JPH06510201A - ダブルｄループ形成の診断応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛プルＤループ≦　の号　、 本出願は、同時係属中で同時所有の１９９０年３月７日に出願された米国出願系 ０７７５２０．３２１号の一部継続出願である、同時係属中で同時所有の１９９ １年９月４日に出願された米国出願系０７／７５５．４６２号の一部継続出願で ある、同時係属中で同時所有の１９９２年７月９日に出願された米国出願系ｏ７ ／９１０．７９１号の、一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、２種のプローブ捕捉／検已系、ＲｅｃＡで促進されたＤＮＡ増幅、お よびインサイチュ−ハイブリダイゼーションを包含する種々の診断方法で利用さ れ得る、ＲｅｃＡで触媒された安定なダブルＤループ構造の形成に関する。

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発明の背景 ＲｅｃＡ＋タフハク質（野生型）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔから発 見された３７．１１４２ダルトンのタンパク質であり、相同的ＤＮＡ組み換えに 重要である。その生化学および酵素学上の多くの情報は、精製ＲｅｃＡ＋タンパ ク質を使用するインビトロの研究に由来している。多くのインビトロの研究は、 ＲｅｃＡ＋タンノくり質が、最終的に相同組み換え現象を生じる、相同ＤＮＡ配 列間のベアリング反応に、本質的に関係していることを示して（する（　Ｒａｄ ｄｉｎｇ　；Ｃｏｘら、またはＲｏｃａらのＲｅｃＡ＋タンノくり質の性質に関 する最近の総説を参照）。ＲｅｃＡ＋タン、４り質に、ＤＮＡ診断への適用り二 関して高い有用性を与えているのが、このベアリング反応である。

ＡＴＰの存在下でＲｅｃＡ＋タンノｆり質は、多（の基質間で鎖の置換ヲ触ＩＩ し、ＤＮＡプローブに使用するとき、大部分の基質（よ一本鎖ＤＮＡプローブお よび二本鎖ＤＮＡである。ＲｅｃＡタン、＜り質でコートされた一末鎖ＤＮＡプ ローブは、まず最初に、ハイブリダイズされ部分的に結合された（単一）Ｄルー プ（または、特定のケースでは三本鎖構造）と呼ばれる分子を含む、組み換え中 間体を形成することにより、二本鎖の（ネイティブな）標的配列の相同な部分と 相互作用する（　５ｈｉｂａｔａら、１９７９）。

次いで、分岐点移動、そして、もとの一本鎖および二本鎖ＤＮＡ間の完全なハイ ブリッド分子を、それらのホモロジーの程度に依存して形成する。

直鎖状標的上での、短い置換ループまたは二本鎖Ｄループ構造は、通常、除タン パク質化の後は不安定である。ＲｅｃＡタンパク質は、ＡＴＰγＳおよび過剰の ＲｅｃＡタンパク質存在下で、長さが９から２０ｂｐ　（またはそれより長い） の短いオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成することが認められている（Ｌ ｅａｈｙら）。直鎖状の二本鎖標的が使用される場合、ＲｅｃＡ除去後の安定な プローブ標的ベアリングは、（ｉ）少なくとも３８がら５６ｂｐの相同な領域、 および（ｉｉ）直鎖状の二重鎖の末端で、プローブ標的ホモロノーがあること、 を必要とするようである（）Ｉｓｉｅｈら、１９９０；　Ｇｏｎｄａら）。

Ｒｊｇａｓらは、標的として二本鎖の負のスーパーコイル環状プラスミドＤＮＡ が使用された場合に、一本鎖の４３マーが、除タンパク質化に対して安定な、単 一のＤループ複合体を形成し得たことを報告した。

二本鎖の負のスーパーコイル環状標的ＤＮＡが使用された場合、ＲｅｃＡてコー トされた一末鎖オリゴヌクレオチドプローブはまた、そのＲｅｃＡタンパク質の 除去前にプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）架橋することにより、さらに安定化さ れ得ニブローブー標的単−Ｄループ生成物は、そのオリゴ塩基数が少なくとも３ ｏマーサイズであれば回収され得る（Ｃｈｅｎｇら、１９８９）。標的ＤＮＡと して、二本鎖の直鎖状ＤＮＡ二重鎖が使用される場合、プソラレン架橋で安定化 された単一〇ループプローブー標的複合体を得るために、プローブは、少なくと も８ｏがら１０７マーサイズでなければならない（Ｃｈｅｎｇら、１９８ｇ）　 ：これらの反応は、負のスーパーコイル環状標的との同様の反応に比べて、非常 に低い効率である。

本発明を支持するために実施した実験は、プローブ鎖の間で相補的な配列を含む 二重鎖プローブが、ハイブリダイゼーション反応で使用されるという条件で、Ｒ ｅｃＡタンパク質で触媒される反応において、除タンパク質化に対して安定なプ ローブ・標的ＤＮＡ複合体が生じ得ることを立証している。この発見は、この安 定な、ＲｅｃＡタンパク質で触媒されんプローブ：標的ハイブリタイゼー７ｇン 複合体を用いる診断的使用の多（の機会を提供する。

発明の要旨 本発明は、第−鎖および第二鎖を有する、直鎖状二重鎖ＤＮＡ分析物を検出する 診断方法を包含し、ここで上記分析物は、第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する 。本方法は、各々が第１標的配列鎖または第２襟的配列鎖にｔ目補的な配列を有 する２種のＤＮＡプローブのセットを提供することを教示し、ここで、これらの プローブはまた、相互に相補的な重腹部分領域を有する。

次いで、両プローブ鎖は、ＲｅｃＡタンパク質コーテニーグ反応中で、ＲｅｃＡ タンパク質でコートされる。このＲｅｃＡでコートされたプローブは、プローブ ：標的複合体を生成する条件下で、標的配列を含む直鎖状二重鎖ＤＮＡと結合す る。このプローブ：標的複合体は、両プローブ鎖および直鎖状二重鎖分析物の両 鏡を含む。本発明の方法では、除タンパク質化は必ずしも必要でないけれども、 上記プローブ：標的複合体は、除タンパク質化に対して安定である。次いで上記 プローブ：標的複合体中の上記プローブＤＮＡの存在が検出される。

本発明の１つの実施態様において、ＲｅｃＡタンパク質は、誼ｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉの野生型ＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質 は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、 または、多くの供給源からのＲｅｃＡ様のタンパク質であり得る。

本発明の１ｉｅｅＡ−タンパク質コーティング反応は、ＡＴＰγＳ、　ｒＡＴＰ 　（単独および再生系の存在下で）　、ｄＡＴＰ、　ＧＴＰγｓ１　および、Ａ ＴＰγＳとｒＡＴＰとの混合物、ならびにＡＴＰγＳとＡＤＰの混合物、を含む 、種々のコファクターを用いて実施され得る。

本発明の１つの実施態様において、上記プローブ踏量の相補的重複部分領域は、 少なくとも約７８塩基対から約５００塩基対以下である。上記プローブ鎖は、ま た、いずれの標的鎖にも相補的でないＤＮＡの末端伸張を含有し得る。両方の鎖 がこのような末端伸張を含有する場合は、これらＤＮＡ伸張は、相互に相補的で あり得る。

本発明の方法の検出工程を行う一つの方法は、上記プローブ・標的複合体を除タ ンパク質化し、次いで、上記プローブ二標的複合体を、遊離のプローブから電気 泳動的に分離することである。上記プローブ・標的複合体は、ＳＤＳまたはプロ テイナーゼＫを用いる処理を包含する種々の方法、および、フェノールを基礎に した方法の様な標準的な化学的除タンノくり質化法により、除タンパク質化され 得る。あるいは、上記検出工程は、上記プローブ標的複合体をトラ、ブする捕捉 系の使用を包含し得、ここで、第一のプローブ鎖は、捕捉部分でラベルされ、第 二プローブ鎖は検出部分でラベルされる。例えば、一方のプローブ鎖かビオチン でラベルされ得、他方は、ンコキンゲニノてラベルされ得る。次いで、上記プロ ーブ：標的複合体は、固体支持体−ストレプトアビジン（またはアビジン）／ラ ベルされた抗ンゴキンゲニン、または固体支持体−抗ジコキンゲニン抗体／ラベ ルされたストレプトアビジン（またはアビジノ）を用いて、捕捉／検出される。

別の実施態様では、第一プローブ鎖が捕捉部分を含有し、第二プローブ鎖か、検 出に使用される放射性ラベルを含有する。

上記プローブ鎖は、多くの方法で、例えば、プローグ゛に結合したビオチンまた はジコキ／ゲニン、および捕捉のためのそれぞれストレプトアビノン（またはア ヒ゛ジン）まｔこ１よ抗ジコキ７ゲニ／抗体を用いて、捕捉のためにラベルされ 得る。

上記プローブ鎖は、また、放射性、ビオチン、ジゴキンゲニン、を包含する、多 くの異なる部分を用いて、検出のためにラヘルされ得る。放射性ラベルは、例え ば、オートラジオグラフィーまたは／ンチレー７ｇン計測により、同定され得る 。

ビオチンまたはジコキンゲニンの存在は、それぞれ、ストレプトアビジンまたは 抗ジゴキンゲニン抗体により検出され得る。ここて、上記ストレプトアビジン（ またはアビジン）または抗ジコキンゲニン抗体は、放射性ラベル、酵素ラベル（ 例えば、アルカリフォスファターゼ、ベルオキシダーゼ、ベータカラクトンダー ゼまたはグルコースオキシダーゼ）または蛍光色素ラベル（例えば、フルオレセ イン、Ｒ−フィコエリトリン、またはロータノン）され得る。上記プローブ：標 的複合体中の上記プローブ鎖の検出はまた、ＤＮＡポリメラーゼで促進される、 各プローブ鎖の３゛末端からのプライマー伸張により達成され得る。ここで、上 記プライマー伸張は、４種のｄＮＴＰ全でおよび検出し得る部分を含有する一種 またはそれ以上のｄＮＴＰの存在下で実施される。

本発明の方法は、さらに、第−鎖および第二鎖を有し、第２の二重鎖標的配列に 相補的な、２種のＤＮＡプローブの第二のセットの提供を包含する。ここで、上 記プローブの第−鎖は、第二の標的配列の一方の鎖に相補的な配列を含有し、そ して上記プローブの第二鎖は、第２の標的配列の他方の鎖に相補的な配列を含有 し、ごこて、（ｉ）これらプローブはまた、相互に相補的な重複部分領域を有し 、そして（１１）上記第二のセ。

トのプローブは、第一のセットのプローブとはハイブリダイズしない。上記の２ 種類のブローブセノ）は、ＲｅｃＡタンパク質コーテコ−ティング反応中ｅｃＡ タンパク質でコートされる。

ＲｅｃＡでコートされたプローブセントは、二種類の標的配列を含む、直鎖状二 重鎖ＤＮＡと結合する。この結合は、４種のプローブ鎖すべてを含むプローブ・ 標的複合体を生成する条件下で行われる。生じたプローブ標的複合体は、除タン パク質化に対して安定である。次いて上記プローブ標的複合体中の上記プローブ ＤＮＡの存在が検出される。

２種類のプローグセットを伴う本方法は、１種類のプローブセットに関して、上 記されたのと同様の多くの方法で使用され得る。例えば、第一のプローブセット は、捕捉部分でラベルされ得、第二のプローブセットは、検出部分でラベルされ 得る。

２種類のプローブセットを伴う二本鎖ブローブ：二重鎖標的腹合体はまた、Ｒｅ ｃＡタノバク質で促進されたＤＮＡ増幅法に使用され得る。例えば、２種類のプ ローブセットは、ＡＴＰγＳ［またはｒＡＴＰ　（適切なＡＴＰ再生系の存在下 または非存在下で）、ｄＡＴＰ、ならびにＡＴＰγＳおよびＡＤＰの混合物］の 存在下で、それらの二重鎖標的配列とハイブリダイズし得、そして、４種のｄＮ ＴＰ全て、ＲｅｃＡタンパク質およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含有する反応 混合物中で反応し得る。この反応は、二つの標的鎖の熱解離に必要な温度未満で 実施され、上記標的配列か所望される程度にまで増幅されるまで続行される。上 記増幅反応は、さらに、増幅反応進行中に、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および （ｉｉ）ＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブを繰り返し添加することを 包含し得る。本発明に適用し得る、増幅のその池のアプローチは、本明細書中に 参照によってとり入れられた１９９０年５月７日出願の同時係属中の米国出願筒 ０７７５２０．３２１号に開示されている。各プローブセットにおいて、一方の 鎖の３′末端は、２種類のプライマーセットにより規定される領域の内側に在り ：これら末端は、増幅反応にとって必要である。しかしながら、２種類のプライ マーセットにより規定される領域の外側にある、各プライマーペアの反対側の３ °末端は、これら末端からの伸張産物の形成を阻害するｌこめにプロ’ｙりされ 得る。この増幅方法はまた、検出方法として使用され得、ここで、プローブ：標 的複合体中の上記プローブの検出は、ＤＮＡポリメラーゼで促進された各プロー ブ鎖の３“末端からのプライマー伸張により達成される。こごで、プライマー伸 張反応は、４種のｄＮＴＰ全ておよび検出し得る部分を含有する一種またはそれ 以上のｄＮＴＰの存在下で実施される。

二本鎖プローブ二重鎖標的腹合体はまた、任意の標的にされた制限部位の切断を ブロックするために使用され得る。

切断のプロ、キングは、（１）プローブ：標的複合体の形成、およびこの複合体 の除タンパク質化前の制限酵素を用いる処理；　（ｉｉ）メチル基の存在に対し て選択された酵素の感受性に依存する、メチル化されたまたはメチル化されない プローブの使用；および（ｉｉｉＨ３的にハイブリダイズした場合に、制限部位 を排除するような配列ミスマツチの上記プローブの各鎖中への導入、を包含する 多くの方法により達成され得る。

上記二本鎖プロープ：二重鎖標的複合体はまた、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的 切断を生成するために使用され得る。二本鎖プローブは、標的二重鎖の各鎖を切 断し得る部分で改変され得る：このプローブ改変は、切断部分の性質に依存して 、除タンパク質化の前または後で起こり得る。このような部分の例は、鉄Ｆｅ１ ｌ（鉄／ＥＤＴＡで促進される切断に用いる）、非特異的ホスホジェステラーゼ 、および制限エンドヌクレアーゼである。いずれの場合も、切断特異性は、上記 二本鎖オリゴヌクレオチドプローブにより規定される標的配列により付与される 。

上記の制限部位保護法および部位特異的切断法の両者は、制限フラグメント多形 性解析に有用である。

本発明の別の実施態様は、第−鎖および第二鎖を有し、第１の内部ＤＮＡ標的配 列を含有する、直鎖状二重鎖ＤＮＡ分析物を分離する方法を包含する。ここで、 上記二重鎖ＤＮＡ分析物（ま、核酸分子の混合物中に存在する。この方法では、 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２種のＤＮＡプローブの１つの セットが提供される。ここで、第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（１） 第−襟的配列鎖および第二標的配タ１１鎖に相補的な配列を含有し、そして（ｉ ｆ）これら相補的配ｒｌｌＪ　ｉ；！また、上記プローブ踏量で相補的重複部分 を含有する。上記プローブは、次いでＲｅｃＡタン／９質でコートされる。上Ｓ 己プローブ鎖および両標的鎖を含有するプローブ・標的複合体を生成する条件下 で、このコートされたプローブは、標的配列を含有する直鎖状二重鎖ＤＮＡと結 合する。得られたプローブ：標的複合体は、除タンパク質化に対して安定である 。上記プローブ・標的複合体は、核酸分子混合物から分離される。次いで、上記 標的配列を含有する二重鎖ＤＮＡ分析物が、単離される。

この方法において、上記複合体は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン で捕捉されるピオチン部分を含有するプローブを用いて、上記核酸混合物から分 離され得る。ストレプトアビジンまたはアビジンは、常磁性ビーズのような固体 支持体に結合し得る。

本方法は、さらに、（ｉ）上記複合体から標的配列を含有する上記二重鎖ＤＮＡ 分析物を遊離するのに充分で、かつ（ｉｆ）標的配列を含有する上記二重鎖ＤＮ Ａ分析物の融解温度未満である温度で、単離されたプローブ：標的複合体の熱変 性を包含する。これは、そのままの状態（ｉｎｔａｃｔ）の二重鎖分子の単離を 可能とする。上記二重鎖は、次いで、必要ならば、一本鎖に変性され得る。ある いは、プローブ＝ｖＡ的複合体は、（ｉ）上記複合体から標的配列を含有する二 重鎖ＤＮＡ分析物を遊離するのに充分で、かつ（ｉｔ）標的配列を含有する二重 鎖ＤＮＡ分析物の融解温度またはそれ以上の温度で、熱変性され得る。これは、 捕捉され二重鎖由来の一本鎖ＤＮＡ分子の単離を生じる。

本発明の別の実施態様は、核酸分子混合物中の直鎖状二重鎖ＤＮＡ分析物の検出 の方法である。この方法は、上記のような、直鎖状二重鎖ＤＮＡ分析物を単離す る工程、および二重鎖ＤＮＡ分析物由来の一本鎖ＤＮＡ分子を得る工程を包含す る：これは、代表的には、二重鎖の融解温度以上で二重鎖を加熱する工程により 達成される（熱変性）。標的配列に相補的で二種のオリジナルなりＮＡプローブ のいずれかに存在する配列を含有しない、少なくとも一種のＤＮＡ合成プライマ ーが、上記一本鎖の標的ＤＮＡ分析物分子配列に添加される。上記ＤＮＡ分析物 の検出は、プライマー３°末端からのＤＮＡポリメラーゼで促進されたプライマ ー伸張により達成される。ここで上記プライマー伸張は、４種のｄＮＴＰの全て および少なくとも一種の、検出可能な部分を含有するｄＮＴＰの存在下で実施さ れる。

本発明の上記二本鎖プローブ：二重鎖標的複合体はまた、診断上のインサイチュ −検出技術に使用され得る。

図面の簡単な説明 図１は、ラムダゲノムに対する、表１に列挙した、プローブおよびプライマーの 関係を示している。

図２は、ラムダゲノム領域５００ｂｐのヌクレオチド配列を提示している：この 配列は、配列番号：１としても提示される。

図３は、ＤＮＡプローブへのＲｅｃＡタンパク質の結合を例証するための、ＤＮ Ａバンド−シフトゲル電気泳動アツセイのオートラジオグラムを示している。

図４Ａは、５００マーおよび２８０マープローブを使用した除タンパク質化した ハイブリダイゼーション反応の成分が分離された、臭化エチジウムで染色された ゲルを示している。図４Ｂは、図４Ａに示されたゲルのオートラジオグラフを示 している。

図５Ａは、２８０マー、１２１マーおよび７９マープローブを使用する除タンパ ク質化したハイブリダイゼーション反応の成分が分離された、臭化エチジウムで 染色されたゲルを示している。図５Ｂは、図５Ａに示されたゲルのオートラジオ グラフを示している。

図６Ａは、別々にラベルされた１２１７−ＤＮＡプローブを使用する除タンパク 質化したハイブリダイゼーション反応の成分が分離された、臭化エチジウムで染 色されたゲルを示している。図６Ｂは、図６Ａに示されたゲルのオートラジオグ ラフを示している。図６Ｂは、安定な、除タンパク質化した、ＲｅｃＡタンパク 質に触媒されたハイブリダイゼー７ジン複合体には、２ｔｌｉのＤＮＡプローブ 鎖が必要であることを示している。

図７は、安定な二本鎖プローブ：二重鎖直鎖状標的ＤＮＡ複合体のモデルを示し ている。

図８は、安定な二本鎖ブロープ：二重鎖直鎖状標的ＤＮＡ７１合体が単離された ゲルを示している。ここで、二重鎖プローブ鎖は、別々にラベルされた。

図９は、種々の二本鎖プローブ：二重鎖直鎖状標的ＤＮＡ複合体を示している。

図１０Ａ、　ＩＯＢ、およびｔＯＣは、単一の、二本鎖ブローブ：二重鎖直鎖状 標的ＤＮＡ複合体をベースとした、いくつかの検出系を示している。

図１１．ＡおよびＩＩＢは、複数の、二本鎖プローブ二二重鎖直鎖状標的ＤＮＡ 複合体をベースとした、いくつかの検出系を示している。

図１２は、ネイティブな標的ＤＮＡ上でのＲｅｃＡタンパク質で触媒された２種 のダブルＤループプライマーの位置付け（図１２Ａ）、および、ＤＮＡポリメラ ーゼを用いたＤＮＡ増幅と引き続＜　ＤＮＡリガーゼを用いた連結反応（プライ マー／プローブの置換の無い状態で）（図１２Ｂ）を示している。

図１３は、単一ダプルＤループプローブ（図１３Ａ）または複数のダブルＤルー プ（図１３Ｂ）を使用する、ＤＮＡポリメラーゼを用いるシグナル増幅反応を示 している。図１３中のＸおよびＸ　は、同一または異なるものでもあり得る：例 えばＸは放射活性ラベルされ、そしてＸｏはジコキンゲニン部分を持ち得る。

図１４は、標的と複合体を形成していない二本鎖プローブの制限エンドヌクレア ーゼによる切断を利用する検出系を示している。ここで、生じる生成物の捕捉は 、制限酵素消化の前（図１４Ｂ）または後（図１４Ａ）に行われる。

図１５は、メチル化またはＲｅｃＡタンパク質のいずれかによる、制限部位の保 護を示している。メチル化による保護の場合、上記ダブルＤループ複合体は、制 限エンドヌクレアーゼ消化前に除タンパク質化される（図１５Ａ）。ＲｅｃＡタ ンｔ　ｆり質による保護の場合、上記ダブルＤループ複合体は、制限エンドヌク レアーゼ消化後に除タンノ（り質化される（図１５Ｂ）。

図１６は、熱変性された２８０マープローブおよび異なるコファクター類を使用 する、除タンパク質化された、ＲｅｃＡを介したダブルＤルーブハイブリタイゼ ーンコン反応の成分が、電気泳動により分離された、臭化エチジウムで染色され たアガロースゲルを示している。

図１７は、図１６に示すゲルの乾燥後の、オートラジオダラムを示している。

図１８は、熱変性された５００マープローブおよびコファクターとしてＡＴＰγ Ｓ１　および、ＡＴＰγＳ／ｒＡＴＰ混合物を使用する、除タンパク質化された 、ＲｅｃＡを介したダブルＤルーブハイブリダイゼーシ３ン反応の成分が、電気 泳動により分離されて臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルを示している 。

図１９は、図１８に示すゲルの乾燥後の、オートラジオダラムを示している。

発明の詳細な説明 １、除タンパク質化に対して安定である、ＲｅｃＡで触媒されたプローブ・標的 ハイブリタイゼーシ目ン複合体の生成。

Ａ、ＤＮＡプローブ類およびプライマー類本発明を支持するために実施した実験 は、短い二本鎖ＤＮＡ分子または相補的な一本鎖分子が、内部領域で直鎖状標的 ＤＮＡ分子とハイブリタイゼー７ヨン複合体を生成するのに使用され得、そして 、これら慢合体か除タンパク質化に対して安定であることを示している。これら の安定な／％イブリダイゼーシゴン復会合体例として、二本鎖および長さを変え た相補的な一本鎖ＤＮＡが、プローブおよびプライマーとしての使用に調製され た〈実施例１、表１）。これらＤＮＡ分子は、ラムタファージケノムの５００ｂ ｐ領域の種々の部分にホモロノーを有すよう選抜された。表１に示したプローブ およびプライマーの、上記ラムダゲノムに対する関係を図１に示す。上記５００ ｂｐのラムダゲノム領域のヌクレオチド配列を、図２に示す。

