JPH06509645A - 虚血状態の迅速な判定のための検査とそのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 虚血状態の迅速な判定のための検査とそのキット技術分野 本発明は、虚血状態を検知する迅速な方法とこの種の方法に用いられるキットに 関するものである。より特殊的には本発明は、虚血症の存在または不存在を判定 するために行われる蛋白結合チオール（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｏｕｎｄ　ｔｈｉｏ ｌ；ＳＨ）基の測定に関するものである。

従来技術 進行性冠状動脈疾患は、胸部疼痛や呼吸困難のような有意の臨床的症状を示すこ となく、進行することがある。したがって、心筋梗塞（Ｍ　Ｉ　）に到る冠状動 脈分枝の閉塞が突発して、たとえば動脈の内膜と管壁の石灰化や動脈管腔の進行 性狭窄のような、長いあいだ放置されていた動脈壁疾患の存在の兆候が、劇的に 示される。

虚血性心臓障害があると直ちに蛋白が血液内に放出される。虚血性心臓障害の後 に放出される蛋白で良く知られたものには、クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉ ｎｅ　ｋｉｎａｓｅ；ＣＫ）、血清グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー ゼ（ＳＧＯＴ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）がある。過去の虚血性心 ｍＫ害の発生を検知する方法で最も良く知られているものの１つは、患者の血液 中におけるこれらの蛋白を検出することである。米国特許４，４９２，７５３号 は、将来の虚血性心臓障害の危険性を評定する上述のような方法に関するもので ある。しかし、障害のある心臓組織は、虚血性障害でも非虚血性障害でも血流中 に蛋白を放出するものである。

心臓以外の手術を受けた患者でも、手術中に虚血状態になり得る。こうした患者 の心電図は、術後副作用の心臓障害発生率と高い相関関係のある、虚血性刃のＳ Ｔ部偏移（ＳＴ−ｓｅｇｍｅｎｔ　５ｈｉｆｔｓ）を示す。だが、ＳＴ部偏移は 、虚血が存在しなくても発生することがあるため、この方法は虚血性障害と非虚 血性障害を弁別することができない。

虚血はしばしば、動脈血管の疾患によって生じる。

動脈血管の疾患の特徴の一つは、アテローム状態から、多量のカルシウムが動脈 筋系に入り込む硬化状態への進行である。時の経過と共に、動脈硬化が進行する 。

細胞内のカルシウム量は増大するが、心臓血液抽出量は基本的に正常のままであ る。細胞内カルシウムは、キサンチンデヒドロゲナーゼをキサンチンオキシダー ゼに変換するプロテアーゼカルパイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｃａｌｐａｉｎ）を 活性化する。キサンチンオキシダーゼはキサンチンとヒポキサンチンに作用し、 水酸基のラジカル（○Ｈ・）と過酸基のラジカル（０２・）を含む遊離基を生成 する。一方これらの遊離基は、チオール基を豊富に含む分子域において細胞膜と 蛋白質を酸化する。「潅流の役割−圧挫症候群の病因論における誘導障害」　「 ニューイングランド医学ジャーナル」誌、３２４：１４１７−１４２２　１９９ １年（”　Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｉ ｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｒｕｓ ｈ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３２４：１４１７−１４２２．１９９１）を参照されたい。

特に心ｂＩＬ病患者の場合においては、虚血性障害と非虚血性障害を識別する方 法が必要である。多くの研究の後、患者の虚血状態または虚血性障害を検出でき る、金属・蛋白質結合の相互作用に基づく本発明方法が、発見された。

金属イオンは、蛋白質において金属結合基と結合できることは、よく知られてい る（「蛋白質における多重子＆Ｊ　Ｊ　シュタインハートおよびＪ　レイノルズ 著、アカデミ−プレス社刊行、第６章２１４頁以下参照−Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｅ ｑｕｉｌｉｂｒｉａ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　−、Ｊ。

５ｔｅｉｎｈａｒｄｔａｎｄ　Ｊ、　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ａｃａｄ、　Ｐｒｅ ｓｓ、　ＣＨ−ＶＴ。

ｐ　２１４　ｅｔ　ｓｅｑ、）。

金属イオンは蛋白質と共有結合を形成するが、または配位結合による化合物を形 成するであろう。その場合、金属イオンは、蛋白質分子の配位子によりキレート 化される　（Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓ、　ＶｏｌＩＩ、Ｊ、Ｌ、Ｗｅｂｂ、（１９６６）、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｈａｐｔ、４゜ｐａｇｅ　６３５　ｅｔ　ｓｅｑ、　）　。

