡＴＲＯＢＥＡＤカラム（０，５ｘ１００ｃｍ）上でさらに精製された。

あるいは、該化合物は、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）により精製された。得られた均一なバンドは、図１ル−ン６に示される。ＴＬＣ上で、該化合物はセレブロシドエステルよりも速く移動するコレステロールよりも速く移動した。該化合物は酸に不安定であることが知られているサルフェートまたはシアル酸を含まなかった。

図１１は、ヒト脳から調製したフォルヒ下層（Ｆｏｌｃｈ’ｓ　ｌｏｗｅｒ　ｐｈａｓｅ）由来の種々の非極性グリコスフィンゴリピッドの高分離能−薄層クロマトグラフィ−（ＨＰＴＬＣ）パターンである。クロマトグラムは、クロロホルム／メタノール／２８％ＮＨ４ＯＨ（８０：　２０　：　２）　の溶媒混合物で展開された。レーン１は、標準ＣＭＨ（セレブロシド）である；レーン２は、フォルヒ分割（Ｆｏｌｃｈ’ｓ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）で得られた下層である；レーン３は、カルボキシメチル　５ＥＰＨＡＤＥＸによる全下層の未吸着通過物である；レーン４は、（ジクロロエタン／アセトン（１：１　容量比）で溶出された）ＰＬＯ，ＲＩＳＩＬカラムから得られたＦｒ、ＶＩである；レーン５は、ＩＡＴＲＯＢＥＡＤクロマトグラフィーから溶出されたフラクション４７−５８である；レーン６は、フラクション４７−５８からの精製されたプラズマルセレブロシドである；レーン７は、精製された精製されたエステル−セレブロシドである。

化合物Ｃ及びＤと同様にセレブロシド（ＣＭＨ）は、酸または塩基処理により化学的に分解された。酸処理は、０．３ＮＨＣ１のＭｅＯＨ溶液で８０℃、３０分間であった。弱塩基加水分解は、Ｑ、３Ｎ　ＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液で８０℃、４０分間行われた。該化合物及びその分解産物は、次いで高分離能−薄層クロマトグラフィーにより分離された。結果は図１２に示される。

図１２中のレーンは、以下の通りである：レーン１は、ＣＭＨ、レーン２は、Ｑ、３ＮＨＣ１のＭｅＯＨ溶液で分解されたＣＭＨ、レーン３は、０゜３Ｎ　ＮａＯＨＣＭＨ；レーン４は、プラズ７０セレブロシド、レーン５は、０．３Ｎ　ＨＣＩのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で処理されたプラズマロセレブロシド；レーン６は、０．３Ｎ　ＮａＯＨのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で処理されたプラズマロセレブロシド；レーン７は、エステルセレブロシド１；Ｌ／−ン８は、０．３Ｎ　ＨＣＩ（７）ＭｅＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシド１；レーン９は、ｏ、３Ｎ　ＮａＯＨのＭ　ｅ　ＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシドｌ；レーンｌｏは、エステルセレブロシド２；レーン１１は、０．３Ｎ　ＨＣＩのＭｅＯＨ溶液で処理されたエステルセレブロシド２；レーン１２は、ｏ、３Ｎ　ＮａＯＨのＭ　ｅ　ＯＨ溶液中のエステルセレブロシド２゜該結果は、プラズマロセレブクシドが酸に不安定で且つ塩基に安定であり、一方、レーン７および１０のセレブロシドエステルは、本質的に酸抵抗性であることを示す。

酸は、脂質的３０−５０μｇの加メタノール分解（無水メタノール中０．５Ｎ　ＨＣＩの１ｍｌ、８０’Ｃ１２４時間）により放出されるメチルエステル（ＦＡＭＥｓ）として見積もられた。同じ手順で放出される脂肪アルデヒドは、サイコシン脂肪アセタールで記載したように長鎖エノールメチルエーテル（ＥＭＥｓ）に変換された。

これら同成分は、中和の前にほぼ同量のヘキサンで３回分割することにより、加メタノール分解物から抽出された。合わされたヘキサン抽出物は、Ｎ２気流下３５−４０℃で約１−２μｌになるまで濃縮され、ＧＣ−ＭＳによる分析用の好適な希釈を与える量のへキサン（１〇−５０μＩ）中に取られた。ヘキサンで抽出可能な物質のアリコートのＧＣ−ＭＳは、Ｅｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００四極子（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）マススペクトロメーターが連結されたヒユーレット− パラカード５８９０Ａガスクロマトグラフを用いて行われた。ガスクロマトグラフィーは、３０ｍＤＢ−５（Ｊ　＆　Ｗ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｒａｎｃｈ　Ｃｏｒｄｏｖａ、　ＣＡ）結合−フニーズ融合シリカキャピラリーカラム（ｂｏｎｄｅｄ−ｐｈａｓｅ　ｆｕｓｅｄ　５ｉｌｉｃａ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｃｏｌｕｍｎ）　（Ｑ、２５ｍｍ　ｏ。

