JPH06509479A - 血小板活性の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板活性の測定 本発明は、血液凝固における血小板の活性を測定する方法に関する。より具体的 には、本発明は、全血中の血小板の凝固促進活性を測定するための色素原アッセ イに、休止活性及び／又は血小板の易興奮性の測定のための方法（それは今度は 、活性化している凝固因子が危険もたらし得るところである、閾値を決定する） に、そして血小板の活性化に対して潜在的な阻害効果の有無について薬物をスク リーニングする方法に関する。 発明の背景 止血すなわち血流の停止は、凝固及びフィブリン溶解という２つの過程よりなる 精密に均衡のとられたシステムの乱れであることを示すことができる。通常の環 境下においては、血液は液体状態のままであるが、もし血管の損傷が生じたり又 はもしある種の異常な生理学的状態が発現すると、これらの過程の一方又は双方 の定常状態が乱されて、止血が起こる。 血液凝固には、血液及び組織に見出される、あるものは凝固を促進しく「凝固促 進物質」）そして他のものは凝固を阻害する（［抗凝固物！Ｊ）、５０を超える 重要な物質が関与している。血液が凝固するか否かは、これらの２つの群の物質 量の均衡の度合いに依存する。健康な個体においては、抗凝固物質が通常優勢で あり、血液は液体状態のままである。ストレスを受けている個体は、すなわち、 内因性に損傷された血管を有する個体、そして特にある種の異常な生理学的状態 を有する個体においては、冒された領域における凝固促進物質が「活性化され」 て抗凝固物質を凌駕しトロンビンの生成をもたらし、それが今度は血餅又は血栓 の発生をもたらす。血栓は、血液諸両分、主として細胞要素を捕捉した血小板及 びフィブリンの凝集体であり、しばしばその形成地点において障害となる。 血液凝固又は凝血は、３つの本質的段階を経て起こるという点では一般に意見の 一致を見ている。第１に、例えば、血管の破裂又は血液自身に加わった損傷に応 答してプロトロンビン・アクチベーターと呼ばれる物質複合体が形成される。第 ２に、このプロトロンビン・アクチベーターは、プロトロンビンのトロンビンへ の変換を触媒する。第３に、トロンビンは、血小板を活性化させるための、及び フィブリノーゲンを、血小板、血球及び血漿をからませて血餅自身を形成するフ ィブリン繊維へと変換するための酵素として働く。 血小板は、血液凝固において非常に重要な役割を演する。その役割は二重であり 、それらは凝集体を形成し、そしてそれらは凝固促進性のリン脂質、すなわち負 電荷を持ったリン脂質を提供する。凝集体は、２つの機能をもった初期の栓とし て働く。一つには、出血を短い時間阻止することができるという機能と、トロン ビンが蓄積することのできる流れていない血漿のだめのスポンジ又は窪みとして 働く機能とである。この蓄積されたトロンビンは、今度は、種々の方法によって 凝血機構を活性化させるが、しかし重要なことに、それはまた血小板をも活性化 させる。 トロンビンは、第Ｘａ因子によるプロトロンビンの活性化によって形成される。 第Ｘａ因子は、第１Ｘａ因子による第Ｘ因子の活性化によって形成される。画情 性化反応は、凝固促進性のリン脂質の不存在下では遅い。リン脂質の膜は、十分 量の負電荷をもったリン脂質（大半がホスファチジルセリンである）が存在する ときのみ、凝固促進性である（Ｂｅｖｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　１２２：４２９−４３６　（１９８２）、この開示は参照によ りここに導入する〕。休止血小板の外側リーフレットは殆と全くホスファチジル セリンを含まない。従って、その膜は殆と又は全く、凝固促進性でない。血小板 が活性化されると、膜の内側リーフレットに存在するホスファチジセリンが外側 リーフレット中に露出される。これは、所謂フリップフロップ反応であり、この 過程によって、血小板は凝固促進性となる。 血小板は、自然の活性化物質であるトロンビン及びコラーゲンによってのみなら ず、カルシウム・イオノフオアＡ２３１８７　（Ｂｅｖｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、 上記）、ジアミド（Ｖａｎ　Ｒｉｊｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１３３：１−１０　（１９８３））及びセロトニン（Ｚｕｃｋｅｒ　 ａｎｄ　Ｎａｃｈｔｍｉａｓ、　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、　５：２ −８　（１９８５す、エピネフリン、血小板活性化因子、アデノシンニリン酸等 の、数種の他の成分によっても活性化される（Ｒａｐａｐｏｒｔ、［ｎｔｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ　ｆｏ　ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ：　４４０−４４８を見よ）。血 小板かトロンビンによって活性化されることから、この化合物は、それ自身の生 成を効率化する。凝固促進性リン脂質の他に、補因子である第Ｖａ因子及び第Ｖ ｌ１１因子が、それぞれプロトロンビン及び第Ｘ因子の最適な活性化に必要であ る。これらの補因子は、痕跡量のトロンビンによる第Ｖ因子及び第Ｖｌ１１因子 の活性化によって形成される。従って、この方法でもまた、トロンビンはそれ自 身の形成を促進する。最初の２．３の分子である第Ｖ因子及び第Ｖ［［＋因子が いかにして活性化されるか、といことは、依然推測の域を出ない。 上記のように、あらゆる種類の血漿阻害物質がこれらの凝血因子を不活性化して いることから、全血中の活性化された凝血因子のレベルは、通常、低い。ある閾 値より下では、これらの活性化された因子は有害ではない。休止血小板は、ホス ファチジルセリンを膜の外側リーフレットから内側リーフレットへと輸送する機 構を有するため、全血中の凝固促進性リン脂質の量もまた低い。おそらく、少量 のホスファチジルセリンが依然、外側リーフレットに存在し、血小板の残存する 凝固促進活性の原因となっている。この残存又は「休止活性」が、活性化された 凝血因子が血栓症を起こし得るところである、閾値を確立している。こうして、 個体の血栓症になり易さは、その者の血小板の凝固促進活性のレベルと非常によ く相関付けることができる。 ヒトにおけるトロンビンの生成のアッセイのための従来の方法は、常に臨床条件 であり、従って疾患の診断及び治療の問題である（Ｒａｐａｐｏｒｔ、Ｉｎｔｒ ｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　：５５８−５７６を見よ） ０トロンビンの生成をアッセイするための従来の方法は、大半の場合、多数の変 形のうちのいずれかにおけるプロトロンビン時間のような、血液凝固時間の評価 である。これらは、外的リン脂質が添加されることから、血小板の凝固促進活性 の情報を与えない。全血の凝固時間は、非常に大きい実験誤差を示し、ヘマトク リット凝血因子、血小板及び線溶現象に同時に依存する。血小板リッチ血漿にお けるトロンビン生成試験のような特殊化した試験室試験は、一層正確であるが、 熟練した試験室要員で少なくとも半時間かかり、集団又は病院のルーチンには適 さない。 従って、血小板の外側膜における負電荷を帯びたリン脂質の利用性に基づいて休 止血小板の凝固促進活性を測定するための方法を確立することが望ましい。これ は、それより上であれば血栓症の発生の危険性があることを予測できるような、 閾値を確立することを容易にするであろう。更に、そのような試験はまた、トロ ンビンの活性化作用に対する血小板の感受性を評価する上でも有用であろう。 例えば、ある血小板は他の血小板よりもトロンビンの活性化作用に対して一層感 受性である、ということが見出されている。これは、血小板の膜組成に、膜の流 動性に又は血小板阻害物質の存在に関係しているかもしれない。容易に刺激され る血小板は、より高い血栓症の危険性をもたらがも知れず、従って、予防的治療 方法を正当化するかも知れない。例えば、血小板の膜における負電荷を帯びたリ ン脂質のフリップフロップ効果を阻害する薬物をスクリーニングするための方法 を得ることもまた望ましいであろう。そのような試験は、血小板の易興奮性を減 少させるための薬物を開発するのに使用でき、それにより患者の血栓症の危険性 を減少させよう。最後に、血小板の単離は時間浪費的であって臨床的使用には直 ちに適用できないため、医療／臨床家が全血中の凝固促進性のリン脂質を測定す るための方法を得ることが望ましいであろう。更に、血小板の単離には、血小板 の活性化という重大な危険性が存在する。 発明の要約 本発明によれば、トロンビンに基づく本質的な３つの血液凝固のフィードバック 機構のうちの一つ、すなわち血小板の凝固促進活性の発生を測定するための、迅 速且つ単純な試験が提供されている。 この試験は、血小板の外側膜に露出している凝固促進性のリン脂質の量に基づい ている。外側膜境界に存在する凝固促進性のリン脂質の量は、血小板の休止活性 、血小板の易興奮性、並びに全血中の血小板の凝固促進活性を測定するための試 験を開発するために使用できる。