JPH06510022A - ある種の腫瘍の治療のためのミュラー阻害物質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ある種の腫瘍の治療のためのミュラー阻害物質の使用本発明は国立衛生研究所の 国立癌研究所によってＣＡ１７３９３の下に付与された政府の支援を受けてなさ れたものである。政府は本発明に関して若干の権利を有する。

発明の分野 本願は糖タンパク質ミュラー阻害物質の有効量を用いである種の腫瘍を治療する ことに関する。具体的には、本願は、外陰類表皮癌腫（ｖｕｌｖａｒ　ｅｐｉｄ ｅｒｍｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、頚部癌腫（ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒ ｃｉｎｏｍａｓ）、子宮内膜腺癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒ ｃｉｎｏｍａｓ）、卵巣腺癌（ｏｖａｒｉａｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓ）および眼球黒色腫（ｏｃｕｌａｒ　ｍｅｌａｎｏｍａｓ）の治療に関する。

そのような治療に使用することができる医薬組成物をも開示する。

発明の背景 ミュラー阻害物質（ＭＩＳ）は胎児精巣によって１４０ｋＤａのグリコノル化さ れたフスルフィドで結合したホモニ量体として生産され、雄胎児中のミュラー管 の退行を引き起こす。還元条件下のケル電気泳動で、このタンパク質は７０ｋＤ ａの見かけ上の分子量のところに移動する。このタンパク質は外因的なプラスミ ンによってタンパク質加水分解的に切断され、完全な５３５アミノ酸単量体の残 基４２７ての切断を伴って、電気泳動的に５７ｋＤａと１２．５ｋＤａ部分とし て移動する２つの異なる断片になる（ベピンスキー、アール・ビーら、　Ｊ、　 Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ２６３：１８９６１−４（＋９８８））。

Ｎｉ１Ｓを精製するには様々な方法が知られている。例えば［精製されたミュラ ー阻害物質とヒト卵巣癌細胞を治療する方法（原題：　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｍｕ ｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏ ｃｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｎｃ ｅｒ　ＣｅPｌｓ）Ｊと いう名称の下に１９８５年１０月１９日に出願され、現在は特許されている米国 特許出願第０６　／　７９２２３３号は、水性極性解離溶液の使用、ＤＮＡおよ びＲＮＡの分離、ゲル濾過クロマトグラフィー溶出による分画並びにＭＩＳの単 離によって精巣からＭＩＳを精製する方法を記述している。「精製されたミュラ ー阻害物質と精製法（原題：　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｍｔｌｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎ ｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｏｆ　Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ）Ｊという名称の下に１９８１年７月２９日に出願された米国 特許第４４０４１８８号は、タンパク質阻害物質による処理、イオン交換クロマ トグラフィー、小麦麦芽レクチン、コンカナバリンＡおよび／または支持された トリアンニル色素でのクロマトグラフィーからなるＭＩＳの精製法を記述してい る。

「ハイブリドーマの作成法と免疫原性物質の精製法」という名称の下に１９８２ 年３月１日に出願された米国特許第４４８７８３３号は免疫アフィニティークロ マトクラフィーを用いてＭＩＳを分離する方法を記述している。ＭＩＳは組換え ＤＮＡ技術から得ることもてきる（ケート、アール・エルら、Ｃｅ１ｌ　４５： ６８５−６９８（１９８６））。

雌の胎児ではミュラー管がファロピオ管、子宮および上部膣中に発達する。ＭＩ ｓが雄胎児におけるミュラー管の退行を引き起こすことは知られている。ＭＩＳ が卵母細胞減数分裂の阻害（タカハソ、エムら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４７　：２２５−２３４（１９８６））、精巣の下降（ハ ドジン、ノエイ・エムら、　Ｅｎｄｃｒ、Ｒｅｖ、　７　：２７０−２８３（１ ９８６））、胎児の肺の発育の阻害（カドリン、イーら、＾ｍ、　Ｊ、０ｂｓｔ ｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１５９・１２９９−１３０３（１９８８））、ＥＧ Ｆ受容体の自己リン酸化の阻害（コウリン、ジエイ・ピーら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ １ｌ。

Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ、　４９ニア５−８６（１９８７）　：　’／ガロ乙エフ・ シーら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　１：１７９−１９P（１ ９８９））および腫瘍成長の阻害（トナホー、ピー・ケイら、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２０５＋９１３−９１５（１９７９）、トナホービー・ケイら、Ａｎｎ、　Ｓｕ ｒｇ、　１９４　＋４７２−４８０（１９８１）　：フラー、ジュニア、エイ・ エフら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　５４　 ：　１０５１−１０５５（１９８２）　：フラー。ジュニアAエイ・ エフら、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　０ｎｃｏ１．２２：１３５−１４８（１９８５） 　：　１９８１年７月２９日に出願されたトナホー、ビー・ケイらの米国特許第 ４４０４１８８号）にある役割を果たしていることも示されている。

米国特許出願第０６／７９２２３３号で立証されたＭＩＳの抗腫瘍効果は牛精巣 から抽出され、部分的に精製された天然のＭＩＳを用いて導かれたものである。

その時以来、牛およびヒトのＭＩＳ遺伝子がクローン化され、ヒトタンパク賃が チャイニース・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現されている。樹立細胞系 に対する初期の抗増殖研究は高度に精製された組換えヒトＭＩＳ（ｒｈＭＩｓ） の使用を伴ったが、これらの研究はヒトの婦人腫瘍細胞に対するｒｈＭＩｓの抗 増殖効果が卵巣癌に限定されることを示唆した（ウォレン、ンエイ・エムら、　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５４９：２００５−２０１１（１９８６））。

発明の要約 過去に報告された腫瘍成長の阻害が牛ＭＩＳによってもたらされたことを鑑み、 本発明者らは高度に純粋な形態のＭＩＳが一般に類似する起源の腫瘍の治療に有 効であるかも知れないと推論した。比較的高度に精製された形態のＭＩＳは過去 に達成されているが、腫瘍治療に関して立証された成功例はほとんどなかった。

したがって腫瘍の成長を阻害するのに有効であろう形態のＭＩＳをさらに開発す ることが望まれていた。

この目標は、患者にミュラー阻害物質の有効量を投与することからなる腫瘍の成 長を阻害する方法であって、該腫瘍が外陰類表皮癌腫、頚部癌腫、子宮内膜腺癌 、卵巣腺癌および眼球黒色腫からなる群から選択される方法を提供する本発明に よって達成された。

本発明のもう１つの目標は本発明の腫瘍の治療に現在使用されている化学療法剤 の濃度を減少させることにある。この目標もまた、化学療法剤とミュラー阻害物 質の組み合わせの有効量を患者に投与することからなる腫瘍の成長を阻害する方 法であって、該腫瘍が外陰類表皮癌腫、頚部癌腫、子宮内膜腺癌、卵巣腺癌およ び眼球黒色腫からなる群から選択される方法を提供することによって達成された 。

さらに本発明は、タンパク質加水分解的に切断されたミュラー阻害物質の有効腫 瘍阻害量と医薬的に許容される担体からなる医薬組成物であって、該腫瘍が外陰 類表皮癌腫、頚部癌腫、子宮内膜腺癌、卵巣腺癌および眼球黒色腫からなる群か ら選択される組成物をも提供する。

図面の簡単な説明 「好ましい態様の説明」の項を添付の図面と共に参照すれば、本発明がよりよく 理解されるであろう。

図１は半固形培地（二層）コロニー阻害検定の結果を表す。この図の左側は本明 細書に記述される免疫アフィニティークロマトグラフィー法（ＩＡＰ−ＭＩＳ） の効果を表し、Ａ４３１、ＨＴ−３、ＨＥＣ−１−Ａ、ＮＩＨ：０ＶＣＡＲ−３ および０Ｍ４３１細胞のコロニー形成が有意に阻害された（３０％Ｍ）。図１の 右側は免疫アフィニティーカラムから前溶出した塩画分（ＩＡＰ−塩）の効果を 表す。塩溶出画分で処理した場合、Ａ４３１．０Ｍ４３１およびＨｅｐ３Ｂコロ ニー形成の刺激が観測された。「＊」という記号は対照と比較した時にｐ＜０． ０５であることを示す。

図２は液体培地コロニー阻害検定の結果を表す。この図の左側はＩＡＰ−ＭＩＳ の効果を表し、Ａ４３１細胞と０Ｍ４３１細胞のコロニー形成が有意に阻害され た（３０％Ｍ）。この図の右側は免疫アフィニティーカラムから前溶出した塩両 分（１、Ａ　Ｐ−塩）の効果を表す。Ａ４３１細胞と０Ｍ４３１細胞のコロニー 形成がＩＡＰ−塩によって刺激された。ＩＡＰ−ＭＩＳとＩＡＰ−塩はＨＴ−３ 細胞とＲＴ４細胞に対して効果を示さなかった。「＊」という記号は対照と比較 した時にｐ〈Ｏ０５であることを示す。

図３はＭＩ　ＳによるＡ４３１コロニー形成の用量依存的阻害を表す。この図の 左側は色素アフィニティークロマトグラフィーによって精製したＭＩ　Ｓ（ＤＧ −ＭＩｓ）を液体培地コロニー阻害検定法を用いて用量を増大させながら試験し た場合を表す。３５および７．０％ＭのＭＩＳ濃度で有意な阻害が観測された。

この図の右側は、ＩＡＰ−Ｍｉｓが２４．４８および９５％Ｍの濃度で有意な阻 害を引き起こしたことを表している。「＊」という記号は対照と比較した時にｐ ＜Ｑ。

０５であることを示す。

図４はＤＧ−Ｍｉｓの抗体吸収を表す。Ａ４３１コロニー形成に対するこの純度 のＭＩ　Ｓの阻害効果はＭＩＳ特異的モノクローナル抗体（５Ｅ１１）での吸収 後に有意に減少したが、正常なＩｇＧによる非特異的吸収の後では減少しなかっ た。

「＊」という記号はＭＩＳ単独の場合と比較した時にｐ＜ｏ、ｏ５であることを 示す。

図５は液体コロニー阻害検定におけるＡ４３１細胞に対する様々な免疫精製画分 の効果を表す。塩および酸溶出の後、ＩＡＰ−Ｍｉｓ（５０％Ｍ）はコロニー成 長を阻害したが、他方、塩溶出画分は成長を刺激した。これら２つの調製物を再 び組み合わせるとＭＩＳ阻害効果が減少した。この組み合わせの生存率はＭ■Ｓ 単独の場合より有意に高かった。「＊」という記号はＭＩＳ濃度は同じであるけ れども、ＩＡＰ−Ｍｉｓのみである場合と比較してｐ＜０．０５であることを示 す。

図６はシスプラチンとＤＧ−ＭＩＳの相加的効果を示す。液体培地コロニー阻害 検定法でシスプラチンとＭＩＳをＡ４３１細胞に対して試験したところ、それら の効果は０．０７８および０．１５６ｍｇ／ｍｌのシスプラチン濃度で相加的で あった。「＊」という記号はシスプラチン＋ＭＩＳを７スプラチン単独の場合と 比較した時にｐ＜０．０５であることを示す。