金属イオンの蛋白質と結合できる性質は、ポリアクリルアミドゲルにおける蛋白 質の鍛着色の基礎をなすものである。米国特許４，４６８，４６６号では、背景 着色を少なくするために、銀イオンで着色する前に、ジチオトレイトール（ＤＴ Ｔ）でゲルを前もって処理しておく。米国特許４，４３４，２３４号では、様々 な着色をするため、炭酸塩または硫酸塩で後処理を行っている。

ある場合において、金属イオンは、蛋白質と反応して、析出沈澱物を形成する。

蛋白質を定量する方法（米国特許４，７８６，６０５号）と、蛋白含有溶液から の蛋白質の全沈澱または分別沈澱において（米国特許４，４８６，２８２号）、 金属・蛋白質沈澱反応が利用されている。

発明の開示 本発明の目的の１つは、患者の虚血状態を迅速に検出する方法を提供することで ある。

また本発明のもう１つの目的は、休息中と運動中の循環系機能の効率を測定し、 リハビリテーション中の患者の虚血症（心筋梗塞）の程度を評価する方法を提供 することである。

さらにもう１つの目的は、心電図の結果を補足して、真の虚血性障害の発生を判 定する迅速な方法を提供することである。

そして本発明のさらなる目的は、上述の目的のために用いられるキットを提供す ることである。

以下に記載の明細書により説明される、本発明の上述の目的とその他の目的は、 患者の虚血症を検出する本方法によって達成されるが、この方法は、以下のよう な各段階、すなわち、 （ａ）金属イオン結合部位において前記試料に結合可能な金属イオンに、患者の 血清、血漿、体液または組織の試料を接触させて、試料結合金属イオンと非試料 結合金属イオンとを含む混合物を生成させる段階、そして （ｂ）非試料結合金属イオンの量を検出する段階よりなる。

本発明はまた、該方法を実施することができるキットを提供する。

本発明を実施するための最良の方法 本発明の方法は、患者の虚血状態の存在を迅速に検出することを可能にする。本 明細書で用いられている「迅速」という用語は、上述の検出の所要時間が１時間 以内、好ましくは３０分以内であることを、示すものである。また、本明細書で 用いられている用語「虚血性障害（ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｅｖｅｎｔ）Ｊとは、当 該患者が、ある器官への血液循環の閉塞のため、局部的かつ一時的な虚血症（ｉ ｓｃｈｅｍｉａ）になっていることを意味する。

本発明は、金属イオンの組織蛋白質への結合を利用する迅速なプロセスにより、 虚血状態を検出する方法を供する。虚血性障害を起こしている患者においては、 該患者の血清、血漿、体液または組織内に含まれる蛋白質のチオール（ＳＨ）基 の数が、水酸基と過酸化基（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）による酸化によって減少し ている。この酸化は、細胞内カルシウムがプロテアーゼカルパインを活性化させ 、その結果キサンチンデヒドロゲナーゼからキサンチンオキシダーゼを生成する 時、起こるものであると考えられる。キサンチンオキシダーゼはキサンチンとヒ ポキサンチンに作用し、遊離基を発生させ、これらの遊離基は蛋白質内のチオー ル基を酸化する。チオール基の酸化は、二硫化物（Ｓ−Ｓ）および８０３等を含 むより酸化度の高い基を生成させる。本発明の畠願者は、試料における蛋白質結 合ＳＨ基の相対的量が、蛋白質の生物学的寿命期間中に発生する酸化の指標とし て機能することを発見した。

特別な理論に結びついているものではないが、本発明の方法は、虚血性障害より 生じた試料の酸化的損傷の尺度（ｍｅａｓｕｒｅ）として、試料内の蛋白質結合 チオール基を定量し、これによって虚血性障害を検知することができると考えら れる。

本発明の方法においては、患者から採取した血清、血漿、体液または組織の試料 は、一般的には塩水溶液の形態の金属イオンと反応させられ、その結果金属イオ ンは、当該試料内に含まれる蛋白質上の金属結合部位に結合される。金属イオン は、蛋白質を構成するアミノ酸に存在するチオール、ヒドロキシル、カルボニル 、アミノ、イミダゾール、ヒドロキシメチオニルおよびグアニジニウムの各基の 様な金属イオン結合部位を含む蛋白質に結合する。試料に金属イオンを添加する と、少量の金属・蛋白質錯体が析出沈澱することがあるが、このような沈澱は、 本発明のプロセスにとって必要でも、また有害でもない。

