JPH06510188A

JPH06510188A - 推定ｈｃｖ　ｎｓ５タンパクに対するモノクローナル抗体およびそれを使用する方法

Info

Publication number: JPH06510188A
Application number: JP5504551A
Authority: JP
Inventors: メフタ，スムリテイ・ユー; ジヨンソン，ジル・イー; デイリー，ステイーブン・エイチ; デイサイ，シユアシユ・エム; デイベア，スーシル・ジー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-08-21
Filing date: 1992-08-21
Publication date: 1994-11-17
Also published as: GR3029320T3; DE69227776D1; EP0599913A1; EP0599913A4; EP0599913B1; DE69227776T2; DK0599913T3; CA2112667C; WO1993004084A1; ES2126598T3; CA2112667A1; AU2501392A; ATE174060T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１０、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　１０８５４ハイブリドーマ細胞系。

１１、ＨＣＶを含んでいる可能性のある試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定する方法であって、ａ、固相に固定されておりＨＣＶ　ＮＳ５抗原と特異的に結合する、少なくとも１種の抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体と試験サンプルとを接触させて混合物を形成させ、ｂ、前記混合物を抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、Ｃ１抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体と結合しており検出可能で定量可能なシグナルを発生し得るシグナル発生性化合物からなる指示試薬と前記複合体とを接触させて第２の混合物を形成させ、ｄ、前記第２混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、ｅ、試験サンプル中のＨＣＶの存在量に比例して発生した測定可能なシグナルを検出することにより試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定することからなる方法。

１２、シグナル発生性化合物が発光性化合物、化学発光性化合物、酵素および放射性元素からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。

１３、固相に固定された抗−ｆ（ＣＶ抗体がポリクローナル抗体である請求項１２の方法。

１４゜前記固相に固定された抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体がモノクローナル抗体である請求項１２の方法。

１５、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡ、Ｔ、Ｃ。

Ｃ１寄託番号ＨＢ　１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。

１６、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡ、Ｔ、Ｃ９Ｃ０寄託番号ＨＢ　１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。

１７、前記指示試薬がポリクローナル抗体に結合したシグナル発生性化合物を含む請求項１１に記載の方法。

１８、前記指示試薬がモノクローナル抗体に結合したシグナル発生性化合物を含む請求項１１に記載の方法。

１９、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。

２０、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，寄託番号）（８１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。

２１、試験サンプル中に存在している可能性のあるＨＣＶの存在および量を決定する方法であって、ａ、固相に固定したポリクローナルまたはモノクローナル抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体、およびシグナル発生性化合物と結合しておりＨＣＶ　ＮＳ５と特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる指示試薬と試験サンプルとを接触させて混合物を形成させ、ｂ、前記混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、Ｃ６試験サンプル中のＨＣＶの存在量と比例して発生した測定可能なシグナルを試験サンプル中のＩ（ＣＶの存在の指標として検出することにより試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定することを含む方法。

２２、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２１に記載の方法。

２３、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　ｔ０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２１に記載の方法。

２４　試験サンプル中に存在している可能性のあるＨＣＶ抗体の存在および量を決定するコンペティティブアッセイ法であって、ａ、ＨＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試験サンプルを、ＨＣＶ　ＮＳ５タンパクを塗った固相ならびにシグナル発生性化合物およびＨＣＶ　ＮＳ５タンパクと特異的に結合するモノクローナル抗体からなる指示試薬と、試験サンプルと固相および／または指示試薬と固相の抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下で接触させ、ｂ、試験サンプル中のＨＣＶ抗体の存在を決定することは負の試験サンプルから発生したシグナルと比較した指示試薬と固相との結合の減少を検出して試験サンプル中のＨＣＶ抗体の存在とを示すことである方法。

２５、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ　丁。

ＣＣ寄託番号ＨＢ　１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。

２６、前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ、　ＴＣ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。

２７、ＨＣＶ　ＮＳ５抗原と特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を含む容器からなる、試験サンプル中のＨＣＶ抗原または抗体の存在を決定するためのアッセイキット。

２８、前記モノクローナル抗体が細胞系Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２７のアッセイキット。

２９、前記モノクローナル抗体が細胞系Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ寄託番号ＨＢ　１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２７のアッセイキット。

明細書本出願は１９９０年８月２４日に出願された米国特許出願番号第０７１５７２．８２２号および１９９０年１１月７日に出願された米国特許出願番号第０７／６１４．０６９号の同一出願人の一部継続出願であり、引用によりそれらの内容を本明細書中に含むこととする。

発明の背景本発明は一般に、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に特異的に結合する抗体に関し、より詳しくは特異的に推定＋（ＣＶタンパクＮＳ５と結合するモノクローナル抗体を分泌する一部の新規のハイブリドーマ細胞系およびこれらのモノクローナル抗体を使用する方法に関する。

黄痘を起こす肝臓病の記述は古くから人類に知られていた。

ウィルス性肝炎は現在、特有のウィルス性組織タンパク構造および複製モードを育しており、異なった感染ルートを介してさまざまな度合いの重症肝臓障害を伴う肝炎を引き起こす一部のウィルス性病原体を含むと知られている。急性ウィルス肝炎は、黄痩、肝臓の圧痛ならびにアスパルテートトランスアミナーゼおよびアラエントランスアミナーゼのような肝臓のトランスアミナーゼのレベル上昇レベルを含む患者の明確に定義された症状により臨床的に診断される。

今日の血清学的アッセイはＡ型肝炎とＢ型肝炎の間のさらなる区別に採用されている。非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）はＡ型肝炎ウィルスによってもＢ型肝炎ウィルスによっても引き起こされない輸血後の肝炎のケースで記述された１９７５年に初めて使用された用語である（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅ４．２９２＋４５４−４５７　（１９７５））。このＮＡＮＢＨの診断は主として、血清学的分析に基いてＡ型肝炎およびＢ型肝炎の存在を除外することによって行われている。ＮＡＢＡＨは輸血後肝炎の約９０％のケースに相当する（Ｈｏｉｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｉｎ　Ｎ、Ｒ。

５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，，５５８−５７２（１９８６）。

既知の肝炎ウィルスのうちの１つに対するゲノムの類似性によるＮＡＮＢＨウィルスの同定の試みは今までのところでは失敗してきたので、ＮＡＮＢＨウィルスは別のゲノム組織および構造を有することが示唆された（Ｆｏｗｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、１２：２０５−２１３　（１９８３）およびＷｅｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ。

２１　：　２３９−２４７　（１９８７））。ＮＡＮＢＨに特異的な抗体を検出するアッセイの開発の進展はこのウィルスに関連する抗原を同定する際に遭遇する困難によって阻止されてきた（Ｗａｒｄｓ　ｅｔ　ａｔ、、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ。

４．８７０，０７６；Ｗａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、８３　：６６０８−６６１２　（１９８６）；０ｈｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒ。

６２７７−６２８１　（１９８７）：Ａｋａｔｓｕｋａ　ｅｔ１９８８年５月にＣｈｉｒｏｎ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとＣｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌとの共同研究によりＮＡＮＢ病原体と推定されるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）が同定できた。Ｍ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等はチンパンジーの感染血漿から簿られたＮＡＮＢ病原体をＥ、ｃｏｌｉ中でクローン化し発現させた（Ｋｕｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｓｃｉ工９８９））。臨床学的にＮＡＮＢＨと診断された患者の大部分に存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードするＨＣＶ由来ｃＤＮＡ　（相捕的ＤＮＡ）配列が同定された。入手し得る情報およびＨＣＶの分子構造に基くと、このウィルスの遺伝子構成は分子量約９．５ｋｂの１重鎖線状ＲＮＡ　（プラス鎖）からなり、１つの連続した翻訳読取り枠（オープンリーディングフレーム）構造を有する（Ｊ、Ａ、Ｃｕｔｈｂｅｒｔ、Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、２９９：３４６−３５５　（１９９０））。これはワラビウイルスに類似した小さなエンベロープを有するウィルスである。研究者等は感染した個体の肝細胞の超微細構造の変化によってＮＡＮＢ病原体を同定することを試みた（Ｈ，Ｇｕｐｔａ、Ｌｉｖｅｒ　８：１１１−１１５　（１９８８）；Ｄ、Ｗ、Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０＋３０７−３１９（１９８５））、肝細胞中の同様な超微細構造の変化およびＰＣＲ増幅）ＩＣＶ　ＲＮＡ配列がＮＡＮＢＨ患者中および感染性のＨＣｖ血漿で実験的に感染させたチンパンジー中で検出された（Ｔ、Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、８７：６４４１−６４４４　（１９９０））。

