JPH06509582A - Ｐｅｇ−ｓｏｄの緩衝化製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＥＧ−３ＯＤの緩衝化製剤 発明の背景 発明の分野 本発明は、哺乳類のスーパーオキシドジスムターゼとポリエチレングリコールと の接合体（ＰＥＧ−３ＯＤ）の水性製剤であって、ｐＨ５，０〜ｐＨ６，５の範 囲内で非キレート化緩衝剤及びＰＥＧ−３ＯＤを含んでなる水性製剤に関する。

更に本発明は、哺乳動物における酸化的損傷の予防及び治療用の製剤の使用方法 に関する。

情報開示 幾つかの文献に、短期間安定な接合させていない哺乳動物のスーパーオキシドジ スムターゼ（ＳＯＤ）の溶液が開示されている。

Ｊｏｈａｎｓｅｎ、米国特許第４．３４１．８６７号及び同第４．３９０．６２ ８号明細書は、１０ミリモル（ｍＭ）のリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７，５） 及び酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ４，８）中にウシＳＯＤを含む溶液を記載する 。

Ｙａｓｕｄａ、米国特許第４．３４６．１７４号明細書は、２．５Ｘ１０−”モ ル（Ｍ）〜７．５　Ｘ　１０−’モル（Ｍ）のリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７， ４）中にウシＳＯＤを含む溶液を記載する。Ｓａｇａｉ他、米国特許第４．８１ ８．６９８号明細書は、５０ミリモルのサッカロースを含有する０、１モルのリ ン酸緩衝剤、ｐＨ７，０中の組換えヒトＳＯＤを開示しており、１週間室温で保 存したときのそれの安定性に関するものである。ＲＯ１ｉｌｉＯ他。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、比２１８２〜２１８７ページ（１９７２）は、タン ノくり質製剤における銅及び亜鉛の役割及びウシＳＯＤの酵素活性について調査 したものである。それらは、「天然のウシの酵素の銅の典型的なＥＰＲシグナル がｐｉｔｓ〜１０の全範囲に渡って維持される」ことを報告している。Ｒｏｅ他 、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２７．　９５０〜９５８　（１９８８）は、 酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ５，５）中のウシ銅−亜鉛ＳＯＤの示差走ンスムタ ーセの安定性における金属の効果について報告している。

ｒｐｌ（及び有機溶剤の効果」と題を付与された節には、［スーパーオキシドジ スムターゼは、炭酸ナトリウム緩衝剤中、ＩＩＨＩｌ、　４．２４°Ｃで２４時 間安定であったＪと記述されている。

Ｈａｍａｇｕｃｈｉ他、ヨーロッパ特許出願第２２５．１３０号明細書は、蒸留 水ＳｍＬ中分子量５．０００のポリエチレングリコールに接合せしめたマンガン Ｓ　ＯＤ　２５ｍｇを含有する０、　０６７モル（Ｍ）のリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７，２，２８７ｍｏｓｍ）の水性溶液を開示する。ｏａｍａｇｕｃｈ　ｉは、「 このようにして、・・・安定な状態で取り込んだ５ＯＤ−ＰＥＧ（５０００）を 存するリポソーム組成物が得られたＪと記載している。

これは、発明者が、ポリエチレングリコールに接合せしめたスーツく一オキシド ジスムターゼの溶液のいずれかについての安定性を開示することに気づいている 唯一の参考文献である。ＳＯＤが哺乳類のＣｕ／ＺローＳＯＤではなく、微生物 由来のＭｎ−３ＯＤであるので、本発明の溶液とは異なる。更に、ＰＥＧ及びＳ ＯＤがスクシニルアミド／エステル結合を介して結合している本発明のＰＥＧ− ３ＯＤとは対照的に、ＰＥＧかアミド結合によりＳＯＤに直接結合している。