ｄ、、０．２５μｍのフィルム厚さ；スプリットレスインジェクション；温度プログラム、１５０−２９０℃、４℃／分）を用いて行われた。マススペクトロメーターは、ＣＩ（イソブタン；質量範囲、１５０−５００ｕ。

１砂崩たり１回のスキャン）又はＥＩ（質量範囲、５Ｏ−５００ｕ、１砂崩たり１回のスキャン）のモードで操作された。誘導体は、特徴的なイオン及び保持時間により同定され、必要な場合には標品との同時注射により確認された。

ｍｇ）を添加して中和し、無水酢酸（１００μｌ）を用いて室温で６時間処理した。次の遠心分離とＭｅＯＨの除去の後、沈殿を１ｍｌのＭ　ｅ　ＯＨで２回洗浄した。ＭｅＯＨ抽出物を合わせ、Ｎ２気流下に乾燥した。得られたモノサッカライドメチルグリコシドは、そのパーー〇−トリメチルシリルエーテルとして（２６，２７）上記のＥｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００システム（Ｄ　Ｂ　−５カラム；スプリットレス　インジェクション；温度プログラム、１４０−２７０℃、４℃／分；ＣＩ−ＭＳ（イソブタン）モード）を用いたＧＣ−ＭＳにより分析された。

メチル化／結合分析　グリコジル残基上の置換基の結合位置は、各サンプル約５０μｇをパーメチル化し、次いで、加水分解、還元、パーアセチル化、並びに分析を上記のＥｘｔｒｅｌ　ＥＬＱ　４００Ｇ　Ｃ−Ｍ　Ｓシステム（ＤＢ−５カラム；スプリットレス　インジェクション；温度プログラム、１４０−２５０℃ 、４℃／分、ＥＩ−ＭＳモード）で行い、保持時間及び特徴的な電子衝撃マススペクトルによりなされる部分的にメチル化されたアルジトールアセテート（ＰＭＡＡ）誘導体の同定（３１，３２）を行うことを除いて、他で詳述されたように（２２）、ＧＣ−ＭＳを行うことにより決定された。同定は、公知の標準混合物におけるＰＭＡＡｓとの比較により確認された。

加速電圧（１０ｋＶ）、キセノンビーム、６ｋＶ；質量範囲、３０００　、レゾリュージョン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）　、３０００の蓄積モード（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ）で操作されるＪＥＯＬ（東京、日本）ＨＸ−１１０／ＤＡ−５０００マススペクトロメーター／データシステムで行われた。

ＭｅＯＨ中のサンプル（約２０μｇ）のアリコートは、ＦＡＢターゲットに移され、ＮＢＡマトリックス中に懸濁された。各スペクトルについて３回のスキャンが蓄積された。Ｋｌ／Ｃｓｌは、較正標準として使用した。

存在を示す古典的な条件下に“プラズマル反応（ｐｌａｓｍａ］　ｒｅａｃｔｉｏｎ）”を与える。これは、メタツリシス後のＧＣ−ＭＳ分析により確認された。

ＨＣｌ−加メタノール分解物のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳ分析は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）１６・０．１８：１．１８：０、及び２４：１に対応するピークに加えて、通常のセレブロシドまたはエステルセレブロシドの加メタノール分解物中に検出されない複数のピークの存在を示した。これらのピークは、標品化合物の電子衝撃（Ｅｌ）及び化学的イオン化（ＣＩ）マススペクトルに加えて保持時間を比較することにより決定された。このようにして、それらは、１６：０，１８：０及び１８：１のエノールメチルエーテル（ＥＭＥ）（図１３）のような脂肪アルデヒド由来のエノールメチルエーテル（ＥＭＥｓ）として同定された。

図１３は、未知の脂質成分の加メタノール分解からの長鎖ＦＡＭＥｓおよびＥＭＥｓのＣＧ−ＥＩ／ＭＳである。ピークは、標識されたように同定された。アステリスクで標識されたピークは、未同定の不純物である。

Ｂマススペクトルは、陽イオンモードで得られた。該スペクトルは、図１４に再現される。図１４中で、ピークは名目的な、単一同位体質量（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｍａｓｓ））で標識される。

