JPH06510185A - オリゴヌクレオチドおよびそのエンセファロパシー分析における用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドおよびそのエンセファロバシー分析における用途 本発明は、ヒトおよび動物におけるエンセファロバシー分析に関する。本明細書 で使用する「エンセファロ１＜シー」は、ヒツジおよびヤギのスクラビー、ラン 、ミンクおよびネコの牛海綿状脳障害ならびにヒトのクロイツフエルトーヤーコ ブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマンーンユトロイスラーーシャインカー症候群（ＧＳ Ｓ）およびクール−などのブリオンが関連した神経変性疾患を意味する。本明細 書で使用する「分析」は、単なる検出（普通に考えられそうな用途）およびサン プル中に存在するＤＮＡの量を評価する定量または半定量法をカバーするもので エンセファ０パン−の原因物質がどこまで知られているかニツイての要約が、最 近、Ｎ、　Ｈ１ｌｆｆｉｌｅ＋、　ＴｌＮ５１４（９）、３８９−３９０（１９ ９１１およびＳ、Ｂ、Ｐｒｏｓｉｎｅ＋、１１　Ｔｏ＋ｃｈ＊　暑ｎｄ　Ｄ、　 Ｗｅｓ＋ｘｗａ７゜Ｃｏ＋ｎｅｌｌ　Ｖｅｌ＋ｒｉｎ＋＋ｉｇｎ　８１（２）、 ８５−１０１　（１９９１）によって出された。

感染物質は、ピリオンとは異なる、「プリオン」と呼ばれる粒子である。プリオ ンは、核酸をほとんど、または全く含まないと考えられ、宿主の細胞遺伝子によ ってコードされるプロテアーゼ耐性蛋白（Ｐ　ｒ　Ｐ）により大部分が構成され ている。ブリオンはこの特徴によりピリオンとはっきり区別される。今日まで、 病気の感染に必要なブリオンに特異的な核酸の同定は成されていない。

既知の全ての海綿状脳障害の脳には、直径２３〜２６ｎｍのウィルス様管糸状粒 子が一貫して認められる。これらの粒子は、Ｈに、Ｎｓｒ■（、１ａｔｅ＋ｖｉ ＋ａｌｏｇ７３２．　１８５−１９２　（１９９１１ならびにＨＫ、ＬｔｘＢ、 Ｄ、Ｍ、＾＋ｈｓ＋　ｓａｄ　Ｄ、　Ｃ，Ｇ１１ｌｅｉ、　Ｐｒｏｃ、Ｎｉ１ｌ 。

＾ｃ１ｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳ八へ５．３５７５−３５７９　（１９８８１および ８４．７７３０−７７３４ｆ１９８７１により研究されている。それらは、杆状 のブリオン核を有する。プリオン杆は、スクラビー関連原繊維（ＳＡＦ）とも呼 ばれる。その核の上はＤＮＡ分解酵素により除去可能なりＮＡ層であり、その上 にはプロテアーゼにより消化される蛋白外膜がある。Ｉｅｌｅｒマｉ＋ｏｌｏｇ ７の論文では、スクラビーに特異的な核酸の存在を支持する証拠はまだないが、 その核酸を特徴付けて病気との関連をめるために、管糸状粒子を精製することが 重要であろうと述べている。ごく最近、Ｈ，Ｋ、　Ｎｇ＋ａｎｇ。

Ｎ、　Ｓ、　Ｍｉｌｌｘ＋、　［１，！Ｊ、　Ａ＋ｈｃ＋　ｔｎｄ　Ｄ、　Ｃ， Ｇｔｉｄａ＋ｅｋ。

Ｉｎｔ！＋ｖｉ＋ｏｌｏｇｒ　３２．３１６−３２４　（１９９１）で、スクラ ビーに感染したハムスターの脳での多様性ミトコンドリアＤＮＡの増加が報告さ れたが、やはり、スクラビーに特異的な核酸の証拠はないと述べてあった。

総説’Ｔｈｅ　５ｅａｒｃｈ　ｌｏｔ　Ｓｅ＋＊ｐｉ＋　Ａｇｅｎｔ　Ｎｗｅｌ ＋ｉ＋　Ａｅｉｄ　”　、ＩＭ　＾１ｋｅｎ　＋ｎｄ　Ｒ，Ｆ、　Ｍｉｒｔｈ、 　Ｍｉｅ＋ｏｂｔｏ１．　Ｒｃｗ、５４　ｆ３）　２４２−２４６（１９９０１ では、スクラピーに特異的な核酸の同定が成功しないことは、そのような核酸が 、あってもごく少数であるか、非常に小さいＲＮＡであるか、感染していない組 織に存在する核酸とかなり類似した配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ種であるこ とを示唆すると結論付けた。同様に、Ｎ、　Ｍｅ７ｅｒ、Ｖ、Ｒｏ＋ｅｎｂａＩ 。

８、　Ｓｃｈｍｉｄｔ、　に、　Ｇ１１ｌｅｉ、　Ｃ，Ｍｉ＋ｔｎ＋ｌ＋、［１ ，Ｇｒｏｊｈ、Ｓ、　ＢＰｒｏ＋ｉｎｓ＋　ｌａｄ　Ｄ、Ｒｉｅｔｎｅｒ、　” ５ｅａｒｃｈ　ｌｏｔ　！　ｐｎｆｘｌｉｖｅ　＋ｅｒｘｐｉｅｇ！ｎｏｓｅ　 ｉｎ　ｐａｒ百ｉｅｄ　ｐ＋ｉｃロ　１＋ｚｃｔｉｏ口Ｉ　Ｉｅマｅｚｌ＋　１ 　ｐｚｏｃｉ１７　ｏｆｎ＋ｃｌ＋ｉｃ　ｊｅｉｄｓ　”　（ｒ精製したブリオ ン画分での推定上のスクラビーゲノムの研究は、核酸が少数であることを示す。

」）。

１、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７２．３７−４９　（１９９１）は、核酸を特異的 に加水分解または修飾する過酷な方法による不活化に対してブリオンが抵抗性を 示し、その特徴は、恐らくポリヌクレオチドが欠けていることを示すと考えられ るが、そのような否定的な結果は、推定上のスクラビーに特異的な核酸が、まだ その存在が見出されていない何らかの独特の構造で十分保護されているかもしれ ないという非難を常に受けやすいと記している。これらの著者は、核酸が非常に 小さい（１００ヌクレオチド未満の大きさ）か、非常に効率的であるか、大きさ が多様であると結論した。

組織学的に最も信頼性のあるエンセファロバシーの検出方法は、特に電子顕微鏡 によるものである（Ｉ（、に　Ｎｇ＋ｇＢ　ｔｎｄ　Ｒ，Ｈ。

Ｐｅ＋＋７．　Ｔｈｅ　１ｓＩｌｃｅｔ、、３３５．　６６３−６６４　（Ｍｓ ｒｃｈ　１７．　＋９９０）、ｗｌｌｄ　ＨＫ、Ｎｔｒ＋Ｂ、　Ｄ、　Ｍ、　＾ ｉｈｅ＋　ｔｎｄ　［１，Ｃ，Ｇｓｉｄｗ＋ｅｋ、Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｔ！Ａｅｘ ｉ　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾１１４．　７７３Ｇ−７７３４ｆ１９１１７１　参照）。