予め定められた過剰量の金属イオン塩が、試料内の蛋白質に接触させられて、金 属イオンは蛋白質に結合される。「過剰」とは、試料の蛋白質において利用でき る全てのチオール基を結合させるのに化学量論的に必要な量より多い金属イオン 量を意味する。過剰な金属イオンが添加されるので、その結果得られた混合物に は遊離イオンが含まれており、それを検出すれば試料内に存在するチオール基の 数の尺度を得ることができる。当初に加えられた金属イオンの総量は知られてい るので、試料中に残留している遊離金属イオンを検出すれば、それは蛋白質に結 合している金属イオン量の尺度を提供することになり、従って蛋白質中の利用で きるチオール基の量の尺度を提供することにもなる。

蛋白検子オール基の錯体化の後に残存している遊離金属イオンは、適当な手段で 検出することができる。

試料内の遊離金属イオンを検出する方法は、当該技術で周知のもので、その方法 には、原子吸光分光分析法、原子発光分光分析法などを含む方法を用いる金属イ オンの直接的測定と共に、遊離金属イオンとの反応時に着色物質を生成する試薬 を用いた比色分析反応のような方法もある。従来のどのような試料白金属イオン 検出・定量法も蛋白質チオール基の錯体化の後に残存している金属イオンを検出 するのに用いることができる。

好ましくは、金属イオンは、着色錯体を生成し、かつ分光光度法によりその着色 錯体を検出することにより、比色定量的に検出される。比色分析検出プロセスの 好ましい１実施態様では、金属塩・試料混合物は、チオール化合物の水溶液と接 触させられる。チオール化合物は遊離金属イオンと反応し、着色生成物を作る。

着色生成物の着色強度は、金属塩・試料混合物内に存在する金属イオンの量に比 例し、従って試料内の蛋白質結合チオール基の量と相関する。上述の結果の着色 溶液の着色強度を測定することにより、当初試料内に存在していた蛋白質結合チ オール基の測定が可能になる。

比色分析検出法が用いられる際に、検出可能な色の生成物が形成される限り、遊 離金属イオンと着色生成物を作るために、チオール化合物以外の発色性化合物を 利用することもできることは明らかである。適当な発色性化合物には、金属水酸 化物溶液、水酸化アンモニウム溶液、金属シアン化物溶液、チオシアン酸アンモ ニウム溶液、等がある。これらの発色性化合物および金属イオンと共に着色溶液 を作るその他の化合物は、当該技術では周知であり、例えば、Ａ、Ｉ　ポーゲル 著の「定性化学分析（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｃ１）ｅｒｎｉｃａｌ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ）」ロングマン、グリーン社刊（１９４５年）、「実験生物学・医学 （Ｊ、　Ｅｘｐｔｌ、Ｂｉｏ＋、、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、）Ｊ誌１８号３４３頁 （１９４０年）のＪ、Ｒ，マーストンとＤ　Ｗ、デューイの論文、「工業技術化 学分析化学版（Ｉｎｄ、　Ｅｎｇ、　Ｃｈｅｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｅｄ、）１誌 １２号４０５頁（１９４０年）のＪ、ＨヨーとＣ，Ｊ、バートンの論文およびり 、Ｌ　ツアＩ／フとＶ、　Ｋ　ザプリアノフ著「分光分析法（Ｓｐｅｅｔｒｏｓ ｃｏｐｙ）Ｊ　ＣＲＣプレス１ボカ“ラタンＦＬ（１９８３年）に言及されてい る。これらの参考文献は、本発明において発色性化合物として用いることができ る試薬をより完全に説明するための、参照文献として本明細書中に挿入されるも のである。

本発明に用いることができる試料には、金属イオンと結合できる蛋白質を含む組 織、血清、血漿または体液の試料がある。組織試料は、器官を侵す虚血性障害の 発生を検出するために身体器官から採取される。適当な器官には、心臓、腎臓、 腸、動脈、静脈、肝臓などを含む、血液供給または酸化可能な蛋白質基質（ｒｒ ｉａｔｒｉｘ）のある器官が含まれる。試料はまた、血漿や血清のほか、例えば リンパ、脳を髄液、唾液などのような他の体液でもよい。この試料は、周知の従 来の生態組織検査法（ｂｉｏｐｓｙ）と体液試料採取技術により、得ることがで きる。好ましい試料は、血漿と血清である。