図７Ａは球形検定の結果を表す。ＤＧ−ＭＩＳ（７％Ｍ）は対照と比較した時に １−ＩＴ−３球形の成長を阻害した（ｐ＜０．０５）。

図７Ｂは球形検定の結果を表す。ＤＧ−ＭＩＳ（７％Ｍ）は対照と比較した時に Ｈｅｐ３Ｂ球形の成長に影響を与えなかった（ｐ＜０．０５）。

図８ＡはＭＩ　Ｓ血清レベルを表す。３３μｇ　ＭＩＳを充填したアルゼット（ ＾１ｚｅｔ）ポンプをＣＤ−１マウスに移植した。移植の２４時間後にＭＩＳの 比較的一定なレベルが達成された。

図８ＢはＭＩｓによるインビボでの腫瘍成長の阻害を表す。Ａ４３１細胞と０〜 １４３１細胞をＣＤ−１マウスの下腎臓嚢空間に移植した。両腫瘍の移植サイズ 比はｋｊ　Ｉ　Ｓ処置群において有意に阻害された。「＊」という記号は対照と 比較した時にｐ＜０．０５であることを示す。

図９は液体コロニー阻害検定におけるＭＩＳによる０Ｍ４３１コロニー形成の用 量依存的阻害を表す。生存率は１００．８．７５６．５０．４．２５，２．９゜ ８および０．９８％ＭのＭｌ！４度について、それぞれ３３％、２９．５％、５ ６゜６％、７１％、１０９．８％および９６．８％てあった。５０．４（ｐ＜０ ．０５）、７５．６（ｐ＜０．００４）および１００．８（ｐ＜領００６）ｎＭ 　ＭＩＳのＭＩＳａ度で有意な阻害が観測された。

図１０は半固形培地（二層）コロニー阻害検定の結果を表す。すべての細胞系が ｒｈＭＩｓによって有意に阻害された。様々な細胞系の生存率は、０Ｍ４３１（ ３ＱｎＭＭＩＳ中）について３４％（ｐ＜０．０１）、０Ｍ４６７（１５０％Ｍ 　ＭＩＳ中）について６１％および０Ｍ４８２（９０％Ｍ　ＭＩＳ中）について ８０％（ｐ＜０．０３）であった。

図１１Ａは０Ｍ４６７細胞の多細胞球形検定の結果を表す。対照群（ｎ＝６）に おける０Ｍ４６７球形の平均移植サイズ比は第５日、第８日および第１１日にそ れぞれ３８５±０４３．４．８５±０．６４および５．５２±０．７８であった 。

ＭＩＳ群（ｎ＝６）における平均移植サイズ比はそれぞれ２．１７士１２６．２ ７９士領３Ｂおよび３，９１土領５９であった。この相違は有意であった（ｐ＜ ００２）。

図１１Ｂは０Ｍ４８２細胞の多細胞球形検定の結果を表す。対照群（ｎ＝１０） における０Ｍ４８２球形の平均移植サイズ比は第３日および第６日にそれぞれ２ ゜１８±０．１７および８２２±０．８１てあった。ＭＩＳ群（ｎ＝１０）にお ける平均移植サイズ比はそれぞれ１．９３±０．１４および９．０±０．６７で あった。

図１２ＡはＣＤ−１照射マウスの下腎臓嚢検定の結果を表す。０Ｍ４３１腫瘍の 移植サイズ比はＭＩＳ群（ｎ＝５）における１、４２±０．４４に対して対照（ ｎ＝７）ては３９３±０．４９てあった。ＭＩＳ処置マウスのそれぞれに８日間 の検定にわたって４８．６μｇのＭＩＳを与えた。各ＭＩＳ群における腫瘍の成 長は対照より有意に低かった（ｐ＜０．００５）。

図１２Ｂはヌードマウスを用いた下腎臓嚢検定の結果を表す。０Ｍ４３１腫瘍の 移植サイズ比はＭＩＳ群（１，６８±００９）と比較して対照の場合（３，０２ ±０１７）に有意に高かった。ＭＩＳ処置群には８日間にわたって４４．７μｇ のＬｉ１Ｓを与えた。このヌードマウス検定の第８日におけるＭＩＳ処置マウス の平均ＭＩＳ血清レベルは７４９ｐＭであった。測定した対照は１０ｐＭ未満の ＭｌＳレベルを有した。各ＭＩＳ群における腫瘍の成長は対照より有意に低かっ た（ｐ＜０．００１）。

図１２Ｃはヌードマウスを用いた下腎臓嚢検定の結果を表す。０Ｍ４３１腫瘍の 移植サイズ比はＭＩＳ群（１，６９±０４３）と比較して対照の場合（３，１４ ±０４０）に有意に高かった。ＭＴＳ処置群には８日間にわたって１３０μｇの ＭＩｓを与えた。このヌードマウス検定の第８日におけるＭＩ　Ｓ処置マウスの 平均ＭＩＳ血清レベルは５７０ｐＭであった。測定した対照は１０ｐＭ未満のＭ ＸＳレベルを有した。各ＭＩＳ群における腫瘍の成長は対照より有意に低かった （ｐ＜０．０５）。

好ましい態様の説明 用語「ミュラー阻害物質Ｊ（ｒＭＩｓＪともいう）はＭＩＳと構造的に類似する 化合物および物質を包含するものとする。このように包含される物質の例はＭＩ Ｓの塩、誘導体およびアグリコン型である。さらに本発明はＭＩＳと実質上同じ 生物学的活性を有するＭＩＳの突然変異型をも包含するものとする。このような 突然変異型の例はアミノ酸配列に欠失、挿入または改変を保持するＭＩＳ分子で あろう。ＭＩＳは任意の哺乳類供給源から得ることができるし、上述のように組 換えＤＮＡ技術の使用によって非補乳類供給源から得ることもでき、またＭＩＳ タンパク質の化学合成によって得ることもできる。

ある遺伝子が組換えＤＮＡ技術の適用によってもたらされたものであるとき、そ の遺伝子を「組換え」遺伝子と呼ぶ。組換えＤＮＡ技術の例にはクローニング、 突体変異誘発、形質転換などが含まれる。組換えＤＮＡ技術はマニアテイスらの ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌＪ　（コールド・スプリングＨ／Ｘ−バー。

ニューヨーク（１９８２））に開示されている。

ＭＩＳを精製するだめの既知の方法のいずれかを用いて、本発明の腫瘍を治療す るための医薬調製物を製造することができる。タンパク質加水分解酵素やＭＩＳ 抗増殖活性の阻害を実質上告まない高度に精製されたＭＩＳを得るためには、本 願と同時に出願された米国特許出願箱　号（代理人整理番号０６０９．３０６０ ０００）（この米国特許出願はすべて参考文献として本明細書の一部を構成する ）に記載の方法の使用が好ましい。この好ましい方法では実質上純粋なＭＩＳ産 物を有する生成物を回収するために、抗原−抗体相互作用の特異性を利用する。

具体的には、この方法では免疫アフィニティークロマトグラフィーの使用を取り 入れるのであるが、回収されるＭＩＳ産物がＭＩＳタンパク質加水加水分解活性 はＭＴＳ抗増殖活性の阻害物質の混入を含まないという点で過去に用いられた方 法を改善するものである。

本発明で用いられる免疫アフィニティークトマトグラフィー法は、有効量のハロ ゲン化アルカリ金属またはハロゲン化アルカリ土類金属での溶出によって、ＭＩ ｓタンパク質加水加水分解活性する酵素またはＭＩＳ抗増殖活性の阻害物質の混 入を免疫アフィニティークロマトグラフィー基盤から効果的に排除する。次に約 ２．５と４．０の間のｐＨを有する酸溶液での溶出によってＭＩＳを回収する。

この最終産物を本明細書てはＩＡＰ−ＭＩＳと呼ぶ。

ＩＡＰ−ＭＩＳは純度９５％までの溶液として得ることができる。この純度は池 の免疫アフィニティー精製法と同等であるが、ＩＡＰ−ＭＩＳはタンパク質加水 分解酵素や１ＭＳ抗増殖活性の阻害物質の混入を実質上告まない。

本発明の精製されたＭＩＳは純度９５％までまたはそれ以上の溶液として得るこ とができる。この純度は他の免疫アフィニティー精製法と同等であるが、本発明 のＮｉ　Ｉ　Ｓ組成物はタンパク質加水分解酵素またはＭＩＳ抗増殖活性の阻害 物質の混入を実質上告まない。

本発明の目的にとって、精製されたＭＩＳとは、純度とは無関係に、タンパク質 加水分解酵素またはＭＩＳ抗増殖活性の阻害物質の混入を実質上告まないＭＩＳ 組成物であると見なされる。精製されたＭＩＳ生成物のゲル電気泳動が１４０ｋ Ｄａまたは７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質を示す時、本組成物はタンパ ク質加水分解酵素を実質上告まないとみなされる。そのような生成物のゲル電気 泳動はＭＩＳの分解産物である時間依存性のタンパク質加水分解断片を示さない であろう。例えば本明細書でさらに記述するＭＩＳの５７ｋＤａ、１２．５ｋＤ ａ、３４ｋＤａおよび２２ｋＤａ分解断片は標準的なゲル電気泳動法では容易に 識別できないであろう。

ＭＩＳ組成物は、ＭＩＳが腫瘍細胞の増殖を遮断する場合に、ＭＩＳ抗増殖活性 の阻害物質を実質上告まないとみなされるであろう。そのような腫瘍細胞の例は 本明細書に記載されているし、米国特許出願箱　号（代理人整理番号０６０９゜ ３０６００００）にも記載されている。これらの例には、外陰類表皮癌腫、子宮 内膜腺癌、頚部癌腫、子宮内膜腺癌、卵巣腺癌および他の眼球黒色腫からなる群 から選択される腫瘍が含まれる。これらの細胞の抗増殖活性の測定は、本明細書 と米国特許出願箱　号（代理人番号０６０９．３０６００００）に記載の方法の いずれかによって達成することができる。

タンパク質加水分解酵素またはＭＩＳ抗増殖活性の阻害物質を実質上含有しない Ｍｉｓを得るためには、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いてＭＩＳ からこれらの混入物を分離する。分離はハロケン化アルカリ金属またはハロゲン 化アルカリ土類金属による酵素または阻害物質の溶出によって起こる。このよう な化合物は一般に溶液状管にあり、ハロゲン化物の有効量は約０．１Ｍと２０Ｍ の間であろう。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウムの イオンが好ましく、ナトリウムが最も好ましい。アルカリ土類金属としては、マ グネシウムとカルシウムのイオンが好ましい。ハロゲン化物としては、フッ素、 塩素、臭素およびヨウ素のイオンが好ましく、塩素が最も好ましい。塩化ナトリ ウムで溶出させる場合、約０１ないし２．０Ｍの溶液が好ましい。所望であれば 溶出が進むにつれてハロゲン化物の濃度を変化させることもできる。これはハロ ゲン化物のモル濃度を段階的に増大させることによって達成することがてきる。

約０．１〜２０ヘット体積の溶液がクロマトグラフィー基盤と接触した後に各段 階を変化させることが好ましい。ただし、このような段階をさらに所望のままに 改良することもてきる。

ハロケン化物は溶液中で有効量のキレート剤を伴ってもよい。これらの試薬は金 属イオンを結合することができ、活性のために金属イオンを必要とする酵素を不 活化することができる。そのような試薬にはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤ ＴＡ）やエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）が含 まれる。キレート剤は０１から５０ｍＭまでの範囲で有効に添加することができ る。

