JPH06509704A - 特定ｄｎａ配列に選択的に結合する蛋白質に対する偽構築体として有用なオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド - Google Patents

特定ｄｎａ配列に選択的に結合する蛋白質に対する偽構築体として有用なオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド

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JPH06509704A JP4510901A JP51090192A JPH06509704A JP H06509704 A JPH06509704 A JP H06509704A JP 4510901 A JP4510901 A JP 4510901A JP 51090192 A JP51090192 A JP 51090192A JP H06509704 A JPH06509704 A JP H06509704A
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オーゲル，レスリー
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ザ　ソールク　インスチチュート　フォア　バイオロジカル　スタディズ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特定ＤＮＡ配列に選択的に結合する蛋白質に対する偽構築体として有用な オリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド発明の分野 本発明は、新規なオリゴデオキシヌクレオチドおよび新規なオリゴヌクレオチド 、ならびに選ばれたメツセンジャーまたは他の細胞性ＲＮＡの産生を修飾するた めのそれらの使用に関する。
発明の背景 多くの遺伝子の転写速度は、制御蛋白質（たとえば。
転写因子、レプレッサー等）と１通常はプロモーターに近接して配置されている 特異的な短いＤＮＡ配列との相互作用に依存する。ＣＲＥＢ蛋白質（ＣＲＥ−Ｂ Ｐとも呼ばれる）はたとえば、配列５−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３゜を含有する二重 鎖ＤＮＡに強固に結合する。
このような標的配列を含有する二重鎖ＤＮＡは、制御蛋白質をそれらの内因性Ｄ ＮＡ標的からそらす偽構築体（ｄｅｃｏｙ）として、／ステム中に導入すること が可能である。制御蛋白質をそれらの内因性標的からそらすことによって、この 種の蛋白質の調節作用を変化させることができる。
このような標的配列を含有する二重鎖ＤＮＡは通常。
まず２つの相補性オリゴヌクレオチド鎖を合成し、ついでこれらを互いにハイブ リダイズさせることによって製造される。多くの治療的適用に際して要求される 。この種の二重鎖ＤＮＡの全細胞中への導入は、細胞がその生存を維持できる生 理的条件下にその構築体が安定でさえあれば有用であろうと考えられる。たとえ ば、その二重鎖ＤＮＡの配列の長さが不十分であると、２つの鎖は解離を起こし やすい、さらに、比較的短いＤＮＡ配列は。
生育培地中では、とくに酵素によるヌクレアーゼ消化を受けやすい傾向がある。
したがって、制御蛋白質に結合する標的配列を含有し。
しかも他の場合にはこのようなりＮＡを分解（および不安定化）してしまう生理 的条件にも安定なりＮＡ二重鎖へリノクスの開発が望まれる。
発明の詳細な説明 本発明によれば、制御蛋白質に結合する標的配列を含有する。改良されたＤＮＡ 構造が開発された０本発明の構造は、鎖の分離および酵素仲介の分解に対して安 定で。
制御蛋白質に対する偽構築体として有用であり、したがってこの種の制御蛋白質 によって正常時に発揮される転写制御を修飾することを可能にする。
図面の簡単な説明 図１は本発明のヘアピン型ＤＮＡの模式図である。
図２は本発明のダンベル”１１　Ｄ　Ｎ　Ａの模式図である。
図３は本発明のダンベル型ＤＮＡの数種の改良型の模式図である。
図４は本発明の共有結合ＤＮＡの模式図である。
発明の詳細な説明 本発明は、オリゴヌクレオチドからなる組成物を提供するものであり、そのオリ ゴヌクレオトドはその５′−末端から読んで。
（ｉ）デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基。
またはそれらの類縁体の配列からなる第一のセグメントであって、その相補体と ハイブリダイズした場合に、少なくとも６個のヌクレオチドの転写制御認識配列 少なくとも１個を形成するセグメント。
（ｉｉ）デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基。
またはそれらの類縁体の配列からなる第二のセグメントであって、上記第一のセ グメントと第三のセグメントとの間に第一のループ構造の形成を可能にするのに 十分なセグメント、および （ｉｉｉ）デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基、またはそれらの類 縁体の配列からなる第三のセグメントであって、上記第一のセグメントに対して 実質的に相補性であるセグメント。
から構成される。
本発明の他の実施態様においては、二重鎖ＤＮＡフラグメントからなる組成物で あって、そのＤＮＡフラグメントは少なくとも６個のヌクレオチド塩基対の転写 制御認識配列を含有し、そのＤＮＡフラグメントの一方の鎖は、上記ＤＮＡの各 鎖と共有結合する少な（とも１個のリンカ−によって他の鎖に結合した組成物を 提供する。
本発明のさらに他の実施態様においては、転写制御認識配列によって調節を受け る産物の転写を修飾する方法であって、上述の組成物の少なくとも１種の治療有 効量を対象に投与することからなる方法を提供する１本発明のさらに他の実施態 様においては、少なくとも６個のヌクレオチド塩基対の転写制御認識配列少なく とも１個を含有する二重鎖ＤＮＡフラグメントの安定性を改良する方法であって 、第−鎖とそれと相補性の鎖の間に、上記二重鎖ＤＮＡフラグメントの各鎖と共 有結合する少なくとも１個のリンカ−を導入する方法を提供する。
本発明のさらに他の実施態様においては、オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌ クレオチド配列を認識するポリペプチドに可逆的に架橋する方法を提供する。こ の方法は、上記オリゴヌクレオチドに１個または２＠以上のナスホロチオエート ジエステル結合が導入されたオリゴヌクレオチドを上述のようにして合成し、ホ スホロチオエートジエステル含有オリゴヌクレオチドを上記オリゴヌクレオチド の配列を認識するポリペプチドに結合させ。
ついでポリペプチド結合オリゴヌクレオチドを遷移金属試薬たとえばに２ＰｔＣ １４と接触させる。架橋の効果は。
この遷移金属に有効なリガンドたとえばアルカリ金属シアニド等で架橋材料を処 理することによって容易に逆転させることができる。
本発明でいう転写制御認識配列とは、制御蛋白質によって認識され、関連配列の 転写の増大もしくは抑制のいずれかに関与する配列である０本発明でいう転写制 御認識配列には、　Ｌｏｃｋｅｒ　＆　Ｂｕｚａｒｄ：　Ｊ、ＤＮＡ　Ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄＭａｐｐｉｎｇ　１：　３−１１　（１９９０）の論文に 掲げられた配列、ならびにプロモーター要素、ホルモン応答要素、ウィルスおよ び細胞要素、肝臓関連要素２組織関連要素等が包含される。
プロモーター要素の例としては、ＣＡＣＣＣボックス（配列５−ＧＣＣＡＣＡＣ ＣＣ−３°を宵する）、ＧＣ−ボックス（配列５−ＫＲＧＧＣＧＫＲＲＹ−３’ を有する。
配列番号＝１４１式中、にはそれぞれ独立にＧまたはＴであり、Ｒはそれぞれ独 立にＧまたはＡであり、ＹはＣまたはＴである）、ＮＦ−１細胞のＣＡＴ−ボッ クス（配列５’−ＴＴＧＧＣＮＮＮＮＮＧＣＣＡＡ−３’　または５−ＴＴＧＧ ＣＮＮＮＮＮＮＧ　ＣＣＡ−３を有する。それぞれ配列番号：１５および１６０ 式中、Ｎはそれぞれ独立にＡ。
Ｇ、ＣまたはＴから選ばれる）等を挙げることができる。
ホルモン応答要素の例としては、エストロゲン応答要素（配列５−ＧＧＴＣＡＣ ＡＧＴＧＡＣＣ−３°を有する。
配列番号：　１７）　、　！質コルチコイド応答要素（配列５−ＹＧＧＴＷＣＡ ＭＷＮＴＧＴＹＣＴ−３°を有する。配列番号＝１８１式中、Ｙはそれぞれ独立 にＣまたはＴであり。
Ｗはそれぞれ独立にＡまたはＴであり１ＭはＡまたはＣであり、ＮはＡ、Ｃ，Ｇ またはＴのいずれかである）。
甲状腺ホルモン応答要素（配列５’−ＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＧＴ− ３°を有する。配列番号：１９）、甲状腺ホルモン阻害要素（配列５−ＡＧＧＧ ＴＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＣ−３を有する。配列番号：２０）、ステロール依存性 レプレッサー（配列５−ＧＴＧＳＧＧＴＧ−３゜を有する０式中、ＳはＧまたは Ｃである）等を挙げることができる。
ウィルス要素の例には、パピローマウィルスＥ２エンハンサ−（配列５’−ＡＣ ＣＮＮＮＮＮＮＧＧＴ−３°を有する。配列番号２１０式中、Ｎはそれぞれ独立 に、Ａ、Ｃ。
ＧまたはＴから選ばれる）、アデノウイルスエンハンサー３（配列５’−ＴＴＴ ＴＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣ−３’を有する。配列番号：２２） 、ＥＩＩ−○ＲＦＰ（アデノ）要素（配列５’−ＡＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＴ −３°を有する。配列番号：２３）　、　ＥＳＶ　Ｉ　Ｅプロモーター（配列５ −ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ−３’を有する。
式中、ＲはＡまたはＧである）、ＥＳＶ後期プロモーター（配列５−ＧＧＧＴＡ ＴＡＡＡＴＴＣＣＧＧ−３°を有する。配列番号＝２４）等がある。
ウィルスおよび細胞性要素の例としては、Ｅ２Ｆ　（アデノ）要素（配列５−Ｔ ＴＴＣＧＣＧＣ−３°を有する）。