スペクトルは、ｄ１８：１スフインゴシンを有するセレブロシドの陽イオンＦＡＢ及びＦＡＢ−ＣＩＤ　（高速原子衝撃−衝突誘導電離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）スペクトル（３６，３８，４１）に共通に見出されるように、Ｄｏｍｏｎ及びＣｏ５ｔｅｌｌｏの命名で各々Ｗ′ 及びＷ″であるセラミドの脱−Ｎ−アセチル化及び脱水に由来するスフィンゴシ、ン関連イオンに、質量及び相対的な多量さにおいて対応する、ｍ／ｚ２８２および２６４のフラグメントにより、より低い質量末端（ｍａｓｓ　ｅｎｄ）で特徴付けられる。セラミドイオン（Ｙ　’）は、１６二〇、１８：、１．１８：０、及び２４：１脂肪酸で最初にＮ−アシル化されたｄ１８　：　１スフインゴシンを有する組成に対応するｍ／ｚ５２０．５４６．５４８、及び６３０で最も多く見出された。これらは、ＦＡＭＥ分析（図１３）に基づき予期されたであろう。セレブロシド［ＭＨ］１に一致する小さいピークは、ｍ／ｚ７９２　（ｄ１８　：１スフインゴシン及び２４：１脂肪酸を有するＨｅｘ・Ｃｅｒに相当）に観察された。シュードモレキュラーイオン［ＭＨ］　の第１のグループは、ｍ／ｚ９３０．９３２．９５６．９５８及び９６０に見出された。観察される偶数の質量数は、奇数の分子量に対応し、それゆえ奇数の窒素原子を含有する化合物に対応する。以前に決定されたサイコシンアセタール構造に類似して、これらのシュードモレキュラーイオン化学種は、ガラクトース部分のビシナルヒドロキシ基と環状アセタール結合で連結した長鎖脂肪アルデヒドにより修飾されたセレブロシドに相当すると仮定された。長鎖ＥＭＥｓに相当するＧＣ−ＭＳピークの分析により決定されたように（図１３）、これらのアルデヒドは、主として１６二〇、１８：１、及び１８：０化字種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であろう。観察されたシュードモレキュラーイオン多量さは、それゆえ脂質中に見出される異なる長さの脂肪酸及び脂肪アルデヒド部分の両方の比率に従った複合体分布を反映しているのであろう。例えば、最も豊富なｍ／ｚ９５６のシュードモレキュラーイオンは、ｄ１８：１スフインゴシン、１８：１脂肪酸及び１８：１脂肪アルデヒドを有するガラクトセレブロシドアセタールに相当するであろう。ｍ／ｚ９３０のイオンは、ｄ１８　：　１スフインゴシン、１８：１脂肪酸及び１６二〇アルデヒド、或いはｄ１８　：　１スフインコシン、１６：０脂肪酸及び１８：１アルデヒドに相当するであろう。クラスター中の他のイオンは、最も豊富な脂肪酸及びアルデヒド分子種の他の可能な組み合わせ（すべてｄ１８　：　１スフインゴシンを有する）を示す。該化合物がガラクトースのビシナルヒドロキシ基とアセタール結合により修飾されたセレブロシドであるという結論は、以下に記載するメチル化／結合分析により確認された。

ＧＣ−ＭＳによるメチル化分析　天然脂質のパーメチル化し、酸加水分解、還元及びアセチル化に続き、得られた部分的にメチル化されたヘキシトールアセテートは、ＧＣ−ＭＳにより分析された。

結果は、以下の図１５に示される。

図１５中、ピークはＰＭＡＡ類の１：２．３，４．６−テトラ−０−；２：２．６−ジー〇−；及び３：４゜６−ジー０−Ｍｅ−Ｇａｌと同定される。

ガラクトース上に３．４−または４，６−で結合された置換基を各々表し、脂質フラクションは、大部分は３゜４−結合の５員環、いくつかの場合には４，６− 結合の６員環を伴うセレブロシドに由来する異性体の環状アセタールから構成されなければならないことを示す。痕跡量の２．　３．　４．　６−チトラー０− Ｍｅ−Ｇａｌは、未置換セレブロシドとして検出される少ない量のシュードモレキュラーイオンに一致する。これらの結合は、以前に決定されたサイコシンアセタールの異なる成分にも見出された。アセタールのＣ−１位のキラリティー（ｃｈｉｒａｌｉｔｙ　）は、明確には決定されていない。しかしながら、それらは６員環アセクールの長鎖はエカトリアルの配向であると考えられ、５員環のこの基はシュードエカトリアルの配向であると推定される。