ＨＣＶを輸血後のＮＡＮＢＨに対する病原因子として関係付けるかなりの血清学的証拠が見つけられた（Ｈ，Ａ］ｔｅｒｅｔ　ａｌｌ、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２１　：　１４９４−１５００　（１９８９）；Ｅｓｔａｂｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ：Ａｕｇ、５：２９４−２９６　（１９８９）；Ｃ，Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｐｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　Ａｕｇ、５：２９７−２９８　（１９８９）；Ｇ、５ｂｏｌ　Ｉ　ｉ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、３０＋２３０−２３２（１９９０）；Ｍ、Ｍａｋｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　３３５：１１１７−１１１９（１９９０）、ＨＣＶ抗体の検出によって血液供給系からのＮＡＮＢ）（感染血液の７０％〜８０％が排除されるとはいっても、これらの抗体はこの疾病の慢性状態の間に検出されやすく、一方、急性ＮＡＮＢＨ期からのサンプルでＨＣＶ抗体に陽性であるのはただ６０％のみである（Ｈ，ＡＩｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ。

Ｊ、Ｍｅｄ、３２１：１９９４−１５００　（１９８９））、これらのデータは明白に、ＨＣｖ感染の有効な血清診断のためには別のＨＣＶタンパクの同定の必要性があることを示している。

構造タンパクＣ０ＲＥおよび３３Ｃのクローニングおよび発現の後、ＮＡＮＢ患者中のＨＣＶ抗体の検出のためにＣ−１００に加えてＨＣＶ　Ｃ０ＲＥおよび３３Ｃを有利する第２世代抗体アッセイが開発された。この第２世代アッセイが顕著に検出の感度を向上させたとはいえども、ＨＣＶへの暴露と抗体の検出の間の長くなった間隔ならびにいろいろな構造および非構造タンパクに対する免疫応答の様子に関する適当な情報の欠如はＮＡＮＢＨ感染の間の抗体陰性期の患者の感染状態に関する問題を起こした。それゆえに、ＨＣｖの急性感染およびＨＣＶの存在を同定するアッセイ系を開発する必要があったのである。

発明の要約本発明は推定ＨＣＶ　ＮＳ５抗原の検出に採用され得る特異性の高い新規な一群のモノクローナル抗体を提供する。このモツクローナル抗体は推定ＨＣＶ　ＮＳ５遺伝子から誘導されたタンパク配列と特異的に結合する。これらのモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは次のように同定された：／１イブリドーマ８１２Ｃ６５（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号ＨＢ　１０８５５）およびハイブリドーマＨ１８Ｃ１４１（Ａ、Ｔ、Ｃ。

Ｃ１寄託番号ＨＢ　１０８５４）。

これらのモノクローナル抗体の特異性により推定ＮＳ５領域中のＨＣＶ抗原の有利な同定をし得て、この同定は分化研究並びにＨＣＶ　（ＮＡＮＢ）感染の診断および評価に有用である。

好ましいアッセイの構成において、ＨＣｖ抗原を含む可能性のある試験サンプルをポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体またはそのフラグメントを結合させである固相と接触させて、混合物を形成させる。この混合物を抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。このようにして形成した複合体をその後、ＨＣＶ抗原に対して特異的であり、シグナル発生化合物に結合させたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらのフラグメントからなる指示試薬と接触させて、第２の混合物を形成させる。この第２の混合物を抗体／抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下反応させる。ＨＣＶ抗原の存在は発生した測定可能なシグナルを検出することによって決定される。試験サンプル中のＨＣＶの存在量、したがって固相に捕獲されたＨＣＶ抗原の量は発生したシグナルの量に比例する。

あるいは、ＨＣＶ　ＮＳ５抗原に対して特異的であるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメントおよびシグナル発生化合物からなる指示試薬を、固相に塗られたポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＣＶ抗体またはそのフラグメントおよび試験サンプルに加えて混合物を形成させる。この混合物を抗体／抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下インキュベートする。試験サンプル中に存在するＨＣＶの存在および量、すなわち、固相に捕獲されたＨＣＶ抗原の量は測定し得るシグナルを検出することによって決定される。試験サンプル中に存在するＨＣＶの量は発生したシグナルの量に比例する。

別の代替アッセイの構成において、一種または一種以上の本発明のモノクローナル抗体の組合せはＨＣＶ　ＮＳ５抗原に対する抗体の検出のためのコンペティティブブローブとして採用し得る。例えば、ＨＣＶ　ＮＳ５抗原は単独でも組合せて用いても固相に塗り得る。ＨＣＶＮＳ５抗原に対する抗体を含む疑いのある試験サンプルを、シグナル発生化合物および本発明のモノクローナル抗体を含む指示試薬と、試験サンブノしおよび指示試薬の両方と固相との抗原／′抗体複合体または指示試薬と固相との抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下でインキュベートする。モノクローナル抗体の固相との結合の減少は定量的に測定し得る。陰性が確定しているＮＡＮＢＨ試験サンプルから発生したシグナルと比較して、シグナルの測定可能な減少は、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体の存在を示す。

さらに他のアッセイの構成において、試験サンプルをＨＣＶＮＳ５タンパクが固定されている固相およびシグナル発生化合物に結合していてＨＣＶＮＳ５に対して特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントからなる指示試薬と接触させ、混合物を形成させる。この混合物を抗体／抗原複合体が形成するのに、十分な時間および条件下インキュベートする。試験サンプル中に存在する抗−ＨＣｖの存在は、発生した測定し得るシグナルを検出し、このシグナルを既知の陰性のサンプルから発生した測定済みのシグナルと比較して決定する。既知の陰性サンプルのシグナルと比較して、試験サンプルのシグナルの測定し得る減少は抗− ＨＣＶ抗体の存在を示す。溶液中に遊離した抗原を使用する、抗−ＨＣＶ抗体の検出のためのコンペティティブアッセイも行い得る。

ＨＣＶ　ＮＳ５抗原の存在は組織サンプル中において検出し得る。そのためには組織サンプルと、ＨＣＶ　ＮＳ５抗原またはそのフラグメントと特異的に結合するモノクローナル抗体に結合したシグナル発生化合物からなる指示試薬とを接触させ、混合物を形成させる。この混合物を、抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。組織サンプル中のＨＣＶ　ＮＳ５抗原の存在は、発生したシグナルを検出して決定する。

本発明のモノクローナル抗体を含み、試験サンプル中のＨＣＶ　ＮＳＩ抗原または抗体の存在を決定するのに有用なキットもまた提供する。

図面の簡単な説明図１はモノクローナル抗体の製造用免疫原としてまたは特性決定用に採用された組換えＨＣＶタンパクのＨＣＶゲノム上の位置を示す図である。

図２Ａおよび図２Ｂはモノクローナル抗体Ｈ１２Ｃ６５（図２Ａ）およびＨ１８Ｃ１４１（図２Ｂ）のＮＳ５に対する特異的結合を示すウェスタンプロット分析図である。

発明の詳細な説明本発明は推定ＨＣＶ　ＮＳ５タンパクに対する新規のモノクローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を使用する方法およびこれらのモノクローナル抗体を含むキットを提供する。

