JPH06509708A - ヒトの治療のための組換え抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの治療のための組換え抗体 本発明は、ニューマンら（Ｎｅｗｍａｎ）の米国特許出願第０７／７３５．０６ ４号（１９９１年７月２５日出願）の一部継続出願である米国特許出願第０７／ ８５６゜２８１号（１９９２年３月２３日出願）の一部継続出願である。これら の出願の全体は図面も含めて引用によって本明細書に包含される。本発明はヒト の治療に有用な組換え抗体、およびそのような抗体の製造方法に関する。

発明の背景 ネズミモノクローナル抗体はヒトの疾患の診断、および生物学的な基礎研究の課 題の解決に用いられている。これらの試薬はまた、白血病、リンパ腫、固形癌（ 例えば大腸癌、乳癌、肝臓癌）、ＡＩＤＳおよび自己免疫疾患などのヒトの急性 および慢性両方の疾患の治療剤として臨床試行にも用いられている。

マウス／ヒトキメラ抗体が創製され、それは親マウス抗体の結合特性を示し、ヒ ト定常領域に関連したエフェクター機能を有することが示された。例えば、キャ ビンーら（Ｃａｂｉｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、　）の米国特許第４．８１６．５６７ 号、ンユーメーカーら（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）の米国特許第４ ．９７８．７４５号、ビー／く−ズら（Ｂｅａｖｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、）の米 国特許第４．９７５，３６９号およびボスら（Ｂｏｓｓ、　ｅｔ　ａｌ。

）の米国特許第４．８１６．３９７号参照；これらのすべてを引用して本明細書 に組み込む）。一般に、これらのキメラ抗体は既存のネズミハイブリドーマから 抽出されたＤＮＡからゲノム遺伝子ライブラリーを調製することにより構築され る　［ニンニクら（Ｎｉｓｈｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　９９９．　１９８７］　ｏ次０で、適正な抗体フラグメント転位 パターンを示している重鎮および軽鎖の両方に由来する可変領域遺伝子に関して ライブラリーをスクリーニングする。次いで、クローン化した可変領域遺伝子を 、クローンした、適当な重鎮または軽鎖ヒト定常領域遺伝子カセットを含有する 発現ベクターに連結（結合　１ｉｇａｔｅ）する。次いで、キメラ遺伝子を選択 した細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）、通常、文ズミ骨髄腫細胞内で発現させる。

そのようなキメラ抗体はヒト治療に用いられていた。しかしながら、多くの症例 で、ヒト受容者によってこれらキメラ抗体に対する抗体が産生されている。その ようなキメラ抗体に対する抗体は、キメラ抗体を用いる継続的な治療にとって有 害である。

エーリッヒら［Ｅｒ１ｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　３４　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　１６８１．１９８８　；　Ｅｒ１ｉｃｈｅｔ　ａｌ、　、　７　 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　３８５．１９８８　；　Ｅｒ１ｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　 ６１１ｙｂｒｊｄｏｍａ　１５１．P９８７　；お よびＥｒ１ｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１１１ｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｂｙ ｂｒｉｄｏｎ＋ａｓ　２３．１９９０、これらは本願の先行技術でない］は、ヒ トのインビボ治療において、ヒトモノクローナル抗体の方がマウスモノクローナ ル抗体よりも改善が期待できると述べている。彼らはまた、非ヒト霊長類抗体（ 例えば、チンパンジーモノクローナル抗体）は、ヒト抗体と構造上類似している ので、ヒト内で耐容性があるだろうと推測している。ヒト抗体がアカゲザルにお いて非免疫原性（即ち、抗体応答を惹起しない）なので、霊長類抗体はヒトに免 疫原性でないだろうと予測している。彼らは、霊長類抗体が、ヒト免疫グロブリ ンの定常領域構造と同一の定常領域構造を有するか、少なくとも、ヒト免疫グロ ブリンと比較して、異なるヒト抗体相互間での相違よりも少ない構造上の相違を 有するならば、ヒトにおける抗体の試験は不要であると述べている。即ち、彼ら はチンパンジー抗体はヒト治療に有用であろうと示唆している。

発明の概要 本発明は旧世界ザル（Ｏｌｄ　Ｗｏｒｌｄ　Ｍｏｎｋｙ　；例えば、ヒトやマカ ク）の、免疫グロブリン可変領域をコードする遺伝子の抗原結合部分の増幅およ びクローニングの方法、これら遺伝子を、クローンした、ヒト、チンパンジーま たは他のサルの定常領域をコードする遺伝子（および、要すれば、ヒト、チンパ ンジーまたは他のサルのフレームワークをコードする遺伝子）に融合させる方法 、およびそれらをヒト／サル組換え抗体、あるいは完全なサル組換え抗体として 、発現させる方法に関する。さらに、本発明はそのような組換え抗体（この語句 は、２個の異なる抗体遺伝子由来のＤＮＡ　（同じ種由来、例えば、アカゲザル とジノモルゲスザルのように、サル−サル抗体を与える異なるサル抗体遺伝子由 来のＤＮＡも含めて）の融合によって製造される抗体を含む）をヒト疾患の治療 のための免疫療法剤として用いる方法に関する。本発明は、チンパンジーとは異 なり、進化論的に離れたサル（例えば、ヒトまたはマカクサル（ジノモルゲスお よびアカゲザルを含む））は、該サル内でヒト抗原（例えばＣＤ４やＣＤ５４等 の比較的保存されているヒト抗原でさえ）に対する抗体が惹起されるに十分な程 、ヒトと相違するのみならず、ヒト抗体と類似した抗体を有するに十分な程、ヒ トと類似しており、そのようなサル抗体、またはそれから誘導される組換え抗体 がヒトに導入されたとき、宿主抗−抗体免疫応答がない、という発見に基づいて いる。

ヒト治療に用いられていた従来の幾つかの抗体類とは異なり、本発明の抗体には 、例えば以下に例示する幾つかの欠点がない。１）免疫原性、および慢性症状の 治療に必要な繰り返し投与の際のヒト抗−抗体（ＨＡＡ）応答の誘導、２）　ヒ ト抗体に比較して短い半減期、および３）　ヒト細胞または補体とのエフェクタ ー機能の欠如。これらの欠点がないことは本発明方法によって製造される抗体を 用いるヒト治療にとって重要な利点である。例えば、自己免疫疾患等の慢性ヒト 疾密の場合、あるいは抗体を長期間投与する必要のある何らかの疾患の場合、繰 返いテう抗体治療における生たる障害の１つは、治療用抗体に対する宿主の応答 である。ＨＡＡ応答は、あるも者と他の患者の間では予測不可能な場合が多い。

そのような応答は優先的に、排他的にという訳ではないが、抗体分子の定常領域 に対するものであり、それが一度惹起されると、しばしばその抗体または同一の イソタイプの他の抗体による以後の治療の効果が妨げられ、もしくは減少される 。

可能性として、）ＩＡＡの問題は、ヒトモノクローナル抗体の使用によって克服 できる。しかしながらこの方法は、抗体産生のために選択する多くの抗原（例、 ヒト抗原、この語句はヒト内に存在する任意のタンパク質、ポリペプチドの免疫 原性部分、またはその同等物を包含する）によってヒト対象を免疫感作するとい う倫理上、臨床上および免疫学上の限界により妨げられる。この問題を克服する ための本出願人の方法には、適当な特異性と所望のエフェクター機能を持つ抗体 の産生と、組換え抗体の製造におけるその使用が含まれる。これらの組換え抗体 は、一般に免疫化したサルから導かれた抗体の可変領域の適当な部分と、ヒトま たはチンパンジー由来の抗体の定常領域とを含む。即ち、モノクローナル抗体の 特異性および高親和性は維持されており、また、所望のエフェクター機能を示す 適当なヒトまたはチンパンジーの定常領域の選択は容易である。

本発明はまた、重鎮および軽鎖可変領域遺伝子ファミリーに特異的な合成オリゴ ヌクレオチドプライマーを用い、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ り、サルリンパ球から抽出したＲＮＡから、サル免疫グロブリン遺伝子を増幅す る方法に基づく。増幅された遺伝子または適当な部分（例えば、相補性決定領域 （ＣＤＲ）をコートする領域；　Ｗｉｎｔｅｒ、英国特許出願Ｎｏ、　ＧＢ２１ ８８６３８Ａ、該文献を本明細書に引用して組み込む）を、サル／ヒト組換え抗 体の製造のための、ヒトまたはチンパンジーの定常領域遺伝子を含有する発現ベ クター、または所望のイソタイプの全サル組換え抗体の製造のための、サル定常 領域遺伝子を含有するベクターにクローンする。これらの抗体は、インビボ投与 後、適当な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に位置することができ、かつ／または それを殺すことができる免疫療法剤である。

即ち、本発明は第１の側面として、サル抗体遺伝子の可変領域の抗原認識部分の クローニング法を特徴とする。この方法は、サルから核酸、例えばＲＮＡを得、 ＲＮＡに対するｃＤＮＡを形成しく逆転写酵素を用い）、抗体遺伝子の５°リー ダー配列をコードするｃＤＮＡ配列に相補的なプライマーを得、プライマーとｃ ＤＮＡとを接触させてハイブリッド複合体（コンプレックス）を形成させ、ｃ　 ＤＮＡを増幅してサル抗体遺伝子の可変領域をコードする核酸を製造することを 含む。

「抗原認識部分」とは、標的抗原（またはエピトープまたはイデオタイブ）との 結合および／′またはその認識に寄与する（責任のある）サル抗体の可変領域の １またはそれ以上の部分を指す。例えば、これは、ＣＤＲ領域（下記参照）また は可変領域全体を含むか、または、抗体の特異的な結合特性を変化させずに、領 域をサル様でなく、よりヒト様にするために暗号領域内に誘導される任意の変化 を含んだ、これら２領域の任意の組み合わせを包含する。もしも全可変領域の１ 部のみを用いれば、残りの部分、例えば、いわゆる「フレームワーク」は、もう １つの抗体、好ましくはヒトまたはチンパンジー抗体から供給される（下記、お よび上記の、ならびに本明細書に引用して組み込まれた文献）。

「可変領域」、「リーダー配列」、「定常領域」および「フレームワーク」とい う語句は、以下に例示するように、その共通の技術分野、および本明細書に引用 して組み込まれた上記の技術分野で認められた方法で使用されている。

好ましい実施態様では、図１に例示したように、リーダー配列は約６０塩基のヒ ト、チンパンジー、またはサルのリーダー配列である。

出願人は、サル、チンパンジー、またはヒトの可変領域リーダー配列が、その１ つについて構築したプライマーが他のものの増幅に適するに十分な程、類似して いることを見いだした。次いで、本発明方法では、後のクローニングのためのベ クター内に配置するに十分な核酸が製造されるまで、ＲＮＡを増幅する。

第２の側面では、本発明はヒト内で免疫原性の無い、ヒト抗原に対する抗体の製 造方法を特徴とする。該方法は、サル内で、ヒト抗原に対するサル抗体を惹起し 、サル抗体の可変領域の抗原認識部分をコードするサル核酸を単離することを含 む。抗体のヒト定常領域をコートするヒト核酸を得、サル核酸に連結して組換え 核酸を形成する。次いて、この組換え核酸を発現させ、所望の抗体を製造する。

別法として、組換え抗体の製造にチンパンジーまたはサルの定常領域をコードす る核酸を用いてもよい。ヒトおよびチンパンジーの定常領域のアミノ酸配列は、 例え有っても、殆ど相違が無く（即ちそれらは相同であり）、サル定常領域をコ ードする核酸を組換え抗体の形成に用いれば、ヒトとサルの間にある相違は標準 的な方法て容易に変更し得る。発明において重要なことはただ、組換え抗体をヒ トに導入した後でなんら有意な免疫応答が起きないよう、サル定常領域よりも免 疫原性が低い抗体が産生されるということである。（そのような抗体領域を、本 明細書中では、相同領域と称する）。即ち、組換え抗体はそのアミノ酸配列では 、ヒト抗体と機能上同一である（つまり、ヒトまたはチンパンジー抗体の定常領 域と相同な定常領域を有する）ように操作されている。要約すると、抗体は、抗 体に対する望ましくない免疫学的応答の機会を減少するに必要な程度、ヒト抗体 に類似しており、サル抗体の抗原結合部分を含有している。

「免疫原性でない」という語句は、抗体が、不ズミ抗体またはネズミーヒトキメ ラ抗体に比較して、治療効果の達成に十分な時間、連続投与したとき、大多数の ヒトにおいて、抗体連続投与の効果を減少する程大きい抗体応答を惹起しないこ とを意味する。抗体応答は観察されないことが好ましい。

好ましい実施態様では、本発明方法は、免疫応答にかかわるサル細胞を、例えば 、ハイブリトーマ融合、Ｈｅｒｐｅｓ　ｐａｐｉｏによるウィルス形質転換、単 −Ｂ細胞クローニング（「一時的な、または一過性の、不滅化ともいう」）によ る不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）　、および組換え免疫グロブリン ライブラリーの製造を含む。他の好ましい実施態様では、本発明方法は、末梢血 白血球、牌臓、骨髄、またはリンパ節のいずれかからサルのＢ細胞を選択し、適 当な抗体を産生ずるクローンを選択し、不滅化細胞系から、その抗体をコートす る免疫グロブリン遺伝子を救出し、該遺伝子を生産細胞系（例えば、ヒト治療に 有用な抗体の十分な製造をもたらす細胞系）て再発現させることを含む。

第３の側面では、本発明は、ヒトまたはチンパンジーの定常領域とサルの可変領 域の抗原認識部分、または第１のサルの定常領域と第２の異なるサルの可変領域 の抗原認識部分、のいずれかで形成される組換え抗体を特徴とする。

関連する側面では、本発明は不滅化サルＢ細胞によって形成されたヒト抗原に対 するモノクローナル抗体、またはＦａｂ、　（Ｆａｂ）２、軽鎖または重鎖２量 体、またはＦｖまたはＳＣＡ　（１本鎖抗体）のような任意のその最小組換えフ ラグメントまたは他の免疫原的に活性なそのフラグメント（例えば、ＣＤＲ領域 ）を特徴とする。そのようなフラグメント（断片）は免疫抑制剤として有用であ る。あるいは、本発明の抗体はエフェクターまたはリポータ−分子と結合してい てもよい。

例えば、本発明の抗体には重金属原子とキレート形成するための巨大環（マクロ サイクル）、または毒素（トキシン、例えばりシン）が共有結合架橋構造によっ て結合していてもよい。さらに、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ３ ドメインを酵素または毒素分子で置換してもよく、免疫グロブリン鎮の１部はポ リペプチドのエフェクターまたはリポータ−分子と結合していてもよい。２特異 性抗体も標準的な方法で構築することができる。

他の側面では、本発明は、治療または予防的な使用のために本発明抗体を与える ための医薬組成物を特徴とする。そのような抗体はまた免疫毒素（イムノドキノ ン）として提供することもてきる。これは、２つの成分により特性化でき、選択 した細胞をインヒドロまたはインヒポで殺すのに有効な分子である。１つの成分 は結合したとき、または吸収されたとき、通常、細胞を死滅させる細胞毒性物質 である。第２の成分は、「デリバリ−ビヒクル（伝達体）」として知られており 、例えば腫瘍細胞など、特定の型の細胞に毒性物質をデリバリ−する手段を与え る。２成分は通常、様々な化学的および遺伝子学的に周知の方法の任意の方法で 化学的に結合されている。例えば、細胞毒性物質がタンパク質であり、第２成分 が無傷の免疫グロブリンであるとき、結合は、異種２機能性交差結合体（ｈｅｔ ｅｒｏ　ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｒｔｊｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ） 　（例えば、カーホンイミド、グルタルアルデヒド 他の関連側面では、本発明は、ヒト／サル組換え抗体をコートする核酸を特徴と する。好ましい実施態様では、核酸はヒトまたはチンパンジーの定常領域および サル可変領域の抗原認識部分をコートし，核酸は精製されており、それが天然で 伴っている生物学的成分から分離されており、あるいは、より好ましくは、均質 な溶液として提供される。