本発明者らか開示する以前には、哺乳動物ＳＯＤ及びポリエチレングリコールの 接合体の安定性に関する情報は、文献からは全く入手できなかった。ＰＥＧに対 するエステル連結基及びＳＯＤ中のアミノ官能基に対するアミド連結基を有する スクシニル残基により連結せしめられた哺乳動物ＳＯＤ及びポリエチレングリコ ールもしくは低級アルコキシポリエチレングリコールの接合体は、以下本明細書 てはＰＥＧ−３−ｍｓＯＤと称される。本明細書で用いられるポリエチレングリ コールもしくはＰＥＧなる語は、次式％式％ （上式中、 Ｒは、水素もしくは炭素原子数１〜４のアルキルであり、そしてｎは、８０〜２ ５．０００の整数である）の化合物又は該化合物の混合物を称する。本発明者ら がＥｎｚｏｎ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、　ＮＪ、　ＵＳＡ）より入手 したＰＥＧ−３−ｍｓＯＤ溶液は、ＥｎｚｏｎによりｐＨ７，３のリン酸緩衝剤 を用いて製剤されたものであった。ここで、本発明者らは、水性ＰＥＧ−３−ｍ ｓＯＤ溶液が、５．０〜６．５の間のｐＨに、即ち、やや酸性に、非キレート化 緩衝剤を用いて調製されるとき、それらは従来のやや塩基性の溶液（Ｅｎｚｏｎ ）よりも７倍程まで安定であることを発見した。

ＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの水性製剤が長期間安定であることの重要性は、臨床的環 境において酸化的損傷の治療及び予防にＰＥＧ−３−ｍｓＯＤを特に利用するこ とから生じる。そのような治療については、非経口適用が好ましい。臨床的に有 用な非経口製剤は、慣習的な保存条件下で適度な自己寿命を有するか、又は非経 口溶液の各々を使用する前にそれらを新たに簡単に調製できなければならない。

明らかに、該製剤は非常に好ましい。本発明は、初めて、経済的に実用的な期間 、慣習的な条件下で保存可能である非経口適用に適する水性溶液を提供する。

発明の要約 物質態様の組成物については、本発明は、ｐＨ５，０〜６．５、好ましくはｐＨ ５，８〜６．２の範囲内で非キレート化緩衝剤及びＰＥＧ−３−ｍｓＯＤを含ん でなるＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの水性製剤に関する。

方法態様については、本発明は、哺乳動物における酸化的損傷の治療方法もしく は予防方法であって、該哺乳動物に、治療有効量のｐＨ５，０〜６．５の非キレ ート化緩衝剤中にＰＥＧ−３−ｍｓＯＤを含む製剤を適用することを含んでなる 方法に関する。

図面の説明 図１は、（１）ｐＨの関数として初期酵素活性（パーセント）を用いた場合のＰ ＥＧ−３−ｍｓＯＤの安定性、及び（２）ＩＩＨの関数として発生した遊離Ｐ　 Ｅ　Ｇ　（ｍｇ／ｍＬ　）を用いた場合のＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの安定性を示す 。両方とも３７°Ｃで６８日間保存した。

図２は、ｐＨ６，２の本発明の溶液及びｐ１４７．３の従来技術の溶液について の、時間（日）の関数として遊離ＰＥＧ及びメトキシＰＥＧの生成速度（ｍｇ／ ｍＬ　、崩壊）を示す。

好ましい態様を含めた説明 スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドアニオンラジカル（０，− ）を酸素及び過酸化水素に分解するのを触媒する酵素のクラスに与えられた名称 である。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙの 系統的命名法に基づいて、スーパーオキシド酸化還元酵素としてＳＯＤは知られ ており、モしてＳＯＤは分類番号１．１５．１．１を有する。そのような物質は 、オルゴテイン及びヘモクプレイン並びにスーパーオキシドジスムターゼと呼は れており、そして分子量範囲は約４００〜約４８．０００である。

鋼−亜鉛ジスムターゼは、全体の構造特性に関して著しく一定に保たれた系列で ある。例外なく、精製された酵素は、１モル当たり鋼及び亜鉛イオンを各々２モ ル含有する二量体（一般的には分子量３１、０００〜３３．０００）であること を示す。マンガン／鉄系列の酵素は、分子量、サブユニット構造及び金属含有量 のような基本的な性質において均一てはない。幾つかは二量体であり、他は四量 体である。

金属含有量の範囲は、サブユニットポリペプチド鎖１モル当たり約０．５〜１モ ルである。哺乳動物由来の天然産Ｚｎ／Ｃｕ−含有酵素並びにそれらの充分に機 能的な類似体及び変異体は、本発明のための哺乳類のＺ口／Ｃｕ−スーパーオキ シドジスムターゼ（ｍｓＯＤ）であるとみなされる。