比色分析検出を行う場合、非試料結合金属イオンと結合したり、またはキレート を作ったりしてして、その結果比色分析反応を妨害するような他の金属結合化合 物が、試料内に含まれていてはならない。試料内に加えたり、入っていてはなら ない金属結合化合物には、凝固防止剤、安定剤としてまたは緩衝液中に用いられ ているクエン酸塩、しゅう酸塩、ホウ酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）　、等がある。

最適な結果は、金属イオン結合のために利用可能なチオール基を有する蛋白質が 高濃度に含まれている試料により得られる。血漿と血清が好ましいとされている が、それは、これらの試料には、金属イオンを結合させるのに特に有効であると 判明している相当量のアルブミンが含まれているからである。血漿と血清が好ま しい試料であるが、利用可能なチオール基を有する蛋白質を相当濃度に含む試料 であれば、本発明に用いることができる。

金属イオン結合に利用できるチオール基を持たない蛋白質でも、本発明の方法を 阻害することはない。しかし、利用可能な千オール基を持たない蛋白質のみしか 含まれていない試料は、金属イオンの結合には有効ではな（、したがって本発明 の方法にとっても無効である。蛋白質内のチオール基の存在または不存在は、知 られている手順に従って通常通り検定することができる。存在はするものの、本 発明の方法に基づき使用しても充分に金属イオンを結合させない蛋白質には、ヘ モグロビン、ミオグロビン、γ−グロブリン、トランスフェリン、フェリチン、 グルタチオン（酸化形態）とプトレシンがある。同様に、金属イオンを結合させ ない他の物質があっても、本方法を阻害しない。このような非妨害物質には、リ ポ酸、ニトログリセリン、亜硝酸ナトリウム、シスチン、ホモシスチンとホモシ スティン（ゲネスト他によって報告されているような低濃度の場合）が含まれる 。ホモシスティンは利用可能なチオール基を有し、早期動脈疾患において思考に 存在することが知られているので（Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｃ誌のＪ、Ｊ、ゲネストの論文 、１９９０年、１６号１１１４〜１１１９頁）、ホモシスティンが非妨害物質で あることは、驚くべきことである。ホモシスティンは約１０ナノモル／ミリリッ トルのレベルで血漿中に検出されている。しかし、この濃度は非常に低いので、 測定できるほど金属イオン結合に影響を与えるほどではない。従って、これらの 化合物は、該化合物が遊離形態または蛋白質結合形態で存在している本発明の方 法を阻害することはない。

試料において蛋白質と反応することができる金属イオンには、蛋白質の金属イオ ン結合部位に結合できる金属イオンが含まれる。比色分析検出法が用いられる場 合、金属イオンはまた、着色生成物を生成できるものでなければならない。金属 イオンが蛋白質に結合しているか否かおよび金属イオン着色生成物を作るか否か を決定することは、日常的なことで、周知の方法を用いて容易に行うことができ る。着色生成物の形成は、例えばチオールのような望みの発色性化合物の水によ る希釈系を作り、血漿または緩衝液に選択した金属イオン（金属塩として）を添 加することにより、確認される。発色は、視覚で確認される。試料における金属 イオンの蛋白質と結合する能力は、周知の手段により確認できる。

金属イオンは一般的に、水溶液に溶解された金属塩として試料に添加される。好 ましい金属イオンは元素周期律表の１ｂ〜７ｂ族と８族の遷移金属である。特に 好ましい金属イオンには、Ｖ、Ａｓ、Ｃｏ、Ｓｂ。

Ｃｒ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｂａ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｈｇ、Ｃｄ。

Ｆｅ、Ｐｂ、ＡｕおよびＡｇが含まれる。最も好ましい金属イオンは、Ｎｉ、Ｆ ｅ、ＭｎとＣｏである。望みならば、これらの金属イオンの混合物も用いられる 。

金属イオンは水溶液として試料に加えられるのが好ましい。水溶液は、望みの金 属イオン濃度を得るため、単に金属イオン塩を水に溶解させて作られる。比色分 析検呂手段が用いられる際に、対イオンが金属イオン蛋白質結合または金属イオ ン着色生成物の形成を妨げたりしない限り、金属イオンにどのような対陰イオン を使用してもよい。適当な陰イオンには、硝酸イオン、亜硝酸イオン、塩素イオ ン、硫酸イオンおよび炭酸イオンが含まれる。塩化コバルトは特に好ましい。