しかし、これは、脳の組織を必要とし、時間がかかつて骨の折れる方法である。

核酸の同定に基づく診断法があれば好ましいと考えられる。

そのような方法は提案されており（Ｈ，Ｓｏｄａｍ、　Ｂ、　Ｈ７１１＋ｅｔｈ 。

Ｒ，Ｋ＋ｏｎｔ　ｌｎｄ　Ｏ，ＯＩ＋ｗｉｋ、　Ａｂ＋ｔ＊ｃｆｔ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ａｅｎｍｓｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ　ｆｂｅ１ｗｃｒｉｃ■５ｏＣｉｅ１７ 　ｏｆ　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏｌｏｇｉ＋Ｈ１９８８，ｐｓＨｅ　３６３゜＾ｂＩ＋ ｔ１ｕ　Ｎｏ、　Ｃ−１８８）　、ブリオン蛋白をコードする遺伝子配列由来の ＤＮＡプローブを使用した。しかし、ブリオン蛋白は、侵− エンセフ７０パシーに感染た動物を含む全哺乳動物に認められる正常な染色体遺 伝子によってコードされることがよく知られているので、上記の研究は容認され なかった。ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ、８９／１１５４５　（Ｉｎｓ＋１ｌＩ ｌｌｅ　ｌｏｔ　Ａｌ１１＊＊ｌ　Ｗｅｔ目ｂ　Ｌｌｌ、）は、スクラピーに感 染したヒツジの短時間インキュページ岬ンに関連するいわゆる５ｉｎｅ遺伝子に 連結した制限酵素断片長多形（ＲＦ　Ｌ　Ｐ’）の使用によるスクラピーの検出 法を記載したものである。ＲＦＬＰは、プリオン遺伝子に関連する非コード部分 に位置すると言われている。この方法は、精々、インキュページ瑚ン時間が短い という特徴を有してヒツジのみを検出するものである。今まで、核酸の同定に基 づく診断方法は、エンセファ０パシーに特異的な核酸が多くの試みにもかかわら ず検出をくぐりぬけるので、成功していないし、成功しそうにもない。

１９９１年に英国の新聞“Ｔｈｅ　Ｇｗ＊ｒｌｉｓａ”　（４月２７日、６月２ ２日、８月１６日付）に載ったいくつかの記載は、本発明者が、ＢＳＥおよび関 連疾患の遺伝的指紋を見出したと信すると報告している。遺伝的指紋の特徴に関 するそれ以上の情報はない。

本発明者は、優れた研究によりスクラピーに特異的な核酸を見出し、それはまた 、他のエンセファロバシーに対しても特異的であると考えられる。この核酸の明 らかに独特の性質が、（ａ）その核酸由来の配列を、ＤＮＡ増幅、特に複製連鎖 反応（ＰＣＲ）のプライマーペースとして使用して、制限酵素断片長多形法によ る検出のための十分な量の核酸を作るか、（ｂ）核酸を標識し、それをオリゴヌ クレオチドプローブとして、所定アッセイ（つまり、そのプローブをサンプル中 の核酸にハイブリダイズさせる工程を含む感受性アッセイ）で使用する方法のい ずれかを典型的には含む診断法の基礎となる。分析は、体液に対して行うことが できる。

スクラピーに特異的な核酸は、−重鎖ＤＮＡであり、配列＝（ＴＡＣＧＴＡ）　 （ｎは少なくとも６である。）を含む。この反復配列のベースとなる６個のヌク レオチド単位は、相補ＤＮＡを５′→３′の方向に見ると同じＴＡＣＧＴＡの配 列になるという点でパリンドロームである。全長のＤＮＡ配列はまだ知られてい ないが、ｎは６よりかなり大きく、恐らく２０〜３０台であり、さらに、ＤＮＡ の一般形はたぶん次の式ニー（ＴＡＣＧＴＡ）　ｃｌ−Ｌｌ−（ＴＡＣＧＴＡ） 、２−Ｌ２−（ＴＡＣＧＴＡ）　１１３−Ｌ３・−・−［式中、ｎ　１、ｎ　２ 　、ｎ３　”””は同じでも異なっていてもよい連続した整数であり、Ｌｌ、Ｌ 　、Ｌ　・・・・・・は同じでも異なっていてもよい一連のＤＮＡ結結 合３片である。］であると推測される。示した一般形は、３′−末端の先頭およ び／又は５′−末端の尾部に、配列が未知の他のＤＮＡを結合してもよい。（Ｔ ＡＣＧＴＡ）　１１ブロツクの数、すなわち、連続したｎ　ｌＳｎ　２　、ｎ　 ３・・・・・・の範囲はまだわかっていないし、従って、リンカ−Ｌｌ、Ｌ２、 Ｌ３・・・・・・の数もわかっていない。それにもかかわらず、ＴＡＣＧＴＡ配 列が診断に有効であることはすでに明らかである。研究により、繰り返しのない ＴＡＣＧＴＡｌすなわちｎ＝１の形状は９３個の遺伝子において知られ、二重配 列（ＴＡＣＧＴＡ）２、すなわちｎ＝２は、ある種のシブウジツウバエおよび酵 母の遺伝子で知られていることがわかっているが、高頻度の反復、すなわち口＝ ３以上のものはユニークであると考えられる。

本発明は、下記式： ［式中、ｒ６Ｎ−パリンドローム」は、ＴＡＣＧＴＡ。

ＡＣＧＴＡＴＳＣＧＴＡＴＡ、ＧＴＡＴＡＣ，ＴＡＴＡＣＧまたはＡＴＡＣＧＴ 　（すなわち、６個のヌクレオチドのどれか１個で始まるパリンドローム配列） を表し、ｎは少なくとも２の適切な整数であり；Ｘは適切な５′−末端または先 頭のＤＮＡであり、ａはＯ（すなわち、先頭のＤＮＡがない）または１であり： Ｙは適切な３′〜末端または尾部のＤＮＡであり、ｂは０（すなわち、尾部のＤ ＮＡがない）または１である。］のオリゴヌクレオチドまたは６Ｎ−パリンドロ ーム配列がその相補配列とアニーリングもしくはハイブリッド形成する能力を保 存したその標識形もしくはその誘導体を提供する。「適切な」は、ＤＮＡ増幅（ 例えば、ＰＣＲ）プライマーとして、またはハイブリッド形成における例えば標 識プローブとしての当該オリゴヌクレオチドの許容可能な用途と適合することを 意味する。もちろん、オリゴヌクレオチドの長さは、その目的用途に応じて実際 的な制限がある。プライマーとして使用する場合、ｎは通常２．３または４であ る。プローブとして使用する場合、長さは通常、全部で２００ヌクレオチドを超 えず、好ましくは７０以下である。「標識」は、ある物質の検出可能な物質また は残基を意味する。「オリゴヌクレオチドＪは、完全遺伝子、または遺伝子から 転写された完全ｍＲＮＡに相補的な完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子の複製を除く。

本発明は、上記オリゴヌクレオチド自体およびエンセファロバシー分析またはそ れに関連して使用するための上記オリゴヌクレオチドの両方を含む。

第三の発明は、複製連鎖反応を行うためのキットであり、そのキットは、（１） デオキシリボヌクレオチド、（２）ＰＣＨに適したポリメラーゼおよび（３）プ ライマーとしての、少なくとも１個の上記で定義した本発明のオリゴヌクレオチ ドからなるか、それらを含む。そのようなキット成分は、通常、別々の容器に入 れて用意され、それらを−緒にするとキットまたはキットの一部になる。

