JPH104980A - 遺伝子の細胞周期調節発現のための核酸構築物、その構築物を含有する細胞および医薬を製造するためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療用核酸構築物の提供。 【解決手段】 （ａ）アクチベーター配列、（ｂ）Ｅ２
Ｆファミリーの少なくとも１種のタンパク質に結合する
ヌクレオチド配列を有し、かつＣＨＦファミリーの少な
くとも１種のタンパク質に結合する他のヌクレオチド配
列を有するプロモーターモジュール、および（ｃ）細胞
周期に依存して発現される活性物質をコードする遺伝子
を含む少なくとも１種の遺伝子の細胞周期に依存した発
現ための核酸構築物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、遺伝子工学において、特に疾
患の遺伝子治療において、使用することができる核酸構
築物に関する。

【０００２】遺伝子治療において、体の中での発現が意
図される遺伝子は体の中に導入される。これらの遺伝子
の発現の調節は、遺伝子治療の治療効果について重要で
ある。

【０００３】

【発明の概要】したがって、本発明は、遺伝子治療にお
いて使用できる核酸構築物に関する。これらは、下記の
成分を含んでなる少なくとも１種の遺伝子の細胞特異的
またはウイルス特異的発現および細胞周期依存的発現の
双方のための核酸構築物である： ａ） その機能が基本転写において細胞特異的またはウ
イルス特異的活性化であるアクチベーター配列、 ｂ） Ｅ２Ｆファミリーの少なくとも１種のタンパク質
に結合するヌクレオチド配列を有し、かつＣＨＦファミ
リーの少なくとも１種のタンパク質に結合する他のヌク
レオチド配列を有し、そして、さらに、転写開始配列を
含有してもよいプロモーターモジュール、 ｃ） 細胞特異的またはウイルス特異的に発現され、か
つ細胞周期依存的に発現される活性物質をコードする構
造遺伝子。

【０００４】

【発明の具体的説明】本発明による核酸構築物におい
て、プロモーターモジュール（ｂ）は、他方において、
Ｅ２Ｆファミリーの少なくとも１種のタンパク質に結合
するヌクレオチド配列を有する。この配列は、好ましく
は、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＧＣＧＧＧまたは機能的
に同様な（類似する）配列、例えば、ＴＴＴＣＧＣＧＣ
Ｃ（ＤＨＦＲ遺伝子のＥ２Ｆ結合部位）またはＴＴＴＣ
ＧＣＧＧＣ（Ｅ２Ｆ−１結合部位）を含んでなるヌクレ
オチド配列から選択される。

【０００５】他方において、プロモーターモジュール
（ｂ）はＣＨＦファミリーの少なくとも１種のタンパク
質に結合するヌクレオチド配列を有する。この配列は、
好ましくは、ヌクレオチド配列ＴＡＧＧＡＡＡまたは機
能的に同様な（類似する）配列を含む。

【０００６】本発明による核酸構築物において、プロモ
ーターモジュール（ｂ）は、細胞周期のＧ０およびＧ１
期において上流に位置するアクチベータ配列の効果を阻
害し、下流に位置する遺伝子（ｃ）の発現を阻害するこ
とができる。

【０００７】好ましい態様において、本発明による核酸
構築物におけるアクチベーター配列（ａ）は細胞特異的
またはウイルス特異的である。

【０００８】核酸構築物は好ましくはＤＮＡから成る。
用語「核酸構築物」は、標的細胞において転写されるこ
とができる人工的核酸構造物を意味する。核酸構築物は
好ましくはベクターの中に挿入される。プラスミドベク
ターまたはウイルスベクターが特に好ましい。

【０００９】本発明による核酸構築物によって、遺伝子
（ｃ）は細胞特異的またはウイルス特異的に発現され、
かつ細胞周期依存的に発現される。遺伝子（ｃ）は好ま
しくは薬理学的に活性な物質をコードするか、または薬
剤の不活性前駆体を活性薬剤に切断する酵素をコードす
る遺伝子である。

【００１０】本発明による核酸構築物は活性化配列を有
し、好ましくは、このような活性化配列は内皮細胞、平
滑筋細胞、造血細胞、リンパ球、マクロファージ、腫瘍
細胞またはグリア細胞における転写を活性化するプロモ
ーターまたはエンハンサーの群から選択されるか、また
はＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ
またはＨＩＶのようなウイルスのプロモーター配列また
はエンハンサー配列の群から選択される。

【００１１】本発明は、また、本発明による核酸構築物
を含んでなる単離された細胞に関する。

【００１２】本発明による核酸構築物、またはこれを含
有する細胞は、好ましくは、過度の細胞増殖に関連する
疾患の治療用薬剤を製造するために使用され、該薬剤の
製造は核酸構築物を標的細胞の中に導入し、そして細胞
増殖の段階においてそれを発現させることを含む。

【００１３】本発明による核酸構築物はこの形態で天然
に存在しない。すなわち、核酸構築物の遺伝子（ｃ）は
アクチベーター配列（ａ）とプロモーターモジュール
（ｂ）との組み合わせで天然に存在しない。

【００１４】活性化配列である成分（ａ）はある領域を
意味し、前記領域は遺伝子の一部分であり、いわゆる転
写因子である調節タンパク質がその領域に結合し、前記
調節タンパク質が、全体において、下流に位置する構造
遺伝子の転写を活性化することができる。

【００１５】「下流の」配列と呼ばれる領域は転写の方
向に位置する領域であり、反対方向に配置された配列は
「上流の」配列と呼ばれる。

【００１６】Ｅ２Ｆファミリーの転写因子およびＣＨＦ
ファミリーの転写因子の双方は、本発明に従い使用され
るプロモーターモジュールに結合し、そして活性化配列
の下流に位置する。

【００１７】Ｅ２Ｆ分子のファミリーは、例えば、Ｅ２
Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４およびＥ２Ｆ５の
ような分子を包含し、これらの分子は、適当ならば、Ｄ
Ｐ１、ＤＰ２またはＤＰ３と複合化されている。Ｅ２Ｆ
分子は、活性化二量体の複合体、例えば、Ｅ２Ｆ１−Ｄ
Ｐ１および三量体のＥ２Ｆ複合体、例えば、Ｅ２Ｆ１−
ＤＰ１−ｐＲｂを包含する［Bandara et al., Nature,2
52,249(1991);Chellappan et al., Cell 65,1053(199
1);Chittenden et al., Cell 65,1073(1991);Helin et
al., 70,337(1992);Kaelin et al., Cell 70,351(199
2)] 。複合体Ｅ２Ｆ４−ＤＰ１およびＥ２Ｆ４−ＤＰ１
−ｐ１０７は、例えば、Beijersbergen et al., Genes
Dev.8,2680(1994)およびGinsberg et al., Genes Dev.
8,2665(1994)に記載されている。さらに、Ｅ２Ｆ２、Ｅ
２Ｆ３、Ｅ２Ｆ５、ＤＰ２およびＤＰ３を含む対応する
複合体が列挙される。

【００１８】Ｅ２Ｆ分子が属する転写因子に共通の性質
は、遺伝子の発現と細胞の状態との間の関係が存在する
ということである。休止細胞における遺伝子の転写は非
常に少ないが、分裂細胞において転写は増加する。培養
した細胞を使用する実験において、血清、好ましくはウ
シ胎児血清を休止細胞に添加することによって、発現を
刺激することができる。

【００１９】細胞は細胞分裂により増殖し、細胞のゲノ
ムは有糸分裂の前に複製される。非分裂の休止細胞はＧ
０と呼ぶ期にあるか、またはＧ１期によりそれらの細胞
状態の進行が阻害される。細胞分裂状態が開始すると
き、細胞はＧ０期またはＧ１ブロックから解放される。
Ｇ１期は通常比較的長い期間を有する期である。細胞の
ＤＮＡ内容物はＧ０およびＧ１期において二倍体の状態
にある。Ｇ１期の次にＳ期が続き、このＳ期において、
ＤＮＡ合成が起こり、そしてゲノムは複製される。次い
で第２のＧ期、すなわち、Ｇ２が続き、このＧ２期にお
いて、細胞は四倍体状態にある。次いで、有糸分裂が起
こり、そして細胞はＧ１またはＧ０状態に到達する。