また、他の側面では、本発明は少な（とも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）、即 ち、アミノ酸残基（Ｋａｂａｔの標準的なアミ、）酸番号付システムを用いて） て表すと、旧世界サルの可変領域の特定の重鎮のアミノ酸３１−３５　（ＣＤＲ Ｉ）、５０−６５（ＣＤＲ２）および９５−１０２（ＣＤＲ３）、および旧世界 ザルの特定（７）軽Ｍの７ミ／酸２４−３４　（ＣＤＲＩ）　、５０−５６　（ ＣＤＲ２）　お、Ｊ．び８９−９７　（ＣＤＲ３）　、および第２の種に由来す る免疫グロブリン可変領域フレームワークから形成されたＣＤＲ−グラフト抗体 を特徴とする。ＣＤＲグラフト抗体は元のサル抗体と同じ抗原に結合することが できる。抗体の定常領域はヒトまたはチンパンジーの免疫グロブリンから導かれ る。この態様を行うための方法論は、ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、 、　３２１　Ｎａｔｕｒｅ　５２２．　１９８６）により一般的に記載された。

そのようなＣＤＲグラフトは、要すれば、抗体に対する逆反応が起きる可能性を 減少するよう、より確かにヒト様であるよう変化させることができる。

好ましい実施態様では、その方法は、マヵクがら、マヵク抗体の産生に責任のあ る細胞を不滅化または選択し、細胞がら免疫グロブリン遺伝子を救済し．抗体の 産生に責任のある抗体遺伝子をクローニングおよびスクリーニングし，ヒト可変 領域フレームワーク配列（好ましくはマヵク可変領域フレームワークに緊密に相 同である）を選択し．マカクＣＤＲ配列をヒトＣＤＲ配列の代用とし、抗体とそ の抗原に対する親和性を維持するためにヒトフレームワーク領域に最小の修飾を 含ませることを含む。

「最小の修飾」という語句は、フレームワーク内で、計約６アミノ酸以下のアミ ノ酸を他のアミノ酸で置換することを意味する。通常、そのような置換、即ち修 飾は、それらのアミノ酸が、所望の抗原を抗体が認識するためにフレームワーク を適当な形に保つ立体配座相互作用に関与している場合にのみ行われる。そのよ うな修飾は、通常、ヒト抗体と比較したとき、サル抗体に存在する異なるアミノ 酸を反映している。例えば、重鎖ＣＤＲ３の直前のヒト抗体のアミノ酸配列、９ ２−９４は通常、ンスティ／ーアルギニンーアルギニンである（アルギニンは少 数の抗体内にてセリンまたはスレオニンと置換されていることが分がっている） サルの幾つかの抗体内ては、配列はノスティンーアラニンーセリンである．がく して、この例では、セリンをアミノ酸９４に用いることが好ましいであろう（図 ９Ｄ参照）。

さらに、別の側面では、本発明は、特定の抗原（例えば、疾患と関連したもの） を有するヒトを治療（処置）する方法を特徴とする。該方法は、治療有効量の、 特定の抗原に特異的な組換え抗体を投与することを含み、ここに、組換え抗体は ヒトまたはチンパンジーの定常領域とサルの可変領域の抗原認識部分を有するか 、第１のサルの定常領域と第２の別のサルの可変領域の抗原認識部分を有する。

上記側面の好ましい実施態様ては、抗原は腫瘍抗原、免疫異常に関与する抗原、 自己免疫疾轡に関与する抗原、宿主細胞で発現された受容体、または、ＣＤ５８ 、ＶＬＡ４（α４β１インテグリン）、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、ＬＡＭＳ ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ヒトＴ細胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ８、 ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔ ｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、Ｃ５ａ等のヒト抗原から選択される抗原、接着分 子類、例えばＶＣＡＭ、ＣＤ５４、ＣＤ２８、ＣＤ１１ａＳＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ ８およびＣＤ１１ｂ等、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１（Ｐ−グリコプロテ ィン）、ＴＧＦαおよびその受容体、およびＰＤＧＦであり１組換え抗体は望ま しくない細胞（例えば抗−ＣＤ４）を補体、またはキラー細胞と一緒に作用する ことにより枯渇させる（殺すまたは消滅させる）か、細胞毒性物質として活性で あるか、又は食細胞によるＦｃ結合を起こす活性を持つ。あるいは、その抗体は 受容体機能を阻害または刺激するか、あるいは１またはそれ以上のインターロイ キノ、ＴＮＦおよびＣ５ａなどの活性な可溶性産物を中和する。

他の側面では、本発明は、上記抗体またはそのフラグメント（断片）の医薬組成 物を特徴とする。本発明の組成物または産物は非経口投与または経鼻投与または 経口投与に適した溶液の形で供給することが便利である。適当な抗体製品を他の 適当な物質の製品と混合することで、臨床上の有用性を増大することができる。

本発明の他の特徴および利点は、下記の本発明の好ましい実施態様、および特許 請求の範囲から明らかであろう。

好ましい態様の説明 まず、図面について簡単に説明する。

怒■ 図１は、９つの異なるＩｇ重鎮リーダー配列および１０個のサルＩｇ重鎮リーダ ー配列の２０個のコドンの一覧表である。

図２はリーダー、可変領域および定常領域の相対的な位置と、制限部位および増 幅に用いたプライマーとが一緒に示された、様々なＩｇ鎖の構造を図解的に示し た図である。

図３はヒトまたはキメラ抗体の発現のための重鎮カセットベクターを図解的に示 した図である。

図４はヒトまたはキメラ抗体の発現のための軽鎖カセットベクターを図解的に示 した図である。

図５および図６は、それぞれ、カッパまたはラムダ軽鎖ｃＤＮＡがらの免疫グロ ブリンの発現のために設計されたベクターを図解的に示した図である。これらの ベクターでは、選択可能マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ を用い、免疫グロブリン遺伝子がタンデム（直列）に配置されている。

図７−１．７−２および図８は、本発明に有用な種々のリーダー配列プライマー の核酸配列を示す（図８におけるこれらプライマーは下記の配列番号１−１２に 記載のものに対応する）。

図９Ａ−９８は、それぞれ、ヒ）・およびサルの、ＶＨＩ、ＶＨ２、ＶＨ３、Ｖ Ｈ４およびＶＨ５配列、およびＶＫＩおよびＶＫＩＴ、およびＶラムダＩＩＩ配 列を対比させた図である。

図１０は、ヒトおよびサルのＶＨ３配列の比較、および１個のヒトＶＨ２領域と の比較を示す図である。

図１１は本発明の抗体とＣＤ４抗原との結合を示すグラフである。

図１２は図１０に示した抗体による、ＩＦ３の結合阻害を示すグラフである。

図１３および図１４は、それぞれ、抗−ＣＤ４ＶＨ領域、および抗−ＣＤ４ＶＬ 領域の核酸配列の部分配列を示す。

図１５は、抗−ＣＤ５４活性を示すグラフである。

図１６は、プラスミド発現像を表すヒストグラムである。

サル抗体 旧世界サルには、ヒトおよびマカクサル（アカゲザルおよびジノモルゲスザルを 含む）と称されるサルが含まれる。本発明では、様々なサル遺伝子を用い、特許 請求にかかる本発明の実施の詳細を提供する。これらの例示は本発明を限定する ものではなく、他の旧世界サルにも容易に応用できる。

図２を参照すると、この図には、免疫グロブリンの重鎮、カッパ軽鎖、およびラ ムダ軽鎖をコードする遺伝子の一般的な構造が図解的な形で示されている。これ ら鎖の各々は、７へＴＧ開始コドン、次いて約６０塩基のリーダー配列、免疫グ ロブリンの可変領域をコートする領域、および該免疫グロブリンの定常領域をコ ートする領域で形成されている。様々な重鎮のリーダー配列、またはシグナルベ ブチドの例は図１に示されている。これらの配列、およびそのサルでの同等物は 、当業者既知の標準的な方法、および以下に記載の方法で決定することができる 。

図１の下方部分に示した配列はヒトリーダー配列である。本発明者らは、これら リーダー領域に相補的なプライマーの構築により、サルから１ｇ遺伝子を増幅で きることを見いだし、た。同様に、サルリーダー配列（例、図１の上方部分）に 相同なプライマーはサル免疫グロブリン遺伝子の増幅、並びにヒト免疫グロブリ １．遺伝子の増幅に用いることができる。

そのようなプライマーを標準的な増幅方法に用いることて、様々なサル免疫グロ ブｌ　＞遺伝子をコートする遺伝子を容易に単離し、抗体の可変領域をコードす る配列を決定することができる。そのような方法を以下に例示する。以下に示す 分析の結果は図９Ａから図９８、および図１０に示す。驚くべきことに、本発明 者らは、サル内で、比較的保存されているヒト抗原に対する抗体が産生されるに もかかわらず、そのようにして産生された抗体の可変領域フレームワーク配列は ヒト抗体におけるそれらと識別できないことを発見した。サルに関して観察され た免疫グロブリン配列における可変性の量はヒトに関して観察されるものと同様 であり、その起源を調べない限り、どの抗体がヒトまたはサルから導かれたもの であるかが決定できなかった。

即ち、例えば、図１０を参照すると、ここではヒトのＶＨ３領域をサルと比較し ている。ヒト抗体相互間の相同性は８３−９８％の範囲であり、サルのそれはヒ トＶＨ３領域と９０−９３％相同であった。対照的に、ヒトＶＨ２領域はヒトＶ Ｈ３と６０％相同であった。［この図では、他の図におけると同様、任意の位置 での同一アミノ酸の存在をダッンユ（線）で示し、異なるアミノ酸の存在を標準 的な１文字記号で示している。コンセンサスアミノ酸を同定できない位置はＸテ 示シタ］　Ｃ同ｍｌ＝、ＶＨＩ、ＶＨ２、ＶＨ３、〜’Ｈ４およびＶＨ５配列、 およびＶＫＩおよびＶＫＩＴ、および〜ｒラムダＩＩＩに関する相同性はそれぞ れ図９Ａ−９Ｈに示されている。再び、サル免疫グロブリン領域とヒトの該領域 には、免疫グロブリンＪ領域配列をも含めて、有意な相同性が認められた。その ような高度の相同性はヒト抗体間に観察される相同性に類似する。

配列決定法を下記実施例に示す。当業者ならば、これらの実施例が本発明を制限 するものでなく、当業者周知の方法により、同等の結果およびモノクローナル抗 体およびキメラ抗体を得ることができることを理解するであろう。例えば、前掲 の、米国特許第４．８１６．５６７号、米国特許第４．９７８．７４５号、米国 特許第４．９７５．３６９号および米国特許第４．８１６．３９７号参照。例え ば、サル可変領域をフードする遺伝子をクローニングした後、そのような遺伝子 をサルまたはヒト定常領域をコードする遺伝子に容易に連結し、融合遺伝子を生 産細胞系内で発現させて所望の抗体を製造する。下記にそのような方法の例を示 す。

以下の実施例で、方法の第１段階では、全ＲＮＡをサル末梢血、リンパ節または 膵臓から単離する。免疫したサル由来のＢ細胞は末梢血またはリンパ節から得、 直接用いることができるが、好ましくはそれらを拡張（エキスパン／コン）する 。

拡張には、Ｈｅｒｐｅｓ　ｐａｐｉｏウィルス形質転換、異種（ヘテロローガス ）骨髄腫細胞との融合と選択、または単−Ｂ細胞を刺激ヒトＴ細胞の存在下で限 界希釈下にクローニングする方法が含まわる。

次いて、全ＲＮＡを非特異的オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴｄＴまたは ランダムヘキサマー）または特異的オリゴヌクレオチドプライマー（免疫グロブ リンＣＨ１またはＣＫまたはＣラムダ定常領域）を用い、逆転写酵素によって、 １本鎖（ｓｓ）ｃＤＮＡに変換する。この反応で生成した１末鎖ｃＤＮＡをポリ メラーゼ連鎖反応、該反応ては、ｓｓ　ｃＤＮＡ、デオキシヌクレオチドトリホ スフェートと一緒に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば熱安定性ポリメラーゼ）およ び特異的なプライマーを用いて重鎮または軽鎖の可変領域免疫グロブリン遺伝子 を増幅する、で増幅した。用いたプライマーは２０−４０塩基の合成１水路オリ コヌクレオチドであり、免疫グロブリン５゛　リーダー配列に結合する幾つかの 縮重塩基を有する。サル重鎮可変領域ファミリーの増幅のために、制限酵素部位 （例、５ａｉｌ）を導入する６つの異なる５゛　リーダー配列プライマー類（図 ７−１参照）を、それらとヒト重鎮可変領域遺伝子ファミリーとの類似性に基づ いて設計した。６つの５°　リーダー配列プライマーの各々と一緒に、これもま た制限酵素部位（例、Ｎ　ｈｅＩ　）を組み込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ）　 、関連イソタイプ（例１ｇＧ、１ｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥ）の定常領域ドメイ ンに特異的な３′プライマーを用いる。同様に、適当な軽鎖可変領域の増幅には 、サルカッパおよびラムダ軽鎖のための、他のプライマ一対を用いる（図７−２ ）。

異なる唯一の（ユニークな）制限酵素部位を組み込み、ＰＣＲ−増幅したＤＮＡ を同一の制限部位を有する適当な発現ベクター内て直接クローニングし得るよう 、池のセント（組）のプライマーを用いることができる。抗体重鎮リーダー配列 の３°末端に結合し１ｌｌｕ１部位を組み込む１セツトのプライマー、またはフ レームワークの最初の２３塩基に結合し、ＸｈｏＩ部位を組み込む１セツトのプ ライマーを用いることがてき、それらは図７−１に示されている。サル免疫グロ ブリン重鎮および軽鎖可変領域遺伝子は、要すれば、ＰＣＨの後、さらなる分子 操作が可能なよう、／ヤトルヘクーに直接クローンするか、ヒト重鎮または軽鎖 定常領域遺伝子を含有する発現ベクターに直接クローンしてもよい。発現ベクタ ー内での分子配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、免疫グロブリンプロモー ター／エンハンサ−および他の調節領域が、スプライス供与／受容配列と同様、 イントロン／エクジンジャンクンコンに存在する、ゲノム的なものであってよい 。あるいは、キメラ免疫グロブリン遺伝子を異種ウィルス性プロモーター／エン ハンサ−配列を用いてｃＤＮＡ配置に挿入してもよい。

図７および図８は、それぞれ、制限部位を含有する、および含有しないプライマ ーであって、サルおよび／またはヒトｃＤＮＡ類から免疫グロブリン遺伝子をＰ ＣＲて増幅するのに用いたプライマーを示す。使用した方法を以下に詳細に説明 する。標準的なグアニンニウム・イソシアナート法でサルの膵臓、末梢血および リンパ節からＲＮＡを単離した。次いで、この方法で単離した全ＲＮＡ画分を鋳 型（テンペレート）として用い、以後の増幅反応を行った。ＲＮＡの１部を２０ ０単位のモロニーネズミ白血病ウィルス逆転写酵素および５０−１００ピコモル の、非特異的オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴｄＴまたはランダムヘキサ マー）または特異的オリゴヌクレオチドプライマー（免疫グロブ９冫１ディング センス１水路ｃＤＮＡ鎖を分離した。次いで、この反応で生成した１末鎖ｃＤＮ Ａをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。１末鎖ｃＤＮＡの一部を、デ オキシヌクレオチドトリホスフェート類（２０μＭ）、熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼ（２−５単位）、およびヒトから導かれた合成オリゴヌクレオチドプライマ ー（５０ピコモル）と−緒にインキュベートシ、重鎮または軽鎖の可変領域免疫 グロブリン遺伝子いずれかを増幅した。

図８の１対のプライマーを用い、多くの遺伝子ファミリーから、幾つかの代表的 なンノモルグス免疫グロブリン重鎮および軽鎖可変領域配列を増幅した。これら 増幅した配列をプラスミドベクターｐ　−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（　ｐ　ｂ　 ｓ　、ストラタジーン、ＣＡから入手可能）のＥｃｏＲＶ部位にクローンし、配 列決定に用いた。ＤＮＡ配列決定は、クローンした挿入体（インサート）を含有 するプラスミドＤＮＡを２本鎖ＤＮＡ鋳型として用い、標準的な鎖終結配列決定 法で行った。