Ｂ、ＲｅｃＡタンパク質の調製およびプローブコーティング本発明におけるＲｅ ｃＡタ／バク質は、全てが実質的に以下のような同一機能の全てまたは大部分を 有する、ＲｅｃＡ様の組み換えタンパク質ファミリーを指し、特定すると：（ｉ ）次のＤＮＡポリメラーゼによる伸張のために、適切にプライマーをそれらと相 同の襟的上に配置させる、上記タンノ４り質の能力；（ｌｉ）ＤＮＡ合成のため にトポロジー的にＤＮＡを調製する、ＲｅｃＡタンパク質の能力；および（目１ ）効果的に相補的な配列を検索し結合する、ＲｅｃＡタンパク質／　ＤＮＡプラ イマー複合体の能力。最も良く特徴付けられたＲｅｃＡタンｔｓｊり質はＥ、　 ｃｏｌ　ｉ由来である；野生型のタンパク質に加えて、数多くの変異型ＲｅｃＡ 様タン／　ｚＨり質が同定されている（例えば、ｒｅｃＡ−８０３、Ｍａｄｉｒ ａｊｕら）。さらに、多くの生物かＲｅｃＡ様の鎖転移タン７　ｚＨり質を有す る（例えば、Ｆｕｇｉｓａｖａ、　Ｈら；　Ｈｓｉｅｈ、Ｐ　ら、＋９８６；　 Ｈｓｉｅｈ、Ｐ　ら、１９８９　：　Ｆｉｓｈｅｌ、　Ｒ，Ａら；　Ｃａ５ｓｕ ｔｏ、Ｅ、ら；　Ｇａｎｅａ、Ｄ、ら；　Ｍｏｏｒｅ、Ｓ、Ｐら；　Ｋｅｅｎｅ 、に、ら；　Ｋｉｅ＋ｅｔｃ、Ｅ、Ｂ、、１９８４；　Ｋｉ園ｅｔｃ、Ｅ、Ｂ、 、１９８６　；にｏｌｏｄｎｅｒ、　Ｒ，ら；　Ｓｕｇｉｎｏ、Ａ、ら；　Ｈａ ｌｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら；　Ｅｉｓｅｎ、Ａ、ら；ＭｃＣａｒｔｈｙ、　Ｊ、ら ；　Ｌｏｗｅｎｈａｕｐｔ、に、ら）。

ＲｅｃＡタンパク質は、代表的には、上記タンパク質を過剰生産する細菌株から 得られる：実施例２で、このような菌株からの野生型大腸菌ＲｅｃＡタンパク質 および変異型ＲｅｃＡ−８０３タンパク質の精製を説明する。また一方で、Ｒｅ ｃＡタンパク質は、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　ＮＪ ）から購入できる。

ＲｅｃＡタンパク質およびＡＴＰγＳでＤＮＡプローブをコートするために用い られる条件は、実施例３で説明する。また一方で、プローブ類は、ＧＴＰ７　Ｓ 、　ｒＡＴＰ　（単独またはｒＡＴＰ再生系（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ社製）の存在下で）　、ｄＡＴＰ、　ＡＴＰ７　ＳおよびｒＡＴＰの混 合物、または、ＡＴＰγＳおよびＡＤＰの混合物を使用してコートされ得る。Ｒ ｅｃＡタンパク質コーテコ−ティング反応る、コファクターとしてＡＴＰ７　Ｓ 、　ｒＡＴＰ、　ｄＡＴＰおよびＧＴＰ７Ｓの使用は、実施例１Ｏで説明する。

これらコファクターを使用するダブルＤループ複合体形成の結果は、図１６およ び１７に提示する。

図１７は、ＡＴＰｙ　Ｓ、　ｒＡＴＰ、　ｄＡＴＰおよびＧＴＰ７Ｓの各々の存 在下で、除タンパク質化に対して安定な、ダブルＤループハイブリダイゼーショ ン複合体が形成されたことを示している。さらに、実施例１１に、ＲｅｃＡタン パク質コーテコ−ティング反応のコファクターとしてＡＴＰγＳ／ｒＡＴＰ混合 物の使用を説明する。図１８および１９に示された結果は、このような混合物の 存在下で、除タンパク質化に対して安定な、ダブルＤループ／％イブリダイゼー ション複合体が形成されたことを示している。ＡＴＰγＳ／ｒＡＴＰに加えて他 のフッアフターの混合物もまた、ＲｅｅＡタンパク質コーテコ−ティング反応す る。

ＲｅｅＡタンパク質によるプローブのコーティングは、多くの方法で評価され得 る。第一に、タンパク質のＤＮＡへの結合は、バンドーンフトゲルアソセイを用 いて試験され得る（ＭｃＥｎｔｅｅら）。実施例３で、ＤＮＡプローブへのＲｅ ｃＡタンパク質の結合を示すための上記ＤＮＡバンド−シフトゲルアッセイの使 用を説明する。ラベルされたプローブは、ＡＴＰγＳ存在下でＲｅｃＡ９７パク 質でコートされ、そしてコーティング反応の生成物は、アガロースゲル電気泳動 により分離された二面３は、ゲル中の得られたＤＮＡのオートラジオグラムを示 している。図３に提示されたデータは、ＲｅｃＡタンパク質と変性した二重鎖プ ローブＤＮＡとのインキニベー／ヨン後に、ＲｅｃＡタンパク質が効果的に、変 性した二重鎖プローブ由来の一重鎖ＤＮＡプローブをコートすることを示してい る。プローブ中のヌクレオチドに対するＲｅｃＡタンパク質モノマーの比率が、 １２１７−に対して０から１・２７．１：２．７．３，７・１（それぞれレーン ｌから４）まで、そして１５９マーに対してＯから１：２２．１：２．２．４． ５・１（それぞれレーン５から８）まで増加すると、ＤＮＡプローブの電気泳動 での移動度は減少する。すなわち、ＤＮＡプローブへのＲｅｃＡの結合によって 遅らされる。レーン２．３および６．７で認められるＤＮＡプローブ移動度の部 分的な遅れは、ＲｅｅＡタンパク質でプローブＤＮＡが飽和されていないことを 反映する。従って、予想されたように（Ｌｅａｈｙら）、ＤＮＡヌクレオチドに 対する過剰量のＲｅｃＡモノマーが、短いＤＮＡプローブの充分なＲｅｃＡコー ティングに必要である。

ＤＮＡへのタンパク質の結合を評価する第二の方法は、ニトロセルロースフィル ター結合アッセイ（ＬｅａｈｙらＨＷｏｏｄｂｕｒｙら）の使用である。ニトロ セルロースフィルター結合方法は、ラベルされたＤＮＡを用いるタンパク質：　 ＤＮＡ複合体の解離比を測定するのに特に有用である。上記フィルター結合アッ セイでは、ＤＮＡ　：タンパク質複合体は、フィルター上に保持され、遊離ＤＮ Ａはフィルターを通過する。このアッセイ法は、遊離のプローブからのＤＮＡ　 ：タンパク質慢合体の分離が急速であるため、解離比の測定に対してより定量的 である。

代表的には、このようなフィルター結合アッセイを実施するために、ニトロセル ロースディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ１社製、ＢＡ８ ５フィルター、またはＨＡＷ　Ｐ（１０２５ニトロセルロースフイルター）が前 処理され、緩衝液に浸され、次いで真空フィルター装置上に置かれる。ＤＮＡ： タンパク質結合反応物は、しばしば複合体を解離することなく、成分の濃度を下 げるために希釈される。反応物は、真空の使用で上記ディスクを通過させる。低 塩濃度条件下では、上記ＤＮＡ　：タンパク質複合体は、上記フィルターに付着 し、遊離ＤＮＡは通過する。上記ディスクを、シンチレーシコン計測液（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ、Ｉｎｃ、）に入れ、そしてそのＣｐＩｌｌがシンチレーションカウンター を使用して測定される。

Ｃ，ＤＮＡ標的 プローブと、内部にある相同二本鎖直鎖状ＤＮＡ標的とのＲｅｃＡで触媒された 、ハイブリダイゼーションの特異性を研究するため、以下を包含するいくつかの モデルラムダＤＮＡ標的系が使用された： （１）完全長ラムダゲノムＤＮＡ　（４８，５ｋｂ；　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＳＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ）の Ｄｒａ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）制限酵素消化により生じた９２から８５９ ８ｂｐのサイズ範囲にある、１４のＤＮＡフラグメントの混合物。図１および２ で規定される領域と相同な標的フラグメントは、８３７０ｂｐのＤｒａ　Ｉフラ グメントである。表１に列記されたプローブとのホモロジー領ｂｆｉはすべて、 二本鎖標的ＤＮＡフラグメントの３゛末端から少な（とも８３２塩基より内側に 存在する。

（２）完全長ラムダゲノムＤＮＡのＡｐａｌ制限酵素消化により生じた二つのフ ラグメント（３８，４１２およびｔｏ、　ｏ９ｏｂｐ）の混合物。

約１０ｋｂのフラグメントは、図１および２で規定される領域を含有する。この ホモロン−領域は、二本鎖標的ＤＮＡフラグメントの３゛末端から少なくとも２ ４６０塩基に存在する。

（３）アガロースゲルで精製し、除タン１＜り質化された、ラムダＤＮＡＡｐａ 　Ｉ消化１０ｋｂフラグメント。

（４）標的ＤＮＡフラグメントが２９５７ｂｐであって、二本鎖標的ＤＮＡフラ グメントの３°末端から少なくとも８３２塩基にプローブと標的とのホモロジー が存在する、Ｄｒａ　ＩおよびＢａｍＨ［を用ｔまたラムダの二重消化物。

（５）全ラムダウィルスＤＮＡもまた、標的として使用される。

この場合、プローブ：標的のホモロジーは、全ラムダゲノムの５°末端から少な くとも７１３１塩基に存在する。

Ｄ、ＲｅｃＡで促進された、二本鎖プローブおよび標的ＤＮＡ配列間のハイブリ ダイゼーション複合体の形成ＲｅｃＡでコートされた一重鎖ＤＮＡプローブおよ び標的ＤＮＡの混合は、ＲｅｃＡでコートされたＤＮＡプローブおよび二重鎖標 的ＤＮＡ分子間のホモロジーの探索を開始する。単一のプローブ配列の場合、い ったんＲｅｃＡ：　ＤＮＡプローブフィラメントが形成されれば、それは、ホモ ロジーの検索、ならびに相捕的なプローブおよび標的ＤＮＡ配列間のＤループ形 成を触媒し得る。従来の単一のＤループは、−重鎖のＲｅｃＡでコートされたＤ ＮＡプローブと直鎖状で二本鎖の標的ＤＮＡとの間で、約５ｏｏ塩基またはそれ 以下のホモロジーで形成され得る。プローブ：標的間のポモロジーの位置が直鎖 状標的の内部に位置する場合、これらＤルーフハ、タンパク質の除去後不安定で ある。

本発明を支持するために実施した実験は、二重鎖直鎖状ＤＮＡ標的上の内部部位 で、５００マーおよびより小さいプローブが、安定な除タンパク質化されたＲｅ ｃＡで触媒されたダブルＤループプローブ、標的複合体を形成し得ることを示し た。しかしながら、このような安定な構造を形成するためには、重複する相互に 相捕的な配列を有する少なくとも二種のプローブが使用されなければならない。

この二種のプローブは、ＲｅｃＡでコ−トされた一重鎖ＤＮＡプローブであり、 モしてＲｅｃＡで触媒されたプローブ橋的ノ・イブリダイゼーション反応に使用 される。

実施例４で、Ｒ６ｃＡタンパク質を介するダブルＤループ、すなわちマルチプレ ックスの形成を説明する。その５００マーおよび２８０マーのプローブは、Ｒｅ ｃＡタンノくり質でコートされ、そしてその標的ＤＮＡは、上記の８３６９ｂｐ のラムダＤＮＡのＤｒａ　！フラグメントである。ＲｅｃＡタンパク質のブロー ブーヌクレオチドに対する比率は、５００マーについて１．５：ｌ、そして２８ ０マーについてはＩＪ：ｌであった。二本鎖ＤＮＡプローブの、相同な二本鎖Ｄ ＮＡ標的フラグメントに対する比率は、５００マーについては１１，１、そして ２８０マーについては２２１であった。図４Ａは、除タンｌｆり貫化されたノ＼ イブリダイゼー／ヨノ反応のＤＮＡ成分が分離され図４Ｂは、図４Ａに示すゲル 中のＤＮＡのオートラジオグラフを示している。図４Ｂに提示された結果は、除 タンノくり質化に安定な５００マー：標的および２８０マー：ｖＡ的、ＤＮＡ１ 〜イフ゛リダイゼーシコン生成物の形成を示している。ＲｅｃＡタンｔ４り質を 含む反応と含まない反応間の比較は、ＲｅｃＡが、相同プローブ標的ＤＮＡ　［ 合体の形成に必要であることを示して（＼る。

ｐＵｃ１８二本鎖環状ＤＮＡは、実施例４でボジテイフ゛コン（・ロールトシテ 念めた。負のスーツく一コイル二重鎖ＤＮＡ環状分子（ま、除タンパク質化に安 定な短い一重鎖プローフ゛を用０るＲｅｃＡタノバク質に触媒された、プローブ ：標的ノ＼イフ′リタイゼーンヨン生成物を形成することが知られて０る（Ｒｉ ｇａｓら；およびＣｈｅｎｇら、１９８８）。

上記の実験で形成されたハイブリダイゼーション生成物ノ同−性を確認するため 、ＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブをラムダゲノムＤＮＡのＤｒａ　 Ｉ　／ＢａｍＨに前哨化物由来の標的フラグメントと反応させた。この実験では 、二重消化から生じた相同標的フラグメントは、鎖長が２９５７ｂｐであり、プ ローブ標的配列のホモロジーの位置は先の実験と変わらなかったくすなわち相同 標的フラグメントの３°末端から８３２塩基）。ハイブリタイゼーシコン反応は 、８３７０ｂｐのラムダＤＮＡ　Ｄｒａ　＋標的フラグメントについて記載した のと全く同一の条件下で実施された。

これらＲｅｃＡタンパク質で触媒されたハイブリダイゼーシコン反応の電気泳動 的分離、引き続く、オートラジオグラフィック解析は、除タンパク質化されたプ ローブ：標的ＤＮＡ７１１合体か２９５７ｂｐの標的フラグメントの位置に丁度 移動したことを示し、プローブ・標的ＤＮＡハイブリダイゼーション反応が実際 に特異的な相同標的との間でおこることが確認された。

ＲｅｃＡタンパク質て触媒されたプローブ：標的反応が、過剰量の非相同の直鎖 状ＤＮＡ標的分子の存在下で実行された。

実施例５て、小さい二本鎖プローブおよび直鎖状二本鎖標的ＤＮＡ間の、除タン パク質化に安定な複合体の形成を説明する。

実施例５に提示したハイブリダイセーフ９フ反応では、変性プローブは、Ｒｅｃ Ａタンパク質のブローブーヌクレオチドに対する比率が、図５Ａおよび５Ｂのそ れぞれレーンｌから６に対応する、１，８１．０．５．７＋１．５．９＋１．２ ．６：１および１１．、Ｉｌ：１の害１ｊ合でコートされた。上記二本鎖プロー ブの二本鎖標的フラグメントにスＪする比率は、４８・１（２８０７−）、３． ６：１（１２１ｖ−）、および５．２：１（７９７−）である。図５Ａは、除ク ン１＜り質化されたノ・イブリタイセーンヲン反応の成分が分離されｔこ、臭イ ヒエチジウム染色されたゲル上のＤＮＡを示してｔＸる。

図５Ｂは、図５八に示すゲルのオートラジーＡ−り゛ラフを示している。図５Ｂ に提示される結果は安定な除タンノ＜り質イヒされたハイブリタイセーノヨンブ ローブ標的生成物力（，２８０塩基よりも短いサイズのプローブを用０て形成し ？与ることを示している。過剰のＲｅｃＡタン／　ｓＨり質の添力旧よ、ＤＮＡ ！・イブＩＪタ゛イゼー／ヨン反応で形成された安定な生成物の量を減少させる よってある（レーン４．５および６の対比）。本実験に使用した＋２１マーおよ び７９マーのプローブ′（よ、３２ｐで末女嵩ラベルされた２８０マー、および ５００マーの二重鎖プローブ′の■１限酵素フラグメントに由来し、各ＤＮＡプ ローブ゛（ま、ラベノ１〕されｔこ５゛多真または３鎖のいずれか（両方ではｆ ｔ　＜　）を２８０マーと同様（こ含有する二分子の５°および３°末端（よ、 全ラムノＤＮＡ１二関して同定される。図５Ｂのレーン３から６（こ認められる ンク゛ナル（ま、上記５゛または３′プローブ鎖が、プローフ゛標的反応（こ関 係することを示し、この観測結果は、両方のブローフ゛多貞力（、除タンノ＜り 質化に対して安定なブローフ゛、漂的ＤＮＡノ・イフ′１ノダイゼー７３ノ複合 体の形成に含まれると一＼う結：１こ一致して−Ａる。

実施例４および５に記載されｔこ基本的プロトコール（こ従う多くのハイブリダ イゼーシコン実験で、ＲｅｃＡタンパク質で触媒されたハイブリタイセーション 反応が、広い範囲の反応条件下で起こり得ることが確認された。代表的には、異 なる濃度の標的ＤＮＡが使用される場合、除タンパク質化されたバイブ’Ｊ　ノ ドの収率は、反応物中の相同標的ＤＮＡ量に比例する。いくつかの反応条件が以 下にまとめられる：（１）１から１２ｍＭ間のＡＴＰγＳ濃度がプローブＲｅｃ Ａコーティング反応で試された。このＡｙｐｙｓｆｉ度範囲は、標的添加後に、 安定なハイブリタイゼー７−Ｉン生成物を与えた。より好ましい範囲は、約２． ４から８ｍＭである。ＡＴＰ７　Ｓ、　ｒＡＴＰ　（単独または再生系の存在下 で）　、ｄＡＴＰ、　ＧＴＰ７　Ｓ、ならびにＡＴＰ７ＳおよびｒＡＴＰの混合 物がまた、プローブコーティング反応で作用する（実施例１０および１１）。さ らに、ＡＴＰγＳの市販の調製物が反応で使用される場合、この調製物の純度は 、調製物に応じて変動し得る。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手したＡＴＰγＳは 、通常、約９５から９７％ＡＴＰγＳである。Ｓｉｇｍａ社から入手したＡＴＰ γＳは、通常、約７５から約９０％ＡＴＰγＳの間で変動し、これらの調製物は 、通常、約１０から２０％間のＡＤＰを含有する。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社および Ｓｉｇｍａ社の両供給源からのＡＴＰγＳを試験した。いずれの供給源の調製物 もＲｅｃＡダブルＤループ反応でよく作用する。従って、ＡＴＰγＳおよびＡＤ Ｐのコンビネーションもまた、ＲｅｃＡを介するダブルＤルーブハイブリダイゼ ーション反応でまた作用する。

さらに、ＤＮＡプローブは、ＡＴＰγＳおよびｒＡＴＰの混合物の存在下、効果 的ニＲｅｃＡタンパク質でコートされ、好ましい混合物は各々約１．４および１ ｍＭの各成分を含む。これら実験の結果は、ダブルＤループ複合体形成について 、ＲｅｃＡが、多くの種類のコファクターおよびそれらのコンビネーションを使 用し得ることを示している。

（ｉｉ）プローブおよび標的ＤＮＡを含有する最終反応物中のＭｇ’゛アセテー トの濃度は、広範囲のＭｇ”濃度で作用する：４から２５ａＭ、好ましくは約６ から８ｍＭの範囲；（ｉｉｉ）プローブコーティング反応物中で、８．４から４ １μＭの間でＲｅｃＡタンパク質の濃度を試験し：各濃度が活性であった。

（ｉｖ）プローブコーティングの間は、ＲｅｃＡタンパク質のプローブ−ヌクレ オチドに対する比率は、１：３から６：１の間が効果的で、好ましい範囲は、約 ２＝１から４：１の間の比率であった；（ｖ）最終的に二本鎖ＤＮＡプローブの 二本鎖ＤＮＡ標的分子に対する比率（ｖ（りａｔ−５−で）が、２：１から２２ ＝１の間のすべてで、安定な除タンパク質化されたプローブ：標的ハイブリッド を生じた。

（ｖｉ）酢酸緩衝液中のプローブコーティングおよび鎖転移は、トリス系より多 くの生成物を与えるように見えるが、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応は、類 似のトリスＨＣＩ反応緩衝液（ｐＨ７，５）中で作用する。

（ｖｉ　１）ＲｅｃＡ−８０３変異型タンパク質は、安定なハイブリダイゼーシ ョン複合体形成で活性であった； （ｖｉｉｉ）ハイブリダイゼーション反応は、−重鎖結合（５ＳＢ）タンパク’ ｊｉ　（Ｍｏｒｒｉｃａｌら）の存在下で機能する；（ｉｘ）数日間−２０℃に 保管された、コートされた変性二本鎖プローブ混合物を含む、ＲｅｃＡタンパク 質でコートされた一重鎖ＤＮＡプローブは、３７°Ｃで標的とのインキュベー７ 冒ン後のハイブリダイゼーション複合体形成で活性であった；（Ｘ）ハイブリダ イゼーション反応は、標的として、全−ｐｌｈｆゲノムＤＮＡを用いて実施され 得る。プローブエ標的ハイブリダイゼーション反応はまた、標的ＤＮＡがアガロ ースプラグまたはマイクロビーズに包埋される場合にも実施され得る：例えば、 ＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブとアガロースプラグ内に包埋された 無傷（ｉｎｔａｃｔ）の４８．５ｋｂλＤＮＡ標的とを用いて、安定なダブルＤ ループハイブリッドが形成される；（ｘｌ）プローブ鏡開の相捕的な重複部分の 領域は、代表的には約７９塩基であり約５００塩基対よりは小さい。本発明のＲ ｅｃＡで触媒されたハイブリダイゼーション反応において、この程度の相補的重 複部分を有するプローブは、安定な生成物を内部の標的部位に形成する。安定な ハイブリダイゼーション生成物の生成はまた、直鎖状分子の末端で立証されたく 例えば、８０マープローブおよび標的として５００マ一二重鎖の使用によって（ 図１））。襟章的なプローブ鎖の標的鎖に対する相補性は９０から１００％の間 である。しかしながら、ＲｅｃＡタンパク質は、い（らかの非特異的塩基対の相 互反応を包含するハイブリダイゼーション複合体の形成を触媒することが知られ ている（Ｃｈｅｎｇら、１９８９）。従って、プローブ：ｔｉＡ的相浦性は、プ ローブのサイズおよび検出反応で必要な特異性に依存して低減され得る：代表的 には相補性は、各プローブ鎖および標的路間で７０％の塩基対マツチよりも低く はない。

（ｘｉｉ）約７９塩基対よりも少ない重複部分を有するプローブも本発明で使用 され得る：これらのより小さいサイズのプローブが使用されるとき、除タンパク 質化後のダブルＤループの安定化が有利である。ダブルＤループ複合体をさらに 安定化させる一つの方法がブソラレン架橋（Ｃｈｅｎｇら、１９８８）である： このような架橋は、過酷な洗浄条件の使用を許容するため、特にインサイチニー で有用である。

図５Ｂに提示の結果は、両方のＤＮＡプローブ鎖が同じ標的分子に存在すること から、観察されたプローブ：標的生成物が除タンパク質化に対して安定であるこ とを示している。このような安定な複合体の一つの代表が、図７に示されている 。この構造は、本明細書中では、従来の単一のＤループ、すなわち二本鎖置換ル ープまたは三重らせん（トリプレックス構造）（二つの標的鎖および特定の単一 の標的鎖に相捕的な単一のＤＮＡプローブ）に対して、ダブルＤループまたはマ ルチプレックスＤＮＡ構造と呼ばれる。

実施例６は、直鎖状標的ＤＮＡ分子上の内部のＤＮＡホモロジーの領域で、安定 な、除タンパク質化されたプローブ：標的ハイブリダイゼーション生成物の生成 に、２種のＲｅｃＡタンパク質でコートされたＤＮＡプローブ鎖が必要であるこ とを示している。

個々の１２１マープローブ鎖は、個々のプローブ鎖が少量の相捕的（反対の）　 ＤＮＡ鎖によって汚染されないことを保証するために化学的に合成された。２種 の別々の相補的ＤＮＡプローブ鎖各々の存在を区別するため、プローブは、区別 してラベルされるニ一方の鎖の５°末端を３２ｐラベルそして他方の単一の５° 末端をビオチンラベルした。