【００２０】Ｂ−ｍｙｂ遺伝子は細胞分裂に関係する。
Ｂ−ｍｙｂ遺伝子の転写は細胞周期の後期Ｇ１期におい
て増加し（例えば、マウス繊維芽細胞において）、そし
てＳ期において最も顕著である（Lam et al., EMBO J.1
2,2705(1993)) 。

【００２１】ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧ
はＢ−ｍｙｂ遺伝子のプロモーター配列の一部であり、
そしてＧ０および初期Ｇ１期における遺伝子の抑制に関
係する（Lam et al., EMBO J.12,2705(1993)) 。ＴＴＴ
ＣＧＣＧＣはＥ２ａアデノウイルスのプロモーターの成
分であり、そして活性化Ｅ２Ｆ結合部位の領域(zone)を
表す（Mudryj et al., EMBO J.9,2179(1990)）。

【００２２】本発明の範囲内において、Ｂ−ｍｙｂ遺伝
子のプロモーター配列からのある種の領域は、本発明に
よる核酸構築物の一部分である遺伝子の発現を制御する
ことができることが見出された。このヌクレオチド配列
は、本発明によるプロモーターモジュール（ｂ）と呼
び、Ｇ０および初期Ｇ１期において下流に位置する遺伝
子を調節、特に抑制、することと本質的に関連する。

【００２３】本発明に従い使用するプロモーターモジュ
ール（ｂ）は、Ｅ２Ｆファミリーの転写因子が結合する
ことができるヌクレオチド配列を有する。これは下記の
配列を含む： ＣＴＴＧＧＣＧＧＧ （配列番号：１） またはこの配列の類似の変異型、例えば、 ＴＴＴＣＧＣＧＣＣ （配列番号：２） ＴＴＴＣＧＣＧＧＣ （配列番号：３）

【００２４】本発明によるプロモーターモジュール
（ｂ）は、さらに、３’末端においてＥ２Ｆ部位より下
流に位置し、かつＣＨＦファミリーの分子が結合できる
配列を有する。このヌクレオチド配列は、同様に抑制に
必要であり、抑制の間にＥ２Ｆ結合部位と共調する。こ
の配列は下記の配列を含む： ＴＡＧＧＡＡＡ （配列番号：４） またはこの配列の類似の変異型。

【００２５】Ｂ−ｍｙｂ遺伝子において、本発明による
プロモーターモジュールの配列１および配列４は、下記
の配置の中に存在する。 ＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡ ＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧ Ｔ （配列番号：５） 特に好ましい態様において、プロモーターはこの配列を
含む。

【００２６】このプロモーターモジュールは高いアフィ
ニティーのＥ２Ｆ結合部位を有し、そしてインビボ、す
なわち、生きている細胞におけるこのヌクレオチド配列
（特にＣＴＴＧＧＣＧＧＧ）へのＥ２Ｆ分子の結合は、
驚くべきことには、Ｇ０および初期Ｇ１期に制限され
（Lam et al., EMBO J.12,2705(1993)の生化学的（イン
ビトロ）結合データと対照的である）、Ｓ、Ｇ２および
Ｍ期（すなわち、Ｂ−ｍｙｂ遺伝子の転写が最も顕著で
あるとき）において検出不可能であることが見出され
た。

【００２７】さらに、Ｅ２Ｆ結合部位から下流に位置す
るＣＨＦファミリーからのタンパク質の他の結合領域
（好ましくはＴＡＧＧＡＡＡ）が有効な抑制に必要であ
ることは予測されなかった。

【００２８】Ｂ−ｍｙｂ遺伝子の転写の時において、ヌ
クレオチド配列ＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧへのＥ２Ｆタン
パク質の結合は見出されないので、細胞の中に存在する
活性化Ｅ２Ｆ二量体はＢ−ｍｙｂ遺伝子の細胞周期調節
において明らかな役割を演じない。したがって、Ｅ２Ｆ
が仲介する抑制はＢ−ｍｙｂの調節においてきわめて重
要なメカニズムである。

【００２９】本発明による核酸構築物の配置は、図８に
示される通りである。

【００３０】本発明による核酸構築物におけるアクチベ
ーター配列および構造遺伝子は、好ましくは下記のよう
にして、使用目的に依存して選択することができる。

【００３１】（１） 内皮細胞の増殖の阻害による腫瘍
および慢性炎症の治療 １．１．ａ） 内皮細胞中で活性化されたアクチベータ
ー配列 本発明の目的から、好ましいアクチベーター配列は、特
に内皮細胞（または増殖する内皮細胞に近い細胞）にお
いて検出可能なタンパク質をコードする遺伝子のプロモ
ーターからの遺伝子調節配列および要素を包含する。

【００３２】これらのタンパク質のいくつかは、Burrow
s et al.,Pharmac.Therp.64,155(1994) およびPlate et
al.,Brain Pathol.4.207(1994）に記載されている。こ
れらの内皮細胞特異的タンパク質は、例えば、下記のも
のを特に包含する。

【００３３】− 脳特異的内皮グルコース１トランスポ
ーター このプロモーター配列は、Murakami et al.,J.Biol.Che
m.267,9300(1992)に記載されている。 − エンドグリン このプロモーター配列は、Bellon et al.,Eur.J.Immuno
l.23,2340(1993）およびGe et al.Gene 138,201(1994）
に記載されている。 − ＶＥＧＦレセプター ２つのレセプターが区別されている（Plate et al., In
t.J.Cancer 59,520(1994)): − ＶＥＧＦレセプター１（ｆｌｔ−１） （de Vries et al., Science 255,989(1992)) および − ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｋ−１、ＫＤＲ） （Terman et al., BBRC 187,1579(1992)) 。

【００３４】双方のレセプターは、内皮細胞上にほとん
ど専ら見出される（Senger et al.,Cancer Metast.Rev.
12,303(1993)）。

【００３５】− 他の内皮細胞特異的レセプターのチロ
シンキナーゼ − ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２ （Partanen et al., Mol.Cell.Biol.12,1698(1992),Sch
nurch およびRisau,Development 119,957(1993),Dumont
et al., Oncogene 7,1471(1992)) − Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター） (Bartley et al., Nature 368、558(1994)、Pandey et a
l., Science 268,567(1995),van der Geer et al., An
n.Rev.Cell Biol.10,251(1994))

【００３６】− Ｂ６１ Ｂ６１分子はＢ６１レセプターのリガンドである。（Ho
lzman et al., J.Am.Soc.Nephrol.4,466(1993),Bartley
et al., Nature 368,558(1994)) − エンドセリン、特に − エンドセリンＢ このプロモーター配列は、Benatti et al., J.Clin.Inv
est.91,1149(1993) に記載されている。

【００３７】− エンドセリン−１ このプロモーター配列は、Wilson et al., Mol.Cell.Bi
ol.10、4654(1990)に記載されている。 − エンドセリンレセプター、特にエンドセリン−Ｂレ
セプター (Webb et al., Mol.Pharmacol.47,730(1995),Haendler
et al., J.Cardiovasc.Pharm.20,1(1992))。

【００３８】− マンノース６−ホスフェートレセプタ
ー このプロモーター配列は、Ludwig et al., Gene 142,31
1(1994),Oshima etal.J.Biol.Chem.263,2553(1988)およ
びPohlmann et al.(PNAS USA 84、5575(1987) に記載さ
れている。 − フォン・ウィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒ
ａｎｄ）因子 このプロモーター配列は、Jahroudi & Lynch,Mol.Cell.
Biol.14,999(1994),Ferreira et al., Biochem.J.293、6
41(1993)およびAird et al.,PNAS USA 92、4567(1995)に
記載されている。

【００３９】− ＩＬ−１α、ＩＬ−１β このプロモーター配列は、Hangen et al., Mol.Carcin
g.2,68(1986),Turneret al., J.Immunol.143,3556(198
9),Fenton et al., J.Immunol.138,3972(1987),Bensi e
t al.,Cell Growth Diff.1,491(1990),Hiscott et al.,
Mol.Cell.Biol.13,6231(1993) およびMori et al., Bl
ood 84,1688(1994)により記載された。 − ＩＬ−１レセプター このプロモーター配列は、Ye et al., PNAS USA 90,229
5(1993) により記載された。

