JPH06509581A

JPH06509581A - 体液中のイミプラミンまたはデシプラミンの定量用の試薬及び方法

Info

Publication number: JPH06509581A
Application number: JP5503713A
Authority: JP
Inventors: アダムツイツク，マシージ; ジヨンソン，ドナルド; ハリントン，チヤールズ・エイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2017-05-27
Also published as: CA2110916A1; JP3285577B2; DE69231448D1; DE69231448T2; ATE196364T1; CA2110916C; AU2424792A; ES2151491T3; EP0641439A1; WO1993003371A1; EP0641439B1; US5340750A; EP0641439A4; US5578500A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、試験サンプル中のイミブラミン（ｉｏ＋１ｐｒａｉｉｎｅ）または試験サンプル中のデシブラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）のイムノアッセイ定量に関する。特に、本発明は、イミプラミン代謝物の存在下に於けるイミブラミンの特異的定量用並びにデシプラミン代謝物及びイミプラミンの存在下に於けるデシブラミンの特異的定量用、好ましくは、蛍光偏光イムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）用の免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及び標識試薬に関する。

ために処方される三環式抗曽薬であり、各々、式１及び式により表される。

イミブラミンがこのような治療の主剤であるとき、イミブラミンの第３級窒素の脱メチル化によりできる天然代謝物としてデシブラミンが通常存在する。従ってデシプラミンは、それ自体が慢性欝病の治療の主剤として処方される時に存在するだけでなく、イミブラミンをこのような治療の主剤として使用する際にも存在する。

体液（例えば、血清、血漿、全血液、尿など）に存在するイミプラミン及びデシブラミンの治療的薬レベルをモニターすると、患者を取り扱う一助となる情報を医者に提供するのに非常に有用である。このような薬レベルをモニターすると、特にイミブラミンを用いる治療（イミブラミン及びデシプラミンの両方が存在することとなる）に於いて、最適治療効果を達成するために患者の投与量を調整し、薬剤不足または毒性レベルとならないようにできる。この点に関しては、高レベルのイミプラミン及びデシブラミンは中枢神経系疾患、心臓血管毒性、高血圧症、癲廟発作、昏睡及び死亡を伴い、特に、所与の投与量に関してもヒト血漿中の量には通常患者によって様々な違いがあるので、患者の血液中のイミプラミン及びデシブラミン濃度を治療範囲内に保持しなければならない。

従って、イミプラミンまたはデンプラミンを用いる治療に対して個人の反応が様々であるので、例えば、患者の血清若しくは血漿中の、イミプラミンが治療の主剤である場合にはイミブラミン及びデシブラミンの両方のレベルを、またはデンブラミンが治療の主剤である場合にはデシブラミンレベルをそれぞれ測定することにより治療をモニターする必要がある。所望の治療範囲以下の濃度では欝病の治療に対して薬剤不足となり、その範囲より高いレベルでは抗欝病効能を全く増大せずに、望ましくない作用（心臓血管合併症、抗コリン作用及び沈静を含む）を併発し得る。

例えば、高圧液体クロマトグラフィー［Ｄｏｒｅｙら、（す」ユＣｈｅＩ１１．．３４．２３４８−２３５１（１９８８）］　、ガスクロマトグラフィー［Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、ＣｏｍＬｌｌ、、１．　４４５ −４５４（１９７５）］、薄層り０７トグラフイ−ＥＮａｇｙら、　Ｊ、　Ｐｈａｒｎ＋、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、。

２５、５９９−６０３（１９７３）］などのクロマトグラフィー法によるイミブラミン及びデシプラミンの測定については雑文がある。

しかしながら、これらの方法は、かなり困難な仕事であり、時間の浪費で且つ冗長な種々の厄介な段階を実施するために高度な熟練者が必要である。

例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ＾）法［Ｍｉｄｈａ、　Ｊ、＾ｎａｌｙｔ、　Ｔｏｘｉｃ、、　２．１８ｌ８５−１９２（１９７］、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳ＾）法［Ｄｅｎｉｓら、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、＾ｃｔａ、　１５９．２５７−２６７（１９８６）］、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩ＾）法［米国特許第４゜４２０、５６８号及び欧州特許出願第２２６．７３０号］及び酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法［米国特許第４．５５１．２７５号及び同第４．２７５．１６０号などによる三環式抗曽薬のレベルのイムノアッセイ測定については報告がある。しかしながら、これらの方法は、特異性（即ち、デシブラミン及びイミブラミン代謝物の存在下でのイミブラミンの測定並びにイミブラミン及びデシプラミン代謝物の存在下でのデシブラミンの測定）に欠けるか、または被分析物質代謝物の存在下での抗体特異性の欠失を克服するために厄介なカラム精製が必要である。特に上記の４種類の主要な三環式抗曽薬の総量を測定するための非特異的蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩ＾）は市販されており、欧州特許出願公開第２２６．７３０号及び米国特許第４．４２０゜５６８号に記載されているが、このアッセイにより測定された濃度は、血漿または血清中の三環式抗犠薬の総量の推測にしかすぎない。従って、このようなアッセイは、例えば、イミプラミンで治療した患者中の特異的な個々の三環式抗−薬を正確に定量するためには使用できず、患者の血漿または血清中のイミプラミン及びデツプラミンの総量が解る本発明は、試験サンプル中のイミブラミンまたはデツプラミンの定量用の特徴的な抗体試薬及び標識試薬を提供する。本発明は、このような抗体試薬の産生及びこのような標識試薬の製造に使用する免疫原を製造するための合成法も提供する。本発明の標識試薬及び抗体は、試験サンプル中のイミブラミンまたはデツプラミンの定量用のイムノアッセイで使用する際に従来法よりも優れている。本発明の好ましい態様により、標識試薬及び抗体試薬は、試験サンプル中のイミプラミンまたはデツプラミンの詳細且つ信頼性のある定量を実施するための、イムノアッセイの特異性とスピード及び均質法の簡便性を併せ持つ蛍光偏光イムノアッセイで標識試薬及び抗体試薬を使用することを開示する。

図面の簡単な説明図１は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにイミブラミンを結合させるための合成経路を例示する。

図２は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにデツプラミンを結合させるための合成経路を例示する。

図３は、本発明の方法により６−カルボキシフルオレセンにイミブラミンを、及び６−カルボキシフルオレセンにデツプラミンを結合させるための合成経路を例示する。

図４は、本発明の方法によりアミノメチルフルオレセンにイミプラミンを、及びアミノメチルフルオレセンにデツプラミンを結合させるための合成経路を例示する。

図５は、＾ｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーに於けるイミブラミン検量曲線を示すグラフである。

図６は、＾ｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーに於けるデツプラミン検量曲線を示すグラフである。

図７は、特異的イミプラミンアッセイに於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示すグラフである。

図８は、特異的デツプラミンアッセイに於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示すグラフである。

図９は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、本発明のイミプラミンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイ法の精度を示すグラフである。

図１０は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、本発明のデツプラミンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイ法の精度を示すグラフである。

発明の詳細な説明本発明により、イミブラミンまたはデツプラミンの特異的定量は、最初に標識試薬またはトレーサー及び抗体試薬と試験サンプルとを同時または任意の順に接触させ、次いで試験サンプル中のイミブラミンまたはデツプラミンの量の関数として抗体試薬との結合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬の量を測定することにより実施し得る。特に、本発明は、イミブラミンの特異的定量及びデツプラミンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイで使用するための、免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及び標識試薬に関する。本発明によるイミブラミンまたはデツプラミンの特異的定量は、イミプラミンイムノアッセイに関しては、イミプラミンの特異的定量をデツプラミン及びイミブラミン代謝物の存在下で実施し、デシブラミンイムノアノセイに関しては、デツプラミンの特異的定量をイミブラミン及びデ／ブラミン代謝物の存在下で実施するものと理解されたい。

本発明の抗体は、弐■・［式中、Ｐは、免疫原性キャリヤ物質であり、イミプラミンの定量に関しては、ＲはＣＨ３であり、Ｘ＋を相互に結合した２個のへテロ原子であり、及びＹは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、デツプラミンの定量に関しては、ＲはＨであり、Ｘ（ま相互に結合した２個のへテロ原子であり、及びＹは炭素原子１〜６個を含む結合基である］の誘導体で製造した免疫原で産生ずる。

［式中、Ｑは、検出可能な成分、好ましく：ま蛍光成分てあイミブラミンの定量に関しては、ＲｏはＣ１１３であり、及びＺは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びデツプラミンの定量に関しては、Ｒ，はＨであり、及びＺは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基である］の誘導体で製造する。