本発明のモノクローナル抗体は試験サンプル中のＨＣＶ　ＮＳ５タンパクの存否を決定するいろいろなアッセイ系に採用し得る。得られたこれらのモノクローナル抗体のフラグメントもまた使用し得る。例えば、第１のアッセイ形式において、固相に塗られたポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＣＶＮＳ５抗体またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の組合せをＨＣＶ　ＮＳ５タンパクを含んでいる可能性のある試験サンプルと接触させ、混合物を形成させる。この混合物を抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。その後、シグナル発生化合物を結合させた、ＨＣＶ　ＮＳ５領域に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の組合せからなる指示試薬を抗原／抗体複合体と接触させ、第２混合物を形成させる。この第２混合物をその後、抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。もし′存在すれば試験サンプル中に存在し、固相に捕獲された１（ＣＶ　ＮＳ５抗原の存在はシグナル発生化合物によって発生された測定可能なシグナルを検出して決定する。試験サンプル中に存在するＨＣＶ　ＮＳ５抗原の量は発生したシグナルに比例する。

あるいは、固体支持体に結合されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗− １（ＣＶ、ＮＳ５抗体またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の組合せ、試験サンプル、およびシグナル発生化合物が結合されているＨＣＶ　ＮＳ５抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの７ラグメント、またはこれらの抗体の組合せを含む指示試薬を接触させ、混合物を形成させる。この混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。もし存在すれば試験サンプル中に存在し、固相に捕獲されたＨＣＶ　ＮＳ５タンパクの存在はシグナル発生化合物によって発生された測定可能なシグナルを検出して決定する。試験サンプル中に存在するＨＣＶタンパクの量は発生したシグナルに比例する。

さらに別のアッセイ形式では、１種の本発明のモノクローナル抗体または１種もしくは多種の本発明のモノクローナル抗体の組合せはＨＣＶタンパクに対する抗体の検出用のコンペテイティブブローブとして使用し得る。例えば、ＨＣｖタン、（りは１種のみでも組合せても固相に塗り得る。ＨＣＶ　ＮＳ５抗原に対する抗体を含んでいる疑いのある試験サンプルを、シグナル発生化合物および少なくとも１種の本発明のモノクローナル抗体からなる指示試薬と、試験サンプルおよび指示試薬の両方と固相とのまたは指示試薬と固相との抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートする。モノクローナル抗体と固相との結合の減少は定量的に測定し得る。

ＮＡＮＢＨ陰性が確定した試験サンプルから発生したシグナルと比較した測定し得るシグナルの減少は試験サンプル中の抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体の存在を示す。

さらに別の検出方法において、本発明のモノクローナル抗体のそれぞれは固定した組織切片および固定した細胞中のＨＣＶ抗原の免疫組織化学的分析による検出に採用し得る。

加えて、これらのモノクローナル抗体はＣＮＢ　ｒ−活性化セファロースに類似のマトリックスに結合し得て、細胞培養物または血液もしくは肝臓のような生物組織中の特定のＨＣＶタンパクのアフィニティー精製のために使用され得る。

本発明のモノクローナル抗体は治療用途または他の類似の用途のキメラ抗体の製造にも使用し得る。

モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントはＨＣＶＮＳ５抗原を検出するためにそれぞれ個別に提供し得る。本発明で提供されたモノクローナル抗体（およびそれらのフラグメント）の組合せは、本発明の少なくとも１種の抗−ＨＣＶ　ＭＳ５抗体と、互いに異なる結合特異性を有する他のＨＣＶ領域に対する抗体との混合物すなわち「カクテル」中の成分として使用し得る。すなわち、このカクテルはＨＣＶ　ＮＳ５タンパクに対する本発明のモノクローナル抗体およびＨＣＶゲノムの他の抗原決定基に対するモノクローナル抗体を含み得る。これらの考えられるカクテルに有用な他のモノクローナル抗体の例には例えば同一出願人の出願であり、引用することにより本明細書中に含むこととするＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　Ｔｏ　ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　ＣＶＩＲＵＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤ　ＦＯＲＵＳ　ＩＮＧ　ＳＡＭＥというｉｉの米国出願番号０７／６１０，１７５号、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＩ−ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　Ｔｏ　ＨＣＶ　３３ＣＰＲＯＴＥＩＮＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＵＳＩＮＧ　ＳＡＭＥという題の米国特許出願番号第０７／６１０，１７５号、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡ、Ｌ　Ａ、ＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　Ｔｏ　ＰＵＴＡＴＩＶＥ　ＨＣＶ　ＥＮＶＥＬＯＰＥ　ＲＥＧＩＯＮ　Ａ、ＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＵ！ＭＮＧ　ＳＡＭＥ、！：いう１１１の米国特許出願番号０７／６４８，４７５号、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＴＥＳ　′ｒｏ　ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ　ＰＲＯＴＥｒＮＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＵＳＩＮＧ　ＳＡＭＥという題の米国特許出願番号第０７／６４８．４７３’ｔお！びＭＯＮＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＴＢＯＤＩＥＳＴｏ　ＰＵＴＡＴＩＶＥ　ＨＣＶ　Ｅ２／Ｎ５ＩＨＣＶ　ＰＲＯＴＦ、ＩＮ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＵＳＩＮＧＳＡＭＥという題の同時出願の米国特許出願番号第０７／７４８．２９２号に開示されているＨｃＶ　Ｃ−１００ＳＨＣＶ３３Ｃ，ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ、、ＨＣＶ　ＮＳＩおよび／またはＨＣｖ推定ＥＮＶに対するものが含まれる。ここに記載されているモノクローナル抗体のカクテルはＮＳ５に対するモノクローナル抗体の代りに本明細書中で詳説されているアッセイ形式において使用し得て、したがって、ＮＳ５および他のＨＣＶ抗原を検出し得るであろう。

前記アッセイ形式で使用し得るポリクローナル抗体またはそのフラグメントはこのアッセイで使用されるＨＣＶ推定ＮＳ５領域またはＨＣｖ　Ｃ−１ｏｏタンパク、Ｈｃｖ　３３ｃタンパク、Ｆ（ＣＶ　Ｅ２／ＮＳＩもしはＨｃＶ　ｃｏＲＥタンパクのような他のＥ（ＣＶタンパクと特異的に結合しなければならない。好ましく用いられるポリクローナル抗体は哺乳類由来である。ヒト、ヤギ、ウサギ、またはヒツジ抗−ＨＣＶポリクローナル抗体が使用し得る。最も好ましくは前記ポリクローナル抗体はウサギポリクローナル抗−ＨＣＶ抗体である。これらのアッセイで使用されるポリクローナル抗体は単独でもポリクローナル抗体のカクテルとしても使用し得る。前記アッセイ形式で使用されるカクテルは異なるＨＣＶ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からなるので、それらはＨＣｖ感染の診断、評価および予後ならびにＨＣＶタンパクの分化および特異性の研究のために有用であるであろう。

本明細書に記載されている本発明の方法によって試験され得る試験サンプルは血液全体、血清、血漿、脳をＨ液、尿、生物学的流体、例えば細胞培養上清、固定した組織標本および固定した細胞標本のようなヒトおよび動物体液を含む。

「固相」は臨界的ではなく、当業者が選択し得る。したがって、ラテックス粒子、極微粒子、磁気または非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、ミクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップおよびヒツジ赤血球はすべて適した例である。ペプチドを同相に固定する適した方法はイオン性、疎水性、共有性の相互作用および類似の方法を含む。本明細書中、「固相」は不溶性であるかまたはのちの反応により不溶性化され得るいかなる物質をも示す。この固相は捕獲試薬を引き付は固定化する本質的な能力によって選択し得る。あるいは同相は捕獲した試薬を引き付は固定化する能力を有する付加的なレセプターを保持し得る。付加的なレセプターは捕獲試薬そのものまたは捕獲試薬に結合した電荷を有する物質に対して逆の電荷を有する荷電物質を含み得る。さらに別の選択において、レセプター分子は固相に（結合して）固定され、特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定する能力を有するいかなる特異的結合構成要素でも有り得る。このレセプター分子により、アッセイの実行の前またはアッセイの実行中に、捕獲試薬と固相物質との間接結合が可能になる。したがって固相はこの様に、プラスチック、誘導プラスチック、磁性または反磁性金属、試験管のガラスまたはケイ素表面、ミクロタイターウェル、シート、ビーズ、極微粒子、チップ、および他の当業者が公知の構成で有り得る。　固相はまた検出抗体がアクセスできるように十分な多孔性を有し、かつ抗原と結合するのに適した表面アフィニティーを有するいかなる好適な多孔性物質でも有り得ることが考えられ、本発明の範囲内であるミクコポーラスな構造が一般に好ましいが水和状態でゲル構造を有する物質もまた使用し得る。