神経突起形成活性の測定化合物Ａ、ＢＳＣ，Ｄ及びＥの神経突起形成活性は、以前に記載されたように（１０）、神経突起の形成が神経成長因子（ＮＧＦ）またはガングリオシドに依存する種々のニューロプラスドーマ細胞株を用いて測定された。

ニューロプラスドーマ細胞株は、以前に記載されたように（１１，１２）、ゼラチンで被覆されプレート中で培養された。種々の濃度（５−１５０μＭ）の糖脂質が加えられ、神経突起形成を観察するために培養された。５０μｍより長い神経突起を形成した細胞の発生率を全集団のパーセントとしてカウントした。化合物Ａ及びＢで処理された細胞の写真を２４時間間隔で撮影した。

著しい神経突起形成が、特にＮＧＦ５０μｇ／ｍｌ濃度の存在下に、プラズマロサイコシン化合物Ａ及びＢを添加したマウス　ニューロプラスドーマ　ニューロ −２Ａ細胞で観察され；５０μｍより長い神経突起は、全細胞集団の６０−８０％を構成した。この濃度は、ガングリオシドの効果として以前に報告されたものよりもはるかに低かった。すなわち、最も効果的なガングリオシドであるＧＴｌｂは、２００μｇ／ｍｌの濃度を要求した。

ウシ脳ガングリオシドの混合物は、少なくとも１０〇−１５０μｇ／ｍｌを要求した。マウス及びヒトニューロプラスドーマを含む他のタイプの細胞は、プラズマロサイコシンにより同程度の神経突起形成の誘導を示した。

サイコシンそれ自体は、種々のニューロプラスドーマ細胞株に強力な細胞障害性効果を示した；細胞の成長は阻害され、形態は変化し、結局、細胞は１０−２０ μｇ／ｍｌのサイコシンの存在下に死亡した。サイコシンの存在下には神経突起形成は起こらなかった。プラズマロサイコシン化合物Ａ及びＢによる神経突起形成のパターンは、図９Ａ、９Ｂ及び１０に示される。

図９Ａ及び９Ｂは、５０μｇ／ｍｌのプラズマロサイコシン化合物Ａ及びＢが培養ディツシュの異なる領域に存在するときのニューロ２人細胞の神経突起形成パターンを示す。

図１０は、ニューロ−２Ａ細胞の神経突起形成におけるプラズマロサイコシンの効果を示すグラフである。横軸はプラズマロサイコシンの濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は神経突起（５０μｍを超える長さ）を形成したニューロ−２Ａ細胞のパーセントを示す。円（○および・）は、プラズマロサイコシンの上側及び中間のバンドの混合物、十及び−神経成長因子（ＮＧＦ）の結果を示す。

△は、ＮＧＦ存在下でのガングリオシドＧＭ１、ＧＤＩａ、ＧＤｌｂ、およびＧＴを含むウシ脳ガングリオシド（Ｂ　Ｂ　Ｇ）混合物の結果を示す。

図１０に示される結果は、ＮＧＦがプラズマロサイコシンで処理される細胞に添加された場合であっても、効果が見られないことを示す。従って、神経突起形成はプラズマロサイコシンのためである。

プラズマロセレブロシドは、細胞培養の初期の段階で明らかな効果を示さない。

しかしながら、１週間後には５０μｍより長い神経突起の形成は明らかに増加した。

従って、プラズマロセレブロシドは、神経突起形成活性を有する。５０μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で２週間インキュベートした後の、ニューロ−２Ａ細胞培養中の神経突起形成は、プラズマロサイコシンよりもプラズマロセレブロシドの存在下の方がより著しかった。

プラズマロサイコシンＡ及びＢは、“プラズマロサイコシンＡ及びＢの合成スキーム”　（図１６）に従い化学的に合成された。

サイコシン（合成によって製造されるか、又はウシ脳から抽出されたＣＭＨのアルカリ加水分解により得られた）のクロロホルムと水の混合溶液中に、９−フルオレニルメチルクロロホルメート及び炭酸カリウム（４５）を加え、反応混合物を室温で２１時間攪拌した。反応混合物を減圧下に留去した後、残渣に少量の水を加えて白色スラリーを形成した。このスラリーを事前に条件を整えたＢＯＮＤ　ＥＬＵＴ　Ｃ−１８カラムにかけ、水でリンスして、水溶性成分を除去した。