【００４０】− 血管細胞付着分子（ＶＣＡＭ−１） ＶＣＡＭ−１のプロモーター配列は、Neish et al., Mo
l.Cell.Biol.15,2558(1995),Ahmad et al., J.Biol.Che
m.270,8976(1995),Neish et al., J.Exp.Med.176,1583
(1992),Iademarco et al., J.Biol.Chem.267,16323(199
2) およびCybulsky et al., PNASUSA 88,7859(1991)に
より記載された。 − 合成アクチベーター配列 また、天然の内皮細胞特異的プロモーターの代替物とし
て、合成アクチベーター配列を使用することができる。
このような合成アクチベーター配列は、内皮細胞におい
て優先的または選択的に活性である転写因子のオリゴマ
ー化結合部位から成る。それらの１つの例は転写因子Ｇ
ＡＴＡ−２であり、そのエンドセリン−１遺伝子中の結
合部位は５’−ＴＴＡＴＣＴ−３’である(Lee et al.,
Biol.Chem.266,16188(1991),Dorfmann et al., J.Bio
l.Chem.267,1279(1992)およびWilson et al., Mol.Cel
l.Biol.10,4854(1990)) 。

【００４１】１．１．ｂ） 活性化された内皮細胞の付
近の細胞の中で活性化されたアクチベーター配列 内皮細胞が増殖しているとき、隣接する細胞は「緊密な
接合」のために血液からの高分子にアクセス可能とな
る。機能的および解剖学的相互関係は、活性化された内
皮細胞の付近における細胞が本発明の目的のための標的
細胞であることを意味する。 − ＶＥＧＦ ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子調節配列は、下記の通りであ
る： − ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター配列（５’フランキ
ング領域）（Michenko et al., Cell.Moll.Biol.Res.4
0、35(1994),Tischer et al., J.Biol.Chem.266、11947(1
991))または − ＶＥＧＦ遺伝子のエンハンサー配列（３’フランキ
ング領域）(Michenko et al., Cell.Moll.Biol.Res.40,
35(1994)) または − ｃ−Ｓｒｃ遺伝子(Mukhopadhyay et al., Nature 3
75,577(1995),Bonham et al., Oncogene 8,1973(1993),
Parker et al., Mol.Cell.Biol.5、831(1985),Anderson
et al., Mol.Cell.Biol.5,1122(1985)) または − Ｖ−Ｓｒｃ遺伝子(Mukhopadhyay et al., Nature 3
75、577(1995),Anderson et al., Mol.Cell.Biol.5,1122
(1985))、Gibbs et al., J.Virol.53,19(1985))

【００４２】− ステロイドホルモンのレセプターおよ
びそれらのプロモーター要素（TrussおよびBeato,Endoc
r.Rev.14,459(1993))、特に、下記のものを包含する： − マウス哺乳動物腫瘍ウイルスのプロモーター ＭＭＴＶの長い末端反復領域のプロモーター領域のｃＤ
ＮＡ配列は、Chalepakis et al., Cell 53、371(1988)お
よびTruss & Beato,Endocr.Rev.14,459(1993) に記載さ
れている。

【００４３】１．２．） 抗腫瘍（または抗炎症）物質
のための構造遺伝子 １．２．ａ） 増殖インヒビター 本発明の目的のための抗腫瘍または抗炎症物質は、内皮
細胞の増殖を阻害するタンパク質のＤＮＡ配列を意味す
る。これらは、例えば、下記のためのＤＮＡ配列を包含
する： − 網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０ ）ま
たはその類似体ｐ１０７およびｐ１２０ − ｐ５３タンパク質 − ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質 − ｐ１６タンパク質 − 他のＣｄＫインヒビター − ＧＡＤＤ４５タンパク質 − ｂａｋタンパク質

【００４４】これらの細胞周期インヒビターの急速な細
胞内不活性化を防止するために、好ましく使用される遺
伝子は、発現されたタンパク質の不活性化部位に対して
突然変異を有する遺伝子であり、これらの突然変異は遺
伝子の機能を障害しない。

【００４５】網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）および
関係するｐ１０７およびｐ１３０タンパク質は、リン酸
化により不活性化される。したがって、ｐＲｂ／ｐ１１
０、ｐ１０７またはｐ１３０ｃＤＮＡ配列は、コードさ
れたタンパク質のリン酸化部位がリン酸化されることが
できないアミノ酸により置換されるような方法におい
て、点突然変異として好ましく使用される。

【００４６】１．２．ｂ．） 血管形成インヒビター 抗腫瘍または抗炎症物質は、さらに、血管形成を阻害す
るタンパク質のためのＤＮＡ配列を意味する。これらの
タンパク質は、例えば、下記のものを包含する。 − 組織因子（ＴＦ）およびそのプロコアグラント(pro
coagulant)断片 − プラスミノゲンアクチベーターインヒビター１（Ｐ
ＡＩ−１） − ＰＡＩ−２ − ＰＡＩ−３ − アンギオスタチン − インターフェロン − ＩＦＮα − ＩＦＮβ − ＩＦＮγ − 血小板因子４ − ＩＬ−１２ − ＴＩＭＰ−１ − ＴＩＭＰ−２ − ＴＩＭＰ−３ − 白血病阻害因子（ＬＩＦ）

【００４７】１．２．ｃ） 細胞増殖抑制および細胞障
害性タンパク質 しかしながら、抗腫瘍または抗炎症物質は、また、腫瘍
に対して、直接または間接的に、細胞増殖抑制作用を有
するタンパク質についてのＤＮＡ配列を意味する。これ
らは、特に、下記のものを包含する。 − 抗体および抗体切断産物 − パーフォリン(perforin) − グランザイム(granzyme) − ＩＬ−２ − ＩＬ−４ − ＩＬ−１２− インターフェロン、例えば、 ＊ ＩＦＮ−α ＊ ＩＦＮ−β ＊ ＩＦＮ−γ − ＴＮＦ ＊ ＴＮＦ−α ＊ ＴＮＦ−α − オンコステインＭ − マガイニンおよびマガイニン誘導体(Cruciani et a
l., PNAS 88,3792(1991);Peck-Miller et al., Cancer
Chemoth.Pharmac.32,109(1993)) − スフィンゴミエリナーゼ(Jarvis et al., PNAS-USA
91、73(1994))

【００４８】１．２．ｄ） 炎症インデューサー 抗腫瘍物質は、さらに、適当ならば、抗腫瘍作用に加え
て炎症を刺激し、したがって、腫瘍細胞の排除に寄与す
るタンパク質のためのＤＮＡ配列を意味する。これら
は、例えば、下記のものを包含する。 − ＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ−２） − 単球化学走性および活性化因子（ＭＣＡＦ） − ＩＬ−８ − マクロファージ炎症タンパク質−１（ＭＩＰ−１
ａ、−β） − 好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２） − ＩＬ−３ − ＩＬ−５ − ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ） − ＩＬ−７ − ＩＬ−１１ − ＩＬ−１３ − ＧＭ−ＣＳＦ − Ｇ−ＣＳＦ − Ｍ−ＣＳＦ − 補体を活性化する細菌のタンパク質 − コブラ毒液因子（ＣＶＦ）およびＣＶＦ部分配列

【００４９】また、本発明の目的のための活性物質とし
て、一方において列挙したサイトカインおよび他方にお
いてヒト免疫グロブリンのＦｃ部分から成る融合タンパ
ク質のＤＮＡ配列を使用することができる。この型のＤ
ＮＡ配列およびそれらの製造は、欧州特許（ＥＰ）第０
４６４ ６３３ Ａ１号に記載されている。

【００５０】１．２．ｅ） 細胞増殖抑制物質の前駆体
を活性化する酵素 しかしながら、抗腫瘍または抗炎症物質は、また、抗腫
瘍活性物質の前駆体を抗腫瘍活性物質に変換することが
できる酵素のためのＤＮＡ配列をも意味する。不活性前
駆体物質（プロドラッグ）を切断して活性細胞増殖抑制
物質（薬物）を生成するこの型の酵素、および各場合に
おける関係するプロドラッグおよび薬物は、既に、Deon
arain et al.,Br.J.Cancer 70,786(1994),von Mullen,P
harmac.Ther.63,199(1994)) およびHarris et al., Gen
eTher.1,170(1994) に記載されている。