ＥＩＩａＥ−ｃβ（アデノ）要素（配列５−ＴＧＧＧＡＡＴＴ−３を宵する）、 Ｅ４１　Ｆ　１　（７デ／、ＣＭＶ）要素（配列５−ＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡ− ３°を有する。配列番号・２５）、アデノウィルス主要後期転写因子、ＵＥＦ。
ＵＳＦ　（配列５−ＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣ−３°を有する。配列番号＝２６ ）等がある。
肝臓関連要素の例としては、ＡＦＰボックスＩ（配列５−ＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡ −３’を有す、配列番号：　２７）　。
肝臓因子−Ａｉ、ＥＮＦ−２要素（配列５−ＴＧＲＭＣＣ−３°を有する８式中 、ＲはＡまたはＧであり２ＭはＡまたはＣである）、ｔ　ｒ−ＬＦｌ（ＦＲｒ） 要素（配列５°−ＡＲＹＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣ−３“を有する。配列番号：２８ 、式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、ｔｆ−ＬＦ２（ＤＲ ■）要素（配列５“−ＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴ−３°を有 する。配列番号：２９）、ＬＦ−Ｂｌ　（ＥＫＦ−１，Ｂ−蛋白質、肝臓要素、 ＰＥ、ＥＰ−１，ＡＦＰＩ）、配列５’−ＴＧＧＴＴＡＡＴＮＷＴＣＮＮＣＡ− ３’を有する（配列番号：３０゜式中ＷはＡまたはＴであり、Ｎはそれぞれ独立 にＡ、Ｃ。
ＧまたはＴから選択される）　、Ｃ／Ｅ　Ｂ　Ｆ’　（Ｅ　Ｂ　Ｐ−２０）要素 （配列５−ＴＣＮＴＡＣＴＣ−３’を有する）等が包含される。
その他の要素の例には、一般要素［たとえば、ＡＰ−１要素（配列５−ＴＧＡＧ Ｔ　ＣＡＧ−３’を有する）、ＡＰ−２要素（配列５−Ｇ　Ｓ　ＳＷＧ　Ｓ　Ｃ Ｃ−３°を有する０式中。
Ｓはそれぞれ独立にＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、ＡＰ−３要素 （配列５−ＧＧＡＡＡＧＴＣＣ−３°を有する）、ＡＰ−４要素（配列５−ＣＡ ＧＣＴＧＴＧＧ−３’を有する）、ＡＰ−５要素（配列５　’−ＣＴ　Ｇ　Ｔ　 ＧＧＡＡＴＧ−３’を有す、配列番号：３１）、ＣＲＥ−ＢＰ要素（配列５’− ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３”を有する）、配列５°−ＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＣ ＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣ−３′をもつ３°−エンハンサ−（配列番号：　３２）　 、　ｆｏｓ基底レベルインヒビター（配列５−ＧＣＧＣＣＡＣＣ−３°を有する ）　、　ｒｏｓ　Ｂ　’Ｌ　Ｅ−２要素（配列５−Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＣＴＧＧＧＧ ＣＧＴＡ−３°、配列番号：　３３）　、血清応答要素（配列５’−ＣＣＷＷＷ ＷＷＷＧＧ−３°を有す、配列番号＝３４９式中、Ｗは独立にＡまたはＴから選 ばれる）。
５ｒｓ−調整培地応答要素（配列５°−Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＣＣＧ　ＴＣＡＡＴＣ− ３’を有する。配列番号：　３５）　、α−インターフェロンウィルス応答要素 （配列５°−Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｎ　Ｎ　ＧＡＡＡＳＫ−３’を有す、配列番号： ３６１式中、Ｎはそれぞれ独立にＡ、Ｃ，ＧまたはＴであり、ＳはＣまたはＧで あり、にはＣまたはＴである）、α−インターフェロンサイレンサーＡ〈配列５ ’−ＧＡＡＡＧＹ−３°を有する。
式中、ＹはＴまたはＣである）、β−インターフェロンサイレンサーＢ（配列５ −ＴＣＭＹＴＴ−３°を有す９式％式％） リゾチームサイリンサー１　（配列５’−ＡＮＣＣＴＣＴＣＹ−３゛を有す）、 リゾチームサイレンサー２　（配列５°−ＡＮＴ’ＣＴＣＣＴＣＣ−３°を有す 、配列番号：３Ｔ）、リゾチームサイレンサー３（配列５−ＡＡＣＡＡＴＧＧＣ ＴＡＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡ−３°を有す、配列番号：３８）。
Ｍｙｃ−ＣＦＩ要素（配列５−ＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴ−３’を有する。配列番号 ＋３９）、ＴＧｐ−β阻害要素（配列５°−ＧＮＮＴＴＧＧＴＧＡ−３°を有す 、配列番号＝４０）等］。
組織関連要素［たとえば７膵臓二ンノ＼ンサー（配列５°−ＧＷＣＡＣＣＴＧＴ ＳＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧ−３°を有する。配列番号：４１）、ケラチン細胞エン ｌ＼ンサー（配列５’−ＡＡＮＣＣＡＡＡ−３°）、免疫グロブリン遺伝子エン バッサ−１たとえばμＥ１エンハンサー（配列５−ＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣ− ３’を有する。配列番号：４２）、μＥ２エンハンサー（配列５　’−ＣＡ　Ｇ 　Ｇ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＧＣＣＣＡ−３を有する。配列番号：４３）、μ Ｅ３エン／＼ノサー（配列５　’−Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ 　ＣＡ　Ａ　Ｃ−３゜を有する。配列番号：４４）、　μＥ４エンノーンサー（ 配列５’−ＴＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴ−３’を有する。
配列番号：４５）等］、ならびにこの種の他の要素が包含される。
本発明によれば、上述の転写制御認識配列に対する制御蛋白質の作用は、適当な 認識配列を含有する本発明の組成物の投与により修飾することができる。すなわ ち。
たとえば、ホルモン応答の誘導は上に掲げたホルモン認識配列の一つを宵する偽 構築体の投与によって修飾できる。同様に、癌遺伝子（たとえば、　ｍｙｃ、　 、釉上、　ｆｏｓ等に関連する遺伝子）の発現、ウィルスエンハンサ−等も。
適当な認識配列を含有する偽構築体の投与により修飾できる。この方法で癌遺伝 子の発現を停止させることにより、細胞集団がその正常状態に復帰するように処 置することが可能になる。ウィルスエンハンサ−の発現を停止させることにより ウィルス種の増殖を防止し、それにより宿主生物がウィルス感染に抵抗すること を可能にする。
本発明の組成物は９本技術分野の熟練者にはよ（知られているように、任意の適 当な投与手段により、たとえば注射により（適当な担体中に製剤化された場合） ９局所投与により（適当な担体中に製剤化された場合）、リポソーム中に封入し ついで慣用方法により投与して、または特異的抗体によってレシピエンド細胞に 標的化してなどにより、対象に供与できる。
本発明によって意図される構造には、「ヘアピン」構造（図１参照）、「ダンベ ル」構造（図２参照）、改良ダンベル構造（図３参照）、「架橋」偽構築体構造 、すなわち偽構築体の各鎖に共有結合する少なくとも一つのリンカ−によって互 いに共有結合した二重鎖構造（図４参照）等が包含される。
本発明の実施に際しての使用が意図されるループ構造は、偽構築体の一方の鎖を 他方に連結する少なくとも３つのヌクレオチドによって構成される０通常、ルー プ構造は約３から１０までの範囲のヌクレオチドからなり、現時点では５つのヌ クレオチドのループ構造が好ましい。
本発明の実施に際しての使用が意図されるダンベル構造は、偽構築体の各端にお ける上述のループ構造からなり、したがって閉じた環状のＤＮＡを形成する。ダ ンベルのハイブリダイズした鎖のいずれかのヌクレオチド結合の１つもしくは２ 以上を、ダンベルの基本的な二重ヘリ、クス構造を破壊することな（、切断でき ることは。
本技術分野の熟練者には知られている通りである。すなわち９本発明によれば、 修飾されたダンベル構造も意図されている（図３参照）、このような修飾構造に は、オリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチド結合中に１もしくは２以上のブレーク を含有する構造を包含する。オリゴヌクレオチドは、転写制御認識配列に必要な 標的制御蛋白質に対する幾何学的配置が実質的に変化しない限り任意に、ブレー ク部位での脱リン酸化および／または切断部位に通常存在する塩基の１つもしく は２以上の実際上の欠失があってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドの設計においては、１個または複数の転写制御認識 配列を組立てるのに必要なデオキ／ヌクレオチド、ヌクレオチドまたはそれらの 類縁体、ならびに１個もしくは複数のループ構造の導入に加えて、「スペーサー 」ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入することもできる。すなわち７本発 明のオリゴヌクレオチドは、それぞれ１個もしくは複数の転写制御認識配列また はループ構造の部分ではない付加的なヌクレオチド配列を包含することができる ９本発明のオリゴヌクレオチドにスペーサーヌクレオチドを導入しなげればなら ないとの絶対的要求はないが、　３０個までもしくはそれ以上のヌクレオチドを 、それぞれ１個もしくは複数の転写制御認識配列およびループ構造に加えて存在 させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の転写制御認識配列を含有するが １本発明の組成物は多重転写制御認識配列を含有することができる。このような オリゴヌクレオチドは同一の転写制御認識配列の多重リピートを含有しても、ま た２種以上の転写制御認識配列の１もしくは２以上のコピーを含有してもよい６ 本発明の単一のオリゴヌクレオチド中に包含できる転写制御認識配列の数には理 論的には限定はないが、一般的には、単一のオリゴヌクレオチド中には１０個も しくはそれ未満の転写制御認識配列が包含される。