保持された親油性の化合物は、カラムをメタノールで溶出することにより回収し、溶出液を減圧下に留去してＦＭＯＣ−サイコシンを得た。生成物の、クロロホルム／メタノール９：１又はトルエン／メタノール３コ１による薄層クロマトグラフィーにより、いくつかのＵＶ陽性の不純物の存在が示され、該不純物はシリカカラム、及びトルエン／メタノール３：１又はクロロホルム／メタノール９：１を溶媒混合物として用いて除去した。精製された化合物は、８７％の収率、［ α］　＋５．１７（クロロホルム中、Ｃ１，４２）で得られ、次いでサイコシンの環状アセクールの製造に使用された。

環状アセタール形成に必要である他の反応物であるα。

α−ジメトキシヘキサデカンは、ｎ−ヘキサデカノール（アルドリッチ、ミルウォーキー、ＷＩ）から２段階で合成された：ｉ）ジクロロメタン中、ピリジニウムクロロクロメート（４６）を用いて酸化し、アルデヒドを得る、及び１１）該アルデヒドをトリメチルオルソホルメート（アルドリッチ、ミルウォーキー、ＷＩ）とＡＭＢＥＲＬＩＴＥ　ＩＲ−１２０（Ｒｏｈｍ＆ＨａａｓＣｏ、、ＰＡ）の存在下に還流して反応させる（４７）。

環状アセタールは、以下のようにして調製された。ＦＭＯＣ−サイコシンのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液に、α、α−ジメトキシヘキサデカン及びｐ−トルエンスルホン酸を加え、反応混合物を室温で１９時間攪拌した。次いで、反応混合物をトリエチルアミンで反応終了させてｐ〜トルエンスルホン酸を中和し、減圧下に留去した。残渣は、ＢＯＮＤ　ＥＬＵＴ　Ｃ−１８カラムに移し、水でリンスした。ＦＭＯＣ−サイコシンの環状アセタールに加えて他の親油性化合物が、メタノールを用いて最終的にカラムから溶出され、溶出液は減圧下に留去された。目的の環状アセタールは、トルエン／メタノール３：１溶媒を用いてシリカカラムクロマトグラフィーにより他の化合物から粗く分離された。

ＦＭＯＣ−サイコシンの環状アセタールの混合物は、次いでＦＭＯＣ保護基を除去するために３時間ピペリジン（ｐｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）で処理しく４８）、減圧下に留去した。

他の生成物からのプラズマロサイコシンＡ及びＢの分離は、イソプロパツール／ヘキサン／水のグラジェントを用いて、実施例１に記載されたようにあらかじめ平衡化された１ＡＴＲＯＢＥＡＤｓ　（１０ｕＭ）ｈラム上で達成された。

該サンプルは、クロロホルム／メタノール２：１を１００μｌ加え、超音波処理をしながら僅かに暖め、注射用に調製した。これに約１．５ｍｌのへキサンを超音波処理をしながら加えた。サンプルは、カラムにかけられ、２００分間かけて徐々にヘキサンからイソプロパツール／ヘキサン／水、３０：６９：１のグラジェントに変化させて溶出し、次いで、同じグラジェントで５０分間かけて（２００−２５０分）溶出した。グラジェントは、最後に５５　：　２５　：　２０　（２５０−４００分）に変化させ、溶出は同じグラジェントで２００分間（４００−６００分）継続した。溶出液（６分／試験管）が集められ、各フラクションはＨＰＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／ＮＨ４０Ｈ１８０：２０：２）によりチェックした。

ＨＰＴＬＣ上での同じフラクションは、−緒に蓄えられ、濃縮されてカルボキシメチル　セファデックスカラムクロマトグラフィーから得られたヒト脳のアニオン性脂質フラクションと比較した。結果は図１７に示される。レーン１はサイコシンアセタールの粗合成物であり、レーン２−５は、ＩＡＴＲＯＢＥＡＤカラム上でＨＰＬＣからの合成生成物の蓄えられたフラクションを示し、レーン６は、カルボキシメチル　セファデックスカラムから０．５Ｍ）リエチルアミンを用いて得られたヒト脳（大脳）のアニオン性脂質フラクションの総溶出物である。

プラズマロサイコシンＡ及びプラズマロサイコシンＢの上側及び中間の脂質バンドと同じフラクションは、ＮＭＲＳＦＡＢ−ＭＳ、及びＧｃ−ＭＳによるメチル化によりさらに特徴付けられ（図１８Ａ−１８Ｃ）、推定構造を確認した。図１７のレーン２及びレーン３のフラクションは、特徴付けされていない。

２　、Ｈａｎｎｕｎ、Ｙ、Ａ、及び　Ｒ，Ｍ、Ｂｅ１ｌ　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３゜３、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ、（１９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５゜４　、　Ｉｇａｒａｓｈｉ、Ｙ、　（１９９０）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉ、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ。