【００５１】例えば、下記の酵素の１つのＤＮＡ配列を
使用すべきである。 − 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ (Garapin et al., PNAS USA 76,3755(1979),Vile et a
l., Cancer Res.53,3860(1993),Wagner et al., PNAS U
SA 78,1441(1981),Moelten et al., Cancer Res.46,527
6(1986),J.Natl.Cancer Inst.82,297(1990)) − 水痘帯状ウイルスチミジンキナーゼ (Huber et al., PNAS USA 88,8039(1991),Snoeck,Int.
J.Antimicrob.Agents4,211(1994)) − 細菌のニトロリダクターゼ (Michael et al., FEMS Microbiol.Lett.124,195(199
4),Bryant et al., J.Biol.Chem.266,4126(1991),Watan
abe et al., Nucleic Acids Res.18,1059(1990)) − 細菌のβ−グルクロニダーゼ (Jefferson et al., PNAS USA 83,8447(1986)) − Secale cerealeからの植物のβ−グルクロニダーゼ
(Schulz et al., Phytochemistry 26,933(1987))

【００５２】− ヒトβ−グルクロニダーゼ (Bosslet et al., Br.J.Cancer 65,234(1992),Oshima e
t al., PNAS USA 84,685(1987)) − ヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば、 ＊ マスト細胞ＣＢ−４ (Reynolds et al., J.Clin.Invest.89,273(1992)) ＊ 膵臓ＣＢ−Ｂ (Yamamoto et al., J.Biol.Chem.267,2575(1992),Catas
us et al., J.Biol.Chem.270,6651(1995)) ＊ 細菌のカルボキシペプチダーゼ (Hamilton et al., J.Bacteriol.174,1626(1992),Oster
man et al., J.Protein Chem.11,561(1992))

【００５３】− 細菌のβ−ラクタマーゼ (Rodrigues et al., Cancer Res.55,63(1995),Hussain
et al., J.Bacteriol.164,223(1985),Coque et al., EM
BO J.12,631(1993)) − 細菌のシトシンデアミナーゼ (Mullen et al., PNAS USA 89,33(1992),Austin et a
l., Mol.Pharmac.43,380(1993),Danielson et al., Mo
l.Microbiol.6,1335(1992)) − ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ (Ezurum et al., Nucl.Acids Res.21,1 607(1993))

【００５４】− ホスファターゼ、特に ＊ ヒトアルカリ性ホスファターゼ (Gum et al., Cancer Res.50,1085(1990)) ＊ ヒト前立腺酸性ホスファターゼ (Sharieff et al., Am.J.Hum.Genet.49,412(1991),Song
et al., Gene129,291(1993),Tailor et al., Nucleic
Acids Res.18,4928(1990)) ＊ ５型酸性ホスファターゼ (Gene 130,201(1993)) − オキシダーゼ、特に ＊ ヒトｌｙｓｙｌオキシダーゼ (Kimi et al., J.Biol.Chem.270,7176(1995)) ＊ ヒト酸性Ｄ−アミノキソイダーゼ (Fukui et al., J.Biol.Chem.267,18631(1992))

【００５５】− ペルオキシダーゼ、特に ＊ ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ (Chada et al., Genomics 6,268(1990),Ishida et al.,
Nucl.Acids Res.15,10051(1987)) ＊ ヒト好酸球ペルオキシダーゼ (Ten et al., J.Exp.Med.169,1757(1989),Sahamaki et
al., J.Biol.Chem.264,16828(1989)) ＊ ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ （Kimura,PNAS USA 84,5555(1987))

【００５６】列挙した酵素の分泌を促進するために、各
場合においてＤＮＡ配列の中に存在する相同シグナル配
列を、細胞外への放出を改良する異種シグナル配列で置
換することができる。

【００５７】したがって、例えば、β−グルクロニダー
ゼのシグナル配列（ＤＮＡ位置＜２７〜９３；Oshima e
t al., PNAS 84,685(1987)) を免疫グロブリンのための
シグナル配列（ＤＮＡ位置＜６３〜＞１０７；Riechman
n et al., Nature 332,323(1988)) で置換することがで
きる。

【００５８】さらに、点突然変異のために、リソソーム
の中に少ない程度に貯蔵された、そしてより大きい程度
に分泌される酵素のＤＮＡを選択することができる。

【００５９】１．３． 複数の抗腫瘍または抗炎症物質
の組み合わせ 本発明は、さらに、複数の同一の抗腫瘍または抗炎症物
質（Ａ、Ａ）または異なる抗腫瘍物質（Ａ，Ｂ）のＤＮ
Ａ配列の組み合わせが存在する核酸構築物に関する。２
つのＤＮＡ配列の発現のために、好ましくは内部リボソ
ームのエントリー部位（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡを調節要
素として挿入する（図９参照）。

【００６０】この型のＩＲＥＳは、例えば、Mountford
& Smith,TIG 11,179(1995),Kaufmann et al., Nucl.Aci
ds Res.19,4485(1991),Morgan et al., Nucl.Acids Re
s.20,1293(1992,Dirks et al., Gene 128,247(1993),Pe
lletier & Sonenberg,Nature334,320(1988) および Su
gitomo et al., Bio Techn.12,694(1994) に記載されて
いる。

【００６１】したがって、ポリオウイルスのＩＲＥＳの
ｃＤＮＡ（５’ＵＴＲの位置＜１４０〜＞６３０；Pell
etier & Sonenberg,Nature 334,320(1988)) を使用し
て、抗炎症物質ＡのＤＮＡ（３’末端において）および
抗炎症物質ＢのＤＮＡ（５’末端において）を結合する
ことができる。

【００６２】この型の活性物質は、組み合わせに依存し
て、本発明の目的に対して加法的（Ａ＋Ａ、Ａ＋Ｂ１）
または相乗的作用を有する。

【００６３】２） 血液細胞の欠陥産生を改善するため
の活性物質 ２．１．） 造血細胞のためのアクチベーター配列の選
択 本発明の目的のために好ましくは使用されるアクチベー
ター配列は、遺伝子調節配列であるか、または造血細胞
において特に強くまたは選択的に発現されるタンパク質
をコードする遺伝子の要素である。この型の遺伝子調節
配列はサイトカインまたはそのレセプターの遺伝子のた
めのプロモーター配列を包含し、未熟造血細胞（または
隣接する細胞、例えば、ストロマ）におけるその発現は
引き続くサイトカインに先行し、前記サイトカインは造
血細胞に作用し、そして活性物質として要求される。未
熟造血細胞に作用するこの型のサイトカインは、例え
ば、下記の通りである： − 幹細胞因子 − ＩＬ−１ − ＩＬ−３ − ＩＬ−６ ＧＭ−ＣＳＦ

【００６４】２．２．） 造血細胞の活性物質について
の構造遺伝子の選択 本発明の目的のための活性物質は、その発現されたタン
パク質が血液細胞の増殖および／または分化を行うＤＮ
Ａ配列を意味する。

【００６５】３） 自己免疫疾患、アレルギー、炎症を
治療し、そして器官の拒絶を防止するための活性物質 ３．１．） 自己免疫疾患のためのアクチベーター配列
の選択 使用すべきアクチベーター配列は、マクロファージおよ
び／またはリンパ球における免疫応答の間に広範に産生
されるタンパク質の遺伝子のプロモーター配列である。 − ＩＬ−１ − ＩＬ−１−β − ＩＬ−１レセプター − ＩＬ−２ − ＩＬ−２レセプター − ＩＬ−３ − ＩＬ−３レセプター − ＩＦＮ−γ − ＩＬ−４ − ＩＬ−４レセプター − ＩＬ−５ − ＩＬ−６ − ＬＩＦ − ＩＬ−７ − ＩＬ−１０ − ＩＬ−１１ − ＩＬ−１２ − ＩＬ−１３ − ＧＭ−ＣＳＦ − ＧＭ−ＣＳＦレセプター − インテグリンβ２タンパク質

【００６６】３．２．） 自己免疫疾患のための活性物
質の遺伝子の選択 本発明の目的のための活性物質は、サイトカイン、ケモ
カイン、それらのインヒビターの１つの成長因子、抗
体、抗体断片、酵素のインヒビターまたは酵素のための
ＤＮＡ配列である。活性物質の選択は、治療すべき基本
的疾患および選択したプロモーター配列に依存する。