転写制御認識配列の相補性配列を連結する別法には。
一方の鎖を他方に、（ポリ）アルキレン［たとえば（ポリ）メチレンコ橋、α、 ω−ポリ（アルキレン）ノカルボン酸、三核ｐｔ目錯体たとえば （式中、ｎは４．５または６である）のようなリッカーによる共有結合での連結 が包含される。転写制御認識配列の相補性配列を連結するさらに他の別法では、 転写制御認識配列の相補性の鎖を天然産物、ブソラレンと接触させついで紫外線 等に暴露して光架橋させる。などの方法がある。
本発明の構造の製造は、標準的な合成技術を用いて実施できる。たとえば１本発 明のヘアピンＤＮＡの製造には、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類縁 体の所望の配列を有するＤＮＡの単一鎖をＤＮＡシンセサイザーで製造し、つい で自己会合させることができる。
本発明のダンベルＤＮＡの製造には、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド 類縁体の所望の配列を有するＤＮＡの単一鎖をＤＮＡシンセサイザーで製造し、 適当なオリゴヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ついで自己会合させることに より１合成オリゴヌクレオチドの２つの末端が出合う位置にブレークを有するダ ンベル構造を形成できる。ついで、ダンベル構造中のブレークをアニーリングし くたとえばＤＮＡリガーゼを用いて）、閉じた環状のＤＮＡを製造できる。
本発明の実施に際しての使用が意図されるオリゴヌクレオチドは、天然に存在す るヌクレオチドまたはチオキンヌクレオチド（Ａ、Ｃ，Ｇ、ＴまたはＵ）ならび にそれらのヌクレアーゼ抵抗性類縁体（たとえば、ホスホロチオエート、メチル ホスホネート、ホスホロアミデート等）から製造できる。
本発明の実施にあたって用いられるオリゴヌクレオチドは、任意に、それに１個 または２個以上のホスホロチオエートジエステル連鎖を導入して修飾することも できる。生成した修飾オリゴヌクレオチドは、たとえば、オリゴヌクレオチドの それに結合するポリペプチドへの遷移金属触媒架橋に有用である。
ホスホロチオニートジエステル連鎖は１合成時、ボスファイト中間体の酸化に用 いられる試薬（この目的には通常、ヨウ素が使用される）をテトラエチルチオウ ラムノスルフィドのような硫化剤に置換することによって。
オリゴヌクレオチドに容易に導入される。
ホスホロチオエートジエステル連鎖は少なくとも１個を合成オリゴヌクレオチド に導入すると、そのポリペプチドとの架橋が容易になる。好ましくは、数個のホ スホロチオエートジエステル連鎖をオリゴヌクレオチドに導入する。現時点で好 ましい実施態様においては、少なくとも４個またはそれ以上のホスホロチオエー トジエステル連鎖がオリゴヌクレオチドの認識配列中（すなわち。
標的ポリペプチドによってｖ！、識されるオリゴヌクレオチドの部分）に導入さ れる。
本発明の実施にあたって用いられる適当な架橋触媒としては、遷移金属触媒たと えば、　Ｐｔ（ＩＩ）錯体を含めたＰｔ（Ｉ［）化合物がある。このような化合 物の例には。
Ｋ２ＰｔＣ１ａ、トランスジアミンニ塩化白金等が含まれる。
次に２本発明を、以下の非限定実施例によって、ざらに詳細に説明する。
性↓ ＣＲＥ−ＢＰに対するコア８−マー認識配列（５°−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’） を含有する以下のオリゴマーを、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて 合成した。
１、コアＣＲＥ−ＢＰ　８−マー認識配列を１両側の５隣接塩基とともに含有す る２つの相補性１８−マー配列：５　’　−ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　 ＴＧＧ　ＴＡＡ−３’　（配列番号：１）：＋１−Ｔｒｒ　ＡＡＣＴＧＣＡＧＴ 　ＡＣＣｈＴＴ−５＋（配列番号：２）２、上記相補性１８−マー配列を含有し 、配列番号１の３°末端が配列番号２の５′末端に、以下のように、５−塩基Ｃ ＴＣＴＣループによって連結した４１−マー（配列番号＝３）： ５’−ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＡ−Ｃ３、上記相補性１ ８−マー配列を含有し、３−ＯＨおよび５−ＯＨ尾部末端間のニックギャップに より自己ループ化構造を形成するように設計された４６−マー（配列番号；４） ： ↓↓ Ｃ−ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＡ−ＣＣイー＼詰ＣＴＧＣ ＡＧＴ　ＡＣＣＡＴＴ−Ｃニックオリゴマーはついで、Ｔ４ポリヌクレオチドキ ナーゼでリン酸化し、ＤＮＡリガーゼでリゲートして。
閉じた環状自己相補性構造を得ることができる（配列番号：５）： Ｃ−ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＡ−ＣＣ−ＴＴＴ　ＡＡＣ ＴＧＣＡＧＴ　ＡＣＣＡＴＴ−Ｃ上記各オリゴマーを、それらの５゛末端で（３ ２ｐ］により標識した。　０．０１〜０．０２光学密度単位（ＯＤ　Ｕ）を、　 ５０ＩＩＩＭトリス、ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣＩ２，５ａ＋ＭＤＤＴおよび ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液５０ｍ　ｌ中、２μＭのγ−［２２ＰコーＡ ＴＰ　（比活性３　μＣｉ／ｐｍｏｌｅ）および２０単位のポリヌクレオチドキ ナーゼとともに、３７℃で４５分間インキュベートした。２μｍの０．５ｍＭ　 Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａで反応を停止させ、フェノール／クロロホルムで抽出して酵素を 除去した。
５　’−［”’Ｐ　］−１識ｔ　ＩＪゴマ−を、ＲＰＣ−５上、ｐＨ１２におい て、０．０３Ｍ〜０．１３Ｍトリス−過クロル酸溶出勾配を用いたＨＰＬＣによ って、キナーゼ処理を受けなかった出発原料から分離した。
５　−［３２ｐコー標識オリゴマーをついで、　Ｎｅｎ５ｏｒｂ精製カートリツ ジ上で精製した。
５　’　−［３２Ｐ　］−］標識４６７−１〜５ｐＩＩＩｏｌを、５０ｍＭ　ト 　リス。
ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．５ｍＭ　ＡＴＰおよび０．５ｍＭＤＴＴ を含む緩衝液５０μｌ中、４単位のＤＮＡリガーゼと室温で一夜反応させた。
リゲートした生成物を、１２％アクリルアミド上変性ゲル電気泳動により、非す ゲート出発原料から分離した。
リゲート生成物は非すゲート物質よりも高い移動度を有し、アルカリホスファタ ーゼ処理に抵抗性を示したが。
非すゲート物質からはこの酵素により５−［３２Ｐ　］−標職が除去された。
本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号３．４および５）のＣＲＥ−ＢＰへの結 合能を検討するために、　０．０１５ｐｎ＋ｏｌｅの（３２ｐ］−標識４１マー 、４６マー、またはりゲート４６７−を、　２００ｎＨの純粋なＣＲＥ−ＢＰま たは４ｍｇの蛋白質を含む核細胞抽出物（Ｐ　Ｃ１２細胞から得た）のいずれか とインキュベートした。インキュベージコンは、　１５＋ｍＭト　リ　ス　、　 ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＫＣＩ、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５ｍＭＤＴＴ および９μｇ／ｌ１ｌｌのアセチル化ウシ血清アルブミンを含む緩衝液５μｍ中 、室温で２０分間行った。比較として　［３２ｐ］−標識二重鎖１８−マー（す なわち、配列番号１および２をハイブリダイズした生成物）を同一の試薬の存在 下に同一の条件でイノキュベートした。
［”Ｐ］−標識オリゴマーのＣＲＥ−ＢＰへの結合は、６％ポリアクリルアミド 非変性ゲル上ゲルシフドア、セイによって測定した。ｉｉ気泳動は７ｍａで約２ ．５時間実施した。ついで、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。
［”Ｐ］−標識オリゴマーのＣＲＥ−ＢＰへの結合は、ゲルの原点近くに移動が 著しく遅いバンドとして見ることができた。一方、非結合オリゴマーはかなり早 い移動度を示した。
二重鎖１８−マー、４１−マーならびに４６−マーの非すゲートおよびリゲート エの両者は、純粋なＣＲＥ−ＢＰおよび粗核抽出物中のＣＲＥ−ＢＰのいずれに も結合した。
リゲートした４６−マーは、他のいずれのオリゴマーよりも効率的に、ＣＲＥ− ＢＰに結合した。
上述の結合アッセイを実施したのちに、リゲートしたＣＲＥ−ＢＰオリゴマーの ＣＲＥ−ＢＰへの架橋を行った。
１ｍは１μｌの０．５ｍＭ）ランスジアミンニ塩化白金溶液を、結合反応混合物 ５μｌに加え室温に１時間放置することによって行った。
オリゴマーに結合した（ただし架橋していない）蛋白質は、最終濃度０．１％の ＳＤＳを添加するとオリゴマーから解離した。蛋白質に架橋したオリゴマーはＳ ＤＳによって解離せず、８％ＳＤＳゲル上で可視化できる９ＣＲＥ−ＢＰに最初 に結合したオリゴマーの約２０％が。
トランスジアミンニ塩化白金溶液による処理で蛋白質に架橋した。
ＣＲＥ−ＢＰ／オリゴマー複合体の、ヒトおよび胎児ウシの両血清中での酵素へ の暴露による分解に対する安定性を、以下のように測定した。すなわち、各［３ ２Ｐ］−１ｍオリゴマー（約１　ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）を、１００％ヒト血清また はＲＰＭ１１５４０培地（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｌａｂｓ）中１０％胎児つ／血清 内において、３７℃で、１０分〜２４時間にわたってイノキュベートした。血清 の７リコートを緩衝液で希釈し。