策四の発明は、具体的には、エンセファ０パシーの分析法であり、その方法は、 エンセファロバシーに対して特異的なりＮＡを含む疑いがあるサンプルを、例え ばＰＣＨにより処理してＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出した後、その産物のＴ ＡＣＧＴＡ反復配列の多重複製の育無を、特に、その産物を酵素的に切断し、切 断された物質を未切断物質と比較することにより分析することを含む。

第五の発明は、具体的には、エンセファロバシーの分析法であり、その方法は、 エンセファロバシーに対して特異的なりＮＡを含む疑いがあるサンプルを、最適 にはＤＮＡを増幅した後、適切なハイブリッド形成条件下で標識相補プローブＤ ＮＡにより探査し、こうして得られたハイブリッド産物を分析することを含む。

相補ＤＮＡは通常、（６Ｎ−パリンドローム）、配列を含むが、選択的に結合配 列（Ｊ　、Ｌ２　、Ｌ３　）またはその一部を含むのを除外するものではない。

そのような結合配列は、（Ａ）、（ＴＡ）、（Ｔ）、（ｐは０または１であり、 ｑは１〜２ｏの数、特に３〜９であり、ｒは０または１である。）の式になる。

もちろん、両方の型の配列を含むこともできる。

さらに、第六の発明は、スクラピーに特異的なりＮＡであり、これは、（ＴＡＣ ＧＴＡ）、（ｎは少な（とも６である。）の少なくとも１個の配列１を含む。所 望により、上述したように、他の成分の配列を有してもよい。

本発明は、上記オリゴヌクレオチド自体を含むが、その好ましい特徴の定義に関 しては、現在意図するその主な用途、すなわちＤＮＡ増幅プライマーとしての用 途が注目される。この目的の場合、式（１）のｎは、好ましくは２．３または４ であり、バリンドロー・ム配列の好ましい最小の長さは約１２である。本発明に おける「パリンドローム配列」は、ＳＥＱ、ｒＤ、Ｎｏ。

１： Ｉ　ＴＡＣＧＴＡＴＡＣＧ　ＴＡ　１２［（ＴＡＣＧＴＡ）２と書くことができ る。］から選択される６個以上の連続したヌクレオチドを意味する。言い換える と、「（６Ｎ−パリンドローム配列）」単位内ならびに式（１）のｒ　（Ｘ）Ｊ およびｒ　（Ｙ）Ｊ内にパリンドローム配列含む。好ましい最小１２よりも短い と、ただ１個のＴＡＣＧＴＡブロックを有するＤＮＡが検出可能になるだけと考 えられる。このようなりＮＡはごく稀であるが、例えば、１種類よりも多くの検 出法を使用している場合など、場合によってはこの短い配列でも許容されるかも しれない。ちょうど１２塩基（例えば、（ＴＡＣＧＴＡ）　２）の場合、酵母に おいて２回反復配列が検出可能な場合もあるが、この可能性が十分許容されるさ らに別の状況があるはずである。

パリンドａ−ム配列のより好ましい長さは１２〜２４、特に１６〜２４であり、 とりわけ１７または１８が好ましい。パリンドローム配列が２４よりも長い（例 えば、（ＴＡＣＧＴＡ）　４ＴＡ）と、場合によっては許容されるが、恐らく自 己アニーリングの問題がある。すなわち、プライマーの３′−末端が、サンプル のエンセファロバシーに特異的なりＮＡの代わりに、自身の５′−末端とアニー リングする可能性がある。実際、この自己アニーリング力は、スクラビーに特異 的なりＮＡがなぜ以前は検出をくぐり抜けたのかについての説明になると考えら れる。

本オリゴヌクレオチドは、反復パリンドローム配列の基本配列から始めて、種々 の方法で修飾して、プライマーとして役立てるこ七ができる。プライマーの伸長 は３′−末端から始める。

従って、プライマーは、「無関係なＪ５’　−尾部、例えば、式：（Ｎ）　［Ｎ は単一のヌクレオチド、例えばＡ、ＣＳＧまたはＴであり、ｍは天然の配列に存 在する可能性が非常に小さいポリ−Ｎ尾部を生じるのに十分大きく、例えば８以 上、特に１０以上である。］を有することができる。しかし、好ましくは、（Ｔ ＡＣＧＴＡ）。の５′−尾部が、５′−末端に直接結合した（Ａ）、（ＴＡ）、 （ｐは０または１であり、ｑは少なくとも１、特に１〜３である。〕の配列から 成るか、該配列を含む。

５′　−尾部の長さのはっきりした上限はないが、長ずざるとＰＣＲを妨げるか もしれない。主として不溶性支持体に連結する手段としてのＰＣＲプライマーに 対しては、以前に、中位の長さの尾部が提案されている（例えば、英国特許出願 明細書２２３３６５４Ａ　（ＮＲＤＣ）参照）。そのような尾部は、必ずしも完 全に核酸で構成されるとは限らない。

上記式（１）によれば、プライマーが完全な全反復数のパリンドローム配列、例 えば両端に他のヌクレオチドを有しない（Ｔ　Ａ　ＣＧ　Ｔ　Ａ）　から成らな くてもよいことが許容される。

已 配列の残基を、もちろん反復パリンドローム配列と同じ順序で配列して含むこと ができる。例えば、１７要素のプライマーは、ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、２： Ｉ　ＡＴＡＣＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＣＧ　１７を有することができる。これは 、式（１）において、「６Ｎ−パリンドローム配列」がＴＡＴＡＣＧであり、ｎ が２であり、ａが０であり、ｂが１であり、５′−尾部がＡＴＡＣＧである。

通常、ＰＣＲで使用する場合は、パリンドローム配列の３′−末端の先にヌクレ オチドがあるとプライマーの伸長を妨げて好ましくないので、ｂは０である。し かし、１個のヌクレオチドの組み合わせが不適当である場合、例えば、１８要素 のＳＥＱ、ＩＤ、　Ｎｏ、　３　： １　ＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡ　ＣＧＴＡＴＡＣＮ　１８　［３’　−末端のヌクレ オチドＮはＡ、ＣまたはＴであり、従ってパリンドローム残基ではない（パリン ドロームであるためにはＧが要求される。）。］は許容されるかもしれない。

本オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成工程を含む分析法で使用する場合、 全体をパリンドローム配列で構成することもでき、または、パリンドローム配列 の５′　−末端もしくは３′−末端もしくはその両方にパリンドロームでないヌ クレオチドを含むこともできる。そのような非パリンドローム配列は、分析を妨 害するとは考えられない。例えば、上述したように、５′−末端が（Ａ）　（Ｔ Ａ）　の配列から成るか、該配列をｑ 含み、あるいは相補的に、３’　ＡＴＧＣＡＴ　Ｓ’配列の３′−末端が３’　 （Ｔ）　（ＡＴ）　５’から成るか、該配列をｑ 含むことができる。