本発明の免疫原は、以下の記載の如く製造するが、これを図１（イミブラミン免疫原）及び図２（デツプラミン免疫原）に示す。イミプラミン免疫原に関しては、イミブラミンのニトロ化、次いで還元により製造した２−アミノイミブラミンをカルボベンジルオキシプロピルスルホニルクロリドと反応させて、特徴的なスルホンアミドを得る。スルホンアミドを脱ヘンノル化すると、遊離酸が得られ、これをヒドロキシスクシンイミド活性エステルを介してウシ血清アルブミンと結合させて、所望のイミプラミン免疫原を得る。デツプラミン免疫原の製造に関しては、２−ニトロデツプラミンから製造したＮ’−ＢＯＣ保護−２−アミノデツプラミンをカルホヘンノルオキシブロピルスルホニルクロリドと反応させると、特徴的なスルホンアミドが得られる。このスルホンアミドを脱ベンジル化すると、Ｎ’−ＢＯＣ遊離酸が得られ、これをヒドロキシスクシンイミド活性エステルを介してウシ血清アルブミンに結合させると、Ｎ’−ＢＯＣ保護化合物が得られる。トリフルオロ酢酸との処理後、所望のデツプラミン免疫原が得られた。

イミプラミン用の特異的蛍光偏光イムノアッセイで使用するための好ましい蛍光標識試薬は、２−アミノイミブラミンと６−カルボキシフルオレセンヒドロキシスクシンイミド活性エステルを縮合して合成すると、図３に示すようなイミプラミントレーサーが得られた。デツプラミン用の特異的蛍光偏光イムノアッセイで使用するための上記の好ましい蛍光デツプラミン標識試薬は、Ｎ’−ＢＯＣ保護 −２−アミノデツプラミンと６−カルボニルフルオレセンヒドロキシスクシンイミド活性エステルを縮合して合成すると、Ｎ’−ＢＯＣ保護トレーサーが得られた。トリフルオロ酢酸との処理後、図３に示されている所望のデツプラミントレーサーが得られた。

本発明の試薬を用いる蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩ＾）手順により、試験サンプル中のイミプラミンまたはデツプラミンの濃度またはレベルを正確に定量し得る。イミプラミンまたはデツプラミンの特異的定量用のＦＰＩ＾を実施するために、検量曲線をイミブラミン（図５）及びデツプラミン（図６）の治療範囲をモニターするために作成した。

本発明により、イミプラミンまたはデツプラミンの定量用の優れた蛍光偏光イムノアッセイのアッセイ結果は、意外且つ驚くべきことに、（ｉ）弐■（式中、Ｐは上記の免疫原キャリヤである）のイミブラミンまたはデツプラミン免疫原から産生じた抗体を含む抗体試薬、及び（ｉｆ）式■（式中、Ｑは上記の蛍光成分である）の蛍光標識試薬を使用すると而られることが分かった。イミブラミンの定量に関しては、抗体試薬は、イミプラミンと結合またはこれを識別し得る抗体を含み、抗体は、式■［式中、Ｐはウシ血清アルブミンてあり、Ｘは−ＮＨ−３Ｏ□−であり、及びＹは −（ＣＨ２）３−ＣＯ−である］のイミプラミン誘導体から製造した免疫原で産生するのが好ましく、及び標識試薬は、式■［式中、Ｑは蛍光成分てあり、及びＺは−ＮＨ−ＣＯ−であり、及びＲ３はＣ１１３である］の誘導体から製造するのが好ましい。同様に、デツプラミンの定量に関しては、抗体試薬は、デツプラミンと結合またはこれを識別し得る抗体を含み、抗体は、弐■［式中、Ｐはウシ血清アルブミンであり、Ｘは−ＮＨ−ｓｏ□−テあり、Ｒ，は■■テあり、及びＹは−（ＣＨ２）３−Ｃｏ”Ｃ’ある］のデツプラミン誘導体から製造した免疫原で産生ずるのが好ましく、及び標識試薬は、式■［式中、Ｑは蛍光成分であり、Ｚは−Ｎ）ｌ−ＣＯ−であり、及びＲ１はＨである］のデツプラミン誘導体から製造するのが好ましい。

特に、意外且つ驚くべきことに、イミプラミンの特異的定量に関して、式■［式中、ＲはＣＨ３であり、芳香環に結合したスルホンアミド基・Ｘ　＝　（−ＮＨ −３Ｏ２−）を含む］の新規免疫原と式■［式中、Ｒ，はＣＨ３であり、芳香環に結合するアミド基を含む；　Ｚ　＝　（−ＮＨ−ＣＯ−）］の新規蛍光トレーサーの組み合わせが、本発明の意図するイミブラミンの特異的な定量に重要であることが知見された。この特徴的な試薬の有効な組み合わせにより、イミブラミンの特異的な定量が改良された。デツプラミンの特異的定量に関しては、式■［式中、ＲはＨてあり、芳香環に結合したスルホンアミド基を含む；　Ｘ　＝　（ −ＮＨ−３Ｏ２−）］の新規免疫原を含む試薬と式■［式中、Ｒ１はＩ］であり、芳香環に結合したアミド基を含む；　Ｚ　＝　（−ＮＨ−Ｃｏ−）］の新規蛍光トレーサーの特徴的な組み合わせがデンブラミンの特異的な定量に重要であった。特徴的な試薬を都合よく組み合わせることにより、デシプラミンの特異的な定量が改良された。上記の組み合わせの性能は、図７（イミブラミン）及び図８（デシプラミン）に示されており、高性能液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）との相関関係が図９（イミブラミン）及び図１０（デシプラミン）に示されている。

上記の如（、イミプラミンまたはデシブラミンの特異的定量用に蛍光偏光イムノアッセイを実施する場合、トレーサーの検出可能な成分は、蛍光成分（例えば、フルオレセン、アミノフルオレセン、カルボキシフルオレセンなど）、好ましくはアミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニルフルオレセン、５−カルボキンフルオレセン、チオウレア−アミノフルオレセン及びメトキシトリアジツリルーアミノフルオレセンなどの蛍光誘導体である。抗体に結合したトレーサー量は、試験サンプル中に存在するイミプラミンまたはデンブラミンの量とは逆に変動する。従って、イミブラミンまたはデシブラミン及びトレーサーの抗体結合部位に対する相対的でそれ故に特徴的な結合親和性は、アッセイ系の重要なパラメーターである。通常、蛍光偏光法は、特徴的な波長の平面偏光により励起されたとき、蛍光トレーサーが所与の媒体中のトレーサーの回転比と逆に関連する入射刺激光に対して偏光度を保ちつつ別の特徴的な波長で光（即ち、蛍光）を放出する原理に基づいている。この特性の結果として、例えば、粘性溶液相中などで無理に回転させられたり、または比較的回転比が低い別の溶液成分と結合した場合、トレーサー物質は自由溶液中にある場合に比べより大きい偏光度の放出光を保持する。従って、配位子及びトレーサーが抗体に結合するのに競合する時間枠内では、トレーサー及び配位子結合速度は、重要な性能パラメーター（例えば、選択性、感受性及び精度）を保持した遊離及び結合トレーサーの好適な割合をもたらすようにする。

本発明のイミプラミンまたはデンプラミンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイを実施する際には、イミブラミンまたはデシプラミンを含むと考えられる試験サンプルを、本発明の免疫原で製造した抗−血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を産生じ得る好適に選択されたそのフルオレセン誘導体の存在下で本発明の免疫原で製造した抗血清と接触させる。次いで、平面偏光を溶液内を通過させて蛍光偏光応答を得、応答を試験サンプル中に存在するイミブラミンまたはデシブラミンの量の尺度として検出する。

本発明のイミブラミンまたはデンプラミン誘導体は、慣用のキャリヤ物質に結合させることにより免疫原を製造し、次いで抗体を得るために使用する。イミプラミン及びデシブラミン誘導体も、試験サンプル中のイミプラミンまたはデシブラミンを定量するためのイムノアッセイ中の検出試薬として作用する標識試薬を製造するのに使用する。本発明のイミプラミン及びデシブラミン誘導体は、弐■中、Ｐが免疫原性キャリヤである当業界で公知の種々の慣用法により免疫原性キャリヤ物質に結合させ得る。当業者には理解されるように、免疫原性キャリヤ物質は、これらの任意の慣用の公知方法により選択され得、殆どの場合タンパク質またはポリペプチドであるが、十分な大きさ且つ免疫原性を有する他の物質［例えば、炭水化物、多糖類、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸、核酸などコも使用し得る。免疫原性キャリヤ物質は、タンパクＷ（例えば、つ／血清アルブミン、アオカイヘモシアニン、サイログロブリンなど）であるのが好ましい。本発明の免疫原を使用して、本発明のイムノアッセイで使用するための公知方法により抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）を製造する。通常、宿主（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、テンジクネズミまたはウマ）に、通常アジュバントとの混合物中の免疫原を種々の部位の一カ所以上に注射する。さらに、最適度に到達したと判断されるまで、抗体量を評価するために採血しながら、一定または不定間隔で同一または別の部位に注射する。