一方の鎖のみが放射活性ラベルされたため、各ダブルＤループＤＮＡハイブリダ イゼーション反応の３２ｐ特異活性は、同一であった：従って、全ての実験の結 果間の比較はより便利であった。ハイブリダイゼーション反応は、実施例６に記 載のように実施された。図６Ａは、除タンパク質化されたハイブリダイゼーショ ン反応物中のＤＮＡ構成物が分離された、臭化エチジウムで染色されたゲルを示 している。

図６Ｂは、図６Ａに示すゲル中のＤＮＡオートラジオグラフを示している。図６ Ｂでの結果は、二種のプローブ鎖が、安定な、除タンパク質化されたプローブ： 標的ハイブリッド生成に必要であることを示している。さらに、上記反応は、両 方のプローブがＲｅｃＡタンパク質で同時にコートされる場合、または別の反応 で行われる場合いずれでも行われる。さらに、上記ハイブリダイゼーション反応 は、ＤＮＡプローブが、反応に逐次的に添加される場合でも、除タンパク質化さ れた安定な複合体を生じる（レーン５および６）。１２ｐラベル鎖をはじめに反 応混合物に添加することは、より多くのＤＮＡハイブリダイゼーション生成物を 提供するようである。末端ビオチンラベルが化学的スペーサーアーム（ｓｐａｃ ｅｒ　ａｒｍ）のサイズまたはプローブ上のラベルの位置により、わずかに阻害 的であることは、起こりうろことである。しかしながら、ハイブリダイゼーショ ン反応へのプローブ添加の順序とは無関係に、二種のプローブ鎖が、安定な、除 タンパク質化された相同な複合体の生成に必要である。ＲｅｃＡタンパク質を介 した相同プローブ標的化反応はまた、内部位置に取り込まれたビオチンを含有す るプローブを使用し得る。このようなプローブは、ポリメラーゼ鎖反応の改変を 用いて合成され得（Ｍｕｌｌｉｎｓ；　Ｍｕｌｌｔｎｓら）、ここでｂｊｏ−１ ４−ｄＡＴＰが、合成中に通常使用サレルｄＡＴＰのあるパーセンテージ（たと えば５から２５％）と置換されて使用される。

ＲｅｃＡで促進された、短いＤＮＡプローブのそれらの同種の標的配列への相同 なベアリングの割合は、付着された異型のＤＮＡラベルの長さと正の相関がある ことが示された（Ｇｏｎｄａら）。従って、本発明のハイブリタイゼー／コン反 応に使用されるプローブは、プローブ配列と標的配列との相同なベアリングを早 めるために、非相同のラベル、すなわぢ、標的ＤＮＡに対してＥ、捕捉５７′検 出法 同−の標的分子上での、３２ｐおよびビオチンラベルされた、１２１マ一プロー ブ両鎖の存在は、さらに捕捉／検出系を用いて、さらに確かめられた〈実施例７ ）。除タンパク質化されたダブルＤループ生成物をストレプトアビジン−磁性ビ ーズを用いて捕捉した。プローブを含むビオチンの捕捉は、３２ｐラベルされた プローブを同時に捕捉した。図８は、ビオチン部分のストレプトアビノン捕捉前 に、プローブ：４ｊＡ的複合体が単離されたゲル上のＤＮＡを示している。ＤＮ Ａ１合体は、プローブ：標的複合体の予想されたサイズに対応するゲルフラグメ ントがらの抽出により単離された〈実施例７）。抽出されたＤＮＡは、次いてス トレプトアビジンでコートされた常磁性ビーズにさらされた。このビーズは次い で単離され、モして３２ｐラベルＤＮＡプローブ鎖の検出のために、ンンチレー ノヨン液中に置かれた。この解析の結果は、表２に提示される。このデータは、 二種のプローブ鎖およびＲｅｃＡタンパク貫を使用した反応だけか、バックグラ ウンドを上回る捕捉シグナルを与えることを示している。この実験では、１０ｋ ｂ標的ＤＮＡの位置に移動したＤＮＡ標的を捕捉のために単離して用いた。それ 故、個々の１０ｋｂ律的分子上に、ダブルＤループ構造を実際に有することなし に、捕捉および検出され得る多重の１０ｋｂｌ的間での複合体組換え生成物の存 在の可能性の除外した。さらに、これらの反応中で形成されたハイブリッド分子 は、使用された単離条件下できわめて安定であり捕捉された３　２　Ｐのシグナ ルが相補的なプローブの再会合によるアーティファクトでないという結論を支持 する。

（以下余白） ■、有用性 図９は、多くの可能なタプルＤループ構造を示している。

図９Ａは、ＤＮＡＩ的分子の内部部位でのダブルＤループ構造の形成を表わす。

図９Ｂは、プローブＤＮＡ分子が非相同のＤＮＡでティリングされたこと（Ｇｏ ｎｄａら）を除いて、類似の構造を表している。このようなティリングは、いく つかの目的に役にたち得る：（１）小さいプローブ上へのＲｅｃＡ付加の促進； 　（ｉｉ＞プローブ中のラベルの含有のための伸張分子の提供、例えば、ジゴキ ンゲニンまたはビオチン；　（ｉｉｉ）捕捉配列の提供；および（ｉｖ）付加し たレポーター分子にハイブリダイズする配列の提供、等である。

［ｆｆ１９Ｃは、相同末端伸張部（すなわち、標的ＤＩＩＡに相同で他方のプロ ーブとは相同でない）に加えて、相補的な重複部分領域（すなわち、相互に相補 性な領域）を有する場合の二種のプローブが、使用される状懸を表わす。

図９Ｄは、非相同の末端伸張部（すなわち、標的ＤＮＡと相同でなく他方のプロ ーブとも相同的でない）に加えて、相補的な重複部分領域を有している場合の二 種のプローブが、使用される法帖を表わす。図９Ｆは、非相同の末端伸張部が各 プローブ鎖の５および３゛末端の両方に存在する場合の類似の状態を表わす。図 ９Ｇは、相同なラベルが、相互に相補的であるが、標的ＤＮＡとは相補的でない 場合の状態を表わす。

タプルＤループ構造は、二種のプローブのみの構成である必要はない。例えば、 図９Ｅは、５つの別々のプローブ鎖から生じたダブルＤループ構造を示している ：内部のプローブ鎖は、一種以上のプローブ鎖と相補的な重複部分領域を有して いる。相補的重複部分の全領域は、代表的には、７９がら５゜Ｏ塩基対であるが 、上記のように、この領域はより小さい領域であり得る。

図９中の構造は、いくつがのしかし全てではない、いくつかの、除タンパク質化 に対して安定なダブルＤループ８４を生じ得る、プローブおよび標的ＤＮＡの可 能な組合せを示している。ダブルＤループ反応に使用されるべき二本鎖プローブ に共通な一つの特徴は、プローブ踏量に相補的な重複部分を有することである。

内部部位で、安定なＲｅｃＡタンパク質で触媒された、除タンパク質化された、 ダブルＤルーブブローブ二標的複合体を形成する能力は、相同な直鎖状ＤＮＡ標 的の特異的な同定を可能とする。このタプルＤループ反応は、ハイブリダイゼー ション診断に新規な可能性を提供する。本アッセイは、別々にラベルされた相補 的なプローブ鎖が、単一の反応で使用され得、そしてただ一つの小さい標的配列 が知られているだけでよいという長所を提供する。

相補的なプローブの再会合は、飽和レベルのＲｅｃＡタンパク質か使用されれば 抑制される（　Ｂｒｙａｎｔら）。このようなプローブの再会合はまた、プロー ブコーティング反応中に、コツアクタ〜とじてＡＴＰγＳを含有させることによ り減少する。

上記のように、ＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブおよび標的ＤＮＡ間 で形成された、本発明の複合体は、除タンパク質化反応に対して安定である（上 記したように）。しかしながら、いくつかの使用では、複合体からのＲｅｃＡタ ンパク質の除去は、本使用の実施に必要ではない。このような場合、唯一の制限 は、残存するタンパク質分子が本使用を妨害しないことである（例えば、以下の セクションＦを参照）。

Ａ、標的ＤＮＡ 本発明の方法は、臨床サンプル中の生物により引き起こされた感染症を診断する のに使用され得る。これらの生物は、原因となる生物に特徴的な特異的ＤＮＡの 検出により診断され得る。このような生物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、　Ｎｅ１ ｓｓｅｒｉａ、　仙ｊ１１ｍ、釧」虹ｎおよび５ｔｒｅ　ｔｏｎ　ｃｅｓ、のよ うなバクテリア；単純ヘルペスウィルス−１（ＨＳＶ−１）　、　単純ヘルペス ウィルス−２（ＦＩＳＶ−２）、およびアデノウィルス、全ての二本鎖ＤＮＡウ ィルス、のようなウィルス；　ＰｌａｓｍｏｄｉｕｉおよびＧｉａｒｄｉａ、の ような寄生虫任意の診断アッセイに対して、プローブ配列は、標的ＤＮＡ中の既 知のホモロジー領域から選択される。標的ＤＮＡは、標準技法により、多くの異 なる供給源から調製され得る：例えば、水溶液、哺乳動物組織、培養細胞、植物 組織、バクテリア、酵母、血液および血液成分（ＡｕｓｕｂｅｌらＨＭａｎｉａ ｔｉｓらＨＳａｍｂｒｏａｋらＨＤａｖｉｓら；　Ｆｅｙ；　５ｔｒｉｃｋｌｅ ｒら；　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ；　Ｗａｃｈｓ＋ｍｕｔｈ）である。

一般に、本発明の検出法は、任意の核酸サンプル中の二重鎖ＤＮＡの検出に適用 され得る。感染症の臨床診断以外の使用は、（１）マイコプラズマのような汚染 物の存在に対する、培養哺乳動物細胞のスクリーニング（Ｚｌｖｉｎら）、（ｉ ｔ）例えばα−地中海貧血、β−地中海貧血、または慢性骨髄性白血病のような 、哺乳動物のＤＮＡ中の特異的な欠失／変異、挿入または再配置により引き起こ された、特定の遺伝病、および、（ｉｉｉ）二重鎖ＤＮＡ分子中の与えられた標 的配列の存在または非存在を区分するためのハイブリタイゼーシタンブローブ、 を包含する。

Ｂ１診断応用に対する一つのダブルＤループ構造の使用図１Ｏは、二重鎖ＤＮＡ ｔｊ！的中の対応する配列の単離および同定のための、一つのダブルＤループ構 造使用のいくつかの実施態様を示している。一方のプローブは、捕捉部分でラベ ルされ得る（例えば、実施例７でビオチンを用いて行われたように）。次いで、 もう一方のプローブは、放射性ラベル、ビオチン、または、ノボキンゲニンまた は他の修飾された塩基のような、検出部分でラベルされ得る。プローブは、コー トされ、そして、標的配列の存在を試験される核酸試料にハイブリダイズされる 。ハイブリダイイー２１フ反応物は、除タンパク質化されるかまたは直接使用さ れる。

捕捉部分でラベルされたプローブはトラップされる。このトラ、ピングは、例え ばビオチン部分でプローブをラベルすることにより、そして反応混合物を、固体 支持体に結合されたストレプトアビジンにさらすことにより達成され得る。ある いは、上記捕捉部分は、ノボキンゲニンであり得、そして上記トラッピングは、 固体支持体に結合された抗ジゴキシゲニン抗体を用いて達成され得る。別の基が 、以下のようにして、都合よく、ＤＮＡ分子の末端に結合され得る。オリゴヌク レオチドプローブを、ノボキンゲニン−１１−ｄＵＴＰ　（ｄＴＴＰのアナログ で、１１原子のスペーサーアームを介してノボキンゲニンにカップリングした、 ２°−デオキシ−ウリジン−５°−トリホスフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ）およびターミナルデ オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製、Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）と連結する。この方法を用いて取り込まれたｄｉｇ− １１−ｄＵＴＰ部分の数は、５未満のようであった（おそらく１つまたは２つ） 。あるいは、ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ部分は、ビオチンの場合のように、プロー ブのオリゴヌクレオチド配列の中に取り込まれ得る。

代表的には、二本鎖プローブの以下の組合せが、捕捉検出系で使用され得る＝（ ｉ）ビオチンまたはノボキンゲニンでラベルされた、第１のプローブ／捕捉、放 射ラベルされた第２のプローブ／検出；　（ｉｉ）ビオチンでラベルされた、第 １のプローブ７／捕捉、ノボキンゲニンでラベルされた、第２のプローブ７′検 出；　（ｉｉｉ）　ノボキンゲニンでラベルされた、第１のプローブ／捕捉、ビ オチンでラベルされた、第２のプローブ／検出。

捕捉されたＤＮＡを分離する一つの便利な方法は、実施例７に記載されたように 、ストレプトアビジンを結合させた超常磁性ポリスチレンビーズの使用である。

ＤＮＡの捕捉後、磁性ラック中に反応チューブを置（ことにより、上記ビーズは 回収され得る。

あるいは、アビジンでコートされたアガロースビーズも使用され得る。ビオチン 化されたアガロースビーズ（固定化されたＤ−ビオチンを、Ｐｉｅｒｃｅ社製） が、アビジンに結合される。

アビジンは、ストレプトアビジンのように、ビオチンに対して、４つの結合部位 を有する。これら結合部位の一つは、１６原子スペーサーアームを介してアガロ ースビーズに結合しビオチンにアビジンを結合するのに使用される：他のビオチ ン結合部位は、利用可能なままである。ビオチン化ＤＮＡを捕捉するため、上記 ビーズはハイブリダイゼーション複合体と混合される（実施例７）。上に記載の ビーズ捕捉法の別の方法（Ｈａｒｌｏｔら）は、以下のストレプトアビジン化ま たはアビジン化された固体支持体を包含する：低タンパク質結合能フィルター、 または９６ウエルプレート、またはイミノビオチン（Ｒｉｇａｓ、Ｂ、ら）のよ うな改変ビオチン捕捉法。

上記のビーズ法のいずれかに対して、ビーズは単離され、そして、捕捉されたハ イブリダイゼーション複合体量が定量される。この定量法は、どのように第二Ｄ ＮＡプローブ鎖が調製されたかに依存する。上記第２のプローブが放射性ラベル される場合、上記ビーズはシンチレーションカウンター中で計測され得る。ある いは、上記捕捉ＤＮＡは、化学発光、蛍光、または比色検出系を用いて検出され 得る。

上記実験の多くは、放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドを使用した：実施例 ７は、ビオチンでラベルした第一プローブの使用を放射活性ラベルの第ニブロー ブと組み合わせる。

オリゴヌクレオチドの放射性ラベルに関する手法は、以上で論した。常法（例え ば、アデノ７ン［γ−３２Ｐ］−５°トリホスフェートおよびＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼによるオリゴヌクレオチドの末端ラベル）を用いて、ＤＮＡ複合体 あたり１０日ｃｐｍの特異活性が、ルーチンに達成される。この特異活性のレベ ルは、フィルムにさらした、ゲルまたはフィルターのオートラジオグラフィー、 または７ノチレーンヨン液中のサンプルの直接計測いずれによっても、少量のＤ ＮＡの測定を可能とする。

放射性ラベルおよび化学発光は（ｉ）　非常に高感度で、フェムトモル以下の量 のオリゴヌクレオチドの検出を可能とし、そして、（ｉｉ）よく確立された方法 を用いる。化学発光検出の場合、プロトコールは、マスースクソーニングアソセ イの要求に適応させるよう考案された。放射性同位体を用いないＤＮＡ検出手法 は、基質から生成物への効率よい転換を与える酵素の能力、および、化学発光ま たは着色生成物を産する基質の入手可能なことから、検出可能なラベルとして原 則的にアルカリホスファターゼを取り入れた。

化学発光検出のために、ビオチン化されたまたはジゴキシゲニンラベルされたオ リゴヌクレオチドプローブは、Ｔｒｏｐｉｘ、　Ｉｎｃで開発された化学発光検 出系ｒ　５ＯＵＴＨＥＲＮ　ＬＩＧＨＴＳＪを用いて検出され得る。その基本的 な手法は、ビーズ、フィルター上いずれかで補足された、または溶液中のＤＮＡ を検出するのに適用され得る。

アルカリホスファターゼは、捕捉されたＤＮＡ複合体に結合される。これを行な うため、普通に使用されるＥＬＩＳＡ　（ＨａｒｌｏｔらＨＰｉｅｒｃｅ社製、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　ＩＬ）手法由来のいくつかの方法を使用し得る。例えば、第 二鎖ＤＮＡプローブは、ノブキンゲニン−１１−ｄＵＴＰ　（ｄｉｇ−１１−ｄ ＵＴＰ）およびターミナルトランスフェラーゼ（上記のような）を用いて末端ラ ベルされ得る。ＤＮＡが捕捉され、ハイブリダイゼーション混合物がら除去され た後、次にアルカリホスファターゼが結合した抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ社製ＩＮ）をジ ゴキ／ゲニン含有オリゴヌクレオチドと反応させる。抗原性のノコキンゲニン部 分は、前記抗体−酵素結合体により認識される。

捕捉されたＤＮＡハイブリダイゼーション生成物は、以下のようにノコキンゲニ ンに対する、アルカリホスファターゼが結合した抗体を用いて検出される。アル カリホスファターゼに対する一つの化学発光基質は、３−（２−スピロアダマン タン）−４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオキシ）フェニル−１゛、２−ジ オ牛セタン二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）である。ＡＭＰＰＤの脱リン酸化は、 不安定な化合物を生じ、それは分解し、長期間の安定した４７７ｎＩＱの発光を 生じる。光測定は非常に高感度であり、微少な量のＤＮＡ　（例えば、１０２〜 １０’アトモル）を測定し得る。

アルカリホスファターゼ系の比色基質もまた試験した。比色基質も使用可能であ るが、発光法の使用がより高感度である。

上記のビオチン捕捉法の代替法は、第−鎖ブローブを修飾するビオチンの代わり にノコキンゲニンを使用することである。ビオチンは、次いで、上記の検出系中 でノコキンゲニン部分と置き換えられる。この再配置では、抗シフキンゲニン抗 体は、ＤＮＡハイブリダイゼーション複合体を捕捉するのに使用される。アルカ リホスファターゼに結合したストレプトアビジンは、次いて捕捉されたオリゴヌ クレオチドの存在を検出するのに使用される。

池の代替の捕捉法は以下を包含する。（ｒ　）　ＤＮＡ結合性タンパク質および その同種の結合性配列、ここで同種の結合性配列は、第−鎖ブローブ中の５末端 間列として包含される捕捉部分である（　Ｋｅｍｐら）　；　（ｉｉ＞ハイブリ タイセーション捕捉の使用、ここでポリ（Ｔ）のような標的と相補的でないＤＮ Ａ配列が、第−鎖ブローブ中の５゛末端配列として組み込まれ、そしてポリ（Ａ ）のような相補的核酸が、上記プローブおよびハイブリダイセー／ヨンにより会 合した核酸を、捕捉するのに使用される。これら二つの方法のいずれも、固体支 持体との結合で使用され得る。

別の代替系は、膜に一方のプローブを固定しく５ａｉｋｉら）、プローブをコー トし、標的および第２のコートされたプローブを添加し、除タンパク質化し、洗 浄しそして検出することである。

図１０は、一つのダブルＤループ構造検出のためのいくつかの配ＩＷを示す。図 １ＯＡは、ビオチンのような、捕捉Ｎ　分’？！　ラベルされた第一プローブ鎖 、およびノコキンゲニンのような、検出部分でラベルされた第二プローブ鎖を示 す。図１ＯＢはジ：＋−＋　シ’ｆ　＝ンのような、捕捉部分でラベルされた第 一プローブ鎖、およびビオチンのような、複数の検出部分でラベルされる相同な ラベル伸張を有する第二プローブ鎖を示す。図１゜Ｃは、二本鎖プローブのどち らがおよび／または両方の鎖に付着した非相同ラベルへの検出部分（または捕捉 部分）の添加を表す。

Ｃ０診断応用に対する複数のダブルＤループ構造の使用捕捉／検出系での単一の ダブルＤループ構造複合体の利用に加え、同様に複数のダブルＤループ構造が使 用され得る。

例えば、より長いプローグを使用するような、プローブ鎖の再会合が問題となり 得る場合に、複数のダブルＤループ構造の使用が、バックグラウンドの減少を提 供する。本方法では、標的配列中で２種またはそれ以上の配列が知られているこ とが重要である。

図１１は、二つのタプルＤループ構造に基づく検出のためのいくつかの配置を示 す。図１１Ａは、第１の二重鎖プローブの両鏡を捕捉部分てラベル、および、第 ２の二重鎖プローブの両鏡を、レボ−ティング／検出基でラベルする例を示して いる。捕捉部分は、第１のプローブセットの一方または両方の鎖に含有され得る 。この系では、ハイブリダイゼーション複合体は上記のように捕捉される。しか しながら、策１の二重鎖プローブ鎖の再会合は、いずれの鎖もレポーター／検出 基を含有しないため、反応に対するバックグラウンドを全（生じない。捕捉後、 ハイブリダイゼーション複合体は、ノーイブリダイゼーション複合体中の第２の 二重鎖プローブの存在に基づいて検出される。レポーター基の検出は、上記のよ うにして達成される。

標的複合体中の複数のダブルＤループ構造の存在に基づく、この系の第２の実施 態様を、図１１Ｂに示す。この場合では、第１の二重鎖プローブの一方の鎖のみ が捕捉部分でラベルされ、そして第２の二重鎖プローブの一方の鎖のみがレポー タ一部分でラベルされる。

単一のタプルＤループ構造検出について上記されたように、非相同のテ）・、お よび標的ＤＮＡに相同な配列が、二重鎖ブ・−ブに添加され得る。

（以下余白） Ｄ、ＲｅｃＡタンパク質で促進されるＤＮＡ増幅反応へのダブルＤループの使用 ＤＮＡ増幅反応は、連続した増幅のための調製物中の錫分離のための熱変性に、 優先的に依存すること（ＭｕｌｌｉｓＨＭｕｆｔｉｓらＨ５ｃｈａｒｆら）が記 載されている。以下の記載は、単一のまたは複数のダブルＤループの形成に続＜ 　ＤＮＡ増幅に基づく、二つの検出系である。

（ｉ）本発明の一つの増幅／検出法は、熱変性の必要なしに増幅を促進するため に複数のＤループを利用する。

本発明を支持するために実施した実験は、本発明のハイブリダイゼーション反応 物中で、二本鎖標的の異なる領域に相同な、二組の相補的なりＮＡプライマーの 使用が、標的ＤＮＡに二つのダブルＤループの形成を生じることを立証している 。これらダブルＤループは、ネイティブな二重鎖標的上のＤＮＡの特定の領域に 隣接しおよび規定する（図１２Ａ）　：　ＤＬ８０１／２およびＤＬ８０３／４ 　（表１）は、この反応に関係し得るプローブ／プライマーである。

得られたＤＮＡ標的構造は、ＤＮＡ合成の基質として、種々のＤＮＡポリメラー ゼにより認識可能となる。このような増幅反応の一つの例が、実施例８で提示さ れる。実施例８に記載の増幅反応のための基質はラムダＤＮＡゲノムである。プ ライマーは、約５００ｂｐの標的領域を規定する。代表的には、上記増幅反応は 、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、フレノウ断片）　、ＲｅｃＡタンパク質てコー トされたプライマー、ＡＴＰγＳ（またはｒＡＴＰ　（単独および再生系の存在 下で）、ｄＡＴＰ％ＧＴＰγＳ１　ならびにＡＴＰγＳおよびｒＡｒｐ、　また はＡＴＰγＳおよびＡＤＰの混合物）、標的である基質、必要なコファクターお よび４種ｄＮＴＰの全て（修飾されたまたは標識されたｄＮＴＰｓを包含する） を含有する。これらの反応はマタ、ＤＮＡへリカーゼ、トポイソメラーゼ、また は他の類似のＤＮＡ巻戻し剤および／または他のＤＮＡポリメラーゼを含有し得 る。

これらの反応条件は、５°から３゛方向へのプライマー伸長へと続く、プライマ ー３゛末端の伸張に有利である。ポリメラーゼによる、上記構造中の４種のＤＮ Ａプライマーのうちの二つまたはそれ以上の３°末端伸張は、ＤＮＡプライマー 間のＤＮＡ標的増幅の領域を規定する（図１３参照）。規定された領域に対する ＤＮＡ増幅を制限するために、それらが化学的または物理的にブロックされなけ れば、他の二種のプライマーのＤＮＡポリメラーゼ伸張もまた、それらの３°末 端で起こり得る（実施例８）。