２、３１９−３３２５、Ｆｏｌｃｈ−Ｐｉ、Ｊ、、Ｓ、Ａｒ５ｏｖｅ、及び　Ｊ、Ａ、Ｍｅａｔｈ　（１９５１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９１．８１９−８３１６、Ｆｅｕｌｇｅｎ、Ｒ，、に、、ＩｍＭｕｓｅｒ、及び　Ｍ、Ｂｅｈｒｅｎｓ　（１９２９）Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２．１６１−１８０７、Ｋａｎｎａｇｉ、Ｒ，、Ｓ、Ｂ、Ｌｅｖｅｒｙ、及び　Ｓ、Ｈａｋｏｍｏｒｉ（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０．６４１０−６４１５８、Ｋａｎｎａｇｉ、Ｒ，、Ｓ、Ｂ、Ｌｅｖｅｒｙ、及び　Ｓ、Ｈａｋｏｍｏｒｉ（１９８４）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．８４４４−８４５１９　、Ｋａｎｎａｇｉ、　Ｒ，、Ｓ、　Ｂ、　Ｌｅｖｅｒｙ、　Ｆ、　Ｉｓｈｉｇａｍｉ、　Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｌ、Ｈ，５ｈｅｖｉｎｓｋｙ、Ｂ、Ｂ、Ｋｎｏｗｌｅｓ　及び　Ｄ、５ｏｌｔｅｒ　（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８．８９３４−８９４２１０、Ｌｅｄｅｅｎ、Ｒ，Ｗ、、Ｇ、Ｗｕ、に、に、Ｖａｓｗａｎｉ　及び　Ｍ、Ｓ、ＣａｎｎｅｌＩａ。

（１９９０）　ｉｎ　Ｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｒｒｏｃｋｓ、Ｌ、Ａ、、Ｎｅｆｆ、Ｎ、Ｈ，、Ｙａｔｅｓ、Ａ、Ｊ、、及びＨａｄ　ｊ　１ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ、　Ｍ、編）　、ｐｐ、１７−３４．　Ｒａｖｅｎ　ＰｒｅｓｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ１１、Ｃａｎｎｅｌｌａ、Ｍ、Ｓ、、Ｆ、Ｊ、Ｒｏｉｓｅｎ、Ｔ、Ｏｇａｖａ、Ｍ、Ｓｕｇｉｍｏｔ。

及び　Ｒ，Ｗ、Ｌｅｄｅｅｎ、（１９８８）Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、３９．　１３７−１４３１２、Ｃａｎｎｅｌｌａ、Ｍ、Ｓ、、Ａ、Ｊ、Ａｃｈｅｒ　及び　Ｒ，Ｗ、Ｌｅｄｅｅｎ　（１９８８）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６．３１９−３２６１３、Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ、Ｎ、に、、１．Ｇ、Ｚｈｕｋｏｖａ　及び　１．Ｓ、Ｇｌｕｋｈｏｄｅｄ（１９６３）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　７０．　７１６−７１９１４、Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ、Ｊ、Ｂ、、Ｓ、Ｒ，Ｋｏｒｅｙ、及び　Ｆ、Ｈ，Ｓｗｅｎｓｏｎ（１９５６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２１９．　３９−４７１５、Ｋｌｅｎｋ、Ｅ、、及び　Ｊ、Ｐ、Ｌ６ｈｒ　（１９６７）　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

３４８、　１７１２１６、Ｔａｍａｉ、Ｙ、（１９６８）　Ｊａｐ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、３８．　６５１７、Ｔａｍａｉ、Ｙ、、Ｔ、Ｔａｋｅｔｏｍｉ、及び　Ｔ、Ｙａｍａｋａｗａ　（１９６７）Ｊａ　、Ｊ、ＥｘｐｏＭｅｄ、３７．　７９１ｇ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、Ｙ、、Ｍ、Ｗａｊｄａ、及び　Ｎ、Ｓ、Ｒａｄｉｎ　（１９６８）２０６．３８９２１、ｌ’ｌａｋｏｍｏｒｉ、Ｓ、、Ｔ、Ｉｓｈｉｍｏｄａ、Ｈ，Ｋａｗａｕｃｈｉ、　及び１３８．１３−２５１００．４１５−４２３２５、Ｃｏｒｅｙ、Ｅ、Ｊ、、及び　Ｇ、Ｓｃｈｍｉｄｔ　（１９７９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｌｅｔｔ、　３９９−４０２２６、　Ｓｗｅｅｌｅｙ、Ｃ，Ｃ，、Ｒ，Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｍ、Ｍａｋｉｔａ、及び　Ｗ、Ｗ、Ｗｅｌｌｓ（１９６３）　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５．　２４９７−２５０７２７、Ｌａ１ｎｅ、Ｒ，Ａ、、Ｗ、Ｊ、Ｅｓｓｅｌｍａｎ、及び　Ｃ，Ｃ，Ｓｗｅｅｌｅｙ　（１９６３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、２８．１５９−１６７１３１．２０９−２１７２９、Ｌａｒｓｏｎ、Ｇ、、Ｈ，Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｇ、Ｃ，Ｈａｎｓｏｎ、及び　Ｗ、Ｐｉｍｌｏｔｔ３１、Ｂｊφｒｎｄａｌ、Ｈ，、Ｃ，Ｇ、Ｈｅ１ｌｅｒｑｖｉｓｔ、Ｂ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、及びＳ、５ｖｅｎｓｓｏｎ　（１９７０）＾ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔｌ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ。