代表的なアノモルゲスザル免疫グロブリン配列を図９Ａ−９Ｈに示す。９Ａ−９ Ｈはヒト可変領域遺伝子のコンセンサスアミノ酸配列であり、主たる可変領域遺 伝子の各ファミリーを示している。定常領域およびＣＤＲ領域を除く、各サル配 列とヒトコンセンサス配列との相同性比率（％）を示す。特定のファミリーに関 するヒト配列とサル配列との相同性の捏度はそのファミリー内の２つのヒト配列 間のそれと同じくらい高い。従って、旧世界ザル由来の可変領域免疫グロブリン 配列と、ヒト由来のそれらとを、配列の比較のみに基づいて識別することは不可 能である。

ＲＮＡの単離 サル抗原−特異的Ｂ細胞は幾つかの方法　免疫したサルリンパ節細胞をヒト／マ ウスへテロ骨髄腫融合パートナ−細胞系に５Ｈ６／Ｂ５と融合した後、ハイブリ トーマ系をスクリーニングすることにより，ウィルスによって形質転換したＢ細 胞により．またはインビトロの単一Ｂ細胞りローニング法により．得られた。

後者の場合、単一サルＢ細胞のインヒドロ増殖は、抗体で刺激したヒトＴ細胞と 一緒にインキュベートすることて支持された。単一のＢ細胞を、約１５０．００ ０の抗ＣＤ３ー刺激マイトマインンＣー処理ヒトＴ細胞と一緒に９６ウ工ル組織 培養プレートの各ウェルに入れた。２週間のインキュベーション期間の後、単一 Ｂ細胞は少な（とも２００の分化したプラズマ（形質）細胞に拡張されていた。

これらのウェルからの培養上清をヤギ抗サル免疫グロブリンの捕獲抗体を用い、 ＥＬＩＳＡ法により、免疫グロブリンの存在に関して分析した。

抗原特異的なウィルスで形質転換された細胞からの細胞またはハイブリドーマか らの細胞のいずれかをＲＮＡの抽出に十分な数になるまで拡張した。インビトロ の１１−Ｂ細胞クローニング法における、免疫グロブリン陽性ウェルを取り、冷 りん酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．５）て２回洗浄し、遠心（１０００ｘｇ．１０分 間）した。洗浄した細胞を溶解液１００μｍ　（４Ｍ　グアニジウム・イソシア ナート、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウムｐＨ７．０，０．５％サルコンンナトリ ウム、領ＬＭ　２−メルカプトエタノール）に懸濁した。２Ｍ酢酸ナトリウム、 ｐＨ４、０（１０μｌ）を加え、混合した。水飽和フェノール１００μｌを加え 、混合し、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９　：　１）２０μｍを加 えてタンパク質を取った。ポルテックスし、氷上で１５分間インキュベートした 後、試料を遠心（１０．０００ｘｇ，２０分間）した。水層を新しい管に移し、 等容量のイソプロパツールと混合し、−２０℃で１時間インキュベートした。１ ０，０００ｘｇて１５分間遠心して沈澱を収集し、７０％エタノールで洗浄し、 再遠心し、ペレットを５ｐｅｅｄｉｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ）内て乾燥した。２ 度目として、乾燥したＲＮＡを溶解バッファー１００μｍに再溶解した。等容量 のイソプロパツールを加え、−２０℃で１時間インキュベートした。１０，００ ０ｘｇで１５分間遠心して沈澱を収集し、７０％エタノールて洗浄した。ペレッ トを５ｐｅｅｄｉｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ）内で乾燥し、使用まで一２０℃て７ ０％エタノール中に保存した。

１末鎖ｃＤＮＡの合成 単一のウェルに由来する細胞から抽出した全ＲＮＡを２回蒸留した水３２μｍグ ロブリンー特異的プライマーのいずれが）１μｍ（５０−１００ピコモル）およ び５Ｘ逆転写酵素ハツ７アー（０．　２　５Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．　３） 　、０．　３　７　５ＭＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ジチオスレ イトール）１０μ】を加えたＣ混合物を６５℃で５分間加熱した後、水中に２分 間置いた。加熱の後、ＲＮＡ　ｓ　ｉ　ｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）　１　μｌ、５ ｍＭデオキシヌクレオチドトリホスフェート５μ１１およびモロニーネズミ白血 病ウィルス逆転写酵素（ＢＲＬ）１μ１（２００単位）を加え、混合物を３７° Ｃで１．５時間インキュベートした。逆転写酵素反応の完了後、フェノール／ク ロロホルムで１水路ｃＤＮＡ／ＲＮＡ混合物を抽出し、１ｍｌのＧ−２５ＳＥＰ ＨＡＤＥＸスピンカラムを通した。このカラムを通過する物實をＰＣＲ増幅のた めの、鋳型５ｓｃＤＮＡとして用いた。

ｓｓ　ｃＤＮＡの増幅 ｓｓ　ｃＤＮＡ　（３−１０μｌ）を１０ｘＰＣＲバツフｙ　（５００ｍＭ　Ｋ ＣＩ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）　、１５ｍＭ　ＭｇＣ１ａ ）　１０μｌ、１゜２５１１Ｍ　デオキシヌクレオチドトリホスフエート１．６ μｍ、特異的免疫グロブリン５°プライマー５０ピコモル、特異的免疫グロブリ ン３°プライマー５０ピコモル、および２−５単位の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ （Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）と混合した。水で反応容量を１００ μｍにし、鉱油１００μｍを重層した。反応混合物を下記の温度で、所定の時間 インキュベートした。

９４℃で１分間 ４８℃で２分間 ７２℃で２分間 このサイクルを３０−３５回繰り返した。増幅した生成物を１．２％アガロース ゲルと分子量標準を用いて、アカロースゲル電気泳動によって試験した。増幅し た免疫グロブリン可変領域遺伝子は、はぼ３５０−５００ｂｐマーカーの間に泳 動した。次いて、ＰＣＲ増幅生成物を用いて適当なプラスミドベクターにクロー ニングした。

サル可変領域遺伝子配列は、ｃＤＮＡレベルでは、同等な遺伝子ファミリーのヒ トメンバーと区別できないので、サル／ヒトキメラ抗体に対する免疫応答１よ、 もしあったとしても、ヒト抗体分子に対して惹起されるものと異ならなＬλであ ろう。

ＰＣＲ法は、図６に記載のものに基づくプライマーを用い、ＰＣＲ増幅反応の間 、Ｓａｌ　Ｉ　、　ＢｇｌＩＩ、　ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩを含む（これらに限定さ れナイ）特異的す制限酵素部位を、旧世界ザル可変領域配列に導入するのに用い ることができる。後１こ遺伝子を発現ベクターにクローンするのに用いる特異的 な制限部位を導入するため、これらのプライマーを用いて既存のクローン化遺伝 子をそれらの特異的ベクターから増幅した。あるいは、これらのプライマーを用 いて細胞性ＲＮＡを直接増幅した。

２つの型の発現ベクターを構築した。第１のもの（図３および４）は、独特の（ ユニークな）制限部位を用い、サル由来のクローン化ｃＤＮＡ免疫グロブリン可 変領域をカセットベクターに挿入することができ、そこでは、免疫グロブリン遺 伝子エレメントはゲノム配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に配置されている 。この型のベクターには免疫グロブリンプロモーター、免疫グロブリンリーダー 配列を構成する２つのエクソン、２つのクローニング部位（ＳｐｅＩおよびＮｈ ｅＩ）　、下流スプライス供与配列、免疫グロブリンエンハンサ−領域、ヒト定 常領域遺伝子（重鎮または軽鎖）および下流ポリアデニル化シグナルが組み込ま れる。加えて、それらは細菌性複製起源、細菌性選択のためのベータラクタマー ゼ遺伝子、および哺乳類細胞内で、Ｇ４１８選択のためのネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ遺伝子、またはミコフェノール（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌ）酸選 択のためのキサンチンーグアニジノホスホリボノルトランスフエラーゼ（ｇｐｔ ）遺伝子を含む。重鎖および軽鎖発現ベクターは、それぞれ、選択可能なマーカ ーとして、ネオマイシンホスホトランスフェラーセ（Ｎｅｏ）遺伝子およびキサ ンチンーグアニジノホスホリボンルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）遺伝子を用い る。

第２の型の発現ベクター基（図５および６）はｃＤＮＡ配置内で免疫グロブリン 遺伝子を用いる。即ち、５゛　リーダー配列および３“定常領域配列の間に、イ ントロンやスプライス部位が存在しない。この型のベクターは、タンデム方式で 配された免疫グロブリン重鎮および軽鎖を操作する、異種のウィルス性プロモー ター／エンハンサ−配列、ポリアデニル化配列および選択可能な哺乳類細胞マー カー（Ｎｅｏ）を用いる。例えば、遺伝子の開始部位から上流またはそれに隣接 したコドンを、ＡＣＣからＴＣＴに変化させることにより、Ｎｅｏ遺伝子を修飾 してその転写を弱めることができる。さらに、後に、メソトレキセートを用いて 遺伝子を増幅するために、／ヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子が存在 する。ｃＤＮＡ配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）の発現ベクターにクローンすべき サル免疫グロブリン可変領域遺伝子を、シャトルベクター（ＰＢＳ内）内で既存 のクローン化配列から増幅するか、あるいは、重鎮のために、制限部位５ａｉｌ または１ＪｌｕｌおよびＮｈｅＩ、カッパまたはラムダ軽鎖のためにＢｇｌＩＩ およびＫｐｎｌまたはＢｓ１ｌＩの（、Ｘずれかを含有するプライマーを用い、 ＲＮＡから直接増幅した。しかしながら、他の可能な独特の制限部位を排除する 訳ではない。

キメラ重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、別々にあるいは連続的に（ゲノ ム的な配置の構築物について）、あるいは同じベクター上で（ｃＤＮＡ配置の構 築物のために）、電気穿孔法（エレクトロポレーション）で生産（プロデューサ ー）細胞系に導入した。電気穿孔法を用いてチャイニーズ／％Ａスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞、またはマウス骨髄腫細胞に、線状化ＤＮＡ構築物を挿入した１ｋ、 ９６ウ工ル組織培養プレート内でトランスフエクタントの単一細胞クローニング を行った。ＢＴＸ−１００（ＢＴＸ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）電気穿孔装置と１ ｌＩの使し）捨てプラスチック製キュヘットを用い、電気穿孔条件によって、特 定量のベクターＤＮＡから最適な数のトランスフエクタントが得られた。ウィル ス性調節エレメントを含有する構築物内で、血清不含培地（Ｃ）（Ｏ〜Ｓ　ＳＦ Ｍ　ＩＩマイナス　ヒポキサンチンおよびチミジン、Ｇｉｂｃｏ）中の懸濁液内 で増殖するよう適合させｔこＣ）（Ｏ細胞を用いた。

１ｇ可変領域遺伝子のサブクローニングＰＣＲ反応の生成物をフェノール／クロ ロホルムで抽出し、１ｌＩの５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２５スピンカラムに通した 。ＤＮＡ断片をプラスミド（こ平滑末端クローンすべきときは、ＬＭ　ｋｉｇｃ １２．１．２５ｍＭ　デオキシヌクレオチドト１ノホスフェー）０．５ｌＩ、お よびフレナラＤＮＡポリメラーゼ１ｍ１（５単位）を全ＰＣＲ反応混合物（１０ ０μｌ）に加え、３７°Ｃて１５分間インキュベートして、あらゆる５°突出を 充填した。プラスミドへの平滑末端クローニング゛の＠（こ、以下のよう（こし て５゛末端をりん酸化した：１０ｍＭ　ＡＴＰ５μｍ、Ｔ４ポ１ノヌクレオチド キナーゼ１μｍ（１０単位）を全反応混合物に加え、３７°Ｃて３０分間インキ ュベートした。内部制限部位を有する増幅した断片は、まず適当な制限酵素で切 断し、りん酸化することなく連結に直接用いた。いずれの場合も、クローニング すべき断片は、適当なベクターに連結する前にフェノール／クロロホルムで抽出 された。

連結反応のために、りん酸化した、または制限酵素切断した、ＰＣＲ増幅断片を 、あらかじめ制限酵素（類）で消化しておいた、はぼ２ｎｇの適当なベクターと 混合した（全容量８μｌ）。平滑末端クローニングのためには、ＥｃｏＲＶで消 化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いた。粘着末端クローニングのためには、適 当な制限酵素で切断した、ベクターＴＣＡＥ５．２またはＴＣＡＥ６．０、また はｐＧｅｎｅｘ（］またはｐＧｅｎｅＸＬを用いた。１０ｘ連結ハソフ７−（５ ００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭンチオオスレイトール）１μｌ、丁４ＤＮＡリカーゼ１ μｍ（１単位）を加え、１４℃で１夜反応させた。連結した物質を用い、形質転 換のための標準的な塩化カルシウム法によりコンピテント（能力）　Ｅ、ｃｏｌ ｉ　ＨＢ　１０１細胞を形質転換した。形質転換された細菌をアンピシリン含有 ＬＢ寒天プレート上て培養して選択した。個々のコロニーを選択し、アンピシリ ン含有培地で１夜培養し、標準的なアルカリ溶解法を用いてプラスミドＤＮＡを 抽出した。どのクローンが免疫グロブリン挿入体（インサート）を含有している かを決定するために制限分析した後、配列決定のためにＤＮＡを調製した。

クローン化遺伝子の配列決定 標準的な鎖終結法でクローン化した免疫グロブリン可変領域遺伝子の配列を決定 した。クローンした挿入体を含有する２本鎖プラスミドＤＮＡを配列決定の鋳型 に用いた。配列決定の前に、２本鎖ＤＮＡを化学的に変性させた。免疫グロブリ ンＧ重鎖可変領域のために、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ５ＥＱＵＥＮＡＳＥ　（Ｉ ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 、　Ｃ１ｅａｖｅｌａｎｄ、　０１１）　、放射性標識アルフ@ デオキシＡＴＰ、および下記の配列決定プライマー・　（５“　ＣＡＧＡＧＣＴ ＧＧＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＡ３’　）および（５’　ＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴ ＧＣＴＣＴＴＧＧ３°）を、それぞれ５゛がら３′および３°がら５゛方向のた めに用いて配列決定した。免疫グロブリンラムダ軽鎖可変領域については、（５ °　ＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＧＴＧＡＡＣＣ３°）および（５°ＧＧＣＴＴ ＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧ３°）を、それぞれ５゛がら３°および３°か ら５°方向のために用いた。反応生成物を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離 し、読み取っｔユ多くの旧世界サル免疫グロブリン重鎮および軽鎖可変領域遺伝 子の配列決定の結果を図９Ａ−９Ｈにまとめて示す。ツノモルゲス免疫グロブリ ン遺伝子のクローニングおよび配列決定は本発明以前には文献に記載されていな い。従って、ヒトと／ノモルグゲス＼゛領域遺伝子の相同性の程度を決定するこ とはできながった。単一のチンパンノー可変ラムダ遺伝子とそのヒトゲノム対応 物との相同性が記載され、フレームワーク傾城で、わずか２％の相違が示された 。

トランス７エクノヨンおよび選択 クローンした重鎮および軽鎖可変領域遺伝子の配列決定の後、それらを適当な発 現のためのベクターにサブクローンした。これらは、ゲノム配置（ｃｏｎｆｉｇ ｕｒａｔｌｏｎ）内で、免疫グロブリン調節エレメントを用いて構築されたベク ター（図３および４に示すように）、あるいはｃＤＮＡ配置を使用しウィルス調 節エレメントを用いて構築されたベクター（図５および６に示すように）であっ てよい。第１増幅ステップの間のＰＣＲ増幅プライマーに適当な制限部位（Ｓｐ ｅｌおよびＮｈｅｌ）を設計するか、あるいは制限部位を含有する逆増幅プラ・ イマーを用いて、それらがクロ一二されている／ヤトルヘクーから免疫グロブリ ン遺伝子を増幅することができる。あるいは、サブクローニングが不要となるよ う、ＲＮＡがらのＰＣＲ増幅の後、免疫り゛ロブリフ可変領域遺伝子を直接発現 ベクターにクローンしてもよい。