本発明の製剤では、ｍ５ＯＤはいかなる起源のものであってもよい。ウシ赤血球 及びヒト赤血球由来のもの並びに微生物、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）及 び酵母における組換え合成によるものが市販されている。ヒト及びウシＳＯＤか 好ましい。

本発明の目的上、ｍ５ＯＤをポリマーに共有結合せしめて、酵素活性を保持して いる接合体を提供する。そのような接合体は、血流中において著しく延長された 半減期を示す。好ましい接合体は、米国特許第４．１７９．３３７号明細書に記 載のスクシニル残基を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合せし められた組換えもしくは天然のヒトＳＯＤ又はウシＳＯＤからなる。上記文献は 引用することにより本明細書に組み入れられる。好ましいポリエチレングリコー ルは、次式 ％式％） （上式中、 Ｒは、水素もしくはメチルであり、そしてｎは、約１１２である） を有する。好ましいＰＥＧの分子量は、ｌＸｌ０”〜２Ｘ１０’であり、好まし くはｌＸＩＯ３〜２Ｘ１０’であり、そして接合体は、入手可能なりジン残基に よって、約２５〜約９９％、好ましくは約４５〜約７０９６か修飾される。ＰＥ Ｇ−３−ｍｓＯＤが、Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ及びＭｃＣｏｒｄの方法（，１，Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４４．６０４９〜６０５５　（１９６９）　）により測 定したものとして約ｌ０００Ｕ／ｍ５ＯＤ　１ｍｇを越える特異的な活性を有す ることは好ましい。

本発明の製剤の別の重要な成分を含む緩衝剤は、ｐＨを５．０〜６．５に維持す る医薬的に許容される非キレート化緩衝剤を包含する。医薬的に許容されるとは 、ＰＥＧ−３−ｍｓＯＤに固有の有益な性質が緩衝剤に起因する副作用により損 なわれないように、薬用量の緩衝剤が動物の器官に対して比較的無害である緩衝 剤を意味する。本発明の実施に際して、リン酸緩衝剤、アジピン酸緩衝剤、マレ イン酸緩衝剤もしくはグルタル酸緩衝剤を使用することは都合か良い。

しかしながら、本発明の範囲内の別の適当な医薬的に許容される緩衝剤としては 、別の鉱酸及び有機酸より誘導されるもの、好ましくはソカルボン酸有機酸が挙 げられる。リン酸緩衝剤及びアジピン酸緩衝剤が特に好ましい。非キレート化と は、緩衝剤か、水性溶液中て銅イオンもしくは亜鉛イオンのどちらかとキレート 化又は封鎖する成分、一般的にはアニオン性成分を含有しないことを意味する。

緩衝剤は、一定のレベルにｐＨを維持するのに充分に高いか、緩衝剤自身による 薬理学的な悪影響を及ぼさない程度に充分低いような、いずれの濃度で存在して もよい。一定のｐＨを維持するのに要する緩衝剤の最低濃度は、溶液中のＰＥＧ −３−ｍｓＯＤの量及び形状の関数であり、そして溶液の所望のｐＨに対する緩 衝剤中の兵役酸のｐＫ。

の関係を表す。ｐ）（か緩衝剤のｐＫ、からかけ離れているとき、又はＰＥＧ− ３−ｍｓＯＤの濃度が高いときには、所望のｐＨを達成及び維持するために必要 とされる最低限の緩衝剤はより多量であるだろう。ＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの濃度 は、　１００Ｕ−１５０，０００Ｕ／ｍＬの範囲でありうる。ＰＥＧ−３−ｍｓ ＯＤを８〜１０ｍｇ／ｍＬ　（２０，０００〜３０、０００　Ｕ　／　ｍＬ）で 含有する本発明の好ましい組成物については、緩衝剤の最低濃度は、リン酸緩衝 剤（ｐＨ６，２）については約３０ミリモル（ｍＭ）である。本発明の別の実施 可能な溶液は、緩衝剤濃度が約ｌＯミリモル（ｍＭ）〜約５００ミリモル（ｍＭ ）　、好ましくは３０ミリモル（ｍＭ）〜５０ミリモル（ｍＭ）の範囲でありう る。

本発明がＰＥＧ−３−ｍｓＯＤ及び緩衝剤の溶液からなるとはいえ、特定の用途 に応じて別の利益を確保するために更なる成分を組成物に添加することは、当業 者らに明らかであろう。例えば、静脈内もしくは動脈内投与については、本発明 の製剤は、ＰＥＧ−３−ｍＳＯＤ及び緩衝剤に加えて、等張化剤、好ましくは１ ４０−１５０　ミリモル（ｍＭ）の塩化ナトリウム及び任意に保存剤を含有して もよい。