９：　６１０−６１９３２、　Ｊａｎｓｓｏｎ、Ｐ、Ｅ、ル、Ｋｅｎｎｅ、Ｂ、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ、Ｂ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ　及び３３、Ｈｏｌｍｅｓ、Ｅ、Ｈ，、及び　Ｓ、Ｉｉ、Ｌｅｖｅｒｙ、（１９８９）＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２７４．　１４−２５３４、Ｈｏｌｍｅｓ、Ｅ、Ｈ９，及び　Ｓ、Ｂ、Ｌｅｖｅｒｙ、（１９８９）５．３９７−４０９３６、Ｄｏｍｏｎ、Ｄ、　及び　Ｃ，Ｅ、Ｃｏ５ｔｅｌｌｏ　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２７、　１５３４−１５４３３７、Ｆｅｕｌｇｅｎ、Ｒ，及び　ＧｒＧｎｂｅｒｇ、Ｈ，（１９３８−１９３９）３８、Ｈｅｍｌｉｎｇ、Ｈ，Ｅ、、Ｙｕ、Ｒ，に、、Ｓｅｄｊｗｉｃｋ　Ｄ、及び　ＲｉｎｅｈａｒｔＪｒ、、に、Ｉ、、　（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２３．５７０６−５７１３３９、Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ、Ｎ、に、、Ｚｈｕｋｏｖａ、１．Ｇ、＆　Ｇｌｕｋｈｏｄｅｄ、　１．　Ｓ。

４］、、０ｈａｓｈｉ、Ｉｗａｍｏｒｉ、Ｙ、、Ｎ、、Ｏｇａｗａ、Ｔ、及び　Ｎａｇａｉ、Ｙ、。

４３、Ｋｕｂｏｔａ、Ｍ、及び　Ｔ、Ｔａｋｅｔｏｍｉ　（１９７４）Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、４４（２）、１４５−１５０４４、Ｋｌｅｎｋ、Ｅ、、及び　Ｍ、Ｄｏｓｓ　（１９６６）Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚｓ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３４６．　２９６−２９８４５、Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｌ、Ａ、及び　Ｇ、Ｙ、Ｈａｎ　（１９７２）　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ。

３７．３４０４４６、Ｃｏｒｒｙ、Ｅ、Ｊ、、及び　Ｊ、Ｗ、Ｓｕｇｇｓ　（１９７５）４８、Ｇｏｄａｎｓｋｙ、Ｍ、、Ｓ、Ｓ、Ｄｅｓｈｍａｎｅ　及び　Ｊ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ　（１９７９）本発・明は好適な実施例を参照して詳細に記述されたが、本発明の範囲及び精神の中で種々の修飾は、当業者には明らかである。従って、本発明は添付のクレームの範囲によってのみ制限されると考えられるべきである。

ＦＩＧ、　１８特表十〇−５０９３５４（２８）相　対　量　相　対　量ＩＱ　ＩＩ　１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　２３　２４　２５ＦＩＧ、　８ＡＦＩＧ、　８ＢＦＩＧ、　８ＣＦＩＧ、　８ＤＦｆＧ、１１ＦＩＧ、　１２ＦＩＧ、　１７ＦＩＧ、　１８Ａフロントページの続き（７２）発明者　ハコモリ　センイチロウアメリカ合衆国　９８１１９　ワシントン　シアトル　エリオツド　アベニュ　ウェスト２０１　ザ　バイオメンブレン　インスティテユート内（７２）発明者　レベツー　ビー、ステイーブンアメリカ合衆国　９８１１９　ワシントン　シアトル　エリオツド　アベニュ　ウェスト２０１　ザ　バイオメンブレン　インスティテユート内（７２）発明者　イガラシ　ャスユキアメリカ合衆国　９８１１９　ワシントン　シアトル　エリオツド　アベニュ　ウェスト２０１　ザ　バイオメンブレン　インスティテユート内（７２）発明者　サドザイ　カリドアメリカ合衆国　９８１１９　ワシントン　シアトル　エリオツド　アベニュ　ウェスト２０１　ザ　バイオメンブレン　インスティテユート内