蛋白質への金属イオン結合はｐＨに依存し、ている。

結合に最適なｐＨは、当方法において用いられる個々の金属により異なる。蛋白 質への金属イオン結合に適当なｐＨは、蛋白質への金属イオン結合のための最適 ｐＦ（に試料のｐＨをＩＩＩするためのｐＨＭ衝液を用いることにより、得るこ とができる。例えばコバルト結合は一般的に、ｐＨ５〜１０．５の範囲で生じる が、好マシくはｐＨ６，８〜７８で、最も好ましいのは約７．４である。コバル トの使用は、本発明の好ましい実施態様であるが、これは、血清が狭いコバルト の好ましい結合ｐＨ範囲（６８〜７８）で充分な緩衝能力を示し、追加緩衝剤を 必要としないからである。

しかし、緩衝剤を必要とする試料と金属イオンが用いられる場合は、ｐＨを望み の最適結合範囲に調整するため、緩衝液が試料に添加されることもある。この種 の緩衝液は良く知られており、市販されている。

金属イオン・蛋白質結合はそれほど温度に敏感ではない。当プロセスは、室温（ ２０°Ｃ）から５０°　Ｃを越えるまでの範囲の温度で実行することができる。

しかし、当方法は約２０°〜２５°Ｃで実施するのが、望ましい。試料が冷蔵さ れているか、冷凍されている場合、検査に先立って試料が解凍して周囲温度に達 するまで放置される。

原子吸光分光分析法のような方法を用いて、直接的に遊離金属イオンを検出する 場合、分析に適当な試料は、当該試料から直接作ることができる。この種の方法 を利用する時は、水溶液の形態の試料に金属イオンを添加するのが好ましく、こ うすれば、蛋白質チオール基に金属が結合した後、未結合の金属イオンを含む試 料溶液を得ることができる。例えば濾過のような試料の準備段階が、残存沈澱物 を除去するために追加されることもある。

直接検出法（原子吸光分光分析法）は、定性的かつ定量的に遊離金属イオンの存 在とその量を測定することができる。水溶液内の金属イオンの当初の量が知られ ていれば、蛋白質結合の後に溶液中に存在する遊離金属イオンを検出することに より、遊離蛋白質チオール基の数を測定すること、およびその結果チオール基酸 化の測定が可能になる。既知量の金属イオンを含む標準化された金属イオン溶液 を用いるのが好都合である。そうすれば、例えば医学実験室での試料の日常的分 析も可能となる。

試料内の避難金属イオンの量は、比色分析的手段によっても検出することができ る。試料が金属イオンと接触した後、その混合物を、未結合の金属イオンと反応 する発色性化合物（チオール）の水溶液と接触させる。発色性化合物は、全ての 有効な未結合金属イオンと反応するのに充分な濃度で水中に溶解していなければ ならない。さらに発色性化合物は、着色金属イオン生成物が検出される波長範囲 では、金属イオンが存在していない場合は、光を吸収してはならない。一般的に 遊離発色性化合物は、約４００〜９００ｎｍの検出波長範囲で、金属イオンが存 在していない場合は、光を吸収しないことが望ましい。この発色性化合物は、試 料内にある生物学的成分による劣化に対して安定であり、かつ本発明方法のｐＨ と温度の条件下においても安定でなければならない。

上記のような特性を有している発色性化合物が、本発明の方法で用いられうるが 、好ましくはチオールが用いられ、チオールとしては、メルカプトエタノール、 ２．３−ジメルカプトプロパノール、ジチオエリトリトールおよびジチオトレイ トールのようなＣ２−６アルキルチオアルコールと、メルカブトエチラミン、メ ルカプトプロピラミン等のようなＣ２−６アルキルチオアミンと、ジメルカプト 琥珀酸、メルカトプロピオン酸、メルカプト酢酸およびメルカプトマロン酸のよ うなＣ２−１ｏアルキルチオモノカルボン酸およびジ酸と、ジメチルジチオカル バミン酸、ジエチルジチオカルバミン酸などのようなジＣ１−６アルキルジチオ カルバミン酸と、システィン、β−メルカプトイソロイシン、グルタチオンなど のようなチオール含有アミノ醗およびペプチドと、そしてパパイン、ホスホエノ ールピルビン酸塩、カルボキシキナーゼ、３−ホスホグリセリンアルデヒドデヒ ドロゲナーゼ、プロピオニル補酵素Ａカルボキシラーゼ、連鎖球菌プロテアーゼ およびチオール含有カルボキシペプチダーゼのようなチオール含有エンザイムが 含まれる。その他の適当なチオールには、１．３．４−チアジアゾール−２，５ −ジチオール、補酵素Ａ４−　−ホスホパンテティンおよびペニシラミンが含ま れる。