プライマーベア間の、ＤＮＡポリメラーゼが触媒する３°伸張は、同じ鏡上のプ ライマーを置換し得、または、その一方で、新たに合成された生成物は、熱抵抗 性、または熱感受性のＤＮＡＩＪガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ、　ＭａｄｉｓｏｎＳＷｌ）を包含する、ＤＮＡリガーゼにより、上 記プライマーと結合され得る。適切なりＮＡへリカーゼ、トポイソメラーゼ、− 重鎖結合性タンパク質（５ＳＢ）、遺伝子３２（または、池の類似の）タンパク 質、または、いくつかのものがヘリカーゼ活性を付随する、ＲｅｃＢＣＤでコー ドされた酵素または他のタンパク質の添加により、複製が促進され得る。Ｒｅｃ Ａタンパク質により適正に位置されたプライマーはいずれも、複製開始に使用さ れ得る。

代表的には、二つのダブルＤループでＲｅｃＡタンパク質テ触媒されたＤＮＡ増 幅で使用されたプローブは、約６０から８０ｂｐのサイズである。より長い、ま たはより短いプローブがまた、同様に使用され得るが、反応条件は改変される必 要があり得、例えば、安定化ペプチド（例えば、ＳＳＢまたは遺伝子３２タンパ ク質）、薬剤、抗体、ポリアミンまたは架橋剤を含有し得る。

異なるサイズの複数のプライマーもまた使用され得る。プライマーはまた、それ らの全長に沿って、標的ＤＮＡ二重鎖に相同であり得、またはそれらは、非相同 のラベルのような、部分的に非相同な末端または内部の領域を含有し得る（上記 参照）。これらプライマーに対する唯一の要求は、所望の増幅生成物の３゛伸張 のために使用された塩基が、ＤＮＡ合成を始めるのに利用可能であるという点で ある。上記のようにプライマーはまた、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような 、または、ＤＮＡ修飾酵素および化学試薬で付加された機能で、修飾されたリン 酸骨格または塩基を含有し得る。

ＲｅｅＡタンパク質でコートされた、過剰のプライマーの存在下の反応は、新た に複製されおよび増幅されたＤＮＡ上に、新たな複数またはダブルＤループの形 成を可能とする。上記Ｒｅｃ＾タンパク質でコートされたプライマーは、さらな るラウンドのＤＮＡ合成を開始するのに役立ち、そしてこのようにＤＮＡ標的は 、増幅プライマーを位置するために、標的ＤＮＡを熱変性する必要なしに増幅さ れる。

ＤＮＡ増幅反応は、以下を包含する、任意の多くのＤＮＡポリメラーゼまたはポ リメラーゼ混合物を使用し得る：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレ ノウ大断片；Ｔ７；Ｔ４；および／または他のウィルスまたは細胞のＤＮＡポリ メラーゼおよびそれらの変異型、例えば、エキソヌクレアーゼ活性を有さないダ ブルフレノウ変異タンパク質。

二つのダブルＤループ反応のＤＮＡ生成物は、使用したＤＮＡプライマーにより 規定される。増幅されるダブルＤルーフ領域の左右のプライマーが、新たに合成 されたＤＮＡ増幅生成物の５゛末端を規定する。プライマーが置換されない場合 、新たに合成されたＤＮＡ生成物は、図１．２Ｂに表されるように、ＲｅｃＡで 触媒された増幅反応で連結され得る。

複数のプライマーセットを使用して、付着末端を有するＤＮＡ増幅生成物を生じ ることもまた可能である。次いでＤＮＡ生成物は、それらの重複する付着末端で ハイブリダイズし得、そしてこれらの会合］またＤＮＡの鎖長は、続いて伸張さ れる（Ｈａａ！Ｉｅら）。存在する鎖の伸張、置換合成、およびＲｅｃＡで触媒 された、重複領域での塩基のベアリングは、大きなりＮＡ標的の収率を増大し得 る。これは、ＲｅｃＡで触媒される細胞内でのインサイチュ−ＤＮＡ増幅に重要 であり得、それは、特定の条件下（Ｈａａｓｅら）で、インサイチュ−で保持さ れるような大きいＤＮＡ生成物または付加された基を必要とする。

上記タプルＤループ反応、または複数のダブルＤループは、インサイチュ−な増 幅反応のためにアガロース中で安定に形成され得る。異なるタイプのアガロース が可能ではあるが、代表的に上記アガロースは、低融解温度種であり、アガロー スｍＦＮは約０４〜１％である。これらの条件下で、アガロースゲルはまた、よ り短いＤＮＡ生成物の保持をさらに可能とする限定媒体を提供する：これは、特 にインサイチュ−反応で有用である（以下参照）。

１１６ｃＡて促進されたＤＮＡ増幅反応は、３７℃、および標的ＤＮＡ二重鎖ま たはプライマー環的ハイブリ、ドの熱変性温＆未満Ｆある、高められたａ度、例 えば５０〜６０℃で実行され得る。これらの反応で高められた温度の使用は、プ ライマー伸張に利用可能な酵素の範囲を広げ、そしてより長い領域のＤＮＡが合 成されるのを可能とし得る。増幅反応の温度は、反応成分の選択を指定する：例 えば、野生型Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲｅｃＡタンパク貫でコートされたプローブは、３ ７〜３９℃で標的ＤＮＡに添加され、次いで、ＤＮＡ合成は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　 ｕ」１匡■のＤＮＡポリメラーゼを用いて、５０〜５５°Ｃで達成され、次いで 反応温度が、３７〜３９℃に低下され、そしてＲｅｃＡ−タンパク質でコートさ れたプローブが添加、再添加される。あるいは、高温下で、熱抵抗性のＲｅｃＡ 様のタンパク質が、野生型Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲｅｃＡタシパク質に置き換わり得る （同時係属中で、同時所有の米国出願第０７１５２０．３２１号で論述するよう に）。

ＤＮＡ増幅反応のための、ＲｅｃＡタンパク質で触媒されたプライマー位置付け を使用する、二つのダブルＤループ、または複数のダブルＤループ反応は、溶液 中の診断またはインサイチュ−診断でＤＮＡ検出および増幅のための診断応用に 重要である。

Ｈ４）ダブルＤループおよびＤＩＩＡ増幅を活用する、第２の検出方法は、シグ ナル増幅のために、ラベルされた標識化または修飾されたｄＮＴＰのポリメラー ゼ付加を使用する。ＤＮＡポリメラーゼを使用する、単一　（二本鎖）のＤルー プ構造中のプライマーの３°末端の伸張は、Ｃｈｅｎｇら（１９８ｆｔ＞により 立証された。標的ＤＮＡ分子中の単一のダブルＤループの形成後、ＤＮＡポリメ ラーゼ、必要なコファクター、および４種のｄＮＴＰ全てを反応に添加する。鎖 伸張は、二本鎖プローブの一方または両方のプローブ鎖の３°末瑞から起こる（ 図１３Ａ）。あるいは、捕捉部分を含有する鎖の３゛末瑞は、プライマー伸張を 防止するためにブロックされ得る。一種またはそれ以上のｄＮＴＰが、常法（例 えば、ビオチン、ジコキンゲニン、または、蛍光または放射活性部分）により、 検出のために樟識され得る。ラベルされたｄＮＴＰの取り込みは、検出シグナル の増幅を生じる。

この方法は、さらに、目的の領域を標的とする複数のダブルＤループ構造の使用 により活用され得る（上記のように）。

標的領域の外部にある二本鎖プライマー３゛末端は、ブｏ　ツクされ得（アステ リスクで図１３Ｂに示したように）またはされない。シグナル増幅のこの方法は 、上記のように、ラベルされた部分の存在下で、ＲｅｃＡで促進された増幅の多 重を用いてさらに増強される。

シグナル増幅を伴う標的検出はまた以下のように達成され得る。ダブルＤループ が、二種のプローブ鎖を使用して標的配列で形成され、ここで少なくとも上記鎖 の一方は、捕捉部分を含有する。生じたタプルＤループ複合体は、除タンパク質 化され、そして捕捉媒体を有する捕捉部分との接触を介して捕捉され得るａ捕捉 された岸合体は、加熱により遊離される二上記複合体は、ｄｓＤＮＡまたは５ｓ ＤＮＡのいずれがとして遊離され得る。必要であれば、例えば、複合体がｄｓＤ ＮＡとして遊離されるならば、複合体は変性され、そして標的ＤＮＡが遊離され る。この混合物に、標的配列に相捕的なりＮＡ合成プライマーが添加される。こ れらのプライマーは、もとの二本鎖プローブに存在する配列は含有しない。次い で、ハイブリダイズしたプライマーからＤＮＡを合成するため、適切な緩衝液条 件下で、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓが添加される。このプライマーに よって導かれる鋳型合成が、ラベルされたｄＮＴＰ、例えば、放射性ラベルされ たｄＮＴＰ、ビオチンラベルされたｃｌＮＴＰ、　ＦＩＴＣラベルされたｄＮＴ Ｐ、または他の適切にラベルされたＤＮＡ前駆体の存在下で実施され得る。ラベ ルの含有は、例えば、Ｆ　ＩＴＣラベルされたｄＮＴＰの場合の蛍光光度計のよ うな、適切な検出系を介する標的検出を可能とする。。

Ｅ、ＲｅｃＡタンパク質で促進されたインサイチューハイプリダイゼーンヨンで のタプルＤループ構造の使用ダブルＤループ構造を利用する、別の検出方法が、 固定された細胞を用いるインサイチューハイブリダイゼーションである（実施例 ９）：ＲｅｃＡで促進されたインサイチュ−ハイブリダイゼーション法は、本出 願と同日に出願された、同時所有の米国特許出願「インサイチュ−／％イブリダ イゼーション法」に記載される。ＲｅｃＡタンパク質でコートされた二重鎖プロ ーブのインサイチュ−ハイブリダイゼーションは、共焦点レーザー走査顕微鏡（ ｙａｎＤｅｋｋｅｎら）を用いて、単離され固定された生物構造、あるいは核ま たは核容積内で他の標的とされた配列および／または液膜に対して、標的配列を 局在化する能力を提供する。

インサイチュ一方法の一つの応用は、実施例９Ｄに記載される。この方法で、分 裂するＨＥｐ−２核が固定され、そしてＲｅｃＡ／染色体Ｘαサテライ）　ＤＮ Ａプローブ複合体でプローブされ、モしてＦＩＴＣ−アビジンでラベルされる。

分裂する液中でプローブ結合のパターンが、積重的な光蛍光またはレーザー走査 顕微鏡手法を用いて評価される。結合したプローブを局在化するため、同一の視 野が、レンズ焦点を変更することなく位相差顕微鏡により観察される。得られた ２種類の顕微鏡写真を重ね合わせることにより、液膜および核の分裂面の相対位 置が、プローブでラベルされた染色体に関連して認識され得る。

本発明のこの局面は、生物構造中で標的配列を局在化するための単純化されたイ ンサイチュ−な手順を提供する。代表的には、固定された細胞または細胞より小 さい構造物が、懸濁液中またはスライド上でプローブされ、引続きフローサイト メ）　ＩＪ−または顕微鏡で解析される。本方法は、熱変性工程の必要性を排除 することにより、アーチファクトを減少させ、そして、より急速で特異的な標的 配列の検出を可能とする。本方法は、唯一、低コピー、および／または高コピー 数の標的配列のいずれにもよく適用され得る。

特に、本方法は、低コピー数配列を、最初に増幅する必要なしに検出する。大部 分の遺伝子マツピングおよび染色体研究は、特異的な、唯一、または低コピー数 の配列を含むと予想されるので、本インサイチュ一方法は、遺伝子マツピング研 究、および、唯一、または低コピー数の正常体、変異体または病原体の配列を包 含する診断応用に重要な利点を提供する。さらに本方法は、フローサイトメトリ ー解析により、染色体含量の測定も可能とする。

このインサイチュ−法の一つの一般的な診断応用は、染色体中、および／または 染色体の特定領域中の、選択された遺伝子または調節配列のマツピングにおける 使用である。標的遺伝子は、（ａ＞選択された遺伝子産物を生じる、（ｂ）細胞 またはウィルスのオンコジーンのような重要な細胞調節機能を果たしていると考 えられる、（ｅ）繰り返し配列に関する、（ｄ）活性な遺伝子産物の発現を抑制 する、遺伝的な欠損を含むと考えられる、（ｅ）既知の遺伝地図位置を有するマ ーカープローブ領域に対する染色体位置に関連し得る、および／または、（ｆ） 組み込まれたウィルスの配列を表し得る、遺伝子であり得る。

インサイチュ−ハイブリダイゼーションのためのプローブ鎖は、フルオレセイン −１１−ｄＵＴＰ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｗ＋）のような蛍 光部分を用いる直接ラベリングを包含する多（の方法でラベルされ得る。さらに 、個々のプローブ鎖が、結合された蛍光系を生じるために使用され得る。例えば 、第１の蛍光部分（一方の鎖に組み込まれた）の放出エネルギーが、第二プロー ブ鎖に取り込まれた第２の蛍光部分の励起エネルギーで光を放射する。このよう な結合された蛍光系は、ダブルＤループ複合体中の近接したプローブ鎖を利用す る。

ＤＮＡプローブが、特異的な細胞性病原体に対し向けられたとき、代表的には感 染細胞中のウィルスまたは細菌病原体の検出に対してであり、固定され標識され た細胞が、細胞中の感染性病原体を検出し、そして局在化するために、光学また は蛍光顕微鏡により試験される。あるいは、細胞感染、および感染された細胞の パーセントが、懸濁液中の核または細胞（こ対するＲｅｃＡタンパク質でコート された二重鎖プローブのインサイチューノ＼イプリダイゼーション後に、蛍光活 性化細胞・ノーター（ＦＡＣ５）により測定され得る（　Ｔｒａｓｋら）。

Ｆ、制限酵素切断に基づく検出系でのダブルＤ／レープ構造の使用 本発明のダブルＤループ構造は、標的／ダブルＤル−プ複合体に変更を導入する ことにより、サンプル中の標的ＤＮＡの存在を検出するのに使用され得、この変 更は、制限酵素消化１こ対するこの複合体の応答を検出できる方法で修飾する。

このような検出系のいくつかの実施例を以下に記載する。

ダブルＤループおよび制限酵素消化を活用する検出方法の一つを以下に示す。標 的ＤＮＡ中のある領域が二本鎖プローブ配列として選抜される。上記プローブ配 列は、標的ＤＮＡ中には存在しない内部制限部位を含有するように改変される。

このような制限部位は、標的およびプローブ間の塩基対ミスマツチが最小となる ように選択され得る（図１４）。次いでダブルＤループが形成され、そして複合 体が除タンパク質化される。

上記複合体は、次いで固体支持体上に捕捉され、そして、上記プローブ配列に導 入された部位に対する制限酵素で消化される（図１４ＡのＰｖｕ■）。あるいは 、上記複合体は、捕捉前に制限エンドヌクレアーゼで消化され得る（図１４Ｂ） 。プローブが標的配列にハイブリダイズされた場合は、ｐｖｕＩＩ制限部位が再 構築されないので、制限酵素は復元されたプローブ：プローブ複合体のみ切断し 、プローブ：標的複合体を切断しない。

固体支持体は洗浄され、そして検出部分の存在について検査される。本方法は、 プローブの復元により発生し得るいかなるバックグラウンドシグナルの減少も可 能とする。

第２の検出法も同様の原則で作用する。本方法では、標的ＤＮＡはメチル化され ず、そして二本鎖プローブＤＮＡは、ＲｅｃＡタンパク質のコーティング前にメ チル化される。ダブルＤループ複合体が形成され、複合体が捕捉され、そして除 タンパク質化される。次いでサンプルは、例えば、両方の鎖のＡ残基がメチル化 された場合のみ、その認識部位（配列番号：２）を切断するＤｐｎ　Ｉで消化さ れる。プローブが標的配列にノ・イブリダイズするときは、メチル化された制限 部位が形成されないので、Ｄｐｎ　ｆ切断は、プローブが復元された場合のみ起 きる。

固体支持体は洗浄され、そして検出部分の存在について検査される。上記のよう に、本方法はまた、プローブの復元により生じるいかなるバックグラウンドフグ ナルの減少も可能にする。

ＤＮＡのメチル化状帖はまた、標的／ダブルＤループ複合体を用いて、以下のよ うに活用され得る。この方法では、ＲｅｅＡタンパク質コーテニーグ前に標的Ｄ ＮＡがメチル化されるか、または二本鎖プローブがメチル化されるかのいずれか である。上記タプルＤループ複合体が形成され、上記複合体は、捕捉され、そし て除タノバク質化される。捕捉された複合体は、固体支持体から単離され得、そ して多数のサンプルに分けられる。一つのサンプルが、メチラーゼ感受性または メチラーゼ依存性制限酵素で消化され、そして別のサンプルが、メチラーゼ非感 受性の制限酵素で消化される：例えば、Ｍｂｏ　Ｉは、Ａ残基がメチル化される 場合はＤＮＡを切断せず、５ａｕ３Ａ　Ｉは、同じ制限部位をＡ残基のメチル化 状態に依存せずに切断する。

これらサンプルは、次いで、サイズ分画（例えば、アカ′ロースまたはアクリル アミドゲル上、または）ＩＰＬＣにより）され得、そしてサンプルのバンドのノ をターンが比較される。この方法は、単離およびそれに続く、異なる供給源から の多くのサンプル間で選択されたフラグメントの制限フラグメント多形性の検査 を可能とする。

メチル化はまた、消化から特異的制限酵素部位を保護するのに使用され得る（Ｎ ｅｌｓｏｎら）。例えば、もし、特定の領域にまたがるＭｂｏ　Ｉフラグメント の単離が所望され、しかし、その領域の内側にＭｂｏ１部位が存在する場合は、 上記フラグメントは、以下のように単離され得る。メチル化プローブを用いて、 標的ＤＮＡ中の内部制限部位にダブルＤループ構造が形成される。襟的／クブル Ｄループ複合体は、除タンパク質化され、Ｍｂｏｌで消化され、そして捕捉され る（図１５Ａ）。この方法は、（ｉ）異なる供給源から得られたフラグメント中 の保護された部位に近接した制限部位で制限酵素多形性を検査する、または（ｉ ｔ）その酵素について内部切断部位が存在する場合であっても制限酵素を使用し て所望の配列を捕捉し、クローンするために使用され得る。除タンパク質化され たダブルＤループ構造が、制限酵素切断を受け易いという事実は、５００マープ ローブと２．９ｋｂの相同標的フラグメントで形成されたプローブ標的ｍ合体の 、Ｐｌｅｌ制限エンドヌクレアーゼによる部位特異的切断により立証された。

二本鎖のＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブは、それら自身、消化から 特異的な制限酵素部位を保護するのに使用され得る。この場合は、上記複合体は 、除タンパク質化扛笠ＬｓＯ襟的／ダブルＤループ複合体は、制限エンドヌクレ アーゼで消化され、そして捕捉される（図１５Ｂ）。あるいは、上記二本鎖のＲ ｅｃＡタンパク質でコートされるプローブは、例えば、メチル化部位である、修 飾部位を修飾がら保護するために使用され得る。この場合は、上記の制限部位保 護に関するのと同様に、上記複合体は、除タンパク質化されない。上記襟的、タ プルＤループ複合体は、修飾試薬で処理され、次いて除タンパク質化される。標 的／ダブルＤループ複合体内部の修飾標的部位は、保護され、そして修飾を欠く 。

制限部位切断をプロ！りする能力は、遺伝子マツピングで育用である。例えば、 標的ＤＮＡが、ラムダゲノム上の約２６．３ｋｂにあるｐｖｕ　１部位のような 、ゲノム中の既知の領域を規定する場合、その既知の部位は、上記のアプローチ の一つによりｆ呆護される。保護されなかった、および保護されたラムダゲノム ＤＮＡは、Ｐｖｕｌて消化される。二つの消化間での制限フラグメツドパターン の変化は、ブロックされた制限部位を含有するサンプル中の、バンドの消失およ び新たなバンドのサイズに基ついて、どのフラグメントが他のフラグメントの次 であると推定することを可能とする。

制限酵素、およびそれらのメチル化状態に対する応答は、普通にｆす用可能であ り、これらの使用に対する条件は、当該分野で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌら； 　Ｍａｎｉａ口Ｓら）ＯＧ、ＤＮＡ中に部位特異的切断を生じるタプルＤループ の使用オリゴヌクレオチドは、特異的な一本鎖および二本鎖核酸部位に対して切 断剤を導くのに使用される（　Ｃｏｒｅｙら；　Ｄｒｅｙｅｒ、Ｇ、Ｂら；　Ｍ ｏ５ｅｒら）。オリゴヌクレオチド特異的切断の一つの利点は、実験者が、存在 する切断機能にもはや依存しないごとである：任意の所望されたＤＮＡ切断機能 が仕立てられ得る。

本発明のＲｅｃＡタンパク質でコートされた二本鎖プローブは、多くの方法で、 部位特異的切断を生じ得る。例えば、特異的な標的配列が選択され、そしてその 選択された配列に対応する二本鎖ＤＮＡプローブが生成される。ＥＤＴＡ部分が 、オリゴヌクレオチドプローブの一方または両方の鎖に付加される。チミジンの Ｃ−５を介する、オリゴデオキシヌクレオチドへのＥＤＴＡ　ヲ付加する一つの 方法が、Ｄｒｅｙｅｒらにより記載されている。上記プローブは、次いでＲｅｃ Ａタンパク質でコートされ得、そして標的ＤＮＡとダブルＤループ複合体が形成 され得る。切断は、ＥＤＴＡ−プローブ：標的ハイブリッドに対し、Ｆｅ（ＩＩ ）および還元剤（通常はＤＴＴ）の添加に際し、酸素の存在下で起こる。

あるいは、切断は、オリゴヌクレオチドプローブに付着するＤＮＡ結合性／切断 性タンパク質（Ｓｌｕｋａ、Ｊ、Ｐ、ら）由来のペプチドフラグメントを用いて 達成され得る。さらに、幾つもの切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼ、ま たは、ぶどう球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ヌクレアーゼの様な、相対 的に非特異的なホスホジェステラーゼが、配列特異性の増大した、ハイブリッド 触媒剤を生成するため、オリゴヌクレオチドに付着され得る（Ｃｏｒｅｙら）。

オリゴヌクレオチドは、ＲｅｃＡタンパク質コーテニーグ前、またはタプルＤル ープ複合体形成および除タンパク質化後のいずれかて、ホスホジェステラーゼ、 または他の切断剤に付加される。ホスホジェステラーゼ、ヌクレアーゼまたはペ プチドとダブルＤループ複合体との会合後、反応条件は、部位特異的な様式で両 方の標的ＤＮＡ鎖が加水分解できるように改変される。触媒剤の活性に依存して 、二本鎖プローブの一方または両方の鎖が、上記触媒剤を含有するよう修飾され る。

Ｈ，ＤＮＡ濃縮におけるダブルＤループの使用本発明のダブルＤルーブハイブリ ダイゼーシ９ン１合体はまた、選択された標的ＤＮＡ配列の分離および濃縮のた めに使用され得る。例えば、二本鎖プローブが、プローブ鎖の一方または両方に 捕捉部分を含有して形成され得る。ダブルＤループ複合体は、上記二本鎖プロー ブおよびＤＮＡ混合物中に存在する標的ＤＮＡの間で形成される。次いで、上記 プローブおよび標的配列を含有する上記ダブルＤループ複合体は、反応混合物か ら捕捉部分を用いて、例えば固体支持体への付着により分離される。次いで上記 複合体は、上記固体支持体から加熱により標的二重鎖を遊離させ分離され得、そ してもし必要であれば、遊離したＤＮＡは復元され、元の標的二重鎖ＤＮＡを再 生する。あるいは、全ダブルＤループ複合体は、固体支持体から簡単に遊離され 得る。