凝固促進性リン脂質のフリップフロップ反応は また、外側膜における凝固促進性のリン脂質の存在を測定する能力と合わせて、 例えば、該フリップフロップ反応を阻害する薬物の評価のための基礎を提供する 。 より具体的には、単離された血小板、血小板リッチ血漿又は全血における、凝固 促進性リン脂質の量を測定するためのアッセイが提供されている。−具体例にお いては、血液サンプル又は血小板リッチ血漿は、例えば食塩水によって、希釈さ れる。この希釈されたサンプルは、プロトロンビンのような、凝固促進性のリン 脂質に依存性である酵素（−複合体）によって活性化されることのできる基質と 混合される。次いで、該酵素、補酵素及び必要な陽イオン（例えば第Ｘａ因子、 第Ｖａ因子、及びＣａＣ１ｚ等）の添加によって、活性化反応（例えばプロトロ ンビン活性化のような）が血液又は血漿中の凝固促進性のリン脂質の量に直線的 に依存するものである、反応系が作られる。 別の一具体例においては、上記のアッセイの変形が、血小板の休止活性及び／又 は易興奮性を確立するために使用できる。血小板の休止活性及び／又は易興奮性 は、血栓症の危険性のある者を決定するのに使用できる。同様に、上記の方法の 修正により、アッセイが、血小板の易興奮性を低下させ及び／又は凝固促進性の リン脂質の存在を、そのような活性が血栓症に至る一連の出来事をもたらし得る ものである、閾値レベルより、下へと低下させる薬物をスクリーニングするのた めに使用できる。 図面の簡単な記述 図１は、凝固促進性リン脂質の濃度の関数としてのトロンビン生成の速度を示す 。 図２Ａ及び２Ｂは、それぞれ１．０ＢＭ及び０．１ＢＭの凝固促進性リン脂質濃 度において、トロンビン生成に対する、第Ｘａ因子及び第Ｖａ因子の増大する濃 度の効果を示す。 図３は、第Ｘａ因子、第Ｖａ因子、ＣａＣ１ｘ及びプロトロンビンの反応混合物 中における、トロンビン生成に対する血小板濃度の効果を示す。方法については 本文を見よ。血小板（３，５５Ｘ１０”個／ｍｊ７）は、１０回（−０−）、５ 回（−−）、２回（−口−）希釈及び無希釈（−一）とした。曲線は、式　ｙ＝ ａｘ３＋ｂｘ２＋ｃｘ＋ｄでシミュレートしてあり、ここにｙは生成されたトロ ンビンでありＸは反応時間である。この方程式の導関数は図３Ｂにプロットしで ある。 図４は血小板の凝固促進活性に対する音波エネルギー処理の効果を示す。血小板 （３，４４ＸＩＯ’個／ｍｌ）を５分間６μピークピークにて音波エネルギーに 付した。３００μｌの無処理の（−〇−）血小板（３，４４ＸＩ０７個／ｍｌ） 又は音波エネルギーに付した血小板（−図５は、血小板の凝固促進活性に対する 、トロンビン並びにトロンビン及びＣａＣＩ　２の効果を示す。血小板（１，７ ２Ｘ　１０’個／　ｍ　ｌ　）を、無処理としく一〇−）、３．３ＢＭのトロン ビンと共に（−一）、又は３．３ＢＭのトロンビン及び２ｍＭのＣａＣｌ　２と 共に（−口−）インキュベーションした。更なる手順は図１に記述されている。 図５Ｂは、図５への導関数である。 図６は、血小板の凝固促進活性に対するトロンビン、コラーゲン、並びにトロン ビン及びコラーゲンの効果を示す。血小板（１，６２Ｘ１０’個／　ｍ　ｌ　） を、無処理としく−０−）　、４．０　ｎＭのトロンビンと共に（−−）、１Ｂ ｇ／ｍｌのコラーゲンと共に（−ロー）、又は４．０ＢＭのトロンビン及び１Ｂ ｇ／ｍｌｌのコラーゲンと共に（−−）インキュベートした。更なる手順は既に 記述しである。 線は三次のシミュレーションである。図６への線の導関数は図６Ｂに与えられて いる。 図７は、血小板の凝固促進活性に対するトロンビンインキュベーションの効果を 時間を追って示す。血小板（ＩＸＩＯ”個／　ｍ　ｌ　）を、無処理としく−０ −）　、又は４ＢＭのトロンビンと共に、１５（−図８は、血小板の凝固促進活 性に対する音波エネルギー処理又はカルシウムイオノフオアＡ２３１８７処理の 効果を示す。血小板（１，５Ｘ１０”個／ｍＩりを、無処理としく−０−）　、 又は血小板（３Ｘ１０＠）を６μピーク・ピークにて５分間音波エネルギー処理 しくｍ−）、又はｌμＭのカルシウムイオノフオアＡ２３１８７と共に５分間イ ンキュベートした（−一）。音波エネルギー処理及びイオノフオア処理において は、見出されたトロンビン生成の速度は約５０倍になっていた。図８Ｂは、図８ への導関数を与える。 図９〜Ｉ６は、健康なボランティアの身体運動の前後の全血の凝固促進活性の測 定結果を示す。 図１７〜１８は、血栓症患者の全血の凝固促進活性の測定結果を示す発明の詳細 な記述 低能度の凝固促進性リン脂質の測定 本発明によるアッセイの開発における第１段階は、負電荷を帯びた少量のリン脂 質を測定する試験を確立することである。そのような凝固促進性のリン脂質の活 性を正確に測定するためには、凝固促進性のリン脂質の濃度に直線的に依存し且 つ少量のリン脂質を検出することのできるアッセイを有することが好ましい。負 電荷を帯びたリン脂質をの量を測定するためには、そのようなリン脂質に依存す る酵素反応が必要である。そのような反応の例は、完全な第Ｘ因子活性化複合体 及び完全なプロトロンビナーゼである。やはり使用できる他の反応系としては、 不完全な第Ｘ因子及びプロトロンビン活性化混合物（第Ｖｌｌｌａ因子及び第Ｖ ａ因子をそれぞれ欠いている）か含まれる。第Ｘ因子活性化複合体の最適の活動 のためには、第１Ｘａ因子及び第ＶＩＩｌａ因子が必要であるが、これに対し、 完全なプロ）・ロンヒナーゼのためには第Ｘａ因子及び第Ｖａ因子が必要である 。第Ｖ［Ｉ［ａ因子は、未だ知られていない理由から血漿中で不安定であること が観察されているため、完全なプロトロンヒナーゼの成分を用いるのが好ましい 。 凝固促進性の少量のリン脂質を測定するためのアッセイは、次の通りにして行う ことができる。 試薬Ａ及び試薬Ｂの、２種の混合物が調製される。試薬Ａは、例えは、第Ｖａ因 子、第Ｘａ因子及びＣａＣ１ｚを含有し、一方試薬Ｂは、プロトロンビンを含有 する。アッセイの実施のための一つの好ましいアプローチは、試薬へにリン脂質 を添加しくこれにより完全なブロトロンビナーゼの全ての成分を与え）、次いで プロトロンビン及び適当な色素原性基質を添加することによってプロトロンビナ ーゼの活性を測定する。第Ｖａ因子の量としては、通常０．２μＭと８μＭとの 間で使用できるが、より好ましくは０．６μＭと３μＭとの間である。第Ｘａ因 子については、これらの数はほぼ同じであるが、しかし第Ｖａ因子と第Ｘａ因子 との比率はｌと２との間であるべきである。ＣａＣＩ　ｔの量としては、通常２ ｍＭと４０ｍ　Ｍとの間で使用できるが、より好ましくは４ｍＭと８ｍＭとの間 である。プロトロンビンの量としては、通常０．６μＭと２４μＭとの間で使用 できるが、より好ましくは２μＭと１２μＭとの間である。 表１はあるアプローチの結果を示し、そこでは、ｉ）試薬Ａが２４０ｐＭの第Ｘ ａ因子と１５ｍ　ＭのＣａＣＩ　ｔて調製されており、 ｉＩ）試薬Ｂが６μＭのプロトロンビンを含有し、１ｉｉ）　リン脂質原液濃度 は、表１に示された濃度に希釈される、３ｍＭ（ホスファチジルコリンが７５　 ｍｏ１％及びホスファチジルコリンが２５　ｍｏ１％）であり、そしてｉｖ）ピ ペッティング方法は、１００μｌの試薬Ａを１００μｌのリン脂質と混合し次い で３７°Ｃにて５分間インキュベーションし、その後１００μｌの試薬Ｂが添加 される。１００μｌのサンプルが採取され、２及び４分の反応時間の後、停止緩 衝液（８８０μｌの１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ）　、色素原性基質及び４０５μｍ又 は３９６μｍにおいて正確に測定することのできる分光光度計のような光学的分 析器を用いて、生成したトロンビンが測定される。 図１は、トロンビン生成速度が、反応混合物中０．４μＭまではリン脂質濃度に 対して直線的であることを示しており、これはサンプル中の１．２μＭまでのリ ン脂質が正確に測定できることを示している。より高いり〕ノ脂質濃度を測定す るためには、サンプルを希釈するか又は一層少量のサンプル（例えば２０μＩり を添加し、そうすることにより、リン脂質の量を減少させなければならない。　 、生成したトロンビンは、色素原性基質（この場合、３２２３８　）の加水分解 速度（ｍΔＡ／分）に比例する。比例定数は、基質そのもの、基質の濃度及び並 びに使用した緩衝液のｐＨ及び塩類強度に依存する。一定の塩類強度及びｐＨて 試験し、且つ一定の基質濃度を用いることにより、この数は一定でとなる。この 特定の例においては、モの数は０．０１１４である。 表１ リン脂質の濃度の関数としての完全なプロトロンビナーゼ複合体の活性。トロン ビン生成速度の計算のためには、ただ２つの少量サンプルのみが使用された。 第Ｖａ因子及び／又は第Ｘａ因子の濃度を増大させることは、形成されるトロン ビン量を増大させる（表［［を見よ）。具体的には、試薬Ａは、０．２４μＭ、 　０．４８ｈＭ、　０．７２μＭ、　０．９６μＭ及び１．２μＭの第Ｘａ及び 第Ｖａ因子をもって調製され、次いでｌμＭ（図２Ａ）のリン脂質と０．１　μ Ｍ（図２Ｂ）が測定された。 表１１は、述べた条件下において、トロンビン生成速度か酵素複合体濃度に依存 しておりそしてこの濃度が、添加した凝固促進性リン脂質の量にのみプロトロン ビン活性化が依存するような反応系を得るためには、好ましくは一定に維持され なければならないということを示す。