実験に使用されるｍ５ＯＤは、ＤＤ［Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　（Ｍｏ ｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、　ＣＡ）より購入したウシ肝臓由来のＳＯＤであった。

ＰＥＧ−３−ｍＳＯＤは、Ｅｎｚｏｎ　Ｉｎｃ、　（Ｓｏｕｔｈ　Ｐｌａｉｎｆ ｉｅｌｄ、　ＮＪ）より購入した３０００±６００１０／ｍｇに相当するもので あった。

本発明の代表的な組成物を以下のように調製した。

実施例１ 等張リン酸緩衝剤ｐｉ（６，２ 注射用ＵＳＰ／ＮＦ水８００ｍＬにＵＳＰ／ＮＦ−塩基性リン酸ナトリウム−水 和物５．０７１ｇ、　ＵＳＰ／ＮＦ二塩基性リン酸ナトリウム七水和物３．５５ ２ｇ及びＵＳＰ／ＮＦ塩化ナトリウム８．５００　ｇを含む溶液を調製し、そし て注射用水で１，０ＯＯＬにした。ｐＨを調べて、ｐＨ６，１〜６．３の範囲外 に入ることか認められた場合には溶液を廃棄した。

実施例２ 等張アジピン酸緩衝剤ｐＨ５，８ 注射用水８００ｍ１ｊニー　７ジビン酸５．８４０　ｇ　、塩化ナトリウム８． ５００　ｇ及びｐＨ５，８とするのに充分な量の水酸化ナトリウムを含む溶液を 調製し、そして注射用水で１．０ＯＯＬにした。

実施例３ 等張リン酸緩衝剤ｐＨ６，０ 注射用水８００ｍＬに一塩基性リン酸ナトリウムー水和物５．６２３　ｇ　。

二塩基性リン酸ナトリウム七水和物２．４８　ｇ及び塩化ナトリウム８、５００ 　ｇを含む溶液を調製し、そして注射用水で１．０００Ｌにした。

ｐＨを調べて、ｐＨ５，９〜６．１の範囲外に入ることが認められた場合には溶 液を廃棄した。

安定性試料の調製：　ＰＥＧ−３−ｍｓＯＤを目的の緩衝剤に対して２４時間４ ℃で透析した。タンパク質濃度はおよそ３．３ｍｇ／ｍＬであった。４ｍｍ滅菌 Ｍｉ　ｆｌｅｘ−ＧＶ　０．２２μｍフィルターを介してその溶液を濾過し、そ して無菌条件下でガラスバイアルに直接添加した。

Ｋｉｍｂｌｅ　２　ｍＬもしくは５ｍＬＵＳＰタイプＩガラスバイアル、　Ｗｅ ｓｔ　４４１６１５０グレ一テフロンコーテイングブチル支持体及びＷｅｓｔ　 ＦＯＬａｃｑクリンプトツブ（ｃｒｉｍｐ　ｔｏｐｓ）を使用した。充填用量は 一般的には１〜３ｍＬであった。試料を恒温の暗室で保存した。各試料の安定性 を、その酵素活性、遊離ＰＥＧの量及びその溶液の透明度をモニターすることに より測定した。また溶液のｐＨを調へて充分な緩衝能力を確メチルの両方）をサ イズ排除ＨＰＬＣにより測定した。ＴＳＫ　２００ＯＰＷＸＬカラム及びＴＳＫ 　３０００　ＰＷＸＬカラムを直列に連結した。移動相は０．１モル（Ｍ）　Ｎ ａＣ１，０，１モル（Ｍ）　ＮａＰｉ緩衝剤、ｐＨ６，７からなるものであった 。クロマトグラフィーにかけてＰＥＧ−３−ｍｓＯＤから遊離ＰＥＧを分離した 。２３０ｎｍに設定したＵＶ検出器によりＰＥＧ−８−ｍｓＯＤピークを検出し 、そして屈折率検出器により遊離ＰＥＧビークを検出した。ピーク面積を積分す ることにより試料中の遊離ＰＥＧの量を検出した。ピーク面積対ＰＥＧ濃度の標 準曲線を、既知濃度のＰ　Ｅ　Ｇ　−５０００の溶液を注入することにより作成 した。

