JPH03216555A - フルクトサミンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はフルクトサミンの測定法に係り、糖尿病の診断
用検査及びその病態把握のために利用される。

（従来の技術及びその課題） フルクトサミンは血液中のグルコースと蛋白との反応生
成物であって安定な物質であり、従って血液例えば血清
を検体としてフルクトサミン濃度を測定すればグルコー
ス濃度を知ることができるので、フルクトサミンの測定
は糖尿病の診断や病態把握の一助となる。

このフルクトサミンはアルカリ性環境下においてエノー
ル型となって還元作用を呈するので、当該作用を利用し
て血清中のフルクトサミン濃度を測定する方法が開発さ
れた［特公平１　−　１３０６２（特開昭５８　−　１
５４ＧＩｌｉＯ）］。この測定法は血清検体に発色剤で
あるテトラゾリウム塩例えば二トロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）を含有するアルカリ緩衝液を添加してイン
キュベートシ、この場合に血清中のグルコースと蛋白と
の反応により生成するエノール型フルクトサミンの還元
作用を利用し上記の発色剤をホルマザン染料に変じて呈
色させ、この液の吸光度を測定することによりフルクト
サミン濃度を測定するものであって、高価な試薬を必要
とせず且つ再現性も比較的高いために注目され１発明者
であるＪｏｈｎ　Ｒｌｃｈａｒｄ　Ｂａｋｅｒの名を冠
して「ベーカ一法」と称され、フルクトサミンの測定法
として実用化されるに至っている。しかしながら、この
ベーカー法は反応速度に伴う呈色変化を利用するもので
あり、従って血清検体と界色試液とを混合して暫時イン
キュベートした後に第１回目の吸光度測定を行い、次い
で更に一定時間インキュベートを行った後に第２回目の
吸光度測定を行う２点測定法である点及び測定タイミン
グに高い精確性が求められる点に課題がある。

このために、吸光度測定が１回で済むエンド●ポイント
測定法が開発された　（特開昭６３−１８２５Ｇ７）。

この方法もエノール型フルクトサミンの還元作用を利用
してテトラゾリウム塩を有色ホルマザン染料に変じた上
で吸光度の測定を行うものであり、血清検体にはアスコ
ルビン酸、グルタチオン、ビリルビン、尿酸、グリセロ
アルデヒド、ジヒドロキシアセトン等の還元作用を有す
る物質が生体内物質として或は被験者に投与された薬物
に起因して存在し且つエンド●ポイント測定法において
は１　これらの還元作用物質が当然のことながらフルク
トサミンの測定妨害物質として振舞うので、これらが悪
影響を及ぼさないように何等かの手段を講じる必要性が
ある。この手段として、上記の特開昭８３　−　１８２
５６７公報によれば、発色試薬を添加する前に血清検体
を前処理することを提案しており、この前処理方法とし
て次の諸方法を教示している。

ａ》低温下での長時間にわたるインキュベーション、 ｂ）高温下でのインキュベーシｅン、 ｃ）　ｐＨ　１０以上のアルカリ条件下でのインキュベ
ーシ日ン、 ｄ）脱塩処理、 ｅ）酸化処理及び ｆ）酵素処理 （発明の目的） 本発明の目的は操作に熟練を必要とせず且つ測定所要時
間が短く、従って用手法にも機器分析法にも適用可能な
フルクトサミンの測定法を提供することにある。

（目的を達成する手段及び作用） 上記の目的を達成するために、本発明者は上記の特開昭
１１ｉ３　−　１８２５６７公報に開示されているエン
ド●ポイント法に着目し、検体の前処理について鋭意検
討を重ねた結果、偶然にも、水溶性金属塩の存在下に血
清検体を処理すると測定妨害物質の影響を無視し得る程
に著しく低減させることができ且つ当該処理のための所
要時間も比較的短いことを見い出して本発明を完成する
に至った。

従って、本発明によるフルクトサミンの測定法は、水溶
性金属塩を含有するアルカリ緩衝液である第１試薬を血
清検体に添加してインキュベートし、次いで発色剤水溶
液である第２試薬を添加して更にインキュベートした後
に吸光度を測定し、一方フルクトサミン濃度が既知の種
々の標準血清を用いて上記と同様に操作して吸光度を測
定することにより予め作成された標準検量線に上記の血
清検体について測定された吸光度値を照合することを特
徴としている。

本発明において上記の水溶性金属塩は系内に金属イオン
をもたらすものであり、当該金属イオンとしてはコバル
ト、ニッケル、クロム、マンガン、鉄、銅、亜鉛等を例
示することができるが、コノ＜ルトが好ましく、その塩
としては例えば舅酸コバルトを挙げることができる。ア
ルカリ緩衝液としては炭酸緩衝液を代表例として挙げる
ことができ、そのｐｎ領域としては測定対象物質である
フルクトサミンをエノール型に変じることにより還元作
用を発現させる観点から　１０　−　１４程度であるこ
とが好ましい。第Ｉ試薬は血清検体の、所謂「前処理液
」であり、本発明においては上記のように水溶性金属塩
を含有しているためにインキュベーション中にこの金属
塩が幾分なりとも沈澱してくる場合があるので、沈澱防
止剤を含有していることができ、この沈澱防止剤として
は酒石酸ナトリウムカリウム、クエン酸ナトリウム、エ
チレンジアミンテトラアセテート等を例示することがで
きる。

