JPH06509509A - 活性化支持体材料、それらの調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化支持体材料、それらの調製および使用本発明は、活性化支持体材料ならび にこれら活性化支持体材料から調製することができるアフィニティー支持体およ び固定化酵素に関する。アフィニティークロマトグラフィ一工程において、分析 されるべき材料といわゆるアフィニティーリガンドとの間の特異的相互反応が共 存する物質を除去するために利用される。

分析されるべき材料は支持体に結合したアフィニティーリガンドに可逆的に結合 される。共存する物質は結合されず、したがって、容易に洗浄除去される。分析 されるべき材料は、結合の可逆性を利用して次いで放出される。放出は、例えば 、ｐＨの変化、イオン強度の変化、または溶解したアフィニティーリガンドを溶 出剤に添加することによって行われる。これらの工程および工程変法は当業者に 公知である。

アフィニティークロマトグラフィーの工程には、特定のタンパク質に対する抗体 の精製が含まれる。タンハク質バクロマドグラフィー支持体材料に結合される。

精製されるべき抗体を含む溶液をこの支持体材料にアプライする。抗体調製物の 非結合部分を洗浄除去して、次いで精製された抗体を溶出する。この工程を逆に して、特定のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する こともできる。その場合は、このタンパク質に対する抗体をクロマトグラフィー 支持体材料に結合させる。アフィニティークロマトグラフィーの他の適用におい ては、例えば、補酵素をクロマトグラフィー支持体に結合させて、この補酵素に 結合する酵素を精製する。補酵素の代わりに、染料を用いても同様の成果を得る ことができる。多数のアフィニティーリガンドを表１にまとめて例示する。他の アフィニティーリガンドおよび分析されるべき材料、さｔｈｍｅｒ　Ｅｎｃｙｃ ｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（ｐｐ、３ ５−４０．３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、１９７８、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　ａｎｄ　 ５ｏｎｓ）およびＰｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊａｎｓｏｎ、 Ｊ。

−Ｃ，ａｎｄ　ＲｙｄｅｎＳ　Ｌ、（ｅｄｉｔｏｒｓ）（ｐｐ、２７５−３２５ 、１９８９、ＶＣＨＰｕｂｌ　１ｓｈｅｒｓ）、あるいはＶｉｊａｙａｌａｋｓ ｈｉｍｉ、Ｍ、Ａ、（１９８９）ＴＩＢＴＥＣＨ７゜ｐｐ、７１−７６に見出さ れる。

プロティンＡ　免疫グロブリン フンカナバリンＡ　糖タンパク質 ビオチン　アビジン／ストレプト アビジン アビジン　ビオチン ストレプトアビジン　ビオチン ２′、５′　−アデノシン　ＮＡＤＰ−依存性オキ二燐酸　シドレドクターゼ アミノアクリジン　ＲＮＡまたはＤＮＡホウ素酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ） 　カテコールアミンｙｈ　ウ素Ｉｔ　（Ｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）　グリコジ ル化ヘモグロビン イミノニ酢酸　金属タンパク質 「好チオ」リガンド　免疫グロブリン シバクロミウムブルー　モノクローナル抗体（Ｃｌｂａｃｈｒｏｍｉｕｍ　Ｂｌ ｕｅ）異なるリガンドがアフィニティークロマトグラフィーにはしばしば必要と される。したがって、特定のリガンドを簡単な工程によってそれに結合すること ができるような活性化支持体材料の提供が確立されてきた。

最初の製品のひとつはＢｒＣＮ−アガロースであって、これは臭化シアンで活性 化した架橋アガロースである。

これはリガンドの一級アミン基と反応して、これを支向上は、例えば架橋ポリ− （メタ）アクリル酸誘導体の導入によってまたは基部材料としてシリカゲルを使 用することによって、達成された。

ＥＰ　０６４　８３３によれば、シリカゲルをγ−グリシドオキシプロビルトリ メトキシシランと反応させて、活性化支持体材料を形成させ、そのオキシラン基 にアフィニティーリガンドを結合させることができる。

ＤＥ　４０　０２　０４４によれば、例えば「好チオ」リガンドをオキシラン基 に結合させる。これらアフィニティー支持体は、例えばモノクローナル抗体のよ うな免疫グロブリンの精製にとくに適している。ＵＳＡ、７３７．５６０には、 活性基としてアズラクトン化合物を含む架橋ポリマーに基づく活性化支持体材料 が記ＥＰ　０１７２　５７９には、その上に架橋ポリマーをアプライした、シリ カゲルの芯を有する支持体材料が記述されている。これらポリマーは、活性化基 として例えばオキシラン基を含むことができる。いくつかのポリマーのオキシラ ン基の反応によって支持体に結合される。これによって、５ｉ−０結合が形成さ れるが、これは容易に加水分解される。前もって形成したポリマーをシリカゲル に結合させることから、そこに付加できる密度は制限される。さらにポリマーの 架橋は、タンパク質や核酸などの高分子化合物のアクセスを妨げる。

アフィニティークロマトグラフィーにおいて分析されるべき材料は高分子量（＞ １０３）の化合物であることが多いことから、質量輸送速度、したがって分離工 程の生産性は、拡散工程によって限定される。ＵＳ５．０１９．２７０には、支 持粒子の特異的形状およびそれによる液体動力学に基づいて、質量輸送の加速が 可能になったクロマトグラフィー支持体が開示されている。ＥＰ　Ｏ２９５０７ ３には、質量輸送を加速するための別の方法が開示されているが、そこでは、ス ペーサーとしてポリエチレングリコールを用いることによってアフィニティーリ ガンドはよりアクセスしゃすくなっている。しかし、これら材料の結合能力には 、ＥＰ　Ｏ０６４８３３による材料と同様に制限がある。

アフィニティー支持体の調製のために用いら株る活性化支持体材料はさらに、一 般に酵素の固定化に適している。そのような固定化酵素は、しばしば安定性が向 上する。さらに、反応バッチから容易に除去され、また再使用もできる。固定化 酵素の別の用途には、貫流条件下での連続反応処理を可能にする酵素リアクタ− の提供がある。しかし、酵素は固定化の間にしばしば不活化されることが見出さ れ、結合反応後の結合酵素の収量はきわめて低い。とくに、高分子量基質（分子 量）１０３）に対する反応性はそのために低下する。

ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡを生物学的に不活性の小オリゴヌクレ オチドに加水分解する核酸加水分解酵素であるペンゾナーゼおよびプロテイナー ゼには高分子量基質を優先的に変化させる酵素であるが、今日までに知られる方 法では固定化できない酵素の例としてあげることができる。ペンゾナーゼは、生 物学的に得られた薬物活性化合物に残存する核酸を分解し、それによって遺伝材 料の望ましくない転移を排除することができる。そのような工程は貫流リアクタ ー中で行うことが好ましい。このためには、高分子量核酸に対する反応性を保持 しながらペンゾナーゼを適当な活性化支持体に固定化することが必須条件となる 。

固定化において同様の問題を有する他の酵素は、文献から当業者に公知である。

このように、アフィニティーリガンドまたは酵素を簡単な方法で結合できる活性 化支持体材料の提供がめられる。得られるアフィニティー支持体は、優れた結合 能を有し、高度の質量輸送を可能にするものでなくてはならず、酵素の固定化の 間は、その反応性、とくに高分子量基質に対する反応性が保持されねばならない 。