抗体は、抗血清を得るために宿主動物を採血するか、またはモノクローナル抗体を得るために公知の体細胞ハイブリダイゼーション法または当業界で公知の他の方法により得、次いで例えば−２０℃で貯蔵し得る。

蛍光偏光イムノアッセイ以外に、本発明のイミプラミンまたはデシプラミンを定量するために種々の他のイムノアッセイ手順を実施し得る。このようなイムノアッセイ系手順としては、競合的、サンドイッチ及びイムノメトリック（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）法が挙げられるが、これらに限定されない。

通常、このようなイムノアッセイ系は、標識または検出可能な成分に結合した本発明の抗体またはそのフラグメントを含む標識試薬を使用して結合量を測定する試験サンプル由来の特異的な被分析物質に結合するための免疫グロブリン（即ち、全抗体またはそのフラグメント）の性能に依存する。このような検出可能な標識としては、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬剤、ハブテン、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光分子、着色粒子及び着色微粒子、蛍光化合物（例えば、アミノメチルフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアシノリルアミノフルオレセンなどの蛍光誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない。既に記載の如（、試験サンプルは天然物、人工的に形成した液体、またはその抽出物であってもよく、生物試験サンプル（例えば、全血液、血清、血漿、尿、排泄物、唾液、脳を髄液、脳組織など）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、試験サンプルは、試験サンプルの抽出液またはその任意の誘導体であってもよい。

典型的には、このようなイムノアッセイ系手順中の結合量は、検出且つ測定した検出可能な成分量が試験サンプル中の被分析物質量に対応し得る、被分析物質との結合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬中に存在する検出可能な成分量によって決定する。例えば、競合的イムノアッセイ系では、（配位子と参照されることもある）測定される物質は、このような抗体を産生ずるために使用された免疫原と配分した構造的に類似した配位子及びトレーサーの（単数または複数の）部分に特異的な抗体上の結合部位の有限数に関して、（トレーサーと参照されることもある）検出可能な成分に結合した構造的に類似した物質と競合する。治療薬がイミプラミンである場合、デシブラミンはイミブラミン代謝物として試験サンプル中に存在するので、イミプラミン及びデシプラミン量は、本発明のイミブラミン及びデンプラミン誘導体を個々に使用する別個のイムノアッセイ系で検出するものと理解されたい。

本発明の試験キットは、既に記載の如く、試験サンプル中のイミブラミンの定量に関してまたは試験サンプル中のデシプラミンの定量に関しては、本発明の所望の特異的蛍光偏光イムノアッセイを実施するのに必要な本質的な試薬をすべて含む。試験キットは、試薬が混和性である場合には組成物または混合物として、必須試薬を保持する１個以上の容器の組み合わせとして市販の包装形に配合されている。特に、イミプラミンまたはデシプラミンのいずれかの個々の定量に関して上記された免疫原で製造した本発明の抗体及び本発明の蛍光トレーサー化合物を含む、試験サンプル中のイミプラミンの蛍光偏光イムノアッセイ定量または試験サンプル中のデンプラミンの蛍光偏光イムノアッセイ定量用の試験キットが好ましい。熱論、試験キットは、従来公知で且つ一般のユーザーの観点からも望ましい他の試薬（例えば、緩衝液、希釈液、標準液など）も含み得るものと理解されたい。

本発明は、本発明を限定しない以下の実施例によりさらに説明されよう。括弧内に含まれた数字は、図面内に使用されている構造式と対応する。

実施例１イミプラミン免疫原（６）の合成（ａ）溶液の略号　ＣｌＩＣｌ５＝クロロホルム、Ｍｅｏｌｌ−メタノール、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、Ｃ１１２Ｃ１２＝塩化メチレン、Ｅｔ２０＝ジエチルエーテル、ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル、Ｈｅｘ　＝ヘキサン、ＴＩＩＦ−テトラヒドロフラン、１１０ＡＣ＝酢酸。全ての溶媒混合物は容量／容量である。

（ｂ）ベンノルアルコール（２８ｍＬ、　２７０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３，８ｍＬ、　２７ｍｍｏｌ　）を混和し、窒素（Ｎ２）下、水浴中で撹拌したっ４−ブロモブチリルクロリド（１）（３，１ｍＬ、　２７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いで反応混合物をさらに３０分撹拌した。終了した反応混合物をＨｚＯ（２５０ｍＬ）中に注ぎ、Ｅｔ２０（３Ｘ２００１１１Ｌ）で抽出した。エーテル抽出液を混和し、ＭｇＳＯ４で脱水し、真空下で溶媒を除去した。得られた粗な生成物をカラムクロマトグラフィーでＥｔＯＡｃ／１ｌｅｘ（１０／９０）で精製すると、所望のベンジル４−ブロモブチレート（２ａ）　（２，５５ｇ、　３７％）が得られた。

宜ＨＮＭＲ（２００ＭｌｌＺ、　ＣＤＣ１３）　δ　７．４（ｓ、　５１１）、　５．２（ｓ、　２Ｈ）、　３．４（ｔ、　２Ｈ）。

２、６（ｔ、　２Ｈ）、　２．２（ｐ、　２１１）　；質量分析（ＤＣｌ、　Ｎ＋１３）（Ｍ＋ＮＦ＋４）”２７５゜ベンジル４−ブロモブチレート（２ａ）（２，５３ｇ、　９．８５ｎ＋ｎ＋ｏｌ）をＥｔＯＨ（１，９ｍＬ）中に溶解し、Ｎ２０（４，８ｍＬ）中の亜硫酸ナトリウム（１，２４ｇ、　９．８５ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら０℃で滴下添加し、次いで反応混合物を４時間還流した。溶媒を真空上除去すると白色固体が得られ、これをＥ　ｔ　Ｏ１１から再結晶させると所望の塩（２ｂ）（１，１７ｇ、　４２％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＩＩｚ。

ＤＭＳＯ−ｄ６）δ　７．４（ｓ、　５８）、　５．２（ｓ、　２＋１）、　２．６−２．４（ｍ、　４Ｈ）、　１．９（ｐ、　２Ｈ）：質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’２５７゜ナトリウム塩（２ｂ）（５４８ｍｇ、　１．９６ｍｍｏｌ）を五塩化リン（８１６ｍｇ、　３．９２ｍｎ＋ｏｌ）と混和し、得られた混合物を加熱して５０℃で３０分撹拌した。次いで反応混合物を水浴（４０ｍＬ）で希釈し、ＣＨＣＬ３（３Ｘ４０ｍｌ−）で抽出した。ＣＨＣｌ５抽出液を混和し、ブライン（飽和ＮａＣ１水溶液）（４０ｎＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、所望の生成物（２ｃ）（４４０ｍｇ、　８１％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００Ｍ）ｌｚ、ＣＤＣｌ５）６７．５−７．１（ｕ＋、　５Ｈ）、　５．２（ｓ、　２Ｈ）、　３．８（ｔ、　２１１）、　２．６（ｔ、　２１１）、　２．３（ｐ、　２ｔｌ）。

イミブラミン塩酸塩（３）（２，２１ｇ、　６．９７ｍｍｏ１）をＨ２Ｏ（３５１１１Ｌ）に溶解し、６１１　Ｎａ０Ｉｌで塩基性にし、ＣＨＣｌ　３　（３Ｘ３５ｍＬ）で抽出した。ＣｌＩＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（３５ｎＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、所望のイミブラミン遊離塩基（１１ａ）（１９５ｇ）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ。