その様な有用な固体支持体は以下の物を含む・天然の高分子炭水化物、およびその合成的変性、架橋または置換誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーゴム、特に硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテル；窒素を含む天然高分子、例えば、タンパクおよびその誘導体（架橋または改質ゼラチンを含む）；ラテックスおよびゴムのような天然炭化水素重合体；好適な多孔性構造を有して製造され得る合成重合体、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解された誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、例えばポリエステル、ポリアミド、および他のポリマー例えばポリウレタンまたはポリエポキシド；多孔性の無機物質例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩および炭酸塩、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；およびアルミニウムまたはケイ素酸化物または水和物、例えばクレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの物質は上記高分子物質と共にフィルターとして使用され得る）；および上記の種類の混合物またはコポリマーたとえば、既に存在している天然高分子上で合成高分子の合成を開始することによって得られるグラフトコポリマー。これらの物質の全ては適した形態、例えばフィルム、シートまたはプレート状態で使用してもよいし、または適当な不活性キャリヤー例えば紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは織物に塗布または結合もしくはラミネートされ得る。

ニトロセルロースの多孔性構造はモノクローナル抗体を含む広くいろいろな試薬に対して優れた吸収および吸着性能を有する。ナイロンもまた同様の性質を有し、ナイロンもまた適している。

上記の様な多孔性の固体の支持体は厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態が好ましいと考えられる。孔のサイズは広い範囲で変え得て、好ましくは約０゜０２５〜１５ミクロンであり、特に、約０．１５〜１５ミクロンである。この様な支持体の表面は抗原または抗体と支持体との共有結合を起こす化学的方法によって活性化され得る。しかしながら一般に、よく理解されていない疎水性力による多孔性物質の吸着によって抗原または抗体の非可逆的結合が得られる。

好適な固体支持体は米国特許出願番号第２２７．２７２号にも記載されている。

指示試薬は外的手段により検出し得る測定可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物（ラベル）がＨＣＶに対する特異的結合メンバーに結合して形成される。本明細書中で使用している「特異的結合メンバー」は特異的結合対の一方のメンノく−を意味する。すなわちそれは２つの異なった分子であって、分子の内の１つが化学的または物理的方法を介して特異的に第２の分子に結合する。ＨＣＶに対する特異的結合対の抗体メンバーであることに加えて、指示試薬はまたいかなる特異的結合対のメンバーでも有り得て、例えばビオチンまたはアンチビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたはレセプター分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤または酵素および類似物のようなハプテン−抗−ハブテン系のいずれか一方を含む。免疫活性特異的結合メンバーはサンドイッチアッセイにおいてＨＣＶと、コンペティティブアッセイにおいて捕獲試薬と、または間接アッセイにおいて補助的特異的結合メンバーと結合し得る抗体、抗原または抗体／抗原複合体で有り得る。

考えられるいろいろなシグナル発生化合物（ラベル）は色原体、酵素のような触媒、フルオレセインまたはローダミンのような発光化合物、アクリジニウム、フエナントリジニウムおよびジオキセタン化合物のような化学発光化合物、放射活性元素および直接目視標識を含む。酵素の例はアルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および類似物を含む。特定のラベルの選択は臨界的ではないが、それ自身が、または１種又は多種の付加的な物質と共に、シグナルを発生し得る。

いろいろな他の固相を使用する他の実施態様もまた意図されていて、本発明の範囲内である。例えば、同一所有者のものであり、引用により本明細書中に含まれる共に係属中のＥＰ公開第０３２６１００号に対応する米国特許出願番号第１５０．２７８号および米国特許出願番号第３７５，０２９号（ＥＰ公開番号０４０６４７３）に記載されている固定され得る反応複合体を負に帯電したポリマーに固定するイオン捕獲方法は本発明にしたがって採用し得て、速い液相免疫化学反応をもたらし得る。固定化し得る免疫複合体は反応混合物の残りから負に帯電したポリ−アニオン／免疫複合体および前処理された正に帯電された多孔性マトリックスの間のイオン性相互作用により分けられ、そして、同一所有者のものであり、引用により本明細書中に含まれる、共に係属中のＥＰＯ公開第０２７３．１１５号に相当する米国特許出願番号第９２１．９７９号に記載されているように化学発光シグナル測定を含む前記のいろいろなシグナル発生系を利用して検出される。

さらに本発明の方法は同相が極微粒子からなる自動化または半自動化システムを含む極微粒子技術を利用するシステムでの使用に適合させ得る。このシステムは係属中の米国特許出願番号第４２５．６５１号および第４２５，６４３号（それぞれ公開されたＥＰＯ出願ＥＰ　０　４２５　６３３およびＥＰ　０４２４　６３４に相当する）に記載されたものを含み、これらは引用により本明細書中に含むこととする。

イムノアッセイにおける走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の使用もまた本発明のモノクローナル抗体を簡単に適合させ得る技術である。走査プローブ顕微鏡において、特に原子力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ　ｆｏｒｃｅ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ）において、捕獲相例えば少なくとも１種の本発明のモノクローナル抗体は固相に付着されて、走査プローブ顕微鏡は固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体の検出に使用される。走査トンネル顕微鏡の使用により、一般に抗原／抗体複合体を検出する多くのイムノアッセイシステムにおいて使用しなければならない、標識の必要がなくなる。この様なシステムは同一所有者の、引用により本明細書中に含まれる係属中の米国特許出願番号第６６２．１４７号に記載されている。

特異的結合反応を検査するＳＰＭの使用はいろいろな方法で行い得る。１つの実施態様において、特異的結合相手の１つのメンバー（本発明のモノクローナル抗体である分析（ａｎａｌｙｔｅ）特異的物質）を走査に適した表面に付着させる。分析特異的物質の付着は当業者に公知の方法によるプラスチックまたは金属表面の面相からなる試験片への吸着でもよい。または、特異的結合相手（分析特異的物質）の誘導体化プラスチック、金属、シリコンまたはガラスからなる試験片への共有結合が使用し得る。共宵結合法は当業者に公知であり、特異的結合相手と試験片とを非可逆的に結合するいろいろな方法を含む。試験片がシリコンまたはガラスの場合には、特異的結合相手を付ける前に表面を活性化しなければならない。トリエトキシアミノプロビルシラン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｊｓ、ＭＯから入手可能）、トリエトキンビニルンラン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ）および（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような活性化シラン化合物がそれぞれアミノ−、ビニルおよびチオールのような活性基を導入するために使用し得る。このような活性化表面は（アミノまたはチオールの場合）結合相手を直接に連結するために使用し得る。またはこの活性化表面はグルタルアルデヒド、ビス（スクシニミジル）スベレート、５ＰＰＤ　９　スクシニミジル　３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネ−））　、ＳＭＣＣ（スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルコ　シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、５ＩＡＢ（スクシニミジル［４−ヨードアセチルコアミノベンゾエート）およびＳＭＰＨ（スクシニミジル　４−［１−マレイミドフェニル］ブチレートのようなリンカ −とさらに反応し得て、表面から結合相手を分離する。ビニル基は共有結合に対する手段を提供するために酸化し得る。それはまた、ポリアクリル酸のようないろいろなポリマーの重合のためのアンカーとして使用し得て、特異的結合相手に複数の結合点を提供し得る。アミン表面は異なったサイズおよび能力の親水性リンカ−を提供するいろいろな分子量の酸化デキストランと反応し得る。酸化し得るデキストランの例にはＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ−４０（分子量４０．０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ−１１０（分子量１１０．０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ −２Ｍ（分子量２．０００．０００ダルトン）（これらすべてはＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、、Ｕ、Ｓ。