２０％変性ゲル（７Ｍ尿素を含有する２０％ポリアクリルアミドゲル、　ｐＨ８ ，２）上で分析した。
結果は、　３０分後には５０〜７５％の単一鎖オリコマ−がヒトおよびつ／血清 中のいずれにおいても分解したことを示した。二重鎖１８−マーは、２４時間後 に、いずれの血清中でも５０〜６０％が分解した。４１−マーは、１０％胎児ウ シ血清中３７°Ｃでは２４時間後にも依然として安定であったが。
１００％ヒト血清中３７℃では２４時間後に約２０％が分解した。
リゲートしたオリゴマーでは劇的に、ウシおよびヒトいずれの血清中において３ ７°Ｃで２４時間処理したのちにも。
検知可能な分解は認められなかった。
例■ 本発明の他の適用として、オリゴヌクレオチドすなわちＢｉｅｌ　１ｎｓｋａら ［５ｃｉｅｎｃｅ　２５０：　９９７−１０００（１９９０）］によって記載さ れた二重鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの安定性が、それへの少なく とも１個のループ構造の導入によって改良することができた。すなわち、著者ら によりＩＬ−２オクタマー転写因子と結合可能な（それにより、　Ｊｕｒｋｅｔ 細胞中、オクタマー配列エンハンサ−の制御下に蛋白質の発現を阻害できる）こ とが示されたＢｉｅｌｉｎｓｋａの二重鎖ホスホロチオエートプローブ（配列番 号二６）： ５　’　−ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＴＡＴ−３’：ｌ 　’　−ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＡＴＡ−５’を、 構造（配列番号ニア） ５’　−ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＴＡＴ−Ｔ３　’　 −ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＡＴＡ−Ｔのホスホロチ オエートヘアピンで置換することができた。
ヘアピン構造は、酵素仲介分解、変性等の作用に、はるかに高度の抵抗性を示す はずである。
同様の実験で、　Ｂｉｅｌｉｎｓｋａの二重鎖ホスホロチオエートプローブ（配 列番号二８）。
はクローン１３細胞中ＨＩＶエンハンサ−からの転写を抑制できることが明らか である。この配列は構造（配列番号：９）二 ５’−ＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＣＴ ３　’　−ＴＣＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＣＣＣＣＴＧＡ　ＡＡＡＧＴのホ スホロチオエートヘアピンで置換できた。ヘアピン構造は、酵素仲介分解、変性 等の作用に、はるかに高度の抵抗性を示すはずである。
性旦 以下の試薬は市販品を入手した。　Ｋ　２Ｐ　ｔＣ１４（Ｐｆａｌｔｚａｎｄ　 Ｂａｕｅｒ）；　トランスジアミンニ塩化白金等（ｔｒａｎｓＰｔ　ｌｒ）。
シスジアミンニ塩化白金等（ｃｉｓＰｔ”）および（ポリ［ｄｌ−ｄＣ］−ポリ ［ｄｌ−ｄＣ］）　（Ｓｉｇｍａ）：　Ｔ　４Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ −ＢＲＬ）　；ならびに、テトラエチルチオウラムシスルフィド（ＴＥＴＤ）／ アセトニトリル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である、精製ＣＲＥ Ｂ蛋白およびＰＣ１２細胞からのＣＲＥＢ含有核含有物抽出物Ｍａｒｅ　Ｍｏｎ ｔｍｉｎｙ博士によって恵与されたＪＵＮ蛋白は、　Ｉｎｄｅｒ　Ｖｅｒｍａ博 士によって恵与された二重鎖ＣＲＥ、ＴＲＥおよびＳｐｌ認識配列を含有するダ ンベルオリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号５，１１および１３）は、線状オ リゴヌクレオチド（それぞれ配列番号４，１０および１２）を、　Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９１ＰＣＲＭＡＴＥ型自動ＤＮＡシンセサイザー でボスポロアミダイト化学を用いて合成し、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼでリゲー トシて得られた。ホスホロチオエート連鎖は合成サイクル中の酸化工程で、Ｉ２ に代えて硫化剤ＴＥＴＤ／アセトニトリルを用いて導入した。これには、Ｉ２試 薬のＴＥＴＤ／アセトニトリルへの置換およびその逆の場合の合成で、ブレーク をもつオリゴマーを連続工程により合成する必要を生じた２　シンセサイザーは ホスポロチオエート残基の各導入の前後に再プログラムして、既に合成された配 列に１通常は樹脂結合開始モノマーによって果される役割を行わせた。
すなわち、配列５’−ＮＩＮ２Ｎ３Ｎ４（ｓ）Ｎ５Ｎ６Ｎ＝、−３’は、まず配 列５−Ｎ　６Ｎ　８Ｎ　？−３°を常法によって合成して作成した。ついでＩ２ 試薬をＴＥＴＤ／アセトニトリルに変え、配列Ｎ４Ｘ（式中Ｘは、既に樹脂に結 合している５°−Ｎ５Ｎ６Ｎ７−３°配列である）を、それが標準合成において 樹脂に結合した３−ヌクレオチドであるかのように処理する１合成プログラムを 硫化試薬についての使用説明書の指示に従って変更し＋Ｎ４をホスポロチオエー ト連鎖を介して配列中に導入する。ついで硫化試薬をヨー素試薬に代えて１通常 の合成サイクルプログラムを用いて配列５−Ｎ　ＩＮ　２Ｎ　３Ｘ−３°をプロ グラムする。
５−トリチル化ＣＲＥ　（Ｓ　＞６−４６ｖ　（配列番号：４）の合成は、たと えば、順次以下の配列を、（Ｓ）の指示のある残基で３−素試薬を硫化試薬に代 えて合成することにより実施した、 １）５’−ＡＴＧ−３’；　２）５−Ｃ（ｓ）Ｘ−３°；３）５−ＧＴＸ−３’ ；　４）５°−Ｃ（ｓ　）Ｘ　−３’５）５−ＧＡＸ−３°；’　６）５−Ｔ（ ｓ）Ｘ−３’７）５−ＡＡＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＣＡＡ　ＡＴＸ−３゜（配列番号 ：４６）； ８　）　５−Ｃ（ｓ　）Ｘ−３°；９）５°−ＧＴＸ−３°：１０）５°−Ｃ（ ｓ　）Ｘ−３°；　１１）　５’−Ｇ　Ａ　Ｘ−３°；１２）　５−Ｔ　（ｓ　 ）Ｘ−３°； １３）５−ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＣＴＣＴＴＡ　ＣＣＡ−３゜（配列番号：４７） 式中、”Ｘ”は樹脂結合オリゴマーである。
アンモニアで脱保護後、５°−トリチル化ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドをｏＰＣオリゴヌクレオチド精製カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅ ＋ｓｓ）上で脱トリチル化し。
１２％アクリルアミド上変性ゲル電気泳動によってさらに精製した（オリゴヌク レオチドは、ゲル負荷前に７０℃に３分間加熱した）、ホスホロチオエート含有 オリゴヌクレオチドは、ＲＰＣ−５カラム上ＨＰＬＣで分析すると。
標準のオリゴマーよりも長い保持時間を示した。それらは、各ホスホロチオエー ト基についてＲ−およびＳ−異性体が存在するので、多重ピークを与えた。Ｉ２ で酸化後［Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３巻、３４４３ −４４５３（１９８４）］。
それらを正常なホスホジエステル結合を含有するオリゴヌクレオチドに変換した 。これらはＲＰＣ−５上で鋭い単一のピークを与えた。オリゴヌクレオチドをそ の５−末端で、γ−［””Ｐ　］−Ａ　Ｔ　Ｐおよびポリヌクレオチドキナーゼ を用いてリン酸化した９キナーゼ処理された生成物を、　Ｎｅｎ５ｏｒｂ　ＤＮ Ａ精製カラム（Ｄｕ　Ｐｎｔ）で精製したが。
この段階では出発オリゴマーは分離されなかった。
５　’−［３２Ｐ　］−オリゴヌクレオチドまたはそれらのホスホロチオエート 含有類縁体（それぞれ配列番号：４，１０゜１２）のりゲートには、約１〜２０ ｐｍｏｌｅの線状オリゴヌクレオチドを、３６μｍの水中６５℃に３分間加熱し た。ついで、　１０μｍの５×リガーゼ緩衝液を加えて、最終反応混合物は５０ ｍＭ）リス（ｐＨ７，８）、　１０ｓ＋Ｍ　ＭｇＣ１２，１ｍＭＡＴＰ、１■Ｍ 　ＤＤＴおよび５％ポリエチレングリコールを含むようにした。室温に１０分間 放置したのち、４単位（４μｌ）のＤＮＡリガーゼを添加した。室温で一夜イン キユベートしたのち１反応混合物を７５℃に３分間加熱した。ついで、リゲート した生成物を、１２％ポリアクリルアミド上変性ゲル電気泳動によって、非すゲ ート出発原料から分離した。アルカリホスファターゼノ作用ニ抵抗性を示すリゲ ート型は、非すゲート型よりも早く移動する。リゲートした生成物の収率は、標 準オリゴデオキシヌクレオチドに対して５０〜９５％、ホスホロチオエート含有 オリゴマーに対して４０〜７０％の範囲であった。
リゲートＣＲＥおよびＣＲＥ　（Ｓ　）６配列のＣＲＥ　Ｂ蛋白への結合は、以 前に記載されているようにして実施した［　Ｄｖａｒｋｉら、ＥＭＢＯＪ、９： 　２２５−２３２（１９９０）：　Ｃｈｕ　＆　Ｏｒｇｅｌ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：　６９５ｇ（１９９１）コ　、　 約０．０１５ｐ＋ｍｏｌｅの［２２Ｐ　］−ＣＲＥ配列を５０＋１Ｍ　Ｋ　Ｃ１ ，１５ｍＭ　トリス（ｐＨ７，５）、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５＋ｎＭ 　ＤＤ　Ｔ、　１８０ｎｇのアセチル化ＢＳＡおよび（ポリ［ｄｌ−ｄｃ］−ポ リ［ｄｌ−ｄＣ］）　２５０ｎｇを含有する緩衝液１０μｌ中純枠なＣＲＥＢ蛋 白約２００　ｎｇに加え、ついで室温で１５〜２０分間インキュベートした。
結合は、非変性ゲル上、電気泳動緩衝液として４０ｍＭ　トリス−ホウ酸塩、　 ｐＨ８，２を用いるゲルシフトアッセイによって検出した。ＰＣＩ２細胞からの 核抽出物のアリコート（総蛋白４μｇ）へのりゲートＣＲＥ配列の結合も同様に して実施した。ＴＨＥ配列のＪＵＮ蛋白への結合も同様にし”Ｃ，５０！ＬＭ　 ）　’）　ス（ｐＨ７，９）、　１００ｍＭ　ＫＣＩ、１ｉＭ　ＥＤＴＡ、１ｍ Ｍ　ＤＤＴ、１２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２０％グリセロールおよび（ポリ［ｄ ｌ−ｄＣ］　・ポリ［ｄｌ−ｄｃ］）　２５０Ｂを含有する緩衝ｅｉ、１０μｍ 中で実施した。結合は、非変性ゲル電気泳動により、６％アクリルアミド上、２ ０■Ｍトリスーホウ酸塩（ｐＨ８，２）を電気泳動緩衝液として用いて検出した 。