ＰＣＲ反応で使用する場合、本オリゴヌクレオチドは通常、可能なその５′−末 端を除いては標識されない（例えば、Ａ、　Ｃ。

Ｓ７ｖ＊ｅｅｅ、　Ｍ、　ＢｅＢｓ１＋ａｍ、１．　Ｔｅｎｈａ＋ｅＩｌ■ｄ　 Ｉｌ、　１ｏｄｅ＋ＩｍｏｄＮｗｃｌｅｉｃ　ＡｅｉｄＩＲｓｓｅｉ＋ｃｈ　１ ６．　１１３２７−１３３８（Ｈ８８）参照）。原則的に、標識は、所望するな らば、アニーリングもプライマー伸長も妨害しない他の方法で行うことができる 。ハイブリッド形成を含む分析で使用する場合、本オリゴヌクレオチドは普通、 標識された形で使用し、標識は放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓまたはビオ チン化（続いて標識アビジンまたはストレプトアビジンとの反応を行うことがで きる。））などの適切な方法により行う。しかし、後に標識に連結するならば、 標識していないオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することもできる。例 えば、本オリゴヌクレオチドにポリ−０尾部をつけ、その後、標識ポリ−〇に連 結することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは通常、プローブとして使用する場合でも２００又 は２００ヌクレオチドより短く、実際はかなり短くて、特に７０ヌクレオチドま で、とりわけ４５ヌクレオチドまでの長さである。すなわち、特にＰＣＲ用の場 合は、パリンドロームを２４ヌクレオチドより多く含むことはないと考えられ、 他に５′−末端または（例えば）８〜２０ヌクレオチドの尾部を含んでもよく、 合わせて全部で３２〜４４ヌクレオチドになる。

（ｂ）分析法 好ましい態様では、本オリゴヌクレオチドを使用してサンプルのＤＮＡを増幅す る。これは、現在、ＰＣＨによって行うのが便利であるが、原則的には、ＤＮＡ 合成のプライマーとして、またはサンプルの一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して 第二のＤＮＡ鎖を作るために、オリゴヌクレオチドを使用することを含む他のど んな方法も使用することができる。

ＰＣＲ法は、市販のキットおよびプライマーとしての本発明のオリゴヌクレオチ ドを使用することにより容易に適用することができる。サンプルのＤＮＡ配列が 反復性であるため、同一のオリゴヌクレオチドを前進プライマーおよび逆方向プ ライマーの両方に使用することができる。市販のキットは通常、デオキシヌクレ オド（Ａ、Ｃ，ＧおよびＴ）　、ＰＣＲで使用する温度に耐えるポリメラーゼ、 緩衝液およびキットの試験用対照ＤＮＡから成る。従って、本オリゴヌクレオチ ドブライマーは、キットとともに使用するためのものとして、それ自体を売り込 むことができる。しかし、本発明の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドブライ マー、パリンドロームを切断するための制限酵素、および所望により使用される 他の成分（エンセファロバシーに特異的なりＮＡと同様の長さの、付加キット試 験用の対照ＤＮＡなど）を含む付加キットを販売することもできる。

ＰＣＲ条件は、この種の分析に使用される公知条件でよく、便宜上、そのキット とともに使用するのに好ましい条件にすることができる。

ＰＣＲ法により、本パリンドローム配列を含む、長さの異なるＤＮＡの形の産物 が得られる。これは、所望の方法により分析することができるが、酵素による切 断に頼る方法が最も容易であると思われる。ＰＣＲ産物は、種々の分子量のバン ドを与える。例えば、エンセファロバシーに特異的なりＮＡの３′　−末端付近 でプライマーを作用させると、大きい分子の多重複製が生じる。ＰＣＲ産物を二 つの部分に分割し、第一の部分を、エンセファロパン−に特異的なりＮＡと関連 する高分子量のバンドを示すために分解ゲルにかける。第二の部分は、パリンド ローム配列を切断する制限酵素で切断する。これにより、より長いＤＮＡの長さ をかなり短くし、短いＤＮＡの他のバンドと共に除去する。ＴＡＣＧＴＡを多重 制限酵素処理すると、検出するには小さすぎる分子量のバンドが多く生じる。二 つの部分から得られる制限酵素断片長パターンを比較することにより、エンセフ ァ０パン−に特異的なりＮＡがサンプルに存在するかどうかを容易に測定するこ とができる。

適切な酵素の例としては、ＴＡＣＧＴＡのＣおよびＧの間を切断する５ｎａＢＩ およびＡｃｃ＋ならびにＡおよびＴの間、すなわち、一つのＴＡＣＧＴＡ配列お よびその隣の配列の間を切断するＭ　ａ　ｅ　ＩおよびＳｎａ　Ｉがある。これ らの酵素は全て、平滑端を残し、６塩基配列を認識する。

別のハイブリッド形成法では、サンプルのＤＮＡを例えばＰＣＲ法によりまず増 幅するか、そのまま使用することができる。ハイブリッド形成プローブは、好ま しくは１６〜１００ヌクレオチド、特に１６〜４５ヌクレオチドの長さである。

ノーイブリッド形成分析は、常法により行うことができる。サザンプロット法が 非常に好都合であると考えられる。

（Ｃ）サンプル 本発明は、感染物質、従ってエンセファロバシーに特異的なりＮＡが適度の濃度 で存在していそうな体組織または体液、特に全血、血清、血漿、脳を髄液、唾液 、腎臓、牌臓、肝臓および胎盤から採ったサンプルの分析に適用できる。所望す るならば、脳およびを髄を使用することができる。

（ｄ）エンセファロバシ一 本発明は、スクラピーの感染粒子由来のＤＮＡを使用して開拓したものであるが 、ＢＳＥ１スクラビー、ＣＪＤおよび他のエンセファロバシーは恐らく同じ感染 物質に由来し、別の種喜こ変わったというのが現在の見解である。正確に同じで なくても、恐らく非常に類似している。従って、ＴＡＣＧＴＡ／ぐリントローム 配列は、公知のエンセファロノくシーおよび可能性のある他のエンセファロバシ ーの全てに現れると考えられる。従って、サンプルは、エンセファロノくシーに 罹って（すると考えられる上述したような動物またはヒトから採取することがで きる。

以下の実施例によって本発明を説明する。

実施例１ 実施例１は、スクラピーに対して特異的な１本鎖ＤＮＡの単離と部分的な配列決 定とを説明する。

試料と方法 （１）動物 合計２００匹の離乳したばかりの雌Ｇｏｌｄｅｎ　Ｓｙ＋ｉ１ｎ　／％ムスター に対して、スクラピーに感染した／％ムスター脳の１０％懸濁液００３１を使用 して、菌種２６３にのスクラピー因子を大脳内に接種した。臨床的に病気である 動物（接種後６５〜９θ日）と、これらの動物と成長の度合いが一致している同 数の対照基準１１ムスターとを、２０匹単位で殺した。