ｉｉ　ｉ　？　ｉｔ。

Ｓ　ｐ　２１０細胞を、重鎖および軽鎖ゲノム構築物でコートランスフエクト（ 同時トランスフェクト）するか、重鎖および軽鎖ゲノム構築物て連続的にトラン スフェクトするために電気穿孔法を用いた。連続トランス７エクノヨンでは、キ メラ軽鎖構築物の電気穿孔の後、ミコフェノール酸で選択した。軽鎖生成のため の、９６ウエルプレートで培養したクローンからの培養上清を、ヒト軽鎖定常領 域に対する抗血清を用いてＥＬＩ　ＳＡ法でスクリーニングすることで、最も高 く軽鎖を発現しているクローンを選択することができた。次いでサル／ヒトキメ ラ重鎮免疫グロブリン構築物を含有するベクターを用いて軽鎖トランス７エクノ ントを電気穿孔することにより、所望の特異性とイソタイプのキメラ抗体を発現 するトランスフエフトーマを選択することができた。

不ズミ骨髄腫細胞系５ｐ２１０を以下のように、電気穿孔法によって、軽鎖構築 物ｐＧＥＮＥＸ−してトランスフェクトした（図３および４）。トランスフェク ンヨンハッファ−（２７２ｍＭ　スクロース、７ｍＭ　りん酸ナトリウムｐＨ７ ４，１ｍＭ　ＭｇＣ１２）中て５ｐ２１０細胞を密度１　ｘ　１０７／ｍｌテ、 適当なりローン化軽鎖遺伝子を含有するｐＧＥＮＥＸ−Ｌ　（あらがじめ制限酵 素ＰｖｕＩＩで消化することにより線状化したもの）５０μｇと混合した。細胞 を１ｍｌの使い捨てプラスチック製分光光度計用のキュベツト内に入れ、キュベ ツト内に３．５ｍｍ離れたプレート電極を挿入した。細胞に５０％の細胞死を起 こすために、ＢＴＸ−１００（ＢＴＸ、Ｉｎｃ、）　トランス７エクノヨン装置 を用いて５００マイクロ秒の間、電流パルスを適用した。この値は、トランスフ ェクション前の、ＤＮＡがない状態で、高めた電圧を用いて細胞をパルス処理し 、２４時間後に生存している細胞の数を測定することにより決定した。電圧対細 胞生存率をグラフにプロットし、５０％細胞死に相当する電圧を以後の全ての電 気穿孔実験に用いた。

ＢＴＸ−１００装置を用い、振幅２００．５００マイクロ秒のパルスが最適な値 であることが分かった。細胞のパルス処理の後、それらを氷上で１５分間回復さ せた後、５％ウン胎児血清および１０％５ｐ２１０調整培地を含有するＤｕｌｂ ｅｃｃ。

ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ、ダルベ ツコの改良イーグル培地）内で、９６ウ工ル組織培養プレートに移した。適当な 薬物で選択した後、ウェル３個について約１個に細胞増殖が観察されるような密 度で細胞をプレートした。このパラメーターは、ウェルあたり様々な数（１００ ０−１０，０００）の電気穿孔した細胞をプレートし、プラスミドを取り込んだ （ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ）細胞を選択することによって、各電気穿孔実験ごと に決定した。各プレート上の細胞増殖を示すウェルの数を選択の２−３週間後に 数えた。即ち、以後の実験のために、ある特定のａｒｔの特定のプラスミドを用 いて、３中１の陽性ウェルを得るに適当な細胞数を決定した。

電気穿孔の直後に、細胞を薬物を含まない培地にプレートした。電気穿孔の２日 １＆、不オマインンホスホトランスフエラーゼ活性またはグアナンルホスホトラ ンスフエラーセ活性を表している細胞に、それぞれ、Ｇ４１８またはミコフェノ ール酸のいずれかを含む新鮮な培地を加えた。第１週は、２日毎に細胞に培地を へえ、それ以後は１週間に２回与えた。用いる薬物の濃度は細胞を増加濃度の薬 物の存在下でインキュベートし、細胞の生存率を観察することて決定した。用い た薬物のａＷは１００％死滅を表す濃度の２倍であった。Ｓ　ｐ２１０に関して は、ミコフェノール酸約１　ｕ　ｇ／ｍｌが必要てあり、Ｇ４１８の場合、約８ ００μｇ／ｍｌを要した。

細胞の電気穿孔は幾つかの方法で行い、重鎮および軽鎖ゲノムベクター（ｐＧｅ ｎｅｘ−ＨまたはｐＧｅｎｅｘ−１、）を同時に電気穿孔するか、軽鎖単独て電 気穿孔した。後者の場合、ＩＥＬＩＳＡ法を用いて、キメラ免疫グロブリン軽鎖 の高レベル発現に関してクローンをスフ１１−二ンゲした。次いて、これらのク ローンを増殖させ、重鎮含有へりターを用いて電気穿孔した。ｃＤＮＡタンダム 遺伝子構築物を用いた場合、まず制限酵素Ｎｏｔｌて発現ベクター（ＴＣ，ＡＥ ５．２またはＴＣＡＥ６）を線状化した。重鎮および軽鎖遺伝子の組み込み（ｊ ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を達成するには１回の電気穿孔で十分てあった。２−３ 週間後、適当な薬物の存在下で増殖を続けているウェルから得た上清を、ＥＬＩ 　ＳＡを用いて、キメラ免疫グロブリン軽鎖または全免疫７０ブ１１ニアの分泌 に関して分析した。ｃＤＮＡ配置の免疫グロブリシ遺伝子は、上記のこと＜５ｐ ２１０細胞に電気穿孔するか、血清不含培地で増殖するよう適合させた千セイニ ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に電気穿孔し１コ、最大数の６１１８耐性コ コニーが得られるように条件を設定し、Ｂ’ＦＸ６００電気穿孔装置を用いてＣ ＨＯ細胞の電気穿孔を行った。それら条件は、２００ホルト、４００μＦおよび １３オームであった。電気穿孔の後、細胞を数え、トランスフェクションバッフ ァーで洗浄し、同じバッファーに再懸濁し、１５分間氷上に置いた。細胞を１ｘ ｌＯ’生存細胞／ｍｌに調節し、細胞懸濁液４００１ｉ１を滅菌した０、４ｍｌ の使い捨てキュベツト（ＢＴＸ、　Ｉｎｃ、）に入れた。ＮｏｔＩで線状化した 、クローン化マカク免疫グロブリン可変領域遺伝子を含有するＴＣＡＥ５．２ま たはＴＣＡＥ６のいずれが２５μｇをＴＥバッフｙ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に１　ｕ　ｇ／ｍｌで再懸濁し、細胞懸 濁液に加えた。電気穿孔は自動充電およびパルスホクンを用い、装置を放電する ことで行った。キュベツトを氷上に１５分間置き、細胞を血清不含培地１２０ｍ １で希釈し、６個の９６ウエルプレート（２ｏｏμｍ／ウェル：ウェルあたり、 電気穿孔した細胞的６．６６７あるいは生存細胞３．３３３を含有する）にプレ ートした。この細胞系に関して独立の電気穿孔パラメーターを確立し、Ｇ４１８ による選択は４００μｇ／＋ｎｌて行った。

抗体の製造のためのスクリーニング トランスフェクタントから分泌されたヒト抗体、サル抗体またはキメラ抗体の存 卒を以下のＥＬＩＳＡ法で分析した。９６ウエルの平底プレート（Ｄｙｎａｔｅ ｃｈ）をコーティングバッフ−ｒ　−（Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ）　（０ ，８ｍｇ／ｍｌ炭酸ナトリウム、１、５５ｍｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ ９，６）中、２００ｎｇ／ウェルでコートし、４°Ｃて少なくとも１６時間イン キュベートした。コーティングバッファーを除去し、ブロッキングバッファー（ ０，２％アシ化ナトリウム含有りん酸緩衝化食塩水中、１％ウシ血清アルブミン ）１２０μｌでウェルをブロックし、３７でて１時間インキュベートした。ブロ ッキングバッファーを含有するウェルに１２５μｌまて細胞培養上清を加え、３ ７℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳて５回洗浄した。

希釈バッファー（ＰＢＳ中、１％ウシ血清アルブミン、００５％Ｔｗｅｅｎ　２ ０．００２％アジ化ナトリウム）で１　：　１０００から１　：　５０００に希 釈した西洋ワサビペルオキシダーゼー標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（またはカッパ）１ ００μｍを加えた。プレートを３７℃で１時間インキユベートシた後、ＰＢＳで ５回洗浄した。キメラ抗体は、ウェルあたり過酸化水素１００μｍと基質として ３．３′、５．　５’−テトラメチルベンジジン（１・１、ｖ　／　ｖ　）を用 いて検出した。２−５分後に２Ｍ硫酸をウェルあたり１００μｍ加えることで発 色反応を終結した。

当業者にとって上記の方法と同等の方法を行うことは容易である。そのような方 法の例として、上記したように、選択したＢ細胞を、キャロルら（Ｃａｒｒｏｌ ｌ　ｅｔａｌ、、　１６４　Ｊ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 　１５６６、１９８６）が記載した細胞系に５Ｈ６／Ｂ５、または同等の細胞系 ［例えば５ＰＡＺ４、サンド（Ｓ　ａｎｄｏｚ）から入手可能、Ｅｈｒｌｉｃｈ 　ｅｔ　ａｌ、、　３４　Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅ＠、　１６８１．１９８８　参照コ とのハイブリドーマ融合により不滅化する方法がある。同様の細胞系は一般に利 用可能な方法で標準的手法により、容易に構築することができる。別法として、 免疫グロブリン遺伝子は、下記からクローンすることができる。（ａ）マルコバ ら（Ｍａｒｋｏｖａ　ｅｔ　ａｌ、。

３０　Ｖｏｐｒ　Ｖｉｒｕｓｏｌ　５４９．１９８５）が記載したように、Ｈｅ ｒｐｅｓ　ｐａｐｉｏ、またはその同等物を用いるウィルス形質転換により不滅 化した細胞、（ｂ）アマロソおよびリプスフ（ＡａＩａｒｏｓｏ　＆　Ｌｉｐｓ ｋｅ　１４５　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３１５５．１９９０）が記載したよ うに、単−Ｂ細胞クローニングによって一過性に不滅化された細胞、あるいは（ Ｃ）フスら（）Ｉｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　２４６５ｃｉｅｎｃｅ　１２７５． １９８９）およびマツクカフエティーら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、 　３４８　Ｎａｔｕｒｅ　５５２．１９９０）が記載したように、組換え免疫グ ロブリンバクテリオファーシライブラリ−を用いることにより。適当な抗体含有 クローンのスクリーニングは上記の方法、または当該技術分野で通常の技術者に とって既知の同等の方法によって行うことができ、所望の免疫グロブリン遺伝子 を不滅化細胞系から救出する。それに加え、単離したＢ細胞によって産生された 抗体は、キメラ抗体の生成のための以後の操作なしに、ヒトの治療に用いること ができる。

ヒト定常領域は当該技術分野で通常の技術者にとって既知の、任意の所望のイソ タイプを用いて、標準的な方法で得ることができ、そのヒト定常領域に、サル抗 体の可変領域を連結することができる。ヒトの免疫治療に有用な、特異的細胞表 面抗原受容体に対する、特に有用なキメラ抗体には、ＣＤ４、ＩＣＡＭ類、ＣＤ ｌ９、ＣＤ２０、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ１８、ＣＤ ４５、ＣＤ７１、およびＴＣＲが含まれる。

実施例３ ＣＤ４特異性を有するサル／ヒトキメラ抗体のクローニングおよび発現以下に、 本発明の方法および抗体の具体例を示す。

サル不滅化Ｂ細胞系の生成 成人ツノモルゲスサル　（ｌｈｉｔｅ　５ａｎｄｓ　Ｎｅｗ　１ｉｅｘｉｃｏ　 Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒより）を、標準的なアノユハントを用い、可溶性 ＣＤ４　（ｓＣＤ４）１５０−３００μｇまたはＣＤ４陽性細胞系５ｕｐＴ　ｌ の細胞膜（Ｉ　Ｘ　１０８細胞）により、複数部位で筋肉内投与により免疫化（ 免疫感作）した。２−３週ごとに、合計６回免疫した。

１方の太ももの付は根（凧径部）に５ＣＤ４　１００μｇを用いて追加免疫（ブ ースター）し、１週後、同じ太ももから外科的にリンパ節をとった。組織を切片 にし、滅菌ＤＭＥＭ培地ですすぎ、リンパ節からリンパ球を得た。細胞懸濁液を ナイロンカーゼに通し、１１００Ｏｘ、１０分間の遠心で集めた。

約１ｘｌＯ’個のリンパ球をトリス−塩化アンモニウムバッファー（１６１Ｍ。

ｐＨ７，５）に懸濁し、３７°Ｃで５分間暖めて赤血球を溶解した。リンパ球を 遠心して集め、Ｌ−ロインンメチルエステル（ＬＭＥ）に再懸濁し、３７℃で４ ５分間インキュベートした。ＬＭＥ処理した細胞をナイロンスクリーンでろ過し 、遠心した。ウソ胎児血清１ｍｌを加え、細胞を懸濁し、血清不含ＲＰＭＩで２ 回洗浄した。細胞を計数し、あらかじめ血清不含培地で洗浄しておいた、同数の に６Ｈ６／Ｂ５へテロ骨髄腫細胞と、１個の５０ｍ１コニカル遠心管内で混合し た。静かに撹拌しながら、１分間かけて５０％ＰＥＧを（ポリエチレングリコー ル）１ｍｌを加え、これに細胞を静かに懸濁した。次いで、静かに撹拌しながら 、５分間かけて血清不含培地２０１１を加えることにより、細胞を再懸濁し、Ｐ ＥＧを希釈した。血清不含培地で２回洗浄した後、細胞を密度５Ｘ１０’１０． １ｍｌで２０％０％ラン血清とゲンタマイ／ンとを含有するＲＰＭＩ培地に再懸 濁し、ウェルあたりＱ、１ｍｌで９６ウエルのマイクロ組織培養プレートに入れ た。等容量のＨＡＴ培地（０，１ｍ１）を各ウェルに加え、スクリーニングの前 に１４−１７日間、ハイブリッドを増殖させた。

抗ＣＤ４の製造のための融合細胞ハイブリッドのスクリーニング抗ＣＤ４特異性 の決定のための検定法は下記の通りであった。ＥＩｊＳＡプレートを組換え５Ｃ Ｄ４により、１度１１００ｎ／ウエルでコートし、ＰＢＳ中１％つ／血清アルブ ミンでブロックした。各ウェルからバイブリド−上清の１部（５０μｌ）をとり 、５ＣＤ４コートプレートと６０分間インキュベートした。＋２５１標識ヤギ抗 ヒトまたはヤキ抗サルＩｇＧと一緒に６０分間インキュベートすることによって 結合を検出した。蒸留水で４回洗浄した後、ガンマカウンターでウェルをカウン トした。陽性ウェルは、２回再検定し、これらのウェルからのノゾブリドーマ細 胞を３回（最初はウェルあたり５細胞、次いで２回、ウェルあたり１細胞）サブ クローンした。この段階て、細胞表面ＣＤ４との結合能力に関して抗５ＣＤ４陽 性をスクリーニングした。これは、抗ＣＤ４ネズミモノクローナル（ＩＦ３と称 する）のＣＤ　／４陽性細胞系５ｕｐＴ１への結合の阻害により行った。簡単に 述べると、これは、様々な量の、サル抗ＣＤ４とＬｏｎｇの１２５１−標識ＩＦ ３を、３Ｘ１０５ｓｕｐＴｌ細胞／ウエルを含む９６ウエルプレート内でコイン キュヘート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）することて行った。室温（約２０−２５ ℃）で１時間インキュベートした後、グラスファイ／＜−フィルター上に細胞を 吸引した。ＰＢＳで綿密に洗浄した後、５ｕｐＴ１細胞へのＩＦ３結合のサルハ イブリドーマ上清による明害を測定するために、ろ液をカンマカウンターでカウ ントした。

１Ｆ３に対する強い阻害を示す候補クローンを選択した。本発明者らが選択する クローンは、ヒトイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）試薬を用いてイソタイ プ決定を行ったところ、ラムダ軽鎖を有する１ｇＧ２であることが分かった。そ の免疫グロブリン遺伝子をクローニングするためにこの細胞株が多数になるまで 増殖させた。