驚くべきことに、オキシラン基もしくはアズラクトン基またはアズラクトン基の 前駆体を含む、（メタ）部支持体上にグラフトすることが可能であることが見出 された。本発明によれば、重合はここでセリウム（ＩＶ）イオンを用いて始めら れる（Ｇ、Ｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｓ、Ｋａ　ｉｚｅｒｍａｎ　（１９５８）Ｊ、Ｐ 。

ｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　３ユ、ｐｐ、２４２−２４３、Ｇ、Ｍｉｎｏ　ｅ ｔ　ａｌ、（１９５９）Ｊ。

Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　３８，３９３−４０１）。この方法によって 得られる支持体材料は簡単な方法でアフィニティー支持体に変換することができ 、優れた結合能および高度の質量輸送能を有している。

そのアズラクトン基がチオエーテル結合を介して支持体に結合しているアズラク トングループを有する活性化支持体材料もまた、顕著な特性を示す。これら活性 化支持体材料もまた、チオエーテル結合が直接に基部支持体に結合していれば、 とくに有利な特性を示す。

このように、本発明は、その表面にポリマーが共有結合で結合している、水酸基 を含む基部支持体に基づく活性化支持体材料に関し、それは次のように特徴づａ ）基部支持体は脂肪族水酸基を含み、ｂ）共有結合したポリマーは末端モノマー ユニットを介して基部支持体に結合され、 Ｃ）ポリマーは一般式Ｉのモノマーユニットを含み、そして ｄ）モノマーユニットは線状に結合している。

［ただし上記式において、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｘは、アズラクトン基またはオキシラン基を含む活性化グループである］ 本発明はまた、一般式ＶＩＩａまたはＶＩＩｂのひとつに対応する基を含む活性 化支持体材料に関する。

［ただし上記式において、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｒ５およびＲ６はそれぞれ互いに独立してＨまたは１〜５個のＣ原子を有するア ルキルである］本発明はまた、その表面にポリマーがグラフト重合　・によって 共有結合されている水酸基を含む基部支持体から出発する活性化支持体材料の調 製法に関し、それは、水酸基を含む基部支持体粒子を懸濁させて、セリウム（Ｉ Ｖ）イオンの存在下で一般式ＩＶのモノマーからなる溶液中で重合させ、 ［ただし上記式において、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｙは、オキシラン基またはアズラクトン基またはそれからアズラクトン基を生じ ることができる基を含む、活性化または活性化が可能なグループである」そして 、適宜、前駆体化合物をアズラクトン環系に変換することを特徴とする。

本発明はまた、一般式ＶＩＩＩのビニルアズラクトンとの反応による、チオール 基を含む基部支持体から出発する活性化支持体材料の調製法に関する。

［ただし上記式において、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立してＨまたは１〜５個のＣ原子を有する アルキルである］本発明はまた、本発明による活性化支持体材料の、アフィニテ ィーリガンド結合および酵素固定化のための使用に関する。

本発明はまた、当業者に詳細に知られるアフィニティーリガンドを本発明による 活性化支持体材料に結合させることを特徴とする、アフィニティー支持体の調製 法に関する。

本発明はまた、アフィニティーリガンドを本発明による活性化支持体材料に結合 させることによって調製することができる、アフィニティー支持体に関する。

本発明はさらに、本発明によるアフィニティー支持体の、バイオポリマーの精製 における使用に関する。

本発明はまた、本発明による活性化支持体材料に酵素を結合させることを特徴と する、酵素固定化法に関する。

本発明はまた、本発明による活性化支持体材料上にに酵素を固定化することによ って調製できる固定化酵素、および酵素反応のためのそれらの使用に関する。

本発明による支持体材料の構造は、Ｍ　ｉ　ｎ　ｏらによって最初に記述された 一連の反応の結果生じる。すなわち、強酸性の水溶液中でセリウム（ＩＶ）塩を 用いる反応によって基部支持体材料の第一および第二の水酸基は炭素または可能 であればまた酸素基に変換される。遊離基連鎖反応はこれらの基土で始まり、加 えられるモノマーは鎖に取り込まれる。この鎖は線状で、モノマーユニットで基 部支持体の脂肪族基に連結される。重合は、セリウム（ＩＶ）塩の関わる終結反 応で終わる。したがって、（平均）鎖長は基部支持体、イニシエーターおよびモ ノマーの濃度比によって影響される。均一モノマーあるいは異なるモノマーの混 合物を用いることもできる。後者の場合は、グラフト共重合体が形成される。

アズラクトン基がチオエーテル結合を介して支持体に結合しているようなアズラ クトングループを有する活性化支持体材料の調製のためには、次のような一連反 応が用いられる。

ａ）基部支持体がチオールまたはオキシラン基のいずれをも有しない場合は、オ キシラン基を最初に導入する。このために、基部支持体の脂肪族水酸基をエビク ロロヒドリンと反応させるが、（メタ）−アクリルグリシジルエステルを基部支 持体の脂肪族水酸基上にグラフトする。次いで、既知の方法でアルカリ媒体中で オキシラン基を二硫化ナトリウムと反応させることによってチオール基を導入す る。

ｂ）次いで、最初のステップによって導入されたまたは既に存在していた基部支 持体のチオール基を、ビニルアズラクトン誘導体のビニル二重結合上に加える。

この反応は、好ましくは、ＥＰ　Ｏ４７３４５７に従って１．８−ジアザビシク ロ［５，４，０］−ウンデク−７−エンによって触媒される。ビニルジメチルア ズラクトンはとくに好ましいビニルアズラクトン誘導体である。

本発明における基部支持体は、粒子にポリマーをグラフトさせるものである。一 般に、その表面に第一または第二脂肪族水酸基を含む限り、通常の有孔または無 孔の支持粒子を基部支持体として用いることができる。とくに適当な材料は、ア ガロースを基にした多糖類、セルロース、セルロース誘導体およびデキストラン を基にしたポリマーである。ポリビニルアルコールを基にしたポリマーまたは（ メタ）アクリル酸塩誘導体の共重合体および脂肪族水酸基との共モノマーが好ま しい。ジオール修飾したシリカゲルはとくに好ましい基部支持体である。好まし い市販の基部支持体は、脂肪族水酸基と同様、脂肪族水酸基（１ミリ等量のＯＨ ／ｇ）を含む多孔性ビニル基部の共重合体であるＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商 標）ＴＳＫ　ＨＷ　６５　（Ｓ）（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）および、ジオール置換シリ カゲルであるＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）ＤＩＯＬ（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ ）である。

しかし、広義の基部支持体としてはまた、脂肪族水酸基を含むか自体公知の方法 でそこに脂肪族水酸基を導入することができるような、膜または先様および網様 または織物様材料がある。これらの材料はまた、機械的安定性を向上させるため の追加の支持体構成を含むことができる。同様に、これら材料は、それらの脂肪 族水酸基を用いることによって活性化支持体材料に変換することもできる。粒子 状基部支持体のための下記のような同様の一連反応が本質的にここでは用いられ る。