混入したタンパク質加水分解酵素またはＭＴＳ抗増殖活性の阻害物質を分離した 後、約２．０と４．０の間のｐＨを有する酸溶液で溶出させることにより、ＭＩ Ｓを回収することができる。ＭＣＩなどの強酸の希釈液を使用することができる が、それらの比較的温和な酸強度ゆえに有機酸が好ましい。例えばモノカルボン 酸、ノカルポン酸およびトリカルボン酸と共に酸アミンおよびイミンの使用が可 能である。モノカルボン酸として好ましいものは酢酸、プロピオン酸およびラフ 酸である。ンカルホン酸として好ましいものはコハク酸、フマル酸およびリンゴ 酸である。トリカルボン酸として好ましいものはクエン酸である。上記アミンの なかで好ましいものはアスパラキン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸である 。

ハロゲン化物の適用と同様に酸溶液のｐＨも漸進的に変化させることができる。

酸加水分解から保護するべく、精製されたＭＩＳ生成物が溶出した後でその生成 物を６．８と７６の間のｐＨに中和することが好ましい。これは、ＮａＯＨやＮ Ｈ４０８などの様々な水酸化物によって、あるいは所望のｐＨ範囲への生成物の 中和を迅速に行うことができる様々な緩衝液によって達成することができる。

これらの水酸化物が当業者の認識するであろうもののすべてであると見なしては ならない。

本明細書ではタンパク質加水分解的に切断されたミュラー阻害物質からなる医薬 組成物について記述するが、ＭＩＳ１４０ｋＤａホモニ量体とＭＩＳの７０ｋＤ ａサブユニツトもその医薬組成物に包含され得ることを理解すべきである。この 場合、インビボて天然に存在するタンパク質加水分解酵素がタンパク質加水分解 的にｈｉＩｓを切断してその有効型にすることができる。本明細書に記載するタ ンパク質加水分解化合物がそのような酵素の代表例である。

用語「タンパク質断片」は、ＭＩＳの天然に存在するアミノ酸配列から誘導する ことができる合成のアミノ酸配列および天然に存在するアミノ酸配列の両方を包 含するものとする。あるタンパク質がＭＩＳの天然に存在する選択された配列を 断片化することによって得られる場合、あるいは天然に存在するアミノ酸配列の 配列に関する知識またはこの配列をコード化する遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ ）の配列に関する知識に基づいて合成することができる場合、そのタンパク質を ｒＭＩｓの天然に存在するアミノ酸配列から誘導することができる」という。

「タンパク質加水分解的に切断された」という用語は、ＭＩＳのホモニ量体か７ ０ｋＤａサブユニツトのいずれかを切断して、本発明の腫瘍の成長を阻害するタ ンパク質断片にすることができる何らかの物質での処理によって得られるＭＩＳ 産物を、Ｗ味する。一般に、タンパク質加水分解的に切断されて約５７ｋＤａと １２．５ｋＤａのタンパク質断片を形成する時、ＭＩ　Ｓは本発明の腫瘍の治療 において有効である。この様式てＭＩ　Ｓを切断するそのような物質には、プラ スミンなどのセリシブロテアーセおよびエンドペブチダーセが含まれる。他の酵 素もＭｉｓをタンパク質加水分解的に切断することができ、そのような酵素は当 業者によって容易に決定することができるので、決して上記の酵素を総括的また は制限的であると見なすべきではない。

さらに本発明は、選択された配列に加えて天然に存在する配列中には存在しない １またはそれ以上のアミノ酸の含有または欠失を含有するポリペプチドであって 、選択したポリペプチドに対して機能的に類似するか、もしくは拮抗薬活性を保 持するポリペプチドに関する。本発明にとってのそのようなポリペプチドは、そ れらがＭＩＳの活性に実質的に類似する活性か、あるいはＭＩＳの活性に対して 拮抗的な活性を示すという条件の下に「機能的誘導体」と呼ばれる。

担体タンパク質への結合を増進するために付加される追加のアミノ酸残基や本発 明の腫瘍形成治療を増進するために付加されるアミノ酸残基の使用は本発明の範 囲に包含される。ＭＩ　Ｓ組成物は遊離のアミンの形態（Ｎ−末端上）であって もよいし、その酸付加塩の形態てあってもよい。一般的な酸溶液塩はハロゲン化 水素酸塩、部ちＨＢｒ、Ｈｌ、より好ましくはＨＣＩである。有用なカチオンは アルカリ金属カチオンまたはアルカリ土類金属カチオン（即ち、Ｎａ、に、Ｌｉ 。

１　／　２　Ｃａ、１　／　２　Ｂ　ａなど）またはアミンカチオン（即ち、テ トラアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムであって、ここにアルキ ルとは０１〜ＣＩ２てあり得る）である。当該技術分野で知られているように、 ＭＩＳのアミノ酸残基は適当なアミンまたはカルボキシル保護基を用いて保護さ れた形態であってもよいし、未保護の形態であってもよい。

本発明の医薬組成物は医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従っ て製剤化することができ、その場合、ＭＩＳまたはその機能的誘導体を医薬的に 許容される担体賦形剤と合わせて混合物にする。好適な賦形剤とそれらの製剤は 、他のヒトタンパク質、即ちヒト血清アルブミンを含めて、例えばｒ　Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｊｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓＪ　（第１ ６版、エイ・オスロ編、マック、ペンフルバニア州イーストン（１９８０））な どに記述されている。効果的な投与に適した医薬的に許容される組成物を形成さ せるために、そのような組成物は有効量のＭＩＳまたはその機能的誘導体を適当 量の担体賦形剤と共に含有するであろう。

ＭＩＳの「有効量」とは、ヒトまたは動物における本発明の腫瘍の成長を阻害す るに足る量である。本発明によれば、腫瘍移植体の阻害が移植サイズ比の減少に よって示され得る。移植サイズ比は（Ｌ２ｘＷ２ｘＷ２）／（ＬｌｘＷｌｘＷｌ ）として計算され、ここにＬｌは移植体の最長の直径を表し、ＷｌはＬｌに垂直 な直径を表し、Ｌ２はその腫瘍の最長の直径を表し、Ｗ２はＬ２に垂直な直径を 表す。この計算を用いれば、処置した接木の移植サイズ比が処置していない対照 の移植サイス比より小さい場合に、阻害が立証される。患者中に自然に存在する 腫瘍の阻害を評価する場合は、処置の前後でその腫瘍の体積（Ｌ２ｘＷ２ｘＷ２ ）を比較するだけてよい。

有効量は受容者の年齢、体重、健康状態、過去の医学的経緯および感受性などの 規準に応じて変化し得る。また有効量は投与が経口、静脈内、筋肉内、皮下、局 所的であるかどうか、あるいは腫瘍に対する直接的な適用によるものであるかと うかによっても変化するであろう。腫瘍に直接適用する場合、達成されるＭｌＳ の最終面／Ｉｖａ度が少なくとも０．１ｎＭ（好ましくは約０１〜１．０ｎＭ） であることが好ましい。追加的に指定さ第１る投与手段による個々の効果的な投 与は、当業者がよく知っている方法によって容易に決定することができる。例え ば上に詳述したサイス比計算を用いて当業者はいずれの投与手段についても最適 な投与レベルを決定することができる。患者を治療する際には、少な（とも１０ ｎｇ／ｍ１のＭＩ　Ｓ血清レベルを達成することが好ましい。

ｈｉｌｓまたはその機能的誘導体を含有する組成物は、経口、静脈内、筋肉内、 皮下、または局所的に投与することができる。作用の持続時間を制御するために さらなる医薬的方法を使用してもよい。放出が制御される調製物は、ＭＩＳまた はその機能的誘導体を錫化するか、吸着するためのポリマーの使用によって達成 することができる。制御された送達は、放出を制御するべく、適当な巨大分子（ 例えはポリエステル、ポリアミノ酸、ポリヒニルピロリドン、エチレンヒニルア セテート、メチルセルロース、カルホキツメチルセルロースおよび硫酸プロタミ ン）と巨大分子の濃度を混合法と共に選択することによって果たすことがてきる 。

放出が制御される調製物によって作用の持続時間を制御するために考え得るもう １つの方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）または エチレンヒニルアセテート共重合体などのポリマー材料中の粒子中にＭＩ　Ｓを 組み込むことである。別法として、これらのポリマー材料にＭＩＳを組み込む代 わりに、例えばコアセルへ一ンタン技術や界面重合などによって製造されるマイ クロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはセラチンマイ クロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート））中、あるいはコロイド状薬 物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルション、ナノ粒 子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルノタン中にＭＩＳを封入するこ とができる。そのような教示はｒＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓＪ　（上記、１９８０）に開示されている。

タンパク質加水分解的に切断された本発明のＭＩ　Ｓタンパク質断片を含む医薬 組成物には、ヒトまたは動物における腫瘍の成長を阻害することが知られている 化学療法剤が含まれていてもよい。本組成物中に含まれる化学療法剤を特定の新 生物疾患に向けることができる。そのような薬剤はｒＧｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　 Ｇｉ１ｍａｎ’　ｓ　ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏ ｆ　ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＪ　（第８版、ペルガモン・プレス、ニューヨー ク州ニューヨーク、　１９８５）に開示されている。しかし化学療法剤が本発明 の腫瘍の成長を阻害することが好ましい。

一般に、ＭＩＳと組合わされる化学療法剤は本発明の腫瘍の治療に対して相加的 な効果を有するであろう。これは、本発明の腫瘍を治療する際に使用される化学 療法剤の量を製造者が推奨している投与量より減少させることができ、それによ って望ましくない副作用を軽減させることができることを意味する。例えば腫瘍 の治療において減少させる化学療法剤の各員ごとに、ＭＴＳの等価な有効量を加 えることができる。

「等価な有効量」という用語の使用は必ずしも等しい重量または体積量を意味す るものではなく、腫瘍の成長に対して等しい阻害を与えるＭＩＳの１を表すもの と理解すべきである。これは症例毎に磨者について評価される必要があろうが、 例えば上に定義した等しいサイズ減少比を達成する量を比較することによって決 定することができる。典型的な場合、本発明の腫瘍の治療のためにＭＩＳと組み 合わせることがてきる化学療法剤は、患者の体重あたり約０００１ないし１０゜ ０ｍｇ／ｋｇの範囲で有効であろう。ＭＩＳと化学療法剤との組み合わせの投与 は％Ｉ　Ｔ　Ｓ単独の投与と同じ方法で行うことができる。

本発明の医薬組成物中に化学療法剤として含まれるものには、シクロホスファミ ド、イフオスアミト（ｉ　ｆｏｓａｍｉｄｅ）およびメルフアランなどのナイト ロジエン・マスタード、ヘキサメチルメラミンやチオテパなどのエチレンイミン およびメチルメラミン、フルオロウラフルやフルオロデオキシウリジンなどのピ リミジン誘導体、ヒシプラスチンなどのニチニチソウ属アルカロイド、エトポン ド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）やテニポシト（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）などのエビポ ドフイロトキノン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌ　１ｏｔｏｘｉｎ）、アクチノマイ ノンＤ、トキソルビノン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、プレオマインニノおよび ミトラマイノンなどの抗生物質、インターフェロンαなどの生物学的応答変調因 子、／スプラチンやカルボプラチンなどの白金配位錯体、ジエチルスチルベスト ロールやエチニルエストラジオールなどのニストロケン、グルタミン（ｆｌｕｔ ａｍｉｎｅ）などの抗アントロジエン、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ） などのゴナドトロピン放出ホルモン類縁体がある。デカルバノン（ｄｅｃａｒｂ ａｚｉｎｅ）、ニトロソウレア、メトトレキセート、ンチセン（ｄｉｔｊｃｅｎ ｅ）およびプロカルバジンなどの他の化合物も有効である。当然のことながら、 ここに列挙したものを包括的または限定的であるとみなすべきてはないから、当 業者が知る他の化学療法剤で置き換えることは容易である。