できるだけ高い信号を得るためには、０． ２μＭと４．０ｎＮ１との間、好ましくは約１．２μＭの酵素複合体濃度を使用 すべきである。これは、特に、全血中の凝固促進性リン脂質の濃度（通常低いも のである）を正確に測定することを望む場合には、重要である表１１ ブロトロンビナーゼによるリン脂質測定。種々の量の第Ｘａ及び第Ｖａ因子を含 む。Ａ、リン脂質濃度は１ｎＭである；Ｂ、リン脂質濃度は０．１ｎＭである。 表１１の結果は、図２にプロットされている。第Ｘａ及び第Ｖａ因子の濃度を０ ．２４ｍ　Ｍから１．２ｍＭへ増大させることにより（図２を見よ）、低い酵素 （−複合体）濃度においては反応速度は酵素（−複合体）濃度に直線的に依存す ることから予測できるように、トロンビン生成速度は約１０倍に増大すると結論 づけることができる。図２は、約１ｎＭより上の濃度においては、トロンビン生 成速度は水平になりつつあることを示している。この効果は、１ｎＭ（図２Ａ） 及び０．１ｎＭ（図２Ｂ）のリン脂質の両方において示されており、このことは 、これらの濃度においては、全てのリン脂質がプロトロンヒナーゼ複合体に結合 しているか又は他の過程が律速的となること（拡散）を意味するものであろう。 図２は、０．０１ｎＭという低濃度のリン脂質が測定できることを示している。 血小板中の凝固促進活性の測定 血小板の休止活性及び／又は易興奮性を測定するための方法を開発するために、 記述した方法が単離された血小板に対しても働くことを実証することができる。 血小板の凝固促進活性はこれらの負電荷を帯びたリン脂質のためであることこと から、単離された血小板の凝固促進活性は、凝固促進性リン脂質の等価なモル量 として表現することができる。 血小板は、被験者／患者血液からゲル濾過により（Ｌａｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ。 、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　８５：８１１−８２５　（１９ ７５）を見よ。〕又は遠心〔Ｂｅｖｅｒｓ　ｅｒ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７３６：５７−６６　（１９８３）を見よ〕 によって単離することができる。濃度（個／　ｍ　ｌ　）は、それらの吸収を４ ０５ｎｍにおいて測定することにより決定される。一旦血小板が単離されれば、 凝固活性は、小濃度のリン脂質を測定するための上述の方法に従って測定するこ とができる。 ａ）血小板濃度の影響 それらの濃度の関数としての血小板の凝固促進活性は、次の通りにして測定でき る。２種の試薬、Ａ及びＢが準備される。試薬Ａは、２４０ｐＭの第Ｖａ因子、 ２４０ｐＭの第Ｘａ因子及び１５ｍＭのＣａＣ１２を含む。試薬Ｂは、６μＭの プロトロンビンを含む。この実験において、血小板濃度は３．４４Ｘ１０”個／ ｍｌである。 ピペッティング方法：３００μｌの試薬Ｂを３００μｌの希釈された血小板と混 合する。３７°Ｃにおける５分間の予備インキュベーションの後、生成したトロ ンビンを測定するために、３００μ！の試薬Ａを加える。１００μｌのサンプル を０．５．　１．１．５，２．２．５，３．３．５及び４分の反応時間後に採取 する。セル内に、８８０μｌの停止緩衝液（１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ）、１００μ ｌのサンプルをピペットし、そして生成したトロンビンを測定するために２０ｕ ｌ！の５２２３８　（ＡＢ　Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｓｔｏｃｋ ｈｏｌｍ、スウェーデン）をピペットする。表ＩＩＩに、トロンビン生成に対す る血小板濃度の影響を示す。対照としては、活性は、添加されたサンプル中の１ １．ｔＭのリン脂質（ホスファチジルセリン２５モル％−ホスファチジルコリン ７５モル％）によって与えられる。得られた加水分解速度は、】及び２分後にお いて、それぞれ３７５．６３及び７８５．６７ｍΔＡ／分である。 図３は、トロンビン生成速度に対する血小板濃度の影響を示す。 図３Ａは、得られたデータを示す。線は、生成したトロンビンの量が三次方程式 に乗るという仮定の下に引かれている。導関数（各時点におけるトロンビンの生 成速度）は、図３Ｂにプロットされている。トロンビンの生成速度が、時間を追 って増大していること及び曲線の形状が各希釈について同じであることが観察さ れる。トロンビンの生成速度（血小板の凝固促進活性の尺度である）は、血小板 濃度に比例している。このことは、血小板あたりの凝固促進活性を測定するため には、一定の血小板濃度にて試験しなければ（又は補正しなければ）ならないこ とを示している。 表１１１ トロンビン生成速度に対する血小板濃度の影響。血小板の凝固促進活性について 測定されており、及び、トロンビン生成速度に対する血小板の音波エネルギー処 理の影響が示されている。 この理由で、測定された凝固促進活性は、血小板カウント（血小板の量）一種々 の方法によって測定できる−につき補正されなければならない。 ｉ）単離された血小板の４０５１ｍにおける光学濃度が測定されるが、それは血 小板濃度と比例する。 ｌｌ）血小板は、血小板カウンター中でカウントされる。単離された血小板及び 全血中の血小板の双方ともがカウントできる。 ｌ目）血小板は、カルシウムイオノフオアＡ２３１８７による処理によって完全 に活性化でき、それは両方の膜にわたってリン脂質を（従ってまたホスファチジ ルセリンをも）ランダム化する。リン脂質組成は実質的に一定であるため、最終 的な凝固促進活性は、血小板の量のみに依存するであろう。 ｂ）血小板の音波エネルギー処理 表■及び図４には、凝固促進活性に対する血小板の音波エネルギー処理の影響が 示されている。見られるように、活性の極度に大きな増大が得られ、それは本試 験システムが非常に高い凝固促進活性でさえも測定するのに良好な道具であるこ とを示し、そして先に得られていたデータを確証している。 Ｃ）血小板に対するトロンビンの影響 血小板の凝固促進活性は、前と同様に、上記と同じ試薬を用いて行われる。この 場合においては、しなしながら、血小板はトロンビンと共に予備インキュベーシ ョンされる。表■には、トロンビンとの、並びにトロンビン及びＣａＣ１＊との 、予備インキュベーションの影響が示されている。 図５は、３．３ｎＭのトロンビンによる血小板の前処理が、トロンビン生成に促 進的な効果を有することを示している。トロンビン（３，３ｎＭ）とＣａＣＩｚ 　（Ｉ　ｍＭ）とが存在するときは、この促進的効果は幾分大きい。 表１■ 血小板の凝固促進活性に対する、トロンビン並びにトロンビン及びＣａＣｌ　ｔ の影響。血小板は、図５に示した通りに処理された。 この結果は、既に得られたデータを確証しており、従って、開発されたこのアッ セイシステムは、トロンビン誘導活性化に対する血小板の感受性の測定のための 良好な道具である。 ｄ）血小板に対するトロンビン＋コラーゲンの影響この実験においては、血小板 の凝固促進活性に対するトロンビン＋コラーゲンの影響が研究される。この活性 は、上述したのと同じ方法で測定される。対照としては、１ｇＭのリン脂質がこ のアッセイシステムにおいて試験される。得られた加水分解速度は、１分及び２ 分の反応時間後において、それぞれ３９０．９６及び７４１．７１　ｍＡ／分て あった。血小板濃度は、１．６２ＸＩＯ’個／ｍｌである。 表Ｖにおいては、時間を追った再サンプリングとトロンビン生成速度の追跡によ るプロトロンビナーゼ・アッセイの間の血小板の凝固促進活性が追跡された。表 ■においては、２つの実験が示されている。すなわち、ｉ）トロンビン生成に対 する血小板の音波エネルギー処理の影響、及びｉｉ）　ｌ−ロンビン、コラーゲ ン並びにトロンビン及びコラーゲンによる前処理の影響、である。 表Ｖ 対照　音波処理　Ｆｌｌａ　コラーゲン　ＦＩ　Ｉａ＋コラーゲン４　５７０． ３６　５３２．７３　６６２．４３　７６３．８１　１０８２．６９血小板の凝 固促進活性に対する音波エネルギー処理（血小板は１０倍希釈される）、トロン ビン、コラーゲン、トロンビン及びコラーゲンの影響。対照もまた示されている 。 これらの実験は、前の知見を確証しており、それにより、開発されたこのアッセ イシステムが、血小板の凝固促進活性を測定するための良好な道具であることを 示している。 ｅ）血小板の、トロンビンとの時間を追ったインキュベーションこの実験におい ては、時間を追った、トロンビンによる血小板の処理の影響が研究されている。 この試験システムは既に述へである。対照としては、ＩＭのリン脂質が試験され 、１分及び２分の後、それぞれ２８１．８６及び５４７．３８　ｍＡ／分の加水 分解速度を与えている。原液血小板濃度はｌＸｌ０＠個／ｍｉ７であった。 この実験においては、血小板は、４ｎＭのトロンビンと共に時間を追ってインキ ュベートされ、それらの凝固促進活性は、１５．６ｏ及び１８０分のインキュベ ーションの後に測定された。表■に結果を示す。 結果を図７にプロットする。血小板（４ｎＭのトロンビンと１５分間インキコベ ートされる）が、対照血小板より多くの凝固促進性リン脂質を露出させているこ とが認められる。