血清検体の前処理に必要とされるインキュベーシｅン時
間は１−１５分間程度である。

第２試薬中の発色剤としては、血清検体中のグルコース
と蛋白との反応により形成され且つ第１試薬中のアルカ
リ緩衝液に起因してアルカリ性環境であるためにエノー
ル型となるフルクトサミンにより還元されて呈色するも
のであれば使用可能であり、テトラゾリウム塩例えばｐ
−ヨードニトロテトラゾリウム　（ＩＮＴ）、ニトロブ
ルーテトラゾリウム　（ＮＢＴ）、テトラゾリウムバー
ブル、テトラゾリウムバイオレット　等を挙げることが
できる。発色剤がテトラゾリウム塩の場合に形成される
ホルマザン染料に沈澱が生じるのを防止するために可溶
化剤を、又変質を防止するために防腐剤を第２試薬は含
有していることができ、上記の可溶化剤としてはＴｒｌ
ｔｏｎ　Ｘ−１００　［ポリエチレン（ｌＯ）オクチル
フェニルエーテル］，　Ｂｒｌｊ　３５　（ポリエチレ
ンラウリルエーテル）、ＢｒｌＪ　５８　（ポリエチレ
ンセチルエーテル）等の界面活性剤を例示することがで
き、父上記の防腐剤としてはＮａＮ３を例示することが
できる。上記の第２試薬が添加された後に更にインキュ
ベーションが行われ、その間に検体血清中のフルクトサ
ミンは周囲環境が既述のようにアルカリ緩衝液に起因し
てアルカリ性であるためにエノール型となって還元作用
を呈し、その結果として上記の発色剤例えばテトラゾリ
ウム塩が還元されホルマザン染料となって溶液は呈色す
るに至る。この呈色反応はなかなかプラトーに達しない
が、この反応が実際上完了するまでに必要とされるイン
キュベーシ日ン所要時間は５−２０分間程度である。

次いで、この反応溶液の吸光度測定が行われる。

測定波長は選択された発色剤の種類に依存するが、テト
ラゾリウム塩の場合に生成するホルマザン染料の極大吸
収波長は５００ｎａ＋付近にあるので（　ＩＮＴ５３０
ｎｍ，　ＮＴＢ　５３０ｎｍ等）、この極大吸収波長が
選択される。

このようにして測定された吸光度を、標準検量線即ちフ
ルクトサミン濃度が既知の種々の血清を検体として上記
のように操作し且つ吸光度を測定してフルクトサミン濃
度と吸光度との関係を予め調べて作成されたグラフ又は
これに代わる資料と照合すれば、上記検体血清のフルク
トサミン濃度を知ることができる。

尚、本発明による測定法の第１工程において水溶性金属
塩含有アルカリ緩衝液である第１試薬を血清検体に添加
してインキュベートするのは血清検体中に場合により存
在する還元性物質、例えばアスコルビン酸等が測定妨害
物質として振舞うのを抑制乃至排除するためであり、血
清検体の前処理に相当する。血清検体の前処理に関連し
て、本明細書の「従来の技術」の項で紹介した特開昭６
３　−　１Ｂ２５１１ｉ７公報には既述のように「アル
カリ条件下でのインキュベーション」がその一つの方策
として示されている。しかしながら、後期の試験例に示
されているように、還元性物質例えばアスコルビン酸が
共存する場合に血清検体をアルカリ緩衝液の存在下に短
時間インキユベーションしただけでは吸光度測定に際し
ての影響を排除し得ず、本発明におけるように前処理時
に水溶性金属塩を共存させる場合に初めて妨害物質の影
響を充分に排除することができることに留意され度い。

この水溶性金属塩が如何なる作用機序を以って妨害物資
の影響を抑制するのかは不明であるが、解離した金属イ
オンが何等かの役目を果たしているものと推定される。

（実施例等） 次ぎに実施例及び試験例に関連して本発明を更に詳細に
且つ具体的に説明する。

夫應ぢ ａ）試薬の調製 Ｉ）　第１試薬： 下記の溶液を配合して調製。

３００＋ａＭ炭酸緩衝液（ｐｌｌ　１０．３）、２．５
ｍＭ　　硫酸コバルト及び ０．３％　酒石酸ナトリウムカリウム。

１１）第２試薬： 下記の溶液を配合して調製。

３．０ｍＭ　ＩＮＴ水溶液、 ０．０５％ＮａＮ＊及び ｌＯ％　Ｔｒ１ｔｏｎ　Ｘ−１００。

ｂ）操作 血清検体１００μ１に第１試薬を１１添加し）３７゜Ｃ
において５分間インキュベートする。次いで第２試薬を
１１添加し、３７゜Ｃにおいて更に５分間インキュベー
トした後に、当該溶液の吸光度を波長５００ｎｍで測定
し、この吸光度値を標準検量線に照合することにより上
記の血清検体中のフルクトサミン濃度を求める。