標的された二重鎖ＤＮＡが、簡単に加熱によりそのノ＼イブリッドからＪＭされ るかどうかを試験するため、３２ｐ−末端ラベルされた５００マープローブおよ び１Ｇ、　ｌｋｂのＡｐａ　Ｉ標的フラグメントで形成された、除タンパク質化 されたダブルＤルーブノ〜イブリッドの熱安定性が試験された二上記ハイブリッ ドは、ＩＸ　ＴＢＢ緩衝液中で、７５℃で全く安定であった。ＤＮＡプローブ鎖 の約半分が８０’Ｃで遊離された。実質的にＤＮＡプローブ鎖の全てが８５℃で 標的から遊離された。この融解プロフィールは、ＲｅｅＡタンパク質の非存在下 で反応物混合物を加熱し、次いで徐々に冷却することによって形成された、二重 鎖ブローブユ標的ハイブリッドについてのそれと類似である。上記ハイブリッド 融解プロフィールは、二重鎖５００マープローブのそれより、約１０°Ｃ低くて 、同一のイオン条件下で、自己アニールされた。

以下の理由により、上記ハイブリダイゼーション反応は、配列でタグされた部位 （ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ　５ｉｔｅ）　（ＳＴＳｓ）　（０１ｓｏｎ ら）によってのみ同定された、染色体または遺伝子フラグメントを標的すること に対して潜在的に有用である：（ｉ）ハイブリッド形成のために、ＲｅｃＡを介 したハイブリダイゼーション反応は、二重鎖ＤＮＡ標的の変性を必要せず、そし て（Ｈ）プローブ：標的複合体からプローブを分離し、しかし、標的を含有する 二重鎖の分析物、例えば、染色体または遺伝子を含有するフラグメントを変性さ せない温度まで加熱することによって、標的は、単離されたハイブリッドから遊 離される。上記標的ＤＮＡ分析物は、次いで二重鎖形態で回収し得る。

さらに、ハイブリッド融解温度の注意深い調節は、プローブと部分的なホモロジ ーのみ有し得るハイブリッドに対する選択を可能にし得る。プローブが標的ＤＮ Ａの複雑な混合物に使用される場合、厳重な融解ａ度の選択が重要であり得る。

−重鎖変性標的ＤＮＡに対する、二重鎖標的ＤＮＡ回収の一つの利点は、完全に 変性された一本鎖ＤＮＡよりも二重鎖ＤＮＡは、剪断力により抵抗性である傾向 がある。本発明の方法による、二重鎖標的ＤＮＡの回収は、特異的二重鎖遺伝子 、または大きい染色体フラグメントを包含するゲノムセグメントの濃縮および単 離を許容し得、次いでさらなる操作および／または解析に使用され得る。

この方法により得られた標的ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ増幅反応（Ｍｕｌｌｉｎｓ ＨＭｕｌｌｉｎｓら）または標準的なりローニング手法（Ａｕｓｕｂｅｌら：　 Ｍａｎｉａｔｔｓら）に使用され得る。

Ｌ　均一診断アノセイ 特異的なネイティブな標的ＤＮＡ二重鎖を検出し得る均一な診断ア、セイの一つ のプロトコールが試験された。このアッセイは、以下に詳細に記載するように、 ダブルＤループハイブリッド、次いでＤＮＡシグナル増幅を用いることにより二 本鎖標的の捕捉することを含む。

（ｉ）二本鎖ＤＮＡ標的の捕捉 ラムダＤＮＡゲノム（〜５０ｋｂ）のような大きい二本鎖ＤＮＡを特異的に捕捉 するために、タプルＤループ／Ｓイブリッドを用いることに対して、一つの手法 が良好に作用し得る。

この反応はまた、より小さい二重鎖ＤＮＡ標的の捕捉に適用可能である。この手 法は、ビオチンのような捕捉部分でラベルされ、ｒｅｃＡでコートされた、好ま しくは平均サイズ３００〜５００塩基の、−重鎖プローブを使用する。全てのＤ ＮＡプローブは、二重鎖ＤＮＡ標的の、好ましくは約ｔｏｏｏ塩基の領域内の配 列に相同であるように選ばれる。ビオチン化プローブは、ｂｉｏ−１４−ｄＡＴ Ｐの存在下で、好ましくは、約１０００ｂｐのＤＮＡ二重鎖フラグメントを、ニ ックトランスレートすることによって提供される。

Ｍｆ性プローブＤＮＡは、ＲｅｃＡタンパク質でコートされ、次いで二重鎖標的 ＤＮＡと反応させる。プローブ：標的ハイブリッド形成後、ハイブリダイゼーシ ョン反応混合物は、例えば、２０ｍＭＥＤＴＡを用いそして０．５Ｍ塩で処理さ れ反応停止され得る。ハイブリッドは、洗浄された磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　’ Ｅ）　Ｍ−２８０ストレプトアビジンＣＤｙｎａｌ＞上に捕捉され得る。捕捉後 、ビーズを、１Ｍ塩を含有する緩衝液中で３回洗浄する。結合したｒｅｃＡタン パク質部分が少なくとも部分的に除去された高塩濃度条件である。標的ＤＮＡの 捕捉は、ｆｆ２ｐでラベルされたラムダＤＮＡの使用、および洗浄後のビーズに 結合したままの放射活性を直接計測することによって測定され得る。大きなラム ダＤＮＡゲノム（〜５０ｋｂ）を使用する捕捉反応の結果を表３に示す。二本鎖 標的とハイブリダイズされたビオチン化プローブの捕捉のための反応の特異性は 、３つのコントロール反応（表３、反応２〜４）の包含により立証された。これ らの反応は、次のことを示した：　（１）ｒｅｃＡなしの反応では、有意なシグ ナルが得られなかった（反応２）ことから、ｒｅｃＡでコートされたビオチン化 プローブが、特異的な標的ＤＮＡ捕捉に必要であった（反応ｌ）、（２）ｒｅｃ Ａでニー、、トされた、非ビオチン化、非相同ＤＮＡプローブ存在下では、バッ クグラウンドレベルのＤＮＡ捕捉しか起こラナかったので、反応中のｒｅｃＡ含 有は、標的捕捉の原因ではなかった（反応３）。そ１７て（３）平均バックグラ ウンド、非特異的な、標的Ｄ　Ｎ　Ａ　１’ｌｌ捉は、約３．５％であった（反 応２〜４）。

（１１）捕捉ＤＮＡからの／グナル増幅ビーズに捕捉された標的ＤＮＡを検出す るための基本型プロトコールを、以下に簡潔に記載する。この工程では、捕捉さ れた標的は、一種またはそれ以上が標識されるｄＮＴＰ前駆体（例えば、ｂｊｏ −１４−ｄＡＴＰ、または、ＦＩＴＣ−１１−ｄＵＴＰ等のような直接検出可能 なラベルを有するｄＮＴＰ）を含有する反応混合物で加熱ｒることによりビーズ から遊離され、そして元の捕捉プローブ配列に非相同的で、標的配列にのみ相同 的な、５ｓＤＮＡプライマー（または複数）が添加され、そして標的ＤＮＡの一 本鎖とアニールさせる。アニーリング後、反応物を冷却し、そしてＤＮＡボ１ツ メラーゼ酵素、好ましくは丁７ＤＮＡポリメラーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅ ｒｓｉｏｎ　２．Ｏｓ　ＵＳＢ製）、および、適切な緩衝液ヲ添加し、プライマ ー伸張によるＤＮＡ合成を行なう。あるいは、高温ポリメラーゼもまた使用され 得、そして反応物はＤＮＡ合成進行を行えるａｖでインキコベートされ得る。プ ライマー伸張の間に、ラベルされたＤＮＡ前駆体は、新たに合成されたＤＮＡ鎖 に取り込まれる。ＤＮＡプライマーは、前に使用されたｒｅｃＡでコートされた プローブに相同的でないため、ラベルの組み込みは、特異的に、正しく捕捉され た標的の存在を示している。ポリ（Ａ）のように直接上記プライマーに結合され た、または後で添加され得るいずれがの捕捉部分の使用は、磁性ビーズ、セルロ ースなどに付着したオリゴ（ｄＴ）上の、増幅された標的シグナルのその後の捕 捉を可能とする。捕捉に引続き、増幅されたＤＮＡから取り込まれなかった前駆 体ラベルを除去し、そして必要であれば、例えば１−Ｂｌｏｃｋ　（Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ”、Ｔｒｏｐｉｘ社製）のようなブロッキング剤が、捕捉マ トリ・７クスに対する検出部分（例えば、ＡＶＩＤｘ−ＡＰ、　Ｔｒｏｐｉｘ社 製）の非特異結合をブロックするために使用される。ブロッキング後、増幅され た標的ＤＮＡ由来の特異的シグナル検出を可能とするために、基質が添加され、 そしてシグナルが任意の適切な手段により検出される。均一な診断タプルＤルー プアッセイの図式的なアウトラインを以下に示す。特異的なラベリング、捕捉、 および検出スキームの概要が提示され、さらに多（の方法で、このようなアッセ イが実施され得る。ダブルＤループハイブリッドを用いる二重鎖ＤＮＡ［的に対 する均一診断ア／セイの図式的なアウトラインを以下に示す。

（以下余白） ７・化イの工科ｉ梵−基本匿Ｉを 以下の実施例は、本発明を説明し、いがなる方法でも本発明を制限する意図はな い。

佳扛立方広 制限酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏ ｌｉｓ　ＩＮ）またはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒ ｌｙ　ＭＡ）がら入手し、製造業者の指示に従って使用した。

通常、オリゴヌクレオチドは、〔γ−３２ＰＩＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチ ド牛ナーゼを用いて放射性ラベルした。ラベリング反応は、緩ｔｉｉ液中で、製 造業者（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ； 　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ）により推奨された方法により実施した。オリ ゴヌクレオチドは、予め形成されたカラムＮｅｎ５ｏｒｂ　２０（ＮＥＮ−Ｄｕ Ｐｏｎｔ、　ＢｏｓｔｏｎｌＭＡ＞を、製造業者の指示に従って使用して、緩衝 液および取り込まれていないトリホスフェートから分離し、そして必要ならば、 続いてｄｄＨ２０に対して透析した。

Ｌ立且１ ＲｅｃＡでコートされたプローブの−１一連の二本鎖および一本鎖ＤＮＡプロー ブ、ならびにプライマーを生成した。ラムダファージゲノムの隣接５ｏｏ塩基対 領域に関するこれらプローブおよびプライマーの位置を、図１に示すコラムダゲ ノムのこの領域のヌクレオチド配列を図２に提ホスる。ラムダウィルスのゲノム に対して、各プローブおよびプライマーの５゛および３°末端の塩基位置を表１ に列挙する。

＆　１ デＯ−グδ゛よひ゛フ゛ライ７−のＤｔＪＡ画已句り暖足１３う４ダ′４逼表２ プローブ・標的ハイブリノドのビーズ捕捉は、ＲｅｃＡで触媒されたダブルＤル ープ生成物が二種のＤＮＡプローブ鎖を含有することを示す ＊　サンプル反応の説明は図８を参照。パーセンテージは、各捕捉反応物を１× 酢酸反応緩衝液で３回洗浄後に、Ｄｙｎａ１社製ストレプトアビジンでコートさ れたビーズ上に残存する１２Ｐ計測数から計算した。１分間の全予測３２ｐ計測 値を、図８中と同一の実験由来の細断したゲル薄片中の、ＤＮＡのシンテレーン ッン計測により測定した。反応３に放射活性ＤＮＡを添加されなかったため（ビ オチン捕捉プローブのみ含有）、この反応では放射活性計測は予測されない。

＋　ＤＮＡ中の放射活性３２Ｐの計測値は、バ１クグラウンドＤＮＡ計測値（す なわち、ビオチン捕捉プローブなしの反応２での計測値）である非特異的なビー ズ捕捉に対して補正される。

プライマーＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ２は、ｒＧＥＮＥＡＭＰＪ　ＤＮＡ増幅試 薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｉｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ　ＣＴ） 中で提供されたプライマーに相当する。

一重鎖プライマー類（ＰＣＲＯＩ、　ＰＣＲＯ２およびＰＣＲＯ３Ａ）および− 重鎖ブローブ類（ＤＬ８０−１から４、ビオチン−１２１，１２１−３２Ｐ、お よびビオチア−７９）は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　 ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ％ Ｐｏ５ｔｅｒ　ｃｔｔｙ　ＣＡ）で、市販のホスホルアミダイト前駆体を使用し て化学的に合成した。

ＤＮＡ分子は脱ブロッキング前に、末端の５°塩基にビオチンホスホルアミダイ トを反応させてビオチン化した（Ｎｅｗ　［：ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ− ＤｕＰｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）。全ての化学合成りＮＡ分子は、製造業 者の仕様書に従って脱ブロツク化した。

短いＤＮＡプローブ（２５マー）は、さらなる精製を行わずに使用した。−重鎖 ８０マーおよび１２１７−ＤＮＡプローブは、それぞれ８％、および５％または ８％のポリアクリルアミドゲルを使用する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より精製した。

完全長のＤＮＡ生成物を、正しいサイズのＤＮＡ分子に対応するゲルからＤＮＡ バンドを摘出することによって得た。ＤＮＡ分子を「ＥＬＵＴＲＡＰｊ　システ ム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ１１Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）を 使用する電気溶出によりゲル片から回収した。プローブおよびプライマーのいず れも、標準的エタノール沈澱により濃縮した（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。プローブ およびプライマーＤＮＡの濃度は、希釈したＤＮＡの２６０ｎｍでのＵＶ吸収を 基に測定した。

ラムダゲノムの二本鎖５００および２８０ｂｐ領域（図１）は、それぞれブライ ７−　ＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ２、またはＰＣＲＯ３ＡおよびｐｃＲＯ２、Ｔ ａｑポリメラーゼならびに標準的なりＮＡ増幅反応条件（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ；　ＭｕｌｌｉｓＨＭｕｌｌｉｓら）を使用して合成した。

増幅産物を、０．７％アガロース（Ｓｊｇｍａ　Ｔｙｐｅ　Ｉｔ、Ｓｉｇｍａ％ Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ　ＭＯ）ゲル（５００７−）または４％ｒＮＵｓｒＥＶＥＪ　（ＦＭ ＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）アガロースゲル（２ ８０？−）を用いた電気泳動により、ＤＮＡプライマーから分離した。上記増幅 産物に対応するバンド中のＤＮＡ分子を、電気溶出し、濃縮し、そして上記のよ うに、それらの実際の濃度を測定した。

二本鎖の１２１マーおよび１５９マープローブは、酵素Ａｌｕｌ（Ｎｅｖ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓＳＢｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）を使用する、精製した２ ８０マーの制限消化により得た。上記ＤＮＡプローブを、ゲル電気泳動で単離し 、上記のように電気溶出しそして濃縮した。

二本鎖７９マープローブは、酵素Ｈｐａ■を使用する、精製した５００マーの制 限消化により得た。この消化生成物を分離し、３％または４％いずれかのｒＮｔ ｌｓＩＥＶＥＪ　（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ゲルもしくは１％アガロー スゲルを使用する電気泳動により、切断されていないＤＮＡから精製した。特異 的ＤＮＡフラグメントを、上記のようにしてゲルから回収した。

−重鎖または二本鎖ＤＮＡ分子を、［γ−３２ＰＩＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗｌ）で、５゛末端ラベ ルした。必要な場合は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるラベリングの前に 、上記ＤＮＡ分子をアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ）で脱リン酸化した。取り込まれ なかったラベルは、ｒＮＥＮｓＯＲＢ　２０Ｊ核酸精製カラム（ＮＥＮ−ＤｕＰ ｏｎｔ）を使用して除去した。ラベルされたＤＮＡ分子は、滅菌２回蒸留水に対 する透析により、さらに精製され得、引続き凍結乾燥により濃縮され得る。３２ ｐでラベルされた１２１．１５９または７９マーもまた、３２ｐで末端ラベルさ れた２８０マーまたは５００マーの、適切な制限酵素消化により得た。

支立且１ ｆｆＲｅｃＡおよびパ　リＲｅｃＡ　８０３タンパク　の　１ＲｅｃＡおよびｒ ｅｃＡ−８０３タンパク質を過剰産生株ＪＣ１２７？２およびＪＣ１５３６９（ Ａ、Ｊ、　Ｃ１ａｒｋおよびＭ、　Ｍａｄｉｒａｊｕから入手）から単離した。

これらの菌株は、ＲｅｃＡおよびｒｅｃＡ−８０３コーディング配列を細胞に高 コピー数で存在するプラスミド上に含有する。

変性条件下での、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、ＪＣ１２７ ７２およびＪＣ１５３６９細胞抽出物から得た全タンパク質の解析は、３８．０ ００ダルトンのＲｅｃＡまたはｒｅｃＡ−８０３タンパク質が、これらの菌株で 産生された主要なタンパク質であることを示した。

ＲｅｃＡおよびｒｅｃＡ−８０３タノバク質を、粉末で入手したヒドロキシアパ タイトカラム（ＢｉｏＲａｄ）と引続くアニオン交換カラム（ｒＭＯＮｏ　ＱＪ 、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰ ＬＣ）を使用する確立された手法（５ｈｉｂａｔａら、１９８１　：　Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈら、１９８５）の改変法により精製した。

タンパク質の精製を以下のようにモニターした：（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　（ｒ 　Ｐ）ＩＡＳＴＧＥＬＪ　システム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ＰｉｓｃａｔａＷ ａｙＮＪ）による３８，０００ダルトンのＲｅｃＡタンパク質の同定；（ｉｉ） ［ｙ−”Ｐ］ＡＴＰおよび一本鎖ＤＮＡ　（Ｓｈｉｂａｔａら、１９８１）を使 用する、ＲｅｃＡ　５ｓＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ。上記反応で の生成物を、ＰＥＩセルロース薄層クロマトグラフィー（ＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅ 、　ＮＪ）を用いて分離し：　ＰＥＩプレートを０．５Ｍ　ＬｉＣ１および０． ２５Ｍギ酸の溶剤中で展開した。生成物をオートラジオグラフィーで検出した。

（ｉｉｊ）ＤＮアーゼ活性のアッセイ。ＤＮアーゼ活性を、Ｒ８゜Ａタンパク質 サンプルを、ＲｅｃＡ鎖転移緩衝液（Ｃｈｅｎｇら、１９８１１）中で、直鎖状 化されたφｘ１７４およびスーパーコイル環状二本鎖ＲＦの混合物、ならびに環 状一本鎖ＤＮＡと、３７℃で、１時間インキュベートすることによりモニターし た。除タンパク質化後のＤＮＡ二、キングおよび消化を、アガロース電気泳動後 の臭化エチジウムによるＤＮＡの可視化および、ＲｅｃＡとインキュベートした サンプル中の各ＤＮＡタイプの量を、ＲｅｃＡを含まない緩衝液でインキュベー トしたそれらと比較することによりモニターした。ＤＮアーゼ活性が認められな いＲｅｃＡタンパク質のみを使用した。

（ｉｖ）Ｃｈｅｎｇら（１９８８）の方法を改変した方法を使用する５００マー オリゴヌクレオチドプローブを用いるＤループ活性のアッセイ。

最終のｒＭＯＮｏ−ＱＪで精製したＲｅｃＡおよびｒｅｃＡ−８０３タンパク質 の銀染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのプロフィールは、実質的に他の細胞 性ポリペプチドを含まない各調製物由来の単一の３８，０００ダルトンのバンド を示した。

支急拠ユ ＲｅｃＡタンパク　コーティング　応 プローブのＲｅｃＡタンパク質コーテコ−ティング常、標準的な１ｘＲｅｃＡコ 一テイング反応緩衝液中（ＩＯＸ　ＲｅｃＡ反応緩衝液：　１００ｍＭ　トリス 酢酸（３７℃でのｐＨ７，５）、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、５００ｍＭ酢酸ナ トリウム、１０ｍＭ　ＤＴＴおよび５０％グリセロール）　（Ｃｈｅｎｇら、１ ９８８）で実施した。上記プローブの全ては、二本鎖または一本鎖にかかわらず 、使用前に、９５〜１００℃で５分間の加熱することにより変性し、１分間水上 に置き、そして、０°Ｃで約２０秒間の遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ）するた め、Ｔｏｍｙ製遠心機に供した。変性したプローブは、直ちに室温の、ＡＴＰγ Ｓを混合し、必要に応じて希釈した（２回蒸留した水で）ＲｅｃＡコーティング 反応緩衝液に添加した。

この反応混合物は、代表的に以下の成分を含有する：　Ｈ）２４ｍＭ　ＡＴＰ　 ｙ　Ｓ　；および（ｉｉ）１０〜４０ｎｇ間の二本鎖プローブ。この混合物に、 （＋＞通常５．２ｍｇ／ｍｌのＲｅｃＡタンパク質（Ｐｈａｒｍａｃｉａから購 入するか、または上記のように精製した）をｌμ１１　または（ｉｉ）等容量の ＲｅｃＡ貯蔵緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，０１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、　１．０ｍＭ　ＤＴＴ、および５０％グリセロール）のいずれかを、急 速に添加し混合した。プローブのＲｅｃＡコーティングの最終反応容量は、通常 約１０μｌであった。プローブのＲｅｃＡコーティングは、３７℃で１０分間プ ローブ−ＲｅｃＡ混合物をインキユベートすることにより開始された。

コーティング反応中のＲｅｃＡタンパク質濃度は、プローブサイズおよび添加し たプローブの量に応じて変化させた：　ＲｅｃＡタンパク質濃度は、代表的には 、６．８から５１ｐＭの範囲であった。−重鎖ＤＮＡプローブを、それらの相補 的プローブ鎖とは無関係に、ＲｅｃＡでコートした場合は、ＡＴＰγＳおよびＲ ｅｃＡタンパク質のａ度は、それぞれ二本鎖プローブで使用した濃度の半分に減 らした：すなわち、ＲｅｃＡタンパク質およびＡＴＰγＳの濃度比率を、個々の プローブ鎖の供試濃度に対して一定に維持した。

図３に、ＤＮＡバンドンフトアノセイにより測定した、１２１７−および１５９ マーＤＮＡプローブに対するＲｅｃＡタンパク質の結合を表わす、オートラジオ グラムを示す。上記のように、熱変性した？２Ｐでラベルされた二本鎖の、１２ １マーおよび１５９７−ＤＮＡプローブをＲｅｃＡタンパク質と反応させた。最 終のＲｅｃＡ−ＤＮＡ反応混合物は、２．４＋ｏＭのＡＴＰγＳを含有する。Ｒ ｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡ貯蔵緩衝液を、０．０１ｐｇの変性した１２１ または１５９マーＤＮＡプローブのいずれかを含有する、４種の反応の各々に添 加した。各反応中のＲｅｃＡの最終濃度は、レーン１および５．２および６．３ および７、または４および８が、それぞれ、０、ｏ１３７．１．３７、または１ ３．７ＭＭである（図３）。全てのＲｅｃＡ／ＤＮＡプローブコーティング反応 を、最終容量が１０μｍて実施した。ＲｅｃＡ結合は、全ての反応物を３７℃、 １０分間インキュベートすることにより開始した。各反応での５μｌアリコート をＩＸ　ＴＢＥ緩衝液中の２％アガロースゲルに充填し、そして９，２ｖ／ｃ＋ ｅで２時間電気泳動した。φＸ−１７４ＤＮＡ　（Ｇ［ＢＣＯ−ＢＲＬ、　Ｇａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ）のＩ（ａｅｍ消化物を、二本鎖ＤＮＡ１７）サイ ズ？−力’−（Ｍ）として供した。マーカーＤＮＡは、上記のように、３２ｐで ５°末端ラベルした。上記ゲルを、６５℃でＢｉｏｓｃｙｃｌｅｒオーブン中で サランラ、プ上で風乾した。乾燥したゲルを次いでＸ線フィルムにさらした。

図３から認められるように、ＤＮＡプローブの電気泳動移動度の遅延は、Ｒｅｅ Ａ濃度の上昇に伴い増大する。

上記と同一の条件をｒｅｃＡ−８０３についても使用した。

Ｌ嵐且Ａ ＲｅｃＡタンパク　を　したマルチプレックスのンブローブコーティング反応を 実施例３に記載のように実施した。コーティング反応が完了した後、標的ＤＮＡ を各反応に添加した。標的ＤＮＡは、上記ラムダウィルスゲノムに由来し、そし て制限酵素で切断した場合は、プローブの配列に相同なりＮＡフラグメントおよ び同様に非相同なフラグメントを含有した。