アフィニティーリガンドは、特異的相互反応をすることができ、したがって、ア フィニティークロマトグラフィーにおける使用に適している、化学的化合物であ る。そのようなアフィニティーリガンドの例の概要は表１に示されている。

本発明における活性化基とは、ポリマーのモノマーまたはモノマーユニットと共 有結合して存在し、アフィニティーリガンドとの共有結合をする、化学的反応性 を有する基である。本発明における活性化基は、とくに、オキシラン基を含む一 般式ＩＩによる基、およびアズラクトンを含む一般式ＩＩＩによる基である。

一般式ＩＩにおいて、 Ｒ４はＨ，１〜５個のＣ原子を有するアルキルまたは６〜１２個のＣ原子を含む アリールであり、そしてｎは１から５までの整数である。

一般式ＩＩＩにおいて、 Ｒ５およびＲ６は互いに独立して、Ｈまたは１〜５個のＣｗ、子を有するアルキ ルである。

活性化支持体材料は、活性化基を有するポリマーがその上に結合されたかたちで 存在する基部支持体である。アフィニティー支持体は、アフィニティーリガンド を有するポリマーがその上に結合している基部支持体であり、その結合は活性化 基によって達成される。

酵素は生物触媒として作用するタンパク質である。

しかし、触媒的機能を有しており（いわゆるリボチーム）、本発明によれば「酵 素」という用語で包含される核酸誘導体もまた、知られている。酵素は、例えば アルコールまたは核酸などの特定の基質が反応する、例えば酸化還元反応または 加水分解反応などの特定の反応を特異的に触媒する。これらの反応において酵素 によって補足因子がしばしば必要とされる。代謝においては、いくつかの酵素が 一緒に作用して、反応値を触媒する。酵素的触媒反応、これらに関与する酵素お よび補足因子、および生化学的反応鎖の詳細は、当業者に公知である。さらに酵 素は、例えばオキシラン、カルボニルイミダゾールまたはトレシル誘導体などの 多様な反応物質によって支持体材料上に固定化することができる。種々の酵素が 反応値において一緒に作用するとすれば、中間的産物の拡散経路を短縮するため にそれら酵素を互いに接近させて支持体に固定化することができる。したがって 、本発明によると、酵素を個々に固定化するか、または例えば反応値で共同で作 用する種々の酵素を一緒に固定化することもできる。

本発明でいう活性化できる基とは、活性化基のための前駆体化合物を含む基であ る。その−例として、一般式ＩＩＩによるアズラクトン基に変換できる、一般式 ＶＩによるカルボン酸塩誘導体があげられる。

一般式ＶＩにおいて、 Ｒ５およびＲ６は互いに独立して、Ｈまたは１〜５個のＣ原子を有するアルキル である。

一般式１、ＩＶおよびＶにおけるＲ１およびＲ２は好ましくはＨであり、すなわ ちアクリル酸およびメタクリル酸誘導体が好ましい。

一般式ＩＩにおいて、ｎは好ましくは１．２または３であり、Ｒ４は好ましくは Ｈ１メチル、エチルまたはプロピルである。２．３−エポキシプロビル基は一般 式ＩＩの化合物としてとくに好ましく、その場合、ｎ＝１およびＲ４＝Ｈである 。

一般式Ｉ　Ｉ　Ｉ、ＶＩ、ｖエエａＳｖ工ＩｂおよびｖＩＩＩにおいて、Ｒ５お よびＲｅ３基は好ましくは同じであり、つまり光学的に不活性の化合物が好まし い。Ｒ５およびＲ６基は好ましくはＨ，メチル、エチルまたはプロピルである。

ふたつの基はとくに好ましくはＨまたはメチルのいずれかであり、すなわちグリ シンおよび２−メチルアラニンの誘導体であり、さらにアズラクトンとの組み合 わせはとくに好ましい。

用いられるビニルアズラクトン誘導体のビニル基は好ましくは置換されておらず 、すなわち一般式ＶＩＩａＸｖＩＩｂおよびｖＩＩＩにおけるＲ１、Ｒ２および Ｒ３は好ましくはＨである。

場合によっては、支持体材料の付加可能な濃度を制限することもまた有益である 。このために、一般式Ｉによるモノマーに加えて、活性化基を含まない一般式■ のモノマーを好ましくは追加して用いる。

一般式Ｖにおいて、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は一般式Ｉの場合と同じ意味を有する 。好ましくは、一般式ＩＶによる七ツマ−６０〜９９．５％および一般式Ｖによ るモノマー０５〜４０％を、共重合体の調製において用いる。

一般式ＩＶおよびＶによるモノマーは市販されていないが、当業者に公知の標準 的工程によって得ることができる。そのような標準的工程の例としては、５ｃｈ ｏｔ　ｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎアシル化および５ｔｒｅｃｋｅｒ合成法などがあ げられる。これらの工程の詳細は、例えばＨｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈ。

ｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）、 Ｇｅｏｒｇ　ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔなどの通常のハン ドブックに記述がある。

Ｍ　ｉ　ｎ　ｏおよびＫａｉｚｅｒｍａｎ法によるグラフト重合は、硝酸の純粋 水溶液中で既知の工程によって行われる。したがって、この反応は、容易に水に 溶けるモノマーについてのみ可能である。しかし、驚くべきことに、水と水酸基 を含まない有機溶媒との混合物を溶媒として用いると、セリウム（ＩＶ）塩を用 いる反応もまた可能であることが見出された。ジオキサンまたはテトラヒドロフ ランはここでとくに好ましい。

反応液中の有機溶媒の含量は、好ましくは１０〜８０容量％であり、とくに好ま しくは２０〜５０容量％である。

オキシラン基は希無機酸で処理することによって加水分解され得ることが知られ ていることから、オキシラン基を含むモノマーが無機酸溶液中でセリウム（工Ｖ ）塩によって重合されてそのオキシラン構造が保持されることは驚くべきことで ある。

グラフト重合体に含まれる一般式ＶＩによるアズラクトン基のための前駆体化合 物は、当業者に公知の工程によってアズラクトン基に変換される。無水酢酸を用 いる反応がこの目的のために好ましい。

アフィニティー支持体を調製した後、一般に未反応の活性化グループがまだ残っ ている。これらの基は通常、過剰の水溶性アミノまたはチオール化合物との反応 によって変換される。この目的のために、アミノエタノールが好ましく用いられ る。アフィニティーリガンドが加水分解に対して安定である場合には、過剰の活 性化グループはまた、例えば酸素を含む硫酸または硝酸などの希無機酸によって 加水分解的に除去できる。

０．５Ｍ硫酸による３５〜６０℃での反応（持続時間、１〜５時間）がここで好 ましい。

通常の支持体材料よりも優れた結合能を有するアフィニティー支持体が本発明に よる活性化支持体材料から調製されることが見出された。質量輸送およびその結 果としてアフィニティー支持体の生産性もまた、改善される。これらの特長は、 多数の活性化基が活性化支持体材料上に付与されたことに基づくことは明らかで あり、これらの基は可撓性の線状ポリマーによって結合されている。アフィニテ ィー支持体の調製中には、とくに立体構造的に好ましい活性化基が反応する。さ らに、これらアフィニティー支持体は、ポリマーに被われていない従来の支持体 材料よりも酸や塩基の作用に対してより抵抗性がある。本発明による活性化支持 体材料から調製され得る固定化酵素もまた、従来の支持体材料、にに固定化され た酵素調製物に比較すると、改善された特性を有する。