サル不滅化Ｂ細胞から得た重鎮および軽鎖可変領域遺伝子のクローニング上記の ごとく、グアニジウム・イソノアナート法を用いて１ｘｌＯ’サル不滅化Ｂ細胞 から、全ＲＮＡを単離した。これもまた上記のごとく、オリゴ−ｄＴオリゴヌク レオチドプライマーと逆転写酵素により、１／１０の全ＲＮＡがら１水路ｃＤＮ Ａを作成した。ＰＣＲ反応に１／１０量の５ｓｃＤＮＡを用いた。６つのＰＣＲ 反応の各々では、５ａｌｌ制限部位を有する６個の５’　Ｖｏファミー特異的オ リゴヌクレオチドプライマープライマーの１個と、ＮｈｅＩ部位を有するＩｇＧ ３°定常領域オリゴヌクレオチド（いずれも図７−１に記載）を用いた。同様に 、ＢｇｌＩＩ部位を含有する５個の５°ラムダリーダー配列オリゴヌクレオチド ブライマーの１個と、ＡｖｒＩＩ部位を含有する３°ラムダ定常領域プライマー を用いる５つのＰＣＲ反応を行った。反応条件は上記の通りであった。各ＰＣＲ 反応は３回ずつ行った。各重鎮および軽鎖増幅反応の生成物を１．２％アガロー スゲル上で泳動させた。ＶＨ４重鎖プライマー（配列番号１３・５’　ＡＣＴＡ ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ３’　）およびラム ダプライマー（配列番号１４：５°　ＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴ ＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣ３°）はアガロースゲル電気泳動で 強いバンドを与えた。

これらの反応の生成物を、ヒト■ｇＧ１およびヒトラムダ定常領域配列を含有す るベクターＴＣＡＥ６にクローニングするのに用いた。

発現ベクターＴＣＡＥ６への２つの可変領域遺伝子のクローニングは連続的に行 った。まず、重ｆａＰｃＲ生成物とベクターＴＣＡＥ６とを制限酵素５ａｉｌお よびＮｈｅＩて消化し、次いで生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、５ ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２５スピンカラムに通した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在 下、１４℃で１夜、ＰＣＲ生成物を切断したベクターに連結した。挿入体（イン サート）／ベクターのモル比１０：１で、１０μｌの容量にて、全ＤＮＡ的５０ ０ｎｇを連結した。連結した物質を用いてＸＬ−ＩＢ］、ｕｅコンピテント細胞 （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、形質転換された細胞を５０μｇ／ｍｌ アンビンリン含有ＬＢ寒天培地にプレートした。アンピシリン耐性菌のコロニー を取り、５＋１のミニカルチャーとして培養した。これらの培養物から標準的な アルカリ溶解法でプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素５ａｉｌおよびＮｈｅＩ で切断し、生成物を１２％アガロースゲル上で泳動させた。以後の軽鎖可変領域 のクローニングには、約４５０ｂｐの挿入体を有するプラスミドを鋳型に用いた 。軽鎖ＰＣＲ反応の生成物を、重鎮挿入体を含有するプラスミドと同様、制限酵 素ＢｇｌＩＩおよびＡｗＩＩで切断し、−緒に連結した。プラスミドのミニカル チャーをＢｇｌＩＩおよびＡｗＩＩで切断することによりスクリーニングした。

約４００−４５０ｂｐの挿入体を与える消化物が陽性であった。、ＤＮＡのスク リーニングのために、５ａｉｌ／ＮｈｅＩ挿入体およびＢｇｌＩＩ、／＾ｖｒＩ Ｉ挿入体の両方を含有するプラスミドを大量に増殖させた。

タンデムキメラ抗体を発現するベクターＴＣＡＥ５．２およびＴＣＡＥ６は、ベ クターＲＬＤＮ　１０　ｂ　（２５３５ｃｉｅｎｃｅ　７７−７９　、１９９１ ）の誘導体であるベクターＣＬＤＮの誘導体である。ＲＬＤＮｌｏｂはまた、発 現ベクターＴＮＤ　（７ＤＮＡ６５１　６６１．１９８８）の誘導体である。

ＲＬＤＮｌｏｂはベクターとＴＮＤと以下の点で異なる。組織プラスミノーゲン アクチベーターカセット（ｔ−ＰＡ発現カセット）とネオマイシンホスホトラン スフエラーゼ（ＮＥＯ）カセットとの間にジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ ）転写力セント（プロモーター、ｃＤＮＡおよびポリアデニル化領域）が位置し ており、これら３つのカセットのすべてが同じ転写方向性でタンデムに並んでい る。さらに、ＣＬＤＮ中のＤＨＦＲ遺伝子プロモーターがマウスベータグロブリ ン主要プロモーター（３Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　ＢｉｏＬ　１２４６−５４．１９８ ３）で置換されており、ｔ−ＰＡｃＤＮＡはポリリンカーて置換されている。こ れら３つの真核性転写カセット（発現、ＤＨＰＲ，ＮＥＯ）のすべてが、細菌プ ラスミドＤＮＡ　（Ｔ）ＵＣ９誘導体）から、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔｌ による消化によってから分離できる。

ポリリンカーの前にあるラウス（Ｒｏｕｓｅ）　Ｌ　Ｔ　Ｒがヒトサイトメガロ ウィルス即時型遺伝子プロモーターエンハンサ−（４１Ｃａ１１．５２１．１９ ８５）で置換されているのて、ＣＬＤＮはＲＬＤＮｌｏｂと異なる。

発現ベクターＴＣＡＥ５．２およびＴＣＡＥ６は、ＣＬＤＮと以下の点で異なる 。

１）それらは４つの転写カセット（３つでなく）をタンデム配列で有する。

（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡの増幅によって導かれたヒト免疫グ ロブリン軽鎖定常領域。ＴＣＡＥ５．２内では、これはヒト免疫グロブリン軽鎖 カッパ定常領域（Ｋｏｂａｔのアミノ酸番号付けにより、１０８−２１４．アロ タイプＫｍ３）であり、ＴＣＡＥ６内では、ヒト免疫グロブリン軽鎖ラムダ定常 領域（Ｋｏｂａｔのアミノ酸番号付けにより、１０８−２１５．遺伝子型Ｏｚマ イナス、Ｍｃｇマイナス、Ｋｅマイナスアロタイプ）である。

（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎮定常領域二両方の構築物内で、ヒト免疫グロブリ ン重鎮はガンマ１定常領域（Ｋｏｂａｔの番号付けによりアミノ酸１１４−４７ ８アロタイプＧｍＩ　ａ、Ｇｍ］　ｚ）であり、これは、ポリメラーゼ連鎖反応 にょるｃＤＮＡの増幅によって導かれた。

（ｃ）ＤＨＦＲ；それ自身の真核性プロモーターとポリアデニル化部位を部位を 含有する。

３）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎮カッセトは免疫グロブリン鎖を分泌する ための合成シグナル配列を有する。

４）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎮カッセトは、翻訳リーディングフレーム を維持し、免疫グロブリン鎖内に通常見いだされるアミノ酸を変化させることな く軽鎖および重鎮免疫グロブリン可変領域を挿入することを可能にする。記述し た変化の導入により、ベクターＴＣＡＥ５．２およびＴＣＡＥ６が構築される。

抗−ＣＤ４ヘテロハイブリドーマ細胞系Ｅ９．１がら、ＴＣＡＥ６への免疫グロ ブリン軽鎖および重鎮可変領域遺伝子のクローニングにより、ＡＴＣＣに寄託さ れている構築物が得られる。寄託された構築物は、抗ＣＤ４ハイブリドーマ細胞 系Ｅ９．１からクローンされた、ンノモルグスザル免疫グロブリン重鎮可変領域 およびンノモルグスザル免疫グロブリン軽鎖可変領域（それぞれの配列は図１３ および図１４に示されている）を含有する。重鎮定常領域はガンマ１イソタイプ およびＧｍ１ａ、Ｇｍ１ｚアロタイプのヒト起源のものである。ラムダ軽鎖定常 領域も、Ｏｚマイナス、ｍｃｇマイナス遺伝子型およびＫｅマイナスアロタイプ の、ヒト起源のものである。免疫グロブリン遺伝子は哺乳類発現ベクターＴＣＡ Ｅ６（図６に記載）にクローンされ、それを哺乳類細胞系ＣＨＯに電気穿孔する と、サル／ヒト抗ＣＤ４キメラ抗体が産生された。本明細書に記載のＤＮＡ構築 物は、細菌株Ｘ　Ｌ　−ｌ　Ｂ］、ｕｅの形質転換に用いられ、抗生物質アンピ シリン中て選択され、１５％グリセリン含有滅菌ＬＢ培地中で細菌性細胞懸濁液 として寄託された。

もう１つの有用な発現系は、所望の配列をコードする組換え系の収率を高めるよ う、選択可能マーカーをコードする遺伝子が修飾されているものである。例えば 、優先的な選択可能マーカーの翻訳開始の損傷により、損傷されていないベクタ ーに比べて薬物耐性コロニー数が少なくなるが、損傷されていないベクター内に おけるよりも、個々のコロニーは有意に高レベルの共結合（ｃｏ−１ｉｎｋｅｄ ）遺伝子産物を発現する。例えば、翻訳開始はタンパク質合成の第１段階である 。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子）の翻訳 開始部位はコンセンサスＫｏｚａｋ　（配列−ｃｃＡｃｃＡＴＧＧ）からｐｏｏ ｒ　Ｋｏｚａｋ　（配列−ＣｃＴｃｃ、ＡＴＧＣ）に変化された。Ｇ４１８耐性 遺伝子の翻訳開始損傷は、１）同量のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされ た細胞から得られるＧ４１８耐性コロニー数の有意な減少（５倍）、および２） 各クローン内で発現される共結合生成物遺伝子量の有意な増大、をもたらす。コ ンセンサスＫｏｚａｋを含有するクローンにおいて、スクリーンされたコロニー の７３％で生産量が２５％ｇ／ｍ１以下であり、わずか３％が１００％ｇ／ｍ１ 以上を生産した。変化し、ｐｏｏｒｅｒ　Ｋｏｚａｋを有するクローンでは、ス クリーンしたコロニーの６３％が１１００ｎ／ｌ１ｌ１以上の生ｑを示したのに 対し、８％が２５　ｎｇ／’ｍ１以下の生産を示した。具体的には、図１６（該 図では、ＴＣＡＥ５．２がコンセンサスＫｏｚａｋを有し、ＴＣＡＥ１２がｐｏ ｏｒｅｒ　Ｋｏｚａｋを有する）を参照すると、コンセンサス（変化していない ）翻訳開始部位を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有す るＤＮＡ２５μｇの２回の電気穿孔で２５８コロニーが導かれた。これらのコロ ニーの２０１　（７８％）がなんら検出可能な遺伝子産物を発現せず（即ち、キ メラ免疫グロブリンが、＜　２５％ｇ／ｍｌ）　、８コロニー（３％）のみが１ １００ｎ／ｍ１以上発現した。変化した翻訳開始部位を有するネオマイシンホス ホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ２５μｇの６電気穿孔で９８コロ ニーが導かれた。これらのコロニーの６３％は１１００ｎ／ｍ１以上の発現を示 し、これらコロニーのわずか８％が２５％ｇ／ｍ１以下の発現を示した。

ＤＮＡ配列決定 １００ｍ１の培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。これを、２．５Ｍ塩化ナ トリウムおよび２０％ポリエチレングリコール（６容量）の混合物を用いて氷上 で１５分間沈澱させる（１容量）ことにより、さらに精製した。１０．ｏｏｏｘ ｇで２０分間遠心した後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、再遠心し、５ ｐｅｅｄｉｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ）中で乾燥した。ＤＮＡペレットを脱イオン 水中に濃度１５０−２５０μｇ／ｍｌで再懸濁した。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ） の方法を用いて２本鎖ＤＮＡ５μｇに関して配列決定を行った。発現ベクター内 の、軽鎖または重鎮挿入体のいずれかの上流または下流の配列に相同な配列決定 プライマーを用いた。挿入体を５′から３′および３′から５“の両方向に配列 決定した。それぞれ別々のＰＣＲ反応で生成された、抗ＣＤ４軽鎖の２つのクロ ーンおよび抗ＣＤ４重鎖の２つのクローンを、ＰＣＲ反応の間になんらかのヌク レオチド変化が導入されたか否かを調べるために、並行して配列決定した。選択 した重鎮クローンの両方、および軽鎖クローンの両方は、全長を通して同一であ ることが分かり、増幅工程の間にエラーが起きなかったことを確認した。抗ＣＤ ４重鎖および軽鎖の配列を図１３および図１４、並びに配列番号１５および１６ に示す。

発現ベクターＴＣＡＥ５．２およびＴＣＡＥ６は、細胞系５ｐ２１０およびＣＨ Ｏに安定に組み込まれ発現され得るのみならず、ＳＶ４０複製起点を有するので 、細胞系ＣｏＳ内で一時的に発現させることもできる。ＣＯ８細胞発現は下記の ごとく行われた。トランスフェクションの１日前にＣＯ８細胞を播種し、翌日に は５０−７０％の全面成長にした。培養培地を除去し、細胞をトランスフェクン ヨンパッフ７　（ＴＢ−１４０ｍＭ　ＮａＣ１，２５＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ、５ｍ Ｍ　ＫＣＩ、０．５ｍＭ　Ｎａ、２ＨＰ０４．１ｍＭ　ＭｇＣｌ４．１ｏ＋Ｍ　 ＣａＣ１ｚ）で２回洗浄した。塩化セシウムで精製した、抗ＣＤ４サル／ヒトキ メラ重鎮および軽鎖免疫グロブリン鎖を含有するＴＣＡＥ６ブラスミド３０μｇ をＤＥＡＥデキストラン３＋１／ディッンユと混合した（ＴＢ中１ａ＋ｇ／＋ｏ ｌ）　。ＤＮＡを細胞と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ溶液 を除去し、１．５−２．５分間、２０％グリセリン３ｍｌで置換した後、細胞を ＴＢで２回洗浄した。細胞を１００μＭりｏロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ） を含有する新鮮な培地５ｍｌ中、３７℃で３−５時間インキュベートした後、培 地で２回洗浄し、通常のＤＭＥＭを用いて７２時間インキュベートした。トラン スフェクトしたＣＯ８細胞から得た上清（１００μｍ）をＥＬＩＳＡに基づく方 法で、様々な希釈度において、抗体の存在に関して分析した。

ヤギ抗ヒトラムダを用いて９６ウエル検定プレートをコートし、標準的なＥＬＩ ＳＡ条件の下、ベルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを検出抗体に用いた。Ｃ Ｏ８細胞は１０から４Ｑｎｇ／ｍｌのサル／ヒトキメラ抗体を産生ずることが分 かった。より多量の上清を１０倍濃縮し、ＣＤ４陽性５ｕｐＴ１細胞への、直接 結合ＲＩＡに用いた。親の全サル抗体および無関係なヒト免疫グロブリンを、そ れぞれ、陽性および陰性対照として用いた（図１１）。さらに、サル抗ＣＤ４お よびサル／ヒトキメラ抗ＣＤ４を、高親和性マウス抗ＣＤ４　（ＩＦ３）抗体の 結合阻害に用いた（図１２）。サル／ヒト組換え抗体（ＡＴＣＣＮｏ、　）はＣ Ｄ４陽性細胞に結合するのみならず、全サル抗体または１．Ｆ３それ自身とほぼ 同じ濃度で、ＩＦ３とＣＤ４陽性細胞との結合を阻害することができた。

以下に本発明の方法および抗体の例を示す。

実施例４ ヒトリンパ球抗原に対するサル抗体の生成成人ジノモルゲスザル　（ｆｈｉｔｅ 　５ａｎｄｓ　Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒより）を 、５ｘｌＯ＠個の全ＣＤ５４陽性ヒトリンパ球を用い、複数部位で筋肉内投与に より免疫化（免疫感作）した。あるいは、用いた細胞は、ＳＢ細胞にトＢリンパ 系細胞）およびアメリカヤマゴボウ分裂促進因子（２，５ｍｇ／ｍｌ）　、ホル ボールモノアセテート（４０ｎＭ）およびフィトヘマグルチニン（４ｍｇ／ウェ ル）の混合物とブレインキュベーションすることにより活性化した、活性化末梢 ヒトリンパ球であり標準的なアジュバントをも含めた。免疫化は、８力月かけて ２−３週ごとに繰り返した。様々な時に、免疫した動物の血清をＩＣＡＭ−１に 結合することが知られている、ネズミ抗体、８４Ｈ１０の結合阻害によりスクリ ーンした。

