JPH06509865A - Ｓｃプロフィールによる被分析物の分類方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＳＣプロフィールによる　の 交籠盆団 本発明は、特異的結合試薬に基づくアッセイを用いる未知試料の分析に関する。

さらに詳細には、本発明は、未知試料の被分析物組成を調べるために、既知試料 と特異的結合試薬のパネルとの反応性によってパターンが調べられる、パ９−ン 認識の使用に関する。この方法は、被分析物の種類をも認識し得る。

背Ｊｕ人 イムノアッセイおよび関連技術は、生物学的試料中の種々被分析物の測定のため の標準的手段になってきている。これらの試験の簡略化および正確さの改善のた めに設計された種々のフォーマ・ノドが当技術分野で入手し得、そして、この種 々のフォーマットが現す数は非常に多い。

これらのアッセイの成功は、特異的な結合試薬を提供する能力に依存している。

結合試薬は通常、抗体あるいは抗体のフラグメントであり、試料中に存在しうる 他の成分に比べ、漂的被分析物に対する特異性が高い。例えば、尿中のヒト繊毛 性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の検出に依存する妊娠アッセイが多数市場に存在す る。これらのアッセイは、使用されるＨＣＧに対して免疫反応性の抗体が、他の 尿成分と検出可能な程度に反応しないため、Ｉ（ＣＧの検出が可能である。

しかしながら、他の特殊な状況では、そのグループの任意の１つに対して調製さ れた抗体に交差反応性のグループのメンバーである被分析物に関して、そして、 任意のメンバーあるいは複数のメンバーが同−試料中に存在して得る、試料を分 析することが要望されている。この問題の一例は、環境中の殺虫剤および除草剤 の調査に関する試みに関している。これらの物質は、構造的に類似している。例 えば、ｖａｎ　Ｅｍｏｎ。

Ｊ、Ｎ、ら、ｉｎ　”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｅ５ ｔｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ： 　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、−５ｈｅ ｒ＊ａ、　Ｊ、、　ｅｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、　１９８９．　ｐｐ、　２１７−２６３；　Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ、Ｍ　 ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓｅｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　（１９８８）　２２＋２４７− ２５４；　Ｎｅｖｓｏ＋ｓｅ、　Ｗ、Ｈ，、Ｊ　Ａｓ５ｏｃ　０ｆｆｉｃ　Ａｎ ａｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８６）６９・９１９−９２３、を参照。

一般には、例えばカルバメート類殺虫剤である特定のクラスの殺虫剤の幾つかの メンバーの内の特定のどれが環境中に存在しているのかは正確には知られていな い。加えて、実際に散布された殺虫剤の分解産物もまた、特異的に免疫反応を行 うとされる抗体あるいは他の結合試薬と、交差反応を行い得る。従って、単純な 単一の抗体アッセイだけで、試料の組成の信頼性のある全体像を得ることは不可 能である。実際に、この様なアッセイの結果は、例えばそのために抗体が調製さ れた、クラスの同定された特定のメンバーに対する「当量」の形式でしばしば示 される。被分析物の内の１つに対して作成さ九た任意の特異的結合試薬に対する 、可能性のある被分析物の交差反応性に加えて、一般的な測定特にはこれらの化 合物の濃度範囲は非常に低く、典型的には１Ｇ　−１００ｎＭ、あるいはＩ）ｌ ）ｂの範囲である。この様に低濃度では、より多量に存在する物質との交差反応 性の問題が、特に問題である。

上記の交差反応性のために、被分析物濃度の定量的な測定は困難である。例えば 、ある抗体の被分析物Ｂに対する親和性が、被分析物Ａに対する親和性の１００ 倍であると仮定すると、その抗体を用いた単一の測定法で、５０　ｎＭの濃度の 被分析物Ａを、０．５ｎＭの濃度の被分析物Ｂと区別することは不可能である。

ＡとＢの種々の混合物もまた、定量的に同様な様式で反応する。従って、単一の 抗体を使用する、構造的に類似の種々の被分析物の混合物を含有する試料を試験 するための方法はない。

本発明は、重複する特異性を有する反応性試薬との反応の様な場合に、数学的パ ターン認識技法をパラメータ値に関する情報チャネルのパネルに適用し、これら の困難を克服する。

標的の被分析物に関する標準プロフィールの集合が一旦調べられると、試験試料 中の被分析物組成のより信頼性の高い測定が可能となり、同時に被分析物の定性 の精度が改善される。

λ匪旦匠丞 存在する可能性のある複数の被分析物が構造的に密接に関連している試料の被分 析物組成の測定を可能とする方法が提供される。これらの方法は、パターン認識 技法およびその処理法の利点を利用し、試料組成に関する詳細な情報を与える。