オリゴヌクレオチドの蛋白質への架橋のためには、適当な［３２Ｐ　］−標ｍダ ンベル型オリゴヌクレオチド約０．０１５ｐｍｏｌｅ　を　、　５０ｉ＋Ｍ　Ｋ 　Ｃｌ、　１５ｍＭ　）　リ　ス　（ｐＨ７，５）、　０．１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　 Ａ　、　０．０６ｍＭ　Ｄ　Ｄ　Ｔ　、　１８０ｎＨのアセチル化ＢＳＡおよび （ポリ［ｄｌ−ｄＣ］−ポリ［ｄｌ−ｄＣ］）　２５０　ｎｇを含有する緩衝液 １０μｍ中２００ｎｇのＣＲＥＢまたはＪＵＮ蛋白とともにまず、上述のように インキュベートした。室温に１５分間装いたのち、所要量の１（２ＰｔＣ１４ま たはｔｒａｎｓＰｔ　”を１簡Ｍリン酸塩（ｐＨ７）および０１票Ｍ　ＥＤＴＡ 含有緩衝液中に含む新たに調製した溶液１〜３μｌを１反応混合物に加えた。イ ンキュベーションは室温、暗所で１時間継続した。ついで、ＳＤＳの５％溶液０ ５μｌを加え、架橋生成物を、非架橋オリゴヌクレオチドから、８％ポリアクリ ルアミド上、　９０＋ｍＭ　トリス−ホウ酸塩（ｐＨ８，２）および０．１％Ｓ ＤＳ　（ＳＤＳは非共有結合会合ＤＮＡ−蛋白質複合体を破壊する）を含有する 緩衝液を使用して分離した。
以上から、リゲートしたダンベルオリゴヌクレオチド中に含まれる二重鎖ＣＲＥ 　認識配列は、正常のハイブリダイズ二重鎖ＤＮＡ配列と同様に効率的に、ＣＲ ＥＢ蛋白に結合することが明らかである。同様の結果がＴＨＥダンベル配列とＪ ＵＮ蛋白についても認められた［Ｃｈｕ＆　Ｏｒｇｅ［１９９１）前出コ、別の 研究で、］ｉｇＣＲＥ（Ｓ）ｅ（配列番号：５参Ｐ、）またはｌｉｇＴ　ＲＥ　 （Ｓ　）８　（配列番号＝１１参照）のオクタマー認識配列内への６ホスホロチ オエート残基の導入はそれらのそれぞれＣＲＥＢまたはＪＵＮへの効率的な結合 を低下させないことが見出された。同様な結果は、ホスホロチオエート含有ＤＮ Ａと他の蛋白質の相互作用についても報告されているＣ　Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら 。
５ｃｉｅｎｃｅ　２５０巻、９９７−１０００（１９９０）コ　。
１ｉ　ＣＲＥ（ｓ）−ＣＲＥＢおよびｌｉ　ＴＲＥ（ｓ）−Ｊ　ＵＮのに２Ｐｔ Ｃ１４による架橋 ［３２Ｐ　］ｌｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　）ａを、０．３１Ｍ　Ｋ　２Ｐ　ｔ　Ｃ１ ４まタハ２＋ｅＭ　Ｋ２ＰｔＣｌ４の存在下にＣＲＥＢに架橋したのちの８％Ｓ ＤＳゲルのオートラジオグラムは、おおよその分子ｊ１１００．０００および５ ２．０００の蛋白質に相当する２つのバンドを示す０分子量１００，０００のバ ンドは二量体ＣＲＥＢ蛋白質（８６，０００）　［Ｍｏｎｔ＋ｍ１ｎｙ　＆　Ｂ １１ｅｚｉｋｊｊａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２８゜１７５−１７８（１９８７） コに結合したダンベルオリゴマー（１６，０００）に相当し、　５２．０００バ ンドはモノマーＣＲＥＢ蛋白質に結合したオリゴマーに相当するものと考えられ る。二量体型の架橋生成物の割合は白金濃度の増大に応じて増加する。これに対 し、架橋操作をＣＲＥＢの不存在下に実施すると、バンドは認められない。
［２２Ｐ　］ｌｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　）６の架橋効率を　［”Ｐ　］ｌｉｇｃ　 ＲＥ（すなわち同しりゲートダンベル配列であるが正常なホスホジエステル連鎖 を含む）および［３２Ｐ　］ｆｉｇｓ　ｐｉ　（ｓ　）６（配列番号：１３参照 ）（オクタマーＳｐｌ認識配列内に６ホスホロチオエート残基を含有する無関係 なダンベルオリゴマー）の場合と比較した。比較のために［３２Ｐ］ｌ１ｇＣＲ Ｅ　（ｓ　＞６および［３２ｐ］−標識されていない非すゲートオリゴマー８０ 倍過剰を含む架橋混合物、ならびに６ポスホロチオエート残基を含有する非標識 の無関係な配列の百倍過剰を含む架橋反応物も包含させた。
［”Ｐ　］］ｉｇＣＲＥ　（ｓ　）ｓの［２２Ｐコｌｉｇｃ　ＲＥとの比較では 、ＤＮＡ認識結合領域内における内部ボスポロチオエート残基の存在が、　Ｉｉ ｇＣＲＥ　（ｓ　）ｓのｃＲＥＢへの効率的な架橋に関与することを指示してい る。同じ環状ダンベルＣＲＥ配列が正常のホスホジエステル結合のみを含有した 場合には、架橋効率は８０％までの低下を示した。
低い白金濃度（０，３ｍＭ　）では、非置換オリゴヌクレオチドを使用した場合 、架橋は観察されなかった。
これらの結果はまた。　ｌｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　）６のｃＲＥＢへの架橋が配列 特異的であることを示している。同一の非標識（シかし非すゲート）ホスホロチ オエート配列の８０倍過剰を架橋反応に加えると架橋生成物の収率は８５〜９０ ％までの低下を示したが、内部６ホスホロチオエート残基を含む無関係な環状配 列を架橋混合物に添加した場合は。
架橋生成物の減少はみられなかった。さらに、Ｓｐｌ認識オクタマー配列中に６ ホスホロチオエート残基を含有するダンベルオリゴマーは、高白金濃度（２■Ｍ ）におけるＣＲＥ配列の場合の１０％未満の効率でＣＲＥＢに架橋した。中間白 金濃度（０，３ｍＭ　）では、架橋は検出できなかった。
ＳＤＳゲル電気泳動によって評価したＣＲＥＢへの架橋１ｉｇＣＲＥ　（ｓ　） ６のｐｍｏｌｅ数を、非変性ゲル電気泳動を用いた独立の実験で評価したＣＲＥ Ｂへの結合ｐｉｏｌｅ数と比較すると、　Ｋ２ＰｔＣｌ４濃度２．３ｍＭのとき 架橋効率は結合効率の４０〜５０％であることがわかった。に２ＰｔＣ１ａ濃度 を０．３ｍＭに低下させると、　２０〜３０％架橋効率を、４ｍＭに上昇させる と６０〜７０％架橋効率を生じた。
［３２ＰコｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）６　（配列番号：１１参照）をＪＵＮに架 橋する場合にも極めて類似した結果が得られる。正常ホスホジエステル結合を含 有する［”Ｐ　］ｌ　ｉｇＣＲＥは。
Ｋ２Ｐ　ｔＣ１４Ｊｉ　２　ｍＭの場合、［３２Ｐ　］ｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　 ）６の約１５％の効率で架橋する。　Ｋ２ＰｔＣｌ４濃度０．３ｍＭでは。
［”Ｐ　］ｌｉｇＴ　ＲＥの架橋は認められない、架橋反応混合物に８０倍過剰 の非標識、非すゲートｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）６を添加すると架橋は８５％ま で阻害されるが、同数のボスポロチオエート残基を含有するランダムオリゴマー の１００倍過剰では架橋は阻害されない、ダンベル［”Ｐ　］１１１ｇ５ｐｉ（ ｓ）６配列（配列番号＝１３参照）はｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）６の効率の１０ ％未満でＪＵＮに架橋する。架橋生成物の分子量から、架橋は［”Ｐ　］ｌｉｇ Ｔ　ＲＥ　（Ｓ　）ｅとモ／７−のＪＵＮの間で起こることがわかる。
ＴｒａｎｓＰｔＩＩはＣＲＥとＣＲＥＢまたはＴＲＥとＪＵＮの間に、に２Ｐｔ Ｃ１４での架橋に必要な濃度よりもかなり低い濃度で、効率的に架橋を形成する 。しかしながら。
比較的低濃度のｔｒａｎｓＰｔ　”　（０，０８ｍＭ　）でも、ＳＤＳゲルの原 点に付着する凝集が形成する。　Ｃ１５Ｐｔ”は効率的な架橋剤ではなかった。
ｐｔ＝架橋生成物を、室温で一夜、０．４Ｍ　ＮａＣＮによって処理すると、シ アニドイオンがホスホロチオエート基から白金錯体を置換し、標識オリゴヌクレ オチドｆｉｇＣＲＥ　Ｂ　（Ｓ　）８またはＩｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）ａが放出 する。
１ｉ　Ｔ　ＲＥ　（ｓ　）６のｃＲＥＢへの架橋ＤＮＡの蛋白質との弱い会合は 、ゲルシフト結合子。
セイによるよりも、白金との架橋によって感度よく検出できる。ゲル電気泳動に よれば、ＴＲＥ配列のＣＲＥＢへの結合はＣＲＥ配列の結合の約１ｏ分の１の規 模であることを示している［Ｍａｅｋａｖａら、ＥＭＢＯＪ、　８巻：　２０２ ３−２０２８（１９８９）］、　Ｔ　ＲＥ　ノＣＲＥ　Ｂ　ヘの会合の検出はに ２ＰｔＣ］４との架橋によって単純化される　ｃ　３２　Ｐコｌｉｇｃ　ＲＥ　 （Ｓ　）ｌｉ。
［”Ｐ　］ｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）ｅ、　ならびに［”’Ｐ　］Ｊｉｇｓ　ｐ ｉ（ｓ　）６のＣＲＥＢへの結合の測定には６％非変性ゲル上でのゲルンフトア ノセイが使用できる。　！ｉｇＣＲＥ　（ｓ　）Ｂは、ｆｉｇＴ　ＲＥ　（Ｓ　 ）＋ｓより約１０倍効Σ的に結合する。
同じ複合体を）（２Ｐｔｅ１４を用いて架橋すると、　［”Ｐ］１ｉｇＴ　ＲＥ 　（Ｓ　）ｓはＣＲＥＢに、［３２Ｐ　］ｌｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　）８がＣＲＥ Ｂに架橋する効率の約４０％の効率で架橋する。いくつかの実験の結果を検討し たところ、ＣＲＥＢに架橋したｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）ｓのｐｍｏｌｅ数は、 ゲルンフトアノセイで検出されたｐｌｏｌｅ数より３〜５倍多いことが明らかで ある。ＣＲＥＢに結合しない配列＋　［３２Ｐ　］１１１ｇ５ｐｉ（ｓ　）６（ 配列番号：５参照）の架橋を試みた場合には、架橋生成物に相当するバンドは見 られなかった。これは、ｌｉｇＴ　ＲＥ　（Ｓ　）８のＣＲＥＢへの架橋は配列 特異的であることを指示している。