【００６７】４） 関節炎の治療のための活性物質 ４．１．） 関節炎に関するアクチベーター配列の選択 アクチベーター配列は、それを使用して転写因子が形成
されるか、または滑膜細胞および炎症細胞において活性
的に相互作用するヌクレオチド配列（プロモーターまた
はエンハンサーの配列）を意味する。本発明の目的に対
して、好ましいプロモーター配列は遺伝子調節配列、お
よび滑膜細胞および炎症細胞において特に発現されるタ
ンパク質をコードする遺伝子からの要素を包含する。

【００６８】４．２．） 関節炎に関する活性物質の構
造遺伝子の選択 本発明の目的のための活性物質は、その発現されたタン
パク質が、例えば、関節における、炎症を直接または間
接的に阻害し、および／または関節における細胞外マト
リックス（軟骨、接続組織）の再構成を促進するＤＮＡ
配列を意味する。

【００６９】５） 抗病原性活性物質の製造 活性物質は、２つの基本的に異なる形態で製造すること
ができる − ウイルス感染および寄生体などによる侵入の治療 − ウイルス、細菌または寄生体のための感染症の予防 感染症の予防のためにワクチンが使用される。しかしな
がら、慣用の手段により有効なワクチンを製造する可能
性は制限された(Brown,Int.J.Technol.Assessm.Health
Care 10,161(1994),Ellis,Adv.Exp.Med.Biol.327,263(1
992),Arnon etal., FASEB J.6,3265(1992))。

【００７０】これはＤＮＡワクチンの技術が開発されて
きている理由である。しかしながら、これらのＤＮＡワ
クチンは安全性および副作用についての問題を発生させ
る(Fynan et al., Int.J.Immunopharm.17,79(1995),Don
nelly et al., Immunol.2,20(1994)) 。

【００７１】本発明の目的のための感染症の予防のため
の活性物質は、それらの細胞特異性および細胞周期調節
のために、高度の安全性により区別される。

【００７２】５．１．） アクチベーター配列の選択 ａ） 感染症の治療について 選択すべきアクチベーター配列は、特に細菌または寄生
体により感染により変更される活性を有する細胞の遺伝
子由来のプロモーター配列を含んでなるか、または選択
すべきプロモーター配列はウイルスにより感染した細胞
を形質転換し、増殖を刺激するウイルス由来のプロモー
ター配列である。

【００７３】これらのウイルスは、例えば、ＨＢＶ、Ｈ
ＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶまたはＨＴＬＶ
を包含する。

【００７４】５．２．） 活性物質のための構造遺伝子
の選択 ａ） 感染症の治療について 選択すべき活性物質は、細胞増殖抑制、細胞障害性、抗
細菌または抗ウイルスの作用を有するタンパク質のＤＮ
Ａである。細胞障害性または細胞増殖抑制タンパク質の
例は、既に上記において列挙された。抗細菌または抗ウ
イルスタンパク質の例として、抗体または抗体断片を述
べることができる。ある酵素を選択するとき、この酵素
により切断することができる前駆体抗細菌、すなわち、
抗ウイルス、細胞障害性または抗寄生体物質の前駆体を
引き続いて投与することができる。

【００７５】本発明の目的のための抗ウイルスタンパク
質についての活性物質は、さらに、抗ウイルス活性を有
するサイトカインおよび成長因子である。これらは、例
えば、下記の活性物質のためのＤＮＡ配列を包含する： − ＩＦＮ−α − ＩＦＮ−β − ＩＦＮ−γ − ＴＮＦ−β − ＴＮＦ−α − ＩＬ−１ − ＴＧＦ−β

【００７６】しかしながら、また、本発明の目的のため
の活性物質として、一方において列挙したサイトカイ
ン、成長因子またはレセプターの細胞外部分、および他
方においてヒト免疫グロブリンのＦｃ部分から構成され
た融合タンパク質のＤＮＡ配列を使用することができ
る。この型のＤＮＡ配列およびそれらの製造は、例え
ば、欧州特許（ＥＰ）第０４６４ ６３３Ａ１号に記載
されている。

【００７７】ｂ） 感染症の予防について 選択すべき活性物質は、病原体に対して特異的な抗体ま
たは抗体断片のＤＮＡであるか、または免疫応答を介し
て、すなわち、抗体結合および／または細胞障害性Ｔリ
ンパ球により、病原体の中和および／または殺傷に導
く、病原体により形成されたタンパク質のＤＮＡであ
る。この型の中和抗原は、既に免疫化抗原として使用さ
れている（下記の概観を参照のこと：Ellis,Adv.Exp.Me
d.Biol.327,263(1992)) 。

【００７８】６） 白血病および腫瘍の治療のための活
性物質 ６．１．） 白血病および腫瘍のための活性物質の選択 提供されるアクチベーター配列は、それを使用して転写
因子が形成されるか、または白血病細胞または腫瘍細胞
において作用的に相互作用するヌクレオチド配列（プロ
モーターまたはエンハンサーの配列）である。

【００７９】しかしながら、本発明の目的に対して、好
ましいアクチベーター配列は遺伝子調節配列、および特
に腫瘍細胞または白血病細胞において形成されるタンパ
ク質をコードする遺伝子からの要素を包含する。

【００８０】６．２．） 白血病および腫瘍細胞のため
の活性物質の構造遺伝子の選択 本発明の目的のための活性物質は、その発現されたタン
パク質が細胞の増殖、特にまた腫瘍細胞または白血病細
胞の増殖を阻害するＤＮＡ配列を意味する。これらの細
胞周期インヒビターは、例えば、既に記載した阻害細胞
増殖抑制および細胞障害性タンパク質および酵素のため
のＤＮＡ配列を包含する。これらは既に記載した。

【００８１】細胞周期インヒビターは、さらに、白血病
または腫瘍に対する細胞増殖抑制または細胞障害性作用
を、直接または間接的に、有するタンパク質を発現する
ＤＮＡ配列を意味する。

【００８２】７） 血管閉鎖における平滑筋細胞の増殖
を阻害する活性物質 ７．１．） 平滑筋細胞のためのアクチベーター配列の
選択 本発明の目的のために好ましく使用されるアクチベータ
ー配列は、遺伝子調節配列、および特に平滑筋細胞にお
いて形成されるタンパク質をコードする遺伝子からの要
素を包含する。

【００８３】７．２．） 平滑筋細胞のための活性物質
の構造遺伝子の選択 本発明の目的のための活性物質は、その発現されたタン
パク質が平滑筋細胞の増殖を阻害するＤＮＡ配列を意味
する。増殖のこれらのインヒビターは既に述べた。

【００８４】しかしながら、活性物質は、また、細胞増
殖抑制物質の不活性前駆体を細胞増殖抑制に変換する酵
素のためのＤＮＡ配列を意味する。

【００８５】８） 凝固を阻害または活性化する活性物
質 ８．１．） 凝固を阻害または活性化するアクチベータ
ー配列の選択 本発明の目的のために使用されるアクチベーター配列
は、好ましくは遺伝子調節配列、または平滑筋細胞、活
性化された内皮細胞、活性化されたマクロファージまた
は活性化されたリンパ球において検出可能であるタンパ
ク質をコードする遺伝子の要素を包含する。

【００８６】ａ） 平滑筋細胞 平滑筋細胞における遺伝子のためのプロモーター配列の
例は、既に述べた。

【００８７】ｂ） 活性化された内皮細胞 特に活性化された内皮細胞において形成されるタンパク
質の例は、Burrows etal.,(Pharmac.Therp.64,155(199
4)) に記載されている。内皮細胞の中に広範に見出され
るこれらのタンパク質は、特に、例えば、それらの遺伝
子のプロモーター配列と一緒に上記において列挙したタ
ンパク質を包含する。

【００８８】ｃ） 活性されたマクロファージおよび／
または活性化されたリンパ球 本発明の目的のためのアクチベーター配列は、さらに、
マクロファージおよび／またはリンパ球において免疫応
答の間に広範に形成されるタンパク質をコードする遺伝
子のプロモーター配列を意味する。