ＣＤＣ１３）６７、２−７．１（ｍ、　６ｔｌ）、　７．０−６．８（ｍ、　２ｔｌ）、　３．８（ｔ、　２Ｈ）、　３．２（ｓ。

４旧、　２．３（ｔ、　２！ｌ）、　２．１（ｓ、　６ｔｌ）、　１．７（ｐ、　２Ｈ）。

・イミブラミン（４ａ）（１，９２５ｇ、６．８７ｍｍｏｌ）を酢酸（３２ｎＬ）に溶解し、１８℃に冷却した。酢酸（１，１ｍＬ）中の濃硝酸（０，７９ｎＬ。

１３　ｍ　ｍ　Ｏ１’）を撹拌しながら、１７〜１８℃に保持しつつ滴下添加し、次いて反応混合物をその温度でさらに２０分撹拌した。

反応混合物を０．１５Ｍ　ＩＩＣＩ（１３０ｍＬ）中に注ぎ、ＥＬｚＯ（２Ｘ８５ｍＬ）で洗浄し、ｐＨをＩＯＮ　Ｎａ０ｔｌで１３に調節して、ＣＩＣＣｌＣｌ５（４Ｘ１００で抽出した。ＣｌＩＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（８５＋ｎＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去した。残渣をカラムク０７トグラフイーでＴＨＦ／ｆｌｅｘ／Ｎ１１４０ｔｌ（７０／３０１０．４）で精製すると、赤いオイル状の所望の２−ニトロイミブラミン（４ｂ）（１，１４５ｇ、　５１％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１５） δ８、　Ｏ−７，９（ｍ、　２８）、　７．３−７．０（ｍ、　５１）、　３．９（ｔ、　２Ｈ）、　３．２（ｓ、　４８）、　２．３（ｔ、　２Ｈ）、　２．１（ｓ、　６Ｈ）、　１．７（ｐ、　２Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ） ”３２６゜２−ニトロイミプラミン（４ｂ）（５５２ｍｇ、　１．７０ｍｍｏｌ）を無水ＥｔＯＨ（２０ｎＬ）に溶解し、炭素上に担持した１０％パラジウム（５５ｍｇ）を添加し、反応混合物をＨ２（ボンベ圧力）下で３．５時間撹拌した。反応混合物をセライト上で真空濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去すると、所望の２−アミノイミプラミン（４Ｃ）（４９９ｍｇ、　９９％）が薄黄色オイル状で得られた。’１１　ＮＭＲ（２００ＭＨｚ。

ＣＤＣｌ５）６７．２−７．０（ｍ、　３Ｈ）、　６．９−６．８（ｍ、　２Ｈ）、　６．５−６．４（ｍ、　２Ｈ）、　３゜７（ｔ、　２８）、　３．２−３．０（ｍ、　４Ｈ）、　２．３（ｔ、　２Ｈ）、　２．１（ｓ、　６８）、　１．７（＋）、　２Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’２９６゜エステル（２ｃ）（４３１ｍｇ、　１．５６ｍｍｏｌ）／ＣＨ□Ｃｌ２（２，７ｍＬ）の溶液を、Ｎ２下、ＣＨ２Ｃｌ２（２，７ｍＬ）に溶解した２−アミノイミブラミン（４ｃ）（４２０ｍｇ、　１．４２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０，４０ｎＬ。

２、８ｍｍｏｌ）の０℃の撹拌した溶液に滴下添加した。反応混合物を０°Ｃでさらに２０分撹拌し、次いで溶媒を真空上除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーでＣｔｌｔＣ１ｚ／ＭｅＯＨ（９０／１０）で精製すると、黄色固体の所望の生成物（５ａ）（３２４ｍｇ、　４３％）が得られた。’Ｉｆ　ＮＭＲ（２００ＭｌｌＺ、ＣＤＣ１３）δ　７．５−６．８（ｍ、　１２１１）、　５．１（ｓ、　２ｔｌ）、　３．８（ｔ、　２ｔｌ）、　３．　Ｉ　（ｓ、　４１１）、　３．１（ｔ、　２１１）、　２．８（ｔ、　２１１）、@２．５（ｓ。

６１１）、　２．５（ｔ、　２１１）、　２．２（ｐ、　２Ｈ）、　２．０（ｐ、　２Ｈ）　；質量分析（ＤＣＩ、　ＮＮ１１３）（＋Ｈ）’５３６ペンシルエステル（５ａ）（２９９ｍｇ、　０．５６ｍｍｏ１．）をＥｔＯＡｃ／無水ＥｔＯＨ（７０／３０）（８ｍＬ）に溶解し、硫酸バリウム上の５％パラジウム（１００ｍｇ）を添加し、反応混合物を１１２（ボンベ圧力）下で３時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を真空下で除去し、残渣を反応溶媒（３ｍＬ）及び触媒（１００ｍｇ）と再び混和し、Ｈ２下で撹拌した。１７時間後、反応混合物を再び濾過し、ロータリーエバポレーターにかけ、新しい溶媒及び触媒で再開始した。Ｉ−（２（ボンベ）下で２４時間撹拌後、反応混合物を濾過し、濾液を真空下で除去すると、白色固体の所望の酸（５ｂ）（２２９ｍｇ、　９２％）が得られた。’Ｉｔ　ＮＭＲ（２００Ｍｌｌｚ、ＣＤ３０Ｄ）δ７、４−６．９（ｍ、　７Ｈ）、　３．８（ｔ、　２Ｈ）、　３．２−３．０（ｍ、　８１１）、　２．７（ｓ、　６Ｈ）、　２．３（ｔ、　２Ｈ）、　２．１−１．９（ｍ、　４ｔｌ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋＋（）”４４６゜酸（５ｂ）（７４ｍｇ、　０．１７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０，７７ｎＬ）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクノンイミト（ｌＩＯ３ｕ、　２３ｍｇ、　０．２０ｍｍｏｌ）を添加し、１．３−シンクロへキ／ルカルボンイミド（ＤＣＣ，４１ｍｇ、　０．２０ｍｍｏｌ）を添加し、次いて反応混合物をＮ２下、１７時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液をＯ，１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）（４，８ｍＬ）及びＤＭＦ（１，３ｍＬ）に溶解したウシ血清アルブミン（ＢＳ＾、　２８９ｍｇ、　０．００４釦ｍｏｌ）の溶液に添加した。−晩撹拌後、反応混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）　（２Ｌ）で４時間、次いで１１２０（７Ｘ２Ｌ）で透析した。凍結乾燥後、所望の免疫原（６）（２８７ｍｇ）がふわふわした白色固体状で得られた。

害−敬豊ヱデシプラミン免疫原（１１）の合成デシプラミン塩酸塩（７）（１０，ＯＯｇ、　３３．０ｍｍｏｌ）をＨｚＯ（２００ｍＬ）に溶解し、５Ｍ　ＮａＯＨでｐＨを１３に調整し、ＣＨＣｌ５（３Ｘ２０ｈＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（２００ａ＋Ｌ）で洗浄し、Ｎａ、ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、無色オイル状の遊離塩基（９，０ｇ）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨ２，ＣＤＣ１３）６７、２−７．０（ｍ、　６Ｈ）、　７．０−６．８（ｍ、　２Ｈ）、　３．８（ｔ、　２Ｈ）、　３．２（ｓ、　４Ｈ）。

２、６（ｔ、　Ｈ）、　２．３（ｓ、　３Ｈ）、　１．７（ｐ、　２Ｈ）　：質量分析（ＤＣｌ、　ＮＨｓ）　（Ｍｉｌ＋）　”２６７゜濃硝酸（４，２ｍＬ、　６７ｍｍｏｌ）を酢酸（５，６＋ｏＬ）に溶解し、酢酸（１６５ｍＬ）中のデンプラミン（８，９７ｇ、　３３．７ｍｍｏｌ）の撹拌した１５℃の溶液に滴下添加し、次いで反応混合物を１５℃で２０分間撹拌し、Ｈ２Ｏ（４００ｍＬ）中に注ぎ、濃ＨＣＩ（９，４ｍＬ）で処理し、ＥｔｚＯ（２Ｘ　２５０ｎＬ）テ洗浄した。濃ＮａＯＨでｐｌ（を１２に調節し、ＣＨＣｌ３（３Ｘ　４００ｎＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去した。粗な生成物をカラムクロマトグラフィーでＣｌＩ２Ｃ１ｚ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４０Ｈ（９０／　１０１０．５）、次いでＣＨ２Ｃｌ　、／ＭｅＯＨ／Ｎ）１＜０Ｈ（８０／２０１０．５）で精製すると、所望の２−ニトロデシブラミン（８ａ）（１，６８ｇ、　１６％）が得られた。ＩＩＩ　ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５）δ　８．１−７．９（ｎ＋、　２１１）、　７．３−７．０（ｍ、　５Ｈ）、　３．９（ｔ、　２１（）。

３２（Ｓ、４Ｈ）、　２．６（ｔ、　２Ｈ）、　２．３（ｓ、　３１）、　１．８（ｐ、　２Ｈ）　；質量分析（ＤＣＩ。

ＮＨ３）（Ｍ＋ｌ（）’３１２゜２−ニトロデシプラミン（８ａ）（１，６７ｇ、　５．３６ｍ１ｏｌ）をＤＭＦ（１２＋ＩＩＬ）に溶解し、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ−０−ＢＯＣ）（１，２９ｇ、　５．９０ｍｍｏｌ）を添加し、トリエチルアミン（０，９０ｎＬ、　６．４ａ＋ｍ。