ｆｂ）核酸の精製 ＤＮＡの単離を、無菌液中で（特に指摘しない限り）０〜４℃で行った。上記ハ ムスターの脳を取り出し、Ｇ＋１ｆｆｉｌｂ管内の１０ｄ　ＭｇＣ１を含む０３ ２Ｍスクロース（０〜４℃）１０１中に、各々の脳を均質化した。宿主の核を取 り除くために、これらのホモジネートを０〜４℃において１０分間に亙って遠心 分離したｆ７２５　！　ｇ）。その上澄み液を０〜４℃において更に１時間に亙 って遠心分離した（４０．　Ｇｏｏ　Ｉ　ｇ）。２０個の脳から形成したベレッ トを、０〜４℃において、１０　ａｌｌ　ｉ＋ｇｃ１２水溶液５１中に再懸濁し 、リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮ＊＋ｅｌ子ウシ膵臓タイプ　ＩＩＩ−Ａ（Ｓｉｇ ｌ）　２００００単位と、デオキシリボヌクレアーゼ　タイプ１ｆ［ｌＮ■ｔｌ 　（ＳｉｇＩ）　２０Ｇ００単位とを加えた。その混合物を１５分毎に混ぜ合わ せながら３７℃で培養した。こうしたヌクレアーゼと共に　１．５時間に亙って 培養した後に、ＴＥ緩衝液（２０ｓＭ）リス、５ｓ＆１ＥＤＴ＾、　ｐＨ８，５ ］を加えて、最終体積を３０１にした（０〜４℃）。その混合物を０〜４℃で１ 時間に亙って再び遠心分離しｆ４０．０００１　Ｉ）、上記ペレットを　５−１ のトリスＥ［ｌＴＡ緩衝液（０〜４℃でｐＨ８，５１中に再懸濁し、ｌｏｍｇ＃ ＩのプロテイナーゼＫｆＢｏｃｈ＋ｉＢｅ＋ｌ　を加え、１５分毎に混ぜ合わせ ながら４２℃で　１８５時間に亙って培養した。０５％の最終濃度を与えるため にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）を加え、フェノール／クロロホルム抽出法 　（Ｓ＊ｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｌ＋ｃｈ　＆　ｉｌｓ＋１ｔｌｉｓ、１９Ｂ９ ）を使用して、その混合物から核酸を抽出した。その核酸をエタノール中に沈殿 させ、脳１個当たり２５μ（のトリスＥＤＴＡ　（ＴＥＩ緩衝液（ａｌ１７４） 中に再懸濁した。

１０個のアリコート）を再処理し、１０−１７１のプロテイナーゼにと共に４２ ℃において１時間に亙って培養した。その混合物から核酸を上記フェノール／ク ロロホルム抽出法を使用して再抽出し、エタノール中に沈殿させ、５００μｍの ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。この標本を、１０１ＭＭｇＣ１２緩衝液中の（ＤＮ ＊Ｉｅに対して熱不活性化されたｌＲＮ■ｅ　２００単位を加えて３７℃で１時 間に亙って培養することによって再処理した。各々の管が５個の脳からのＤＮＡ を収容するように、その混合物から核酸を上記フェノール／クロロホルム抽出法 を使用して再抽出し、エタノール中に沈殿させた。

アルカリ性ゲルの場合には、核酸を５００　ｓＭ　ＮｉＨ中に再懸濁し、９０分 間に亙って６５℃で培養した。６ｘアルカリ性充填緩衝液を含むＤＮＡ標本を、 アルカリ性ゲルの窪みの中に充填した。６ｘアルカリ性充填緩衝液は、３００　 ｍＮのＮ１０Ｈと、６ｌＭのＥＤＴＡと、１８％のＦｉｅｏｌｌ　（Ｔｙｐｅ　 ４００；　Ｐｂｔｒｌｅｉｓ）水溶液と、０．１５％のブロモクレゾール緑と、 ０２５％のキシレンシアツールＦＦとから成る。

ｆｄ）アガロースゲル電気泳動 ＴＡＥ緩衝液　（４０ｄ　ト’）　スー酢酸塩、ｐ）１７．５、ｌ　ｓｌｌ　Ｅ ＤＴＡｌ中の水平プレート上の１．０％アガロース（ＢＲＬ）中での電気泳動に よって、核酸を分離した。アガロースゲル中に２μ（／ｍｌの濃度で混合された 臭化エチジウムによって、ゲルを染色した。このゲル上で７５ｍＡの定電流によ って電気泳動を行った。ＬｉｍｂｄｓＤＮＡ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　消化フラグメン トとｌ　ｋｂのサイズのマーカーとを使用した。

（ｅｌ　アルカリ性アガロースゲル アルカリ性アガロースゲルを調製するために、蒸留水中に既知量のアガロース＋ ＢＲＬ）を溶融し、５０℃において平衡化し、５０５Ｍ　Ｎ＊ＯＨ，２ｍＭ　Ｅ ＴＩＩＡの最終濃度を与えるように３　Ｍ　Ｎ＊ＯＨを加えた。ゲルからのバン ド（ｂｅａｄ）の精製が必要とされた時には、低融点アガロース（ＢＲＬ）を使 用した。このゲルを調製するためには、先ず最初に、１％アガロースを使用して 従来通りのアガロース床を作り、そのゲルが固まった後に、従来通りに、そのゲ ルの上表面に低融点アルカリ性ゲルを注いだ。ＤＮＡの分解のためのアルカリ性 アガロースゲルに臭化エチジウムを加えることは、一般的には奇妙なことと考え られるだろう。臭化エチジウム染色剤は、２本鎖ＤＮＡの鎖の間への挿入によっ て働く。しかし、アルカリ性ゲル上では、この２本鎖１１ＮＡは１本鎖となるだ ろう。この例では、間違って、臭化エチジウム染色剤がアルカリ性ケルノ中に加 えられた（２ｕ　ｇ／Ｉｆ）　。Ｍ、Ｗ、　ＭｃＤｏｉｅｌｌ　とＭ、　＋１． 　Ｓｉｍｏｎ　とＷ　Ｓ１ｗｄ＋ｅｒ（Ｊ　１ｌｏｌ　Ｂ１６１　１１０．　１ １９−１４６１によって詳細に説明されているように、４０−＾の定電流におい て５０ａｉｌ　ＨｚＯＲアルカリ性電気泳動緩衝液中で電気泳動を行った。

（１）アルカリゲルからの核酸の精製 アルカリ性低融点アガロースゲル上での電気泳動の後では、核酸の約１．２ｋｌ ＋の非連続バンドは、スクラピー感染試料の核酸を含むレーンにおいてだけ、臭 化エチジウムによって染色された状態のままだった。アルカリ性条件下で染色さ れたままだったこの１Ｊｋｂのバンドを、そのゲルから切断した。このゲル断片 を、２０体積の１．５　Ｍ　ＬＣＩ／　ｌ　Ｍトリス緩衝液　（ｐｌ！　７．６ ）中で数回の交換によって中和した。Ｎ５Ｃ１とトリス緩衝液の各々の濃度を次 第にｌｏ−Ｍに低下させた。最後に、そのゲル切片を１．５ｍｌ微量遠心分離管 の中で重量を測定し、３体積の蒸留水を加えた。アガロースが溶融するまで、こ の管を６０”Ｃの水浴中に５分間に亙って湿原した。核酸を更に精製するために 様々な試みを行ったが、これらの試みは失敗に終わった。ｅＤＮＡの第２の鎖の 合成のために使用した低融点アガロース懸濁物中で上記ＤＮＡを更に精製するこ となしに、最善の結果が得られた。合成りＮＡ　リンカ−を末端トランスフェラ ーゼと結合させるために、Ｅ、　Ｈ）ｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏ１７＊ｅｒ＊ｓ＊のＫ ｌｅａｏｗフラグメントの自己開始法（＋ｅ目−ｐ＋１ｓｉＢ　＊ｅｊｈｏｄｌ 　を含む様々な方法とこれらの方法の組み合わせを試みた。スクラビーに対して 特異的な１本鎖ＤＮＡを末端トランスフェラーゼによってプラスミドＤＮＡに結 合する試みも行った。使用したこれらの方法の全ては、“Ｍ＠１６ｃｗｌｚｔＣ Ｉｏｎｉｎ（、ｔ　Ｌｓｂｏ＋＊１ｏｒＹ　ｌｎｍ５ｌ”　、　２ａｄ　ｅｄ、 、　Ｊ、　Ｓ＊＊ｂｔｏｏｋ、　Ｅ。