尚、上記の標準検量線はフルクトサミン濃度が既知の種
々の標準血清を検体とし、それぞれの標準血清検体につ
いて上記の操作を行うことによりフルクトサミン濃度と
吸光度との関係を予め調べて作成されたものである。

抜１且」（ベーカ一法との相関） 特公平ｉ−　ｔ３ｏｅ２公報に開示されているベーカ一
法によるフルクトサミンの測定試薬は日本ロッシュ株式
会社から市販されているので、この試薬を利用し、血清
検体５０例について用手法でフルクトサミンを測定し、
又これらの血清検体につき上記の「操作」の項で述べた
本発明方法によりフルクトサミンを測定し、両方法の相
関を求めた結果は第１図に示される通りであり良好な相
関のあることが判明した（回帰式Ｙ　：　０．８７３ｘ
　＋　０．２５）。

尚、本発明方法の同時再現性を調べた結果、ＣＶ　：　
２．０％であった。

抜１且」（還元性物質が吸光度に及ぼす影響）検体であ
る血清中に場合により存在し且つエンド●ポイント法に
よりフルクトサミンを測定する場合に妨害物質となり得
る還元性物質としてはアスコルビン酸、グルタチオン、
ピリルビン、尿酸、グリセロアルデヒド、ジヒドロキシ
アセトン等があるが、殊にアスコルビン酸はビタミンＣ
であり、摂取した食品や投与される各種の薬剤に由来し
て血清中に存在することの多い物質である。

そこで、妨害物質としてアスコルビン酸を選択して、そ
の２２＋ａｇ／ｄ　ｌ水溶液を調製し、このアスコルビ
ン酸溶液を０．２又は０　．３ｍｌ採取して２００ｍＭ
炭酸緩衝液（ｐ［１　１０．３）又は２．５ｍＭ硫酸コ
バルト溶液１．０１に添加し、次いで既述の実施例にお
けると同様に操作して、即ち３７℃で５分間インキュベ
ートし、次いで第２試薬を１．０１添加し、更に３７℃
で５分間インキュベートした後に波長５００ｎ＋ｓでの
吸光度を測定した。用いられた各試料及び結果は下記の
通りであり、測定妨害物質であるアスコルビン酸の影響
はアルカリ性である炭酸緩衝液により除去することはで
きないが、水溶性金属塩である硫酸コバルトが存在する
と無視し得る程に低下することが判明した。

試料Ｉ： （アスコルビン酸溶液０．２１＋炭酸緩衝液）十第２試
薬 試料２： （アスコルビン酸溶液０．３１＋炭酸緩衝液）÷第２試
薬 試料３： （アスコルビン酸溶液０．２１＋硫酸コバルトー炭酸緩
衝液）十第２試薬 試料４： （アスコルビン酸溶液０．３１＋硫酸コバルトー炭酸緩
衝液）十第２試薬 試料５（ブランク試料）： （精製水０．２１＋硫酸コバルトー炭酸緩衝液）第 ２ 試薬 （発明の効果） 本発明によるフルクトサミンの測定法は、所謂「エンド
●ポイント法」を採用するものであるので、吸光度測定
が１回で済み且つ測定操作に格別の熟練を必要としない
。本発明によるフルクトサミンの測定法は、基本的には
従来法と同様に、血清検体中のグルコースと蛋白との反
応生成物であるフルクトサミンをアルカリ性環境下でエ
ノール型のものに変じ、このエノール型フルクトサミン
が有している還元作用により発色剤を呈色させ、この呈
色液の吸光度を測定することを基礎とするものであり、
血清検体中に還元作用を有するアスコルビン酸等が存在
すれば、これらの物質は当然のことながらエノール型フ
ルクトサミンの還元作用と干渉してフルクトサミンの正
確な測定を妨害することになるので、これらの妨害物質
の影響を排除する必要性があるが、本発明によれば発色
剤溶液の添加に先立ち水溶性金属塩の存在下に血清検体
をインキュベー，トすることにより、妨害物質が測定に
及ぼす影響をほぼ完全に排除することができる。本発明
方法において試薬を適切に選択すれば、この所謂血清検
体の前処理に要するインキュベーション時間を５分間程
度になすことができ、又発色剤を添加した後のインキュ
ベーション所要時間も同程度になすことができ、従って
本発明方法は用手法にて実施する場合にも容易であり、
機器分析に適用することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法とべ一カー法とにより血清中のフル
クトサミンを測定して両方法の相関を調べた結果を示す
グラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）水溶性金属塩を含有するアルカリ緩衝液である第
   １試薬を血清検体に添加してインキュベートし、次いで
   発色剤水溶液である第２試薬を添加して更にインキュベ
   ートした後に吸光度を測定し、一方フルクトサミン濃度
   が既知の種々の標準血清を用いて上記と同様に操作して
   吸光度を測定することにより予め作成された標準検量線
   に上記の血清検体について測定された吸光度値を照合す
   ることを特徴とする、フルクトサミンの測定法。