血小板の凝固促進活性は、最初の１５分間のインキュベーショ ン時間の後、徐々に増大している。最初の１５分後における凝固促進活性のこの 増大はトロンビンの影響によるのではなく、血小板の老化によるものである。 これは、もし最大の識別を得んとするなら、この試験は、好ましくは新鮮なサン プルについて実施されるべきであることを示している。 表■１ ０．５　２．５１　１５．５９　１５．６８　１７．１９１　６．８６　２９． ５４　３０．６１　３９．５７１．５　１５．０２　５９．５９　５ｇ、９９　 ７５．５７２　２５．４６　９０．２１　９６．３８　１２３．６０２．５　４ ０．３７　１３５．６５　１４２．２７　１７９．４３３　５９．９４　１８８ ．０３　１９７．５８　２５４．３８３．５　８２．９３　２４８．９０　２６ １．６３　３２６．１７４　１１２．４６　３２４．０９　３３９．５１　４０ ７．４４４ｎＮ１のトロンビンて１５．６０及び１８０分間処理した後の血小板 の凝固促進活性。 ｆ）カルシウムイオノフオアＡ２３＋８７の影響この実験においては、血小板は 、ＩＭのＡ２３１８７　（イオノフオアの概説及びＡ２３＋８７の構造式につい ては、Ｐｒｅｓｓｍａｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４５： ５０１−５３０　（１９７６）を見よ。本試薬は、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−Ｈｏ ｅｃｈｓｔ、　ＵＳＡより入手した）で処理され、続いて凝固促進活性が測定さ れた。音波エネルギー処理血小板と対照血小板とについて比較がなされた。血小 板の凝固促進活性を試験するための先に記述した方法か使用される。血小板濃度 は１．５　ＸＩＯ”個／ｍｌである。 表ＶＩ［及び図８には、血小板の音波エネルギー処理の影響、血小板のカルシウ ムイオノフオアＡ２３１８７　（ＩＭ）による処理の影響及び対照が示されてい る。いずれの処理も、凝固促進活性の極度に大きな増大を引き起こす。 表Ｖ１１ 無処理　音波処理　Ａ２３＋８７ 対照の血小板、音波エネルギーで処理した血小板及びカルシウムイオノフオアＡ ２３１８７（Ｉ　Ｍ）で処理した血小板の凝固促進活性。音波エネルギーで処理 した血小板又はＡ２３１８７で処理した血小板については、測定前に５０倍希釈 された。 上記より、血小板は、トロンビンによる処理によっである量増大されることので きる低い凝固活性を有することが見て取れる。トロンビン＋コラーゲンによる処 理は、この活性を一層増大させる。血小板をカルシウムイオノフォアＡ２３１８ ７と共にインキュベーションすることにより、極度に大きな凝固促進活性が現れ 、それは血小板の音波エネルギー処理によって現れる活性と同等である。 以下に一層詳細に論するように、これは血小板の休止活性及び／又は易興奮性を 測定するためのアッセイを開発するための基礎を提供し、そしてまた、血小板膜 のフリップフロップ機構を阻害することによって血小板の凝固促進活性を例えば 妨害し又は阻害する薬物をスクリーニングすることを許容する。 血小板の休止活性の測定のための方法 血小板休止活性は、血栓症傾向の一指標であると信じられている。 休止している血小板の凝固促進活性が高いほど、活性化された凝血因子が血液凝 固を引き起こすであろう点である、閾値が低い。 一般に、アッセイは、血小板を活性化されていない状態に維持するため、血小板 の活性化を避けるためにクエン酸塩又はクエン酸塩及び追加の物質上に注意深く 血液を収集することによって行われる。血液は、赤血球の存在によるアッセイの 妨害を防止するために、食塩水で十分に希釈される。希釈された血液は、物質（ 基質）と混合され、それは凝固促進性リン脂質依存性酵素（−複合体）によって 変換されることができる。基質の例としては、プロトロンビン及び第Ｘ因子があ り、それらはそれぞれ、０．１〜６Ｍ及び０．０５〜３Ｍの濃度において使用で きる。リン脂質依存性酵素−複合体の例としては、第Ｘ因子活性化複合体及びプ ロトロンビンがある。第Ｘ因子活性化複合体の構成成分は、第１Ｘａ因子（１〜 ２００　ｎ　Ｍ）及び第ＶＩＩ［ａ因子（０，１〜１０ｎＭ）であり、プロトロ ンビナーゼの構成成分は、第Ｘａ因子（０，１〜５ｎＭ）及び第Ｖａ因子（０， １−１０ｎＭ）である。次いで酵素複合体が加えられ、そして０．５〜４分の反 応時間の後、基質の更なる活性化は該酵素の阻害剤（例えばＥＤＴＡ　、クエン 酸塩又その他の、該酵素が依存している２価の陽イオンと錯体形成する化合物） の添加によって停止される。測定の妨害を避けるだに、赤血球は除去されねばな らない。これは、遠心により、又は反応液を炭酸水素アンモニウムと混合するこ とによる細胞溶解によって達成できる。 生成した活性化された基質は、血液（血小板）の凝固促進活性の尺度である。活 性化された基質は、色素原性基質を加水分解するその能力によって測定すること ができる。例えば、活性化されたプロトロンビン（トロンビン）は、３２２３８ を加水分解する能力によって、及び活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）は、５ ２３３７．５２２２２、又はＣ）１．−０−ＣＯ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ｐＮＡアセテートを加水分解する能力によって、測定することができる。 休止している血小板の凝固促進活性を測定するための好ましい方法の一つは次の 通りである。すなわち、３種の試薬が必要である。試薬ｌは、６Ｍのプロトロン ビンを含有し、試薬２は、１．２ｎＭの第Ｘａ因子、１．２ｎＭの第Ｖａ因子、 １５ｍ　ＭのＣａＣＬを含有し、そして試薬３は１０ｍＭのＥＴＤＡ　（ｐＨ８ ，０）を含有する。 −血液は、血小板の活性化を避けるため注意深＜　ＡＣＤ　（１８３ｍＭのブド ウ糖、８０ｍ　Ｍのクエン酸三ナトリウム、５２ｍ　Ｍのクエン酸）上に収集さ れる。すなわち、５部の血液力月部のＡＣＤにと混合される。ブドウ糖は、血小 板を自然の、活性化されていない状態に維持するためにある。 −血小板はゲル濾過によって（Ｌａｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｌａｂ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ。 、　８５：８１１−８２５　（１９７５）を見よ）か、又は遠心（Ｂｅｖｅｒｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７３６ ：５７−６６　（１９８３）を見よ）によって単離される−　更なる手順は、一 定温度、例えば３７°Ｃ（こて行われる。１５０１の血小板に１５０βの試薬１ が加えられ、そしてこの混合物（よ５分間インキュベートされる。 −ついて１５０　Ｉ！の試薬２が、プロトロンビナーゼを開身台させるために加 えられる。 −１，２，３及び４分後に、１００ｍｊ７のサンブル力（採取され、プロトロン ビン活性化を直ちに停止させるために、セル中（こお０て５００βの試薬３と混 合される。 −セルは恒温（例えば３７°Ｃ）の分光光度計中番装置カーれ、トロンビンは、 ２０１の５２２３Ｂの添加と４０５ｎｍにおける吸収増大の追跡（こよって測定 される。 健康な個体の群の血液から単離された血小板をぶ１定することによって、−揃い の値が得られる。これらの値の平均値及び標準偏差を計算することによって、境 界値を決定すること力くでき、その中（こ正常な休止血小板が入る。 血小板の易興奮性の測定 血小板の易興奮性はまた、血栓症傾向の一指標であると信しられてもいる。何ら かの理由で血液中のトロンビン濃度力（上昇するとき、特に血小板の易興奮性が 高まっているとき（こ（よ、危険な状況力（存在するであろう。そのような場合 （こ（よ−正常な血／１１板ならイ氏能度のトロンビンによる活性化は一般に受 けな０の（二対して−−４能度のトロンビンても血小板を活性化させるであろう 。 一般に本アッセイは、血小板の休止活性を測定するための方法（＝ついて上述し たのと同様である。しかしながら、更なる一段階を要する。血小板はトロンビン と、又はトロンビン及びコラーゲンとインキュベートされるが、これらは血小板 の天然の活性化剤である。 基質へのトロンビンの、又はトロンビン及びコラーゲンの添加及びこの溶液中で の血小板のインキュベーションによって同じことが達成されるが、しかしピペッ ティング段階の削減が実現される。 血小板の易興奮性を測定するための好ましい手順の一つは、次の通りである。 −血小板は上述のようにして単離される。 −血小板は４ｍＭのトロンビンと、又は４ｍＭのトロンビン及びコラーゲン（Ｉ ｇ／ｍｆ）と、室温にて１０分間インキュベートされる。 −次いて、上述の手順が続けられる。 血小板の正常な易興奮性を測定するためには、健康な個体の群からの血液が収集 され、血小板が単離され、そしてその血小板の易興奮性が測定される。次いで、 −揃いの値が得られ、それらは正常値とみなされることができる。これらの値か ら正常人の統計が計算され、それは、ある人の血小板が正常血小板に比して高い 易興奮性を有するか否かを決定するために使用できる。 