Ｆ、Ｆｒ１ｌ＋ｃｈ、　Ｔ、　ｂｌ＊ｏ目ｔｉｓ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＩｌｌ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌｓｂｏｒｓｌｏ「ＹＰ＋ｓｓ＋、１９８９に詳細に説明され ている。成功した唯一の方法を、下記で説明する。

低融点アガロースからの精製ＤＮＡの水中懸濁液１０μｍと、丁Ｂ　Ｐｏ１７■ ！１ｌｌｅ緩衝液中の合成ランダム１４−ｓｅｔオリゴヌクレオｆ　Ｆフ５　イ ？−ＮＥＰ−１１２１（Ｄｗ　ＰＯｆｉｌ）　ｌμｌを、５分間に亙ッテ９５〜 １００℃に加熱した。それらの管の温度を徐々に３７’Ｃに低下させた。結果的 に得られた凝縮物を（緩衝液だけを加えて）遠心分離し、それらの管を再加熱し 、再び徐々に３７℃に低下させた。０．５５ｌｌｉ　ｄＮＴＰ混合物２μｌ　と 、＾ｍｐｌｉＴＢ　ＤＮＡ　Ｐｏ１７ｍｅｒｔｓｅ（Ｐｅｒｋｉａ　Ｅｌｄ！ｒ 　Ｃｔ１ｍ＋）　１単位を加えた。その混合物を３分間８０℃に加熱し、更に、 ５分間７５℃に加熱した。追加のＡｍｐｌｉＴｉｑＤＮＡ　Ｐｏ１Ｙ−ｅ＋ｔ＋ ｅ　１単位を加え、それらの管の温度を、各々の温度を５分間ずつ維持しながら ７０℃、６５℃、６０℃、５５℃、５０℃と低下させた。この段階ではＰＣＲは 行なわなかった。合成された２本鎖ＤＮＡを、フェニル／クロロホルム抽出とエ タノール沈殿とによって再び精製した。そのベレットを蒸留水２０μｉ中に一ゼ （Ｐｈｇ＋ｍｇｃｉｇｌ　で処理し、フェニル／クロロホルム抽出法とエタノー ル沈殿とによって再び精製した。

（ｇ１組換えプラスミドの形成 合成したｅＤＮ＾を、切断し脱リン酸化したＭＮｍｐｌＯ，Ｓｌｌ　ｌの中に、 Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。’Ｍｕ　Ｃ１ｏａｉｎｌ／Ｄｉｄｅｏ ｘ７Ｓｅｑｍｅ＋ｃｉａｇ　Ｉｎ１ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ＭＩＩＩＷＪｌ（ＢＩＩ Ｌ）に説明されている通りに、その組換えファージを、コンピテント　Ｅ　Ｃ１ １ｌｌｌｌ１株ＤＨ５＊（ＢＲＬ）に変換し、ＬＢ寒天プレート上に植え付け、 ３７℃で一晩に亙って培養した。

（ｈ）　ＤＮＡ配列の分析 ”ｉｌＮ　Ｃｌｏａｉａｇ／Ｄｉｄｅｏｘ７　ＳｅｑｗｅｎｃｉＢ　１ｎｓｌ＋ ｗｅｌｉｏｎ　Ｍｒ＋＋ｕ＊ｌ　”（ＢＲＬ）に説明されている通りに、１本鎖 ファージＤＮＡを、　１．５１の培養液から６時間をかけて単離し、１１１３− プライマー　５ＥＱＩＤ　ＮＯ：　４　：　５’　−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ ＧＴＴＧＴ　−３’を有する［ｌＮ＾シーヌクレオチド方法によって、直接的に 配列決定した。１５μｍの総体積中ニ１．５〜２．０　μｇ　ｃ７）１本鎖［Ｉ ＮＡ　ト、３μ１ｆ５１１）配列決定緩衝液と、　１μｌのプライマーとを含む アニーリング反応混合物を、５分間に亙って９５〜１００℃に加熱し、その混合 物を、加熱ブロック中で約４５分間をかけて室温に戻し、短時間だけマイクロフ ユージ（ｓｉｃ＋ｏｌＢ＋ｌ　した。１５μｍのアニーリング／プライマー混合 物に対して、１μｍの０．　Ｉ　Ｍ　ＤＴＴと、１ポリメラーゼ　（ＤａＰｏｎ ｌ）を加え、それらの管を室温で３分間培養した。この混合物を、２μｍの０． １閤Ｍ　ｄＮＴＰ及びｄｄｌｌＴＰ配列決定混合物を収容する４本の管の中に分 散させた。それらの管を３７℃で３０分間に亙って培養し、その後で短時間だけ マイクロフユージし、ｄｄＮＴＰを含まないが非標識ｄＡＴＰを含む０．４ｉＭ の配列決定混合物２μＩを各々の管に加えた。更に２０分間に亙って３７℃で培 養した後に、５μｍの停止液を各々の管に加え、遠心分離によって混合した。ト リス−ホウ駿塩電気泳動（ＴＢＥＩ緩衝液中に７Ｍ尿素を含む６％アクリルアミ ドゲル中で、試料に対して６０ワツト（４０１＾）の電流で電気泳動を行った。

試料を５分間に亙って沸騰させ、載置の前に、湿った氷の上で冷却した。

ｒＮ１＋　５０Ｊと呼ばれるクローンからの１つの試料も、染料プライマー［− ２１Ｍ１３１を使用して、Ｕｎｉｗｅｚｉｔ７　ｏｌ　［１ｕ＋ｂ＋ｍ（Ｅｎｇ ｌｌｎｄ）においてＭｏｄｅｌ　３７０Ａ　ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅ ｄＲｉｏｔ）の自動プロセスによって配列決定した。ヌクレオチド配列決定デー タをコンピュータプログラムによってＧｃｅＢ＊ｎｋデータベースと比較した。

（ｉｌ　ＰＣＲによるクローンの増幅 １１３２本鎖ＤＮＡのクローンと、挿入断片を伴う１本鎖ＤＮＡのクローンとを 、Ｍ３の一２０逆プライマーとのポリメラーゼ反応（ＰＣＩＩ）による増幅のた めに使用した。その反応を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔａ＋　ＰＣＲキッ ト中の　１００μｌの反応混合物中で、その製造者の指示に従って行った。全て の試料に対して次のようなＰＣＲを４０サイクル行った・９４℃における６０秒 間の変性、４５℃における　１５０秒間のプライマーのアニーリング、７５℃に おける１２０秒間の伸張。ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウム染色を使用して、０ ．１％アガロースゲル上で分析した。

結果 に、　ｌ’１．　Ｎｘ＋１ｎ（、Ｉｌ、　Ｓ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ、　！Ｊ、 　Ａｓｈｅｒ、　Ｄ、　ＣＧ＋ｉｄｕ＋ｅｋ、１ｎｌｅ＋ｙｉ＋ｏｌｏｇ７１９ ９１．３２．３１６−３２４　［Ｎ９１）で詳細に説明されているように、ＴＡ Ｅ緩衝液を使用して中性アガロースゲル中で単離し電気泳動した、スクラピー感 染脳の核酸フラクションと非感染脳の核酸フラクションとの両方の分析によって 、スクラピー感染脳試料と非感染脳試料との間に大きな相違があることが明らか になった。簡単に言えば、これらの両試料には、約Ｉ５．７Ｈの２本鎖の環状分 子であるハムスターのミトコンドリア（ａｌｌＤＮＡのバンドにサイズが一致す るバンドが存在した。このバンドに加えて、高分子量の幾つかの広幅のバンドが 、スクラビー感染試料にだけ発見された。上記の以前の研究では、より遅く移動 する核酸のバンドが環状囲ｔＤＮ＾の多量体形態であることが示されている。