１つの局面では、本発明は、試料の被分析物組成を調べる方法であって、試料と 、存在すると考えられている被分析物のクラスのメンバーと幾らか異なった程度 の反応性である特異的反応性試薬のパネルの各々とを接触させる工程、を包含す る方法を提供する。反応性のプロフィール、即ち「特性探査（ＳＣ）プロフィー ル」が、その試料に関して得られ、そして次に、このＳＣプロフィールを、標準 の既知組成で予め調べられたＳＣプロフィールとマツチさせる。

別の局面では、本発明は、種々の既知の被分析物組成の予め測定されたＳＣプロ フィールを得る方法であって、予め決められた組成物の集合と、これらの被分析 物と反応性の、好ましくはこれらの被分析物と特異的に結合する試薬である２− １０が好ましいｎ個の試薬のパネルとを接触させる工程、および、各組成物で得 られたプロフィールをｎ次元空間にプロットする工程、を包含する方法に関する 。さらに別の局面では、本発明は、この様にして決定された組成パターンに関す る。

さらに別の局面では、本発明は、ｎ次元の内のどの次元がアッセイに関して最大 の情報量を有するのかを明確にする、従って測定すべき特性（次元）の最小数の 選択を可能とする、マルチパラメーター統計解析技法の使用に関する。

区」し１１隼ｌり１吸 図１は、一連のモノクローナル抗体の固定されたトリアジンに対する結合の阻害 のパターンを、関連抗原の溶液中濃度の関数として示している。

図２は、５０ｐｐｂの濃度で調べたトリアジンホモログに関スる予測および実験 で得た、特性探査（ＳＣ）プロフィールを示している。

図３は、１ｏ−ｉｏｏｏ　ｐｐｂの濃度範囲の７種のトリアジン系除草剤に関す る５次元のＳＣプロフィールの、最適化しいた２次元投影図を示している。

日を　るための 本発明の方法は、特に不純な試料中の、試料中に含まれると考えられる複数の被 分析物が比較的密接な関連した構造である被分析物組成の測定の信頼性を改善す る。「被分析物組成の測定」という用語により、多くの可能な被分析物の各々の 濃度レベルの確認を意味する。被分析物組成の測定に意義が状況には、多くの構 造的に関連した物質を類似した目的で使用し得る場合、あるいは、これらの物質 が、類似した環境を占有する様な方法で取り扱う場合が含まれる。例えば、多く の除草剤および殺虫剤は、分解産物になった場合互いに他に対してホモログある いはアナログである。種々のトリアジン誘導体の場合を以下に例示する。これら の誘導体は全て除草剤として有用である。

この様なグループの他の例には、生物学的な液体あるいは組織中に存在し得る物 質のファミリー（生物学的試料の臨床的分析に有用である）が含まれる。一般に 、これらのファミリーは３つのカテゴリーに分類される。第一に、ステロイド類 、タンパク質ホルモン類、あるいは代謝産物の様な臨床的状態、あるいはそれら の直接投与によって、増大あるいは亢進が減少し得る天然の物質は臨床上有用で ある。第二に、β−遮断剤類、化学療法剤類、プロスタグランジンインヒビター 類等の様な治療目的に設計された人工的物質は、モニターし得る。

第三に、種々の不法薬剤のファミリーは、法廷で用いる目的に検出および区別し 得る。

目的の生成物の合成に至る一連の反応中の、一連の出発物質および生成物もまた 測定し得る（オンラインの品質管理業務に有用である）。この様な測定を目的と する本発明の方法は、これらの物質がファミリーとして合成され、そしてそれら の生成物が同時に製造され、そして分画される生産物を現す場合に特に有用であ る。代表的な例には、繊維用染料、絶縁物中に用いられるＰＣＢ類、および界面 活性剤類が含まれる。さらに、全ての製造で、競合する副反応は、構造的に類似 し、目的生成物と区別されるべき同じファミリーのメン７ＸＩ−を生成する。

環境中での種々の物質の分解に関する分析値も測定し得る（環境的に重要な物質 の存続の評価の場合の如く）。

本発明の方法は、被分析物と、試薬の集合との異なった反応性、あるいは被分析 物を特徴付ける他のパラメータに依存している。特に、結合試薬が好ましい。被 分析物は構造的に類似なので、かなりの交差反応性が予測され、そして、実際に 本発明の方法の必要要件および実用性は、この交差反応性に依存している。便利 なパラメータには、典型的にはモノクローナル抗体である抗体の様な結合試薬と の反応性があるが、これは単なる例である、必要要件ではない。例えば、その存 在、欠如あるいは量を調べるべき被分析物の群と一般的に反応することが判明し ている任意の物質は、本発明の方法に使用し得る。例えば一本鎖抗体および組換 えで製造された抗体を含む抗体は、当技術分野でよく理解されている様に、それ 自体、またはその免疫学的に反応性のフラグメントとして使用できる。例えばＦ ａｂ、　Ｐａｂ’、あるいはＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用は、特異的結合 アッセイでしばしば有用である。酵素−基質結合あるいは酵素−阻害剤結合、リ ガンド−レセプター結合、あるいは本明細書では参考文献として援用する米国特 許第４．９６３．２６３号に記載されているバラログの様なアフィニティー試薬 への結合の様に、適切な交差反応性を与える任意の試薬相互反応を使用し得る。