Ａ、から入手し得る）またはＦｉｃｏｌｌ　（分子量７０，０００ダルトン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手し得る）が含まれる。さらに、高分子電解質相互作用は特異的結合相手を試験片表面上に、係属中であり、引用することにより本明細書中に含まれる、同一所有者の１９８８年１月２９日に出願された米国特許出願番号第１５０．２７８号および１９８９年７月７日に出願された出願番号第３７５．０２９号に記載されている技術および化学的性質を使用して、固定するために使用され得る。結合の好ましい方法は、共有方法による。特異的結合メンバーの付加に続いて、表面は非特異的結合を最小化するためにさらに血清、タンパクおよび他のブロッキング剤のような物質で処理され得る。この表面はまた、製造時または使用時にそのアッセイ目的に対する適合性を確めるために走査され得る。この走査法は試験片の特異的結合特性を変えないと思われる。

本発明は固相の使用の選択を開示するが、本発明のペプチドは非固相アッセイ系Ｊこおいて使用し得ることが考えられる。これらのアッセイ系は当業者に公知であり・、本発明の範囲内に含まれると考えられる。

このアッセイで採用された試薬は１種または多種の、各々がアッセイで採用されているモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のカクテルのような分離した試薬を含むＩくイアル又は瓶のような容器を伴うキットの形態で提供され得ると考えられる。

以下の実施例は本発明のＨＣＶの血清診断の利点および有用性をこれらのモノクローナル抗体の開発、特性付け、エピトープマツピングおよび臨床用途の方法を記載して説明する。モノクローナル抗体の開発に使われる方法は当業界で公知の方法に従い、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９４　（１９７５）に詳説されていて、Ｊ、Ｇ。

Ｒ，Ｈｕｒｒｅｌｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、、Ｂｏｃｏ　Ｒａｔａｎ、ＦＬ　（１９８２）ｌこ概論されている。Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法に基くモノクローナル抗体の他の開発法はり、Ｔ、Ｍｉｍｍｓ　ｅｔａｌ、、Ｖｉｒｏ！ｏｇｙ　１７６：６０４−６１９　（１９９０）の方法であり、これは引用することにより本明細書中に含まれる。これらの実施例は説明を意図するものであり、本発明の精神および範囲を限定することを意図するものではな−）。

実施例実施例１ｐＨＣＶ４５によるマウスの免疫化ｐＨＣＶ４５　（ＨＣＶ　ＮＳ５．ａ、ａ、１９３２−２１９１．３ＥＱ、ＴＤ、Ｎｏ、１）と命名されたＨＣｖ配列ニヨリコードされたＥ、ｃｏｌｉ誘導組換え抗原をＨＣＶ　ＮＳ５に特異的なネズミモノクローナル抗体の産生用の免疫原として採用した。ＨＣＶ　ａ、ａ、１９３２−２１９１を表現する８つの個々のオリゴヌクレオチドを互いに連結し、７９３塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＴフラグメントとして、ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中にクローン化した。この組換えタン、（りの合成、クローニングおよび発現の詳細な情報は米国特許出願番号第０７１５７２．８２２号に開示されていて、これは同一所有者のものであり、引用により本明細書中に含まれる。このタンパクは当業者に公知のタンパク精製方法による精製の後に適当なアジュバントと共に免疫化用に調製した。図１は、ゲノム上の組換えＨＣＶタンパクｐＨＣＶ　４５の位置を示す。

最初の日にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバンｈ２００μｌ中（Ｄ精製ｐＨＣＶ４５　５０Ｍｇを２つの部位から腹腔内（ｉ、ｐ、）に注射した。２回目の免疫化は２１日後および３５日後にＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント中のｐＨＣＶ４５　５０Ｍｇで行われた。４１日目にマウスから血を抜き、ｐＨＣＶ４５に対する免疫応答をエンザイムリンクトイムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）およびウェスタンプロット分析によってアッセイした。融合は少な（とも８週間マウスを休ませた後に行った。

エンザイムーリンクトイムノアツセイ（ＥＩＡ）免疫化する抗原の免疫応答をミクロタイターＥＩＡおよびウェスタンプロット分析によってアッセイした。ミクロタイタープレートのウェルにｐＨ９，５の０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液上の精製組換え９ンパク（ｐＨＣＶ　４５．ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ。

１）１００μｌを塗った。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．０１％およびＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡから入手可能）０．０５％もまた含むリン酸緩衝生理的食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）での洗浄の後、遊離の部位をｐＨ９，５の重炭酸塩緩衝液中の１％ＢＳＡで被覆した。最終洗浄に続いてプレートを４℃で貯蔵した。天然のまたは免疫化マウスからの血清を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，０，１５ＭのＮａＣ１１２０％の普通のヤギ血清、１０％のウシ胎児血清、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５０ｍＭのトリス、０．２％のＴｗｅｅｎ −２０（登録商標）と−緒にナトリウムアジドを防腐剤として含む希釈緩衝液１００μｍ中で順番に希釈した（ｐＨ６，８）。希釈した血清を抗原と３７℃で３時間反応させた。プレートを洗浄し、適当に希釈したヤギ抗−マウス　ＩｇＧ（重い［ｈコおよび軽い［１］鎖）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ） −結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｍを加えた。このプレートを３７℃で２時間インキュベートシた。最終洗浄の後、０−フ二二レンジアミン　２）（ＣＬ（ＯＰＤ）カラー試薬１００μｌを加えた。これを１０〜３０分間室温で反応させ、その後、ＩＮｏ）Ｈ２Ｓ０４を１ｍｌ加えて反応を停止させた。それぞれの抗原と結合した特異的抗体の量と正比例することが判明した４　９２　／　６００　ｎ　ｍの吸収を記録した。

ウェスタンプロット分析精製しｆ＝ｒＨｃＶ９ンバク（ｐＨＣＶ−４５）（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１）はぼ３００μｇを９５℃でＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールで処理し、１２％のポリアクリルアミド−３ＯＳゲル中で電気泳動させた（Ｌａｅｍｍｌｉ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１９７０））。タンパクを１晩かけてゲルからニトロセルロースに１００ｍＡで電気泳動させて移すかまたは、１〜２時間、１．ＯＡで２５ｍＭのトリス［（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、１９２ｍＭのグリシンおよび２．０％のメタノールからなりｐＨ８，３の標準移動緩衝液中で移した（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

３５４　［１９７９］　）。タンパクの移動およびＰＢＳ中の５％のドライミルクでのニトロセルロースのブロックの後、ニトロセルロースを細片（各細片は、その後試験血清［または他のサンプル］中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を決定するために使用するｒＨＣＶをほぼ５μｇ含んでいる）に切った。ニトロセルロース細片からなる反応混合物を緩衝液（２０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ＭのＮａＣｌ０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）およびウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）２ｍｇ、ｍｌ、ｐｉ（’７．５．５％のＥ、ｃｏｌｉ溶解物および３％のＣＫＳ溶解物）２．０ｍｌ中の適当な量の試験サンプルと４℃ で１晩インキユベートさせた。細片を緩衝洗浄剤（０゜１％のＳＤＳおよび０．５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−Ｚｏｏ（登録商標）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理的食塩水（Ｐ　Ｂ　５）ｐ）１７．５）で洗浄し、続いて、ＨＲＰＯに結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体を加えた。細片を１〜２時間室温でインキュベートし、続いて緩衝洗浄剤で洗浄した。最後に、タンパクに結合した抗体は新たに調製したＨＲＰカラー試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｆｅｈｍｏｎｄ　ＣＡ）（水冷メタノール４０ｍ１中に１２０ｍｇ溶解し、その後、３０％過酸化水素１２０μｍを含む、トリス緩衝生理的食塩水［ＴＢＳ］　ｐＨ７，８２００ｍ１で希釈した）を加えて可視化した。このアッセイはマウスが免疫された組換えタンパクに対する抗体の存在を示した。