用いられるその他の発色性化合物には、ピリジン−２−アゾ−バラジメチル−ア ニリン、σ−ニトロソーβ−ナフトール、β−ニトロソ−α−ナフトール、ジチ オオキサミド、チオセミカルバジドと、２−メチル−３−チオセミカルバジド、 ４−メチル−３−チオセミカルバジドおよび４−エチル−３−チオセミカルバジ ドのようなＣ１−６アルキルチオセミカルバジドと、ホルムアルデヒド−トリプ トファン、サリチルアルデヒド、キノキサリン−２−カルボサルデヒドー２−ク ロロアセチル−アミノメチル−ベンゾイミダゾールと、プロフラビンヘミ硫酸塩 および塩酸塩のようなプロフラビン塩が含まれる。

特に好ましい化合物は、ジチオトレイトール、システィンおよびグルタチオンで ある。

発色性化合物は、全ての利用できる未結合金属イオンと反応するのに充分な濃度 を有する水溶液として、作られる。発色性化合物の濃度が濃すぎると、金属イオ ンと共に大量の沈澱物が形成される。溶液が希釈され過ぎていると、着色生成物 の検出が難しくなる。実際問題として、溶液の濃度は、分光光度計またはこれと 同様な検知手段を用いて光の吸収を検出するのに充分な着色溶液を供給できるよ うに、調整される。発色性化合物濃度の最適化は、ルーチンとして決定できる。

試料に添加される金属イオンの量は、全ての利用できる蛋白質結合チオール基を 結合させるのに充分な量でなければならないし、また検出可能金属イオンの過剰 を提供できるものでなければならない。

比色分析検出が用いられる場合、添加される金属イオンの量は、分光光度計のよ うな検知器により検出される着色生成物を充分供給できる量にする必要がある。

金属イオン溶液の濃度は、約０．００１〜０．１００Ｍが好ましく、より好まし いのはｏ、ｏｏｚ〜０．０１０Ｍである。試料に添加される金属イオンの量は、 未結合金属イオンが、信頼性をもって検出されるのに充分な発色生成物を形成す る限り、様々であってよく、日常的に調整できるものである。金属イオンの添加 量が多すぎると、その結果の発色強度が高くなり過ぎ、検知器による測定が不正 確になる。金属イオンの量が少なすぎる（血清の量が多すぎる）と、長い平衡期 間が必要となり、発色量が過少になる。これらの反応体の相対量は、分光光度計 またはその他の検知器を用いて最適な吸収示度を示すように、ルーチンとして決 定できる。

必要ならば、検出に適当な発色強度を有する希薄溶液にするため、チオール試薬 の添加の後、血液と等浸透圧性の塩類溶液を試料に加えることもできる。等浸透 圧性溶液で希釈すれば、蛋白質の沈澱と混濁を最小にすることができる。好まし い等浸透圧性溶液は、塩化ナトリウムから作られた溶液であるが、塩化カリウム や塩化リチウムのような他の塩もまた適当である。

もしチオール溶液の添加で、検出のために適当な発色強度が得られたならば、さ らに等浸透圧性溶液で希釈する必要はない。

金属イオン・蛋白質混合物に発色性化合物溶液を加え、そしてもし必要ならば次 に希釈した後、在来型の分光光度計でその結果できた生成物の発色強度を測定す ることができる。着色生成物の吸光度は一般的に、形成された着色生成物の最大 吸光波長において測定される。当然、着色生成物は、当方法において用いられる 特定の発色性化合物と金属イオンによって定まる。

最適吸光波長は既知の手順によりルーチンとして定めることができる。

本発明はまた、上述の方法を実施するに際して使用するキットを提供する。本発 明の検査キットには、金属塩、発色性化合物と、必要ならば、血漿または血清と 等浸透圧性の溶液が含まれる。金属塩と発色性化合物の水溶液は、望みの溶液を 得るため試験キット内に含まれる化合物に単に水を加えることにより、作られる 。また、金属塩と発色性化合物の水溶液が直接キットに含まれている場合もある 。キットにはその他に、上述の３つの成分に検査試料を混合するための試験容器 が含まれている。金属塩溶液と試料を混合し、遊離金属イオンの量を検出するこ とにより、虚血状態の迅速な判定が可能になる。