特異的な結合による反応性に加え、任意のタイプの反応性を測定し得る。例えば 、候補被分析物が一連のアイソエンザイムの場合、パネルの阻害剤の各々の活性 に対する影響を測定、あるいは一連の基質に対する活性のレベルを測定し得る。

あるいは逆に、被分析物のパネルが一連の関連した基質の場合、一連の酵素と、 これらの関連した基質との反応性を、プロフィールの決定に使用し得る。同じタ イプの、反応性あるいは他の特性パラメータを、プロフィールを構成する情報チ ャネルの各々を調べるために使用する必要はない。従って、プロフィールは、抗 体との結合、阻害剤との結合、酵素との反応性、基質との反応性、あるいは測定 すべき種々の候補の被分析物に関して変動する値を有する他の化学的活性あるい は物理的特性、の組合せで構成され得る。

同様に、パネル中の試薬の反応性を検出する特異的アッセイのフォーマット、あ るいは、被分析物グループのメンバーのプロフィールに関する一連の情報チャネ ルを与えるパネル中の特性パラメータの値、の選択は任意である。試験される試 料の、結合あるいは反応性、そして種々の被分析物組成に対するデータ点の標準 セットの作成は、直接法あるいは競合法のフォーマットの何れでも調べ得る。例 えば、結合試薬を標識し、そして得られる複合体を沈降させることで抗原への結 合を検知し、そして沈澱中の標識の量を測定し得る。あるいは、より簡便には、 結合試薬を固相支持体にカップリングし、次いで候補被分析物を、既知の結合能 力を有する類似の被分析物と競合させる。特定のグループ中の被分析物に対する 特異的結合試薬の結合を、検知およびし測定するために設計されたアッセイを実 施するための別の方法は、本明細書では参考文献として援用するＰＣＴ出願ＵＳ ８８１０３５５４号に開示されている。特異的結合試薬の設計のための方法はま た、全て本明細書では参考文献として援用する、米国特許第４．９６３．２６３ 号およびＰＣＴ　［ｌ５８９１０１１９４号とＰＣＴ　ＵＳ９０１０６３３３号 に記載されている。

イムノア、セイあるいは他の特異的結合アッセイの実施者には、別のブａトコー ルも即座に明白となる。

同様に、化学的反応性または物理的特性を測定するためのパラメータを決定する 方法もまた、容易に考案し得る。例えば、クロマトグラフィーの支持体中の被分 析物の相対易動度は、分別的な交差反応性を構成し、１つのチャンネルに情報を 与える。電気泳動の易動度、ＰＩ値、特定の基質との反応性、または特定の阻害 剤による阻害もまたプロフィールに情報を与えるパラメータを構成する。

しかし、各情報チャネルに対する特性パラメータの値が調べられても、「交差反 応性」の特性パラメータのパネルに関するプロフィールを、一連の既知の被分析 物の組成に関して調べる。最も単純なこの様な組成物で、標準的なパターンを得 るために典型的に使用されるものは、ある範囲の濃度で単一のメンバーの被分析 物のみを含む試料である。これらの対照データ点から最終的に得られる標準プロ ットを用い、既知の位置との相関関係によって、単一被分析物を検出し得る。

混合物に対するプロットの位置の計算で、同様のマツチングにより、それらの確 認を行い得る。

被分析物、標準物質、および未知組成物に関して調べたプロフィールは、交差反 応免疫アッセイ（ＣＲＩＭ）のプロフィールにいくぶん類似しており、そして本 発明の方法は、被検試料のＣＲＩＭプロフィールと、既知の被分析物組成の試料 から得たＣＩ？１Ｍプロフィールの予め調べられたプロットとを比較するのに類 似している。本発明の方法では、ＣＲＩＭプロフィールの概念が拡大され、抗体 あるいは結合試薬との反応性のみならず、種々の意味の反応性、および候補被分 析物全体にわたる任意の分別的な値を有する物理的あるいは化学的な情報特性を 含む、特異的反応性の様な特性パラメータの値の一連のチャンネルを含む。探査 し得る特性の数が大きいため、便宜上このプロフィールを、本明細書では特性探 査プロフィールまたはｒｓｃＳＣプロフィール呼ぶ。