さらなる実施態様を示すまでもなく、当業者は上記された記述をより広範囲に利 用することができると考えられる。したがって、好ましい実施態様は単なる説明 的開示であり、開示を限定するものでは決してないことが了解されるべきである 。

上記および下記のすべての出願、特許および公開物ならびに１９９２年４月１６ 日出願の対応する出願ＤＥ　４２　１２　７３０の完全な開示は、本出願中に参 考文献として表示されている。

以下の実施例は発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものでは ない。

調製実施例 以下の調製実施例において、室温は１５〜３０℃である。重合は、攪拌器、滴下 濾過および温度計を備えた適当な大きさの三つ首フラスコの中で行う。洗浄は吸 引フィルター上で吸引による濾過によって行う。

［実施例１］ Ｆｒａｅｔｏｇｅｌ　（登録商標）−ＴＳＫ　ＨＷ　６５（Ｓ）を出発材料とす るＡキシラン−活性化支持体の調製 ２ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム（２５ｍ１０’）　２　Ｍ　ＨＮ　Ｏ ａに溶解）を、５０ｒｎｌの沈澱させたＦｒａｅｔｏｇｅｌ　（登録商標）−Ｔ ＳＫ　ＨＷ　６５（Ｓ）および２５　ｍ　ｌの水との懸濁液を室温ではげしく攪 拌しながら混合する。１分間後に、３ｇのメタクリル酸２．３−・エポキシプロ ビル３０ｍ１のジオキサン溶液を加える。攪拌をさらに３時間続ける。次いで、 反応懸濁液を、最初に蒸留水で、次に０．０５ＭのＥＤＴＡ溶液で、洗浄する。

［実施例２］ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）−Ｄｉａｌを出発材料とするオキシラン −活性化支持体の調製調製は実施例１と同様にして行うが、ＦｒａＣｔＯｇｅ　 １−ＴＳＫ　ＨＷ　６５　（Ｓ）の代わりにＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商 標）−ジオール（粒子サイズ１５〜２５μｍ１孔サイズ８０ｎｍ）を基部支持体 として用いる。

［実施例３］ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）に基づく金属キレートクロマトグラフィーの ためのアフィニティー支持体の調製 イミノニ酢酸のジナトリウム塩の０．４Ｍ溶液２００　ｍ　ｌを、実施例１によ って調製した吸引濾過したオキシラン−活性化支持体材料の１００　ｍ　Ｖに加 える（ｐＨ＝１１）。溶液を４５℃で２４時間攪拌する。反応生産物を吸引濾過 して、水で洗浄して、未−反応のオキシラン基をＺ　ＯＯｍ　Ｌの０．５Ｍ硫酸 による処理によって加水分解する（４５℃で２時間）。

次いで、アフィニティー支持体材料を０．２Ｍ亜硫酸塩溶液（ｐＨ＝２）　、そ して１Ｍ硝酸および０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗浄する。

［実施例４］ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）−ジオールニ基づく金属キレートクロマ トグラフィーのためのアフィニティー支持体の調製 イミノニ酢酸のジナトリウム塩の０．４Ｍ溶液２００　ｍ　ｌを、実施例２によ って調製した吸引濾過したオキシラン−活性化支持体材料の１００　ｍ　ｌに加 える（ｐＨ＝９）。溶液を４５℃で２４時間攪拌する。反応生産物を吸引濾過し て、水で洗浄して、未反応のオキシラン基を２００　ｍ　ｌの０．５Ｍ硫酸によ る処理によって加水分解する（４５℃で２時間）。

次いで、アフィニティー支持体材料を０，２Ｍ亜硫酸塩溶液（ｐＨ＝２）および １Ｍ硝酸で洗浄する。最後に、Ｎａ燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７）で洗浄し て中和する。

［実施例５］ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）−ＴＳＫ　ＨＷ　６５（Ｓ）に基づく「好チ オ」タンパク質吸着のためのアフィニティー支持体の調製 ステップ１： 実施例１によって調製した吸引濾過したオキシラン−活性化支持体材料の１００ 　ｍ　ｌを、２００ｍ　ｌの４ＭＮａＨＳ溶液（ｐＨ＝１１）に懸濁させて、懸 濁液を室温で１時間攪拌する。次いでこれを蒸留水で洗浄する。

ステップ２： ＺＯＯｍｌの０．４Ｍジビニルスルホン溶液（０゜５ＭＮａ２ＣＯ３溶液に溶解 、ｐＨ＝１１）をステップｌにおいて得られた材料に加えて、混合物を室温で１ 時間攪拌する。次いでゲルを蒸留水で洗浄する。

ステップ３ニ ステップ２で得られた材料を、２００ｍ１の２．３Ｍ　メルカプトエタノールの ０．５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３溶液（ｐＨ＝１１）中で４５分間攪拌する。次いで、生 産物をそれぞれ２回それぞれ２００　ｍ　ｌの０，２Ｍ亜硫酸塩溶液（ｐＨ＝１ ）、１Ｍ硝酸および０．０５ＭＮａＯＨで洗浄する。

［実施例６］ ■、１Ｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）−ジオールに基づく「好チオ」タンパ ク質吸着のためのアフィニティー支持体の調製 ステップ１ １００　ｍ　ｌの実施例２によって調製した吸引濾過したオキシラン−活性化支 持体材料を、２００　ｍ　ｌの４ＭＮａＨ３溶液（ｐＨ＝９）に懸濁させて、懸 濁液を室温で１時間攪拌する。次いで、これを蒸留水で洗浄２００　ｍ　ｌの０ ．４Ｍジビニルスルホン溶液（０゜５Ｍ　Ｎａ２ｃＯ３溶液に溶解、ｐＨ＝９） をステップ１において得られた材料に加えて、混合物を室温で１時間攪拌する。

次いでゲルを蒸留水で洗浄する。

ステップ３ニ ステップ２で得られた材料を、２００　ｍ　ｌの２．３Ｍメルカプトエタノール の０．５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３溶液（ｐＨ＝９）中で４５分間攪拌する。

次いで、生産物をそれぞれ２回それぞれ０．２Ｍ亜硫酸塩溶液（ｐＨ＝１）およ び１Ｍ硝酸で洗浄する。

最後に、これをＮａ燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ５ｐＨ７）で洗浄して中和する。

［実施例７］ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）−ＴＳＫ　ＨＷ　６５（Ｓ）を出発材料とす るアズラクトン−活性化支持体の調製 ステップｌ：ポリ−（アクリロイルメチルアラニン）からなるグラフト重合体 反応のために、出発物質を懸濁させて七ツマ−［［およびイニシエーター溶液を 調製する。

モノマー溶液　５ｇのアクリロイル−２−メチルアラニンを２０ｍ１の水に４Ｍ ＮａＯＨを加えて溶解する。

５０　ｍ　ｌのジオキサンを添加した後、混合物を４５℃に加熱する。次いで、 ｐＨを２５％ＨＣＩを用Ｉ／′１てｐＨ＝１．５にする。

イニシエーター溶液、３５ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムを５０　ｍ　 ｌの２Ｍ　ＨＮＯ３に溶解する。