臭化エチジウムで染色されたＮ＊ＯＨを使用してアルカリ性アガロースゲル中で 単離し電気泳動した、スクラピー感染脳の核酸フラクションと非感染脳の核酸フ ラクションとの両方の分析によって、スクラピー感染脳の場合に、１つの約１， ２ｋｂのバンドがそのアルカリ性条件下でそのレーン内に依然として発見できる が、一方、ＤＮＡ標識は発見できない（これらはアルカリ性条件下で変性された ）ということが明らかになった。これらの核酸のバンド全てが、そのゲルをＮｏ ＣＩとトリス緩衝液とで中和した後に視覚化された。

スクラピーに特異的な１．２ｋｂのバンドを切り取り、上記方法の説明の通りに ｃＤＮＡの２本鎖の中に合成した。Ｓｓ＊ｌ切断部位に挿入断片を有する３つの クローンを調べた。１つのクローンは、１３塩基だけの挿入断片しか持たなかっ た（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　５　：１　＾ＴＡＴＡＴＡＴＡＣＧＴＡ　Ｎ）。

他の２つの配列はｆＴＡｃＧ丁Ａｌ　ｎ　ＴＡと読み取れ、その両方とも、３８ 塩基の後は読み取りが困難だった。これら２つのクローンの一方である（３８塩 基が読み取れたｌ　ｒＮｚ＋　５０Ｊを自動システムで配列決定し、結果が同一 であることを発見した。６塩基ＴＡＣＧＴＡの読み取り配列が同一の順序で反復 した。

中央でＴＡＣＧＴＡを切断する５ｎｓＢＩには制限部位がある。Ｓ＋＋ｓＢＩ制 限酵素に関してはＭＨに単一部位がある。挿入断片を伴うＭ１３プラスミドの２ 本鎖［１１１Ａを、小規模調製方法によってＥ。

ｃｏｌｉから調製した。Ｓ■Ｂｌ制限酵素によってＤＮＡを切断した。

ゲル分析によって、一方が５．０ＯＱ塩基以上を有し、他方が約２．２５０塩基 を有する、２つのバンドが示された。生じた２つの７ラグメントのサイズが大き いので、これらのフラグメント内の挿入断片のサイズを推定することは困難だっ た。

ＴＡＥ緩衝液を使用して中性アガロースゲル中で電気泳動したＭ１３２本鎖１１ ＮＡと１本鎖ＤＮＡの１０ｕｌの増幅ＰＣＩＩ生成物の分析によって、約２５０ 塩基の単一バンドの増幅が明らかになった。

約１００塩基にプライマーを含む１１３の塩基を計算することによって、約１５ ０塩基のサイズの挿入断片が示された。そのＰＣＩ生成物を、ＥｃｏＲｌかＩ（ ｉａｄｌｌｌかＳｎＢＩを使用して、又は、これらの酵素を２つ又は３つ組み合 わせて、切断した。ＥｅｏＲｌ又はＨｉＩｌｄｌｌｌは、そのバンドの移動度に 極めて僅かな差異しか与えなかったが、５ｎｔＢｌだけ、又は、他の２つの制限 酵素とＳｎ＊Ｂｌとの組み合わせは、そのサイズを約半分の１２５塩基に減少さ せた。

挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列をＧｅｎＢＩｋヌクレオチドデータベースと比較 することによって、有意な相同性はな（１ことが明らかになった〇 実施例１の調製手順を反復した時に、パリンドローム配列ＴＡＧＣＴＡに先行す る更に別の配列ＡＴＡＡＴＡを検出した。これは、パリンドローム配列を接続す る中間（リンカ−）配列の少なくとも一部分であると考えられる。

実施例２ 本実施例は、ＰＣＲを使用する診断分析を例示する。

血液中のスクラピー等の量は、血液１グラム（又はｃ−）当たり１０３感染用量 （＋１ｏｓｅ　ｏｆ　１ｎｌｅｃｌｉマ自りであろう。（１感染血液中で概ね一 定不変である。１マイクロリットル程度の血液がそのＤＮＡの１分子を含むだろ うが、これはＰｃｔの場合に限ってそうであるのであって、実際には、これより 著しく多（島量の試料を使用することになるだろう。ＤＮＡとの結合から不要な タンパク質を取り外すためにプロテイナーゼＸで血液を処理し、プロテイナーゼ Ｋを破壊するために１０分間に亙って９５℃に加熱した。７１ｇポリメラーゼ中 の混合ヌクレオチドである（丁＾ＣＧＴ＾）３プライマーを使用して、ＰＣＩを 行った。その後で、そのＰＣＲ生成物を１０μｍの試料中のゲル上で電気泳動し た。プライマーによるアニーリングと伸張と変性とから成る３段階の第１のサイ クルをサイクル全体を通して９５”Ｃで行った。その後で、この３段階の形で、 ４０回のサイクルを４５〜５０℃、７２℃、９２℃で行った。

１つのＰＣＲ生成物試料を制限酵素Ｓ＋ｓＢＩで分解し、別の試料は未処理のま まにした。その酵素による処理によって、ＰＣＲ生成物に起因するバンドが消滅 する場合には、スクラピーに対して特異的なりＮＡが存在する。（ＳｏｒＢＩの 作用は、ＴＡＣＧＴ＾配列を切断し、多数の小さなりＮＡ断片を形成することで ある）。

以下の配列リスト（Ｓｅｑｓｅ＋ｃ！Ｌ目目ａｔ）は、米国特許庁によって提供 された「ｐ＊１ｅａｌｉｎＪプログラムを使用して作られた。このプログラムは 、その核酸が本明細書の場合のように１本鎖である時にさえ、ヌクレオチド長が 「塩基対」で表されることを生じさせるというエラーを含んでいる。何故なら、 「塩基対」が「ヌクレオチド」を表すからである。

配列リスト ［１）一般情報 （１）出願人　ＮＡＲＡＮＧ、　ＩＩＡＲＡｓＨＫＢＩＩＩＴＩＳＩＩ　ＴＥＣ １ｉ！ｌ０ＬＯＧＹ　ＧＲＯＩＩＰ　ＬＴＤ（１、発明の名称　オリゴヌクレオ チドと、脳疾患に関する分析におけるその使用 （ｉ　ｉ　ｉ）配列数：５ （ｉマ）通信連絡先： （＾）８宛て人：　Ｒ，ＫＥＩＴＦＩ　ＰＥＲＣＴ　ＭＡ　ＣＩ’Ａ（Ｂ）街区 ：　！１ｉｌｌＴＩｓｌＩ　ＴＫＣＩＩＩＩＯＬＯＧマＧＲＯＵＰ　ＬＴｆｌ、 。