従って、　「ＳＣプロフィール」という用語は、試薬により得られる情報チャン ネルのパネルにわたる特性パラメータの値のパターン、あるいは単一の固定され た被分析物組成に関する物理的あるいは化学的特性の集合を意味する。本発明に 有用な典型的なＳＣプロフィールでは、２−１Ｏ個の好ましくは４−６個の異な る情報チャンネルに関する被分析物の特性が蓄積される。例えば、２−１０個の 好ましくは４−６個の異なる試薬のパネルと試料との反応性が調べられる。以下 の実施例から明らかな様に、各組成は、試薬との反応性、および／または他の特 性で構成されている情報チャンネルのパネル全体にわたる特徴的ＳＣプロフィー ルを有する。パネルのメンバーの数が多い程、アッセイの改善は大きく、一方パ ネルのメンバーが少ない程、アッセイはより簡便となる。パネルのメンバーの数 の選択は任意であり、アッセイに望まれる微調整のレベルに依存する。

本明細書に開示されている数学的技法は、最も意義のあるパネルのメンバーの選 択を可能とし、そしてプロフィールに必要な情報チャンネルの数の減少に使用し 得る。

しかし、濃度を測定するためにプロフィールを使用する場合は、情報チャンネル に利用される特性の少なくとも幾つかは、候補被分析物の濃度に従属しなければ ならない。従って、この様な濃度測定に用いる場合は、レセプター、抗体、また は他の特異的結合試薬に対する特異的結合性が特に有用である。しかし濃度依存 性の、基質の酵素との反応性、競合インヒビターによる酵素の阻害、およびその 他の反応性も使用し得る。

種々の濃度でのプロフィールを得る場合、上記の最も単純な概念的方法を用いて 、種々の既知の被分析物の濃度での結合試薬あるいは酵素活性に対する阻害値を 直接測定することによってこの一連のプロフィールが得られる。しかしその他の プロフィールは、阻害率（％）対被分析物濃度をプロットして得た曲線を用いて 内挿し得る。

腹笠妊処里 未知試料と比較される個々の標？＄組成に関して得られたプロフィールを、次に 標準プロフィールと未知試料のプロフィールとを比較し得るコンピュータを利用 した技法で処理する。

この方法は用手法では容易に実施し得ない。

これらのパターン認識技法を応用する最も簡単な方法では、ｓｃプロフィールの 各々を、ｎを各パネルの結合試薬の数とするｎ次元中の点としてプロットする。

例えば、モノクローナル抗体である６種の異なる結合試薬を含むパネルが使用し 得る。これらの抗体は、例えば、Ａを被分析物、ｉを１−１０の整数とする被分 析物Ａｉのクラスの１０個のメンバーと交差反応性であると仮定する。例えば、 これらの被分析物の１つであるＡｌを、のそれ自体および残りの被分析物の種々 の濃度で結合の競合のプロフィールを調べるために、標識競合体として選択し得 る。例えば、一定濃度の標識Ａ、を用い、種々の濃度のＡｌ−Ａｌ１１で、パネ ル中の各抗体の結合に関して阻害百分率が調べられる。

１つの濃度の各被分析物Ａ、に関して、標識Ａ＋がパネル中の種々の抗体への結 合を阻害する百分率である６個のデータ点がある。次にこれらの百分率を数学的 に処理し、最初の次元が最初の抗体に関する阻害百分率を示し、２番目の次元が ２番目の抗体に関する阻害百分率を示す等、６次元的空間中に単一の点の位置が 定義される。この様にして、種々の濃度のＡ１．Ａ２．Ａ３・・・Ａｌ９を示す 点が決定される。

６次元のプロットが容易に視覚化されない場合は、例えばり、　Ｌ、　Ｍａｓｓ ａｒｔら、”Ｃｈｅｍｏ＋５ｅｔｒｉｅｓ：　Ａ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ−（１９８ ８）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　（Ｎ、Ｙ、）に記載されている様な公知の数学的方 法を用い、その６次元のアレーを２次元の平面あるいは低次元の他の表面に投影 し得る。次に、２次元空間中のこの一連の点は、未知の試料を用いて得たプロフ ィールと標準のプロフィールとの比較を可視化して試料の組成の同定に利用し得 る。当然、６次元空間は数学的に扱い得るので、試料によって生成したデータ点 を対照の点のセットのデータ点との比較のために投影を行う必要はない。

しかし、投影を選択すると、ｓｃに対する抗体の有用性に関して抗体をランク順 位付けれるという別の利点が生じる。６次元的空間中で投影平面が軸線に対して 垂直に近い程、投影の際のその要素の情報内容の喪失量が大きくなる。要因分析 によって、その情報の分散態様を保持する最適平面が得られるので、この観点か らの抗体の相対的重要性は容易に調べ得る。

この知見は、例えばパネル中の抗体の数の減少に有効に利用し得る。

以下に記載の実施例では、この比較的簡単な数学的アプローチを用い、信頼性が ある推定値が、事例の約８５％の未知試料の組成で得られることが見い出された 。重要なデータ点を比較的意味のないデータ点と区別するために、種々の方法を 適用し、改善された結果が得られた。