免疫したマウスの血清中に特異的抗−ＨＣＶ抗体が妥当な力価で存在することと証明した上で、マウスを抗原の前−融合ブーストに先立って少なくとも８週間休息させた。前−融合抗原ブーストはそれぞれ精製したＨＣＶ組換えタンパクをほぼ４０℃ｇ尻尾静脈注射（ＴＶ）して行った。３日後、マウスを殺し、抗−ＨＣＶ抗体産生細胞を含む膵臓を単個細胞に粉砕した。これらの単個細胞懸濁液を０．８３％のＮＨ，ＣＩで処理し、赤血球を除き、その後、これらの懸濁液をＳ　Ｐ　２１０細胞と１０・１　（ＳＰ２１０　：肺臓細胞）比で混合した。この混合した細胞を遠心分離し、無血清培地で１回洗浄し、再び遠心分離した。

細胞融合剤ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、免疫ドナー膵臓細胞、＝ミエローマ細胞系５Ｐ２１０　（ＨＲＰＴｎｅｇ、）とのハイブリッドを形成させた（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎ７５）　、　Ｊ、Ｇ、　Ｒ，Ｈｕｒｒｅ　Ｉ、ｅｄ、、Ｍｏｎｏｃ　ｌ。

Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｏｃｏ　Ｒａｔａｎ、ＦＬ（１９８２）に概説）。概説すると、膵臓とＳ　Ｐ　２１０細胞との融合はペレットを無血清Ｔｓｃｏｅの改質Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地（ＩＭＤＭ）中で４０％のＰＥＧ　（ＡＴＣＣ，ｍｗ　１３００−１６００）に２分間晒して完成された。ＰＥＧおよび細胞懸濁液をゆっくりと５分間かけて、無血清Ｔ　ＭＤＭを２０ｍ１添加して希釈した。遠心分離で細胞を集めた後上清をデカンテーシヨンし、ハイブリドーマを選ぶためにウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　５）（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ。

Ｕｔａｈ）を２０％含むＩ　ＭＤＭとＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）３０ｍｌで置き換えた。

−匹の非免疫Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの肺臓細胞も支持細胞層として加えた。細胞を３枚の９６ウ工ル組織培養プレートに０．１ｍｌ／ウェル入れた。付加的なＨＡＴ培地０．１ｍｌを各ウェルに３日後入れた。その後１週間毎に、培地の半分をＦＢ８２０％を含むｒＭＤＭとＨＴ（ヒポキサンチンおよびチミジン）で置き換え、ハイブリッドをさらに７〜１４日間増殖させた。

ハイブリッドのいくつかがＨＣＶに対する抗体を産生ずる、５Ｐ２１０細胞と融合された肺臓細胞から構成されたことが判明した。概説すると、細胞融合剤で促進された肺臓細胞と５Ｐ２１０細胞膜の融合は両方の核を含むヘテロカリオンを形成した。最終的に、異なった核の融合により同時に有糸分裂し得る単個核が得られた。融合した細胞が分裂するにつれてハイブリッドは各校の染色体を失って安定化した。融合した細胞を複数の９６−ウェルプレート中に１ウエルにつき１０〜１０６細胞入れた。５Ｐ２１０：肺臓細胞融合で形成されたハイブリッド細胞をＨＡＴ培地中で培養して選択的に繁殖させた。使用されなかった全Ｓ　Ｐ　２１０または５Ｐ２１０　：　５Ｐ２１０融合細胞はアミノプテリン中で増殖できず、融合されなかった牌臓細胞または膵臓：肺臓融合細胞は培養中に死滅した。５Ｐ２１０：膵臓細胞ハイブリッドのみがＨＡＴ遺択培地中で増殖した。

１０〜１４日後、ハイブリドーマ細胞成長を含むウェルの培養液を単一特異性抗体の存在に対して以下のようにスクリーニングした。各ハイブリドーマ培養液を免疫原を塗った試験プレートおよびＣＫＳタンパク（ＨＣＶタンパクＳＥＱ、ＩＤ、Ｎ００１用に使用された融合相手）を塗ったプレート上で実施例１に記載のＥＩＡ法で試験した。免疫原、即ち、ＨＣＶタンパクと特異的に反応しＣＫＳ融合相手とは反応しないハイブリドーマ培養液をウェスタンプロット分析による更なる分析用に選択した。ＥＩＡ−陽性ハイブリドーマ培養液の）（ＣＶタンパクｐｉ（ＣＶ　４５　（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１）およびＣＫＳｌ、ｌｔする反応性を実施例１に記載のウェスタンプロット分析で試験した。ＥＩＡおよびウェスタンプロットの両方で）ＩＣＶタンパクと特異的に反応するが、ＣＫＳタンパクとは反応しないハイブリドーマサンプルを同定し、クローニング用にＪ、Ｗ、Ｇ。

ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）に概説されたガイドラインを使う限界希釈法で選択した。ＨＣＶタンパク配列ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１に対する単一特異的反応性を確認するために、クローン化サンプルの培養上清を再び上記実施何重の記載のように免疫原およびＣＫＳタンパクでのＥＩＡによって試験した。このタンパクに対する最も強い特異的反応性を有するクローンを増殖および更なる分析のために選択した。

大量のモノクローナル抗体を得るために所望のハイブリドーマ細胞系の１０，０００，０００〜２０，０００，０００のクローン化細胞をあらかじめブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌでｉ、ｐ、処理したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　マウスにＪ、Ｇ、Ｒ，Ｈｕｒｒｅｌ、ｅｄ、。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、Ｂｏｃｏ　Ｒａｔａｎ。

ＦＬ　（１９８２）に概説されている方法で接種した。ブリスタン処理はマウスの腹膜でのマウス骨髄腫ハイブリッドの増殖を強め、形成された腹水中にはこのハイブリッド細胞が分泌したモノクローナル抗体が豊富にあった。適当な腹水の形成後（はぼ７日）、マウスを殺し、腹水を覆膜から抜き取り、遠心分離によって、透明にし、−２０℃で保存した。腹水液からのモノクローナル抗体をプロティン−Ａセファロースを使用して（Ｊ。

Ｇ、Ｒ，Ｈｕｒｒｅｌｌ、ｅｄ、、５ｕｐｒａに従って）、精製した。本明細書中の全ての特性付は方法は培養上清、腹水液またはプロティン−Ａ精製１ｇＧのいずれかで行った。

実施例１に記載のエンザイムーリンクトイムノアッセイをＮＳ５に対する各モノクローナル抗体の特異性を決定するために用いた。概説すると、透明にした腹水液またはプロティン−Ａ精製１ｇＧをａ）免疫原ｐＨＣＶ４５　（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ。

１）またはｂ）ＣＫＳタンパク（免疫原のクローニングおよび発現に使用された融合相手）のいずれかを塗ったミクロタイタープレート中の順次希釈液中で反応させた。各モノクローナル抗体のｐＨ（、Ｖ４５タンパクに対する特異性をＣＫＳタンパク以外の免疫原に対するモノクローナル抗体の特異的活性により確認した。表１はＨＣＶ　ＮＳ５に対するモノクローナル抗体の特性性はデータを示す。

ウェスタンプロット分析希釈緩衝液からＣＫＳ溶解物を除いた以外、ウェスタンプロット分析の一般的プロトコールは実施例１に記述の通りである。

概説すると、ａ）ｐＨＣＶ４５免疫原またはｂ）ＣＫＳタンパク（免疫原に対する融合相手）のいずれかほぼ３００μｇを電気泳動し、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロース上の遊離の部位をブロックした後、巾２ｍｍの細片に切った。モノクローナル抗体のそれぞれの、免疫原およびＣＫＳに対する反応性を試験した。それぞれのモノクローナル抗体の特異性をＥＩＡ分析の記述のように確認した。これらのデータを図２に示す。図２Ａと図２Ｂで、これらの写真は本発明の各モノクローナル抗体のその特異的タンパクに対する単一特異的結合を示す。