フリップフロップ機構を阻害する薬物のスクリーニングのための方法 血小板活性化（フリップフロップ）を阻害する能力について薬物をスクリーニン グするために、この試験を使用することができる。 そのような薬物は、血栓症を有する患者を治療するために育用な医薬であろうし 、又は、血栓症傾向を有する人のための優れた予防薬であろう。 薬物のアッセイのための一般的手順は次の通りである。血小板は上述の通りにし て単離される。薬物とトロンビンとの、又はトロンビン及びコラーゲンとの混合 物が調製される。標準化された条件下に血小板がこの混合物とインキュベートさ れ、次いて、既に記述した通りにして血小板の易興奮性が測定される。必要な対 照は、薬物の不存在下での血小板のインキュベーション、並びに、薬物の存在下 及び不存在下における既知の組成のリン脂質小嚢による実験である。後者の対照 は、アッセイ自身に対する薬物の効果を排除するために必要である。 フリップフロップを阻害する薬物をめるスクリーニングの好ましい方法の一つは 、血小板の易興奮性を測定する方法に基礎を置いたものである。 −血小板の易興奮性を測定するだめの方法において記述した好ましい手順に従う 。 −追加の一段階が含まれる。薬物をトロンビンと、又はトロンビン及びコラーゲ ンと混合する。次いて、述へた通りに手順を続行する。 −必要な対照は次のものである： １）薬物の不存在下での実験。 ｌｌ）アッセイ自身に対する薬物の試験。高い凝固促進活性を有する小嚢が調製 され、薬物の不存在下及び存在下において、数通りのリン脂質濃度（０〜０．４ Ｍ）にてプロトロンビンの活性化が測定される。もしも薬物がアッセイに影響を 及ぼすなら、この影響を排除するために補正を行うことができる。 全血中の血小板の凝固促進活性を漠噌定するための方法本発明の別の一面におい て、全血中の血小板の凝固促進活性を測定するための方法が提供される。上述の ように、単純なアッセイにおいて血小板の凝固促進活性を測定することができる が、血小板の単離は１〜２時間を要し、そのため臨床的使用には理想的でない。 全血の凝固促進活性の測定が、その目的のためには好ましい。全血中において直 接に血小板の活性を測定するための単純なアッセイを利用できることにより、非 常に多数のサンプルを迅速に試験するために診療所においてルーチンな手順が使 用することができる。 一般に、血液はボランティア／被験者から採取され、プロトロンビンと混合され る。適当な温度（例えば３７°Ｃ）にてインキコベ　−ションした後、全血とプ ロトロンビンを、例えば第Ｖａ因子、第Ｘａ因子及びＣａＣ１，と混合すること によって反応が開始される。所定の増分をもってサンプルが採取され、停止緩衝 液を含んだ管に加えられる。赤血球はその後遠心により沈降され除去される。な ぜなら赤血球は、測定される活性に寄与しない一方でトロンビン測定を妨害する からである。次いて上澄が除去されセルに加えられる。生成したトロンビンは、 色素原性基質を添加した後に測定される。 別の一具体例においては、トロンビン測定前に赤血球を除去するのではなく、以 下の実施例に一層に記述されるように、赤血球が溶解されることができる。しか しながら、細胞溶解アプローチが用いられる場合には、溶解が完全であることを 保証するために、全血を希釈することが必要である。希釈量は、停止緩衝液に添 加されるサンプルのサイズに依存する。一般に、全血は少なくとも約１６倍に、 最も好ましくは少なくとも２０倍に希釈しなければならない。フリップフロップ 反応が完全である場合（例えば、カルシウムイオノフオアＡ２３１８７による処 理）には、一層高い希釈（２００倍まで）が必要であろう。 以下は、全血の凝固促進活性を測定するために使用できる好ましい方法の−っで ある。３種の試薬が必要である。試薬ｌは、６Ｍのプロトロンビンを含有し、試 薬２は、１．２部Ｍの第Ｘａ因子、１．２ｍＭの第Ｖａ因子、１５ｍＭのＣａＣ １，を含有し、そして試薬３は、１０ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　（３Ａ ）か、又は１０ｒｎ　ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　＋１００　ｍＭの炭酸水 素アンモニウム（３Ｂ）のいずれかを含有する。 −血液はＡＣＤ　（１８３ｍＭのブドウ糖、８０ｍ　Ｍのクエン酸三ナトリウム 、５２ｍ　Ｍのクエン酸）上に収集される。すなわち、血液５部がＡＣＤ　１部 と混合される。ブドウ糖は、血小板の活性化を阻止するためにある。 −血液は、等偏食塩水により２０倍希釈される。 −希釈された血液は、例えばトロンビン＋コラーゲンと、又は薬物と、室温にて １０分間インキュベートされる。 −更なる手順は一定温度（例えば３７°Ｃ）にて行われる。１５０１の希釈され た血液に１５０１の試薬が加えられ、混合物が５分間インキュベートされる。 −次いて、プロトロンビナーゼを開始させるために１５０１の試薬２が加えられ る。 −ｌ、２．３及び４分後に、１００ｍ１のサンプルが採取され、プロトロンビン 活性化を直ちに停止させるために、セル中において５００１の試薬３と混合され る。 −試薬３Ａが使用される場合には、赤血球は遠心によって除去される。しかし試 薬３Ｂが使用される場合には、赤血球の完全な溶解を得るためにたった２分のイ ンキュベーション時間が必要にすぎない。 −混合物は、恒温（例えば３７°Ｃ）の分光光度計中に置かれたセル内に移され 、２０Ｉ！の５２２３８を添加しそして４０５ｎｍにおける吸収増大を追跡する ことによって、トロンビンが測定される。 上述のように、休止血小板の凝固促進活性及び血小板の易興奮性は、健康な被験 者群から得られた血液サンプル中において測定することができる。これらの試験 で得られた−揃いの値は、−人の被験者が休止血小板の凝固促進活性を有するか 又は正常値から離れた血小板の易興奮性を有するかを判定するために、使用する ことができる。血小板カウントのための補正は、カウンター内の血小板を数える ことによって又はカルシウムイオノフオアＡ２３１８７で処理した後の凝固促進 活性（これは血小板カウントの尺度である）を測定することによって、行うこと ができる。 フリップフロップ機構に対する阻害効果をめて薬物をスクリーニングすることも また可能である。その場合には、血液サンプルは健康なホランティアから得られ ねばならず、血小板の易興奮性に対する薬物の効果が測定される。 本発明は、以下の実施例に一層詳細に記述されよう。 実施例１ 血小板の休止活性の測定 血液５部が、Ｎ８３ｍＭのブドウ糖、８０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、５２ｍ 　Ｍのクエン酸」の１部と混合される。３種類の試薬が調製される。試薬Ｂは、 ６Ｍのプロトロンビンを含有し、試薬Ａは、１．２ｎＭの第Ｘａ因子、１．２ｎ Ｍの第Ｖａ因子、１５ｍＭのＣａＣｌ　、よりなり、そして試薬３は、ｌｏｍＭ のＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ８，０）及び１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムを含有す る。血液は、等張食塩水により２０倍に希釈される。次いで、１００１の希釈さ れた血液が１０Ｏｆの試薬Ｂと混合され、３７°Ｃにて５分間インキュベートさ れる。この混合物に１００１！の試薬へが加えられ、溶液はよく混合されて０． ７５又は１．５分後、２５０１のサンプルが、５００　Ｉ！の試薬３を有するセ ルに加えられる。最後に、赤血球の完全な溶解を許容するための２分という時間 の後、５０１の５２２３８　（これは血小板の凝固促進活性を反映する）が、生 成したトロンビンを測定するために加えられる。 臨床適用のためには、２．３のピペッティング操作のみが必要でありそのため単 純な試験で多数の個体がスクリーニングできる、ということが重要である。 一群の対照個体、及び血栓症傾向を有することの証明された一群の患者の凝固促 進活性を測定することによって、血小板の凝固促進活性の閾値−これは血栓症傾 向の増大を示すものである−を決定することができる。例えば、対照被験者群が ５．５２ｍ　Ａ　／分の平均血小板凝固促進活性を有したのに対して、一群の患 者（彼らはバイパス手術を受けていた）は、９．３８ｍ　Ａ　／分の平均血小板 凝固促進活性を有した。 実施例１１ 血小板の易興奮性の測定 実施例Ｉに記述した通りの手順に従う。しかしながら、試薬Ｂには、例えば、４ ｎＭのトロンビン及びＩｇ／ｍＡ’のコラーゲンが加えられる。 これら天然の血小板活性化物質であるトロンビン＋コラーゲンの存在によって、 凝固促進活性（易興奮性）の限定された増大が起こるであろう。血小板のこの部 分的活性化は、−の群の個体と別の群の個体との間で変動するであろう。対照群 に比較して、血小板の易興奮性が高いことは、血栓症の危険性を増大するものと 信じられている。 実施例１１１ フリップフロップ反応を阻害する薬物のスクリーニングのための方法 血小板の凝固促進活性を測定するために、やはり実施例Ｉに記述したのと同じ手 順に従うことができる。血小板の凝固促進活性に対する薬物の効果は、その薬物 を全血に、希釈された血液に、又は試薬ｌに添加し、次いで各薬物について同じ インキュベーション方法を行うことによって、研究することができる。 