効果として、プロフィールを構成する種々のメンバーニ対する重み付図子を導入 し、標準曲線の直線部分上の結合の阻害を示す濃度が、非常に低いあるいは高い 阻害を示す曲線の漸近部分の濃度よりも、情報量が大きいことが明らかにできた 。これらの因子は、データを「分散分析Ｊで処理する場合に適用される。この例 では一般的概略であるが、この技法では、パネル中の６種のモノクローナル抗体 の五久且対応する次元で表される値は、６８ｉの抗体の全てに対するｎ次元の結 果の全体ではなく、未知試料中の対応する抗体に対応する値と別個に比較される 。

例えば、抗体＃１の実測阻害値は、被分析物Ａ１の対応する濃度、そして被分析 物Ａ２に対する異なる対応する濃度、等を意味する。抗体＃２も同様に予想値の ファミリーを生成する。等が以下に行われる。被分析物の正しい選択のためには 、６種の抗体の個々の予測値は、不正確に選択された被分析物よりもより密接に 一致する。プロフィールを確認するこのアプローチは、分散分析の一形態であり 、異なった検査室あるいは異なった測定法で得られる独立した推定値の比較に通 常は用いられる。分散の計算は、標準曲線の作成に使用したデータ集合の分散で 決定されるデータの信頼性を表す因子により予測値に重みを付けるために容易に 改変し得る。この方法を本明細書では「結果の重み付け」と呼ぶ。

Ｍａｎｄｅｌ、　”Ｔｈｅ　５ｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ 　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｄａｔａ−（１９８４）　Ｄｏｗｅｒに記載され ているこの数学的技法は、重要な結合データに充分な重み付けを与え、９５％の 事例で明確な結果が得られた。

最後に、標準を用い、ニューラルネットの入力／出力特性を訓練する過程で調節 因子が必然的に生じる二二一うルネットンステムもまた使用し得る。このシステ ムは、例えばＨａｒｔｚ。

Ｊ、Ａ　ら、　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒ　ｏｆ　 Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｏｗ　ｕｔａｔｉｏｎ　（Ａｄｄｉｓｏｎ　Ｗｅｓｌｅｙ、　 ５ａｎｔａ　Ｆｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　５ｅｒｉｅｓ　ｏｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　１９９１）；　Ｐａｒａｌｌｅｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅ ｄ　Ｐｒｏｃｅｓ旦ユ、２ｖｏｌｓ、（Ｄ、Ｅ、　ＲｕｍｅｌｈａｒｔおよびＪ 、Ｌ、　ＭｃＣ１ｅｌｌａｎｄ編、ＭＩＴ　Ｐｒａｓｓ、　１９８６）；あるい は、ＤＡＲＰＡ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　５ｔｕｄ　（ＡｒｍｅｄＦｏ ｒｃｅｓ　Ｃｏｗｖｕｎｉｃａｔｊｏｎ　ａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ａ ｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｉｎｔ’　ＩＰｒｅｓｓ、　１９８８）に概略が記載さ れている。

化合物に対して中程度の固有特異性のみを有する結合試薬の小さいパネルの使用 で達成された被分析物同定のこの高い信頼性は、より高い固有特異性を達成する ために膨大な努力を行った従来技術の結合アッセイからは予期し得ない。従って 、本発明の方法は、既存のアッセイの信頼性の改善のみでなく、例えば組換えラ イブラリーからの適切な抗体の単離を容易とする等、イムノアッセイの範囲の拡 大にも有用である。

パッケージしたアッセイ 本発明のアッセイに用いる試薬およびソフトウェアは、上記した状況の様な、１ つのクラスの種々のメンバーが存在し得る様な状況の複雑な試料の、迅速で簡便 なアッセイが可能す様に、簡便にパッケージし得る。結合試薬を用いるこの様な アッセイ用の典型的なキットは、好ましくは固相支持体にカップリングした試薬 のパネルのメンバー、および、標識した競合体およびその標識を検出する手段を 含む。適切な標識には、放射性同位元素、蛍光発光体および酵素が含まれる。

あるいは、抗体の様な結合試薬を、標識した形態で供給し得、および固相支持体 にカップリングした競合被分析物。このアノセイを直接するために、抗体でコー トした固相支持体を試料と反応させ、そして次に標識を有する二次抗体で処理す るサンドイッチフォーマットを使用し得る。

キットに用いる試薬とアクセサリ−物質の選択は、当然、ＳＣプロフィールの構 築に用いる特性の選択に依存する。種々の基質に対する反応性、あるいは種々の インヒビターの効果を利用する場合、例えば、キットは候補基質、候補インヒビ ターおよび反応検出手段を含む。

試薬パネルと試料との反応で得られた値は、次に、対照のデータバンクと比較さ れる。パッケージされた試薬と共に供給されるソフトウェアは、試料から得た重 要な結果の入力および対照パネルとの比較を可能とする。ソフトウェアの種類は 、上記の様に、選択した特定の数学的処理に依存する。