あらかじめヒトＣＤ５４ｃＤＮＡ含有ベクターでトランスフェクトし、細胞表面 ＣＤ５４の高発現に関して選択しておいたチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ ＨＯ）に、サル血清の希釈度の増大と共に、飽和量の８４Ｈ１０が結合した。８ ４Ｈ１０結合の阻害は図１５に記載されている。

他のヒトリンパ球抗原を認識する他のネズミモノクローナル抗体を、同じ免疫上 記の方法又はそれと同様の手法によって調製した抗体はアフィニティー及びサイ ズ排除クロマトグラフィーの組合わせによって精製することができ、そして機能 的な生物学的検定にて特性化することができる。これらの検定は、発現アイソタ イプ、例えばＡＤＣＣに関連する特異性及び結合親和性並びにエフェクター機能 又は補体結合性を測定するものである。このような抗体は、多くのヒト疾患、例 えばＢ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳなどの感染症、自己免疫疾患及び炎症疾患、移植 などに対する受動又は能動治療物質として使用することができる。本発明の抗体 は、天然の形態で、又は抗体／キレート剤、抗体／薬物もしくは抗体／毒素複合 体の一部としていずれも使用可能である。さらに、全抗体又は抗体断片（Ｆａｂ ２、ＦａｂＳＦｖ）もイメージング試薬又は、抗−イディオタイプ応答を生成さ せるための能動免疫療法における可能性あるワクチンもしくは免疫原として使用 することができる。

治療効果を上げるために有用な抗体の量は、当業者に周知の標準的な手法によっ て測定することができる。一般に、抗体は標準的な手法によって製薬的に許容さ れ得る緩衝液中に提供されるが、あらゆる所望の経路によって投与することがで きる。本出願にて特許請求している抗体の効能及びそのヒトにおける寛容性のお かげで、ヒトの種々の疾患又は疾患症状に抵抗するため、反復して投与すること が可能である。

本発明の抗−ＣＤ４組換え抗体（又はその断片）は免疫抑制を誘導、即ち、ヒト 又は動物の免疫系の抑制を誘導するのにも有用である。従って、本発明は、ヒト 及び他の動物において予防的又は治療的に免疫抑制を誘導するための方法であっ て、それを必要としているヒト及び他の動物に本発明の抗体の有効かつ非毒性量 を投与することを特徴とする方法を提供する。

本発明の化合物における免疫抑制誘導の能力は、この目的のために使用される標 準的な試験、例えば混合リンパ球反応試験又はチミジン取り込みによって測定さ れるＴ細胞増殖の阻害性を測定する試験などによって証明することができる。

本発明の抗体が免疫抑制手段を誘導するものとして利用できる事実から、移植器 官又は組織（例えば、腎、心臓、肺、骨髄、皮膚、角膜など）に対する抵抗性又 は拒絶の処置又は予防、自己免疫疾患、炎症、増殖性及び超増殖性疾患、及び免 疫学的に治療された疾患の皮膚症発現（例えば、慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘉 、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖 尿病、ぶどう腋臭、不フローゼ症候群、乾癖、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎及 びさらなる湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、Ｌｉｃｈｅｎ　ｐｌａｎｕｓ、　Ｐｅ ｍｐｌｕｇｕｓ、水庖性天庖癒、表皮水庖症、奪麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑 、皮膚性好酸球増加症、円形脱毛症）の処置又は予防、可逆性気道閉塞症、腸管 炎症及びアレルギー（例えば、腹腔疾１ｉ１．（Ｃｏｅｌｉａｃ　ｄｉｓｅａｓ ｅ）、直腸炎、好酸球増加胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、及び消化性大腸炎 ）、及び食物関連アレルギー（例えば、偏頭痛、鼻炎、湿疹）の処置に有用であ る。

−当業者ならば、通常の実験によって、免疫抑制を誘導するための抗体の有効か つ非毒性の量を決定することができるであろう。しがし、一般に、有効量は約０ ０５−１００菖ｇ／ｋｇ体重／日である。

本発明の抗体（又はその断片）はまた哺乳動物の腫瘍を処置するうえでも当然な がら有用である。より詳細には、本発明の抗体又はその断片は腫瘍サイズを減少 させ、腫瘍の発育を抑制し、及び／又は腫瘍を有する動物の生存時間を延長させ るのに有用であるはずである。従って、本発明はさらに、ヒト又は他の動物の腫 瘍を処置するための方法であって、そのようなヒト又は動物に有効かつ非毒性量 の抗体を投与することを特徴とする方法をも提供するものである。当業者であれ ば、通常の実験によって、癌性腫瘍を処置するための抗体の有効かつ非毒性な量 を決定することができるであろう。しかし、一般に、有効量は約０．　０５−１ ００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

本発明の抗体の投与は、その作用を治療的又は予防的な程度にさせるに充分な量 で上記の処置方法に従ってヒト又は他の動物に行うことができる。本発明の抗体 は通常の製薬的に許容し得る担体又は既知手法における希釈剤と混合することに よって製造される通常の投与剤形としてヒト又は他の動物に投与することができ る。当業者ならば認識できるように、製薬的に許容され得る担体又は希釈剤の列 形及び特性は混合する活性成分の量、投与経路及び他の周知の変動事項によって 左右される。

本発明の抗体（又はその断片）の投与経路は経口、腸管外、吸入又は局所投与で あってよい。本明細書にて使用する腸管外なる用語は静脈内、筋肉内、皮下、直 腸、膣又は腹腔内投与を包含する。皮下及び筋肉内設与剤形の腸管外投与が一般 に好ましい。

免疫抑制を予防的もしくは治療的に誘導するため、又は癌性腫瘍を治療的に処置 するうえで本発明化合物を使用するための１日当たりの腸管外及び経口投与の計 画は、一般に約０．０５−１００＋＋ｇ／ｋｇ体重／日の範囲であるが、好まし くは約０．５−１０鼠ｇ／ｋｇ体重／日である。

本発明の抗体は吸入によっても投与することができる。「吸入」とは、鼻腔内及 び経口吸入投与を意味する。エアロゾル製剤又は計量吸入器などによるこのよう な投与方法の適当な投与剤形は常法によって調製することができる。使用される 本発明の化合物の好ましい投与量は一般に約１０−１００ｍｇの範囲である。

本発明の抗体は局所的に投与することもできる。局所投与とは非全身投与を意味 し、本発明抗体（又はその断片）の外部的な表皮への適用、口腔内、眼、鼻、及 び血流へは顕著に侵入しない部分などへの適用が包含される。全身投与とは経口 、静脈内、腹腔内及び筋肉内適用を意味する。治療的又は予防的効果に要する抗 体の量は当然ながら、選択する抗体、処置する症状の性質と重篤度及び処置する 動物に応じて変動し、最終的には臨床医の決定に委ねられる。本発明抗体の適当 な局所投与量は一般に約１−１００＋＋ｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。

製　剤 抗体又はその断片は単独で投与できるが、医薬製剤として用いるのが好ましい。

局所適用では活性成分は１製剤重量当たりｏ、ｏｏｉ％−１０％ｗ／ｙ、例えば １％−２％とすることができるが、５％Ｗ／Ｗ以上にしないことが好ましく、０ ．１％−１％ｖ／ｗがより好ましい。

本発明の局所製剤は、１つ又はそれ以上の許容し得る担体（群）、及び要すれば 他の医薬成分（群）と共に活性成分を含有する。担体は製剤の他の成分との適合 性と受容者に害を与えない観点から許容されるものでなければならない。

局所適用にとって適当な製剤にはヒフを介して処置が必要な部位に浸透するに適 した液状又は半液状調製物、例えばリニメント剤、ローション剤、クリーム剤、 軟膏剤又はペースト剤、及び眼、耳又は鼻に適した点滴剤が包含される。

本発明の点滴剤は滅菌水性又は油性溶液又は懸濁液を含有でき、その製造は殺菌 及び／又は殺真菌剤及び／又は他の適当な保存剤、好ましくは表面活性剤を含有 させた適当な水性溶液に活性成分を溶解させることによって行われる。次いで、 得られた溶液を濾過によって清澄化し、適当な容器に移し、次いでそれに栓をし 、オートクレーブ又は９０−１００℃半時間の保存によづて滅菌する。あるいは 、得られた溶液は凍結乾燥によって滅菌することができ、それを隔壁手法によっ て容器に移す。点滴剤に入れるに適した殺菌及び殺真菌剤は例えば、硝酸又は酢 酸フェニル水ｍ（０，００２％）、ベンゾアルコニウム・クロリド（０，０１％ ）、及び酢酸クロルヘキシジン（領　０１％）などである。油状溶液の調製に適 した溶媒はグリセリン、希釈アルコール、及びプロピレングリコールなどである 。

本発明のローション剤には、ヒフ又は眼への適用に適したものなどがある。眼ロ ーノヨンには、要すれば殺菌剤を含有させた滅菌水溶液があり、それは点滴剤の 調製の記載と類似の方法によって製造することができる。ヒフの適用に適したロ ーション剤又はリニメント剤には乾燥を促進させ、またヒフを冷やす物質、例え ばアルコール又はアセトン及び／又はグリセリンなどの湿潤化剤、又はひまし油 もしくはアラキス油などの油を含有させることもできる。

本発明のクリーム剤、軟膏剤又はペースト剤は外部適用のための活性成分の半固 形製剤である。これらを製造するには、活性成分を細かに分離した形態又は粉末 形態に単独で、又は水性もしくは非水性液中の溶液又は懸濁液内で適当な機械を 用いて脂又は非脂ベースで混合する。このベースには、硬、軟又は液状パラフィ ン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸などの炭化水素；粘漿剤、アーモンド、トウモ ロコシ、アラキス（ａｒａｃｈｉｓ）、ひまし油又はオリーブ油；羊毛脂又はそ の誘導体、又はプロピレングリコール又はマクロゴールなどのアルコールと共に ステアリン酸又はオレイン酸などの脂肪酸を含有させることができる。この製剤 には、陰イオン、陽イオン、又は非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエス テル又はそのポリオキシエチレン誘導体などの適当な界面活性剤を含有させるこ とができる。

天然ゴム、セルロース誘導体又は無機物質、例えばケイ質シリカ、及びラノリン などの他の成分も含有させることができる。

当業者ならば、本発明抗体又はその断片の個々の投与の最適な量及びその間隔は 、処置する症状の性質及び程度、列形、投与経路及び部位、並びに処置する個々 の動物に応じて決定でき、これらの最適なものは常法によって決定できる。さら に、当業者ならば、処置の最適な方法、即ち本発明抗体又はその断片の規定され た日数における１日当たりの投与回数は通常の処置決定試験によって当業者が究 明できることも理解されよう。

これ以上の詳細を記載するまでもなく、当業者ならば、本発明をその完全な範囲 で利用できるものと理解している。従って、以下の説明は単なる説明の例示であ って、いかなる意味においても本発明の範囲の限定を意図するものではない。

カプセル組成物 カプセル剤の形態にある本発明の医薬組成物は、標準的な２片のゼラチン硬カプ セルに粉末形態にある本発明の抗体又はその断片５０ｍｇ、ラクトース１００１ ｇ、タルク３２ｍｇ、及びステアリン酸マグネシウム８ｍｇを充填することによ って製造される。

注射用腸管外組成物 注射による投与に適した形態の本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又はその断 片１．５重量％を１０重量％プロピレングリコール及び水中で撹拌することによ って製造される。得られた溶液を濾過して滅菌する。

軟膏組成物 本発明の抗体又はその断片１．Ｏｇ 白色軟パラフィン１００．０ｇまで。

本発明の抗体又はその断片をそのビヒクル少量に分散させ、滑らかな均質産物を 得る。次いで、その分散物を折りたたみ金属チューブに充填する。

局所クリーム組成物 本発明の抗体又はその断片１．　０ｇ ポーラ”ｙ・ｙクス（Ｐｏｌａｗａｘ’）Ｇ　Ｐ　２００　２０．　０　ｇ無水 ラノリン２．０ｇ 白色蜜蝋２．５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチル０１ｇ 蒸留水１００．０ｇまで。

ポーラワックス、蜜蝋及びラノリンを一緒に６０℃に暖める。ヒドロキシ安息香 酸メチルの溶液を加え、高速撹拌によって均質にする。次いで、温度を５０℃に 下げる。本発明の抗体又はその断片を加え、完全に分散させ、得られた組成物を 低速度で撹拌させながら冷却する。

局所ローション組成物 本発明の抗体又は抗体断片１．０ｇ モノラウリン酸ランルビタン０．６ ポリソルベート２００．６ｇ セトステアリール・アルコール１．２ｇグリセリン６．０ｇ ヒドロキシ安息香酸メチル０２ｇ 精製水ＢＰ、を１００．　００＋＋ｆまで（Ｂ、　Ｐ、　＝英国薬局方）ヒドロ キシ安息香酸メチル及びグリセリンを水７０ｗ１．に７５℃にて溶解する。

モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０及びセトステアリール・アルコ ールを７５℃にて共に融解し、先の水溶液に加える。得られたエマルジョンをホ モジナイズし、連続して撹拌しながら冷却し、本発明の抗体又はその断片を残り の水中懸濁液として加える。全懸濁液が均質になるまで撹拌する。

点眼側組成物 本発明の抗体又はその断片０．５ｇ ヒドロキシ安５り香酸メチル０、Ｏ１ｇヒドロキシ安息香酸プロピル０．０４ｇ 精製水Ｂ、Ｐ、１００．０Ｃｈｌまで。

ヒドロキシ安叡香酸メチル及びプロピルを精製水７０ｍ１に７５℃にて溶解し、 得られた溶液を冷却する。次いで、本発明の抗体又はその断片を加え、その溶液 をフィルター膜（０，０２２μ胃孔サイズ）で濾過して滅菌し、適当な滅菌容器 に充填する。

吸入投与用の組成物 １５　２０ｍ１容量のエアロゾル容器用二　本発明の抗体又はその断片１０ｍｇ をポリソルベート８５又はオレイン酸などの滑沢剤０．　２−０．　５％と混合 し、得られた混合物をフレオン、好ましくは（１，２−ジクロロテトラフルオロ エタン）及びジフルオロクロロメタンの組合わせ物などの噴射剤中に分散させ、 それを経鼻又は経口吸入投与のいずれかに適した適当なエアロゾル溶液に入れる 。

吸入投与用の組成物 １５　２０ｍｆ容量のエアロゾル容器用：　本発明の抗体又はその断片１０ｍｇ をエタノール（６−８１１）に溶解し、０．１−０．２％滑沢剤、例えばポリソ ルベート８５又はオレイン酸を加え、得られた混合物をフレオン、好ましくは（ １゜２−ジクロロテトラフルオロエタン）及びジフルオロクロロメタンの組合わ せ物などの噴射剤中に分散させ、それを経鼻又は経口吸入投与のいずれかに適し た適当なエアロゾル溶液に入れる。

本発明の抗体及び医薬組成物は腸管外投与、即ち皮下、筋肉内又は静脈内用に特 に有用である。腸管外投与のための組成物は普通、許容し得る担体、好ましくは 水性担体中に溶解した本発明の抗体又はその断片の溶液、又はそれらのカクテル を含有している。種々の水性担体、例えば水、緩衝化水溶液、０．４％食塩水、 ０．３％グリノンなどを使用できる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状 物質を含有していない。これらの溶液は通常の周知の滅菌手法によって滅菌する ことができる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤及び緩衝化剤などの適当な生理学 的条件に必要な製薬的に許容し得る補助物質を含有できる。このような医薬製剤 における本発明の抗体又はその断片の濃度は幅広く変動でき、即ち約０．５重量 ％以下、通常は約１重量％又は少なく約１重量％から１５又は２０重量％までと 変動でき、主として体液量、粘性等、選択する具体的な投与態様に応じて選択さ れる。

従って、本発明の筋肉内投与用医薬組成物は、滅菌緩衝水１１／、本発明の抗体 又はその断片５０＋＋ｇを含有するよう製造することができる。同様に、静脈投 与用の本発明医薬組成物は滅菌リンゲル液２５０ｍ７！、及び本発明の抗体又は その断片１５０１ｇを含有するよう製造することができる。腸管外がら投与可能 な組成物の実際の製造方法は周知であって当業者には明らかであり、例えＩＪ、 、　Ｒｅｉｉｎｇｔ。

ｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１５編、　Ｍａｃ ｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　イーストンB ペンシルバニアに詳細に記載されているにれを引用によって本明細書に包含させ るコ。

本発明の抗体（又はその断片）は凍結乾燥して保存でき、そして使用前に適当な 担体にて再構成できる。この手法は通常の免疫グロブリンにて有効であることが 示されており、当業者に知られている凍結乾燥及び再構成手法が使用できる。

目指す結果に応じて、本発明の医薬組成物は予防的及び／又は治療的処置のため に投与することができる。治療的適用では、疾患及びその合併症を治癒させ、又 は少なくとも部分的にそれらを抑制するに充分な量で組成物を、既に疾患に罹患 している患者に投与する。予防的適用では、本発明抗体又はそのカクテルを含有 する組成物を、既に疾患状態ではない患者に投与し、患者の抵抗性を増大させる 。

医薬組成物の単回又は頻回投与は、処置する臨床医が選択した用量レベル及びパ ターンで行うことができる。いずれにしても、本発明の医薬組成物は患者を有効 に処置するに充分な本発明の改変抗体（又はその断片）の内容量を提供できるは ずである。

さらに、本発明の抗体は、抗体と同じ治療方法に有用であるペプチド又は非ペプ チド化合物（模擬物質）の設計及び合成に使用することができる。例えば、５ａ ９９２年７月９日になされた。

出願人及びその譲受人は、発行された特許の期間が満了する前、培養物の最後の 要求の５年後、又はいずれにせよ３０年間、その培養物が死滅したなら交換すべ き義務、及び寄託物が変更できない状態で公に入手可能になった時点で、このよ うな特許の発行を寄託機関に通知すべき義務、を承知している。この時までは、 寄託物は３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，セクション１−１４及び３５Ｕ、　Ｓ、　Ｃ，セ クション１１２の下に特許庁長官に入手可能となっている。

他の態様は以下の請求の範囲に包含される。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）　特許出願人：　ローランド・エイ・ニューマンネイビル・ハンチ ローランド・ダブりニー・ラーゾ （ｉｉ）　発明の名称：　ヒトの治療のためのキメラ抗体（ｆｆｉ）　配列の数 二　１６ （汁）連絡先： （Ａ）　宛名ニライオン＆ライオン （Ｂ）　通り・ウェスト・シックスス・ストリート６１１番（Ｃ）　市：ロス・ アンシェルス （Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：０２１１１−２６５８（ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型：３．５”ディスケット、１．４４Ｍｂ記憶装置（Ｂ）　コンピ ューター：ＩＢＭ適合 （Ｃ）　オペレーティング・システム　ＩＢＭ　Ｐ、Ｃ，（、バージョン５０） （Ｄ）　ソフトウエア：ワードパーフェクト（バージョン５．０）（ｖｉ）　本 出願のデータ （Ａ）　出願番号・ （Ｂ）　出願日 （Ｃ）　分類。

（ｖｉ）　優先権主張出願のデータ： 優先権主張出願の総数二次に記載の２通（Ａ）　出願番号：０７／８５６，２８ １（Ｂ）　出願日・１９９２年３月２３日（Ａ）　出願番号＋０７／７３５．０ ６４（Ｂ）　出願日：１９９１年７月２５日（ｍ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名：ワーバーグ、リチャード・ジエイ（Ｂ）　登録番号：３２．３２ ７ （Ｃ）　参照／整理番号・１９８／１５８（ｉＸ）電話連絡先情報 （Ａ）　電話番号＋　（２１３）４８９−１６００（Ｂ）　ファックス番号：　 （２１３）９５５−０４４０（Ｃ）　テレックス　６７−３５１０ （２）配列番号１の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）　長さ・１７ （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数、１本鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （Ｘｌ）配列、配列番号１： ＣＣＡＴにＧＡＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＧＧ（３）、配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・２０ （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数・１本鎖 ＣＤ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号２・ ＡＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣ（４）配列番号３の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・２０ （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数：１本鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （カ）配列：配列番号３： ＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴ　ＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ２０（５）配列番号４の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ・２０ （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数　１本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎮状 （Ｘｌ）配列　配列番号４ ＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴにＴＧＧＴＴＣＴＴ　２０（６）配列番号５の情報 （１）配列の特徴−・ （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数・１本鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （Ｘｌ）配列・配列番号５ （７）配列番号６の情報 （１）配列の特徴・ （Ａ）　長さ・２０ ＭにＡＣＡＧＡＴＧ　ＧＴＧＣＡＣＣＣＡ　１９（１３）配列番号１２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ　２０ （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数　１本鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）　配列　配列番号１２ に（、ＡＡＣＡＧＡＣ；Ｔ　ＧＡＣＣＧＡＧＧにＧ　２０（１４）配列番号１３ の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　３１ 、（Ｂ）型　核酸 （Ｃ）　鎖の数　１本鎖 （Ｄ）　トポロン−直鎖状 （刀）配列　配列番号１３ ＡＣＴＡＡにＴＣにＡ　ＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴ　Ｔ　３工 （１５）配列番号１４の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　３９ （Ｂ）　型　核酸 （刀）配列　配列番号１６ （Ｃ）　鎖の数：１本鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｊ）　配列　配列番号１４； ＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＣＣＭ；ＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣ ＣＴＣＣコ９（１６）配列番号１５の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）　長さ・４２３ （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数　１本鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号１５ ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＧ　ＴｒＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ Ｇ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＣＣＣＡＧＡ　４８ＴＣ；ＣＧＴＣＴＴＧ　ＴＣＣ ＣＡＧ　ＧＴＣ；　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＣＣＡ　 ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　９U ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡ ＧＴ　ＧＴＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＴＣＣ１４４ＡＴＣＡＧＣＧＧＴ　ＣＡＣ ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　Ｔ＋ｒＣＴＧＧ　ＡＴＣＣＧＣＣＡＧ　ＴＣＣＣＣＡ 　ＧにＧ　ＡＡＧ　１９２ＧＧＡ　ＣＴＣＧＡに　ＴＧＧ　ＡＴＣＧＧＣＴＡＣ ＡＴＣＴＡＴ　Ｇ＋、ＣＡＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＣＡＣＣＡＡＴ　２４０ ＴＡＣＡＡＴ　ＣＣＣＴＣＣＣＴＣＭＣＭＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＴＣＣＡＴＴ　Ｔ ＣＡ　ＡＴＡ　ＧＡＣＡＣＧ　ＴＣＣ２８８ＡＡＧ　ＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣ ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＧに　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＡＣＣＧＣＣＧＣＧ　ＧＡ ＣＡＣＧ　３３６ＧＣＣＧＴＣＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＴ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＭＴ　 ＡＴＡ　ＴＴに　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＴ’ｒ　ＣＡＣＴＧに　ＴＴＡ　３８４Ｔ ＴＡ　ＴＡＣＴＧＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＴ ＣＴＣＣ，ＴＣＡ　、　−４２３（１７）配列番号１６の情報 （］）配列の特徴 （Ａ）　長さ・３８７ （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 ＡＣＣＡＴに　ＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＴＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣ（ＴＴＣＧＧＣＣ ＴＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣ’［’！Ｔ　ＡＣＡ　４８ＧＡＣＴＣＴ　ＧＣＧ　 ＧＣＣＴＣＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＣＧＣＴＣＡ 　ＧＴＧ　ＴＣＣＧＴＧ　９６ＴＣＣＣＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ ＧＧＧ　ＴＴＣＡＣＣＴＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣＭＣＧＴＴ　ＧＧＡ　１ ４４ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ 　ＭＧ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＣＣＴ　ＧＴＧ　１９Q −ＮＦｌ　ｙ　の　−〜円　曽 ：ｅ−ｙ　ｓ　：Ｉ：ｇ　ｇ　ｘｚ　ｘ　ｘｓ　ニーｇｇｇ　＋ｒ、ｇ＞＞＞＞ ＞　＞＞＞　＞ （Ｊ（Ｊ（ＪＵｈ？ｓ−＋ｔＪｔＪｕ　ｕｕｕ＋ｈｈ←ＬＩＣＪ−Ｑυυｕａａ ａｕｖｖ　ｕｕｕａ口。０υＱ←←Ｆ４←←←ト←トド　トトト←トトト←トＬ コン５　ｌ； Ｆ／Ｇ、　６ ＳＶ　０Ｒ１＝ＳＶ４０起点 ＣＡＥ　６ ヒト１ｇｃ＋ｌ及びラムダ定常領域を含有サル免疫クロプリン重鎮可変領域の増 幅のためのプライマーＡ、５ａｌ１部位を含有するヒト又はサル重鎮初期リーダ ー配列プライマーＶ、＋３５’　ＡＣＴＡＡ二甚ＡＴＧＧＡＧＴｎＧＧＧＣＴＧ ＡＧＣ３’ＶＨ４５’ＡＣＴん嵯迂σシ五込ＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴｒ Ｃ−口′３′■Ｈ５５°ＡＣＴＡＡＱ■ｘ込ΩＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＣＣ ＡＴＣＣＴ３’ＶＨ６５’ＡＣＴＡＡ印二頭ＱＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴｒＣ ＣＴＣＡＴ３’Ｂ、Ｍｌｕ１部位を含有するヒト又はサル重鎮後期リーダー配列 プライマー＋１ ＶＨｌ　５’ＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（ＣＴ）ｉＧｃｃｃＡｃＴｃｃＧＡＧＧＴ３’ ＋１ ＶＨ２５’ＧＡＣＣＧＴＣＣＣＧ］ＧＴ（ＴＣ）ｎＧＴｃｃｃＡＧＧＴ３’＋１ ＶＨ３５’　ＧＣＴ　Ａ“ロ°−ローｃｍ返］ＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧ３’＋ １ ＶＨ４５’ＧＣＧＧＣＴＣＣＣＪＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧ、１３’＋１ ＶＨ５５’ＧＧＣＴＧｎＣＴＣＪＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴ３’サル免疫グ ロブリン軽鎖可変領域の増幅のためのプライマー３′「アンチセンス」プライマ ー Ｂｓ１ＷＩ ｐｎ　Ｉ ｗｌｌ Ａ７重鎮可変領域。

ＶＨｌ　５’　ＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧ３’ＶＨ２５’　ＡＴＧＧ ＡＣＡＴＡＣｍＧＴＴＣＣＡＣ３’ＶＨ５５’　ＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＣ ＣＡＴＣＣＴ　３”ＶＨ６５’　ＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴｒＣＣＴＣＡＴ３ ’Ｂ、　！鎖定常領域アンチセンス鎖 ÷１１９　＋ｌ１５ １ｃ）Ｍ　５’　ＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴ３’今１１９　＋１１５ １（ＩＧＩ−４５’　ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡ　３’ヒトコンセン サスＶｌ−１１配列とクローン化サル可変領域との比較Ｓ　Ｑ ＡＫＬＧ　Ｒ１−Ｉ Ｑ　ＥＲ工　Ｔ　ＫＶ ＸＶＯＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＸＳＶＸＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ　ＤＸＸｌＨ ＷＶＲＱＡＰＧＸＧＬＥＷＸＧ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−ＦＮ−Ｇ　ＭＹＡＬＳ　−−−−−−−−−−−−−−−−−Ｑ−−− −−−−−−−−Ｔ−−−−−−−−−−−−−Ｔ　、ｍ二Ｎ＝−−−−−−− Ｖ−−−Ｓ−Ｊｐ　”　Ｉ’　ＲＶＴＸＴＸＤＸＳＸＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲ５ ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩｆ　−一−Ｆ−＋１−−−−−−−−−ＸＩ−Ｌ　Ｋ− −−−−−−−−−−Ｉ−／　ｐ　−−−−−−−−−−一−−−−−−Ｎ−− −−−−−−−ｍ−−−−；　′　ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ　ヒトＶｌ−１１コ ンセンサ：ＡＦＩＧ、　９ａ ヒトＶＨ２コンセンサス配列とクローン化サル可変領域との比較ＸＶＴＬＲＥＳ ＧＰＸＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ　５　Ｗ工ＲＱＰＰＧＫＸＬ ＥＷＬＡ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−Ｗば 、Ｓ　−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−一−−−−−−−Ａｆユバ２−−−−Ｓ−−−−−−−−Ｔ−−−−−一 一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一エユニＵバＵ　−−−−− −一−−−−−−−ｈＪＶＳＳＶ　Ｇ Ｔ　Ｐ　Ｙ　Ｔ　ＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＷＬＸＸＸＸＸＤＰＸＤＴＡＴＹＹ ＣＡＲＥＩＤり　Ｖ　ｑ　−−−−−−−−−−−−−−−−−−一−−−Ｌ− −−−−−−−−，５ｉｆｆ　Ｐ７　−−−−−５−−−−Ｄ−−−−Ａ−−− −−−Ｉ−−−−−−−Ｇ−Ｓｌｉ　−１’ＶＹＹ　ｒ７　−−−−−Ｒ−−− −−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−Ωｖｎ宏江ＨΣ　−Ｅ１２ｊ ’　−−−Ａ−−−−−−サルクローン２−１３　”’”−Ｔ　−ＶＩ′）　！ 　−−−−ＡＶ−−−−−サルクローン２−１０　９７％んσ９ｂ ヒトコンセンサスＶＨ３配列とクローン化サル可変領域との比較Ｇ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ　！　Ｗ’Ｌ ヱＱＡＰＧＫＧＬＥ跳−−−−Ｅ−−−−−−−−Ｆ−−−−−−一−−−−− −−−−エニ及ｆｆ　−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−− −−−−−−−−−一−−−−−−−−五亡Ｕ五　−−−−−Ｑ−−−−Ｒ−− −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ｆｆ匠ぎ　 −−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ｓ−一− −−−−−−−−Ｎｎ弘Ｑ　−−−−５−−−−−−−−）（ＶＳＫＴ ＮＡ　ＳＡＦ　Ｄ　ＥＰ　ＬＦ　Ｔ Ω５ＶＫＧ　ＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ ＡＲｕ　−−−−−−−−−一−−−−−−−−−Ｒ−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−５−−−−−−Ｔ−−−−−−−−−一−−−−ヱｘ　ｒ 　−−−−−−−Ｆ−−−一−５−−−−−−−−一−−−−−−−−−ＢＺＵ 上　−Ｖ　−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −相同性 ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ　ヒトＶｌ−１３コンｔンｔスｆｆ　−一−−−−−− −−−サルクローン３−３４　９６％ヒトコンセンサスＶＨ４配列とクローン化 サル可変領域との比較ＴＹＶ　５Ｒ ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＧＳＪＳ　５Ｓｘｎｌ ＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷ工Ｇ−Ｍ−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−Ｍ二座グー−−−−−−Ｍ−−−−−Ａ−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−、ＷＤ集６−−−−Ｔ−−−−− −−−−−−Ｈ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５−−−−−−−，５ ！工ｎ角−−−−一一−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−＝９３℃−−−−Ｔ−−−−−−−−−−一−−−− Ａ−−−−−−−−−−−−−−−５−−−−−−一旦ユＤ蕩アー一一一−一− −−一−−一−ＭＰＫＫＨＹＮ ｆｉ　Ｑ　ＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹ ＣＡＲ７、ｆ　−Ｎ−−−一−−−−−Ｎ−−−−−−ＭＴ−−−−−−−（− −−−−５ＬＱｆ；Ｅ　ＣαｕぼＬｍｌ−−−−−−Ｌ−Ａ−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−−−ＳｌＢｆｉＳΩα塾ρｍ−一　−−−−− Ｌ−−−−−Ｇ−に−−−−−−−−−−−−−−−−Ｆ−−−五二Ｘ詔Ωα虻 ゴム心Ｗ　−−−−−Ｌ−Ａ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−ヱＬα票豆の＝ＷχＷ−弘　ＮＮ−−５−−工−−−−−Ｌ−−−−−Ｒ −−−−−−−−−−一−−ＳヒトコンセンサスｖＨ５配列とクローン化サル可 変領域との比較ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫ工５ＣＫＧＳＧＹＳＦ 　３　ＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷ−−−−−−−−Ｇ−−−Ｒ−−−−−Ｒ−− −−ＴＣ−Ｆ−−ＩＱロ二五　−−−−Ｖ−−Ｑ−−−−・　〜’ｐ−Ｄ　ＶＴ ＩＳＡＤＫＳ工５ＴＡＹＬＱ讐ＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣ佃、。