Claims

【特許請求の範囲】

１．化合物Ａ及び化合物Ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｂ）［式中、ｎ１は０より大きな数である］及びその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、単離されまたは合成されたプラズマロサイコシン。
２．化合物Ａである請求項１に記載の単離されまたは合成されたプラズマロサイコシン。
３．化合物ＡのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項２に記載の単離されまたは合成されたプラズマロサイコシン。
４．化合物Ｂである請求項１に記載の単離されまたは合成されたプラズマロサイコシン。
５．化合物ＢのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項４に記載の単離されまたは合成されたプラズマロサイコシン。
６．化合物Ｃ及び化合物Ｄ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｄ）［式中、ｎ２およびｎ３は、各々０より大きな数である］及びその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、単離されまたは合成されたプラズマロセレブロシド。
７．化合物Ｃである請求項６に記載の単離されまたは合成されたプラズマロセレブロシド。
８．化合物ＣのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項７に記載の単離されまたは合成されたプラズマロセレブロシド。
９．化合物Ｄである請求項６に記載の単離されまたは合成されたプラズマロセレブロシド。
１０．化合物ＤのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項９に記載の単離されまたは合成されたプラズマロセレブロシド。
１１．化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄ：▲数式、化学式、表等があります▼（Ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｄ）［式中、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、各々０より大きな数である］並びにその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、１種またはそれ以上のプラズマロサイコシン及び／又はプラズマロセレブロシド；及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む神経細胞疾患及び組織障害の治療用組成物。
１２．プラズマロサイコシンが化合物Ａである請求項１１に記載の組成物。
１３．化合物ＡのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項１２に記載の組成物。
１４．プラズマロサイコシンが化合物Ｂである請求項１１に記載の組成物。
１５．化合物ＢのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項１４に記載の組成物。
１６．プラズマロセレブロシドが化合物Ｃである請求項１１に記載の組成物。
１７．化合物ＣのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項１６に記載の組成物。
１８．プラズマロセレブロシドが化合物Ｄである請求項１１に記載の組成物。
１９．化合物ＤのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項１８に記載の組成物。
２０．化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄ：▲数式、化学式、表等があります▼（Ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｄ）［式中、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、各々０より大きな数である］からなる群から選ばれた、１種またはそれ以上のプラズマロサイコシン及び／又はプラズマロセレブロシドの有効量を神経細胞に接触させることを含む神経細胞からの神経突起の形成方法。
２１．プラズマロサイコシンが化合物Ａである請求項２０に記載の方法。
２２．化合物ＡのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項２１に記載の方法。
２３．プラズマロサイコシンが化合物Ｂである請求項２０に記載の方法。
２４．化合物ＢのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項２３に記載の方法。
２５．プラズマロセレブロシドが化合物Ｃである請求項２０に記載の方法。
２６．化合物ＣのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項２５に記載の方法。
２７．プラズマロセレブロシドが化合物Ｄである請求項２０に記載の方法。
２８．化合物ＤのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項２７に記載の方法。
２９．化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄ：▲数式、化学式、表等があります▼（Ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｄ）［式中、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、各々０より大きな数である］；並びにその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた、１種またはそれ以上のプラズマロサイコシン及び／又はプラズマロセレブロシドの生物学的有効量を治療を必要とする宿主に投与することを含む神経細胞疾患及び組織障害を治療する方法。
３０．プラズマロサイコシンが化合物Ａである請求項２９に記載の方法。
３１．化合物ＡのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項３０に記載の方法。
３２．プラズマロサイコシンが化合物Ｂである請求項２９に記載の方法。
３３．化合物ＢのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項３２に記載の方法。
３４．プラズマロセレブロシドが化合物Ｃである請求項２９に記載の方法。
３５．化合物ＣのアセタールＣ１位のキラリティーがエカトリアル配向である請求項３４に記載の方法。
３６．プラズマロセレブロシドが化合物Ｄである請求項２９に記載の方法。
３７．化合物ＤのアセタールＣ１位のキラリティーがシュードエカトリアル配向である請求項３６に記載の方法。