本発明を一般的に記述し終えたので、下記の特定の実施例を参照することによっ て本発明がより容易に理解されるようになるであろう。ただしこれらの実施例は 単に例示を目的として記載されるものであって、特に明言しない限り制限を意図 するものではない。

実施例Ｉ ■　材料と方法 Ａ、ｒｈＭＩｓの生産と精製 ケイトラノ方法（ケイトアール・エルら、Ｃｅ１ｌ　４５：６８５−６９８（１ ９８６））に従って、ＭＩｓのｃＤＮＡとケノムＤＮＡをクローニングした後、 ヒトＭＩＳ遺伝子とジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の両方の直鎖状転写物てン ヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯを同時トランスフエクノタンした。トランス フエクノタンされｔこＣＨＯ細胞をメトトレキセート中で増幅させ、リボヌクレ オシドとデオキシリボヌクレノ［・を含まず１０％牛ＭＩＳ非含有雌牛脂児血清 （Ｆｅ２）を補足したアルファ最少必須培地中３７°Ｃて生育させた。２つの異 なるＭＩＳｍ製法を用Ｌ１て部分的に精製されたＭＩＳか均一なＭＩＳのいずれ かを得た。第１の方法では、ノ（トチ・ヌク（ベトチック。ジー・ビーら、Ｃｅ １ｌ　３４：３０７−３１４（１９８３））の方法に従って、連続的なアニオン 交換クロマトグラフィーと色素アフィニティークロマトグラフィー（ＤＧ−ＭＩ Ｓ）を用いることにより、１〜１０％濃度のＭＩＳを得た。第２の方法では、米 国特許出願第　号（代理人整理番号０６０９．３０６００００）ｌこ詳述されて いる免疫アフィニティークロマトグラフィー法（ＩＡＰ−ＭＩＳ）を使用して９ ０〜９５％濃度のＭＩＳを得た。

ここで使用した免疫アフィニティークロマトグラフィー法は組換えヒトＭＩＳ（ ｒｈＭＩｓ）の回収を目指すものである。ヒトｒｈＭＩｓ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝 子の直鎖状構築物でトランスフエク／タンし、３０％Ｍメトトレキセート選択に よって増幅し、改良したローラーホトルか、エプスタイン（エプスタインら、Ｉ ｎＶｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ　２５（２）：２ １３−６（１９８９））が記述しているステンレス鋼コイルの４リツトルバイオ リアクター中で、５％雌牛脂児血清（ＦＦＣ８）、１０ｍｇ／ｍ　］アアミカシ ン＾ｍ１ｋａｃｉｎ）、１．３ｇ／ｌ　Ｉ−グルタミン、２．０ｇ／Ｉ　ｄ−ク ルコースおよび０．１　ｇ／　ｌビルビン酸ナトリウムを補足したアルファ変法 イーグル培地（ａ−ＭＥＭ　）中、ヌクレオシドの非存在下で密集成長させたチ ャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の調整培地からタンパク質を精製し た。培地を３〜４日毎に集め、−２０℃に保存した。培地を融解し、ワットマン ＃４濾紙を通して濾過することによって残漬を除去し、３０ｋＤａ排除の限外フ ィルターｔ−有するミニタン（Ｍｉｎｊｔａｎ）（ミリポア）で２０倍に濃縮し 、精製するまで一７０℃で保存した。プロティンＡ−セファロース（バイオラド ）約５０ｍｇと、／ＸＸドレンハドジン、ビー・エルら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　７０：］］６−２２１９９０））が記 述しているモノクローナル抗体であって、製造者の指示に従ってアフィゲル−１ ０アカロース樹脂（バイオラド）に共有結合（結合効率的８０％）させた精製モ ノクローナル抗ヒトｒｈＭＩｓ抗体［６Ｅ１１］を用いて、免疫アフィニティー カラム５ｍｌを構築した。このカラムを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（＋）ＨＴ、４） １００ｍｌで平衡化し、濃縮した培地２００ｍ１を４℃で１力ラム体積／時間の 速度で充填した。充填の後、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに戻るまで（６ ０〜１００ｍ１）、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）てカラムラ洗浄シタ。

このカラムに結合したｒｈｌｖｊｌｓの溶出は、２．０Ｍチオオンン酸ナトリウ ム（ＮａＳＣＮ）か、１Ｍ酢酸、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ３，０）を用いて 、０．５ＭＮａＣ］、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．００１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ　 ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７４）を含有する前溶出段階を伴って、あるいはこの前溶出段 階を伴わずに行われた。ｒｈＭＩｓタンパク質の大半は１つの２ｍ１分画中に溶 出し、それを直ちにＮａＯＨかＮＨ４ＯＨで７０と７４の間のｐＨに中和した。

その分画の最初のｐＨと中和の技術に応じて、希釈効果は１０〜５０％の範囲で あった。

トナホーのラットミュラー管退行器官培養検定法（ドナホー、ピー・ケイら、　 Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、　２３：ｌ４ｌ−１４８（１９７７））を用いて、 ＭＩＳの生物学的活性をインビトロで検出した。ハトジン（上記）の方法に従っ て、ＭＩＳのための酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてＭ ＩＳ４度を評価した。タンパク質濃度はプラントフォートの方法（ブラットフォ ートエム−エム、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８−２５４（１ ９７６））で測定した。

Ｂ　ＭＩＳ吸収用のモノクローナル抗体の調製中ＭＩＳについて過去に記述され た方法（ハドジン、ピー・エルら、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ、　Ｍｅｔａｂ、　７０：　１６−２２（１９９０）　：マノエソトーハンタ ー、エムら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２８：P３２ ７−３３（１９８２））を用いて、雌のＡ／Ｊマウス（ンヤクジン・ラホラトリ ー、メイン州バー・バーバー）を免疫アフィニティー精製したｒｈＭＩｓで免疫 化することによってモノクローナル抗体を作成した。コーラ−（コーラ−、ンー 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２８５−９８（１９８１））が記述 しているようにして、抗ＭＩＳ抗体を生産する牌臓細胞を収集し、ハイブリトー マを作成した。１つのモノクローナル系（６Ｅ１１）を選択し、１５％ＦＣ５を 補足したダルヘノコ変法必須培地中で増幅させた。５０％（Ｎ１−（、）、ＳＯ ，を用いて６Ｅ１１調整培地から抗体を沈殿させ、プロティンＡ−セファロース ＣＬ−４Ｂ（ンクマ、ミスーり州セント・ルイス）クロマトグラフィーでさらに 精製した。

Ｃ細胞系 ヒト外陰類表皮癌腫から導かれた細胞系Ａ４３１．頚部癌腫のヒトリンパ節転移 からのＨＴ−３、ヒト卵巣腺癌からのＮＩＨ：○〜“ＣＡＲ−３、ヒト子宮内膜 腺癌からのＨＥＣ−１−Ａ、ヒト膀胱転移細胞乳頭腫からのＨＴ４、ヒト肝細胞 性癌瞳からのＨｅｐ３Ｂをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから 入手した。ヒト眼球黒色腫からの０Ｍ４３１はマサチューセッツ・ジェネラル・ ホスピタルのンエイムス・エプスタイン博士から入手した。

Ａ４３１、ＨＴ−３、ＮＩＨ：ＯＮ７ＣＡＲ−３，０Ｍ４３１およびＨｅｐ３Ｂ 細胞を、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含み（α−ＭＥＭ＋） 、１０％雌ＦＣ５と２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補足したアルファ最少必須培地で 維持した。ＨＥＣ−１−ＡとＨＴ４は、１０％雌ＦＣ５を補足したマツコイ５Ａ 培地で維持した。研究の前に細胞を連続的に継代培養し、次いで７０〜８０％密 集時にトリプ／ン処理することによって同調性を達成した。次にこの増殖性の細 胞集団を１５０ＯＲＰＭで５分間遠心分離し、１０％雌ＦＣ３補足培地で再腎濁 した。血球針で細胞を計数した。

Ｄ　半固形培地（二層）コロニー阻害検定ハンバーガーの従来の二層アカロース コロニー阻害検定法（ハンバーガー、エイ・ダブリュら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９ ７：４６１−４６３（１９７７）　；　／＼ン１＜−ガー、エイ・ダブリュら、 Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６０：８４６−８５４（１９７７））て、Ａ ４３１、ＨＴ−３、ＨＥＣ−ＩＡＳＮＩＨ：０■ＣＡＲ−３，０Ｍ４３１および Ｈｅｐ３Ｂ細胞を用いて、ＴＡＰ−Ｍｉｓと免疫アフィニティーカラムからの塩 溶出分画（ＩＡＰ−塩）の効果を試験した。３５ｍｍ培養皿の下層は１０％雌Ｆ Ｃ３補足α−ＭＥＭ＋中の０６％アガロース（シグマミズーリ州セント・ルイス ）１ｍｌを含有した。上層は１０％雌ＦＣ８補足アルファーＭＥＭ＋中の０３％ アカロース、試験すべき細胞（Ａ４３１、ＨＴ−３およびＯＮ・１４３１につい ては５００００細胞／ｍｌ　：ＨＥＣ−１−Ａ、ＮＩＨ：ＯＶＣＡ　Ｒ−３およ びＨｅｐ３Ｂについては２５０００細胞／ｍ１）、表皮成長因子（ＥＧＦ）１０ ％ｇ／ｍｌ（ノグマ、ミズーリ州セント・ルイス）並びに次に挙げるもののうち の１つからなった　（ａ）ＩＡＰ−Ｍｉｓ（最終濃度３０ｎＭ）、（ｂ）ＩＡＰ −塩（最終タンパク質濃度１９３μｇ／ｍｌ）または（Ｃ）陰性対照としての賦 形剤緩衝液。これらの培養皿を５％ＣＯ２を含む湿潤化した空気中３７°Ｃて１ ０〜２１日間インキュベートした。３０細抱以上を伴うコロニーを逆相顕微鏡に コン）で計数した。その結果を対昭群に対する生存率として表した（試験群中の コロニ−数×１００／対照群中のコロニー数）。

Ｅ　液体培地コロニー阻害検定 ２４穴培養プレート（ファルコン、カリフォルニア州オクスナード、＃３０４７ ）に単−細胞呼局液を入れて生育させた。細胞接着の後、凝集することなく良好 な単一細胞分散を伴うものだけをさらなる研究に使用した。試験すべき薬物を各 ウェルの全体積の１／１０未満の体積で加え、３つ一組として試験した。５％Ｃ Ｏ２を含む湿潤化した空気の中で３７℃で細胞をインキュベートした。５〜７日 で形成したコロニーをキームザ溶液で染色し、３０細抱以上を伴うものを逆相顕 微鏡か、あるいは画像分析装置に基づく計算機によって計数した。