［３２Ｐ　］ｌ＋　ＣＲＥ　（ｓ　）６および［３２Ｐ　］Ｉｉ　Ｔ　ＲＥ　（ ｓ　）のＰＣ１２核細胞抽出物中蛋白質への架橋（３２Ｐ　］ＩｉｇＣＲＥ　（ ｓ　）ａまたは［３２Ｐ　］１ｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）６をＰＣＩ２細胞からの 核細胞抽出物に添加し、に２ＰｔＣ１４で処理したところ、それらは抽出物中の 蛋白質に架橋した。
［３２Ｐ　］ｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）ｅの場合、ＳＤＳゲル上に数個のバンド が存在した。主要なバンドは、予想されたように。
［”Ｐ　］ｌｉｇＴ　ＲＥ　（ｓ　）６と純粋なＪＵＮによって形成された付加 物と同じ移動度を示した。しかしながら、　［２２Ｐ］１ｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　 ）６の場合には、主要バンドは＋　Ｃ３２Ｐ］　］　ｉｇＣＲ，Ｅ（ｓ）ｅ−Ｃ ＲＥＢ付加物と同じ移動度を示さなかった。その代わり、それは、ｌｉｇＴ　Ｒ Ｅ　（Ｓ　）６−Ｊ　Ｕ　Ｎと共電気泳動した。
組物細胞抽出物中で、　ｌｉｇｃ　ＲＥ　（ｓ　）＋ｓは、ＣＲＥ配列が結合す ることが既に知られているＡＰ−１結合蛋白質［５ａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら 、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５巻：　４２７−４３１（１９９０）］　に優先的に架橋 するものと考えられる。ＰＣ１２細胞核抽出物を用いる標準ゲルシフトアッセイ により、ＣＲＥ配列はＣＲＥＢ蛋白質に対するよりもＡＰ−１蛋白質により広範 に結合することが確認される。
以上１本発明をその好ましい一部の実施態様をとくに参照しながら詳細に説明し たが１本明細書に記述し、請求された本発明の精神および範囲内で改変および修 飾が可能であることを理解すべきである。
配列表 配列番号１： ５　’　−ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＡ−：ｌ　’配列番 号２： ５’−ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＣＧＴ　Ｃ島ＴＴＴ−３’配列番号３： ３　’−ＴＴＴ　ＡＡＣＴＧＣＡＧＴ　ＡＣＣＡＴＴ−Ｃ配列番号４： Ｃ−ＴＴＴ　ＡＡ、、ＣＴＧ、、ＣＡＧ、、Ｔ　ＡＣＣＡＴＴ−Ｃ式中、−（Ｓ ）−は、そこにホスホロチオエートジエステル連鎖が任意に導入されるヌクレオ チド（すなわち、正常ホスホジエステル結合がホスホロチオエートジエステル結 合で置換される位置）を示す。
配列番号５： 配列番号６゜ 配列番号７： ５　’　−ｋｋｋ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＴＡＴ−Ｔ配列番 号８： ５　’−ＡＧＧ　ＧＡＣＴＴ’ｒ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　 Ｃ−３’３　’　−ＴＣＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＣＣＣＣＴＧＡ　ＡＡＡ 　Ｇ−５’配列番号９： ５’−ＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＣＴ τ コミ−ＴＣＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＣＣＣＣＴＧＡ　ＡＡＡ　ＧＴ配列番 号１０： ］５ Ｃ−ＡＧＣＡＴ・・・Ｇ　ＡＧ・・・Ｔ　ＣＡ・・・Ｇ　ＡＣＡ　ＣＡ″″０Ｃ −ＴＣＧ　ＴＡ、ｓ、ＣＴＣ，、Ａ　ＧＴ（ｓ、ＣＴＧＴ　ＧＴ−Ｃ配列番号１ １： Ｃ−ＴＣＧ　ＴＡ、ｓ、ＣＴＣ，、Ａ　ＧＴ（ｓ、ＣＴＧＴ　ＧＴ−Ｃ配列番号 １２： 〕５ 配列番号１３： Ｃ−ＣＴＡ　ＧＣ（、ＣＣＣ，、）Ｇ　ＣＣ（ｓ、ＣＣＧＣＴＣＧ−Ｃ配列番号 １４： ５−ＫＲＧＧＣＧＫＲＲＹ−３’　（式中、にはそれぞれ独立にＧまたはＴであ り、Ｒはそれぞれ独立にＧまたはＡであり、ＹはＣまたはＴである） 配列番号１５： ５°−ＴＴＧＧＣＮＮＮＮＮＧＣＣＡＡ−３’配列番号１６： ５°−ＴＴＧＧＣＮＮＮＮＮＮＧＣＣＡ−３゜配列番号１７： ５−ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣ−３“配列番号１８： ５°−ＹＧＧＴＷＣＡＭＷＮＴＧＴＹＣＴ−３’（式中、Ｙはそれぞれ独立にＣ またはＴであり、Ｗはそれぞれ独立にＡまたはＴであり２ＭはＡまたはＣであり 。
ＮはＡ、Ｃ，ＧまたはＴのいずれかである）配列番号１９： ５°−ＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＧＴ−３’配列番号２０： ５’−、ＡＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＣ−３’配列番号２１： ５’−ＡＣＣＮＮＮＮＮＮＧＧＴ−３’（式中、Ｎはそれぞれ独立に、Ａ、Ｃ， ＧまたはＴから選ばれる） 配列番号２２： ５−ＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣ−３′ 配列番号２３： ５−ＡＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣ’ＧＡＴ−３’配列番号２４： ５−ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧＧ−３゜配列番号２５： ５’−ＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡ−３’ 配列番号２５： ５−ＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣ−３’ 配列番号２７： ５’−ＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡ−３’ 配列番号２８： ５−ＡＲＹＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣ−３’（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣ またはＴである）配列番号２９： ５−ＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴ−３゜配列番号３０： 配列５−ＴＧＧＴＴＡＡＴＮＷＴＣＮＮＣＡ−３’（式中、ＷはＡまたはＴであ り、Ｎはそれぞれ独立にＡ。
Ｃ，ＧまたはＴから選択される） 配列番号３１： ５−ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ−３゜配列番号３２： ５−ＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣ−３゜ 配列番号３３： ５−ＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＡ−３゜配列番号３４： ５−ＣＣＷＷＷＷＷＷＧＧ−３゜ （式中、Ｗは独立にＡまたはＴがら選ばれる）配列番号３５： ５’−ＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣ−３’配列番号３６： ５°−ＧＡＡＡＮＮＧＡＡＡＳＫ−３゜（式中、Ｎはそれぞれ独立にＡ、Ｃ，Ｇ またはＴであり。
Ｓ　＋′ＩＣまたはＧであり、にはＣまたはＴである）配列番号３７： ５°−ＡＮＴＣＴＣＣＴＣＣ−３゜ 配列番号３８： ５°−ＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡ−３°配列番号３９： ５’−ＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴ−３゜ 配列番号４０： ５°−ＧＮＮＴＴＧＧＴＧＡ−３゜ 配列番号４１： ５’−ＧＷＣＡＣＣＴＧＴＳ　ＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧ−３’配列番号４２： ５’−ＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣ−３゜配列番号４３： ５’−ＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡ−３゜配列番号４４： ５°−ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＡＡＣ−３゜配列番号４５二 ５’−ＴＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴ−３゜配列番号４６： ５°−ＡＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＴＸ−３’（式中、“Ｘ”は樹脂付着オリゴ マーである）配列番号４７： ５’−ＧＴＡＡＣＴＣＴＣＴ　ＴＡＣＣＡＸ−３’（式中、“Ｘ”は樹脂付着オ リゴマーである）ＦＩＧ、３ 補正書の写しく翻訳文）提出書（曲法第１８４条）８）平成　５　年　１０　月 　１５−

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. １．オリゴヌクレオチドの５′−末端から読んで，（ｉ）デオキシヌクレオチド もしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類縁体の配列からなる第一のセグメ ントであって，その相補体とハイブリダイズした場合に，少なくとも６個のヌク レオチドの転写制御認識配列少なくとも１個を形成するセグメント， （ｉｉ）デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類縁 体の配列からなる第二のセグメントであって，上記第一のセグメントと第三のセ グメントとの間に第一のループ構造の形成を可能にするのに十分なセグメント， および （ｉｉｉ）デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類 縁体の配列からなる第三のセグメントであって，上記第一のセグメントに対して 実質的に相補性であるセグメント， から構成されるオリゴヌクレオチド。