下記の実施例は例示を目的とし、本発明の限定を意図しない。

胤１ モノクローナル　の１１ Ｇｏｏｄｒｏｖ、Ｍ、ら、Ｊ　Ａ　ｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｉ　（１９９０） 　３８：　９９０〜９９６に記載されている様に、２種のＳ−トリアジン化合物 のアトラジンおよびシマジン（調製Ｂ参照）を、Ｎ１（ＳおよびＥＤＣＩ（Ｐｉ ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を 用いて牛−ホール・リンペノトヘモンアニン（ＫＬＨ）に結合し、マウスの免疫 に用いた。高力価の抗−８−トリアジン抗体が得られた時に、マウスを殺し、肺 臓細胞を回収した。肺臓細胞とマウスのミエローマ細胞ヲ５０％ポリエチレング リフール中で融合させ、固定したアトラジン、ラン血清アルブミン（ＢＳＡ）複 合体への結合に関するＥＬＩＳＡＴ、セイを用い、抗体産生をスクリーニングし 、ハイブリドーマを得た。これらの複合体は、カルボジイミドを利用したプロト コールで調製した。

陽性の培養物を、限界希釈法でクローニングし、そして安定な細胞株を５％のウ シ胎児血清を含む完全借地中で培養した。

培養上清を集め、分割し、そして−２０℃で凍結保存した。抗体のＩｇＧサブタ イプを、Ｚｙ■ｅｄ社のアイソタイピングキットを用いて確認した。７種の重要 なＳ−）リアジン誘導体に種々のアフィニティーで反応性の５種のモノクローナ ル抗体からなるパネルを選択した。これらの抗体は、アトラジンによる免疫由来 のＡＭ５Ｃ５，３、ＡＭＩＢＳ、ｌ、　ＡＭ５Ｄ１．２およびＡＭ７Ｂ２．１と 、シマジンによる免疫由来の５Ａ５Ａ１．１である。

旦１１ ７種のトリアジン類アナログのセｙ）を用い、本発明の詳細な説明する。市販さ れているこれらアナログの構造を表１に示す。

（以下余白） 」」」− １、ア　ト　ラ　ジ　ン　Ｃ１イソブＯヒ゛ル　エチル２、シマ　ジ　ン　Ｃ１ エチル　エチル３、プロパ　ジン　Ｃ１イソ７°０ピル　イソプロピル４　プロ 　メ　ト　ン　Ｏ−メチル　イソプロピル５　プロ　メ　ト　リ　ン　Ｓ−メチ ル　イソ７°ロピル　イソツブ０ピル６　アメ　ト　リ　ン　Ｓ−メチル　エチ ル　イソ７°０ピル７　テルフ゛　ト　リ　ン　Ｓ−メチル　ｔ−７゛チル　エ チルカルボジイミド仲介架橋法によるＢＳＡあるいはＫＬＨへの結合のために、 アトラジンのＲ３のエチル基を−（Ｃ）１２）５ＣＯＯＨで、そしてシマジンの Ｒ１のクロル基を一ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ００Ｈで置換した。

−Ｇに、結合は、免疫用およびスクリーニング用に異なった担体に行った。これ により、スクリーニング時に、目的のハプテンではなく、担体に対して産生され た抗体の検出が最少化される。

爽ｌノＤ工 の　の確認 調製Ａの項に記載した様にして得られた５種のモノクローナル抗体を、調製Ｂの ７種の被分析物に対する反応性に関して試験した。このプロフィール化試験は、 ＥＬＩＳＡフォーマットを用い９６−ウェルのマイクドブレート中で行った。こ のプレートを、４℃で一晩、アトラジン−ＢＳＡ複合体でコートした。非特異な タンパク質の結合部位を、各々０．５％のＢＳＡおよびカゼインと共ニ２時間イ ンキュベートしてブロックし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭノリン酸ナ トリウム、ｐＨ７．２、１００　ｍＭのＮａＣｌプラス０．０５％のＴｖｅｅｎ −２０）で洗浄した。緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎプラス各々０．１％のＢＳＡ とカゼイン）中の、被検抗体プラス種々の濃度の被検Ｓ−）リアジンアナログと を、４重で（ｑｕａｄｒｕｐｌ　ｉｃａｔｅ）ウェルに加えた。

プレートを室温で２時間インキュベートした。結合した抗体を、ニアルカリホス ファターゼで標識した次ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）を用い、ｐ−ニト ロフェノールホスフェート（０．１Ｍジェタ／ールアミン、ｐＨ　１０．３；　 ０．５　ｍＭ　ＭｇＣ１２中＋Ｃｉ　Ｉ１ｇ／ｅｌ）を基質として定量した。反 応生成物の終点蓄積量を、４０５　ｎｍでの吸光度を、ＶＩＩａＸ？イクロプレ ートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ。

Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，　ＣＡ）で測定し調べた。阻害曲線は、ソフトウェアパ ッケージＳｏｆｔ　Ｍａｘ（Ｖ．２．０ＩＣ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉ ｃｅｓ＞中のＦｏｕｒ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　Ｌｏｇｉｓｔｉｃ　Ｐｏｇｒａｍ を用いフィッティングした０特定の濃度のＳ−）リアジンアナログの存在による 、モノクローナル抗体の固相への結合の減少を、ゼロ投与量の対照の光学２１１ 度の百分率で示した（Ｒ／Ｒｏ　ｘ　１００％）。

アトラジンおよびプロメトリンの代表的試験結果を、各々図ＩＡおよびＩＢに示 した。図に示した様に、パネルの阻害曲線は２つのアナログで異なる。５メンバ ーの抗体パネルに対する７ｆ！のアナログ全てに関して、ＩＣＡＯ値（５０％の 阻害物が得られる濃度）を表２に示した。

（以下余白） これらの結果は、トリアジンアナログの各々が、５−メンバーの抗体パネルに対 して特徴的プロフィールを有することを示している。

叉１１１１ ＳＣプロフィールの定 ｔｏ−ｔｏｏｏ　Ｉ）ｌ）ｂの範囲にわたるトリアジンアナログの各々に関する 一連の標準プロフィールを、図１に例示した様に、アナログの各々に関して得ら れた阻害曲線から計算した。ｓｏ　ｐｌ）ｂでのこの理論的計算の結果を図２Ａ に示した。図から分かる様に、パネル全体の百分率で現した阻害のパターンは、 個々の各アナログに関して特有である。

プロフィールを５０１）ｌ）ｂで実験的にも調べ、図２Ｂに示した。

計算したパターンと実験で得たパターンは非常によく似ている。図２Ｂにグラフ で示した結果を、下記の表３に数値で示した。

実験プロフィールを計算した対照プロフィールにマツチングさせることで、未知 試料の確認ができる。従って、計算プロフィールのカタログ的集合は、この様に 未知試料の確認のための対照を提供する。

（以下余白） 反応　プロットの′ 実施例２の図２Ａに示した様なプロフィールを、１０（０００ｐｐｂの範囲の一 連の濃度の７種のトリアジン全てに関して調べた。

各濃度での各トリアジンに対する５種の抗体に関する阻害百分率の値は、５次元 空間中の座標を与える。従って、各濃度での各アナログは、５次元空間中でのプ ロフィールを表す単一の点を与える。

得られたパターンは、抗体のパネルに関して、種々の濃度での個々の被分析物に より表される固有の一連の点を示している。

これらのデータをよりよく視覚化するために、この５次元プロットを、図３に示 す様に２次元のアレーに投影した。

この投影に用いた２次元の平面の配向は、データの分散を最もよく保持する配向 、即ち投影された線がよく分離されている時に、投影図中で、互いに他の頂の上 に位置する点が最も少なくなる配向である。この配向は、データの一次成分によ り特定される平面として数学的に定義される。−次成分により定義されたこの平 面上の投影点は、Ｍａｓｓａｒｔ、　Ｄ、　Ｌ、ら、”Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃ ｓ：　Ａ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ−（１９８８）、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋに８己載されている様に、元のデータの集合状態（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ ｇ）と特性を保持している。