出発材料の懸濁液　７５　ｍ　ｌの沈澱させたゲルＦｒａｅｔｏｇｅｌ（登録商 標’）ＴＳＫ　ＨＷ　６５　（Ｓ）を７５　ｍ　ｌの蒸留水に懸濁して、懸濁液 を番よ＆デしく攪拌しながら１００　ｍ　ｌのジオキサンで希釈する（約２００ 回転／分）。

出発材料の懸濁液を４５℃に加熱して、装置を空気抜きしてからアルゴンを通す 。

イニシエーター溶液を加えて、混合物を１分間放置し、次いで、４５℃に加熱し たモノマー溶液を加える。

得られる混合物を４５℃で３時間攪拌する。室温まで冷却した後、生産物を０． ２Ｍ亜硫酸溶液（ｐ　Ｈ＝　１　）、０．５Ｍ　ＮａＯＨおよびアセトンで洗浄 する。次いで、ゲルを６０℃で２４時間で乾燥する。

ステップ２：アズラクトン誘導体への環化５００　ｍ　ｌの無水酢酸をステップ １で得られた生産物に加えて、混合物を１００℃で２時間攪拌する。生産物を吸 引濾過して、真空乾燥キャビネット中で６０℃で２４時間乾燥する。

［実施例８］ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）−ジオールを出発材料とするアズラクト ン−活性化支持体の調製ステップ１゛ポリ−（アクリロイルメチルアラニン）か らなるグラフト重合体 反応のために、出発物質を懸濁させてモノマー溶液およびイニシエーター溶液を 調製する。

モノマー溶液：５ｇのアクリロイル−２−メチルアラニンを２０　ｍ　ｌの水に ４ＭＮａＯＨを加えて溶解する。

５０　ｍ　ｌのジオキサンを添加した後、混合物を４５℃に加熱する。次いで、 ｐＨを２５％ＨＣＩを用いてｐＨ＝１．５にする。

ビニルエーター溶液：３．５ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムを５０ｍ１ の２Ｍ　ＨＮＯ３に溶解する。

出発材料の懸濁液：　７５　ｍ　ｌの沈澱させたゲルＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　 （登録商標）−ジオールを７５　ｍ　ｌの蒸留水に懸濁して、懸濁液をはげしく 攪拌しながら１００　ｍ　ｌのジオキサンで希釈する（約２００回転／分）。

出発材料の懸濁液を４５℃に加熱して、装置を空気抜きしてからアルゴンを通す 。

ビニルエーター溶液を加えて、混合物を１分間放置し、次いで、４５℃に加熱し たモノマー溶液を加える。

得られる混合物を４５℃で３時間攪拌する。室温まで冷却した後、生産物を０． ２Ｍ亜硫酸溶液（ｐＨ＝１）およびＮａ燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ５ｐＨ７）で洗 浄する。次いで、ゲルを６０℃で２４時間乾燥する。

ステップ２°アズラクトン誘導体への環化５００　ｍ　ｌの無水酢酸をステップ １で得られた生産物に加えて、混合物を１００℃で２時間攪拌する。生産物を吸 引濾過して、真空乾燥キャビネット中で６０℃で２４時間で乾燥する。

［実施例９］ プロティンＡを含むアフィニティー支持体の調製２０　ｍ　ｇのプロティンＡを １０ｍ１の１Ｍ硫酸アンモニウム溶液および２５　ｍ　ｌのＮａ燐酸塩緩衝液（ ２０ｍ　Ｍ　Ｓｐ　Ｈ＝　７　、　５　）の混合物に溶解する。実施例７で得ら れるＩｇのアズラクトン−活性化支持体材料を加えて、懸濁液を室温で２４時間 振盪する。

次いで、５０ｍ１のエタノールアミン水溶液（ＩＭ）を懸濁液に加えて、混合物 をさらに１時間振盪する。

その後、生産物を吸引濾過して、２５ｍＭＮａ燐酸塩＋０．１５Ｍ　ＮａＣ１（ ｐＨ＝７．５）で洗浄する。

このようにして得られるアフィニティー支持体は、湿ゲルＩｇ当たり２０　ｍ　 ｇのγ−グロブリンを結合する（９ｇ／リットルＮａＣ１を含む５０ｍＭのトリ ス緩衝液（ｐＨ８）中で）。

［実施例１０］ チオエーテル架橋を介してアズラクトン基を結合させた、アズラクトン−活性化 支持体の調製ステップｌ：エポキシ基の導入 ２５０ｍ１のＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＨＷ　６５　（Ｓ）　（Ｅ、　 Ｍｅ　ｒ　ｃ　ｋ、　ＤＥ）を１５ｇのＮ　ａ　ＯＨノ１００　ｍ　ｌ水溶液中 に懸濁する。６０　ｍ　ｌのエビクロロヒドリンを、２０分間かけて攪拌しなが ら滴下して加える。次いで温度を７０℃に上げて、混合物を９０分間攪拌する。

次いで懸濁液を再び室温にまで放冷して、ゲルを吸引濾過する。次いでゲルをそ れぞれ２００　ｍ　ｌの水を用いて３回、メタノールで２回および水で２回洗浄 する。

ステップ２゛チオール基の導入 ステップ１からの生産物を１０００　ｍ　ｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ１１）中に懸濁させて、２００ｇのＮａＨ３（−水化物、商品番号１７．１ ５０７８　（Ｊａｎｓｅｎ　ＣｈｉｍｉｃａＳＤＥ））を攪拌しながら加えて、 混合物を１時間攪拌する。次いで生産物を吸引濾過して、それぞれ２００　ｍ　 ｌの水で３回洗浄して、５００　ｍ　ｌの０．５Ｍ硫酸中に再懸濁する。懸濁液 を６０ｔｌｌ、に攪拌しながら加熱して、２時間攪拌する。生産物を吸引濾過し て、それぞれ２００ｍ１の水で５回およびそれぞれ２００　ｍ　ｌのアセトンで ３回洗浄して、次いで乾燥する（６０℃で１６時間）ステップ３：ビニルジメチ ルアズラクトンへのチオール基の付加 ７ｇのビニルジメチルアズラクトンを３５　ｍ、　１のジメチルホルムアミドに 溶解して、ステップ２で得られる３、５ｇのチオール−誘導体化したＦｒａｃｔ ｏｇｅｌ（登録商標）をこの溶液に懸濁させる。６００μｌの１，８−ジアザビ シクロ（５，４，０）ウンデク−７−ｚ：ｚ（商品番号８０３２８２、Ｅ、Ｍｅ ｒｃｋ／ＤＥ）を加えて、混合物を室温で２４時間攪拌する。

ゲルを吸引濾過して、それぞれ５０　ｍ　ｌのジオキサンで３回洗浄して、３０ ０　ｍ　ｌの酢酸エチルを用いてツクスレー抽出装置中で１６時間抽出する。ゲ ルを再び吸引濾過して、それぞれ５０　ｍ　ｌのジオキサンで３回、それぞれ５ ０　ｍ　ｌのアセトンで３回洗浄して、６０’Ｃで１６時間乾燥する。