虚血障害のない正常な患者より採取した試料は、検出可能な金属イオンが低濃度 で、かつ、虚血障害のある患者から採取した試料に比べてより低い吸光度（より 低い発色強度）の試料溶液を作る。例えば非心臓性の胸部疼痛のある患者から採 取した試料は、心筋梗塞または不安定アンギナのような虚血障害のある患者の試 料に比して、検出可能な金属イオンをかなり少なくしか含有していない。本発明 の方法によれば、胸部疼痛を訴える患者から採取した試料を検査し、その胸部疼 痛が虚血障害と関連しているか、または単なる非心臓性胸部疼痛であるか、迅速 に判定できる。同様に、心筋梗塞のような症状の発現から回復している患者の経 過は、定期的に患者の組織の試料を採取して、循環系機能の効率と虚血条件の軽 減を評価することによって、判断することができる。

本発明の他の特徴は、以下の幾つかの実施例の説明により、明らかになるであろ うが、これらの実施例は本発明の例示のためであり、本発明をこれらの例に限定 するものではない。

実施例 選択された１実施例では、蛋白質結合チオール基と反応させるため、コバルトが 選ばれている。反応しなかったコバルトは、コバルトイオンと共に褐色の生成物 を形成するジチオトレイトールにより検出された。

この褐色の生成物は、４７０　ｎｍの波長において分光光度計を使用して検出さ れた。

実施例１ 材料 コバルト溶液：　蒸留水２　ｍ　ｌの中に２００　ｍｇのＣｏＣｌ２　・６Ｈ２ ０を溶解させた。この溶液は使用する時、１００倍に希釈された。

ジチオトレイトール溶液：　１０ｍ１の蒸留水に１５　ｍ　ｇのジチオトレイト ールを溶解させた。

食塩水：　１００ｍ１の水に０９ｇの塩化ナトリウムを溶解させた。

血清二　末梢静脈穿刺により２〜１０ｍ１の血液を採り、凝固するままにしてお いた。３．ＯＯＯｒｐｍで５分間、試験管を遠心分離し、上澄みの血清を別のコ ツプまたはプラスチック容器に移した。

血漿：　２〜１０ｍ１の血液をヘパリン処理したバキュテナー（ｈｅｐａｒｉｎ ｉｚｅｄ　ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）中に採取した。３．ＯＯＯｒｐｍで５分間、 試験管を遠心分離し、上澄みの血漿を別のコツプあるいはプラスチック容器に移 した。

血清は心筋梗塞または虚血症の発現があると知られている患者２２人から採取さ れた。これらの患者からそれぞれ採取して、試験管またはキュベツトに入れた０ ．２ｍｌの血清または血漿にＣｏＣｌ２　−６Ｈ２０溶液を５０μｍ加え、この 混合物を１０分間、放置しておいた。各試験管に５０μｌのジチオトレイトール 溶液を加えた後、混合した。次に試験管は、着色生成物を形成させるため、室温 で２分間放置された。重量／容量表示で０．９％のＮａＣ１を１　ｍ　ｌ　、各 試験管に加えた後、撹拌し、各試験管の吸光度を４７０ｎｍにおいて分光光度計 を用いて読み取った。対照試験用の試験管が幾つか準備され、同一の血清、塩化 コバルト溶液および塩化ナトリウム溶液を加えて、但しジチオトレイトール溶液 を加えることなく試験された。対照用の試験管の吸光度も、４７０ｎｍで読み取 られ、試験結果から差し引かれた。

心筋梗塞または虚血症の発現があると知られている患者２２人は、０．６２±０ ．１５　（ｎ＝２２）の平均値と標準偏差を有することが判明した。対照は、０ ２７±０．０５　（ｎ＝１１）の平均値と標準偏差であった。平均値は、スチュ ーデン）　（ｓｔｕｄｅｎｔ）のＴ検定により統計的に有意であることが確かめ られた。非心臓性の胸部疼痛のある正常な患者は、０．３２±０．０５　（ｎ＝ １５）の平均値であった。不安定アンギナを有する患者は、０．６１±０．２２ 　（ｎ＝８）の平均値であった。