Ｆ　コロニー形成に関するＩＡＰ−ＭＩＳとＩＡＰ−塩の比較路ウェルにつき０ ．３ｍｌのＡ４３１（２５０００細胞／ｍｌ）、０Ｍ４３　Ｈ２５０００細胞／ ｍ１）、）（Ｔ−３（５０００細胞／ｍ１）およびＨＴ４（５０００細胞／ｍ１ ）を用いて、ＩＡＰ−ＭＩＳ（最終濃度３０ｎＭ）とＩＡＰ−塩（最終タンパク 質濃度１９３Ｂｇ／ｍｌ）を液体培地コロニー阻害検定法で試験した。単層成長 を抑制し、コロニー形成を刺激するべく、リ−の方法（ツー。ケイら、Ｅｘｐ、 　Ｃｅ１．ｌＲｅ５．１７３：１５６−１６２（１９８７））に従って、ＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌをＡ４３１と０Ｍ４３１に添加した。賦形剤緩衝液対照に対する 生存率として結果を表した。

ｃ、ＭＩｓによるＡ４３１細胞の用量依存的阻害賦形剤緩衝液で希釈した後、Ａ ４３１細胞（２５０００細胞／ｍ１．ＥＧＦ５０　ｎ　ｇ／″ｍ　］　）を用い る液体培地コロニー阻害検定法で、ＤＧ−Ｍｉｓを最終濃度０９．１８．３５お よび７．ＯｎＭて試験した。ＩＡＰ−Ｍｉｓを１２．２４．４４８および９６　 ｎ　Ｍの１度て試験した。結果を賦形剤緩衝液対照に対する生存率として表した 。

Ｈ，ＭＩＳの抗体吸収 使用の前に、Ｍ■Ｓモノクローナル抗体（６Ｅ１１）と正常なウサギＩｇＧ（ダ コ・コーポレインタン、デンマーク・ロフト１０８）を血清非含有α−ＭＥＭ＋ 中に透析した。過去の実験ては１３のＭＩＳ：Ａｂ比てＭＩＡ活性の最大吸収が 示された。そこで１７４μｇの６Ｅ１１を５６μｇのＤＧ−ＭＩＳに加えた。

正常なウサギＩｇＧを培養培地で希釈し、同じ１３の比率でＭＩｓに加えること によって非特異的な吸収を決定した。トランスフェクションされていない野生型 のＣＨＯ細胞の調整培地から精製した等価な量のタンパク質を、上述のように１ ３で抗体と混合し、これを陰性対照とした。これらの調製物を４℃で１２時間混 合した。

プロティンＡセファロース９ＣＬ−４Ｂ（ングマ、ミズーリ州セント・ルイス） を予め血清非含有培地で洗浄した後、これを加え、４℃でさらに１２時間インキ ュベートした。その混合物を遠心分離し、その上清を、Ａ４３１細胞（２５００ ０細胞／ｍ１．ＥＧＦ　５０ｎｇ／ｍｌ）を用いる液体培地コロニー阻害検定法 で試験した。各群のコロニー数を野生型陰性対照と比較することにより、各群の 生存率を計算した。

１、ＩＡＰ−ＭＩＳと塩溶出分画（ＩＡＰ−塩）の同時処置■、八Ｐ−ＭＩＳを 等体積のＩＡＰ−塩（タンパク質濃度０．１９９ｍｇ／ｍｌ）と混合して、最終 Ｍｌ！ＩＪＩ度を５０ｎＭとした。液体培地コロニー阻害検定法でＡ４３１細胞 （２５０００細胞／ｍ１．ＥＧＦ　５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて試験し、ＩＡＰ− ＭＩＳ、ＩＡＰ−塩および賦形剤緩衝液と比較した。各群のコロニー数を賦形剤 緩衝液陰性対照のコロニー数と比較することによって生存率を計算した。

Ｊ、ＭＩＳと７スプラチンの同時処置 ンスプラチン（ブリストル・ラボラトリ−、ニューヨーク州シラキュース）を血 清非含有培養培地で希釈することによってＯＳＯ，０７８，０，１５６，０，３ １２および０６２４μｇ／ｍｌの濃度にし、液体培地コロニー阻害検定法でＡ４ ３】細胞（２５０００細胞／ｍ１．ＥＧＦ　５０ｎｇ／ｍｌ）を用イルコとニよ す、ＤＧ−Ｍ　Ｉ　５（ＪｔｕｉｌｌｔＪｔ７　ｎＭ）ト共ニ、あるいはＤＧ− ＭＩｓなしで、３−）−組として試験しこ。賦形剤緩衝液を陰性対照として使用 した。各投与量におけるコロニー成長の数を賦形剤緩衝液陰性対照で達成された 数と比較することによって生存率を計算した。

Ｋ　多細胞腫瘍球形検定 ユハスらが記述した方法（ユハス、ノエイ・エイら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３ ７：３６３９−３６４３（１９７７））によってＨＴ−３細胞とＨｅ　ｐ　３　 Ｂ細胞の多細胞腫瘍球形を作成した。簡単に述べると、１０％雌ＦＣ５補足α− ＭＥＭ＋　１０ｍ１中のＨＴ−３またはＨｅｐ３Ｂ　１０６細胞を１０ｃｍ培養 皿中の１％アカロースの上部に置き、５％ｃ。

２を含む湿潤化した空気の中で３７℃でインキュベートした。通常２〜５日で球 形が形成した。１％アカロース０．５ｍｌを２４穴培養プレート（ファルコン、 カリフォルニア州オクスナート＃３０４７）の各ウェルに加えることにより、使 用の前に底層を形成させた。類似したサイズ（直径約２５０μｍ）の個々の球形 を切開用顕微鏡下で選択し、アカロース層の上部に１０％雌ＦＣ５補足α−ＭＥ Ｍ＋０．５ｍｌを含有する各ウェルに１つの球形をマイフロピペントて移した。

第０日に、最長の直径（Ｌ）と最長の直径に垂直な直径（Ｗ）によって球形のサ イズを測定した。次に（Ｌ　ｘ　ＸＶ　ｘ　Ｗ）として体積を表した。各細胞型 の球形含有ウェル６個をＤＧ−ＭＩＳ（最終ｆｉ［７ＢＭ）か賦形剤緩衝液で処 置した。第３日、第６日および第９日に再度体積を測定した。第０日における同 じ球形のサイズと比較することによって、異なる間隔における各球形のサイズ比 を得た。各群の平均サイズ比を成長曲線中の時間に対してプロットし、他の群と 比較した。

■、　下腎＠嚢検定 （辛１ニフィンケルトら（フィンケルト、エイチ・ンエイラ、　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　４７：３８２４−３８２９（１９８７））によって改良されたホンエ ン（ホンエン、エイ・セットら、Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

４７：２８１−２９３（１９７９））の方法に従って、Ａ４３１細胞と０Ｍ４３ １細胞を試験した。

これらの細Ｑｎ１０７個を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離してベレットを形成 させた一フィブリノーケン（７グマ、ミズーリ州セント・ルイスＰＢＳ（ｐＨ７ ，４）で２０ｍｇ／ｍｌに溶解したもの）１５μｍをそのペレットに加えた後、 トロンピン８１Ｊ１（／りで、ミス−り州セント・ルイス、２倍強度ダルヘソコ 変法必須培地で２０単ｆ、７／ｍｌに溶解したもの）を加えた。移植の準備とし て、このようにして形成した細胞塊をおよそ１００個の断片に切断した（各１ｍ ｍ３は約１０５細胞を含有する）。

腫瘍の移植時に腹腔内に設置したアルゼットミニ浸透ポンプ（＃２００１．アル ザ、カリフォルニア州パロ・アルド）によってＭＩｓを送達した。これらのポン プは２０９±６μｍの充填体積を持ち、およそ８日の送達時間の間、それらの内 容物を１，０３±０．０４μｊ／時開の速度で放出する。上記ポンプにＩＡＰ− ＭＩＳ（ＭＩ　Ｓ　：　１５９μｇ／ｍ１（ＥＬＩＳＡによる））または賦形剤 緩衝液を充填した。ＭＩ　Ｓ群の各マウスにはこの実験の過程で約３３μｇ（２ ３０μＭ）の総ＭＩＳ投与量を与えた。

実験の１６〜２４時間前に、ウィルスと病原体を含有しない雌のＣＤ−１マウス （１０週齢、平均３５ｇ、チャールス・リバ町ブリーディング・ラボラトリ−、 マサチューセソッ州つィルミントン）に、マーク−１（Ｍａｒｋ−１）セシウム −１３７照射によって６４０ラドの全身照射を与えた（ガジュウスキー、ダブリ ュ・エイチら、Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｆｏｒｕｍ　３８：４６８−４７０（１９８ ７））。１０％ベントシトヒタール（アボット・ラトラトリー、イリンイ州ノー ス・シカゴ）０．３ｍｌの腹腔内注射て麻酔を誘発した後、マウスの左脇腹に切 開を施し、左腎臓を体外に出した。１９ゲージ針トロカールを用いて下前空間を 開いた。この空間に５−０ナイロン縫合糸の断片（長さ約１ｍｍ）（これは接眼 レンズマイクロメーター測定を較正するため並びに腫瘍の位置を特定するために 用いられた）と共に細胞塊を導入した。２４匹のマウスにＡ４３１細抱塊を移植 し、１２匹のマウスに０Ｍ４３１細胞塊を移植した。移植体の最長の直径（Ｌｌ ）、最長の直径に垂直な直径（ｗｌ）および縫合糸の長さを、切開用顕微鏡の接 眼レンズマイクロメーターで測定した。これらの動物を腹腔内に設置したアルゼ ットポンプによって送達されるＩＡＰ−Ｍｉｓまたは賦形剤緩衝液のいずれかで 処置した。６時間、２４時間、４８時間、１２０時間（５日）および１９２時間 （８日）に、選択した動物から眼窩出血によって血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡ によって血７′ｍＭＩｓレベルを測定した。第８日にこれらの動物を犠牲にした ｃ２人の独立した研究者が腫瘍の最長の直径（Ｌｌ）、最長の直径に垂直な直径 （Ｘ八“１）および縫合糸の長さを盲目的に測定した。測定値を較正した後、移 植サイズ比を（Ｌ２ｘＷ２ｘＷ２）／（Ｌｌ、ｘＷｌｘＷｌ）によって表した。

腎臓の組織学的切片をも入手して調べた。嚢胞性変化を伴う腫瘍を排除した。

Ｍ　統計学的分析 液体培地コロニー阻害検定と半固形培地コロニー阻害検定の結果を、イエーツ（ Ｙａｔｅｓ）補正を伴うか、もしくはイエーツ補正を伴わないチニ乗（Ｃｈｉ　 ５ｑｕａｒｅ）検定によって分析し、多細胞球形検定と下腎臓嚢検定をスチュー デシト（Ｓｔｕｄｅｎｔ）を検定によって試験した。ｐ＜Ｑ。０５を統計学的に 有意であると見なした。