代表的には０．６６〜１．５μｇの標的ＤＮＡを１×反応緩衝液中の各反応物に 添加した。全反応物中のマグネフラムイオン濃度を、０．２Ｍ酢酸マグネシウム の了りコートの添加により、１２１Ｍに調整した。最終の反応容量は、標的ＤＮ Ａの添加後、通常２０μｌであった。

ＲｅｃＡで触媒された、相同的なプローブ標的反応を行うため、プローブ標的混 合物を３７℃でインキュベートした。６０分間のインキュベーションの後、反応 物を、３７℃で１５〜２０分、プロテイナーゼＫ　（ｌｈｇ／■ｌ）で、続いて 、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）を最終濃度０．５〜１．２％（ｗ／ｖ）と なるよう添加して、除タンパク質した。トラッキング色素（Ｍａｎｉａｔｉｓら ）の添加後、各反応物のアリコートを、０．７〜１．０％アガロースゲルのウェ ルに充填した。上記ゲルを室温または４℃のいずれかで電気泳動した。上記ゲル を臭化エチジウムで染色し、そして［ＩＶライトで［ｌＮ４分子を可視化した。

上記ゲルを、赤色フィルターおよびＰｏ１ａｒｏｉｄ　６６７の白黒フィルムを 使用して写真に撮った。

放射性ラベルしたＤＮＡプローブを反応に使用した場合は、プローブ：標的複合 体は、ＤｕＰｏｎｔ社製のｒｃＲＯＮＥＸ　ＱＵＡＮＴＡ　ＩＩＩＪまたはｒＬ ＩＧＨＴＥＮＩＮＧ　ＰＬＵＳＪ増強スクリーンのいずれがおよびＫｏｄａｋ社 製ｒＸ−ＯＭＡＴ　ＡＲ５ＪＲ５用ムを使用して、湿潤または乾燥したアガロー スゲルのいずれかのオートラジオグラフィーにより検出した。シグナル定量のた めに、オートラジオグラム上でシグナルを示す標的ＤＮＡのバンドをゲルから切 取り、粉砕し、シンチレーションカクｆル（ｒＡＱＵＡｓＯＬ７２Ｊ、ＤｕＰｏ ｎｔ−ＮＥＮ、　Ｂｏｓｔｏｎ　ＭＡ）に懸濁し、そしてＰａｃｋａｒｄ　２０ ００　ＣＡ　Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーションアナライザー中で、放射活 性を計測した。

二本鎖の２８０マーおよび５００マープローブ（表１）を上記のように二本鎖の 直鎖状標的ＤＮＡフラグメント（各プローブ配列を含有する、８３７０ｂｐのラ ムダＤｒａ　Ｉ消化フラグメント）と反応させた。変性プローブＤＮＡ分子は、 ２．４＋ｉＭのＡＴＰγＳおよび３４．２μＭのＲｅｃＡタンパク質存在下で、 ＲｅｃＡタンパク質でコートした。

ＲｅｃＡタンパク質でコートされない変性プローブをＲｅｃＡ９７バク質を含ま ない以外は同一の反応条件下に添加した。３７℃で１０分間のインキュベーンジ ン後、制限酵素Ｄｒａ　Ｉで消化した、０．６６μｇのラムダゲノムＤＮＡを、 各プローブ混合物に添加した：上記ゲノムＤＮＡを、上記のように、Ｍｇ”濃度 を調整したｌ×反応ｍｌ液に懸濁した。二本鎖プローブの、相同な二本鎖標的フ ラグメントに対する最終マイクロモル比は、５００マーについてはｔｏ、ｓ：　 ｌそしてｚ８０マーについては２１．６：　１であった。

プローブ：標的反応物のインキュベーンコンは、上記のように実施された。

上記反応物を除タンパク質化し、そして０．７％アガロースゲルに充填した。プ ローブと標的ＤＮＡフラグンメントとを分離するため、上記ＤＮＡ　＠　ＩＩ電 気泳動供した。図４Ａに、これら反応物を含有する上記ゲル中の臭化エチジウム で染色されたＤＮＡの写真を示す。左側の３つの反応物は、ｐＵｃ１８二本鎖環 状ＤＮＡ標的およびＲｅｃＡてコートされた一重鎖６９マープローブを使用した 、コントロール反応である（これらコントロール基質は、Ｂ、　Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎ、　ＳＲＩ、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡより提供された）。中央のレーン は、ＩｋｂのマーカーＤＮＡ　（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含有する。

ゲル右側の４つの反応物が、上記ラムダＤｒａ　Ｉ切断標的ＤＮＡである。

このゲルを乾燥し、そして上記のようにＸ線フィルムにさらした。図４Ｂに、得 られたオートラジオグラムを示す。ＲｅｃＡでコートされた５００マーおよび２ ８０マープローブいずれも、正しいＤｒａ　ＩラムダＤＮＡ１ｌ！Ｉ化標的フラ グメントと特異的にハイブリダイズした。プローブ：標的ＤＮＡのホモロジーの 位置は、８３７Ｏｂｐｌ的フラグメントの３°末端から少な（とも８３２ｂＪ） に存在する。この結果は、除タンパク質化に安定な、５ｏｏマーおよび２８０マ ーＲｅｃＡ促進ＤＮＡハイブリダイゼーシツン生成物の形成を立証している。こ れらの安定なりＮＡ　？１合体の生成には、ＲｅｃＡタンパク質が必要である。

支皿五五 ハさいニ　プローブおよび　二　“・ＤＮＡ日の　な１１生辺形底 この実施例で、除タンパク質化に安定な、直鎖状二本鎖ＤＮＡとの複合体を生成 するための、小さい二本鎖プローブの使用を説明する。

以下のハイブリダイゼーション反応は、実施例４に記載のように実行した。全て のＲｅｃＡタンパク質コーテコ−ティング反応は１０μｌであった。別に記載が なければ、各反応とも２．４ｍＭのＡＴＰγＳおよび２０．５μＭのＲｅｃＡを 含有した。最終の反応物は、１．３μｇのＤｒａ　Ｉで消化されたラムダＤＮＡ を含有した。以下の反応条件は、図５Ａおよび５Ｂ中のレーンに対応する：レー ン１および２は、２８０マープローブのそれぞれＲｅｃＡタンパク質を有するも のと有さないものであり：　レーン３は、ＲｅｃＡ　９７　ハク質を有する１２ １マープローブでありル−ン４〜６は、ＲｅｃＡ９７パク質を有する７９マープ ローブである。レーン５および６の反応物は、ＲｅｃＡプローブコーティング反 応の間、ＲｅｃＡタンパク質１度が、各々８５４および４１ｐＭであった。上記 反応物を除タンパク質化し、０．７％アガロースゲルに充填した。プローブと標 的ＤＮＡフラグンメントとを分離するため、上記ゲルを電気泳動に供した。

図５Ａは、上記反応物からのラムダＤｒａ　Ｉ消化標的フラグメントを示す、ア ガロースゲル中の臭化エチジウムで染色されたＤＮＡの写真を示す。図５Ｂは、 図５Ａに示すアガロースゲル中のＤＮＡのオートラジオグラフを示す。図中の矢 印は、使用された上記プローブに相同的な、Ｄｒａｌラムタラムフラグメントの 移動位置を表している。この結果は、除タンパク質化１４定な複合体が、全ての ＲｅｃＡでコートされたＤＮＡプローブ：２８０マー、１２１マー、および７９ マー、を用いて達成され得ることを表している。上記のように、安定な複合体が 、直鎖状二本鎖ＤＮＡ標的分子の末端から少なくとも８３２塩基で形成された。

（以下余白） 実去ｌ引ｌ な　Ａ　乏　は、ニ　プローブを・′・　と　るＡ、二本鎖ＤＮＡプローブの必 要性 ＲｅｃＡでコートされたＤＮＡプローブを、実施例４に記載のように、反応（６ ０分）あたり３．０ＭｇのラムダＤｒａ　Ｉ消化された標的ＤＮＡとのハイブリ ダイゼーションに使用した。二種の化学的に合成された一本鎖ＤＮＡ１２１７− を使用した。この鎖は、相互に相補的であった。一方の鎖をビオチンラベルし、 他方は、３２Ｐラベルした。

以下の反応番号は、図６Ａおよび６Ｂ中のレーンに対応する。反応１．　２．５ ．６および３．４は、各々２．４＋ｓＭまたは４８ｍＭのＡＴＰγＳを含有する 。全ての反応で、２０ｎＨの３２ｐラベルされたＤＮＡプローブ鎖および１０． ４μｇのＲｅｃＡタンパク質を使用した：各反応は、同一の３２ｐ比活性を含有 していた。反応３〜６は、さらに上記ビオチンラベルされた鎖を含有していた。

反応３および４では、最初の１０μｌのＲｅｃＡ反応液に両方のＤＮＡプローブ を、同時に添加した。反応５および６については、上記３２Ｐおよびビオチンで ラベルされたプローブを、各々別々の１０Ｍ１反応液中でＲｅｃＡでコートし、 次いで各反応混合物の半分を、−緒にしていないＲｅｃＡでコートされた相補的 なりＮＡプローブの添加前に３０分間、標的ＤＮＡとインキュベートした。３２ ｐでラベルされたＤＮＡ鎖は、反応５では最初に、反応６では、二番目に添加し た。

全ての反応物は電気泳動前に、プロティナーゼにおよびＳＤＳで除タンパク質化 した。図６Ａは、上記反応物からのラムダＤｒａ　Ｉ切断標的フラグメントを示 す、アガロースゲル中の臭化エチジウム染色されたＤＮＡの写真を示す。上記反 応条件を図６Ａおよび６Ｂ中に要約する。風乾した図６Ａのゲルのオートラジオ グラムを、図６Ｂに示す。

直鎖状標的ＤＮＡ上の相同内部の配列で形成された安定な除タンパク質化された 生成物の生成に、二種のＤＮＡプローブ鎖が必要である（レーン３．５、および ６とレーン２との比較）。

ＲｅｃＡタンパク質がまた、生成物形成に必要である（レーン３．５および６と レーン４との比較）。

Ｂ、二本鎖の安定な生成物のモデル 除タンパク質化された二本鎖のＲｅｃＡで触媒されたハイブリダイゼーション生 成物の可能なモデルを図７に示す。図７は、短い末端ラベルされたＤＮＡプロー ブと二本鎖直鎖状ＤＮＡ標的とで形成された、安定なダブルＤループマルチプレ ックスを表している。図示されたこのモデルは、８３７０ｂｌ）のＤｒａ　Ｉラ ムダ標的ＤＩＪＡ上のハイブリダイゼーションを描写し、ここで、ブローフ、襟 的のホモロジーは、標的の短末端（全ラムダゲノムに関して３°末端）から少な くとも８３２の塩基で始まる。上記Ｄｒａ　１フラグメントは、ラムダの塩基９ ３〜８４６２を含有する。ホモロノーの正確な領域は表１で規定される。−重鎖 のＲｅｃＡタンノくり質でコートされたプローブは、除タンパク質化に安定な、 複合体を生じない（上記の図６Ｂ参照）。

尖１漕］− プローブ＝ａ′・の　およびＤＮＡの Ａ、ハイブリダイゼーシロン反応 相補的な１２１７−ＤＮＡプローブ（表１）を別々に化学的に合成した。この相 補的な鎖は、〔γ−”’ＰＩＡＴＰおよびビオチン（それぞれレポーターおよび 捕捉部分）を使用して、別々にラベルした。全てのプローブコーティング反応混 合物は、１０μＩの反応あたり、２．４ｍＭのＡＴＰ　７　Ｓ、２０ｎｇの一本 鎖プローブ、５．２μｇのＲｅｃＡタンパク質（５，２８ｇ７μｌ　；　Ｐｈａ ｒｎ＋ａｃｉａ）、または等量のＲｅｃＡ貯蔵緩衝液（ＲｅｅＡタンパク質なし ）を含有した。ビオチンおよび３２ｐでラベルされた、両方のプローブ（反応１ および４）を使用する実験に対しては、類似のビオチンまたは３２Ｐてラベルさ れた、プローブコーティング反応の１０μｌアリコートを、これら混合物を標的 ＤＮＡ混合物に添加する前に、−緒に（２０μｌとなる）混合した。全ての反応 容量を一定に保つため、ただ一種の一重鎖ブローブ鎖（反応２および３）を用い る反応は、１０μＩのプローブ混合物、１０μＩのプローブ反応緩衝液くすなわ ち、第二鎖のプローブはない）および２０ｕＩの標的ＤＮＡ混合物を使用した。

ラムダ標的ＤＮＡ混合物を以下のように調製した＝１×ＲｅｃＡ反応緩衝液、０ ．２Ｍの貯蔵酢酸Ｍｇの１対１０希釈、およびＡｐａ　Ｉ　／ｌ！ｌ化されたラ ムダＤＮＡ、　２０マイクロリツトルの上記標的ＤＮＡ混合物を２０μｌの各プ ローブ反応混合物に添加した。これら反応物を３７℃で６０分間インキュベート とした。上記４０μｌの反応物を除タンパク質化し、二つの等量のアリコートに 分け、その二つのアリコートを０．７％アガロースゲルの隣接ウェルに充填し、 そして電気泳動により、その成分を分画した（上記のように）。

上記３２ｐラベル鎖を含有する全ての反応物（１，２および４）の最初の比活性 は同一であった。臭化エチジウム染色された各反応の隣接した二重のレーンを図 ８に示す。各反応の内容を図８中に要約する。

ｔｏ、　１ｔｔｂのラムダ標的ＤＮＡに対応する、上記ゲル各レーンの部分（図 ８）をゲルから切り取った。各切り取られたフラグメントを微量遠心チューブに 入れドライアイスを使用して急速に凍結した。各ゲルフラグメント中に含まれた ＤＮＡは、上記凍結ゲルを折り畳んだパラフィルムの間で、もはや液体が排出し な（なるまで絞り出すことによって回収した。このＤＮＡを含有する液体を次い で注意深＜　ｒＥＰＰＥＮＤＯＲＦＪマイクロピペットで除去した。

Ｂ、捕捉／検出アッセイ 同一の標的分子上の二種のプローブ鎖（一方はビオチンラベル、他方は３２Ｐラ ベル）の存在を、ストレプトアビジンでコートされた常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ 、　０ｓｉｏ、Ｎｏｒｗａｙ）上に、ビオチン含有プローブ：標的ノ＼イブリッ ドを捕捉することによりアッセイした。製造業者のビーズ貯蔵緩衝液は、使用前 に除去した。上記ビーズを、１ＸＲｅｃＡ反応緩衝液、そして１０ＸＲｅｃＡ反 応緩衝液、そして最後に１ｘＲ６ｃＡ反応緩衝液で洗浄した。

ＤＮＡ捕捉前に、洗浄されたビーズと等量のアリコートを個々の１５１の微量遠 心チューブに添加し、そして上記最後の緩衝洗浄液を除去した。上記ビーズ混合 物を含有する微量遠心チューブを磁性分離ラック（Ｐｒｏｍｅｇａ％Ｍａｄｉｓ ｏｎ　Ｗｌ）中に置くことにより、全てのビーズ懸濁液から液体を除去した。

上記のＤＮＡを含有する反応サンプルを、各々、上記の洗浄した常磁性ビーズの アリコートを含有する微量遠心チューブに添加した。上記サンプルを混合し、そ して室温で１５分間インキュベートした。ビーズは、時間とともに沈降するので 、ビオチン：ストレプトアビジンの効果的な暴露を確実にするため、この混合物 をインキュベーション中に、数度振とうした。

捕捉反応後、すなわち、ストレプトアビジンとビオチンとの結合後、各反応中の 上記常磁性ビーズを磁石で寄せ集め、そして反応液を除去した。

各サンプルのビーズは、１ＸＲｅｃＡ反応緩衝液で３回洗浄した。３２ｐでラベ ルされたプローブ鎖の存在は、液体シンチレーシヲン計測蛍光剤（ｒｌｕｏｒ） をビーズに添加し、そして各ビーズ反応により捕捉された、ＤＮＡの放射活性を 計測することにより評価した。これらのデータを表２に示す。

（以下余白） 表２ プローブ標的ハイブリッドのビーズ捕捉は、ＲｅｃＡで触媒されたダブルＤルー プ生成物が二種のＤＮＡプローブ鎖を含有するこ＋　ＤＮＡ中の放射活性３２Ｐ の計屓１１値ＣＬ　ノ＜ツクグランドｏＮＡｉ士ｆｆ１ＩＩ値（スなわち、ビオ チン捕捉プローブなしの反応２での３十１ｕｌ１表２中のパーセンテージ（ま、 各捕捉反応の、ｌ×酢酸反応緩衝液を用いて３回洗浄しｔこ後、Ｄｙｎａ１社製 ストレプトアビジンてフートされたビーズ；こ残存する、３２ｐで放射ラベルさ れた１分間あたりＤＮＡ計測数から計算した。ヒ′オチン捕捉プローブのみ含有 する、反応３（こ（よ、ｆｆ２ｐでラベルされたＤＮＡ７！ｌ（添加されておら ず、ビオチン捕捉プローブのみを有する：この反応「全予測計測数」は以下のよ うに測定した。同一の反応を上記のように実施し、そしてアガロースゲル電気泳 動により生成物を分離した。１０．１ｋｂ標的ＤＮＡに対応する、ゲルフラグメ ントを、ゲルから切り取り、刻み、そしてｒ　ＡＱＵＡＳＯＬＪに移した。

サンプル中に存在する、３２ｐでラベルされたＤＮＡの量を液体シンチレーシマ ン計測により測定した。

本結果は、二種の相補的で異ってラベルされたプローブを含有する、ハイブリダ イゼーション生成物が、ストレプトアビジンとビオチンラベルされたプローブ鎖 との相互作用を用いて捕捉され得、そして続いて相補的なプローブ鎖中のラベル により検出し得ることを示している。

安定なプローブ：標的ハイブリッドのこのビーズ捕捉は、ＲｅｃＡタンパク質に より触媒された、相同プローブ：標的複合体が、実際に、同−二本鎖標的分子上 に二種の相同なプローブ鎖を含有したことを支持する。

支胤拠１ ７のパ　が１　な、ＲｅｃＡ＋で　°　されたＤＮＡＲｅｃＡタンパク質で促進 されたＤＮＡ増幅の反応条件は、本明細書に参照によって、取り込まれた、同時 係属で同時所有の第０７１５２（１，３２１号「核酸ハイブリダイゼーションお よび増幅のための方法」、１９９０年５月７日出願、に記載されている。

ＤＬ１１０１／２およびＤＬ８０３／４　（表１）に対応する二本鎖プローブ／ プライマーのペアを、上記のように変性し、モしてＲｅｃＡ夕ンパク質でコート した。ＤＮＡプライマーの伸張が所望の方向にのみ起きることを確実にするため 、適切なプライマーの３°末端を２゛、３−ジブオキ／ヌクレオチドにより終結 させ得る。ジブオキ／ヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰｓに存在する３−ヒドロ キシル基が欠けている。ヒドロキシル基の欠如は、ジデオキシヌクレオチドおよ び後に続〈従来のｄＮＴＰ開のホスホジエステル結合の形成を防止することによ り伸張を阻害する。プライマーへの上記ジデオキシヌクレオチドの添加は、酵素 ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　 Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＯ）の使用により達成され得る。

上記プローブを、次いで上記のように標的ＤＮＡと反応させる。

ダブルＤルーズの２つのセットから成る、上記反応の生成物を、次いで代表的な りＮＡ増幅反応中で基質として使用する。上記ＤＮＡ反応は、２００〜７５０μ ＭのｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼの存在 しないＤＮＡポリメラーゼＩ、フレノウ、またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）が添 加された、ｌｏｍＭのトリス−１（ＣＩ　（ｆ＋Ｈ７，５）、８〜１２ｍＭのＭ ｇＣｌ２、および５０ＩＩＩＭのＮａＣ１を含有する緩衝液中で実行し得る。さ らに、特異的な増幅反応生成物の形成を促進し得る、他の酵素またはタンパク質 （例えば、ＤＮＡへリカーゼ、トポイソメラーゼ、ＤＮＡリガーゼおよび一重鎖 結合性タンパク質（ＳＳＢ）　）を、上記反応に添加し得る。上記反応は、必要 な間は３７°Ｃで進行させる。完了時に、サンプルは、除タンパク貫化（ＳＤＳ 、プロテイナーゼにおよび２、′またはフェノール抽出）し得、そしてケル電気 泳動により分析し得た。電気泳動分離の後、得られた増幅ＤＮＡを、ゲル中のＤ ＮＡの臭化エチジウム染色または標的特異的ＤＮＡプローブとのＤＮＡハイブリ ダイゼーションのいずれかにより可視化し得る。

あるいは、増幅ＤＮＡプローブをビオチン化し得、そして新たな合成りＮＡが適 切な手段で捕捉され、次いでレポートされ、前記のように検出され得る。

１〜２ユニツトの、エキソヌクレアーゼの存在しない大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ　（Ｕ、Ｓ、　Ｂｆｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および７５０μＭの各ｄＮＴＰの 添加により、Ｄ？ｌＡ合成反応を開始する。上記反応を、３７°Ｃで維持する。

最初のポリメラーゼの添加に続いて、上記反応に、例えば、フレノウのＩユニッ トおよび／または追加のｄＮＴＰを、反応の時間経過中特定の間隔で添加し得る 。

サンプルを、電気泳動分離のために充填される前に、プロティナーゼにで処理す る。電気泳動分離の後、得られた増幅ＤＮＡフラグメントを、ゲルの臭化エチジ ウム染色または標的特異的プローブとのハイブリダイゼーションのいずれかによ り可視化し得る。

ハイブリダイゼーション分析のために、上記ゲルを標準プロトコール（Ｍａｎｉ ａｔｉＳら）により、ハイブリダイゼーション転移膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＳＡｍ ｅｒｓｈａｍ）上に転移し得る。上記ＤＮＡをＵ■で膜に架橋する（Ｓｔｒａｔ ｏｌｔｎｋｅｒ、　ＳＬｒａｔａｇｅｎｅ）。上記ＬＩｖで処理した転移膜を、 末端ラベルされた（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）プローブＰＣＲ Ｏ３Ａ　（表１）でハイブリダイズする：　ＰＣＲＯ３Ａ　（ネイティブのラム ダゲノムの７３５１から７３９０ヌクレオチド）は、上記増幅反応の標的である 、５００塩基対のラムダ鋳型の内部ＤＮＡ配列に対応する４０マーである。上記 膜は、オートラジオグラフィーに供する。

（以下余白） 大浦ｍ ダブルＤループ　応を　るインサイチュ−ＤＮＡＡ、プローブ複合体の調製 ビオチン化染色体ＸアルファサテライトＤＮＡプローブは、ＯＮＣＯＲ（Ｇａｉ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から入手される。その代わりとしては、ＩＩの二ノ クトランスレーンヨン法により、または、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｅｒら 、１９９０）により、プローブをビオチン化し得る。

無菌のｄｄＨ２０で変性の前に所望の濃度に希釈した二本鎖プローブを、０．５ ｍｌ容量のミクロ遠心管内でＩ　Ｏｒ）”Ｃの熱ブロック中５分間で変性させる 。直ちにその管を氷水浴中に１から２分間置き、次いで−ＴＯＭＹ”ミクロ遠心 機を用いて４−６°Ｃで簡単な遠心分離を行い、そして、再び管を氷水浴に戻し た。変性したＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション混合物に添加する約５分 前に、上記プローブが入った管を一２０’Ｃのフリーザーの水中に置く。このブ ローブハイプリダイゼーシジン混合物は、広範囲の濃度で次の成分を含み、そし て、記載された順に混合される：　１０ｘ　ＲｅｃＡ反応緩衝液　１　ＩＩ　［ １０ｘ　ＲｅｃＡ反応緩反応緩衝液＋１００＋詐＋ 酢酸マグネ／ウム、５００ｍＭ酢酸ナトリウム、１．ＯｍＭ　ＤＴＴ，　および ５０％グリセリン（Ｃｈｅｎｇら．１９８８）］　；　１Ｂ．２ｍＭストック（ Ｐｈａｒｍａｃｆａ）由来のＡＴＰ７　Ｓ　１．５μＩ　［ＧＴＰ７　Ｓ，　（ 単独またはｒＡ　ＴＰ再再生の存在下の）ｒＡＴＰ．　ｄＡＴＰ．　ＡＴＰ　ｙ 　ＳとｒＡＴＰとの混合物．あるいはＡＴＰγＳとＡＤＰとの混合物も、い（っ がの反応中で用い得る］；２０重Ｍ酢酸マグネシウム０．７５μｍ；無菌水中の 変性されたプローブ４４−６０ｎ　（または、いくつかの反応中ではそれ以上） ；０゜１３７５Ｍ　ストックＲｅｃＡタンパク質（Ｐｈａｒ＋５ａｅｉａから購 入した時）１．２５μｌ　［他の供給源から入手した時あるいは研究室で調製し た時は、ストックの濃度に従って多様な量（μｌの量）で加える］。