［実施例１１］ 千オニーチル架橋によってアズラクトン基を結合させた、アズラクトン−活性化 支持体の調製溶液： ａ）スターター溶液： ４ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムおよび７゜５ｇの硝酸（含量６５％） を５００　ｍ　ｌの水に溶解する。

ｂ）モノマー溶ｔ： ３．８ｇのメタクリル酸２．３−エポキシプロビルを１００　ｍ　ｌの１，４− ジオキサンに溶解する。

ステップｌニゲラフト重合 ２５０　ｍ　ｌ　＋７）沈澱させたＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＴＳＫ　 ＨＷ６５　（Ｓ）を１２５　ｍ　ｌ　（り水に懸濁する。スターター溶液を攪拌 しながら加えて、混合物を１分間攪拌する。次いでモノマー溶液を攪拌しながら 加える。３時間攪拌した後、ゲルをガラスフィルター吸引フィルター上で吸引濾 過して、それぞれ２５０　ｍ　ｌの次の洗浄溶液で処理する。水で２回、０．０ ５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で１回、水で１回、０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ 溶液で１回、水で２回、アセトンで２回、ジエチルエーテルで２回。生産物を３ ５℃で真空乾燥キャビネット中で乾燥させる。元素分析の結果は、Ｃ：５３．７ ％、Ｈニア、５％、Ｎ：０゜４％である。

ステップ２：チオール基の導入 ステップ１からの生産物を１０００　ｍ　ｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ１１）中に懸濁させて、２００ｇのＮａＨ３（−水化物、商品番号１７．１ ５０７８　（Ｊａｎｓｅｎ　Ｃｈｉｍｉｃａ、ＤＥ））を攪拌しながら加えて、 混合物を１時間攪拌する。次いで生産物を吸引濾過して、それぞれ２００ｍ１の 水で３回洗浄して、５００　ｍ　ｌの０．５Ｍ硫酸中に再懸濁する。懸濁液を６ ０℃に攪拌しながら加熱して、２時間攪拌する。生産物を吸引濾過して、それぞ れ２００ｍ１の水で５回およびそれぞれ２００　ｍ　ｌのアセトンで３回洗浄し て、次いで乾燥する（６０℃で１６時間）ステップ３：ビニルジメチルアズラク トンへのチオール基の付加 ７ｇのビニルジメチルアズラクトンを３５ｍ１のジメチルホルムアミドに溶解し て、ステップＺで得られる３、５ｇのチオール−誘導体化したＦｒａｃｔｏｇｌ の１．８−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−７−エン（商品番号８０３ ２８２、Ｅ、Ｍｅｒｃｋ／ＤＥ）を加えて、混合物を室温で２４時間攪拌する。

ゲルを吸引濾過して、それぞれ５０ｍ１のジオキサンで３回洗浄して、３００　 ｍ　ｌの酢酸エチルを用いてツクスレー抽出装置中で１６時間抽出する。ゲルを 再び吸引濾過して、それぞれ５０ｍ１のジオキサンで３回、そ゛れぞれ５０ｍ１ のアセトンで３回洗浄して、６０℃で１６時間乾燥する。

［実施例１２］ チオエーテル架橋を介してアズラクトン基を結合させた、アズラクトン−活性化 支持体へのプロティンＡの固定化 ５０　ｍ　ｇのプｏフィンＡを１０　ｍ　ｌの緩衝液Ａ（２５ｍＭ燐酸ナトリウ ム、ｐＨ７，５，１Ｍ硫酸ナトリウム）に溶解して、２ｇの実施例１０からのア ズラクトン−誘導体化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）をこの溶液に懸濁 させる。懸濁液を振盪機上で２４時間振盪する。次いでゲルを吸引濾過して、そ れぞれ２０　ｍ　ｌの緩衝液Ｂ（２５ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ９゜０．１Ｍエ タノールアミン）で３回洗浄して、５０ｍ１の緩衝液Ｂに懸濁して、再度５分間 振盪する。再びゲルを吸引濾過して、それぞれ２０　ｍ　ｌの緩衝液Ｃ（５０ｍ Ｍ）リス、ｐＨ７，４，９ｇ／リットルＮａＣ１）で３回洗浄して、５０　ｍ　 ｌの緩衝液Ｃに懸濁する。

［実施例１３］ エポキシ−活性化支持体上へのペンゾナーゼの固定化溶液： ａ）スターター溶液： ３ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムおよび３ｇの硝酸（含量６５％）を１ ９０　ｍ　ｌの水に溶解する。

ｂ）モノマー溶液： ６ｇのメタクリル酸２．３−エポキシプロビルを４４　ｍ　ｌの１．４−ジオキ サンに溶解する。

Ｃ）緩衝液Ｉ： ２５ｍＭ）リス／ＭＣＩ、０．５ｍＭ　ＭｇＣＩ２、ｐＨ８，０，５０容量％の エチレングリコール。

ｄ）緩衝液Ｌ： ２５　ｍ　Ｍ　）リス、２．５ｍＭ　ＣａＣ１２、ｐＨ７゜５．５０容量％のエ チレングリコール。

ステップ１：エポキシ基を含む線状ポリマーの、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商 標）ＴＳＫ　ＨＷ６５　（Ｓ）へのグラフト １００　ｍ　ｌの沈澱させたＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＴＳＫ　）ＩＷ ６５　（Ｓ）を６６ｍ１の水に懸濁する。攪拌しながらスターター溶液を加えて 、混合物を１分間攪拌する。次いで、攪拌しながらモノマー溶液を加える。室温 で１８０回転／分で１時間攪拌した後、ゲルをガラスフィルター吸引フィルター 上で吸引濾過して、それぞれ１５０ｍ１の次の洗浄溶液で処理する。水で４回、 アセトンで３回、水で３回、１０％硫酸で１回、水で２回、０．２Ｍ燐酸塩緩衝 液（ｐＨ７）で１回、水で３回、アセトンで３回、ジエチルエーテルで１回。活 性化ゲルを３５℃で真空乾燥キャビネット中で乾燥させる。

ステップ２°ベンゾナーゼの活性化ゲルとの反応８００μｌのペンゾナーゼ溶液 （１８００ｋＵ／ｍｌ）を２０　ｍ　ｌの緩衝液Ｉに溶解する。２．５ｇのステ ップ１からの活性化ゲルをこの溶液に懸濁する。反応混合物を三角フラスコ中で 室温で２０時間振盪する（２００回転／分）。ゲルをガラスフィルター吸引フィ ルター上で吸引濾過して、それぞれ２０　ｍ　ｌの次の洗浄溶液で処理する。ａ ｍ液工で２回、水で１回、緩衝液して２回。ゲルを吸引濾過して、それぞれ２０ ｍ１の新鮮滅菌緩衝液りで３回洗浄して、緩衝液り中で４℃で保存する。

［実施例１４］ エポキシ−活性化支持体上へのプロテイナーゼにの固定化 溶液： ａ）スターター溶液： １５ｇの硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムおよび１５ｇの硝酸（含量６５％） を９５０　ｍ　ｌの水に溶解する。