■結果 、八　半固形培地（二層）コロニー阻害検定３０ｎＭのＴＡＰ−ＭＩＳと共にイ ンキュベーションした後の様々な細胞系の生存率は、Ａ４３１について４５％、 ＨＴ−３について７４７％、ＨＥＣ−１，−Ａについて５４％、ＮＴＨ０ＶＣＡ Ｒ−３について５９％、０Ｍ４３１について３４％、Ｈｅｐ３Ｂについて１１４ ％てあった。対照と比較した場合、ＭＩＳで処置した後の生存は、Ｈｅｐ３Ｂを 除くすべての細胞系でＩＡＰ−ＭＩＳによって有意に阻害された（ｐ＜０．０５ ）。Ｈｅｐ３Ｂの成長はＭＩＳによって阻害されなかった。ＩＡＰ−塩と共にイ ンキュベーションした後の生存率は、Ａ４３１について１７２％、ＨＴ−３につ いて９３％、ＨＥＣ−１−Ａについて９２％、Ｏ〜１４３１１ｍツイテ１２０％ 、ＮＴＨ：０ＶＣＡＲ−３について１０５％、Ｈｅｐ１３３Ｂについて１７３％ てあった。刺激効果はＡ４３１．０Ｍ４３Ｆ−およびＨｅｐ３ＢＩＢ胞について 有意であった（ｐ　＜　０．０５Ｘ図１）。

Ｂ　液体培地コロニー阻害検定法を用いたコロニー形成に対するＩＡＰ−ＭＩＳ とＩＡＰ−塩の効果 ３０　ｎ　ＭのＩＡＰ−ＭＩＳて処置した場合、生存率はＡ４３１について５５ ９％、０ｈ１４３１について３６．８％、ＨＴ−３について１００．５％、ＨＴ ４について１１５８％であった。ＩＡＰ−塩（最終タンパク質濃度１９３μｇ／ ｍｌ）で処置した場合、生存率はＡ４３１について１６９０％、０Ｍ４３１につ いて２２６７％、ＨＴ−３について１０１．６％、ＨＴ４について９６５％であ った。

ＩＡＰ−ＭＩＳの阻害効果とＩＡＰ−塩の刺激効果はＡ４３１コロニー形成と０ Ｍ４３１コロニー形成について有意であった（ｐ＜０．０５Ｘ図２）。

Ｃ，ＭＩＳによるＡ４３１コロニー形成の用量依存的な阻害０．９．１，８．３ ．５および７．０％ＭのＤＧ−ＭＩＳｆｉ度についての生存率はそれぞれ１０３ ．４％、８１．４％、６１．３％および２６．５％であった。３．５％Ｍと７． ０％ＭのＤＧ−Ｍｉｓ濃度で有意な阻害が認められた（ｐ＜０．０５）。

１２．２４．４８および９６％ＭのＩＡＰ−ＭＩＳ濃度にツイテノ生存率はそれ ぞれ１０９．７％、７１１％、５６．６％および３３．３％であった。２４．４ ８および９６％ＭのＩＡＰ−Ｍｉｓ濃度で有意な阻害が認められた（図３）。し たがってＤＧ−ＭＩＳはＴＡＰ−ＭＴＳより１０〜１４倍強力であった。

Ｄ、ＭＩＳの抗体吸収 ＭＩＳ用のＥＩｊＳＡによって測定したＭＩＳレベルは、陽性対照（Ｍｉｓのみ ）について９．０％Ｍ、正常なＩｇＧ吸収（非特異的）の後には８．８％Ｍ、モ ノクローナル抗体吸収（特異的）の後には０．６２　ｎＭであった。野生型の陰 性対照はいずれも０に等しいＭＩＳレベルを有した。生存率は、ＭＩＳ単独につ いて４２９％、正常なＴ　ｇＧ（非特異的吸収）について３８．０％、モノクロ ーナル抗体（特異的吸収）について７４．２％であった。ＭＴＳ活性の有意な非 特異的吸収はなかった（陰性対照と比較してｐ＞０．０５）。モノクローナル抗 体吸収後の生存率は陽性対照（ＭＩ　Ｓのみ）および正常なＩｇＧより有意に高 かった（図４）。

Ｅ　塩溶出分画（■ＡＰ−塩）はＴＡＰ−Ｍｉｓを阻害するＡ４３１ｍ胞（７） 生存率はＩＡＰ−ＭＩＳのみ（５０％Ｍ）について５１．３％、ＩＡＰ−塩のみ について１１６９％、これら２つの組み合わせ（ＭＩＳ　５０％Ｍ）について８ １６％であった。ＩＡＰ−ＭＩＳのみとＩＡＰ−Ｍｉｓ／ＩＡ、Ｐ−塩の組み合 わせとの間の相違は存意であった（ｐ＜０．０５Ｘ図５）。ＩＡＰ−塩とＩＡＰ −Ｍｉｓの２つの別個の調製物の還元後にＳＤＳケル電気泳動を行った。ＩＡＰ −塩には数個のタンパク質バンドが１４〜４３ｋＤａの領域に認められたが、Ｉ ＡＰ−Ｍｉｓには存在しなかった。

Ｆ　シスプラチンとＭＩＳの相加的効果０．００７８．０．１５６．０．３１２ および領６２４μｇ／ｍｌのシスプラチン濃度について、Ａ４３１細胞の生存率 はそれぞれ１００％、５６．５％、３８．７％、３４．３％および１０．８％で あった。７％Ｍ　ＤＧ−ＭＩ　Ｓを添加すると、同じ濃度のシスプラチンについ て生存率が３９．３％、３２．２％、２３．１％、２０４％および５．４％にな った。シスプラチンのみとシスプラチン＋ＭＩＳの生存率は０．０７８と０１５ ６μｇ／ｍｌのシスプラチン濃度で有意に異なった（図６）。

Ｇ　多細胞球形検定 対照群（ｎ＝６）におけるＨＴ−３球形の平均サイズ比は第３日、第６日および 第９日にそれぞれ１１５±０．０４．１４４±０．０２および１５１．９６±０ ゜１１であったが、Ｎｉ　Ｉ　Ｓ群（ｎ＝６）では０．９８±０．０４、領９４ ±領０４および１０８±０．０６（図７Ａ）てあった。対照群（ｎ＝６）におけ るＨｅｐ３Ｂ球形の平均サイズ比は第３日、第６日および第９日にそれぞれ２． ５６±０．０５．５６４±０５３および１３０７±１．０９であったが、ＭＩＳ 群（ｎ＝６）ては２３６±０．２５．５．７７±０５４および１４．３０±０５ ４であった。Ｈｅｐ３Ｂ球形の成長はより迅速で、ＭＩＳによって阻害されなか った（図７Ｂ）。

１１　下腎臓嚢検定 マウス血清中のＭＩＳレベルはＭＩＳを充填したアルゼットポンプの移植後２４ 時間から第８日まて比較的安定であった（図８Ａ）。第２日から第８日までの１ ４個の血液試料の平均ＭＩＳレヘレベ１９１±２．７％ｇ／ｍ＋（約１４０　ｐ Ｍ）であった。刻ａマウスの血清ＭＩＳレベルは検出不能であった。移植したＡ ４３１腫瘍の移植サイズ比は対照群（ｎ＝１２）て３７０±０３１てあったのに 対し、ＭＩＳ群（ｎ＝１２）ては１５０±０８２６てあった。０Ｍ４３１腫瘍の 移植サイズ比は対照（ｎ＝７）で３９３±０４９であったのに対し、ＭＩＳ群（ ｎ＝５）では１．−４２±０．４４であった。Ｎｌｌ５群における腫瘍の成長は 両細胞系共に対照より有意に低かった（ｐ＜０．０５）（図８Ｂ）。

■、考察 増幅したＣＨＯ細胞系の調整培地から得られる組換えヒトＭＪＳ（ｒｈＭＩｓ） であって、連続的なイオン交換と色素アフィニティークロマトグラフィーによる か（ＤＧ−ＭＩ　Ｓ）、もしくは免疫アフィニティークロマトグラフィーによっ て（ＩＡＰ−Ｍｉｓ）精製したものを、いくつかの成長検定法で様々な細胞系に 対して試験した。半固形検定では高度に精製したＭＩＳによって阻害されたが、 液体検定では阻害されなかったＨＴ−３（頚部癌腫）細胞系を例外として、全般 的にみて液体検定と半固形検定の結果は極めて類似していた。細胞−細胞相互作 用と栄養素によって影響される成長様式を伴う腫瘍微小領域を反復させるために 多細胞球形検定を使用した。ＨＴ−３細胞は充分な球形を形成し、これはＭＩＳ によって阻害された。Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌腫）の球形成長についてはＭＩＳ効 果が認められなかった。３種類のインビトロ検定すべてを利用できることは、各 腫瘍に関する最適な条件の選択を可能にする。

ＭＩＳを抗癌剤として評価する際には、利用可能な化学療法との相互作用を考慮 することが重要である。これを評価するために、ＭＩＳとシスプラチンを単独で 、並びに、様々に組み合わせて試験した。ＭＩＳとシスプラチンの阻害効果は相 加的であるのて、ＭＩＳを与える場合にはシスプラチンの投与量を下げることが でき、それゆえにこの生物学的変調物質は選択されたヒト悪性腫瘍の多様性治療 における佐剤として機能するかもしれない。ＭＩＳまたはＭＩＳ＋細胞毒性物質 の反復投与を試験するために液体コロニー阻害検定法と球形検定法を使用するこ とができる。しかし、最初は増殖性の細胞集団に最も影響を与えるＭＩＳとそれ に続く細胞毒性物質の非同調的添加が好ましい。

精製度は低いがＤＧ−Ｍｉｓもインビトロでの細胞成長の阻害を一貫して示した 。ＭＩＳ効果の特異性はＭＩＳモノクローナル抗体による聞書効果の遮断によっ て立証された。

ウォレンら（ウォレン、ノエイ・ダブリュら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９ ：２００５−２０１１（１９８６））は免疫精製したＭＩ　Ｓ調製物を様々な樹 立細胞系に対して試験した時に、最小限度の抗増殖活性しか報告しなかった。実 施例１において、１Ｍ酢酸による溶出に先立って塩溶用段階を加える前には、Ｉ ＡＰ−Ｍｉｓで同じく乏しい応答が観測された。さらに、免疫アフィニティーカ ラムから溶出した塩分画は実際にいくつかの細胞系において成長刺激効果を示し た。この塩分画の電気泳動は１４〜２０ｋＤａの領域に数本のバンドを示し、こ れらのバンドは続いて１Ｍ酢酸で溶出させた分画には存在しない。トランスフェ クションされていない野生型ＣＨＯ細胞の濃縮した培養培地を同じ精製工程に付 したところ、Ａ４３１細胞に対してやはり刺激効果を示す（図１および２）塩分 画が１４〜４３ｋＤａに同じバンドの存在を示し、トランスフェクションされて いないＣＨＯ細胞のこれらのタンパク質産物が成長刺激因子としてＭ■Ｓ効果を 遮断するように作用するのかもしれないことを含意している。この発見は図５に 示す結果によって支持される。高度に精製したＩＡＰ−ＭＩＳとＤＧ−ＭＴＳに 対する用量応答を比較すると、ＤＧ−Ｍｉｓはより高度に精製されたＩＡＰ−Ｍ ＩＳより約１０倍強力であることが示された。