【００８９】８．２．） 凝固を阻害または活性化する
活性物質の構造遺伝子の選択 本発明の目的のために使用すべき活性物質は、血小板の
凝集または凝固因子を、直接または間接的に、阻害する
か、または繊維素溶解を刺激するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列である。

【００９０】この型の活性物質は抗凝固因子と呼ばれ
る。使用すべき抗凝固因子は、例えば、プラスミノゲン
アクチベーター（ＰＡ）、例えば、組織ＰＡ（ｔＰＡ）
またはウロキナーゼ様ＰＡ（ｕＰＡ）またはプロテイン
Ｃ、抗トロンビンＩＩＩ、Ｃ−１Ｓインヒビター、μ１
抗トリプシン、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）
またはヒルジンのための遺伝子である。

【００９１】しかしながら、本発明の目的のために使用
すべき活性物質は、また、血液凝固を促進するタンパク
質をコードするＤＮＡ配列である。このようなタンパク
質の例は、プラスミドタンパク質、例えば、因子ＶＩＩ
Ｉまたは因子ＩＸである。

【００９２】９） ＣＮＳ損傷から保護する活性物質 ９．１） ＣＮＳ損傷から保護する活性物質のためのア
クチベーター配列 ９．１．ａ） 内皮細胞において活性化されたアクチベ
ーター配列 これらは特に内皮細胞に対して特異的なタンパク質の遺
伝子のためのプロモーター配列を包含する。

【００９３】９．１．ｂ） グリア細胞において活性化
されたアクチベーター配列 好ましいアクチベーター配列は、さらに、グリア細胞に
おいて形成されるか、または特定の程度に活性である転
写因子が相互作用するヌクレオチド配列（プロモーター
またはエンハンサーの配列）を意味する。

【００９４】９．２） 神経特異的因子のための構造遺
伝子の選択 本発明の目的のための神経特異的因子は、神経成長因子
をコードするＤＮＡ配列を意味する。

【００９５】下記の実施例により、本発明を詳細に説明
する。

【００９６】

【実施例】実施例１ 生化学的研究 電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）およびメチ
ル化保護フットプリント法により、Ｂ−ｍｙｂプロモー
ターのヌクレオチド配列ＣＴＴＧＣＧＧＧＡＧとＥ２Ｆ
複合体との間の相互作用を研究した。

【００９７】Barberis et al., Cell 50、347(1987)に記
載されているようにして、ＥＭＳＡを実施した。

【００９８】この目的のため、下記のＧＳＴ融合タンパ
ク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、アフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製した： − Ｅ２Ｆ１、アミノ酸８７−１３９８(Heilin et a
l., Cell 70,337(1992)およびKaelin et al., Genes De
v.8,2665(1994)) − Ｅ２Ｆ４、全タンパク質(Beijersbergen et al., G
enes Dev.8,2680(1994)およびGinsberget al., Genes D
ev.8,2665(1994)) − ｐＲｂ、アミノ酸３００−９２８(Bernard et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6474(1989)) − ｐ１０７、アミノ酸７４４−２４６０(Ewen et a
l., Cell66,1155(1991))。

【００９９】５０ｍＭのｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．
０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖのグリセロー
ル、０．２ｍＭのＥＤＴＡおよび６７μｇのポリ［ｄＡ
／ｄＴ］／μｌを含有する１５μｌの緩衝液中で２２℃
において約０．５ｐｍｏｌの³²Ｐ標識化プローブと、精
製したタンパク質（約１００ｎｇ）を３０分間インキュ
ベートした。５’突起末端に４〜７塩基を挿入すること
によって、プローブを標識化した。０．５×ＴＢＥ中の
４％非変性ポリアクリルアミドゲル中で４℃、１０Ｖ／
ｃｍにおいて、試料を分画した。ゲルをＸ線感受性フィ
ルムに露出し、モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）リン画像形成装置によ
り定量的に分析した。

【０１００】下記のプローブを使用した。 − Ｂ−ｍｙｂ［Lam et al., EMBO J.12,2705(199
3)］：５’−ＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧ
ＧＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＧＴＧ（配
列番号：６）（Ｅ２Ｆ結合部位には下線が引かれてい
る） − 突然変異したＢ−ｍｙｂ：５’−ＧＧＣＧＣＣＧＡ
ＣＧＣＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＴ
ＧＧＴＴＣＴＧＴＧ（配列番号：７） − Ｅ２ａアデノウイルスのプロモーター：５’−ｇａ
ｔｃＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＣＴＡｃ
ｔａｇ（配列番号：８）（小文字は充填標識試薬のため
に使用した無関係の配列を表す） − 対照プローブ ５’−ＧＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧ
（配列番号：９）

【０１０１】メチル化保護フットプリント法は下記のよ
うにして実施した。

【０１０２】Ｂ−ｍｙｂをコードするオリゴヌクレオチ
ド配列を末端において４〜７オーバーハング塩基を使用
して標識化し、精製し、非コーディング鎖と組み合わせ
た。結合反応はＥＭＳＡについて既に記載したように実
施した。２μｌの２％ジメチルサルフェート（ＤＭＳ）
を添加し、３分後に２μｌの６０ｍＭのβ−メルカプト
エタノールの添加によりメチル化反応を停止させた。試
料を４％ゲル中で分画し、イオン交換紙に移した。バン
ドを切出し、ＴＥ緩衝液中で洗浄し、６５℃において
１．５ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ緩衝液で溶離した。
溶離されたＤＮＡをクロロホルムで抽出し、沈降させ、
水中に溶解した。適用点に残留するバンド（試料を含有
しない）および移動したバンド（複合体）の等しい反応
性を有する量を、１０％のピペリジンで９５℃において
３０分間切断した。ＤＮＡを沈降させ、１５％の変性ア
クリルアミドゲル上にロードした。

【０１０３】図１に示すように、Ｅ２Ｆ１−ＤＰ１、Ｅ
２Ｆ１−ＤＰ１−ｐＲｂ、Ｅ２Ｆ４−ＤＰ１およびＥ２
Ｆ４−ＤＰ１−ｐ１０７は、高いアフィニティーのＥ２
ａアデノウイルスのプロモーター結合部位に匹敵する強
さおよびこれと同様なアフィニティーで、Ｂ−ｍｙｂプ
ロモーターのＥ２Ｆ結合部位に結合する(Mudryj et a
l., EMBO J.9、2179(1990))。

【０１０４】Ｂ−ｍｙｂプロモーターのＥ２Ｆ結合部位
へのＥ２Ｆ複合体の結合の評価を、ＥＭＳＡゲル上で、
結合した試料の量を決定するリン画像形成装置により実
施した。下記の結果が得られた（結合した比率）。

【０１０５】− Ｅ２ａプロモーターＥ２Ｆ結合部位：
１０％（Ｅ２Ｆ１−ＤＰ１）または０．８％（Ｅ２Ｆ４
−ＤＰ１） − Ｂ−ｍｙｂ：０．７％（Ｅ２Ｆ１−ＤＰ１）または
２．０％（Ｅ２Ｆ１−ＤＰ１または２．０％（Ｅ２Ｆ４
−ＤＰ１） − 突然変異したＢ−ｍｙｂ：＜０．０１％ − ネガティブコントロール試料：＜０．００２％

【０１０６】Ｅ２Ｆ４複合体をジメチルサルフェート
（ＤＭＳ）保護フットプリント分析のための選択した。
その理由は、ｐ１０７タンパク質は結合構造物と反応す
るＥ２Ｆ複合体において必須の結合タンパク質と見なさ
れ(Lam et al., EMBO J.13,871(1994)) そしてＥ２Ｆ４
はｐ１０７と反応するＥ２Ｆファミリーの唯一の既知の
メンバーだからである(Beijersbergen et al., Genes D
ev.8,2680(1994) およびGinsberg et al., Genes Dev.
8,2665(1994))。