ｂ）モノマー溶液： ３０ｇのメタクリル酸２．３−エポキシプロビルを２２０　ｍ　ｌの１．４−ジ オキサンに溶解する。

Ｃ）ｌｌｔ衝液Ｉ゛ ２５ｍＭバルビッル酸塩、５ｍＭＭｇＣ１２、ｐＨ９，２゜ ｄ）Ｍ衝液Ｌ： ５０ｍＭ）リス、５ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７，５゜ステップｌ：エポキシ基を含 む線状ポリマーの、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＴＳＫ　ＨＷ６５　（Ｓ ）へのグラフト ５００　ｍ　ｌ　＋７）沈澱させたＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＴＳＫ　 ＨＷ６５　（Ｓ）を３３０　ｍ　１　ｔ７）水に懸濁する。攪拌しながらスター ター溶液を加えて、混合物を１分間攪拌する。次いで、攪拌しながらモノマー溶 液を加える。室温で１８０回転／分で１時間攪拌した後、ゲルをガラス吸引フィ ルター上で吸引濾過して、それぞれ５００　ｍ　ｌの次の洗浄溶液で処理する。

水で４回、アセトンで３回、水で３回、１０−％硫酸で１回、水で２回、０．２ Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７）で２回、水で３回。

ステップ２　プロテイナーゼにの活性化ゲルとの反応２５ｇのプロテイナーゼＫ （カタロク番号２４５６８、Ｅ、Ｍｅ　ｒ　ｃ　ｋ、ＤＥ）を５０００　ｍ　ｌ の緩衝液■に溶解する。ステップ１がらの活性化ゲルをこの溶液に懸濁する。反 応混合物を三つ首フラスコ中で室温で２２時間攪拌する。１８時間後に、ｐＨを 水酸化ナトリウム溶液で９．２に調整する。ゲルをガラスフィルター吸引フィル ター上で吸引濾過して、それぞれ５００　ｍ　ｌの次の洗浄溶液で処理する。緩 衝液Ｉで２回、５ｍＭＣａＣｌ２水溶液で１回、ＩＭＮａＣｌおよび５ｍＭＣａ Ｃｌ２を含む水溶液で２回、５ｍＭＣａｃ１２水溶液で１回、０．１Ｍ酢酸ナト リウム（ｐＨ４）および４ｍＭＣａＣｌ２を含む水溶液で２回、５ｍＭＣａＣｌ ２水溶液で１回、６Ｍ尿素水溶液で２回、５ｍＭＣａＣｌ２水溶液で３回、緩衝 液りで２回。

ゲルを吸引濾過して、それぞれ５００　ｍ　ｌの新鮮滅菌緩衝液りで３回洗浄し て、緩衝液り中で４℃で保存する。

上記の実施例から、本発明による活性化支持体材料はアフィニティー支持体の調 製に著しく適していること、そしてそれから調製されるアフィニティー支持体は アフィニティークロマトグラフィーのための改善された特性を有することが認め られる。さらに、本発明による活性化支持体材料は酵素の固定化に著しく適して いること、そしてその活性はとくに高分子量基質に対しての活性が、十分に保持 されることが認められる。

使用実施例 ［使用実施例Ａ］ 種々の金属キレートアフィニティー支持体のタンパク質結合能 クロマトグラフィー条件： 装置：　メルク−日立ＨＰＬＣ不活性システムカラム：　Ｓｕｐｅｒｆｏｒｍａ ｎｃｅ（登録商標）５０−１０ｍｍ　（Ｅ、　Ｍｅ　ｒ　ｃ　ｋ）流速：　１ｍ ｌ／分 溶出液　２０ｍＭＮａ燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７）およびＩＭＮａＣｌ 試料：　１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、溶出液に溶解波長　２８０ｎｍ 結果を表２に要約する。

表」、種々の金属キレートアフィニティー支持体のタンパク質結合能 ゲル１ｍｌ当りのりゾチーム結合量、ｍｇ従来ゲル　本発明のゲル 比較材料１）４０ 基部支持体： Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）　３６２）　６５ＴＳＫ　ＨＷ６５（ｓ） ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）３５３）　７０ＤＩＯＬ 注： ｌ）市販のアフィニティー支持体 ２）エビクロロヒドリンを用いる従来技術による基部支持体の活性化 ３）γ−グリシドキシプロビルトリメトキシシランを用いる従来技術による基部 支持体の活性化［使用実施例Ｂ］ 種々の「好チオ」アフィニティー支持体のタンパク質結合能 クロマトグラフィー条件： 装置：　メルク−日立ＨＰＬＣ不活性システムカラム：　Ｓｕｐｅｒｆｏｒｍａ ｎｃｅ（登録商標）５０−１０ｍｍ　（Ｅ、Ｍｅ　ｒ　ｃ　ｋ）流速：　０．２ ５ｍ１／分 溶出液：　２０ｍＭＮａ燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７）および０．８Ｍ硫酸アンモニ ウム 試料：　５ｍｇ／ｍｌのγ−グロブリン、溶出液に溶解 波長：　２８０ｎｍ 結果を表３に要約する。

五」　種々の「好チオ」アフィニティー支持体のタンパク質結合能 ゲル１ｍｌ当りのγ−グロブリン結合量、ｍｇ従来ゲル　本発明のゲル 比較材料１）　３５　− 比較材料１）　４２　− 基部支持体 ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　（登録商標）３０２）　５２ＤＩＯＬ 注゛ ｌ）アガロースに　づいた市販のアフィニティー支持体 ２）γ−グリシドキシプロビルトリメトキシシランを用いる従来技術による基部 支持体の活性化［使用実施例Ｃ］ プロティンＡを含むアフィニティー支持体上における、ヒト血清アルブミン（Ｈ ３Ａ）とヒトＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の分離 クロマトグラフィー条件： 装置：　メルク−日立ＨＰＬＣ不活性システムカラム：　Ｓｕｐｅｒｆｏｒｍａ ｎｃｅ（登録商標）２５−１０ｍｍ　（Ｅ、　Ｍｅ　ｒ　ｃ　ｋ）吸着体：　Ｆ ｒａｃｔｏｇｅｌ　（登録商標）ＴＳＫＨＷ　６５　（Ｓ）に基づくアフィニテ ィー支持体（実施例９により調製） 流速：１ｍｌ／分 溶出液Ａ：　５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４）＋ＮａＣ１（９ｇ／リットル） 溶出液Ｂ：　ＩＭ酢酸 段階勾配、　１０分後、溶出液Ｂに替える。

試料：２ｍｇのＨ３Ａおよび１　ｍ　ｌ　ｔｆ）　ヒトＩｇＧＩ７）２００μｌ の溶出液Ａ溶液 波長：　２８０ｎｍ Ｕ： ヒト血清アルブミンは前溶媒中に２分後に溶出され、一方、ヒ）ＩｇＧは溶出液 Ｂによって１４分後に初めて溶出される。

［使用実施例Ｄ］ 種々の含プロティンＡ−アフィニティー支持体上における、ヒト血清がらのヒト ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）のクロマトグラフィーによる分離 固定化プロティンＡを有するふたつの生産物の結合特性を比較した。