ＳＯＤ活性アッセイ：　ＭｃＣｏｒｄ及びＦｒ１ｄｏｖｉｃｈ　（ｏｐ、　ｃｉ ｔ、）により記載された方法により、ＳＯＤの酵素活性を測定した。

円偏光二色性（ＣＤ）分光分析法、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、原子吸光（ ＡＡ）分光測光法及び種々条件下における安定性試験を包含する予備製剤研究由 来のデータに基づいて、試験的ｐＨの初期範囲を開発した。ＤＳＣデータは、ｐ Ｈ５，５〜７の範囲でｍ５ＯＤ及びＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの安定性が最大である ことを示した。ｐＨ５未満での酵素の安定性の低減は、ＡＡ研究のデータから認 められるように銅及び亜鉛イオンの喪失によるものでありうる。更に確証するデ ータが、ｐＨ５，０未満でＳＯＤが部分的に折り重なっていないことを示すＣＤ 研究より得られた。

溶液中の遊離ＰＥＧのＨＰＬＣ分析は、スクシニル連結基の安定性に関して最適 なｐＨ範囲が６．５未満であることを示した。この範囲を越えるｐＨでは、ＰＥ Ｇ−３−ｍｓＯＤは、恐らくスクシニル基へのエステル結合の加水分解による溶 液中へのＰＥＧのより高い放出速度を示した。初期研究の結果を図１に示す。従 来の製剤（ｐＨ７，３）と比較した実施例１　（ｐ）Ｉ　６．２）の溶液を長期 間保存した結果を図２に示す。従来の溶液におけるＰＥＧ−３−ｍｓＯＤの分解 速度は、本発明の溶液におけるその分解速度よりも約７倍の高いものである。

（１１ｉｌ／ｊ””）　Ｄヨｄ脂流 ｔ、ｏｔｎ　寸　つ　へ　−０ （１”／”ｕｌ）　９Ｅ　ｄｌｌ［’ 国際調査報告 、、、　ｋ＋　ＰＣＴ／ＵＳ９２１０６４３３国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ユアン、バーバラ　オー−チンアメリカ合衆国、ペンシルバニ ア　１９０８５゜ピラノーバ、サウス　スプリング　ミルロード　１４０ （７２）発明者　リベロー、キム　マリ−アメリカ合衆国、ペンシルバニア　１ ９０２９゜エツシントン、カール　アベニュ　２０８

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐＨ５．０〜６．５の範囲内で非キレート化緩衝剤及びＰＥＧ−Ｓ−ｍＳＯ Ｄを含んでなるＰＥＧ−Ｓ−ｍＳＯＤの水性製剤。
2. ２．前記緩衝剤が１０ミリモル（ｍＭ）〜５００ミリモルの濃度で存在する請求 項１記載の製剤。
3. ３．前記緩衝剤がリン酸塩、アジピン酸塩、マレイン酸塩もしくはグルタル酸塩 である請求項１記載の製剤。
4. ４．前記緩衝剤がリン酸塩であり、そして前記ｐＨが６．０〜６．２である請求 項２記載の製剤。
5. ５．前記緩衝剤がアジピン酸塩であり、そして前記ｐＨが５．５〜５．８である 請求項２記載の製剤。
6. ６．１ｍＬ当たり２０，０００〜３０，０００ＵのＰＥＧ−Ｓ−ｍＳＯＤ、３０ 〜５０ミリモルのリン酸緩衝剤及び１４０〜１５０ミリモルの塩化ナトリウムを 含んでなる請求項４記載の製剤。
7. ７．１ｍＬ当たり２０，０００〜３０，０００ＵのＰＥＧ−Ｓ−ｍＳＯＤ、３０ 〜５０ミリモルのアジピン酸緩衝剤及び１４０〜１５０ミリモルの塩化ナトリウ ムを含んでなる請求項５記載の製剤。
8. ８．請求項１記載の製剤を投与することを含んでなる哺乳動物における酸化的損 傷の治療又は予防方法。
9. ９．請求項６記載の製剤を投与することを含んでなる哺乳動物における酸化的損 傷の治療又は予防方法。
10. １０．請求項７記載の製剤を投与することを含んでなる哺乳動物における酸化的 損傷の治療又は予防方法。