この混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで２０ｈＭ酢酸マグネシ ウムを反応物あたり０．５μ！添加する。反応成分の最終濃度は以下のとおりで ある：４．ＯａＭから１０ｍＭ酢酸トリス、２．０ｍＭから１５ｍＭ酢酸マグネ シウム、２０．０ｍＭから５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．４ｍＭから１．ｏ＋ａ Ｍ　ＤＴＴ、２％から５％グリセリン、１ｍＭから２．５ｍＭ　ＡＴＰｙ　ｓ、 　０．００５ＩＩＩＭから０．０２＋１Ｍ　ＲｅｃＡタンパク質。

Ｂ、ＨＥｐ−２固定細胞核の調製 ＨＥｐ−２細胞は、もとはヒト（男性）咽頭表皮性（ｅｐｉｄｅｒＩＩｏｉｄ） 名種組織に由来する。ＨＥｐ−２は、染色体倍数性可変細胞系（Ｃｈｅｎ）であ る。

これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、およびペニンジン／ス トレプトマイシンの混合抗生物質を補った３７℃のｖＡ準条件下のＤＭＥＭ培地 （ＷｈｉｊｔａｋｅｒまたはＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に接種した後、２４時間培養 する。細胞を低速の遠心分離によってベレット化し、このペレットを、所望の量 の核膨潤が起こるように、３７℃の水浴中て５から１５分の間７５ｍＭ　ＫＣＩ で再懸濁し、次いで、３．１の水冷メタノール：酢酸の添加および６℃での遠心 分離による細胞の固定を行う。

ベレット化した細胞と共に液体１ｍｌが管に残り、さらに水冷メタノール：酢酸 を加え、管を緩やかに混合することにより細胞を混合し、次いで遠心分離する。

繰り返し、メタノール−酢酸を添加して、細胞質を分解する（ＨＥｐ−２および 他の細胞タイプは、いくつかの細胞質を分解しない代わりの方法で固定し得る） 。　単離された核の調製は、３：１のメタノール：酢酸中に〜２ｘ　１０６／＋ ＊ｌの濃度に再懸濁することにより固定し、後の使用のために、−２０°Ｃに保 たれたきれいなスライドガラス上に１０μｌアリコートをピペットで滴下するが 、または、懸濁した核を一２０°Ｃに保存する。

Ｃ１固定された調製物のハイブリダイゼーシコン反応実施例９Ａ由来のプローブ 混合物／反応物１０μｌを、スライドガラス上の固定された調製物に加える。カ バーガラスをハイブリダイゼーション領域の上に置き、ゴム状（ｒｕｂｂｅｒ） セメントでシールし、そして反応物を、３７℃のＣＯ２インキュベーター内の湿 潤コンテナ内で１−４時間のインキュベートする。

インキュベートした後、上記ゴム状セメントを手で取り除き、このスライドをフ プリン容器（ｃｏｐｌｉｎ　ｊａｒ）内で３回洗浄する。各洗浄は、３７℃の水 浴中にある２Ｘ　ＳＳＣ（２０Ｘ　ＳＳＣ：　３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍ　クエ ン酸ナトリウム、　ｐｌ＋７．０が、これらのアッセイにおける調製物を含む全 てのＳＳＣに用いられている）中で１゜分間行う。他の洗浄条件も用いられ得る 。

このスライドを、室温ＣＲＴ）で２５分間、前プロ７．り溶液［４×ＳＳＣ，０ ，１％”ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００−、５％カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏ ｎ）脱脂粉乳、２％標準ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ）、　０．０２％アジ化ナトリウ ム、　ｐ）１７．０１内に置き、次いで前ブロツク溶液中の５重ｇ／ｍｌ　ＦＩ ＴＣ−アビジンＤＣＳ、　セルソーターグレード（Ｖｅｃｔｏｒ、　Ａ−２０１ １）に、室温（ＲＴ）で２５分間浸漬する。このスライドを、それぞれ室温（Ｒ Ｔ）　テｔｏ分間、４Ｘ　ＳＳＣ，４ｘ　ＳＳＣおよびＯ，１％　”ＴＲＩＴＯ Ｎ　Ｘ−１００°、４ｘ　ＳＳＣで続けて洗浄し、次いで２重に蒸留された水で 短時間すすぐ。その後、このスライドを乾燥する。

抗退色溶液［１０＋ｃｌ’Ｊン酸緩衝生理食塩水中の１００＋＊ｇ　ｐ−フェニ レンジアミンジヒドロクロリド（Ｓｉｇ＋＊ａ　Ｐ１５１９）を、０．５Ｍ炭酸 −重炭酸緩衝液（ＮａＯＨでｐＨ９に調整された０、４２ｇ　ＮａＨＣＯ３（１ ０ｍｌ　ｄｄＲ２０中））を用いてｐＨ８に調整し、９０ｍ１のグリセロールに 添加し、０．２２μｍ　テ濾過された］を上記スライドに加え、このｇ型物の上 にカバーガラスを置く。ヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰ　＋溶液のようなカウ ンター染色を含有する抗退色溶液を、抗退色溶液単独の代わりに用い得る。

必要に応じて、シグナル増幅を次のようにして行うニスライドを、カバーガラス および抗進色剤を除去するために、ＲＴで５−１０分間、４ｘ　ＳＳＣおよび０ ．１％”ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００”で洗浄し、次いで２０分までの間、前ブロ ツク溶液内でインキュベートする。その後、これらのスライドを、前プロ・ツク 溶液で希釈した５重ｇ／ｍｌのｄＫのビオチン化ヤギ抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔ ｏｒ　ＢＡ−０３００＞を用いて３７℃で３０分間インキュベートする。このス ライドを、それぞれＲＴで１０分間、４ｘ　５ＳＣ１４Ｘ　ＳＳＣおよび０゜１ ％”ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００°、４ｘ　ＳＳＣで続けて洗浄し、次イテ、ＲＴ テ２０分間、前ブロツク溶液内に浸漬し、そして、５重ｇ／＋ｌ　ＦＩＴＣ−ア ビジンを加えた前ブロツク溶液に、ＲＴで２０分間浸漬する。

このスライドを、再び、ＪＸ　ＳＳＣシリーズで洗浄し、ｄｄＨ２０中で簡単に すすぎ、そして、このスライド上に、抗退色溶液またはカウンター染色液を加え た抗退色溶液をのせる。

特定のシグナルを標準の蛍光顕微鏡観察手段を用いて検出する。

Ｄ、固定された核および細胞全体中の特定の染色体配列の検出 ハイブリダイゼーション混合物は、記載した順に混合される：　１　μｌ　ＩＯ Ｘ　ＲｅｃＡ反応緩衝液、１．５μＡＴＰ７Ｓ（１６，２１１Ｍストック、　Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）、０．７５μｍ酢酸マグネシウム（２０ｍＭストック）、１ ２μｌ　（ｄｄＨ２０中の変性したプローブを２０から６０ｎｇ含有した実施例 ８Ａのもの）、ＲｅｃＡ（０，１３７＋ｍＭストック、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 。

この混合物を３７℃の水浴中で１０分間インキュベートし、次いで０．５μｍ　 ２００ｍＭ酢酸マグネシウムを添加する。

上記のように調製し、固定した）ＩＥｐ−２細胞の核または細胞全体を、３：ｌ のメタノール：酢酸（または他の適切な固定化溶液）中、−２０°Ｃ１約２−３ ｘ　１０’／ｍｌの濃度で、固定した状態で保存する。約１−１．５ｘ　１０６ の核の！￥濁した核（または細胞全体）約０．５ａ＋１を、０．５または１．ｓ ｍｌのミクロ遠心管内で、”ＴＯＭＹ−遠心分離機セットを用いて、３から６回 遠心分離を行う。この核または細胞全体を、段階的に２００μｌから１１の７０ ％、８５％、および１００％の水冷ＥＬＯＨに再懸濁する。最終の遠心分離およ び１００％ＥｔＯＨ上澄を除去した後、０．５ｍｌのミクロ遠心管内で、ベレッ トを、室温で、２００−５００μｌ　ＩＸ　ＲｅｃＡ反応緩衝液で再懸濁し、そ して遠心分離する。

上記完全なプローブ混合物を、このベルノドと混合し、そして、この遠心管を１ ．５−２．５時間、３７℃の水浴中に保持した。

３７℃で、２Ｘ　ＳＳＣ２５０μｍの添加によりインキュベーションを停止し、 次いで遠心分離する。このペレ’ｙ　）を３７℃の２Ｘ　５ＳＣ２５０μｍで再 懸濁し、そして５分間、３７°Ｃでインキュベートする。次いで遠心分離の後、 このベレットを、室温で２０分間、ブロッキング溶液５００μｌで再懸濁し、そ して、遠心分離し、２０分間、室温のブロッキング溶液１００μｌ中のｌｏｕｇ ／ｍｌ　ＦＩＴＣ−アビジンで再懸濁する。この遠心管を、遠心分離し、４Ｘ　 ＳＳＣ２５０μｍとこのベレットとを混合し、再び遠心分離し、そして、０．１ ％　”ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００−を加えた４Ｘ　ＳＳＣ２５０μｌ　とＣｔ７ ）ベレ、トを混合し、そして、再び４ｘ　ＳＳＣ２５０μｌとともに遠心分離す る（これらすべてを室温で行う）。いくつかの例で（よ、異なる濃度の、および ／または、異なる洗浄の、成分を用１．ｉ６゜最終の遠心分離の後、このベルｙ ）を抗退色溶液約２０μｍと混合する。調製された核をスライド上に載せ、特定 のンク゛ナルを１．１の蛍光顕微鏡観察手段を用いて検出する。

実１１乳１」− 々のコツアク　−を　いるＲｅｃＡ ダブルＤルーブハイブリダイゼーシッン　応この実施例では、ＲｅｃＡタンパク 質コーテニーグ反応に対して異なる多数のコファクターを用いるダブルＤループ 複合体の形成を記述する。

ダブルＤループ反応は、ＬＸ　Ｄループ緩衝液（ｌＯ×　緩衝液＝１００冒Ｍ酢 酸トリス（ｐＨ７，５，３７℃）、２０■Ｍ酢酸マグネシウム、５００ｍＭ酢酸 ナトリウム、ＬＯｍＭ　ＤＴＴ、　５０％グリセリン（Ｃｈｅｎｇら。

１９８１１））の中で、３８ｎｇのプローブを用い、ＡＴＰ　７　Ｓ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）、ｒＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｄＡＴＰ（ＵＳＢ）、または ＧＴＰ　７　Ｓ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）を含有させ、１．２ｗ＋Ｍの濃度で行わ れた。この反応物は、再生系を用いてまたは用いずに確立され、そして、λ／Ａ ｐａｌラムダＤＮＡｍ的消化物（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　 Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）１．２μｇを含有した。このプローブは、３２ｐで末端 ラベルされたラムダ２８０−マー（表１　）（Ａｕｓｕｂｅｌら）であった。ラ ムダ標的フラグメント（すなわちプローブと相同の配列を含有するＡｐａ　Ｉフ ラグメント）は、図１６中に矢印で示した小さい方の１０．１ｋｂフラグメント である。

ＲｅｃＡを含有する全ての反応物中のＲｅｃＡの最終濃度は、１２．３μＭであ った。代表的には、最終酢酸マグネシウム濃度は、それぞれの反応物（実施例４ ）につき、約１２ｗＭであった。

ダブルＤループ形成反応物は、Ｌｏｎｇ／＋１プロテナーゼにおよび０．５％Ｓ ＤＳを用いて、除タンパク質化された。この除タンパク質化ＲｅｃＡ介在ダブル Ｄループハイブリダイゼーション反応物（熱変性された２８０−マープローブお よび上記のようなコファクターを含有する）を、アガロースゲル上に電気泳動に より分離した。このゲルを臭化エチジウム（Ｍａｎｉａｔｉｓら）により染色し た。このゲルの写真を、図１６に示す。このゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光 させた。

図１７は、図１６に示した乾燥ゲルのオートラジオグラフである。図１７中のレ ーンは、次の反応条件に対応する。ＲｅｃＡに関して：レーン２はＲｅｃＡなし ：レーン１．３−７は、＋ＲｅｃＡ、コファクターに関して：ＡＴＰγＳはレー ン１および２　；ｒＡＴＰはレーン３および４　、ｄＡＴＰはレーン５および６ 　；ＧＴＰγＳはレーン７゜レーン３および５は、ＡＴＰ再生系［６ｍＭクレア チンリン酸、ＩＯＵ／１ホスホクレアチンキナーゼ（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏ ｕｉｓ　ＭＯ）、および１００ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄ ｉｓｏｎ　ＷＩＧ］もまた含有する。全反応条件は上記の通りであった。

この試料の起点を、図１６および図１７に示す。図１７Ｉこ示された結果から見 られ得るように、安定なダブルＤ）レープ複合体は、１０．１ｋｂラムタ襟的フ ラグメントの位置に対応するラベルされたバント責矢印）により示されるように 、各コファクターの存在下で形成された。

尖立匠上上 ＡＴＰＳまたはＡＴＰＳおよびｒＡＴＰの゛　４　を　るＲｅｃＡダブルＤルー プ／−イブリダイゼーンヨン　店この実施例では、ＲｅｃＡタン、４り質コーテ ィング反応（こス１するコファクターとしてＡＴＰγＳまたはＡＴＰγＳ／ｒＡ ＴＰの混合物を用いるダブルＤループ複合体の形成を記述する。

この反応条件は実施例１０で記載した通りであった。図１８に、電気泳動により 分離した除タンパク質化ＲｅｃＡ介在ダブルＤループハイブリダイゼーション反 応物の成分（熱変性された５ｏ。

−マープローブ（表１　）２０ｎｇを用いた）が載った、臭化エチジウム染色ア ガロースゲルの写真を示す。このプローブを３２ｐで末端ラベルした。このゲル を乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。

図１９に、図１８中の乾燥ゲルのオートラジオグラフを示す。

図１つ中のレーンは、次の反応条件に対応する。レーン１，３、および５−−Ａ ＴＰ７　Ｓコ−ｙ　ｙフタ−（１，２＋＊Ｍ）；レ−７２，４、および６−−Ａ ＴＰγＳコフアクターとｒＡＴＰコファクターとの組み合せ（それぞれ、０．７ ３ｍＭおよび０．５ｍＭ）。レーン１．２および３．４−一反応はλ／Ａｐａｌ 標的ＤＮＡ消化物（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の２種の異なる ロフトを用いて行った。レーン５および６の反応はえ／Ｄｒａ［標的ＤＮＡ消化 物を用いた。全反応物は、標的ＤＮＡ混合物１．５μｇを含有した。全反応物中 のＲｅｃＡ濃度は、６．８５μＭであった。全濃度は、最終容量２０μｍを基準 にしたものである。全反応条件は上記の通りであった。

ごの試料の起点を、図１８および図１９に示す。図１９に示された結果から見ら れ得るように、安定なダブルＤループ複合体は、１０．１ｋｂおよび８．４ｋｂ ラムダ標的フラグメノトの位置に対応するラベルされたバンド（矢印）により示 されるように、それぞれのコファクターの存在下で形成された。

本発明は、特定の方法および具体例に関して記載しているが、本発明から逸脱す ることなく、多様な修飾および改変がなされ得る。

支流１」」− 均：１」Ｌ乙ヱｊΔ− Ａ、ラムダＤＮＡ標的のラベルリング キャプチャー反応の評価を促進するために、ラムダＤＮＡ（ＢＲＬ）（５分間６ ５６Ｃで加熱された）を、フレノウ充填反応を用いて３２Ｐで末端ラベルした。

このラベルされた反応物は、１０μｍ　１０ｘ　フレノウ緩衝液（５０μｌＭ　 ）リスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０１Ｍ／β−メルカプ トエタノール）、８μｌ　１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、５μ！［α−”’　 Ｐ　］−ｄＣＴＰ、１８．３μｍ０．８２μｇ／μｍラムダＤＮＡ、　２μ１５ Ｕ／μｌ　フレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｊａ）および５６．７ μｍ　ｄｄＨ２０を含有した。３７℃で３０分間インキュベーションした後、こ の反応物を、１ｗ＋１　シリンジ中の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒｉ ａｃｉａ）カラムに通し、ラベルしたＤＮＡを０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃの存在下で エタノールで沈澱させ、２０ｍＭ　）リス）ＩｃＩ　ｐＨ７，５，０，１ｓＭ　 ＥＤＴＡ（ＴＥ）に再懸濁させ、そして、再びエタノールで沈澱させた。

この乾燥したＤＮＡベレットを、４５μｌ　ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。

このＤＮＡ′ａｌｔを分光光度計の２６０ｎｍにおける吸光度により決定した。

（以下余白） Ｂ、ＤＮＡプローブ合成およびビオチン化ラムダゲノムの１０００ｂｐ領域を、 熱サイクルＰＣＲの標準プロトコルを用いて合成した。反応は、２種の化学的に 合成されたプライ７−　（ＰＣＲＯ２およびＰＣＲＯｌｏｏＯ（配列：　５’　 ＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡ　３’、ラムダゲノム上 の塩基６６３１から６６５５を含有する））、全４種のｄＮＴＰ前駆体およびＴ ａｇ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。合成された１０００− マーＤＮＡ　（ラムダ塩基６６３１から７６３０を含有する）を、５ｅｐｈａｄ ｅｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通して遠心分離し、そして、エ タノール沈澱（２×）によりＤＮＡを回収した。この１０００−マーＤＮＡをＴ Ｅ緩衝液に再懸濁させ、そして、この濃度を２６０ｎｌのＯＤ測測定より決定し 、そしてＤＮＡＤｉｐｓｔｉｅｋ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて確認した 。精製された１０００−７−　を、ＢＲＩ　Ｎ１ｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ 　５ｙｓｔｅ＋＊を用いて、ｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰ　（Ｇｌｃｏ−ＢＲＬ）で ラベルした。　ＢＲＬプロトコルをわずかに改変し、推奨された量の２倍量の酵 素混合物を加え、１時間１５分間、１５−１６℃でインキュベートすることによ り、３００−５００塩基の平均サイズの一重鎖ＤＮＡプローブが得られた。ニッ クトランスレート化プローブを０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃエタノール溶液で沈澱させ 、ＴＥ中に再懸濁させた後、ＤＮＡ濃度をＤＮＡ　Ｄｉｐｓｔｉｃ”（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ＞を用いて決定した。

Ｃ，プローブのＲｅｃＡ−コート化およびプローブ：標的ハイブリダイゼーショ ン 上記−重鎖のニックトランスレート化プローブを、ｔＯＸ　酢酸反応緩衝液（Ｃ ｈｅｎｇら、ＬＳＢ［Ｉ）　ｌ　ｕ　Ｌ、３．２４ｍＭ　ＡＴＰ　７　Ｓ（Ｓｉ ｇｍａ）１．５μｍ、ｒｅｃＡ（２，７６μｇ／μＩ）０．６μｌ、無菌ｄｄ） Ｉ２０４．４μｍ、および熱変性ＤＮＡプローブ（１５ｎｇ／μＩ）２μｍを含 有する反応混合溶Ｍ中で、ｒｅｃＡタンパク質を用いてコートした。このＤＮＡ プローブを、５分間１００°Ｃで熱変性させ、氷水洛中で急冷し、Ｔｏｍｙ　ミ クロ遠心分離機を用いて４℃で２０秒間液体を集めるために遠心分離し、その後 、これを適切に分割したアリコートを、他の反応成分を含有する混合物に直ちに 加えた。プローブを加えた後のｒｅｃＡでコーティングされた反応混合物の総容 量は、１０μｌであった。このプローブ混合物を１５分間３７℃でインキュベー トし、次いで１０ｘ　酢酸反応緩衝液４μｍ、　０．２Ｍ　Ｍｇ０Ａｃ４μｌ、 ３２ｐでラベルした全二重鎖ラムダＤＮＡ（２８０ｎｇ／μｌ：あらかじめ５分 間６５℃で加熱した）４μｍ、およびｄｄＨ２０２８μｌを含有するラムダ標的 ＤＮＡ混合物１０μｍを加えた。このｒｅｃＡ介在ハ介在ハイブリダイブ−２３ フ ートし、そしテ３（ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐ）ＩＢ．０＞　１．３μｌを最終濃 度が〜ｚＯｍＭになるように加えた。次いで、これに、最終塩濃度が０．５Ｍと なるように、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を有する２０μｌＭトリス酢酸緩衝液ｐＨ７、５ を２１μｌ加えた。３つのコントロール反応物をラムダプローブを含有する上記 ｒｅｃＡ反応物と共に反応させた。第１のコントロール反応物は、ｒｅｃＡタン パク質を含有せず、その代わりにｒｅｃＡ保存緩衝液を等重加える以外は、ｒｅ ｃＡ反応物と同様に行った。池の２つのコントロール反応物は、ラムダプロー− ｊを等量のラベルしていない二９，クトランスレート化φｘ１７４ＤＮＡ　ＲＦ ［　ＤＮＡ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）と置換する以外は、ラムダプローブを含有す る実験と同様に行った。使用の約５分前、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　’：）　（ｄｙ ｎａｌ）　３００ｍ１を２０ｍＭ　）リス酢酸ｐ１１７．　５、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ １で３回洗浄した。上記ビーズを磁気分離ラック（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で収集す ることにより洗浄緩衝液を除去し、そして、それぞれのハイブリダイゼーション 反応物（０．５Ｍ　ＮａＣ１中の）を、洗浄したビーズのアリコート（１００ｕ ｌ）に、ミクロ遠心管の中で加え、このビーズを反応液体中で再懸濁させるため に時おりやさしくこの管を振とうしながら、３０分間室温でこのビーズをインキ ュベートした。捕捉後、この液体を除去し、このビーズを、１００μｍの２０ｍ Ｍ　）リス酢酸ｐ）１７．５、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１で３回洗浄した。

Ｐａｃｋａｒｄ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎカウンターの５ａｆｅｔｙ−Ｓｏ ｌｖｅ（ＲＰＩ　Ｃｏｒｐ．　）中でカウントすることにより、ビーズ上のおよ び洗浄液中の放射活性を測定した。これらの実験の結果を、表３に示す。

（以下余白） 表３．　ｒｅｃＡでコートされたビオチン化相補的ラムダＤＮＡプローブとのダ ブルＤルーブハイブリダイゼーンヲン反応は、磁気ビーズ上の二本鎖〜５０ｋｂ ラムダウィルス標的ＤＮＡの特異的捕捉を可能にする。

反応　−重鎖ＲｅｃＡタンパク質　３２ｐでラベルしたプローブＤＮＡ　、ラム ダＤＮＡ 標的の 捕捉％ １　ラムダ　＋　４５．９ ２　ラムダ　３．７ ３　φＸ１７４’　＋　３゜６ 表３の説明：ビオチン化（ｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰでニックトランスレートした ）ラムダＤＮＡプローブ、または非ラベル化（ｄＡＴＰで二・ツクトランスレー トした）φＸ１７４　ＲＦＩ　プローブ、および、３２ｐでラベルした全ラムダ ゲノムＤＮＡ標的物を用いた、ＲｅｃＡ介在ダブル［）ルーフ反応を実施した。