図３に示した様に、ｒｌＪのラベルをつけた点は全て種々の濃度のアトラジンを 、「２」のラベルを付けた水は全て種々の濃度のシマジンを示す、等である。

この実施例で既知の組成に関して記載したのと同様の様式で、試料のプロフィー ルを得ることから、点の位置を調べることで、その試料の被分析物組成が得られ る。

ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧ、　Ｅｌ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．交差反応性の被分析物の集合の少なくとも一つのメンバーの被分析物を含有 する試料の被分析物組成を調べる方法であって： 該集合のメンバーの特性パラメーターに関するｎ個の情報チャンネルを含むパネ ル中のｎ個の情報チャンネルの各々に関して試料を評価し、特性調査（ＳＣ）プ ロフィールを得る工程；および 該試料から得られた該ＳＣプロフィールを、該交差反応性集合のメンバーの既知 の組成から得たＳＣプロフィールの対照集合と比較する工程； を包含する方法。
2. ２．前記評価が、 前記集合のメンバーと反応するｎ個の特異的結合試薬を含むパネル中の特異的結 合試薬の各々と、前記試料とを接触させる工程；および 該パネル中の特異的結合試薬の各々と、該試料との反応性の量を検知および測定 し、ＳＣプロフィールを得る工程；により行われる、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記比較が、 ｎをパネル中の情報チャンネルの数とするｎ次元間の情報チャンネルの各々に、 前記試料に関して得られた値をプロットすることで得た点を確認する工程；およ び該点の位置と、前記パネルと反応させた前記被分析物メンバーの種々の濃度を 表す該ｎ次元の空間中の予め決められた点とを比較し、それにより該試料の被分 析物組成を調べる工程を包含する、請求項１あるいは２に記載の方法。
4. ４．前記比較が、 前記パネル中の各特性パラメーターの値に対応する前記試料中の各候補被分析物 の濃度の値を調べ、各候補被分析物に関するｎ個の調べられた濃度の組を得る工 程；および該パネルの該ｎ個の特性パラメーターの中から最も適切な濃度をもた らすものとして該被分析物を同定する工程；を包含し、 最適にはさらに、特性パラメーターの各々に関する試験結果に重み付を行う工程 ； を包含する、請求項１から３に記載の方法。
5. ５．前記比較が、各ＳＣプロフィール中の各特性パラメーターに関する結果を、 ＳＣプロフィールの対照セットを含有するニューラルネットに提供する工程を含 有する、請求項１から３に記載の方法。
6. ６．前記交差反応性の被分析物の集合が、２−２０個のメンバーを含有する、お よび／あるいは 前記特性パラメーターーのパネルが、２−１０個の特性パラメーターを含有する 、 請求項１から５に記載の方法。
7. ７．前記特異的結合試薬が、抗体、あるいその免疫学的に反応性のフラグメント であり、そして、該抗体が任意に、一本鎖抗体、あるいは組換えで製造された抗 体である、請求項２から６に記載の方法。
8. ８．前記交差反応性の被分析物の集合が、トリアジン類を包含する、請求項１か ら７に記載の方法。
9. ９．交差反応性の被分析物の集合のメンバーに関する特性パラメーターに各々関 連した情報チャンネルのパネルに関するＳＣプロフィールの参照集合を準備する 方法であって；一連の濃度の該メンバーで、該交差反応性の被分析物の集合のメ ンバーの各々に関する該パネルの各情報チャンネル中の特性パラメーターの各々 の値を調べ、上記の濃度の各々で、該パネルに対する該メンバーのＳＣプロフィ ールを得る工程；および 該ＳＣプロフィールを、コンピュータでアクセス可能な形態で記憶する工程； を包含する方法。
10. １０．前記コンピューターでアクセス可能な形態が、交差反応性の被分析物の集 合の少なくとも１つのメンバーの被分析物を含む試料の被分析物組成を調べるた めに有用な、ｎ次元空間中の点のパターンであり、該点のパターンが、各濃度の 被分析物に関する特性パラメーターの値を、ｎ次元空間中のｎ個の各特性パラメ ータに対してプロットして得られる点を同定する工程；および ｎ次元空間中に、既知の被分析物濃度を表す、該点のパターンを得る工程；、 で得られる、請求項９に記載の方法。
11. １１．前記パターンをより低次元の空間に投影し、コンピュータでより扱い易い 前記既知の濃度の表現形式を得る工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方 法。
12. １２．前記特性パラメーターが、前記交差反応性の被分析物の集合のメンバーに 対する特異的結合試薬の反応性を包含し、そして、前記各特性パラメーターの値 を調べる工程が、メンバーの一連の濃度での、該交差反応性の被分析物の集合の メンバーの各々に関する、前記パネル中の特異的結合試薬の各々のアフィニティ ーを調べる工程を包含する、請求項９から１１に記載の方法。
13. １３．Ａ）前記一連の濃度での、前記交差反応性の被分析物の集合のメンバーの 各々に関する、前記パネル中の特異的結合試薬の各々のアフィニティーを調べる 前記工程が、異なった既知濃度の該交差反応性の集合のメンバー被分析物を有す る複数の試料と、該集合のメンバーと反応性の特異的結合試薬の前記パネル中の ｎ個の特異的結合試薬の各々とを接触させる工程；および 該パネル中の特異的結合試薬の各々と、該既知濃度を含有する試料との反応性の 量を検知および測定する工程；で行われる、そして／あるいは、ここでＢ）該メ ンバーの一連の濃度での、該交差反応性の被分析物の集合のメンバーの各々に関 する、前記パネル中の特異的結合試薬の各々のアフィニティーを調べる前記工程 が：各濃度での、該アフィニティーの量を、該前記被分析物の該パネルのメンバ ーに対する阻害曲線から、計算する工程；で行われる、請求項１２に記載の方法 。
14. １４．前記特異的結合試薬が、抗体、あるいその免疫学的に反応性のフラグメン トであり、そして、該抗体が任意に、一本鎖抗体、あるいは組換えで製造された 抗体である、請求項１２から１３に記載の方法。
15. １５．前記交差反応性の被分析物の集合が、トリアジン類である、請求項９から １４に記載の方法。
16. １６．請求項９から１５の方法で得られる、コンピューターでアクセス可能なＳ Ｃプロフィールの対照セット。