例えば、血液は、Ｌｇ／ｍｌのアスピリンを添加した等張食塩水によって２０倍 に希釈される。この混合物は、３７°Ｃにて１５分間インキュベートされる。次 いで実施例１１の手順が行われる。その方法で、トロンビン＋コラーゲンによる 血小板の易興奮性に対する、アスピリンの効果を研究することが可能である。も しも、例えば、血小板の易興奮性が約５０％を超えて低下したならば、候補薬物 はフリップフロップ反応を阻害したかさもなくば妨害したと結論付けることがで きる。 実施例１■ 全血中の血小板の活性の測定 最初の試みにおいて、試薬Ａ及びＢは次の通りに調製された。試薬Ａは２４０ｐ Ｍの第Ｖａ因子、２４０ｐＭの第Ｘａ因子及び１５ｍ　ＭのＣａＣＩ　２を含有 した。試薬Ｂは６Ｍのプロトロンビンを含有した。実験アプローチ、　全血が試 薬Ｂと混合され、反応が試薬Ａの添加によって開始され、次いてブロトロンビナ ーゼ活性が測定された。血液は、表Ｖｌｌ＋に示されているように希釈された。 ピペッティング法・　３００１の試薬Ｂを３００１の希釈された全血と混合され た。３７°Ｃにおける５分間の予備インキュベーションの後、３００　Ｉ！の試 薬へが加えられた。１００１！のサンプルが、０．５、ｌ、１．５．２．２．５ ．３．３．５及び４分の反応時間の後に採取され、９００　Ｉ！の停止緩衝液（ １０ｍＭのＥＤＴＡ　）を含んだ管に加えられた。赤血球は遠心（Ｅｐｐｅｎｄ ｏｒｆ）により沈降され、９００　Ｉ！の上澄がセルに加えられた。生成したト ロンビンは、１１の５２２３８を加えることにより測定された。表■１１］に結 果を示す。 最低希釈の場合には血餅が形成されたことから、０．５ｍＭのｃｔｙ−ＰｒＯ− Ａｒｇ−ＰｒＯが反応混合物に添加され、血液は前と同様に試験されｌこ。 表ｖ１１１ 全血中において測定された血小板の凝固促進活性０．５　＋、２６　２．３５　 ３．６３　５．２８＋　２．７６　、　６．７４　１２．８６　１４．４５１． ５　５．３４　＋４．６３　２５．４２　２９．２６２　８．６３　２３．６６ 　３８．５３　４５．１５２．５　１２．９４　３５．９３　５５．２２　６４ ．９６表ｖ１１１は、信号が、添加した血液の量と直線的でないことを示す。赤 血球が測定を妨害するため、赤血球除去のために、遠心段階は避けられなかった 。 更なる試験は、次の方法で行われた。２７Ｏｆの全血に３０１のｃｔｙ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ｐｒｏ　（１０ｍ　Ｍ　）が添加され、上述のようにして凝固促進活 性が測定された（対照）。血液へのカルシウムイオノフオアＡ２３１８７の添加 の効果もまた研究された。次の混合物が調製され＋３０ｊ？の全血、２６７１’ の標準緩衝液、３　ｆ　Ａ２３１８７　（１００Ｍ）　：及びこの溶液が、室温 にて５分後に上述のようにして試験された（表ＩＸを見よ）。 表１ｘ 上記から見られるように、カルシウムイオノフオアＡ３２１８７は、活性を極度 に増大させる。この活性は血小板全量により測定される。なぜなら、全ての利用 可能なリン脂質の完全なフリップフロップがイオノフオアによって誘導され、活 性は、リン脂質の全量とリン脂質膜中のホスファチジルセリンのパーセントとに よって決定されるからである。ホスファチジルセリンは細胞内に一定量に存在し ており、従って、最大凝固促進活性は、リン脂質の全量に依存するのみである。 従って、Ａ２３１８７によって誘導された活性は、血小板カウントとして用いる ことができ、血小板濃度における変動を排除するために補正をすることができる 。 実施例■ 全血の凝固促進活性を測定するためのより単純なアプローチを開発するために、 炭酸水素アンモニウム十ＥＤＴＡの停止緩衝液が使用された。赤血球は炭酸水素 アンモニウム中において溶解する。この塩は水中において完全にはイオン化して いないからである。水溶液中に、荷電していない小さな分子であるＮＨ，及びＣ ０２が存在し、これらは赤血球膜を通過する。細胞内において、これらの分子が 水と反応し、イオンが再び形成され、そのため細胞内のイオン強度が増大する。 イオン強度のこの増大を補うために細胞内に水か拡散し、最終的に細胞は溶解す る。炭酸水素アンモニウム中に再サンプリングすることにより、赤血球は溶解し 、色素原性測定を妨害することがない。 第１に、緩衝液の変更がトロンビンによるＡ２２３８の加水分解速度にいかに影 響を与えるかが測定された。表Ｘは、これが事実であることを示している。 表Ｘ １７５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍ　ＭのＴｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ 　Ｈ７，９）（すなわち標準緩衝液）中、又は、１００ｍＭの炭酸水素アンモニ ウム、１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　（すなわち溶解緩衝液）中のい ずれかにおける、トロンビンによる５２２３８の加水分解速度。セル中に、１Ｏ Ｏｌのトロンビン（８％Ｍ）と、３２２３８を示したように、そして緩衝液を加 え、最終液量を１ｍｌとした。 表ＸＩに示した実験は、２つの方法で行う。すなわち、標準の停止緩衝液中の再 サンプリングによるか、又は炭酸水素アンモニウム＋ＥＤＴＡ中の再サンプリン グによる、反応の停止である。標準の停止緩衝液中の再サンプリングの場合には 、赤血球は遠心により沈降されそしてトロンビン生成は上澄中において測定され た。炭酸水素アンモニウム緩衝液の場合には、遠心段階は省かれた。 表×１ 全血中の凝固促進活性リン脂質の測定。血液は３．８％のクエン酸ナトリウム中 に収集された（クエン酸塩１部、血液９部）。血液（よ、ｒ１７５ｍＭのＮａＣ ｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸、１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ７，９）」中 に、又はｒｌｏＯｍＭの炭酸水素アンモニウム、１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ ８，０）　Ｊ中に、再サンプリングされた。標準の停止緩衝液中の再サンプリン グの場合には、赤血球は遠心により沈降されトロンビンは上澄中において測定さ れた。第２の場合には、遠心段階は省かれた。 ２　１５９．４２　１３５．０２ ”　３　２７７．４０　２１４．４１ ４　４１６．４４　３１２．６５ ３　１２３５．５８　１０１１．１６ ４　１８２３．４４　１２３６．４８ ３　１６２ｇ、３５　１４２４．７９ ４　１９９０．６８　１７９６．２５ ３　７２７．７１　５６５．３０ ４　１０２５．０２　７９９．６４ アツセイの感度を高めるために、より多い量の第Ｘａ及びＶａ因子を含んだ試薬 が調製された（［低濃度のリン脂質を測定する方法」に関する部を見よ）。その 理由により、１．２％Ｍの第Ｘａ因子、］、２ｎＭの第Ｖａ因子及び１５ｍ　Ｍ のＣａＣＩｚを含んだ試薬Ａが調製された。６Ｍのプロトロンビンを含んだ試薬 Ｂが調製された。これらの試薬は、次の実験例■〜ＩＸにおいて使用された。 実施例ｖ１ 単純化された手順による全血中の血小板の試験２つの時間依存性のピペッティン グ段階を要するに過ぎないために臨床使用に一層適している、単純な方法で測定 できることを示している。全血を使用することにより、時間浪費的更に血小板の 活性化の危険を増大させる血小板の単離手順を回避することができる。血液の活 性化を回避するために注意が払われねばならない。次いで、食塩水希釈した血液 １部が、プロトロンビン１部（試薬Ｂ）と混合される。例えば３７°Ｃての、数 分間のインキュベーションの後、試薬Ａ１部が加えられ、所定の反応時間の後、 サンプルが溶解停止緩衝液と混合される。生成したトロンビンは、赤血球の完全 な溶解を許容するに十分な時間の後に、色素原性トロンビン基質の添加によって 測定される。 全血の凝固促進活性の測定のための好ましい方法の一つが次の実施例である。血 液は食塩水により２０倍に希釈される。反応温度が正確に３７°Ｃであることを 保証するために、全ての試薬は３７°Ｃにて５分間予備インキュベーションされ る。１５０　Ｉ！の希釈された血液に、１５０１の試薬Ｂが加えられ、次いで反 応を開始させるために１５０１！の試薬Ａが加えられる。１００１のサンプル力 月、２．３及び４分の反応時間の後に採取され、５００１のｒｌｏｏｍＭの炭酸 水素アンモニウム、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　Ｊ　と混合される。 生成したトロンビンは、２分後に２０１の５２２３８の添加によって測定される 。 ある実験においては、血液は、身体的努力の前後に健康な人から採取された。人 ｌ〜５においては、血液はクエン酸塩上に収集され、これに対し、例６〜８にお いては、ＡＣＤ　（クエン酸塩、クエン酸、ブドウ糖）上に収集された。表Ｘ［ Ｉに結果が示されている。 図１〜８には、身体的努力の前後に採取された血液サンプル（それぞれ人１〜８ ）の結果がプロットされている。 身体的努力の影響は、全ての例において殆ど同じであることが認識できる。一つ （人４）を除く全ての例において、血小板の凝固促進活性は、その努力の後では 高まっていた。