ニックトランスレージコンにより得られた一重鎖プローブは、平均して３００− ５００塩基サイズであり、ラムダＤＮＡプローブは、全てラムダウィルスゲノム の隣Ｆａ　１０００ｂｐ領域に相同であった。ＲｅｃＡでコートされたＳＳブロ ーフヲ、３７℃で１時間、うＬダ標的ＤＮＡと反応サセ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡお よび０．５Ｍ　ＮａＣ１で処理し、新しく洗浄されたストレプトアビジンでコー トされた磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ■（Ｄｙｎａｌ）上でアフィニティー捕捉を行 った。捕捉されなかったＤＮＡを反応混合物から洗浄により除去した。洗浄後に ビーズ上に残存する３２ｐでラベルしたラムダＤＮＡの％を、ンンチレーション 計測によす決定した。ｒｅｃＡタンパク質なしで、および／または、プローグと して　φＸ１７４　ＤＮＡ配列を有する反応物を、コントロールとしたく詳細は テキストおよび方法を参照）。この結果は、ニックトランスレート化プローブと 大きな二本鎖標的ＤＮＡとの間に形成されたダブルＤループハイブリッドが特異 的に捕捉され、磁気ビーズで検出され得ることを示している。

Ｄ、シグナル増幅 標的物がラベルされていない時に捕捉された標的ＤＮＡを検出する目的に、およ び／または、低いコピー数の標的を検出するだめのシグナルを増幅する目的で、 付着した捕捉されたＤＮＡを有する洗浄されたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏを、１× 　Ｔ７緩衝液（１０×緩衝液：　４００ｍＭ　トリスＨＣＩ　ｐＨ７，５，１１ ００ｒａ　ＭｇＣｌ２．５０ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ）で１回洗浄し、そして、ｄｄＨ２ ０３１，１μＩ、１０ｄ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰをそれぞれ０． ５μ＋、０．５３ｍＭ　ｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰ（ＢＲＬ）　９．４μｍ、およ び０８ｄＭのポリ（Ａ＞プライマー［配列：５’　Ａ＋５ＡＴＡＣＧＧＣＴＧＡ ＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＧＧＣ３’　ニラムダゲノム上の番号８００１から８０２ ３の塩基（ポリ（Ａ）ラベルなし）を含有する１２μｍを含有する増幅反応混合 物４４μｌ中に再懸濁させた。このプライマー標的ＤＮＡ混合物を、１００℃で ５分間加熱し、そして、〜１０分間で、〜３７°Ｃに冷却した。次いで、以下を 添加した；　ＩＯＸ　Ｔ７緩衝液５μｌ、１３Ｕ／μｌ　Ｔ７５ｅｑｕｅｎａｓ ｅＯＶｅｒｓｉｏｎ　２．０（ＵＳＢ）　０．５μｌ、および最終容量が５０μ ｍとなる量のｄｄＨ２０゜そして、０．３ＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，０を５μｍ添加 して反応を停止させる前に、この反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートした 。

Ｅ、／グナル検出 プライマー合成されたＤＮＡへのｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰの取り込みを、Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ”（Ｔｒｏｐｉｘ）化学発光アッセイを用いて検出した 。Ｔ７酵素を有するおよび有しない増幅反応物由来のＤＮＡをＴＥで適量に希釈 し、そして、ＤＮＡ混合物１μｌを１２．５ｍＭ　ＥＤＴＡを有する、２００ｍ Ｍ　ＮａＯＨ４μｍに加え、５から１０分間室温でインキュベート腰　そして、 プラスチックラップ上の乾燥Ｔｒｏｐｉ１ｏｎ−４５”ナイロン膜」二に滴下し た。ＤＮＡのスボ、トを風乾し、乾燥した膜を３ＭＭ　ＣＨＲｆｆｈａｔｍａｎ ）クロマトグラフ紙上に移し、２０Ｘ　ＳＳＣをナイロン周縁の３ＭＭ紙の上に 滴下した。ＤＮＡド、１・が濡れた時に、゛自動”にセットされたＳｔｒａｔａ ｇｅｎｃ　５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒを用いて、ＤＮＡを膜に架橋した。ナイロ ン膜を２０Ｘ　ＳＳＣで充分に濡らし、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ”（Ｔｒ ｏｐｉｘ）ビオチン化ＤＮＡ検出手法を、ＡＶＩＤｘ−ＡＰ（アルカリ性ホスフ ァターゼ＋Ｔｒｏｐｉｘ）およびＡＭＰＰＤ基質とともに、製造者が推奨するプ ロトコールに従って用いた。化学発光を、Ｃａｍｅｒａ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ ｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）およびＰｏ１ａｒｏｉｄ　６１２フイルムを用いて検出した 。Ｔ７５ｅｑｕｅｎａｓｅ○を有するおよび有しない反応物の結果の比較で、ビ オチンがＤＮＡに取り込まれ、簡単に化学発光アッセイを用いて検出可能である とことが示された。もし、検出に、間接ラベル検出方法（すなわち、ＦＩＴＣの ような取り込まれたラベルの直接検出よりむしろ、検出のためにＡｊ／ＩＤｘ− ＡＰと反応させたビオチンラベル）、および、ビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　＠ 　、　Ｄｙｎａｌ　；オリゴ（ｄＴ）ビーズ。

Ｐｒｏｍｅｇａｌまたはマトリックス［例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロース、　 ＳｊＨｔａｇｅｎｅポリ（Ａ）　Ｑｕｉｃｋ”］上で行われる検出工程を用いた なら、捕捉マトリックスへの検出試薬の非特異性粘着をプロ、りするために、捕 捉マトリックスをいくつかの薬剤ととともにインキュベートしなければならない （１−Ｂｌｏｃｋ試薬混合物（ブロッキング緩衝液：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｌｊｇ ｈｔ”（Ｔｒｏｐｉｘ））はこの目的で用いられる）。付着したＤＮＡと共に洗 浄されたビーズ［またはｔ　ｌ／ゴ（ｄＴ）セルロース］を、プロ、キング緩衝 液中で１回洗浄し、次いで１０から３０分間ブロッキング緩衝液中でインキュベ ートし、洗浄およびＡＶＩＤｘ−ＡＰ（Ｔｒｏｐｊｘ＞の添加を行った。

余剰の結合していないＡＶＩＤに−ＡＰを、Ｔｒｏｐｉｘプロトコールに従って 洗浄することにより除去した。捕捉マトリ・ノクスを、基質検出物に適合する緩 衝液を用いて洗浄した（アツセイ緩衝液（Ｔｒｏｐｉｘ）が、化学発光による検 出のために使用され得る：あるいはＪＢＬ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＡＴＴＯＰ ＨＯＳシステムのような蛍光による検出のためには、それに適した緩衝液が使用 され得る）。

基質を加え、ＤＮＡ結合ＡＰを適切な手法により検出する。

（ｌゾ丁侘ｈ） 獣歿轟 （１）一般的情報： （ｉ）　出願人：　セナ、　エリノサ　ビー。

カルホウン１　コ一不リア　ジェイ。

イーリング。ディピッド　エイ。

（ｉｔ）発明の名称：　ダブルＤループ形成の診断応用（ｉｉｉ）配列数＝　２ （Ｂ）番地：　スィート３００．ケンブリッジ　アベニニー　３５０（Ｃ）市： 　パロ　アルド （Ｄ）州：　カリフォルニア （Ｅ）国：　アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４３０６ （Ｖ）フンビニ−クー読み出し形態 （Ａ）ＩＩＩＫ体型：　フロノピーディスクバージッン＃　１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）優先権主張の出願データ： （Ｂ）登録番号：　３３．８７５ （Ｃ）照会、／記録番号：　４２５５−０００１．３２（ｕ）ｍ１話回線情報 （Ａ）電話：　（４１５）　３２４−０８８０（Ｂ）テレファックス：　（４１ ５）　３２４−０９６０（２）配列番号ｌの情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５００塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｔ＞配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｆｉｔ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　ＬＡＭＢＤＡ（ラムダ）（ｖ　ｉ　ｉ　Ｄゲノム内での位置： （Ａ）染色体／セグメント名＝５００塩基対（Ｂ）染色体上の位１ｉ　７１３１ から７６３０（Ｃ）単位：ｂｐ （ｘｉ）配列：配列番号＝１＝ ＾ＣＧＣＣＡＣＣＣ（ｌｉ　ＧＧ入τＣ入ＡＣＣＴ　ＧＴＣＧＣＡτττＧ　Ｔ ＧＣＴＣＣＣＧＧＣ，λ＾ＣＧＧＣＧＴττＣａτＧτＣＴbＴＧ　４２０ ＣＣＧＣ；ＴＧτＧＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡ’Ｌ’Ｇ　ＡＣＡＣＡＣＣＣＣＧ　Ｇ ＣＣＴＧＧＣＣＡＧ　入ＡＴＧＣＡＡτＡＡ　ＣにＧｏ八Ｇ■bにＣ４８０ ＴＧＴＧＧＣＴＧ＾丁ＴＴＣＣＡＴＡＡＣＣ５００（２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　４塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。

（ｖｉ）起源： （Ｃ）個体・単離クローン名：　Ｄｐｎｌの切断部位（ｘｉ）配列：配列番号： ２： ＧＡＴＣヰ １２３４　５６７８Ｍ ｒ−ｆ）− ｐｉｇ、７ Ｆｉｇ、５？、Ａ ｙｉｇ、９Ｃ Ｆｉｇ、９Ｅ ｐｉｇ、９Ｆ Ｆｉｇ、９Ｇ Ｆｉｇ、１０Ｂ 獲　エ Ｆｉｇ、１３Ａ ネ灸已生版吻Ｄ］’ＴＡ　ング灼し ０　捧九訃な ｇ・轡・　÷−％＃　−ν　―・・ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する、第一鎖および第二鎖を有する直鎖状 二重鎖ＤＮＡ分析物を検出する診断方法であって、以下の工程を包含する方法： 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２種のＤＮＡプローブのセット を提供する工程であって、該第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第 一標的配列鎖および第二標的配列鎖に相補的な配列を含有し、そして（ｉｉ）こ こで、該相補的な配列は、該プローブ鎖間で相補的重複部分をさらに含有する； ＲｅｃＡタンパク質コーティング反応において、ＲｅｃＡタンパク質により該プ ローブをコートする工程；該ＲｅｃＡでコートされたプローブを、該プローブ鎖 および両方の標的鎖を含有するプローブ：標的複合体が生じる条件下で、該標的 配列を含有する該直鎖状二重鎖ＤＮＡと結合させる工程であって、該複合体は除 タンパク質化に安定である；および該プローブ：標的複合体中の該ＤＮＡプロー ブの存在を検出する工程。 ２．前記ＤＮＡプローブがニッタトランスレーションにより調製される、請求項 １に記載の方法。 ３．前記コーティング反応が、ＡＴＰγＳ、ｒＡＴＰ、ｄＡＴＰ、およびＧＴＰ γＳからなる群から選択されるコファクターを含有する、請求項１に記載の方法 。 ４．前記コファクターがｒＡＴＰであり、前記反応がＡＴＰ再生系の存在あるい は欠如において実施される、請求項３に記載の方法。 ５．前記コファクターが、ＡＴＰγＳおよびｒＡＴＰの混合物、または、ＡＴＰ γＳおよびＡＤＰの混合物である、請求項１に記載の方法。 ６．前記コファクターがＡＴＰγＳである、請求項３に記載の方法。 ７．前記コファクターがｄＡＴＰである、請求項３に記載の方法。 ８．前記ＲｅｃＡタンパク質が、Ｅｓｃｈｅｒｉｏｈｉａ　ｃｏｌｉの野生型タ ンパク質である、請求項１に記載の方法。 ９．前記ＲｅｃＡタンパク質が、Ｅｓｃｈｏｒｉｏｈｉａ　ｃｏｌｉのｒｅｃＡ −８０３タンパク質である、請求項１に記載の方法。 １０．前記プローブ鎖間の相補的重複部分の領域が、少なくとも約７８塩基対で あり、多くとも約５００塩基対である、請求項１に記載の方法。 １１．プローブ鎖が、どちらかの標的鎖に相補的でないＤＮＡの末端伸長を含有 する、請求項１に記載の方法。 １２．それぞれのプローブ鎖が末端ＤＮＡ伸長を含有し、該ＤＮＡ伸長が互いに 相補的である、請求項１１に記載の方法。 １３．プローブ鎖が放射性部分を含有する、請求項１に記載の方法。 １４．前記検出する工程が、前記プローブ：標的複合体の除タンパク質化、次い で遊離のプローブからの該プローブ：標的複合体の電気泳動分離により達成され る、請求項１３に記載の方法。 １５．前記第一プローブ鎖が捕捉部分によりラベルされ、第二プローブ鎖が検出 部分によりラベルされる、請求項１に記載の方法。 １６．前記捕捉部分がビオチンであり、前記プローブ：標的複合体の捕捉がスト レプトアビジンを用いて達成される、請求項１５に記載の方法。 １７．前記ストレプトアビジンが固体支持体と結合する、請求項１６に記載の方 法。 １８．前記第二プローブ鎖が、放射性ラベルおよびジゴキシゲニンからなる群か ら選択される検出部分を含有する、請求項１６に記載の方法。 １９．前記検出部分がジゴキシゲニンであり、レセプター部分を含有する抗ジゴ キシゲニン抗体を用いて該ジゴキシゲニンの存在が検出される、請求項１８に記 載の方法。 ２０．制限フラグメント多形性を検出するために、前記両方のプローブ鎖を含有 する前記プローブ：標的複合体を用いて既知の制限部位を保護する工程、および 前記標的ＤＮＡの制限酵素切断から得られるフラグメント化パターンを検査する 工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 ２１．前記保護が、プローブ：標的複合体の除タンパク質化前の制限酵素による 消化により達成される、請求項２０に記載の方法。 ２２．前記保護が、ＲｅｃＡタンパク質コーティング反応において前記２種のプ ローブ鎖をＲｅｃＡタンパク質でコーティングする前に、該両方のプローブ鎖の メチル化により達成される、請求項２０に記載の方法。 ２３．前記検出方法が、一方のまたは両方のプローブ鎖に、標的ＤＮＡを切断し 得る部分を付着させて、前記プローブ：標的複合体を形成し、そして該切断性部 分により標的ＤＮＡの切断が行われる反応条件を作り出すことにより、該標的Ｄ ＮＡの切断が達成される、制限フラグメント多形性分析をさらに包含する、請求 項１に記載の方法。 ２４．前記切断性部分が鉄ＦｅＩＩ分子である、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記切断性部分が、非特異性ホスホジエステラーゼおよび制限エンドヌク レアーゼからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。 ２６．前記検出方法が、前記プローブ：標的複合体を形成し、一方のまたは両方 のプローブ鎖に標的ＤＮＡを切断し得る部分を付着させ、そして該切断性部分に より標的ＤＮＡの切断が行われる反応条件を作り出すことにより、該標的ＤＮＡ の切断が達成される、制限フラグメント多形性分析をさらに包含する、請求項１ に記載の方法。 ２７．前記検出工程が、一方または両方のプローブ鎖の３′末端からのＤＨＡポ リメラーゼで促進されたプライマー伸長により達成される、請求項１に記載の方 法であって、該プライマー伸長が、４種のｄＮＴＰ全部、および、検出可能な部 分を含有する１種またはそれより多いＤＮＡＴＰの存在下でなされる、方法。 ２８．請求項１に記載の方法であって、第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を 有する、第２の二重鎖標的配列に相補的な２つのＤＮＡプローブの第２のセット を提供する工程をさらに包含する方法であって、該第一プローブ鎖が、第２の標 的配列の一方の鎖に相補的な配列を含有し、該第二プローブ鎖が、第２の標的配 列の他の鎖に相補的な配列を含有し、（ｉ）該プローブも互いに相補的に重複す る領域を有し、そして（ｉｉ）該第２のプローブのセットが、該第１のプローブ のセットにハイブリダイズしない。 ２９．前記ＤＮＡプローブがニッタトランスレーションにより調製される、請求 項２８に記載の方法。 ３０．前記第１のプローブのセットが捕捉部分によりラベルされ、第２のプロー ブのセットが検出部分によりラベルされた、請求項２８に記載の方法。 ３１．前記捕捉部分がビオチンまたはジゴキシゲニンである、請求項３０に記載 の方法。 ３２．前記検出部分が、放射性ラベル、ビオチン、およびジゴキシゲニンからな る群から選択される、請求項３０に記載の方法。 ３３．前記検出工程がさらに、前記プローブ：標的複合体をトラップする捕捉系 の使用を包含する、請求項３０に記載の方法。 ３４．前記捕捉系が一方のプローブのセットのビオチン化を包含し、前記捕捉が ストレプトアビジンの使用により達成される、請求項３３に記載の方法。 ３５．ストレプトアビジンが固体支持体と結合する、請求項３４に記載の方法。 ３５．前記２種のプローブのセットが前記標的ＤＮＡの内部領域を規定し、それ ぞれのプローブのセットが、前記領域内部の３′末端および該領域外部の３′末 端を含有する１つの鎖を有する、請求項２８に記載の方法。 ３７．前記検出工程が、それぞれのプローブ鎖の３′末端からのＤＮＡポリメラ ーゼで促進されたプライマー伸長により達成される、請求項３６に記載の方法で あって、該プライマー伸長反応が、４種のｄＮＴＰ全部、および、検出可能な部 分を含有する１種またはそれより多いｄＮＴＰの存在下でなされる、方法。 ３８．前記それぞれのプローブ鎖の外部の３′末端が、外部の３′末端からのプ ライマー伸長が可能ではないように阻害される、請求項３７に記載の方法。 ３９．前記プライマー伸長反応が、前記２本の標的鎖の熱解離に必要な温度以下 でなされ、前記標的配列の所望程度の増幅が達成されるまで続けられる、請求項 ３８に記載の方法。 ４０．前記反応工程がＤＮＡポリメラーゼのさらなる追加を包含する、請求項３ ９に記載の方法。 ４１．前記反応工程がＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブのさらなる追 加を包含する、請求項３９に記載の方法。 ４２．第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する、第一鎖および第二鎖を有する直鎖 状二重鎖ＤＮＡ分析物を検出する診断方法であって、以下の工程を毎合する方法 ： 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２種のＤＮＡプローブのセット を提供する工程であって、該第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第 一標的配列鎖および第二標的配列鎖に相補的な配列を含有し、そして（ｉｉ）こ こで、該相補的な配列は、該プローブ鎖間で相補的重複部分をさらに含有する； ＡＴＰγＳを含有するＲｅｃＡタンパク質コーティング反応において、ＲｅｃＡ タンパク質により該プローブをコートする工程；該ＲｅｃＡでコートされたプロ ーブを、該プローブ鎖および両方の標的鎖を含有するプローブ：標的複合体が生 じる条件下で、該標的配列を含有する該直鎖状二重鎖ＤＮＡと結合させる工程で あって、該複合体は除タンパク質化に安定である；および該プローブ：標的複合 体中の該ＤＮＡプローブの存在を検出する工程。 ４３．前記ＤＮＡプローブがニッタトランスレーションにより調製される、請求 項４２に記載の方法。 ４４．第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する、第一鎖および第二鎖を有する直鎖 伏工重鎖ＤＮＡ分析物を検出する診断方法であって、以下の工程を包含する方法 ： 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２種のＤＮＡプローブのセット を提供する工程であって、該第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第 一標的配列鎖および第二標的配列鎖に相補的な配列を含有し、そして（ｉｉ）こ こで、該相補的な配列は、該プローブ鎖間で相補的重複部分をさらに含有する； ＡＴＰを含有するＲｅｃＡタンパク質コーティング反応において、ＲｅｃＡタン パク質により該プローブをコートする工程；該ＲｅｃＡでコートされたプローブ を、該プローブ鎖および両方の標的鎖を含有するプローブ：標的複合体が生じる 条件下で、該標的配列を含有する該直鎖状二重鎖ＤＮＡと結合させる工程であっ て、該複合体は除タンパク質化に安定である；および該プローブ：標的複合体中 の該ＤＮＡプローブの存在を検出する工程。 ４５．前記ＤＮＡプローブがニッタトランスレーションにより調製される、請求 項４４に記載の方法。 ４６．第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する、第一鎖および第二鎖を有する直鎖 状二重鎖ＤＮＡ分析物を単離する方法であって、該二重鎖ＤＮＡ分析物が核酸分 子の混合物中に存在し、以下の工程を包含する方法： 第一プローブ鎖および第二プローブ組を有する、２つのＤＮＡプローブのセット を提供する工程であって、該第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第 一標的配列鎖および第二標的配列鎖の相補的配列を含有し、そして（ｉｉ）ここ で、該相補的な配列は、該プローブ鎖間で相補的重複部分をさらに含有する； ＲｅｃＡタンパク質コート反応において、ＲｅｃＡタンパク質により該プローブ をコートする工程； 該ＲｅｏＡでコーティングされたプローブを、該プローブ鎖および両方の標的鎖 を含有するプローブ：標的複合体が生じる条件下で、該標的配列を含有する該直 鎖状二重鎖ＤＮＡと結合させる工程であって、該複合体は除タンパク質化に安定 である；該核酸分子の混合物から該プローブ：標的複合体を分離する工程；およ び 該プローブ：標的複合体から、該標的配列を含有する該二重鎖ＤＮＡ分折物を単 離する工程。 ４７．前記ＤＮＡプローブがニッタトランスレーションにより調製される、請求 項４６に記載の方法。 ４６．前記プローブが固体支持体と結合する、請求項４５に記載の方法。 ４９．前記プローブが少なくとも１つのビオチン部分を含有する、請求項４６に 記載の方法。 ５０．前記分離工程が、ストレプトアビジンの使用により達成される、請求項４ ９に記載の方法。 ５１．前記ストレプトアビジンが固体支持体と結合する、請求項５０に記載の方 法。 ５２．前記単離工程が、（ｉ）前記複合体から前記標的配列を含有する前記二重 鎖ＤＮＡ分析物を放出させるに充分な、そして（ｉｉ）該標的配列を含有する該 二重鎖ＤＮＡ分析物の融解温度より低い温度で、前記プローブ：標的複合体の熱 変性をさらに含有する、請求項４６に記載の方法。 ５３．前記二重鎖ＤＮＡ分析物が一本鎖ＤＮＡに変性された、請求項５２に記載 の方法。 ５４．前記単離工程が、（ｉ）前記複合体から前記標的配列を含有する前記二重 鎖ＤＮＡ分析物を放出させるに充分な、そして（ｉｉ）該標的配列を含有する該 二重鎖ＤＮＡ分析物の融解温度またはそれ以上の温度で、前記プローブ：標的複 合体の熱変性をさらに含有する、請求項４６に記載の方法。 ５５．第１の内部ＤＮＡ標的配列を含有する、第一鎖および第二鎖を有する直鎖 状二重鎖ＤＮＡ分析物を検出する方法であって、該二重鎖ＤＮＡ分析物が核酸分 子の混合物中に存在し、請求項４６に記載の該直鎖状二重鎖ＤＮＡ分析物を単離 する工程であって、該単離工程が、（ｉ）前記複合体から前記標的配列を含有す る前記二重鎖ＤＮＡ分析物を放出させるに充分な、そして（ｉｉ）該標的配列を 含有する該二重鎖ＤＮＡ分析物の融解温度またはそれ以上の温度で、前記プロー ブ：標的複合体の熱変性をさらに含有する、工程； 該標的配列に相補的な、５′および３′末端を有する、少なくとも１種のＤＮＡ 合成プライマーを添加する工程であって、該プライマーは前記２種のＤＮＡプロ ーブのどちらかにおいて存在する配列を含有しない；を包含し、そして、該ＤＮ Ａ分析物の検出が、該プライマーの３′末端からのＤＮＡポリメラーゼで促進さ れたプライマー伸長により達成され、該プライマー伸長が、４種のｄＮＴＰ全部 、および、検出可能な部分を含有する少なくとも１種のｄＮＴＰの存在でなされ る、方法。 ５６．前記ＤＮＡプローブがニックトランスレーションにより調製される、請求 項５５に記載の方法。 ５７．前記プライマー鎖が、いずれかの標的鎖に相補的でないＤＮＡの末端伸長 を含有する、請求項５５に記載の方法。 ５８．少なくとも１種のＤＮＡ合成プライマーが捕捉部分を含有する、請求項５ ５に記載の方法。 ５９．前記検出が、前記捕捉部分および前記検出部分を含有する前記プライマー 伸長産物の生成をさらに包含し、該産物が該捕捉部分を用いて単離される、請求 項５８に記載の方法。