表１参照。

表　１ 以上の結果は、本発明の方法が虚血状態を検出するために利用できることを示し ている。本発明の方法は、虚血性心臓疾患胸部疼痛と非心臓性胸部疼痛を弁別す るのに有効である。

上述の説明によれば、本発明に関して多くの修正や変形が可能であることは明ら かである。したがって、添付の請求の範囲内において、本明細書に具体的に記載 されているものとは異なる本発明の実施形態もあり得ることは理解されるであろ う。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．患者の虚血症を検出する方法であって、以下の各段階、すなわち （ａ）該患者の血清、血漿、体液または組織の試料を前記試料内のチオール基に 結合可能な金属イオンに接触させて、試料結合金属イオンと非試料結合金属イオ ンとを含む混合物を生成させる段階と、そして（ｂ）試料内の前記チオール基の 量を決定するため、非試料結合金属イオンの量を検出する段階とよりなる方法。
2. ２．前記検出段階には、前記非試料結合金属イオンの量を直接検出することが含 まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．前記直接検出には、原子吸光または原子発光の分光分析が含まれることを特 徴とする請求項２に記載の方法。
4. ４．前記検出段階には、非試料結合金属イオンの量を比色分析によって検出する ことが含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. ５．着色溶液を作るため、前記混合物を発色性化合物の水溶液に接触させること と、かつ、前記非試料結合金属イオンの量を検出するため、該着色溶液の発色強 度を検出することを含む請求項４に記載の方法。
6. ６．さらに、前記検出段階に先立って、血清または血漿と等浸透圧性の水溶液で 前記着色溶液を希釈することを含む請求項５に記載の方法。
7. ７．前記試料は血清または血漿であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. ８．前記発色性化合物は、Ｃ２−６アルキルチオアルコール、Ｃ２−６アルキル チオアミン、Ｃ２−１０アルキルチオモノカルボン酸、Ｃ２−１０アルキルチオ ジカルボン酸、Ｃ２−１０アルキルジチオ−ジカルボン酸、ジ−Ｃ１−６アルキ ルジチオカルバミン酸、チオール含有アミノ酸、チオール含有ペプチドまたはチ オール含有エンザイムであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
9. ９．前記発色性化合物は、ジチオトレイトール、システインまたはグルタチオン であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
10. １０．前記発色性化合物は、ジチオトレイトールであることを特徴とする請求項 ９に記載の方法。
11. １１．前記金属イオンは、元素周期律表の１ｂ〜７ｂ族または８族の遷移金属イ オンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. １２．前記の金属イオンは、Ｖ，Ａｓ，Ｃｏ，Ｓｂ，Ｃｒ，Ｍｏ，Ｍｎ，Ｂａ， Ｚｎ，Ｎｉ，Ｈｇ，Ｃｄ，Ｆｅ，Ｐｂ，ＡｕおよびＡｇから成る群から選択され ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. １３．前記金属イオンはコバルトであることを特徴とする請求項１に記載の方法 。
14. １４．前記検出段階は、５〜１０．５のｐＨ範囲で実施されることを特徴とする 請求項４に記載の方法。
15. １５．前記検出段階は、分光光度計を用いて実施されることを特徴とする請求項 ４に記載の方法。
16. １６．患者の虚血性障害の存在を検出するたｂのキットであって、該キットには 、金属塩と共に着色化合物を形成することができる発色性化合物と、金属塩とが 含まれていることを特徴とするキット。
17. １７．前記の金属塩と発色性化合物の少なくとも１つは、水溶液の形状であるこ とを特徴とする請求項１６に記載のキット。
18. １８．さらに、血漿または血清と等浸透圧性の塩溶液を含む請求項１６のキット 。
19. １９．さらに、前記金属塩と発色性化合物を混合するための試験容器を含む請求 項１６のキット。
20. ２０．前記の発色性化合物は、Ｃ２−６アルキルチオアルコール、Ｃ２−６アル キルチオアミン、Ｃ２−１０アルキルチオモノカルボン酸、Ｃ２−１０アルキル チオジカルボン酸、Ｃ２−１０アルキルジチオ−ジカルボン酸、ジ−Ｃ１−６ア ルキルジチオカルバミン酸、チオール含有アミノ酸、チオール含有ペプチドまた はチオール含有エンザイムであることを特徴とする請求項１６に記載のキット。