、努力の後に血小板の凝固促進活性がなぜ高いのかという理由は 、明らかでない。 我々はまた、ＡＣＤ上に収集された血液中の血小板の凝固促進活性が他の場合に 比して幾分低いことに気づくが、この影響は余り大きくはない。ＡＣＤのこの影 響は、２．３時間の後に非常によく認められる（示していない）。血液サンプル 中にはブドウ糖が存在しないため、血小板は２．３時間以内に活性化するが（表 ｘ１を見よ）、これに対して、ブドウ糖の存在下においては、血小板はこの時間 の間はその低い凝固促進活性を維持する。その理由により、ブドウ糖を添加して いない血液は約１時間以内に測定することが必要である。なぜなら、より長いイ ンキュベーション時間の後は血小板は多かれ少なかれ活性化され、こうして活性 （それはその患者／被験者の「真のＪ値より上である）が測定されるだろうから である。血栓症の危険性の偽の陽性指標がもたらされることになろう。 表Ｘｌ＋ ３　８１．０２　８５．７２　２０５．２９　１８６．８３　１０．９４２　’ １００．９２　１０ｇ、８０　１３２．４８　１３９．３６３　１８５．２２　 １８８．７９　２３７．３４　２４６．１８２　９１．５５　９４．９３　２０ ｇ、８２　２１２．３８３　１６３．０２　１６７．２２　３５９．６３　３６ ２．７９２　１９１．０３　１ｇ４．３０　１８９．６５　１８５．９７３　３ １４．９５　３０９．８５　３１０．６０　３１３．６７３　１８６．２４　１ ９６．０２　２８５．６８　３１７．７９２　３９．８２　４０．７０　１０８ ．４３　１０８．３４３　６８．６８　６７．７７　１６５．５３　１６６．０ １３　７４．７１　７５．３０　１６２．６０　１５５．７６人８１　２４．９ ８　２５．７８　６６．４７６６．８０２　７１．４８　７０．５１　１７５． ０１　１６８．６４３　１２８．４７　１２８．３０　２８５．２０　２８６． ３４、＜　１７３．０１　１８４．７９　４α）、８５　３８８．６１全血中の 凝固促進活性の測定。単純化した手順を使用（本文参照）。 実施例Ｖ＋＋ 「血栓症」患者の血小板の試験 ビタミンに依存性凝血因子の合成を部分的に阻害するためにシントロミティス（ Ｓｉｎｔｒｏｍｉ　ｔｉｓ）で処置した患者からの全血中の血小板の凝固促進活 性を測定するために、炭酸水素アンモニウム停止緩衝液を用いた単純化された血 小板試験が用いられた。血液中のビタミンに依存性凝血因子の濃度を減少させる ことによって、血液凝固は部分的に阻害され、例えば、血栓症の危険性が低下す る。ビタミンに依存性凝血因子のレベルは、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　５ｅｒｖｉ ｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｍａａｓｔ ｒｉｃｈｔにおいて定期的に測定された。血小板を可能な限り自然の状態に維持 するため、血液はＡＣＤ上に収集された。結果は表Ｘ１１１に示されている。 図１７〜Ｉ８には、結果がプロットされている（それぞれ患者ｌ及び２〜９）。 ある例（例１７）においては、測定は、血小板の安定性を試験するために４時間 後に繰り返された。サンプル中のブドウ糖の存在にもかかわらず、４時間後には 凝固促進活性がいくらか上昇しているのが認められる。図１７にこれが図解され ている。 図１８に、患者２〜８の結果をプロットした。曲線の形が前の結果といくらか異 なるのを認めることができる。トロンビン生成速度は、２分までは直線的であり 、次いで非常に増大する。これが、患者の処置の、年齢の、又は疾患のいずれに よるものであるかは明らかでない。我々はまた、殆ど全ての場合において血小板 の凝固促進活性が、健康なボランティア（対照）の血小板より高いことに気づい ている。 表Ｘ１１１ 表ｘｔｔｉは、全ての例において、「患者」の血小板が対照血小板に比し高い凝 固促進活性を有していたことを示している。これらの効果は患者の血小板の休止 凝固促進活性が対照血小板の休止凝固促進活性より高いということを強く示すも のである、と確信される。血小板の凝固促進活性の上昇が血栓症の危険性の指標 であるとし）うことを証明するためには、この活性を、よく規定された大きい群 において定量することが好ましい。 患者群の間での統計学的に有意な差を得るためには、信頼区間が重複しないこと も好ましい。差が大きい程、これは早いであろう。 従って、統計的に有意な差を証明するためには、差が小さいほど群が大きくなけ ればならない。 表ＸＩ［Ｉは、被験者のそのような小さな群から結論を引き出すことができる限 り、血栓症の明らかな危険性を有する患者では、対照被験者に比して休止血小板 の凝固促進活性が一層高いということを示している。 表×１１１ ３　５５．６２　５２．０９ ２　３９．７０　３７．０５　４０．１４３　６８．４７　６４．ω　ω、５０ ２　８６．０８　ｇ４．５０ ３　１２Ｌ３７　１２９．０３ ３　２２１．８９　２２１．１６ ３　１５０．９４　１ω、３４ ２　７０．８６　７３．１４ ３　１１０．８９　１１３．６５ ３　１１６．３５　１１９．１７ ２　７１．６４　７０．９９ ３　１１９．５１　１１１．９５ ２　６０．１７　５１．２６ ３　９３．２６　８８．３２ ４　１８７．８３　１８０．５＋ 虫者９　１　２９．９７　３３．４５ ２　６９．４８　７４．１４ ３　１１０．５９　１１８．０９ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　５ｅｒｖｉｃｅの患者の全血中の凝固促進性リン脂質の 測定。 実施例ｖ１１１ 血液は食塩水により２０倍に希釈される。次いで５０ｊ’の希釈された血液が５ ０１’のプロトロンビン（６Ｍ）と混合される。混合物を予備加温するための短 い予備インキュベーションの後に、５０１の活性化混合物が加えられる（ｔ＝０ ）。この活性化混合物は、１．２ｎＭの第Ｖａ因子、２．１ｎＭの第Ｘａ因子及 び１５〜３０ｍＭのＣａＣＩｚを合作する。１〜４分後、５００１の停止緩衝液 （１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム、ＩＯｍ　ＭのＥＤＴＡ）が加えられる。 次いて約１〜２分後に、生成したトロンビンを測定するため色素原性基質が加え られる。 可能な適応は次の通りである。 プロタミンの添加。これはアッセイをヘパリンに対して非感受性にする。 停止緩衝液は炭酸水素アンモニウム（これは赤血球を溶解させるために必要であ る）を合作する。色素原性基質を停止緩衝液に添加し、再サンプリング段階を回 避することが可能である。しかしながら、赤血球を溶解するには短い時間を要し 、そしてこれらの細胞は測定を妨害することから、トロンビンは、反応を停止さ せた後１〜２分より前には測定できない。従って、大過剰の色素原性基質が存在 しなければならない。さもなければ生成したトロンビンを測定できるようになる 前に基質が消費し尽くされてしまう。この問題は、血小板リッチ血漿を使用する ことにより回避できる。 血小板の量を標準化するための可能な方法は、カルシウムイオノフすアＡ２３１ ８７　（これは、両方の膜リーフレットにわたってホスファチジルセリンの完全 なランダム化を引き起こし、最大量の凝固促進活性リン脂質が露出される）との 予備インキュベーションである。 この場合に活性を測定するためには、サンプルは好ましくは少なくとも約１００ 倍に希釈しなければならない。 健康な被験者からの、身体的努力を課された人からの、そしてシントロミティス で処置された患者からの全血の凝固促進活性が示されている。表Ｘ１■に結果が 要約されている。血小板の活性化を回避するために、血液は注意深く収集される ことが重要である。また、活性を１時間以内に測定することが必要であり、さも ないと、血小板は活性化される。ＡＣＤ　（クエン酸ナトリウム、クエン酸、ブ ドウ糖）中に血液を収集した場合にのみ、血小板はより安定であり２．３時間は 活性化されるこなく維持できる。表ＸＩＶにはいくつかの統計も示されている。 もっとも重要な結果は、身体的努力が凝固促進活性の２〜４倍の増大を引き起こ すこと、及び［シトロミティスｊ患者の凝固促進活性は、対照群の２〜１．５倍 高いことである。 実施例■〜ＶＩＩ［にて既に導かれた結論の他に、もう一つの重要点は、群間の 差が、反応時間が短いときに最も明らかなことである。 これは、生成したトロンビンによる反応混合物中の血小板の活性化のためである と確信される。この理由から、反応容器内において誘導された活性でなく血小板 の初期凝固促進活性を測定するためには、短い反応時間を用いる方がよい。 表ｘ１ｖ 全血の凝固促進活性。血液は食塩水で２０倍に希釈された。５０ｆの希釈された 血液が、５０１のプロトロンビンと混合された。３７°Ｃにおける２、３分間の 平衡化の後、５０ｆの活性化混合物が加えられた。 プロトロンビナーゼは、ｌ、２．３及び４分の反応時間の後に５００βの停止緩 衝液の添加によって停止された。生成したトロンビンは、赤血球を溶解させるた めの１〜２分の後に、２ｏβの５２２３８の添加により測定された。 １　１７．２５　５７．８３　８９．２８　１５１．０２２　１４．４２　４８ ．４２　１１５．７２　２０３．２８３　４５．４１　１２９．４２　２２９． ２０　３３８．１０４　１８．９６　５５．