・・・　・・・・・・・・・・・・　ヒトＶＨ５コンセンサス＆と田旦比り工の 　ＥＩＩ　ＷＧＨＧＶＬＶＴＶＳＳＧ　サルクローン５−＋　Ｉ　８４％■ ヒトコンセンサスＶＫＩＩ配列とクローン化サル可変領域との比較Ｒ ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＶ　ＷＹＬＱＫＰＤＩＶＭＴ ＱＳＰＡＳ−一−−Ｌ−Ｇ−−−−−−−−−−−−−ＬＡ−ｐ−−−ｘ−−Ｘ −−−−ｏ−−−−−−Ｂｊｌｕ；：ｙ５１ｆＸ５ａＬＬ工Ｈ−−−−−−−− Ｐ−−−−−−２−−−Ａ−−一−−−−−−−−−−−ＦＮＰ−一−Ｄ−Ａ− Ｄ−−−ヒトコンセンサスラムダＶ１１１配列とり０−ンイはル可変領域との比 較　Ｇ Ω２ｕ込Σｌｙ　ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ　ヒトλＩＩＩ：ｌ：／ｆ’：／サス ＩＡ＝Ｉ　ＷＶ　−−−−−Ｒ−−−−−サｈ７ンチーＣＤ４　９１％Ｆ／Ｇ、 　９ｈ。

Ｆ／Ｇ、　１０ ヒトＶＨ３コンセンサス配列、４つのサルＶＨ３配列および８つのヒトＶＨ３配 列の比較 ０−−−−−−−−−Ｖ−−−５Ｒ−−−−−−−−−−一−−−ＳＹＡＭＪ（ −−−Ｇ−−−−−−−−−−Ｖ工Ｓ　ＤＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ　−−− 一−−−−−−に一−−−−−−−−−Ｄ−−−−−−−−−ＫＲＩＮ　＞：Ｗ ＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＲ５−Ｌ−−−に−Ｔ−−−ＱＷ−ＸＸＸＸＸＤＰＸ−− −Ｔ−−一−−ＧＯＶＬＹＹＧＳＧＳＹＨＷ　ＦＤＰ−−−−−−−−−−−１ ８／２Ｇ）ｐＶＬＱＦＬＥＷＬＬＰＴＴＧＳ　Ｄｖ−−Ｐ−Ｖ−−−−−サル　 ８４０ｎＶ〜仏ＧＴ　Ｇ−−−Ｖ−−−−−−”ｊル＃　９Ｆ／Ｇ、／／ ＳＵＰ　Ｔ＋　ＣＤ４−陽性細胞に対するキメラ抗−ＣＤ４の直接結合性抗体　 （ｎｇ／ｍｌ　ｌ ＣＤ４陽性細胞に対する＋Ｆ３結合性のサルおよびサル／ヒトキメラ抗体による 阻害Ｆ／Ｇ、　／３゜ サル抗−ＣＤ４Ｖ、配列。ｌ−４２０ｂｐまでの配列。リーダー配列メチオニン ＡＴＧ（ｂｐ４）からｂｐ４２０までを翻訳。タンパク質配列には抗体フレーム ワーク残基＋１から最後のＶ、残基＋１２０までに番号付けしている。

ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＧ　ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ Ｇ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　Ａ ＣＣＣＴＧ　ＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴ　ＧＴＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ ＴｅＣｌ４ Ｆ／Ｇ、　／４゜ サル抗−ＣＤ　４　Ｖｑ−ｒ配列。ｌ−３８７ｂｐまでの配列。リーダー配列メ チオニンＡＴＧ（ｂｐ４）からｂｐ３８７までを翻訳。タンパク質配列には抗体 フレームワーク残基＋１から最後のＶｑｔ、ｙ残基＋１０９までに番号付けして いる。

ＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣ ＴＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＣＡＦ’５ＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳ Ｇ ＴＴＣＴＣＴ　ＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡ　ＧＧＧ　ＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣ ＣＴＧ　ＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＴＧＧ　 ＧＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＧＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＧＴＣＣＴ 八へ０９ Ｂ細胞免疫サルにおける抗ＣＤ５４競合活性；ＩＣＡＭトランスフェクトＣＨＯ 細胞に対する８４ＨＩＯＭＡＢ結合性の阻害 １　２　４　８　１６３２６４１２Ｂ２５６血清希釈物×　１／１００ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ＺＮＡ　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５１０６ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１３ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｌ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、 ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 　ＭＧ、　ＭＮ、　Ｎ・ｆＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、Ｕ Ｓ ＦＩ （７２）発明者　ハンナ、ネイビル アメリカ合衆国９２０２４カリフォルニア、オリ−ベンへイン、フォーチューナ ・ランチ・ロード３２５５番 （７２）発明者　ラーブ、ローランド・ダブリューアメリカ合衆国９２１１１カ リフオルニア、サン・ディエゴ、チューリパン・ウェイ２４６８番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト、チンパンジーまたは第１の旧世界ザルの免疫グロブリン定常領域と、 該第１の旧世界ザルと同じ、または異なる第２の旧世界ザルの免疫グロブリン可 変領域の抗原結合部分とを含有する組換え抗体。 ２．対応するヒト、チンパンジーまたは第１の旧世界ザルの定常領域に相同な定 常領域、 対応するヒト、チンパンジーまたは第２の旧世界ザルのフレームワーク領域と相 同なフレームワーク領域、および 第３の旧世界ザルの抗原結合部分に相同な抗原結合部分を有する特定の既知の抗 原に対して特異性を持った免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含有する組換え抗体 であって、該第１、第２および第３の旧世界ザルは同じでも異なっていてもよい 抗体。 ３．ヒトに対して免疫原性でない免疫グロブリン定常領域、本質的にヒトに対し て免疫原性でないフレームワーク領域、および第１旧世界ザルの免疫グロブリン 可変領域の抗原結合部分を含有する組換え抗体。 ４．該抗体がヒト抗原に特異的に結合するものである請求項１、２または３の抗 体。 ５．該定常領域がヒト、チンパンジー、または第２の旧世界ザルの免疫グロブリ ン定常領域の定常領域と相同である請求項３の抗体であって、該第１および第２ の旧世界ザルは同じでも異なっていてもよい抗体。 ６．該フレームワーク領域がヒト、チンパンジー、または旧世界ザルのフレーム ワーク領域と相同である請求項３の抗体。 ７．該旧世界ザルの１つがアカゲザルである請求項１、２、または３の抗体。 ８．該旧世界ザルの１つがシノモルグスザルである請求項１、２、または３の抗 体。 ９．該旧世界ザルの１つがヒヒである請求項１、２、または３の抗体。 １０．第１の旧世界ザルの免疫グロブリン定常領域と、異なる旧世界ザルの免疫 グロブリン可変領域の第２抗原結合部分とを含有する組換え抗体。 １１．該抗体がヒト抗原に特異的に結合するものである請求項１０の抗体。 １２．該抗体がＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、 ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ４ ４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、Ｃ Ｄ５ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的 に結合するものである請求項１、２、３、５、６、１０または１１の抗体。 １３．該抗体がＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、 ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ４ ４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１８、ＣＤ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的 に結合するものである請求項４の抗体。 １４．該抗体がＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、 ＬＡＭ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４１、ＣＤ４ ４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１８、ＣＤ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的 に結合するものである請求項７の抗体。 １５．該抗体がＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、 ＬＡＭ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４１、ＣＤ４ ４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１８、ＣＤ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的 に結合するものである請求項８の抗体。 １６．該抗体がＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ、 ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ４ ４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１８、ＣＤ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的 に結合するものである請求項９の抗体。 １７．該旧世界ザルの各々か、ヒヒ、アカゲザルおよびシノモルグスザルからな る群から選択される請求項１０の抗体。 １８．該抗原結合部分が、旧世界ザル可変領域の１またはそれ以上のＣＤＲ領域 を含有するものである請求項１、２または３の抗体。 １９．該抗原結合部分が、旧世界ザルの全可変領域を含有するものである請求項 １、２または３の抗体。 ２０．第１の旧世界ザルの免疫グロブリンの抗原結合部分を含有する組換え抗体 をコードする核酸。 ２１．該組換え抗体が、ヒト、チンパンジーまたは第２の旧世界ザルの定常領域 を含有するものである請求項２０の核酸であって、該第１および第２の旧世界ザ ルは同じ、または異なっていてよい核酸。 ２２．該抗体が、第２の旧世界ザル、ヒトまたはチンパンジーの抗体のフレーム ワーク領域を含有するものである請求項２１の核酸であって、該第１および第２ の旧世界ザルは同じ、または異なっていてよい核酸。 ２３．該抗原認識部分が、該旧世界ザル抗体の全可変領域を含有するものである 請求項２０の核酸。 ２４．該抗原認識部分が、該第１旧世界ザルの可変領域の１またはそれ以上のＣ ＤＲ領域を含有するものである請求項２０の核酸。 ２５．該第１および第２の旧世界ザルが、ヒヒ、アカゲザルおよびシノモルグス ザルからなる群から独立に選択されるものである請求項２０、２１または２２の 核酸。 ２６．不滅化した旧世界ザルのＢ細胞によって形成されたモノクローナル抗体、 またはそのＦａｂもしくはＦｖもしくは（Ｆａｂ）２フラグメント。 ２７．該Ｂ細胞がシノモルグスＢ細胞である請求項２６のモノクローナル抗体。 ２８．該Ｂ細胞がアカゲザルＢ細胞である請求項２６のモノクローナル抗体。 ２９．該Ｂ細胞がヒヒＢ細胞である請求項２６のモノクローナル抗体。 ３０．該抗体がヒト抗原に対して産生されたものである請求項２６、２７、２８ または２９のモノクローナル抗体。 ３１．該抗体が、ＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ 、ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ ４４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒト細 胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、Ｃ Ｄ１１ｃ、Ｃｓａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα、 ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるヒト抗原に特異的に 結合するものである請求項２６、２７、２８または２９のモノクローナル抗体。 ３２、旧世界ザル抗体遺伝子の可変領域を単離する方法であって、旧世界ザルか ら得た核酸と、該抗体遺伝子の５′リーダー配列をコードする核酸に相補的なプ ライマーとを接触させてハイブリッド複合体を形成させ、該ハイブリッド複合体 内の該核酸を増幅して増幅された核酸を製造することを特徴とする方法。 ３３．該核酸がＤＮＡまたはｃＤＮＡである請求項３２の方法。 ３４．該プライマーがヒトまたは旧世界ザルの抗体遺伝子の５′リーダー配列の 非コーディング鎖に棺桶的なものである請求項３２の方法。 ３５．該増幅工程においてベクター内に配するに十分な核酸が製造される、請求 項３２の方法。 ３６．旧世界ザル抗体遺伝子の可変領域を単離する方法であって、旧世界ザルか ら得たＲＮＡと逆転写酵素とを接触させてｃＤＮＡを形成し、該ｃＤＮＡを、該 抗体遺伝子の５′リーダー配列をコードする部位のｃＤＮＡに相補的なプライマ ーと接触させてハイブリッド複合体を形成させ、該ハイブリッド複合体内の該核 酸を増幅して増幅された核酸を製造することを特徴とする方法。 ３７．ヒトにおいて免疫原性でない、ヒト抗原に対する組換え抗体を製造する方 法であって、 該抗原に対する旧世界ザル抗体を旧世界ザル内に惹起させ、該旧世界ザル抗体の 可変領域の抗原結合部分をコードする旧世界ザル核酸を単離し、 ヒト抗体のヒト定常領域をコードするヒト核酸を得、該旧世界ザル核酸と該ヒト 核酸とを連結して組換え核酸を形成させ、そして該組換え核酸を発現させて該組 換え抗体を製造することを特徴とする方法。 ３８．該抗原結合部分が、旧世界ザル可変領域の１またはそれ以上のＣＤＲ領域 を含有するものである請求項３７の方法。 ３９．該抗原結合部分が、旧世界ザルの全可変領域を含有するものである請求項 ３７の方法。 ４０．旧世界ザル抗体を産生することができる細胞を不滅化する工程をさらに包 含する請求項３７の方法。 ４１．旧世界ザル抗体の可変領域をコードする旧世界ザル核酸を同定する工程を さらに包含する請求項３７の方法。 ４２．該不滅化がハイプリドーマ融合によるものである請求項４０の方法。 ４３．該不滅化かウイルス形質転換によるものである請求項４０の方法。 ４４．該不滅化が単一Ｂ細胞クローニングによるものである請求項４０の方法。 ４５．該不滅化がライブラリーの構築によるものである請求項４０の方法。 ４６．該ヒト定常領域が、所望のインタイプを有することで選択される請求項３ ７の方法。 ４７．該旧世界ザルからＢ細胞を選択する工程をさらに包含する請求項３７の方 法。 ４８．該Ｂ細胞が、末梢血リンパ球、リンパ節、骨髄または脾臓から得られるも のである請求項４７の方法。 ４９．該旧世界ザルの細胞を、該抗体の製造に関してスクリーニングする工程を さらに包含する請求項３７の方法。 ５０．該発現が、生産細胞系内での発現である請求項３７の方法。 ５１．該単離が、該可変領域の免疫グロブリン遺伝子の救済を含む、請求項３７ の方法。 ５２．該抗原が、ＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ 、ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ ４４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ 細胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、 ＣＤ１１ｃ、Ｃ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるものである請求項 ３０−４４のいずれかに記載の方法。 ５３．ある抗原を有している処置が必要なヒトを処置する方法であって、ヒトま たはチンパンジーまたは第１の旧世界ザルの定常領域と、第２の旧世界ザル可変 領域の抗原結合部分とを含有する、該抗原に特異的な組換え抗体、の治療有効量 を投与することを特徴とする方法。 ５４．該ヒトが癌を患っており、咳抗原が腫瘍抗原である請求項５３の方法。 ５５．該ヒトが自己免疫応答疾患を患っており、該抗原がヒトでの自己免疫応答 に関与する抗原である請求項５３の方法。 ５６．該抗原が、宿主細胞上で発現される受容体である請求項５３の方法。 ５７．該抗体が、ヒト抗体および旧世界ザル抗体に相同な部分を含んでいる請求 項５３の方法。 ５８．該抗原が、ＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ 、ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ ４４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ 細胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、 ＣＤ１１ｃ、Ｃ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、およびＣＤ７１から選択されるものである請求項 ５３または５７に記載の方法。 ５９．該抗原結合部分が旧世界ザル可変領域の１またはそれ以上のＣＤＲ領域を 含有するものである請求項５３の方法。 ６０．該抗原結合部分が旧世界ザルの全可変領域を含有するものである請求項５ ３の方法。 ６１．（１）ヒト抗体の重鎖の定常領域；（２）該ヒト抗体の軽鎖の定常領域； （３）ヒト抗原に対する旧世界ザル抗体の重鎖の可変領域；および（４）該旧世 界ザル抗体の軽鎖の可変領域を含有する組換え抗体。 ６２．配列番号１５または１６内の可変領域の、少なくとも１個のＣＤＲ領域を 含有する組換え核酸。 ６３．製薬的に許容される担体中に、請求項１、２、３、１０または２６のいず れかに記載の抗体の治療有効量または予防有効量を含有する医薬組成物。 ６４．該抗体が、ＣＤ５８、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ４、ＣＤ２、ＬＦＡ３、ＥＬＡＭ 、ＬＡＭ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４１、ＣＤ ４４、ＣＤ５４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｔｎ抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ヒトＴ 細胞受容体、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、 ＣＤ１１ｃ、Ｃ５ａ、ＣＤ４５、ｎｅｕ腫瘍遺伝子産物、ＭＤＲ−１、ＴＧＦα 、ＴＧＦα受容体、ＰＤＧＦ、またはＣＤ７１に特異的に結合するものである請 求項６３の医薬組成物。 ６５．リュウマチ様関節炎、湿疹および免疫変調疾患から選択される疾患の治療 方法であって、該疾患を患っているヒトに請求項６３に記載の医薬組成物を投与 することを特徴とする方法。