図２Ａはモノクローナル抗体Ｈ１２Ｃ６５の結合を示し、図中、Ｌ／−ン１はｐＨＣＶ４５　（ＳＥＱ、１０．Ｎｏ、１）を含み、レーン２はＣＫＳベクタータンパクのみを含む。図２Ｂはモノクローナル抗体Ｈ１８Ｃ１４１の結合を示し、図中、レーン１はｐＨｃＶ４５　（ＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ、１）を含み、レーン２はＣＫＳベクタータンパクのみを含む。

イソタイプモノクローナル抗体のそれぞれのイソタイプをイソタイピングキット　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて、それに添附の説明書に従って、決定した。概説すると、各モノクローナル抗体の組織培養上清及び適当なコントロールを１：５希釈液中で、上記のキットで得られた特異的抗−イツタイブ抗体を塗った細片と反応させた。アッセイプロトコールは製造元の説明書に正確に従った。本発明のモノクローナル抗体のイソタイプのそれぞれを表１に示す。

免疫ヒト血清との競合各モノクローナル抗体がヒトにおいて免疫学的意味を有するエピトープを認識するか否かを確立するために、競合アッセイを以下のように行った。モノクローナル抗体のそれぞれを、Ｎ３５　（ＳＥＱ、ＴＤ、Ｎｏ、１）に対する抗体に対して血清陽性のヒト血清と対応する抗原に対する結合に対して競合させるアッセイで試験した。概説すると、ＮＡＮＢ）Ｉに感染した個体のヒト血清でＨＣＶのＮＳ５タンパクに対する抗体に強い血清陽性のヒト血清を各モノクローナル抗体が最終濃度１０％の反応混合物に含ませた。ミクロタイターＥＴＡを実施例１の記載のように行った。免疫ヒト血清による相当するタン１＜りに対するモノクローナル抗体の結合の５０％以上の阻害は競合的であると考えられる（表１にデータを記載）。

ＨＣＶタンパクに対するモノクローナル抗体は（ａ）各モノクローナル抗体と相当するＨＣＶタンパクのサブフラグメントとのウェスタンプロット反応性および（ｂ）　ミクロタイターＥｒＡによる、相当するタンパク配列に対して選択されたいくつかの合成ペプチドとの反応性、によりタンパクの特異的領域に対してマツピングした。マツピングの特別な付加的な詳細は個々のモノクローナル抗体について適当なところに詳説した。

合成ペプチドとの反応性ＨＣＶタンパクＮＳ５の異なった領域からいくつかのアミノ酸配列を選んだ。これらのモノクローナル抗体のエピトープマツピングに用いたペプチドのリストを以下の表２に列記した。

表２合成ペプチドによるエピトープマツピングＨＣＶゲノム　試験した　ペプチド　各々のペプチドの領域　モノクローナル　ａ、ａ、　との反応性Ｎ　Ｓ　５　Ｈ１２Ｃ６５ＳＰ　＋９５７−１９７１’　なし参ネＨ１８Ｃ１４１ＳＰ　２０４２−２０５６　なしＳＰ、　２０７２−２０９１” ’ ＊ＳＥＱ、　１０．　Ｎｏ、　２．傘寧ＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　３および＊傘傘ＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　４゜これらのタンパクのそれぞれをカルボキシ末端残基から始めて、樹脂支持体上に逐次固相合成により集めた。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ反応容器を使用するＥ、Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄＴ、Ｈｅ１ｎｅｈｏｆｅｒ、ｅｄｓ、、Ｂａｒａｒｙ　ａｎｄＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　２：１２８４、Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）の記述と類似の方法を採用した。

樹脂からペプチドを開裂させた後、このペプチドをジエチルエ−チルで洗浄し、４０％の酢酸溶液で抽出した。水性溶液を凍結乾燥した後に得られた粗ペプチドをエピトープマツピング実験の抗原ターゲットとして用いた。概説すると、試験されたペプチドのそれぞれをミクロタイターウェル上にｐＨ９，５の重炭酸緩衝液中、濃度１０μｇ　／　ｍ　ｌで塗った。ＥＩＡを実施例１に記載の方法で行った。負のコントロールの４倍の反応性を示すモノクローナル抗体を陽性とした。

Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント中の実施例１に記載の高精製ＨＣｖ　ＮＳ５タンパク１００〜１５０μｇを異なった４箇所への筋肉内（ｉ、ｍ、）注射により若いウサギ（生後３〜４ケ月および体重はぼ２〜３ｋｇ）（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｌａｂｓ、ＤｅｎａｅｒＰＡから入手可能）に免疫した。続いて、２週間の間をおいてＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントで同様な方法で２回免疫した。ウサギの免疫応答はＥＩＡおよびウェスタンプロット法で検査した。このタンパクに対する許容し得る免疫応答を達成したときウサギから血液をぬいた。免疫ウサギ血清からのＩｇＧを当業者に公知のプロティン−Ａセファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製した。

固相のコーティングウサギＩｇＧを本明細書中に記載のように製造し、そしてその後、試験サンプル中のＮＳ５抗原捕獲用固体支持体としてのポリスチレンのビーズに塗った。ポリスチレンビーズを蒸留水で洗浄し、４０℃で２時間、緩衝溶液中（０，１Ｍのトリス、０．５ＭのＮａＣｌ、０．００２２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）　、ｐＨ８，５）ｔｖ精製ＨＣＶ　ＮＳ５合成ヘブチドウサギＩ　ｇＧ５〜１０μｇ　／　ｍ　Ｉと共にインキュベートした。ビーズを１回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（登録商標）中に４０℃はぼ１時間浸した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ビーズをＰＢＳ中の３％のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）でほぼ４０℃で１時間被覆した。最後に、ビーズをＰＢＳ中の５％のサクロース溶液で被覆し、窒素下乾燥させた。ＮＳ５に対するＨＣＶ抗体に血清陽性の個体の血清から精製した抗−ＨＣＶヒトポリクローナルＩｇＧもまた同様の方法で被覆した。

ＥＩＡＨＣＶ　ＮＳ５に特異的なモノクローナル抗体をＥＴＡによる試験サンプル中のＨＣＶタンパクの検出用のプローブとして使用するためにスクリーニングした。

概説すると、モノクローナル抗体のそれぞれを抗−ＨＣＶウサギポリクローナルＩｇＧを塗ったポリスチレンビーズの存在下でＮＳ５抗原とインキュベートした。ＥＩＡのプロトコールは本明細書中以下の記載と同様にした。

ＨＣＶ　ＮＳ５タンパクに対する抗原を含む疑いのある試験標本２００μｍを反応トレー中で本発明のモノクローナル抗体（２０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、３．０％のＢＳＡ、０．３％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）および１０％のＦＢＳを含むｐ）（７，５の緩衝液中に希釈した最終タンパク濃度約５〜１０μＩ／ｍ１）５０μｌ及び（本明細書中、上記の）ＨＣＶウサギＩｇＧを塗ったビーズとともにインキュベートした。室温での１晩のインキュベーションを行った後、ビーズを蒸留水で洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗−マウスＩ　ｇＧ　（Ｈ＆Ｌ）　（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の適当な希釈液２００μｍを加えた。ラベル化プローブでのインキュベーションを約４０℃でほぼ２時間行った。ビーズを洗浄し、０−フ二二レンジアミン（ＯＰ　Ｄ）呈色試薬３００μｍを含む反応チューブに移した。反応を暗室内で室温で約３０分間行い、ＩＮ　Ｈ２Ｓ０４１ｍ１を添加して停止させた。吸収を４９２　／　６００　ｎ　ｍで記録した。前もってスクリーニングされ、ＮＡＮＢＨ感染に陰性であることが確認されている負のコントロールを実験に含めた。正のコントールは本明細書中、上記されている緩衝溶液中のＮＳ５に対する合成ペプチドの溶液からなる。正および負のコントロール両方３組を各実験セットに含めた。