ａ）プロティンＡがチオエーテル基なしで結合されている（支持体：セファロー ス）：吸ｆｒ体Ａｂ）プロティンＡが実施例１２によって結合されている゛吸着 体Ｂ それぞれの場合、緩衝液Ａ（２５ｍＭトリス／ＨＣ１、ｐＨ８，０）で平衡にし ておいた２５０μｌのゲルをミ二カラム（５００／７１．Ｍｏｂ　ｉ　ｔ　ｅｃ ／ＤＥ）に充填する。２５０μｌのヒト血清と２５０μｌの緩衝液Ａの混合物を 供して、カラムを２　ｍ　ｌの緩衝液Ａで洗浄する。次いで、２　ｍ　ｌの緩衝 液Ｂ（５０ｍＭグリシン／ＨＣＩ、ｐＨ３，０）で溶出する。血清試料および溶 出液中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量を、免疫濁度測定法によって測定する 。結果を表４に要約する。

ＬＡ： 血清　吸着体Ａ　吸着体Ｂ ＩｇＧ　（ｍｇ）　３．１５　１．０５　２．６７％　１００　３３　８４ ［使用実施例Ｅ］ 固定化ペンゾナーゼの活性の測定 種々の分子量のＤＮＡ調製物（Ｈｉ　ｎ　ｄ　：　ＬＡＭＢＤＡ−ＤＮＡ）Ｈｉ 　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　７ラグメント、ｐＢｒＢｒニブラスミドルＢｒ３２ＬＡ ＭＢＤＡ　ニラムダ−ファージのＤＮＡ）を、実施例１３によって調製された固 定化ペンゾナーゼとともにインキュベート（３７℃で振盪）して、反応上溝液中 の高分子量基質の含量をいろいろな時間（１，４，１６分）にアガロースゲル（ ０，８％）上での電気泳動によって測定する。固定化ペンゾナーゼはトリス緩衝 液ｐＨ８，０（５０ｍＭトリス、Ｉ　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．５０容量％グ リセリン、０．５容量％メルカプトエタノール）中に懸濁する。

それぞれ１０μｍの懸濁液を用いる。５０ｐｌの各ＤＮＡ溶液をペンゾナーゼ懸 濁液に加えて、混合物をインキュベートする。

時間　１　４　１６ 注 ＋十　高分子量内容物が本質的に存在する。

＋　高分子量内容物が有意に分解されている。

−高分子量内容物が本質的に分解されている。

−一　高分子量内容物が検出されない。

１）　２３．１３０，９４１６．６５５７．４３６１．２３２２．２０２７．５ ６４および１２５塩基対のフラグメント ２）　４３６１塩基対 ３）　何時間も攪拌した４　８，５２０塩基対。反応生産物を吸引濾過して水で 洗浄し、未反応のオキシラン基を２００　ｍ　ｌの０．５Ｍ硫酸による処理（４ ５℃、２時間）によって加水分解する。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５４５ 　Ａ　８３１０−２Ｊ（７２）発明者　ミュラー、アンドレアスドイツ連邦共和 国　デー−６２３０フランクフルト　（８０）　ハインリヒーハルトーシュトラ ーセ　４３ Ｉ （７２）発明者　ヘルベルト、シュテファンドイツ連邦共和国　デー−６４９２ ジンタール　２　ロートヴイーゼンヴエーク　１１（７２）発明者　シュタイラ ー、アニアドイツ連邦共和国　デー−８７５１シュトックシュタット／マイン　 アム　シャッヘンブルッフ　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．表面にポリマーが共有結合で結合している、水酸基を含む基部支持体に基づ く活性化支持体材料であって、次のように特徴づけられる。 ａ）基部支持体は脂肪族水酸基を含み、ｂ）共有結合したポリマーは末端モノマ ーユニットを介して基部支持体に結合され、 ｃ）ポリマーは一般式Ｉのモノマーユニットを含み、そして ｄ）モノマーユニットは線状に結合している。 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ［式中、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｘは、アズラクトン基またはオキシラン基を含む活性化グループである］ ２．一般式Ｉ中のＸ基が一般式ＩＩによる基であることを特徴とする、請求項１ に記載の活性化支持体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ「式中、 Ｒ４はＨ、１〜５個のＣ原子を有するアルキルまたは６〜１２個のＣ原子を含む アリールであり、そしてｎは１から５までの整数である］ ３．一般式Ｉ中のＸ基が一般式ＩＩＩによる基であることを特徴とする、請求項 １に記載の活性化支持体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ「式中、 Ｒ５およびＲ６は互いに独立して、Ｈまたは１〜５個のＣ原子を有するアルキル である］ ４．一般式ＶＩＩａまたはＶＩＩｂのひとつに対応する基を活性化グループとし て含むことを特徴とする活性化支持体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＶＩＩａ▲数式、化学式、表等があります▼ ＶＩＩｂ［式中、、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｒ５およびＲ６はそれぞれ互いに独立してＨまたは１〜５個のＣ原子を有するア ルキルである］５．表面にポリマーがグラフト重合によって共有結合されている 水酸基を含む基部支持体から出発する活性化支持体材料の調製法であって、水酸 基を含む基部支持体粒子を懸濁させて、セリウム（ＩＶ）イオンの存在下で一般 式ＩＶのモノマーからなる溶液中で重合させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＶ［式中、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｙは、オキシラン基またはアズラクトン基またはそれからアズラクトン基を生じ ることができる基を含む、活性化または活性化が可能なグループである」そして 、適宜、前駆体化合物をアズラクトン環系に変換することを特徴とする。 ６．一般式ＩＶの異なるモノマーが共重合されていることを特徴とする、請求項 ５に記載の調製法。 ７．一般式ＩＶによるモノマーに加えて、一般式Ｖのモノマーが共重合されてい ることを特徴とする請求項５または６に記載の調製法。 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｖ ［式中、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、ＨまたはＣＨ３である」 ８．チオール基を含む基部支持体を一般式ＶＩＩＩのビニルアズラクトンと反応 させることを特徴とする、請求項４に記載の活性化支持体材料の調製法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＶＩＩＩ［式中、 Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはＣＨ３であり、そして Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立してＨまたは１〜５個のＣ原子を有する アルキルである］９．アフイニテイーリガンドの結合のための、請求項１〜４の いずれか１項に記載の活性化支持体材料の使用。 １０．酸素の固定化のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性化支持 体材料の使用。 １１．アフィニティーリガンドが請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性化支 持体材料に結合していることを特徴とする、アフィニテイー支持体の調製法。 １２．請求項１１に記載の調製法によって調製されるアフィニティー支持体。 １３．プロテインＡを含む請求項１２に記載のアフィニテイー支持体。 １４．アフィニティークロマトグラフィーによるバイオポリマーの精製における 、請求項１２または１３に記載のアフィニティー支持体の使用。 １５．免疫グロブリンの分離のための、請求項１２または１３に記載のアフィニ ティー支持体の使用。 １６．請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性化支持体材料に結合しているこ とを特徴とする、酵素固定化の方法。 １７．請求項１６に記載の調製法によって調製される固定化酵素。 １８．請求項１６に記載の調製法によって調製される固定化ベンゾナーゼ。 １９．核酸の加水分解のための請求項１８に記載の固定化ベンゾナーゼ。