【０１０７】図２に示すように、ヌクレオチドはＥ２Ｆ
結合部位の領域において保護された（ＣＴＴＧＧＣＧＧ
ＧＡＧ、保護されたグアニンには下線が引かれており、
３’末端に位置する２つのグアニンはＥ２Ｆコア結合部
位の下流において部分的にのみ保護されている）。さら
に、これらの結果により示されるように、Ｅ２Ｆ４−Ｄ
Ｐ１（「Ｅ２Ｆを含有しない」）およびＥ２Ｆ４−ＤＰ
１−ｐ１０７を使用して得られたフットプリントの間で
検出可能な差は存在しなかった。この観察により明らか
に示されるように、Ｅ２Ｆ複合体はｐ１０７タンパク質
に対して独立にＤＮＡに結合し、そしてこのＤＮＡの結
合はメチル化保護フットプリント法により検出すること
ができる。これはＥ２Ｆ４−ＤＰ１およびＥ２Ｆ４−Ｄ
Ｐ１−ｐ１０７複合体についての会合および解離の速度
が非常に類似するという発見と一致する。

【０１０８】実施例２ 細胞についての試験 生化学的にばかりでなく、かつまた生きている細胞にお
いてＢ−ｍｙｂプロモーターへのＥ２Ｆの結合を検出す
るために、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞をＧ０において血清
の除去により同期化し、引き続いて１０％ＦＣＳで刺激
した。刺激後の種々の時間において、細胞周期の進行
（ＤＮＡ含量）、Ｂ−ｍｙｂのｍＲＮＡの発現およびＥ
２Ｆ結合部位へのＥ２Ｆ複合体の結合（メチル化からの
保護）についてインビボ試験を実施した。図３に示され
るように、休止細胞の刺激は約１２時間後にＳ期の開始
に導く。

【０１０９】Lam et al., EMBO J.12、2705(1993)に既に
示されているように、Ｂ−ｍｙｂのｍＲＮＡの発現は刺
激後８時間（すなわち、後期Ｇ１期）に増加し、約１２
時間後、すなわち、Ｓ期の開始時において最大になる。

【０１１０】細胞におけるＥ２Ｆ結合部位の役割を分析
するために、Lucibelloet al., EMBO J.14,132(1995)お
よびPfeifer et al., Science 246,810(1989) に記載さ
れているように、ゲノムＤＭＳフットプリント法を実施
した。

【０１１１】下記のプライマーをこの目的に使用した。 １． プライマー：５’−ＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣ
ＴＧＣＴ（配列番号：１０） ２． プライマー：５’−ＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＧＧ
ＧＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号：１１） ３． プライマー：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴ
ＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ（配列番号：１２）

【０１１２】ゲノムのフットプリント法によりＧ０細胞
の分析（図５）において、Ｅ２Ｆ結合部位の明確な占有
が示され、コア要素および２つのグアニンの双方は直ぐ
下流に位置した。したがって、位置−２０９、−２０
８、−２０６、−２０５、−２０４および−２０２にお
ける６つのグアニン（ＡＴＧ開始コドンに関して(Lam e
t al., EMBO J.12、2705(1993))は、明瞭に保護された
が、最後の２つはわずかに部分的保護を示した。メチル
化に対するこの保護は純粋に生化学的研究におけるもの
に類似し、これにより細胞内保護を提供するタンパク質
複合体は事実Ｅ２Ｆであることが示唆される。

【０１１３】Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ５、ＤＰ２お
よびＤＰ３を含有する複合体を使用して、同様な結果が
得られた。期待されるように、点突然変異をＥ２Ｆ結合
部位の中に挿入したとき、結合は見出されなかった（Ｃ
ＴＴＧＧＣＧＧ→ＣＴＴＧＧＣＴＧ）。

【０１１４】血清刺激された細胞の分析において、４時
間後にＥ２Ｆ結合配列の同様な保護が示された。しかし
ながら、この保護は８時間後にかなり減少し、後の時間
において有意な保護は観察されなかった。この保護の減
少は、Ｂ−ｍｙｂ転写と同時に起こった。例えば、メチ
ル化からのＥ２Ｆ結合配列の細胞周期調節保護と対照的
に、位置−２２３におけるグアニンは細胞周期を通じて
未変化の超メチル化を示した。

【０１１５】これらの結果により示されるように、Ｅ２
Ｆ複合体（これは事実後期Ｇ１およびＳ期における細胞
抽出物の分析において、例えば、遊離Ｅ２ＦおよびＥ２
Ｆ複合体として、見出される）は、生きている細胞、す
なわち、in situ 、においてＥ２Ｆ結合配列に結合しな
い。

【０１１６】さらに、転写が増加するとき、Ｅ２Ｆ結合
配列がＥ２Ｆに占有されないので、Ｅ２Ｆ結合配列への
Ｅ２Ｆの結合はＢ−ｍｙｂ遺伝子の転写の活性化におい
て重要な役割を演じないことが、これらの結果により証
明される。反対に、例えば、細胞周期の間のＢ−ｍｙｂ
の発現の調節に対するＥ２Ｆの作用の主要なメカニズム
は、Ｇ０およびＧ１期における発現の阻害である。

【０１１７】ＣＤＣ２５Ｃ、サイクリンＡおよびＣＤＣ
２遺伝子の近傍プロモーター配列をＢ−ｍｙｂのプロモ
ーターと比較すると、ＣＤＥおよびＥ２Ｆ結合部位の間
ばかりでなく、かつまたＣＨＲの領域において明確な類
似性が示される（図６）。ＨｅＬａ細胞からの核抽出物
を使用するＥＭＳＡによるインビトロ結合実験におい
て、事実、Ｂ−ｍｙｂのＣＨＲは１種または２種以上の
核タンパク質により認識されることが示される。これら
の発見に基づいて、Ｂ−ｍｙｂプロモーター(Lamet a
l., EMBO J.12,2706(1993))がルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子（ｐ×Ｐ２ベクター、Nordeen,Bio Techniques
6,454,(1988))にカップリングされている構築物が調製
された。この構築物は、Lam et al.(1993)に記載されて
いるように休止細胞（増殖している細胞に比較して）に
おいてほぼ１５倍の抑制を示した。この抑制はＣＨＲの
突然変異（ＴＡＧＧＡＡＡＧ→ＴＡＧＧＣＣＴＧ）によ
り事実上完全に破壊された（約２倍の抑制）。それ以上
の実験において、ＣＤＣ２５Ｃプロモーターがルシフェ
ラーゼリポーター遺伝子にカップリングされている構築
物が調製された。さらに、この構築物において、ＣＤＣ
２５Ｃ遺伝子のＣＨＲ要素はＢ−ｍｙｂ遺伝子のＣＨＲ
要素により置換された（図７）。このキメラ構築物はも
はや細胞周期調節されなかった。Ｂ−ｍｙｂ ＣＨＲお
よびＣＤＣ２５Ｃ遺伝子のＣＨＲは機能的に同等でない
ことが、これらのデータにより明らか証明される。

【０１１８】したがって、Ｅ２ＦおよびＣＨＦファミリ
ーの転写因子が結合するヌクレオチド配列、例えば、ヌ
クレオチド配列ＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡ
ＡＧＴは、新規なプロモーターモジュールと考えられ
る。これはＥ２ＦおよびＣＨＦ複合体の結合によりＧ０
およびＧ１期において下流に位置する遺伝子の転写を阻
害する。

【０１１９】実験の結果は添付図面において詳細に説明
されている。

【０１２０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．９ 配列 CTTGGCGGG 9

【０１２１】配列番号：２ 配列の長さ：９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．９ 配列 TTTCGCGCC 9

【０１２２】配列番号：３ 配列の長さ：９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．９ 配列 TTTCGCGGC 9

【０１２３】配列番号：４ 配列の長さ：７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．７ 配列 TAGGAAA 7

【０１２４】配列番号：５ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２１ 配列 CTTGGCGGGA GATAGGAAAG T 21

【０１２５】配列番号：６ 配列の長さ：４２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．４２ 配列 GGCGCCGACG CACTTGGCGG GAGATAGGAA AGTGGTTCTG TG 42

【０１２６】配列番号：７ 配列の長さ：４２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．４２ 配列 GGCGCCGACG CACTTGGCTG GAGATAGGAA AGTGGTTCTG TG 42

【０１２７】配列番号：８ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．３０ 配列 GATCGACTAG TTTCGCGCCC TTTCTACTAG 30

【０１２８】配列番号：９ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２１ 配列 GATCCTCTCA CCTGCTGCTA G 21

【０１２９】配列番号：１０ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．１７ 配列 TCAGGACTCA GGCTGCT 17

【０１３０】配列番号：１１ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２１ 配列 CGAGCCGCTC CGGGCCCCAG G 21