ｌ）を添加し、反応混合物をＮ２下で１６時間撹拌し、次いでｔ１２０（６０ｎＬ）に注ぎ、Ｅｔ２０（３×６０ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出液を混和し、Ｍｇ５Ｏ，で脱水し、溶媒を真空下で除去した。

得られたオイルをカラムクロマトグラフィーでＥｔＯＡｃ／ｆｌｅｘ（２０／８０）で精製すると、所望の保護アミン（８ｂ）（１，８２ｇ、　８２％）が得られた。’　Ｉｆ　ＮＭＲ（２００ＭＩＩＺ、　ＣＤＣ１３）δ　８．１−７．９（ｍ、　２Ｈ）、　７．３−７．０（ｍ、　５１１）、　３．８（ｔ、　２１１）、　３．２（ｔ、　２Ｈ）、　３．２（ｓ、　４１１）、　２．７（ｓ、　３Ｈ）。

１、８（ｐ、　２ｔｌ）、　１．４（ｓ、　９１１）；質量分析（ＤＣＩ、　ＮＮ１１３）（＋Ｈ）”４１２゜ニトロ化合物（８ｂ）（９６０ｍｇ、　２．３３ｎａ＋ｏｌ）をＭｅＯＨ（１８ｎＬ）に溶解し、炭素上の１０％パラジウム（１２４ｍｇ）を添加し、続いてアンモニウムフォーメート（６７７ｍｇ、　１０．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４５分撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を１１．０（５０＋ｎＬ）ｌ：添加し、ＣＨＣｌ　３（２×５０ｍＬ）　Ｔ’ 油抽出た。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（５０ｎＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、所望のデシプラミン誘導体（９）（８８５ｍｇ、　９９％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）δ７．２−６゜９（ｍ、　３１）、　６．９−６．８（ｍ、　２Ｈ）、　６．５−６．４（ｍ、　２１１）、　３．７（ｔ、　２８）、　３．４（ｓ。

２Ｈ）、　３．２（ｔ、　２Ｈ）、　３．１（ｓ、　４１１）、　２．７（ｓ、　３Ｈ）、　１．８（ｐ、　２１１）、１．４（ｓ、　９Ｈj ；質量分析（ＤＣｌ、　ＮＨ３）（Ｍ＋ｌｌ）’３８２゜エステル（２ｃ）（４４２ｍｇ、　１．６０ｍｍｏｌ）をＣｌｌＣｌ　３　（２，９ｍｌ、）に溶解し、ＣｌｌＣｌ　ｓ　（２，４ｍＬ）中のデシプラミン誘導体（９）（４５３ｍｇ、　１゜１９ｍｍｏｌ）及びトリエチル７　ミン（０，３３ｍ１．２．４ａ＋ｍｏｌ）（７）　撹拌シた０℃溶液にＮ２下で滴下添加した。反応混合物を０℃でさらに１５時間撹拌し、Ｈ□Ｏ（２５ｎＬ）ｌ：注ぎ、ＣｌｌＣｌ　３　（３× ２５ｍｌ）　”Ｃ抽出した。ＣｌＩＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（２５ｎＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーてＥｔＯ＾ｃ／Ｈｅｘ（３０／７０）で精製すると、所望のブチレート（１０ａ）（１２６ｍｇ、　１７％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ　３）６７．５−６．９（ｍ、　１２Ｈ）、　５．１（ｓ、　２１１）、　３．７（ｔ、　２Ｈ）、　３．３（ｔ、　２Ｈ）、　３．２（ｓ、　４１１）、　３．１（ｔ、　２ｔｌ）、　２．７（ｓ、　３１１）、　２．５（ｔ、　２１１）、　２．Q（ｐ。

２１１）、　１．８（ｐ、　２１＋）、　１．４（ｓ、　９１１）　：質量分析（ＤＣｌ、　ＮＮ１１３）（＋ｌ＋）”６２２゜ベンジルエステル（１０ａ）（１２０ｍｇ、　０．１９ｂｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ／無水ＥｔＯＨ（７０／３０）（１，１ｍ１）中に溶解させ、硫酸バリウム上の５％パラジウムを添加し、反応混合物を０２（ボンベ圧力）下で２．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、新しい触媒（４０ｍｇ）を濾液に添加し、次いでＨ２下で撹拌した。１７時間後、反応混合物を濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去すると、所望の酸（１０ｂ）　（９４ｍｇ、　９１％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭｌｌＺ、　ＣＤＣ１３）６７、３−６．８（ｍ、　７Ｂ）、　３．７（ｔ、　２Ｈ）、　３．３（ｔ、　２１１）、　３．２（ｓ、　４Ｈ）、　３．１（ｔ。

２Ｈ）、　２．７（ｓ、　３Ｈ）、　２．５（ｔ、　２Ｈ）、　２．２（ｍ、　２１１）、　１．８（ｐ、　２Ｈ）、　１．４（ｓ、　９１P）、質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”５３２゜酸（１０ｂ）（７６ｍｇ、　０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０，６７ｎＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１８ｍｇ、　０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、１，３−シンクロへキンルカルポジイミド（３２＋ｎｇ、　０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をＮ２下で２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を０．１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）（４，ＩｍＬ）及びＤＭＦ（１，ＩｍＬ）に溶解したラン血清アルブミン（２４ｂｇ、　０．００３６ＩＯｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。− 晩撹拌後、反応混合物を０゜１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）　（２Ｌ）　テ４時間、続イテ１１□ｏ（７×２し）で透析した。凍結乾燥後、所望のＮ −ＢＯＣ免疫原（２７７ＩＩ１ｇ）が得られた。

Ｎ−ＢＯＣ免疫原（２６５ｍｇ）ｌ＝　ＣｌＩＣ１２（ＩＯＩＩＩＬ）、続イテトリフルオロ酢酸（１０ｎＬ）を添加した。５分間撹拌後、溶媒を真空下で除去し、残渣を０．１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＴｏ７．８）　（６０ｎＬ）に再溶解させた。得られた濁った溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）（２１，）テ１６時間、続イテＨ２０（５Ｘ２Ｌ）　テ透析した。

凍結乾燥後、所望の免疫原（１１）（２３０ｍｇ）が得られた。

実施例３イミプラミントレーサー（１２）の合成６−カルボキンフルオレセン（１，００ｇ、　２．６６ｍＩＩｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３０６ｎ＋ｇ、　２．６６ｍｍｏｌ）を添加し、１．３−ジンクロヘキシル力ルポジイミド（５４９ｍｇ、　２゜６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を暗所、Ｎ２下、１７時間撹拌した。反応混合物を真空濾過し、濾液を２− アミノイミブラミン（４ｃ）（７，８４ｍｇ、　２．６５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０，５６ｎＬ。

４、　Ｏｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（４，０ｍＬ）　（！：　ａ　合Ｌ、反応混合物ヲ暗所、Ｎ２下で４時間撹拌した。反応溶媒を真空下で除去し、残渣を逆相Ｃ＋　ａ半分数（１ｍｍ）ＴＬＣプＬ／　−ト上’Ｔ：　１１２０／ＴＩＩＦ／ＨＯＡＣ（４０／６０／０．４）で溶離し、続いてＷａｔｅｒｓ　ａ＋ｂｏｎｄａｐａｋ　ＣＢカラム（１９ｍｍＸ　１５０ｍｍ）　ｌ：　Ｊｌニル分取ＨＰｉ、Ｃ１？　Ｈ２０／ＴＨＦ／ＨＯＡｃ（３５／６５１０．４）　テ流速７．０ｍＬ／分で溶離精製すると、橙色の粉末状の所望のイミプラミントレーサー（１２）（４１０ｍｇ、　２４％）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋ｔ（）”６５４゜実施例４デシプラミントレーサー（１３）の合成６−カルボキシフルオレセン（８５０ｍｇ、　２．２６＋ｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ａ＋Ｌ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクノンイミド（２６０ｏ＋ｇ、　２．２６ｍｍｏｌ）を添加し、１．３−シンクロヘキシルカルボジイミド（４６６ｍｇ、　２゜２６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を暗所、Ｎ２下で１７時間撹拌した。