下腎臓嚢検定法を用いてインビボでのＭＩＳの効果を試験した。腫瘍移植の際に 挿入された腹腔内定常注入アルゼットポンプを通してＭＩＳを送達することによ って、外陰類表皮癌腫細胞系Ａ４３１と眼球黒色腫系０Ｍ４３１の成長がインビ ボで阻害された。この検定法を評価する際には、それぞれの異なる腫瘍について 組織学を詳細に記録し、中央の壊死が起こる前に実験を完了することが重要であ る。したがってこの検定を第８日に停止した。なぜならこれより長い持続時間は 可変的な嚢胞性変化をもたらしたからである。このような変化は、嚢胞性変化と 液体の吸収ゆえに比較の信頼性を損なうほどに移植サイズ比を変化させ得る。

この注意深い分析により、各腫瘍細胞系の移植後の特徴を確立し、人工産物を避 けることができる。この下腎臓検定でのインビボ効果は生理学的またはｐＭの濃 度で達成される。他方、インビトロ研究は５０〜５００倍高いレベルを必要とし 、これは活性化の失敗を反映するものであろう。動物に対する毒性は観測されな かった。

実施例２ ■　材料と方法 Ａ、ｒｈＭＩｓの生産と精製 実施例１と同様に、ＭＩＳのｃＤＮＡとゲノムＤＮＡをクローニングした後、ン ヒドロ葉酸しダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞をヒトＭＩＳ遺伝子とジヒドロ葉酸レダ クターゼ遺伝子の両方の直鎖状構築物で同時トランスフェクションした。トラン スフェクションされたＣＨＯ細胞をメトトレキセート中で増幅し、１ノボヌクレ オシドとデオキシリボヌクレオシドを含まず１０％牛Ｍｌ！ＩＪ−含有雌胎児牛 血清（Ｆｅ２）を補足したアルファ最少必須培地中３７℃で生育させｔこ。実施 ｌｌＡｌ　１　に記載の如く、抗ヒトＭＩＳモノクローナル抗体を用りする免疫 アフィニティークロマトグラフィーを使用してｒｈＭＩ　Ｓ（純度９０〜９５％ ）を精製した。

実施例１と同様に、ラットのミュラー管退行器官培養検定法を用し）で、ＭＩＳ の生物学的活性をインビトロで検出した。Ｍｉｓｔこ関する酵素結合イムノ゛ノ ルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてＭＩＳ濃度を見積もり、タンノ（り質濃 度を実施例１と同様に測定した。

Ｂ　細胞系 ヒト眼球黒色腫細胞系○Ｍ４３１．０Ｍ４６４．０Ｍ４６７および０Ｍ４８２は １９８４年に樹立され、この実験のため（こ初期継代アンプルを融解するまで液 体窒素中に保存された。これらの細胞を、リボヌクレオノドとチオキシ１ノボヌ クレオノドを補足したアルファ変法イーグル培地（α−ＭＥＭ＋）ｌこ１０％雌 ＦＣ３とＩｇ／ＩＬ−グルタミンを添加したものの中で維持した。研究の前１こ 細胞を連続的に継代培養し、次いで７０〜８０％密集時（こ）ＩＪプシン処理し ｔこ。次０で、この増殖性の細胞集団を１５０ＯＲＰＭで５分間遠ノロ・分離し 、１０％雌ＦＣ３補足培地で再懸濁した。血球針で細胞を計数しｔこ。

Ｃ半固形（二層）コロニー阻害検定 実施例１と同様に従来の二層アガロースコロニー阻害検定を用し）てｒｈＭＩｓ の効果を試験した。３５ｍｍ培養皿の下層（ま１０％雌ＦＣ３補足α−ＭＥＭ十 中の０６％アカロース（シグマ、ミズーリ州セント・ルイス）１ｍｌを含有した 。上層は１０％雌ＦＣ３補足ａ−ＭＥＭ＋、試験すべき細胞（０Ｍ４３１につい ては５００００細胞／ｍｌ＋０Ｍ４６４．０Ｍ４６７および０Ｍ４８２について は２５０００細胞／ｍ１）、表皮成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ（シグマ、 ミズーリ州セント・ルイス）およびｒｈＭＩｓもしくは陰性対照としての賦形剤 緩衝液中の０３％アガロースからなった。これらの培養皿を５％ＣＯ２を含む湿 潤化した空気中３７℃で１０〜２１日間インキュベートした。３０細胞以上を伴 うコロニーを逆相顕微鏡にコン）で計数した。その結果を対照群に対する生存率 して表す（試験群中のコロニー数Ｘ１００／対照群中のコロニー数）。

Ｄ　液体培地コロニー阻害検定 実施例１と同様に、２４穴培養プレート（ファルコン、カリフォルニア州オクス ナード、＃３０４７）に０Ｍ４３１の単一細胞懸濁液を０．５ｍｌの培地（１０ ％雌ＦＣ３と５０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦを含むα−ＭＥＭ＋）中で各ウェルにつき ８２５０細胞の濃度で入れて、生育した。細胞接着の後、凝集せずに良好な単一 細胞分散液を伴うものだけをさらなる研究に使用した。試験すべき物質を加え（ １ウエルあたり５０μｍ）、３つ一組として試験した。これら細胞を５％ＣＯ２ を含む湿潤化した空気中３７°Ｃでインキュベートした。５〜７日内に形成した コロニーをギームザ溶液で染色し、３０細胞以上を伴うものを逆相顕微鏡を用い て目で計数するか、もしくはコンピューターに基づく画像分析装置を用いて計数 を自動化した。

Ｅ、ＭＩＳによる０Ｍ４３１細胞の用量依存的な阻害賦形剤緩衝液で希釈した後 、０．９８．９８．２５，２．５０４．７５．６および１００．８ｎＮｉの濃度 てＭＩ　Ｓを試験した。賦形剤緩衝液対照に対する生存率として結果を表した。

Ｆ　多細胞腫瘍球形検定 ０ｈ１４６７細胞と０Ｍ４８２細胞の多細胞腫瘍球形を実施例１に記載の如く作 成した。簡単に述べると、残存するトリブノンを除去するために充分に洗浄した 後、１０％雌ＦＣ３補足α−ＭＥＭ＋１ｍｌ中の０Ｍ４６７　１０５細胞を３５ ×１０培養皿中の１％アガロース１．５ｍｌの上部に置き、５％Ｃ０２を含む湿 潤化した空気中３７℃で通常球形が形成する２〜５日の間インキュベートした。

次に１％アガロース０．５ｍｌを２４穴培養プレート（ファルコン、カリフォル ニア州オクスナード、＃３０４７）の各ウェルに加えた。類似するサイズの個々 の球形（直径約２５０ｍｍ）を切開用顕微鏡の下で選択し、アガロース層の上部 の１０％雌ＦＣ３補足α−ＭＥＭ＋　０．５ｍｌを含有するウェルにそれぞれを マイクロピペットで移した。第０日に最長の直径（Ｌ）と最長の直径に垂直な直 径（Ｗ）によって球形のサイズを測定し、体積を（Ｌ、ｘＷｘＷ）として表した 。６個の球形含有ウェルをｒｈＭＩｓか賦形剤緩衝液によって処置した。体積を 定期的に測定した。異なる間隔における各球形のサイズ比を、第０日における同 じ球形のサイズとそれとを比較することによって得た。各群の平均サイズ比を成 長曲線中の時間に対してプロットし、他の群と比較した。

Ｇ、下腎臓嚢検定 実施例１に記載の方法にしたがって、０Ｍ４３１細胞を３６８±０．５６の移植 サイズに、０Ｍ４８２を１９７±０６７に、０Ｍ４６７を１．３４±０．５に、 ０Ｍ４６４をく１に成長させた。その後１０７個の０Ｍ４３１細胞を１５０ＯＲ ＰＭで５分間遠心分離することによりペレットを形成させた。そのペレットにフ ィブリノーゲン（シグマ、ミズーリ州セント・ルイス、ＰＢＳ（ｐＨ７，４）に ２０ｍｇ／ｍｌで溶解したもの）２０ｍｌを加え、次いでトロンビン（シグマ、 ミズーリ州セント・ルイス、２倍強度ダルベツコ変法必須培地に２０単位／ｍ＋ で溶解したもの）を加えた。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした 。このようにして形成させた細胞塊を移植の準備としておよそ５０断片（１ｍｍ ３．それぞれ約５０５細胞を含有する）に切断した。

腫瘍の移植時に腹腔内に設置したアルゼットミニ浸透ポンプ（＃２００１．アル ザ、カリフォルニア州パロ・アルド）によってＭＩＳを送達した。これらのポン プは約２１０μｍの充填体積を有し、それらの内容物を８日間の送達期間にわた りて約１μｍ／時間の速度で放出する。これらのポンプにｒｈＭＩｓまたは賦形 剤緩衝液のいずれかを充填した。

実験の１６〜２４時間前に、実施例１の如く、ウィルスと病原体を含まない雌の ＣＩ）−１マウス（１０週船齢。均体重３５ｇ、チャールズ・リバー・ブリーデ ィング・ラボラトリ−、マサチューセッツ州つィルミントン）にマーク−■セシ ウムー１３７放射装置によって６４０ラドの全身放射を与えた。ヌードマウス（ ８退部。

平均体重２４ｇ、ニドウィン・エル・スティール・ラボラトリ−、マサチューセ ッツ・ジェネラル・ホスピタル、マサチューセッツ州ボストン）をも使用した。

１０％ベンドパルビタール（アボット・ラボラトリ−、イリンイ州ノース・ンカ ゴ）０゜３ｍｌの腹腔的注射で麻酔を誘発した後、マウスの左脇腹に切開を施し 、左腎臓を体外に出した。１９ゲーン針トロカールを用いて下前空間を開いた。

この空間に５−〇ナイロン縫合糸の断片（長さ約１ｍｍＸこれは接眼レンズマイ クロメーター測定を較正するため並びに腫瘍の位置を特定するために用いた）と 共に細胞塊を入れた。１２匹のＣＤ−１マウスと２０匹のヌードマウスに０Ｍ４ ３１細胞塊を埋め込んだ。移植体の最長の直径（Ｌｌ）、最長の直径に垂直な直 径（Ｗｌ）および縫合糸の長さを切開用顕微鏡の接眼レンズマイクロメーターで 測定した。これらの動物を、腹腔内に設置されたアルゼットポンプによって送達 されるｒｈＭＩＳまたは賦形剤緩衝液で処置した。これらの動物を第８日に犠牲 にした。第８日にヌードマウスから血液試料を採取し、ＥＬＩ　ＳＡによって血 清Ｍ■Ｓレベルを測定した。その腫瘍の最長の直径（Ｌ２）、最長の直径に垂直 な直径（Ｗ２）および縫合糸の長さを２人の別個の研究者が盲目的に測定した。

測定値を較正した後、移植サイズ比を（Ｌ　２　ｘＷ２　ｘＷ２）／（Ｌ　１　 ｘＷｌ　ｘ　Ｌ　１）によって表した。腎臓の組織学的切片をも入手して、それ を調べた。嚢胞性変化を伴う腫瘍を排除した。

Ｈ２統計学的分析 液体培地、半固形培地コロニー阻害、多細胞球形および下腎臓嚢検定の結果をス テニープントを一検定によって試験した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意と見な した。

■、結果 Ａ、液体コロニー阻害検定におけるＭＩＳによる０Ｍ４３１コロニー形成の用量 依存的な阻害 ０Ｍ４３１細胞のみがその配位子コロニー阻害検定で充分な成長を遂げた。１０ ０．８．７５．６．５０．４．２５２．９８および０．９８　ｎＭのＭＩＳ濃度 についての生存率はそれぞれ３３％、２９．５％、５５．６％１．７１％、１０ ９゜８％および９６．８％であった。５０．４（ｐ＜０．０５）、７５．６（ｐ ＜０．００４）および１００．８（ｐ＜０．００６）ｎＭ　ＭｉｓのＭＩＳ１度 で有意な阻害が認メられた（図９）。