【０１３１】配列番号：１２ 配列の長さ：２４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２４ 配列 GGCCCCAGGC GGTGCTCTCA GGCG 24

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｂ−ｍｙｂ Ｅ２Ｆ結合部位と種々のＥ２Ｆ−
ＤＰ１およびＥ２Ｆ−ＤＰ１−ｐ１０７複合体との相互
作用を示した図である。複合体を組換えＧＳＴ融合タン
パク質として調製し、合成オリゴヌクレオチドによりＥ
ＭＳＡ(Barberis etal.,Cell 50,347(1987))により分析
し、前記合成オリゴヌクレオチドはＢ−ｍｙｂＥ２Ｆ結
合部位(Lam et al., EMBO J.12,2075(1993))またはＥ２
ａアデノウイルスのプロモーターのＥ２Ｆ結合部位(Mud
ryj et al., EMBO J.9,2179(1990))を含有した。Ｅ２Ｆ
１およびＥ２Ｆ４複合体の間に見られる強度の差は、Ｅ
２Ｆタンパク質調製物の変動を反映するが、結合アフィ
ニティーの差をそれほど反映しない。

【図２】Ｅ２Ｆ２−ＤＰ１およびＥ２Ｆ４−ＤＰ１−ｐ
１０７複合体のメチル化保護のフットプリントを示した
図である。メチル化された複合体をＥＭＳＡにより分離
し（図１参照）、保護されたグアニンを分析した。黒
丸：完全な保護；半円が黒色の丸：部分的保護。

【図３】血清の除去によりＧ０において同期化され、１
０％ＦＣＳで刺激されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞周期分
析を示した図である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８
で染色してＤＮＡを検出し、ＦＡＣＳ(Lucibello et a
l., EMBO J.14,132(1995)) により分析した。分析は、
同一の細胞集団を使用して実施された。

【図４】ＲＴ−ＰＣＲにより測定した、細胞周期の間の
Ｂ−ｍｙｂのｍＲＮＡ発現を示した図である。ＲＮＡの
単離およびＲＴ−ＰＣＲは、Lucibello et al., EMBO
J.14,132(1995))に記載されているように実施した。位
置＋１６３０から＋２２２８までのＢ−ｍｙｂ ｃＤＮ
Ａの領域を下記のプライマーを使用して増幅した：５’
−ＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＡＴＣお
よび５’−ＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴ。
ＧＰＤＨを対照として使用した分析は、同一の細胞集団
を使用して実施された。。

【図５】種々の細胞周期の進行段階におけるＢ−ｍｙｂ
コアプロモーター領域のゲノムＤＭＳフットプリント(L
ucibello et al., EMBO J.14,132(1995)およびPfeiffer
et al., Science 256,810(1989)) の結果を示した図で
ある。Ｅ２Ｆ結合部位および潜在的Ｓｐ１結合部位に印
が付されている。分析は、同一の細胞集団を使用して実
施された。黒丸：顕著な保護（＞８０％、リン画像形成
分析）；半円が黒色の：部分的保護（約５０％）。

【図６】ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、ｃｄｃ２および
Ｂ−ｍｙｂ遺伝子の近傍プロモーター配列の比較を示し
た図である。位置のデータは文献(Zwicker et al., EMB
O J.14,132(1995)) から取り、各場合において主要な出
発点と関係する(B-myb,Lam et al., EMBO J.12,2705(19
93))。

【図７】休止（Ｇ０）および成長するＮＩＨ３Ｔ３細胞
におけるｃｄｃ２５Ｃ−プロモーター−ルシフェラーゼ
反復構築物の分析結果を示した図である。野生型Ｃ２９
０構築物（図面の上部、Zwicker et al., 1995) をＣＨ
Ｒ（図面の下部、下線が引かれている塩基）において突
然変異させてＢ−ｍｙｂＣＨＲを産生させた。分析はLu
cibello et al., EMBO J.14,132(1995) およびZwicker,
EMBO J.14,4514(1995)に記載されているようにして実施
した。

【図８】本発明による核酸構築物の配置を示した図であ
る。

【図９】本発明による核酸構築物の配置を示した図であ
る。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の成分： ａ） アクチベーター配列、 ｂ） Ｅ２Ｆファミリーの少なくとも１種のタンパク質
   と結合するヌクレオチド配列を有し、かつＣＨＦファミ
   リーの少なくとも１種のタンパク質と結合する他のヌク
   レオチド配列を有するプロモーターモジュール、および ｃ） 細胞周期に依存して発現される活性物質をコード
   する遺伝子、 を含む、少なくとも１種の遺伝子の細胞周期調節発現の
   ための核酸構築物。
2. 【請求項２】プロモーターモジュール（ｂ）において、
   Ｅ２Ｆファミリーの少なくとも１種のタンパク質に結合
   するヌクレオチド配列がヌクレオチド配列ＣＴＴＧＧＣ
   ＧＧＧ、ＴＴＴＣＧＣＧＣＣまたはＴＴＴＣＧＣＧＧＣ
   から選択される少なくとも１種の配列を含む、請求項１
   に記載の核酸構築物。
3. 【請求項３】プロモーターモジュール（ｂ）において、
   ＣＨＦファミリーの少なくとも１種のタンパク質に結合
   するヌクレオチド配列がヌクレオチド配列ＴＡＧＧＡＡ
   Ａを含有する少なくとも１種の配列を含む、請求項１に
   記載の核酸構築物。
4. 【請求項４】ＣＨＦに結合するヌクレオチド配列がＥ２
   Ｆの結合のためのヌクレオチド配列の下流に位置し、か
   つヌクレオチド配列ＡＧＡが２つの（ＣＴＴＧＧＣＧＧ
   ＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡＡ）の間に位置する、請求項２ま
   たは３に記載の核酸構築物。
5. 【請求項５】プロモーターモジュール（ｂ）が上流に位
   置するアクチベーター配列（ａ）と相互作用することが
   でき、かつ下流に位置する遺伝子（ｃ）の発現に影響を
   与えることができる、特に、阻害することができる、請
   求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
6. 【請求項６】アクチベーター配列が細胞特異的である、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
7. 【請求項７】アクチベーター配列がウイルス特異的であ
   る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
8. 【請求項８】核酸がＤＮＡである、請求項１〜７のいず
   れか一項に記載の核酸構築物。
9. 【請求項９】核酸構築物がベクターである、請求項１〜
   ８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
10. 【請求項１０】プラスミドベクターである、請求項９に
    記載の核酸構築物。
11. 【請求項１１】ウイルスベクターである、請求項９に記
    載の核酸構築物。
12. 【請求項１２】遺伝子（ｃ）がサイトカイン、成長因
    子、サイトカインまたは成長因子のレセプター、抗増殖
    または細胞増殖抑制作用を有するタンパク質、抗体、抗
    体断片、血管形成インヒビター、凝固因子および抗凝固
    物質から成る群より選択される活性物質をコードする遺
    伝子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核
    酸構築物。
13. 【請求項１３】遺伝子（ｃ）が内皮細胞、平滑筋細胞、
    マクロファージ、リンパ球、白血病細胞、腫瘍細胞およ
    びグリア細胞において活性化されたプロモーターからな
    る群から選択されるか、またはウイルスＨＢＶ、ＨＣ
    Ｖ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶの
    プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１
    〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
14. 【請求項１４】遺伝子（ｃ）が薬剤の前駆体を切断して
    薬剤を生成する酵素をコードする遺伝子である、請求項
    １〜１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
15. 【請求項１５】請求項１〜１４のいずれか一項に記載の
    核酸構築物を含む単離された細胞。
16. 【請求項１６】標的細胞の増殖に関連する疾患の治療用
    薬剤の製造における請求項１〜１４のいずれか一項に記
    載の核酸構築物または請求項１５に記載の細胞の使用で
    あって、前記薬剤の製造が標的細胞の中への核酸構築物
    の導入を含む使用。
17. 【請求項１７】過度の細胞増殖に関連する疾患が腫瘍症
    (oncosis) である、請求項１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】薬物の製造が、請求項１〜１４のいずれ
    か一項に記載の核酸構築物を、標的細胞の中への核酸構
    築物の導入を含む形態に変換することを含んでなる、請
    求項１６または１７に記載の使用。