反応混合物を真空濾過し、濾液を２−アミノデシプラミン誘導体（９）（８５３ｍ、　２．２４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０，４７＋ｅＬ、３．４ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（４ｍＬ）と混和した。反応混合物を暗所、Ｎ２下で４日間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をカラムク０７トグラ７　イーテＣ！Ｉ２Ｃ１２／ＭｅＯＨ（９５１５）テ、次イテＣ１１２Ｃ１２／Ｍｅ０１１（８５／　１５）て溶離精製し、続いて逆相Ｃ１８分取（１ｍｍ）ＴＬＣプレート上、Ｈ□ ０／ＭｅＯＨ／１１０＾ｃ（１０／９０１０．４）で２回目の溶離精製をすると、燈色粉末状の中間体ＢＯＣ−保護トレーサー（５１０ｍｇ、３１％）が得られた；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”７４０゜ＢＯＣ−トレーサー（５０８＋ｇ、　０．６８７１１１１０１）をＣＪＣｌｔ（７ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（７＋ｏＬ）と混和し、４０分撹拌し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＨｅｘ／Ｃ１１２Ｃ１ｔ（１／１）のアリコート（２０ＩＩＬ）で２回すり砕き、次いでトルエン／ＭｅＯＨ（１／１）のアリコート（２ｈＬ）と共沸し、真空ポンプ上に暗所中、３日間放置すると、所望のデシブラミントレーサー（１３）（５９９＋ｇｇ）が得られた：質量分析（ＦＡＢ）（ｖ＋Ｈ）”６４０゜実施例５イミプラミンスルホンアミドトレーサ−（１４）の合成トリエチルアミン（０，０３ｍＬ、　０．２０ｍｍｏｌ）をカルボン酸（５ｂ）（２０ｍｇ、　０．４５ｍｍｏｌ）、２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３゛−スルホネート（Ｗｏｏｄｗａｒｄ’　ｓ　Ｋ、　１３ｍｇ、　０．０４９５ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（０，５０ｍＬ）の溶液に添加した：Ｎ、下で３０分撹拌後、４′−アミノメチルフルオレセン（八ＭＦ）塩酸塩（１８ｍｇ、　０．０４５ｏ＋ｍｏ１．）及びトリエチルアミン（０，０３ｍＬ、　０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を暗所で１８時間撹拌し、次いで溶媒を真空下で除去すると、燈色の固体が得られ、これを逆相自６分取（１ｍ＋ａ）ＴＬＣプレート上でＨｔＯ／ＭｅＯｔｌ／ＨＯ＾ｃ（３０／７０１０．４）で精製すると、所望のイミプラミンスルホンアミドトレーサー（１４）（９，９ｍｇ。

２８％）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）　（Ｍ＋Ｈ）　′″７８９゜実施例６デシブラミンスルホンアミドトレーサー（１５）の合成トリエチルアミン（０，０３ｍＬ、　０．２０ｍｍｏｌ）をカルボン酸（１０ｂ）（３０ｍｇ、　０．５６ｍｍｏｌ）、２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３−スルホネート（Ｗｏｏｄｗａｒｄ’　ｓ　Ｋ、　１６ｍｇ、　０．０６２ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（０，５０ｍＬ）の溶液に添加し、Ｎ２下で３０分撹拌した後、４°−アミノメチルフルオレセン（ＡＭＦ）塩酸塩（２２ｍｇ、　０．０５６１ｇｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０，０３ｍ１７．０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を暗所で２１時間撹拌し、溶媒を真空下で除去すると、燈色の固体が得られ、これをシリカゲルの分取（２ｍｓ＋）ＴＬＣプレート上てＨ２０／ＭｅＯ１１／ＨＯＡｃ（３０／７０１０．４）で溶離精製すると、所望の中間体ＢＯＣ−保護トレーサー（４ｈ＋ｇ、　４７％）が得られた；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋ｌｌ）’８２５゜ＢＯＣ−トレーサー（２３ｍｇ、　０．０２６ｍ＋ｏｏｌ）をＣＩｌ、ＣＩ、（０，５ｍＬ）及びｌ・リフルオロ酢酸（０，５回目、）と混和し、５分撹拌し、溶媒を真空下で除去した。逆相Ｃ１８分取（１ｎ＋ｍ）ＴＬＣプレート上で、１１２０／Ｍｅ０１１／ＨＯ＾ｃ（２０／８０１０．４）で精製すると、所望のデシブラミンスルホンアミトトレーサー（１５）（２０ｍｇ、　９９％）が得られた。

質量分析（ＦＡＢ）　（Ｍ＋ｌＩ）　’　７７５゜抗血清の産生ウサギを最初に免疫原（ｌＩｌｇ）で免疫感作し、続いて応答が成熟（〜１２− １５週）するまで免疫原（０，５ｍｇ）で追加免疫し、その後、動物を４週間毎に免疫原（０，２ｍｇ）で追加免疫した。

動物を２週間口で出血させ、ブリードを力価滴定して適当な希釈で好適な置換及び結合を示す抗血清集団を選択する。

イミプラミンに関しては、典型的なプールを１対２５０に希釈したものは、２１０ミリ偏光単位（ｍＰ）の結合及び１１ＩＩＬ当たり７５ｎｇのイミブラミンを含むイミブラミン溶液に対し約９５ｍＰの置換を有し；デシプラミンに関しては、典型的なプールを１対２５０に希釈したものは、約２１０ミリ偏光単位の結合及びＩＩＩＩＬ当たり７５ｎｇのデシブラミンを含むデシプラミン溶液に対し約９５ｍＰの置換を有する。

実施例８イミプラミンに関する蛍光偏光イムノアッセイ実施例１に記載の如くイミブラミン免疫原（６）で免疫感作した１３匹のウサギからの血清を混合することにより抗血清を製造した。個々の動物中の力価変動は３０％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（ｍａｔｕｒｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（１種類の免疫原で６力月以上）を示した。使用した免疫原は少なくとも２種類の別個の合成製剤から得たもので、力価、永続性（ａｖｉｄｉｔｙ）（曲線特性）及びデシブラミンに対する交差反応によって（５０％偏向に於いて〈１０％）判定される限り同等の応答を与えた。生抗血清を混合し、７０％リン酸でｐＨを４．５に調節したＯ、　１００Ｍグリシルグリシンからなる緩衝液中に希釈した。アッセイ進行中、抗血清をＴＤｘ系に於いてＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈し、終濃度を１：１６．０００とした。

実施例３に記載されている蛍光トレーサー（１２）を、十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムを各々１．０％及び０，１％濃度に溶解した、２５％ジメチルホルムアミド、２５％グリセロール及び５０％蒸留水からなる溶液中に乾燥試薬を希釈して製造した。このトレーサー試薬ストック溶液をアッセイで使用するための同一希釈マトリックス中に濃度〜４ＱｎＭに希釈した。アッセイ進行中、この希釈トレーサー製剤をさらにＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈して終濃度を〜４８０ｐＭとしｌこ。

各試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出方法により製造した。１．２５ｍＬポリプロピレン試験管にサンプル（０，１００ｍＬ）を添加した。この試験サンプルを、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム（０，１００ｍＬ）及びイソアミルアルコール（０，０２５ｍＬ）を添加して塩基性にした。この溶液を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ｎ−デカン（０，５００ｍＬ）をサンプルに添加して、１．０分渦動させて混合した。渦動後、サンプルを〜ｓ、　０００Ｘｇで５．０分間、遠心分離した。５．０分の遠心分離後、上清（上部相）（０，１００ａ＋Ｌ）を取ってＯ，１００Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ３）／アセトニトリル溶液（９：１）（０，０９０■Ｌ）を各々含む１．２５＋ｎＬの第２のポリプロピレン試験管にいれた。

係属中の米国特許出願箱６２７．２８２号（１９９０年１２月１４日出願）に記載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性クロラミン−■の１０μ ｇ／ＩＩＩＬ溶液）　（０，０１０ｍＬ）を加え、溶液を１．０分渦動させて混合し、第２の試験管からの上部相（０，０５０〜０．１００ｍＬ）をＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーノサンプルウエルに移した。

試験容量（０，０１５ｍＬ）を希釈抗血清（０，０２５＋＋＋Ｌ）及び希釈蛍光トレーサー（０，０２５ｍＬ）と混合したサンプルをＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘアナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッセイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（ｍＰ）で表す。ミリ偏光単位は自動的に保存標準曲線（ｓｔｏｒｅｄ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ）（表４）から内挿され、濃度（ｎｇ／ｍＬ）として表される。アッセイ用のサンプル製造方法ではサンプルを５倍に希釈しているので、（保存曲線は加重平均した４つのパラメーター曲線の接合により構成されている）較正試料の重量濃度は、表示公称濃度の１１５である。較正試料は、ｏ、　１ｏｏｉ＋グリシルグリシン（ｐＨ３）を含む緩衝液中の重量希釈により製造した。これらをオフラインサンプル処理（二相抽出）を実施せずにＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘアナライザーに直接導入する。