８８　９４．７０　１４９．５１７ 　２７．７５　７７．６１　１３４．５１　３１８．５８２　４．３４＋５　３ ．２９７８　２．３５１７　２．０６６７３　２．１１２０　２．２５８７　２ ．１８７６　２．２３８３４　２．９３８１　２．６９２１　２．４２９８　２ ．５５１６５　２．２４４９　２．１ｇ５０　２．１２２３　２．０４２９９　 ２７．０＋　６０．７７　９７．５４　１５７．５０１０　４９．５５　１１８ ．３８　１７８．６４　３２８．３５１１　８６．８１　１９２．７９　３０７ ．４８　５２６．１１１２　５５．９＋　１３２．１９　２１６．０３　３４３ ．８４統計 実施例１ｘ 異なる患者群からの血小板の凝固促進活性４つの異なる患者群と１つの対照群と が試験された。患者群は、バイパス手術を受けた患者、冠動脈梗塞の患者、心房 細動の患者、及び深部静脈血栓症の患者である。実施例Ｖ［ｌ［に記述した組成 を有する凍結乾燥した試薬が使用された。プロトコールは、１＝０分においては １００１のプロトロンビン、又はプロトロンビン＋［［ａ　（１０ｎＭ）＋コラ ーゲン（１０ｇ／ｍＡ）　、又はプロトロンビン＋カルシウムイオノフオアＡ２ ３＋８７　（５Ｍ）が、＋００　ｆの希釈された血液（食塩水で２０倍、しかし イオノフオアの場合は２００倍）と混合された：ｔ＝５分においては１００１の 第Ｘａ、Ｖａ因子、カルシウムが加えられ：ｔ−５分４５秒及び６分３０秒にお いては、ｉｏｏ　Ｉ！が５００　Ｉ！のＥＤＴＡ−炭酸水素アンモニウムと混合 され；そして２分後には、２０ｒの５２２３８の添加によりトロンビンが測定さ れた。 表Ｘ■には、全群の平均値か与えられ、及び更にいくつかの統計的値が与えられ ている。加水分解速度の他に、無添加の速度とイオノフオアの速度との間の、そ してＩｌａ／コラーゲンの速度とイオノフオアの速度との間の比率が与えられて いる。これらの値は、血小板の活性化パーセンテージの指標である。 表Ｘ■の結果は、全患者群の凝固促進活性（無添加；４５秒）が、対照群の活性 より高いことを示している。これらの比率をみると、患者群の場合の値は、対照 群の値より約３倍大きいことが認められる。これらの認められた差は、９０秒値 においては少なくなっているか又は殆ど存在しない。このことは、４５秒値は９ ０秒値より識別性があるということを示している。トロンビン＋コラーゲンによ って誘導された凝固促進活性は、全ての群において多かれ少なかれ同じであり、 それは、患者の血小板は対照群の血小板より易興奮性が低いことを示しているが 、これは患者の血小板は既にある程度活性化されていることから、予想されると ころである。 従って、血小板リッチ血漿が用いられる限り、僅かに２つの時間に依存するピペ ッティング段階を要するに過ぎない血小板アッセイが開発されることが分かる。 血小板リッチ血漿の調製は、一定の時間及び重力（分間回転数及び半径より決定 される）の遠心によって、臨床試験室で標準化することができる。もしも依然と して全血の使用を好むのであれば、大過剰の色素原性基質を含んだ停止緩衝液を 使用する必要があるか、又は追加の再サンプリング段階が必要である。 アッセイを自動化に適合させるために、例えばｉｏｏ　Ｉ！の希釈された血液と １００１のプロトロンビンをとり、混合しそして３分間インキュベートシ、１０ ０１の活性化混合物を加えそして６ｏｏＩ！の停止緩衝液を３．７５又は４．５ 分にて加えることによって、試薬の液量を変更することもまた可能である。最終 的に、５０ｆの色素原性基質を、停止緩衝液の添加の１．５分後に加える。この 最後の段階は、赤血球の完全な溶解を保証するために必要である。 実際的な臨床使用のためには、凍結乾燥された試薬を使用できることか好ましい 。 ＦＩＧ、１ リン脂質（４Ｍ） Ｌ　（任／四Ｕ）渭玉ζ３ペロ」 、　（仔／四Ｕ）漬玉と３ζ口ｌ Ｌ　（仔／四〇）準玉べ３ぺ０（ ＦＩＧ、　７ 反応時間（分） Ｌ　（四〇）軍圭ζ３ペロ」 Ｌ　（四Ｕ）慕ド３べＯ」 、　（Ｗ’）、Ｗｉ／：、ｔｗｏ（ Ｌ　（八〇）謳：ｆぺ３ζ口ｑ Ｌ　（八Ｕ）箭圭ぺ３ζ口９ ＦＩＧ、１７ 反応時間（分） ＦＩＧ、１８Ａ　ＦＩＧ、１８Ｂ ＦＩＧ、１８ＣＦＩＧ、１８Ｃ 反応時間（分）　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（ｍｉｎ）ＦＩＧ、１８Ｅ　Ｆ ＩＧ、１８Ｆ ＦＩＧ、１８Ｇ　ＦＩＧ、１８Ｈ 国際調査報告 ＰＣＴ／ｕｓ　９３１０５４３６

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．休止血小板の凝固促進活性を測定することによる標的個体における血栓症の 危険性を判定するための方法であって、（ａ）標的個体からの血小板を含んだサ ンプルを、凝固促進性リン脂質依存性酵素又は酵素複合体によって変換されるこ とのできる基質と混合し、 （ｂ）段階（ａ）の混合物を、活性化された基質を生成させるために該酵素又は 該酵素複合体と接触させて反応させ、（ｃ）該サンプル中の生成した活性化され た基質の量を測定し、そして （ｄ）該標的個体からの生成した活性化された基質の量を、一又より多くの対照 個体からの生成した活性化された基質の量と比較する、 こを含んでなる方法。
2. ２．該標的個体からの血小板が、血小板を活性化されていない状態に維持する方 法で単離されるものである、請求項１の方法。
3. ３．該基質がプロトロンビンと第Ｘ因子とからなる群より選ばれるものである、 請求項１の方法。
4. ４．該凝固促進性リン脂質に依存性の酵素又は酵素複合体が、第Ｘ因子活性化複 合体とブロトロンビナーゼとからなる群より選ばれるものである、請求項１の方 法。
5. ５．サンプル中の生成した活性化された基質の量が、色素原性基質を加水分解す る能力によって測定されるものである、請求項１の方法。
6. ６．血小板を含んだ該サンプルが、該標的個体から採取された全血を含んでなる ものである、請求項１の方法。
7. ７．該サンプル中の生成した活性化された基質の量を測定する前に、該全血から 赤血球を除去する段階を更に含んでなる、請求項６の方法。
8. ８．該サンプル中の生成した活性化された基質の量を測定する前に、全血が希釈 されそして赤血球が溶解されるものである、請求項６の方法。
9. ９．該全血が少なくとも約１６倍に希釈されるものである、請求項８の方法。
10. １０．該全血が少なくとも約２０倍に希釈されるものである、請求項８の方法。
11. １１．血小板の易興奮性を測定することによって標的個体の血栓症の危険性を判 定するための方法であって、（ａ）標的個体からの血小板を含んだサンプルをト ロンビンと、又はトロンビン及びコラーゲンと共にインキュベートし、（ｂ）段 階（ａ）より得られた生成物を、凝固促進性リン脂質依存性酵素又は酵素複合体 によって変換されることのできる基質と混合し、 （ｃ）段階（ａ）の混合物を、活性化された基質を生成させるために該酵素又は 該酵素複合体と接触させて反応させ、（ｄ）該サンプル中の生成した活性化され た基質の量を測定し、そして （ｅ）該標的個体からの血小板の易興奮性を一又はより多くの対照個体からの血 小板の易興奮性と比較する、ことを含んでなる方法。
12. １２．該標的個体からの血小板が、該血小板を活性化していない状態に維持する 仕方で単離されるものである、請求項１１の方法。
13. １３．該基質がプロトロンビンと第Ｘ因子とからなる群より選ばれるものである 、請求項１１の方法。
14. １４．該凝固促進性リン脂質依存性の酵素又は酵素複合体が、第Ｘ因子活性化複 合体とブロトロンビナーゼとからなる群より選ばれるものである、請求項１１の 方法。
15. １５．サンプル中の生成した活性化された基質が、色素原性基質を加水分解する その能力によって測定されるものである、請求項１１の方法。
16. １６．血小板を含んだ該サンプルが該標的個体から採取された全血を含んでなる ものである、請求項１１の方法。
17. １７．該サンプル中の生成した活性化された基質の量を測定する前に該全血から 赤血球を除去する段階を更に含んでなる、請求項１６の方法。
18. １８．該サンプル中の生成した活性化された基質の量を測定する前に該全血が希 釈され赤血球が溶解されるものである、請求項１６の方法。
19. １９．該全血が少なくとも約１６倍に希釈されるものである、請求項１８の方法 。
20. ２０．該全血が少なくとも約２０倍に希釈されるものである、請求項１８の方法 。
21. ２１．血小板の活性化を阻害する薬物をスクリーニングするための方法であって 、 （ａ）血小板を含んだサンプルを、（ｉ）トロンビン、又はトロンビン及びコラ ーゲン、及び（ｉｉ）試験薬物と共にインキュベートし、 （ｂ）段階（ａ）の得られた生成物を、凝固促進性リン脂質に依存性の酵素又は 酵素複合体によって変換されることのできる基質と混合し、 （ｃ）活性化された基質を生成させるために段階（ｂ）の混合物を該酵素又は酵 素複合体と接触させて反応させ、（ｄ）該サンプル中の生成した活性化された基 質の量を測定し、そして （ｅ）該試験薬物を含んだ該サンプルからの生成した活性化された基質の量を薬 物不含のサンプルからの生成した活性化された基質の量と比較し、そして該試験 薬物を含んだサンプルからの、該試験薬物自体によって生成した活性化された基 質の量を補正する、ことを含んでなる方法。