  2. ２．さらにデオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類 縁体の配列からなる第四のセグメントから構成され，この第四のセグメントは上 記第一のセグメントと第三のセグメントとの間に第二にのループ構造の形成を可 能にするのに十分ナセグメントであり，第二のループ構造は第一のセグメントの ５′−末端と第三のセグメントの３′−末端を連結することによって形成される 「請求項１」に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. ３．第一または第三のセグメントのいずれかにブレークが存在する「請求項２」 に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. ４．オリゴヌクレオチドは第一または第三のセグメントのいずれかに存在するブ レークの部位において脱リン酸化されている「請求項３」に記載のオリゴヌクレ オチド。
  5. ５．脱リン酸化に加えて，上記オリゴヌクレオチドから，ブレークの部位で，上 記デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類縁体の１ または２以上が欠失している「請求項４」に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. ６．上記第一および第三のセグメントはさらに，共有結合による結合手段で互い に結合している「請求項１」に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. ７．共有結合は，上記第一のセグメントの上流末端を上記第三のセグメントの下 流末端に結合させる役目を果す「請求項６」に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. ８．上記共有結合による結合手段は，（ポリ）アルキレン橋，α，ω−ポリ（ア ルキレン）ジカルボン酸，式▲数式、化学式、表等があります▼ （式中，ｎは４、５または６である）から選ばれる二核Ｐｔ１１錯体，または転 写制御認識配列の相補性鎖を天然産物，プソラレンと接触させ，ついで紫外線に 暴露して光架橋させることから選択される「請求項６」に記載のオリゴヌクレオ チド。
  9. ９．デオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基，またはそれらの類縁体の ループ構造の形成に十分な上記配列は少なくとも３残基からなる「請求項１」に 記載のオリゴヌクレオチド。
  10. １０．上記オリゴヌクレオチドはさらに，上記転写制御認識配列と会合する蛋白 質と共有結合を形成できるように修飾される「請求項１」に記載のオリゴヌクレ オチド。
  11. １１．二重鎖ＤＮＡフラグメントからなる組成物であって，上記二重鎖ＤＮＡフ ラグメントは少なくとも６個のヌクレオチド塩基対の転写制御認識配列少なくと も１個を含有し，上記ＤＮＡフラグメントの一方の鎖は他の鎖に，上記ＤＮＡ鎖 のそれぞれに共有結合する少なくとも１個のリンカーによって結合する組成物。
  12. １２．上記共有結合リンカーは，上記二重鎖ＤＮＡフラグメントの一方の鎖の３ ′−末端とそれと相補性である鎖の５′−末端の間にループ構造の形成を可能に するのに十分な塩基の配列，または上記二重鎖ＤＮＡフラグメントの一方の鎖の ５′−末端とそれと相補性の鎖の３′−末端の間にループ構造の形成を可能にす るのに十分な塩基の配列，または２つの塩基配列が上記二重鎖ＤＮＡフラグメン トの一方の鎖の３′−末端とそれと相補性である鎖の５′−末端の間ならびに上 記二重鎖ＤＮＡフラグメントの相補性の鎖の３′−末端と第一の鎖の５′−末端 との間にループ構造の形成を可能にするのに十分な塩基の２つの配列であるか， あるいは，（ポリ）アルキレン橋，α，ω−ポリ（アルキレン）ジカルボン酸， 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中，ｎは４，５または６である）から選ばれる二核Ｐｔ１１錯体，または転 写制御認識配列の相補性鎖を天然産物，プソラレンと接触させついで紫外線に暴 露して光架橋させることである「請求項１１」に記載の組成物。
  13. １３．単一のもしくは複数のループ構造の形成を可能にするのに十分な上記塩基 配列は約３〜１０個の範囲のヌクレオチドからなる「請求項１２」に記載の組成 物。
  14. １４．単一のもしくは複数のループ構造の形成を可能にするのに十分な上記塩基 配列は任意の５個のヌクレオチド塩基からなる「請求項１３」に記載の組成物。
  15. １５．転写制御認識配列によって調節が行われる生成物の転写を修飾する方法に おいて，「請求項１」に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することからな る方法。
  16. １６．転写制御認識配列によって調節が行われる生成物の転写を修飾する方法に おいて，「請求項１１」に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することから なる方法。
  17. １７．少なくとも６個のヌクレオチド塩基対の転写制御認識配列少なくとも１個 を含有する二重鎖ＤＮＡフラグメントの安定性を改良する方法において，第一の 鎖とそれと相補性の鎖の間に，上記二重鎖ＤＮＡフラグメントの各鎖に共有結合 する少なくとも１個のリンカーを導入することからなる方法。
  18. １８．オリゴヌクレオチドをそれに結合するポリペプチドに架橋する方法におい て，そのオリゴヌクレオチドに少なくとも１個のホスホロチオエート基を導入シ ，ポリペプチド結合，ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドを遷移金属触 媒と接触させることからなる方法。
  19. １９．遷移金属触媒はＫ２ＰｔＣｌ４である「請求項１８」に記載の方法。
  20. ２０．上記オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの認識配列中に導入され た少なくとも４個もしくはそれ以上のホスホロチオエートジエステルを含有する 「請求項１８」に記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010090103A (ja) * 2008-02-13 2010-04-22 Gene Design Inc 新規オリゴヌクレオチド誘導体及びそれから成るＮＦ−κＢデコイ
JP2011050381A (ja) * 2009-08-07 2011-03-17 Gene Design Inc 新規オリゴヌクレオチド誘導体及びそれから成るＮＦ−κＢデコイ

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
US5747253A (en) * 1991-08-23 1998-05-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial oligomer immunoabsorbant screening assay for transcription factors and other biomolecule binding
US5445935A (en) * 1992-11-23 1995-08-29 Royer; Catherine A. Quantitative detection of macromolecules with fluorescent oligonucleotides
US5859226A (en) * 1993-07-29 1999-01-12 Regents Of The University Of California, The Polynucleotide decoys that inhibit MHC-II expression and uses thereof
WO1995004064A1 (en) * 1993-07-29 1995-02-09 The Regents Of The University Of California Polynucleotide decoys that ihnibit mhc-ii expression and uses thereof
DE69332702T2 (de) * 1993-10-29 2003-10-16 Shunichi Shiozawa Verwendung der gensequenz eines promotors zur behandlung rheumatischer erkrankungen
US7615538B2 (en) 1993-10-29 2009-11-10 Shunichi Shiozawa Method for therapy of rheumatoid arthritis
EP1350514A3 (en) * 1993-10-29 2004-07-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic use of cis-element decoys in vivo
US6399376B1 (en) 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US5643726A (en) * 1994-11-10 1997-07-01 The General Hospital Corporation Methods for modulating transcription from the amyloid β-protein precursor (APP) promoter
WO1996016074A1 (en) * 1994-11-17 1996-05-30 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide and carcinostatic agent containing the same as active ingredient
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US6060310A (en) * 1997-11-24 2000-05-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor
DE69841110D1 (de) 1997-12-17 2009-10-08 Serono Genetics Inst Sa Verlängerte cdns, die für sekretierte proteine kodieren
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1049773B1 (en) 1998-01-22 2007-07-25 Btg International Limited Inhibition of cytokine production
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
WO1999049029A1 (en) * 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd Control of gene expression
ATE356630T1 (de) 1998-04-03 2007-04-15 Univ Iowa Res Found Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
AU5329599A (en) * 1998-07-30 2000-02-21 University Of South Florida Method for the modulation of function of transcription factors
DE19855013C2 (de) 1998-11-20 2001-09-13 Schering Ag Androgen- und Progesteron-Rezeptor bindendes Hormon Response Element
EP2314700A1 (en) * 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
AU4343700A (en) 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
WO2001040516A2 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Molecular Staging Inc. Generation of single-strand circular dna from linear self-annealing segments
EP1322655B1 (en) 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20030040613A1 (en) * 2000-04-24 2003-02-27 Bishop Karl Duncan Structurally modified molecular decoys for the manipulation of cellular or viral replication and other uses relating thereto
AU2001270134B2 (en) 2000-06-22 2006-06-15 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US6911541B2 (en) * 2000-08-30 2005-06-28 North Carolina State University Promoter fragment that is recognized by the product of the tobacco Nic gene
WO2002038588A2 (en) * 2000-11-07 2002-05-16 North Carolina State University Putrescine-n-methyltransferase promoter
EP1229134A3 (en) * 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US6867189B2 (en) 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
WO2003020884A2 (en) 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
DE10148828B4 (de) 2001-10-04 2005-05-19 Avontec Gmbh Modulation der Expression STAT-1-abhängiger Gene
AU2002366710A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US20030224992A1 (en) * 2002-03-15 2003-12-04 Praecis Pharmaceuticals Inc. Transcription factor modulators and uses thereof
CN1240439C (zh) * 2002-03-28 2006-02-08 南京凯基生物科技发展有限公司 肿瘤基因开关药物
AU2003304107B2 (en) 2002-11-01 2008-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory CpG oligonucleotides
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
US20050070494A1 (en) * 2003-05-14 2005-03-31 Cutroneo Kenneth R. Transforming growth factor-beta response element decoys and methods
US7482158B2 (en) 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
JP4989493B2 (ja) * 2006-01-20 2012-08-01 オリンパス株式会社 分子内プローブによる核酸配列の検出方法
EP2426142A3 (en) 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
CA2723672C (en) * 2007-05-11 2019-09-03 Adynxx, Inc. Gene expression and pain
US20110306653A1 (en) * 2010-05-14 2011-12-15 Tagcyx Biotechnologies Stabilization method of functional nucleic acid
EP3511022A1 (en) 2012-05-10 2019-07-17 Adynxx, Inc. Formulations for the delivery of active ingredients
JP6705807B2 (ja) 2014-08-15 2020-06-03 エーダイニクス インコーポレイテッド 疼痛を治療するためのオリゴヌクレオチドデコイ
EP3740495A1 (en) * 2018-01-15 2020-11-25 Universität Heidelberg Nfat binding polynucleotides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582789A (en) * 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
DE3717436A1 (de) * 1987-05-23 1988-12-08 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von doppelstraengiger dna
JPH03505966A (ja) * 1988-07-14 1991-12-26 ベイラー カレッジ オブ メディシン 生物高分子の固相組立及び再構築方法
WO1990003445A1 (en) * 1988-09-30 1990-04-05 The Salk Institute For Biological Studies Target nucleic acid amplification/detection systems
US5449769A (en) * 1989-03-06 1995-09-12 Gen-Probe Incorporated Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
NO904633L (no) * 1989-11-09 1991-05-10 Molecular Diagnostics Inc Amplifikasjon av nukleinsyrer ved transkriberbar haarnaalsprobe.
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010090103A (ja) * 2008-02-13 2010-04-22 Gene Design Inc 新規オリゴヌクレオチド誘導体及びそれから成るＮＦ−κＢデコイ
JP2011050381A (ja) * 2009-08-07 2011-03-17 Gene Design Inc 新規オリゴヌクレオチド誘導体及びそれから成るＮＦ−κＢデコイ

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Publication number Publication date
CA2106386A1 (en) 1992-10-19
EP0580754A1 (en) 1994-02-02
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US5683985A (en) 1997-11-04

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