実施例９デシプラミンに関する蛍光偏光イムノアッセイ実施例２に記載の如く、デシブラミン免疫原（１１）で免疫感作した１２匹のウサギからの血清を混合することにより抗血清を製造した。個々の動物中の力価変動は３０％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（１種類の免疫原で６力月以上）を示した。使用した免疫原は少なくとも２種類の別個の合成製剤から得たもので、力価、永続性（曲線特性）及びイミプラミンに対する交差反応（５０％偏光に於いて＜１０％）によって判定される限り同等の応答を与えた。生抗血清を混合し、７０％リン酸でｐＨを４．５に調整したＯ、　１００Ｍグリシルグリシンからなる緩衝液中で混合し希釈した。ア・ソセイ進行中、抗血清をＴＤｘ系に於いてＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈し、終濃度を１　：１６．０００とした。

実施例４に記載されているデシプラミン蛍光トレーサー（１３）を、十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムを各々１．０％及び０．１％濃度に溶解した、２５％ジメチルホルムアミド、２５％グリセロール及び５０％蒸留水からなる溶液中に乾燥試薬を希釈して製造した。このトレーサー試薬ストック溶液をアッセイで使用するための同一希釈マトリックス中に濃度〜４０ｎＭに希釈した。

アッセイ進行中、この希釈トレーサー製剤をさらにＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈して終濃度を〜４８０ｐＭとした。

各試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出方法により製造した。１．２５ＩＩＬポリプロピレン試験管にサンプル（０，１００ｍＬ）を添加した。この試験サンプルを、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム（０，１００ｍＬ）及びイソアミルアルコール（０，０２５ｍＬ）を添加して塩基性にした。この溶液を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ｎ−デカン（０，５００ｍＬ）をサンプルに添加して、１．０分渦動させて混合した。渦動後、サンプルを〜ｓ、　０００Ｘｇで５．０分間、遠心分離した。５．０分の遠心分離後、上清（上部相）（０，１００ｍＬ）を取って０．１００Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ３）／アセトニトリル溶液（９：１）（０，０９０ａ＋Ｌ）を含む１．２５ｍ１、の第２のポリプロピレン試験管にいれた。係真中の米国特許出願筒６２７．２８２号（１９９０年１２月１４日出願）に記載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性クロラミン−Ｔの１０μｇ／ｍＬ溶液）（０，０１０ｎ＋Ｌ）を加え、溶液を１゜０分渦動させて混合し、第２の試験管からの上部相（０，０５０〜０．１００ｍ１、）をＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーのサンプルウェルに移した。

試験容量（０，０２ｆ）ｎＬ）を希釈抗血清（０，０２５ｍＬ）及び希釈蛍光トレーサー（０，０２５ｍＬ）と混合したサンプルをＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘアナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッセイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（ｍＰ）で表す。ミリ偏光単位は自動的に保存標準曲線（表５）から内挿され、濃度（ｎｇ／ｍｌ、）として表される。アッセイ用のサンプル製造方法ではサンプルを５倍に希釈しているので、（保存曲線は加重平均した４つのパラメーター曲線の接合により構成されている）較正試料の重量濃度は、表示公称濃度の１７５である。較正試料は、Ｏ，１００Ｍグリシルグリシン（ｐＨ３）を含む緩衝液中の重量希釈により製造した。これらをオフラインサンプル処理（二相抽出）を実施せずにＴＤｘアナライザーに直接導入イミプラミントレーサーの構造変更の効果図４に示されているイミプラミンスルホンアミドトレーサー（１４）から図３に示されているイミプラミンアミドトレーサー（１２）に蛍光トレーサー構造を変更すると、アッセイ特性に於いて非常に有効である。２種類の蛍光トレーサー（１２）及び（１４）を用いて６種類の既知濃度で検量曲線を引いた。

スルホンアミド結合を含むイミブラミン誘導トレーサー（１４）の場合、交替トレーサー複合体由来のイミプラミンとトレーサーとの置換は、平坦な曲線及び小さなスパンで示されるように効果がない。アミド結合を含むトレーサー（１２）ノ場合、抗体−トレーサー複合体由来のイミブラミンによる多（のトレーサーの置換が急勾配の曲線及び大きなスパンで知見される。これらの結果は図７のグラフに示されている。これらの知見は、特異的イミプラミンアッセイに関して本発明の好ましい態様を示している。

実施例１１デシプラミントレーサーの構造変更の効果図４に示されているデシブラミンスルポンアミドトレーサ−（１５）から図３に示されているデシブラミンアミドトレーサー（１３）に蛍光トレーサー構造を変更すると、アッセイ特性に於いて非常に有効である。２種類の蛍光トレーサー（１３）及び（１５）を用いて６種類の既知濃度で検量曲線を引いた。スルホンアミド結合を含むトレーサー（１５）の場合、抗体−トレーサー複合体由来のデシプラミンによるトレーサーの置換は、平坦な曲線及び小さなスパンにより示されるように効果がなかった。アミド結合を含むトレーサー（１３）の場合、抗体−トレーサー複合体由来のデシブラミンによる多（のトレーサーの置換が急勾配の曲線及び大きなスパンで示されるように起きた。これらの結果は図８のグラフに示されている。これらの知見は、特異的デシプラミンアソセイに関して本発明の好ましい態様を示している。

実施例１２ＨＰＬＣの説明及びＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘイミプラミンアッセイ対ＨＰＬＣの比較分析Ａｂｂｏｔｔ　ＴＤｘイミプラミンアッセイの相対精度を、患者サンプル抽出物を使用して１（ＰＬＣとの対比により決定した。）ｌＰＬＣ分析用の抽出物は以下に記載の如く製造し、三環式抗僻薬トリミプラミンを内部標準としてアセトニトリル中、各々濃度４μｇ／ｍＬで使用した。

１　患者標準（１，０ｍＬ）をテフロンねじ栓のついた１６Ｘ１２５シリル化チユーブにビペｙｈでいれた。冷凍庫がら好適な標準検量曲線の冷凍アリコートを取り出して、溶かした。内部標準を含むアセトニトリル（０，７５ａ＋Ｌ）を各チューブに入れた。

２、０．２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ（１，０ｍ１．）、続イテイソ７ミ／Ｉ／７／Ｉ／］　−／１ｚ（０，２００ｍＬ）を添加し、激しく渦動させ、チューブを５．０分放置した。

３、各チューブにローへブタン（１０，０ＲＩＬ）をピペットで加え、各チューブの栓をしっかり閉めた。ヘプタン／血漿二相混合物を１．０時間激しく振盪した。

４、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

ヘプタン／血漿混合物を少な（とも２０００Ｘｇで３０分遠心分離し、層を透明にした。

５、遠心分離機からチューブを取り出し、ヘプタン上部層を０．１ＭｐＨ３のグリノルグリシン緩衝液（１，Ｏａ＋Ｌ）を含む同一仕様の別のソリル化チューブに移した。これらのチューブを閉め、１．０時間激しく振盪した。

６、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

二相グリシルグリシン／ヘプタン混合物を少なくとも２０００Ｘｇで３０分間遠心分離した。

７　遠心分離機からチューブを取り出し、栓を開けて、ヘプタン上部層を吸引するかピペットで取り出して、廃棄した。

８、０．２５Ｎ　Ｎａ０）ｌ（２，０ｍＬ）を各々残ッテイるグリンルクリシン下部層に添加した。ｎ−へブタン（５，ｈＬ）を各水性抽出液に添加し、チューブに栓をして１．０時間振盪した。

９、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

ペンタン／水性混合物を２００Ｘｇで３０分間遠心分離した。

１０、遠心分離機からチューブを取り出し、ペンタン上部層を１６Ｘ１００ンリル化円錐ねじ山付き試験管に移した。試験管の栓をしっかり閉めて、１７４回転緩めた。温かい砂浴にチューブをおき、チューブの入った砂浴を真空デシケータ −キャビネットに移して、真空にした。ペンタン蒸発には約２５−３０分を要した。

１１、砂浴中のチューブをデンケーターから取り出し、各チューブにペンタン（１，Ｏｎ＋Ｌ）をピペットで計り入れ、再び栓をし、各チューブを暫く渦動した。栓を１／４回転分開けて、チューブをデンケーターに戻し、ペンタンが蒸発するまで１０−１５分再び真空にした。

１２　乾燥したチューブをデンケーターから取り出し、ＨＰＬＣ移動相（０，０７０ｍＬ）をピペットで計りいれた。各チューブを約３０秒間、チューブの側面が濡れるように注意しながら渦動した。