Ｂ、半固形培地（二層）コロニー阻害検定コロニーを成長させ得なかった０Ｍ４ ３４を除くすべての細胞系がｒｈＭＩｓによって有意に阻害された。様々な細胞 系の生存率は、０Ｍ４３１（３０％Ｍ　ＭＩＳ中）について３４％（ｐ＜０．０ １）、０Ｍ４６７（１５０ｎＭ　ＭＩＳ中）ニラいて６１％（ｐ＜領０２）、０ Ｍ４８２（９０％Ｍ　ＭＩＳ中）について８０％（ｐ＜　０．０３）であった（ 図２）。

Ｃ１多細胞球形検定 対照群（ｎ＝６）における０Ｍ４６７球形の平均サイズ比が第５日、第８日およ び第１１日にそれぞれ３．８５±０４３．４８５±０．６４および５．５２±０ ゜７８てあったのに対して、ＭＩＳ群（ｎ＝６）では２．１７±０２６．２．７ ９±０３３および３．９１±０．５９であった。この相違は有意であった（ｐ＜ ｏ、。

２）。対照群（ｎ＝１０）における０Ｍ４８２球形の平均サイズ比が第３日およ び第６日にそれぞれ２．１８±０．１７および８．２２±０８１であったのに対 して、ＭＩＳ群（ｎ＝１０）では１．９３士１ｌ４および９．０±０．６７であ った（図ＩＩＡおよびＢ）。０Ｍ４３１と０Ｍ４６４は球形として成長すること ができなかった。

Ｄ、下腎臓嚢検定 ＣＤ−１照射マウスにおいて０Ｍ４３１腫瘍の移植サイズ比は対照（ｎ＝７）で ３９３±０．４９であり、これに対してＭＩＳ群（ｎ＝５）では１．４２±０． ４４（ｐ＜０．００５）であった。各ＭＩＳ処置マウスには８日間の検定の間に ４８．６μｇのＭＩＳを与えた。１１匹の対照と９匹のＭＩＳ処置マウスを伴う ヌードマウスを用いる２つの検定ては、０Ｍ４３１腫瘍の移植サイズ比が有意に 高く、対照についてそれぞれ３．０２±０．１７および３．１４±０．４０であ ったのに対して、ＭＩＳ群については１．６８±０．０９（ｐ＜０．００１）お よび１．６９±０゜４３（ｐ＜０．００５）であった。第１のヌードマウス検定 では８日間にわたって４４．７Ｉ１ｇのＭＩ　ＳをＭＩＳ処置群に与えたが、第 ２のヌードマウス検定ではＭＩＳ群に１３０μｇを与えた。ヌードマウス検定の 第８日におけるＭＩＳ処置マウスの平均ＭＩＳ血清レヘしベそれぞれ７４９およ び５７０ｐＭであった。測定した対照は１０ｐＭ未満のＭＩ　Ｓレベルを有した 。各ＭＩＳ群における腫瘍の成長は３つの検定すべてにおいて対照より有意に低 かった（ｐ＜０．０５Ｘ図１２実施例２ては、３つの異なるインヒドロ・クロノ ジエニンク（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）検定法を用いて、３種類のヒト眼球黒色腫 細胞系に対する組換えヒトＭＩＳの効果を調べた。信頼性と再現性がある二層阻 害検定法を各細胞系と共に使用した。かなり長いインキュヘーノヨシ期間（１０ 〜２１日）にもかかわらず、この検定法ではすべての細胞系がよく成長した。０ Ｍ４８２．０Ｍ４３１および０Ｍ４６７は有意に阻害された。液体コロニー阻害 検定法を０Ｍ４３１細胞系と共に使用した。

ＯＭ、４６７と０Ｍ４８２はこの検定法で分離したコロニーを成長させ得なかっ た。

０Ｍ４３１の場合のように効果的である場合には、この検定法は迅速（５〜７日 ）であり、わずかな試料しか使用しない。０Ｍ４３１は２５％Ｍ以上のｒｈＭＩ ｓ濃度でコロニー形成の阻害を伴って明らかな用量応答を示した。０Ｍ４３１の 生存率はこれら２つの検定法の間でよく相関した。細胞−細胞相互作用と栄養素 が影響を与える成長様式を伴う腫瘍微小領域を反復させるために多細胞球形検定 を用いた。０Ｍ４６７細胞と０Ｍ４８２細胞は充分な球形を形成した。０Ｍ４６ ７は有意な阻害を示したが、０Ｍ４８２の成長は影響を受けなかった。０Ｍ４３ １は球形を成長させることができなかった。３種類のインビトロ検定法を利用で きるということは、各腫瘍に関する最適な条件の選択を可能にする。

０Ｍ４３１に対するＭＩＳのインビボての効果を調べるために下腎臓嚢検定を使 用した。なぜならこの細胞系は比較を可能にするに足るほど大きく成長したから である。腫瘍の移植時に挿入した腹腔内定常注入アルゼットポンプを介してＭＩ ｓを送達することによって、０Ｍ４３１の成長がインビボで阻害された。この検 定系を評価する際には、それぞれの異なる腫瘍について組織学的に詳細に記録す ること、並びに、腫瘍がまだ固形である間に、リンパ球浸潤および／または中央 の壊死が起こる前に実験を完了することが重要である。したがって、照射したＣ Ｄ−１マウスてはこの検定法を第８日で終わらせた。なぜならインキュベーショ ン期間がこれより長くなると、短寿命の液体の吸収、炎症性細胞の浸潤および嚢 胞性変化ゆえに、比較の信頼性がなくなるほどに移植サイズ比が変化し得るとい う可変性の組織学的変化をもたらすからである。照射が誘発する免疫抑制の潜在 的な落とし穴を排除するために、ヌードマウスをも使用し、同様の腫瘍成長阻害 が観測された。腫瘍をヌードマウスに移植する場合には、同じ期間を用いた。動 物に対する明白な毒性はこの研究の短い過程では観測されなかった。この下腎臓 検定におけるインヒポ効果はｐＭ１１度で達成される。他方、インビトロ研究で は１０〜１００倍高いレベルが必要であり、切断と活性化の失敗が示唆された。

ここに本発明を完全に記述し終えたので、本発明の範囲と目的またはその態様か ら逸悦することな（、組成物、濃度、投与法および条件の広範囲にわたる等価な 変数内で本発明を実施できることを当業者は理解するであろう。

半固形培地コロニー阻害検定 液体培地コロニー阻害検定 液体培地コロニー阻害検定 ００．９＋、８３５７．０　０１２２４４８９６ＭＩＳ濃度　（ｎＭ） ＭＩＳ活性の抗体吸収 ＋００ ＴＡＰ−塩によるＭＩＳ効果の阻害 ンスブラチンとＭＩＳの相加的効果 ンスブラチン濃度　（ｕｑ／ｍＬ） ０８　３日　６日　９日 時間 ０日　３日　６日　９日 時間 時間（時間） Ａ４Ｂ１　０Ｍ４３１ ＦＩＧ、　９ ｎ＝３　ｎ＝３　ｎ＝３ 時間（日） 巳広Ｊ旦 時間（日） Ｄ−１ ｎ＝４　ｎ＝５ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　バリー、ロバート・エルアメリカ合衆国マサチューセッツ０２ １８１ウェラリー、メドウブルック・ロード２２番（７２）発明者　エプスタイ ン、ジェームスアメリカ合衆国マサチューセッツ０２１１４ボストン、ミルトル ・ストリート８２番（７２）発明者　ラギン、リチャード・シーアメリカ合衆国 マサチューセッツ０２１３５ブライトン、ジェラルド・ロード３６番（７２）発 明者　マクロ−リン、ディピッド・ティーアメリカ合衆国マサチューセッツ０１ ９０６ソーガス、ダンフォース・アベニュー９番

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．患者にＭＩＳの有効量を投与することからなる腫瘍の成長を阻害する方法で あって、該腫瘍が外陰類表皮癌腫、頚部癌種、子宮内膜腺癌、卵巣腺癌および眼 球黒色腫からなる群から選択される方法。
2. ２．該ＭＩＳが１４０ｋＤａまたは７０ｋＤａの分子量を有する請求項１の方法 。
3. ３．ハロゲン化アルカリ金属またはハロゲン化アルカリ土類金属の有効量で溶出 させ、次いで約２．５と４．０の間のｐＨを有する酸溶液で溶出させることによ って、免疫アフィニティークロマトグラフィー基盤からＭＩＳを精製する請求項 １の方法。
4. ４．タンパク質加水分解化合物との反応によって該ＭＩＳがタンパク質加水分解 的に切断されて約５７ｋＤａと１２．５ｋＤａの分子量を有するタンパク質断片 を形成する請求項３の方法。
5. ５．該タンパク質加水分解化合物がプラスミンである請求項４の方法。
6. ６．ＭＩＳの投与後に化学療法剤の有効量を投与することをさらに含み、該化学 療法剤が該腫瘍の成長の阻害に関して有効である請求項１に記載の方法。
7. ７．化学療法剤かシスプラチンである請求項６の方法。
8. ８．ＭＩＳがｒｈＭＩＳである請求項１の方法。
9. ９．患者に化学療法剤とＭｌＳの組み合わせの有効量を投与することからなる腫 瘍の成長を阻害する方法であって、該腫瘍が外陰類表皮癌腫、頚部癌種、子宮内 膜腺癌、卵巣腺癌および眼球黒色腫からなる群から選択される方法。
10. １０．該ＭＩＳが１４０ｋＤａまたは７０ｋＤａの分子量を有する請求項９の方 法。
11. １１．ハロゲン化アルカリ金属またはハロゲン化アルカリ土類金属の有効量で溶 出させ、次いで約２．５と４．０の間のｐＨを有する酸溶液で溶出させることに よって、免疫アフィニティークロマトグラフィー基盤からＭＩＳを精製する請求 項９の方法。
12. １２．タンパク質加水分解化合物との反応によって該ＭＩＳがタンパク質加水分 解的に切断されて約５７ｋＤａと１２．５ｋＤａの分子量を有するタンパク質断 片を形成する請求項１１の方法。
13. １３．該タンパク質加水分解化合物がプラスミンである請求項１２の方法。
14. １４．タンパク質加水分解的に切断されたＭＩＳの有効腫瘍阻害量と医薬的に許 容される担体からなる医薬組成物であって、該腫瘍が外陰類表皮癌腫、頚部癌種 、子宮内膜腺癌、卵巣腺癌および眼球黒色腫からなる群から選択される医薬組成 物。
15. １５．該タンパク質加水分解的に切断されたＭＩＳが約５７ｋＤａと１２．５ｋ Ｄａの分子量を有するタンパク質断片からなる請求項１４の医薬組成物。
16. １６．該腫瘍の成長の阻害に有効な化学療法剤をさらに含む請求項１４の医薬組 成物。
17. １７．該化学療法剤がシスプラチンである請求項１６の医薬組成物。
18. １８．該ＭＩＳがｒｈＭＩＳである請求項１４の医薬組成物。