１０１　ＮＥＷＩＮＧＴＯＮ　ＣＡｌｌ５ＥＷＡＹ。

（Ｃ１都市　ロンドン ｆＤ１国・英国 （Ｆ）郵便番号Ｉ　ＳＥｌ　６１１ｔｌ（マ）コンピュータ可読形式 （＾）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂｌコンピュータ　ＩＢＭ　ＰＣコン パチブルＩＣ）オヘレーｆインクシス＋１：　ＰＣ−ＤＯ３／１ｌｓ−Ｄｏｓ（ ［ｌ）ソフトウェア：　？１ｅｅＮＩＩＲｅｌ＠＊ｓ＊　ｔ　１．０．　Ｖｅｒ ｓｉｏｍｔｌ、２５ （マｌ）現行出願データ （Ａｌ出願番号・ＷＯ現在不明 （Ｂ）出願日付。

（Ｃ）分類：　ＣＯ７ＩＩ　２１／Ｇｏ　？Ｃ１２Ｎ　＋５／１１　？ ＧＯｌ　Ｎ　３３１５３　？ （マロ１）弁護士／代理人情報。

（Ａ）名称：　ＰＥＩＩＣＹ、　ＩＩＩＣＲＡＲＤ　Ｋ（８１登録番号：　ＵＫ 　ＰＡＴＥＮＴ　ＡＴＴＯＲＮＥＹ（Ｃ）　参照／認可！番号＋　ＰＦ　１３４ ６４８　ＰＣＴ／ＲＫＰ（ｉり電気通信情報。

（Ａｌ電話：　＋４４７［４０３６６６６１２３１１（ｆｌｌ　７　ｙ　り’ｉ 　ミ’）　：　４４４７１４０３７５！１ｇ（２）　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：ｌ に関する情報（１）配列特徴 （＾）長さ；１０アミノ酸 （ｘｌ）配列記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡ　ＣＧτ ＾ＴＡＣＮ（２）　ＳＥＱ　１０に０：４に関する情報（ｉ）配列特徴 （Ａｌ長さ；１７塩基対 ｆＢｌ　タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の状態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （■）分子タイプ・Ｄに＾　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説、無し くｉマ）アンチセンス　、無し く月）原ソース（ｏｒｉｇｉＩＩａｌ　ｓｏｗｒｃｅｌ＋（＾）生体：關１３プ ライマー （！１）配列記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４：ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ　ＡＣＧ ＴＴＧＴ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５に関する情報（１）配列特徴 （＾）長さ：１３塩基対 ＋Ｂｌタイプ、核酸 （Ｃ）鎖の状態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー、直線 （１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（■五）仮説：無し く皇マ）アンチセンス　、無し くｒｉ）配列記述：　ＳＥＱ　ｌ［ｌ　ＮＯ：５：＾ＴＡＴＡＴＡＴＡＣＧＴＡ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年２月１〜か

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次式のオリゴヌクレオチド、 （Ｘ）ａ−（６Ｎ−パリンドローム）ｎ−（Ｙ）ｂ（１）［式（１）中の「６Ｎ −パリンドローム」が（左側に５′末端が位置する従来の表記法で読まれた）【 配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列がありま す】、【配列があります】、又は、【配列があります】を表し、ｎが２以上の適 切な整数であり、 Ｘがある長さの適切な５′末端又は末尾ＤＮＡであり、ａが０又は１であり、 Ｙがある長さの適切な３′末端又は先頭ＤＮＡであり、且つｂが０又は１である ］ 又は、相補的配列にアニーリング又はハイブリダイズする当該「６Ｎ−パリンド ローム」配列の能力を維持する、前記オリゴヌクレオチドの任意の標識付き形態 もしくは前記オリゴヌクレオチドの任意の誘導体。 ２．前記ｎが２、３又は４である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．前記ａが０であるか、又は、前記Ｘが６Ｎ−パリンドローム配列の残分を表 し且つａが１であり、前記ｂが０であるか、又は、前記Ｙが６Ｎ−パリンドロー ム配列の残分を表し且つｂが１であり、 更に、前記オリゴヌクレオチド中のパリンドローム配列の全長が１２〜２４であ る請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。 ４．前記オリゴヌクレオチド中のパリンドローム配列の全長が１６〜２４である 請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．前記「６Ｎ−パリンドローム」がＴＡＣＧＴＡを表し、前記ａが１であり、 前記Ｘが、式（Ａ）ｐ（ＴＡ）ｑ［ｐが０又は１であり且つｑが１以上である］ の配列を、前記「６Ｎ−パリンドローム」配列の５′末端に隣接して有する請求 項４に記載のオリゴヌクレオチド。 ６．その長さが２００ヌクレオチドを越えない請求項１、２、３、４又は５に記 載のオリゴヌクレオチド。 ７．標識が前記５′末端に付けられる標識付き形態の請求項１、２、３、４、５ 又は６に記載のオリゴヌクレオチド。 ８．脳疾患エンセファロパシィーの分析における請求項１、２、３、４、５、６ 又は７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 ９．ＤＮＡ増幅におけるプライマーとしての請求項１、２、３、４、５、６又は ７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 １０．プローブとしての、標識付き形態の請求項１、２、３、４、５、６又は７ に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 １１．ポリメラーゼ鎖反応を行うためのキットであって、（１）デオキシリボヌ クレオチド、 （２）ポリメラーゼ鎖反応に適したポリメラーゼ、（３）プライマーとして使用 するための少なくとも１つの請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載のオリ ゴヌクレオチドを含むキット。 １２．成分（３）が前記オリゴヌクレオチドの正方向又は逆方向のプライマーを 含む請求項１１に記載のキット。 １３．前記オリゴヌクレオチドに標識が付けられていない請求項１１又は１２に 記載のキット。 １４．前記６Ｎ−パリンドロームを切断することが可能な制限酵素を更に含む請 求項１１、１２又は１３に記載のキット。 １５．前記制限酵素がＳｎａＢＩ、ＡｃｃＩ、ＭａｅＩ又はＳｎａＩである請求 項１４に記載のキット。 １６．脳疾患エンセファロパシーの分析方法であって、当該脳疾患に対して特異 的なＤＮＡを含むと考えられる試料を処理して、前記ＤＮＡを増幅することと、 この増幅生成物を検出することと、その後で、ＴＡＣＧＴＡ反復配列の複数の複 製の存在に関して前記生成物を分析することとを含む方法。 １７．前記ＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応によって増幅する請求項１６に記載の方 法。 １８．増幅生成物を酵素によって切断し、その切断された生成物を非切断の生成 物と比較し、それによって、より長い長さのＤＮＡの切断による消失が、当該脳 疾患に対して特異的なＤＮＡの存在を示す請求項１６又は１７に記載の方法。 １９．前記制限酵素がＳｎａＢＩ、ＡｃｃＩ、ＭａｅＩ又はＳｎａＩである請求 項１８に記載の方法。 ２０．適切なハイブリッド形成条件下で標識付きの相補的プローブＤＮＡを使用 して、当該脳疾患に対して特異的なＤＮＡを含むと考えられる試料をプローブ検 査し、得られたハイブリッド生成物を分析することを含む、脳疾患の分析方法。 ２１．式中のｎが６以上である式（ＴＡＣＧＴＡ）ｎの少なくとも１つの配列を 含むスクラピーに対して特異的なＤＮＡ。 ２２．式Ａ（ＴＡ）３（ＴＡＣＧＴＡ）ｎの少なくとも１つの配列を含む請求項 ２１に記載のＤＮＡ。