１３、チューブを遠心分離機に移して、２００Ｘｇで２−３分遠心分離した。

１４　チューブを遠心分離機から取り出し、内容物を全てｆＩｓＰオートカル− セル（ａｕｔｏｃａｒｏｕｓｅｌ）サンプルキュベツトに移した。注射量を８０オングストローム孔径の３ミクロンシリカを詰めた１０ｃｍＸ　０．６ｃＩＡカラム上に０．０５ｈＬ／注射１回に設定する。クロマトグラフィーの移動相は、濃リン酸でｐＨ３に調節した０、　０２５Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム８０部／アセトニトリル２０部１０．０２１Ｍ　ｎ−ノニルアミン（ｐＨ範囲＝　７．４ −７．８）の混合物からなっていた。分析カラムには、４０ミクロンの薄膜シリカを含む乾燥充填保護カラムをつける。溶媒の流速は、１．６ｍＬ／分であった。

直線回帰分析では、イミブラミンＴＤｘアッセイとＨＰＬＣアッセイの間には良好な相関関係があった（Ｎ　＝　１０２．　Ｒ＝　０．９９０４、　Ｓ　＝　１．０１５３）。結果を図９に示す。

実施例１３デシプラミンＴＤｘアッセイ対ＨＰＬＣの対比分析へＢＢＯＴＴ　ＴＤｘデツプラミンアッセイの相対精度を、患者サンプル抽出物を使用してＨＰＬＣとの対比により決定した。上記と同様にＨＰＬＣ分析用の抽出物を製造し、クロマトグラフィー条件を用いた。直線回帰分析では、＾ｂｂｏｔｔ　ＴＤｘデシプラミンアソセイとＨＰＬＣアッセイの間には良好な相関関係があった（Ｎ　＝　１２２．　Ｒ＝　０．９８６４．　Ｓ　＝　０．９４１６１）。結果を図１Ｏに示す。

当業者には本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の多くの改質及び変形を考えつくであろうが、本発明は付記請求項のみによって限定されることは自明である。

」Ｕ− Ｆｉｇｕｒｅ　５濃度（ｎｇ／ｍＬ　）濃度（ｎｇ　／　ＭＬ）０　２００　４００　６００　Ｂｏｏ　１０００　１２００濃度　（ｎｇ　／　ｍＬ）Ｆｉｇｕｒｅ　８ＨＰＬＣ（ｎｇ　／　ｍＬ　）Ｆｉｇｕｒｅ　９ＨＰＬＣ（ｎｇ／ｍＬ　）Ｆｉｇｕｒｅ　１０フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３３　８３１０−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲＩ（７２）発明者　バリントン、チャールズ・エイアメリカ合衆国、イリノイ・６００４６、レイク・ビラ、ショショーニ・５０１

Claims

【特許請求の範囲】

１．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンを定量するためのイムノアッセイ法であって、（ａ）（ｉ）抗体を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造した免疫原で製造し、（ｉｉ）標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、Ｒ１はＣＨ３またはＨであり、及びＱは検出可能な成分である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造し、かかるイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体を含む抗体試薬及び標識試薬を試験サンプルと接触させて反応溶液を形成し、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンの量の関数として前記抗体と結合反応に関与したか、または関与しなかった前記反応溶液中の前記標識試薬量を測定する段階を含む該方法。
２．前記免疫原のＲがＣＨ３であり、前記標識試薬のＲ１がＣＨ３である、イミプラミン検出のための請求項１に記載の方法。
３．前記免疫原のＲがＨであり、前記標識試薬のＲ１がＣＨ３である、デシプラミン検出のための請求項１に記載の方法。
４．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
５．前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
６．前記イムノアッセイ法が、前記標識試薬の検出可能な成分が体液中のイミプラミンまたはデシプラミンの定量用の抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を産生し得る蛍光分子である蛍光偏光イムノアッセイであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
７．前記標識試薬の量を、（ａ）蛍光偏光応答を得るために前記反応溶液中に平面偏光を通過させ、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンの関数として前記反応溶液に対する蛍光偏光応答を検出することにより測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
９．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンを定量するための蛍光偏光イムノアッセイ法であって、（ａ）（ｉ）抗体を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の誘導体から製造した免疫原で製造し、（ｉｉ）前記標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＱは蛍光成分である］の誘導体から製造し、かかるイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体を含む抗体試薬及び標識試薬を試験サンプルと接触させて反応溶液を形成し、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンの量の関数として前記抗体と結合反応に関与したか、または関与しなかった前記反応溶液中の前記標識試薬量を測定する段階を含む該方法。
１０．前記免疫原のＲがＣＨ３であり、前記標識試薬のＲ１がＣＨ３である、イミプラミン定量のための請求項９に記載の方法。
１１．前記免疫原のＲがＨであり、前記標識試薬のＲ１がＨであるデシプラミン定量のための請求項９に記載の方法。
１２．前記免疫原性キャリヤ物質がウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
１３．前記標識試薬の量を、（ａ）平面偏光を前記反応溶液中を通過させて、蛍光偏光応答を得、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンの関数として前記反応溶液に対する前記蛍光偏光応答を検出することにより測定することを特徴とする請求項９に記載の方法。
１４．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメチルトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
１５．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンに結合し得る抗体を含む抗体試薬であって、前記抗体を、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり及びＰは免疫原性キャリヤ物質である〕のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造した免疫原で製造することを特徴とする該抗体試薬。
１６．前記免疫原のＲがＣＨ３であるイミプラミン用の請求項１５に記載の抗体試薬。
１７．前記免疫原のＲがＨであるデシプラミン用の請求項１５に記載の抗体試薬。
１８．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の抗体試薬。
１９．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体により識別し得る標識試薬であって、前記標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、Ｒ１はＣＨ３またはＨであり、及びＱは検出可能な成分である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造することを特徴とする該標識試薬。
２０．前記標識試薬のＲ１がＣＨ３であるイミプラミン用の請求項１９に記載の標識試薬。
２１．前記標識試薬のＲ１がＨであるデシプラミン用の請求項１９に記載の標識試薬。
２２．前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の標識試薬。
２３．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の標識試薬。
２４．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体により識別し得る標識試薬であって、前記標識試薬が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、Ｒ１はＣＨ３またはＨであり、及びＱは検出可能な成分である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造することを特徴とする該標識試薬。
２５．前記標識試薬のＲ１がＣＨ３であるイミプラミン用の請求項２４に記載の標識試薬。
２６．前記標識試薬のＲ１がＨであるデシプラミン用の請求項２４に記載の標識試薬。
２７．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の標識試薬。
２８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の免疫原。
２９．ＲがＣＨ３であることを特徴とする請求項２８に記載の免疫原。
３０．ＲがＨであることを特徴とする請求項２８に記載の免疫原。
３１．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の免疫原。
３２．式：▲数式、化学式、表等があります▼［式中、ＲはＣＨ３であり、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
３３．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の化合物。
３４．Ｘが−ＮＨ−ＳＯ２−であり、Ｙが−（ＣＨ２）３−ＣＯ−であり、及びＰはウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求項３２に記載の化合物。
３５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨであり、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
３６．前記免疫原性キャリヤ物質がウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の化合物。
３７．Ｘが−ＮＨ−ＳＯ２−であり、Ｙが−（ＣＨ２）３−ＣＯ−であり、及びＰはウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求項３５に記載の化合物。
３８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１はＣＨ３であり、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱはフルオレセンまたはフルオレセン誘導体である］の化合物。
３９．前記フルオレセンまたはフルオレセン誘導体が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４０．Ｚが−ＮＨ−ＣＯ−であり、及びＱが５−フルオレセニルであることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４１．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１はＨであり、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱはフルオレセンまたはフルオレセン誘導体である］の化合物。
４２．前記フルオレセンまたはフルオレセン誘導体が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の化合物。
４３．Ｚが−ＮＨ−ＣＯ−であり、及びＱが５−フルオレセニルであることを特徴とする請求項４１に記載の化合物。
４４．試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンを定量するための試験キットであって、前記試験キットが、（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子１〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造した免疫原で製造した、試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体を含む抗体試薬；及び（ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、Ｒ１はＣＨ３またはＨであり、及びＱは検出可能な成分である］のイミプラミンまたはデシプラミン誘導体から製造した、試験サンプル中のイミプラミンまたはデシプラミンと結合し得る抗体により識別可能な標識試薬を含むことを特徴とする該試験キット。
４５．前記免疫原のＲがＣＨ３であり、前記標識試薬のＲ１がＣＨ３である、イミプラミン定量のための請求項４４に記載の試験キット。
４６．前記免疫原のＲがＨであり、前記標識試薬のＲ１がＨである、デシプラミン定量のための請求項４４に記載の試験キット。
４７．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の試験キット。
４８．前記蛍光成分が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の試験キット。