サンプル中のＨＣＶ　ＮＳ５の検出用の抗原捕獲アッセイの効果を決定するために、１１００ｎタンパク／ｍｌ〜１１００ｐタンパク／ｍｌのいろいろな濃度の組換えＨＣＶ　ＮＳ５タンパクを上記の緩衝液中で希釈した。上記のＥＩＡ法を希釈したパネルメンバーそれぞれに行った。比較のために、パネルメンバーそれぞれを（ａ）固相上の抗−ＨＣＶウサギポリクローナル抗体および（ｂ）固相上の抗−ＨＣＶヒトポリクローナル抗体で試験した。アッセイの効果は得られたデータを評価して決定した。

本発明のモノクローナル抗体を産生ずる７％イブリドーマをモノクローナル抗体）（１２Ｃ６５産生）−イブリドーマＨ１２Ｃ６５およびモノクローナル抗体Ｈ１８Ｃ１４１産生ノ−イブリドーマＨ１８Ｃ１４１と同定した。ハイブリドーマＨ１２Ｃ６５およびＨ１８Ｃ１４１はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に１９９１年８月２０日付で寄託されていて、以下の寄託番号を与えられている：ハイブリドーマＨ１２Ｃ６５はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０８５５、ハイブリドーマＨ１８Ｃ１４１はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０８５４を与えられている。

このように本発明の新規のモノクローナル抗体はいろいろな方法で使用し得る。

これらのモノクローナル抗体は増幅した産物の免疫沈殿およびＨＣＶ核酸の極微細粒の検出に使用し得、またはＨＣＶ　ＲＮＡに関連するウィルスまたはウィルスタンパクを捕獲するために使用される抗−ＨＣＶモノクローナル抗体を塗ったキャリヤーとして使用し得る。その後、ＲＮＡの検出方法が使用し得る。このタイプのアッセイの側は係属中のＡＭＥＴＨＯＤ　ＦＯＲＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ　ＡＮＤ　ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ　Ａ　ＴＡＲＧＥＴ　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣｒＤ　５ＥＱＵＥＮＣＥという名称の米国特許出願番号第０７１５６８．６６３号に言及されていて、これは同一出願人のものであり引用により本明細書中に含むこととする。

これらのモノクローナル抗体は直接ラベルした（蛍光、コロイダルゴールド等）ＨＣＶモノクローナル抗体を使用するかまたは第２のラベル付き抗マウス抗体を使用する細胞中のＨＣＶ抗原の位置決定にもまた使用し得る。疾病の組織病理学も行い得る。さらに、血清、組織、細胞、培養培地または体液中の天然または組換えＨＣＶ抗原を検出するために、サンドイッチ配置で個々のモノクローナル抗体を使用したり、または検出系で固相上のモノクローナル状態のカクテルを使用する。

オーバーラツプしていないエピトープに対するモノクローナル抗体を使用する１段階抗原アッセイもまた行い得る。いくつかのモノクローナル抗体は感染した固体によって認識されない抗原性エピトープを認識し得、それゆえに、遊離のおよびヒトさらに、「潜在的」または隠れた、抗原または抗原決定基は標本の洗剤もしくは還元剤またはその両方での処理によってむき出しにし得る。例えば、ＮＳ５抗原はウィルスエンベロープおおわれたキャブジッド形態で存在し得る。洗剤によってエンベロープを剥がすことによりＮＳ５抗原が剥きだしにされる。モノクローナル抗体はまた、高い力価のポリクローナル抗体と比べてアッセイにおいてより高い感変を与えること、またはより短いインキュベーンコン時間を可能にすること、において実用上の利点を与える。

さらに、抗体イムノアッセイ、１段階または２段階コンペティティブイムノアブセイでは抗−ＨＣＶを標識化抗−ＨＣＶモノクローナル抗体と隈定数の抗原性部位との結合に対して競合させる。溶液中においてＨＣＶ抗原サンすイッチアッセイ中のＨＣＶ抗原結合をブロックするかまたは抑制するヒト抗−ＨＣＶがＨＣＶ抗原に結合するより敏感なコンペテイテイブアツセイを開発し得る。モノクローナル抗体を使用するコンペテイティブアノセイはより明確なヒト抗体エピトープのマツピングを可能にし、ウィルス中和抗体エピトープの決定に有用であろう。

いくつかのモノクローナル抗体にウィルス中和活性を持つ。

最後に、モノクローナル抗体は天然ウィルス性および組換えＨＣｖ抗原およびタンパクの免疫アフィニティー精製に有用であるであろう。

本明細書中で提供されたこれらの素晴らしいモノクローナル抗体の使用用途の他の変形は免疫複合体中のＨＣＶの検出および／またはＰＣＲ，ＬＣＲもしくは直接のハイブリダイゼーションによる核酸の検出のためのウィルス核酸との結合を含む。

本明細書中で説明した本発明の特定の実施態様の変形および改良は当業者に明白である。したがって、本発明はただ添附の請求の範囲にしたがって限定されることを意図するものである。

配列表（１）一般情報・（ｉ）出願人：ＭＥＨＴＡ、ｓ。

ＪＯＨＮＳＯＮ−ＰＡＥＰＫＥ、Ｊ。

ＤＡＩＬＥＹ、Ｓ。

ＤＢＳＡＩ、Ｓ。

ＤＥＶＡＲＥ、Ｓ。

（１、発明の名称：推定）ＩＣＶ　ＮＳ５タンパクに対するモノクローナル抗体およびそれを使用する方法（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数＝４（１ｖ）通信住所− （Ａ）宛名：ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（Ｂ）通り：ＯＮＥ　ＡＢＢＯＴＴ　ＰＡＲＫ　ＲＯＡＤ（Ｃ）市：ＡＢＢＯＴＴ　ＰＡＲＫ（Ｄ）州：　ＩＬＬＩＮＯＩＳ（Ｅ）国：合衆国（Ｆ）郵便番号　６００６５−３５００（Ｖ）コンピューター読取り可能型。

（Ａ）媒体形態：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５（ｖｉ）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願臼：（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人情報（Ａ）氏名：　ＰＯＲＥＭＢＳＫ　Ｉ、ＰＲＩ　ＳＣＩ　ＬＬＡＥ。

（Ｂ）登録番号：３３，２０７（Ｃ）　リファレンス／ドケット番号：４８３４ＰＣ，０５（ｉｘ）電気通信情報：（Ａ）電話：　７０８−９３７−６３６５（Ｂ）ファクシミリ：　７０８−９３７−９５５６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌの情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝５１７アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖数：１重（Ｄ）形態：線状（ｉ　ｉ）分子形：ペプチド（”）ＩＺ１４１ｃｉａ＊　’：５ＥＯＩＤＮＯ：ｊ：Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｍｅ＋　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　ｌｌｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＴｒｐＡｒｇ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＰｈｅＶａｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＰｈｅＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＨｉｓＡｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｆｉｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ■ Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ（２）ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：２（７）情１ｊ（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝１５アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）路数：１重（Ｄ）形態　線状（１１）分子形・ペプチド（ｘＱ　印已亨り　の　會ｔ、ｔ　：５ＥＯＩＤ　ＮＯ２：（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：３の１１［（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）路数・１重（Ｄ）形態、線状（１皿）分子形：ペプチド（ｘＱ　＃、Ｚ９り一＜ご、７　□：　ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：３：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のｔｌｌ報（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ、２０アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）路数　１重（Ｄ）形態：線状（ｉ　ｉ）分子形：ペプチド（ｘＱ　５ＥＯＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ：　ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：４：ＦＩＧ、２８フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５／２８Ｃ１２Ｎ　５／２０ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　ディリー、ステイーブン・エムアメリカ合衆国、イリノイ・６００６１、バーノン・ヒルズ、タイラー・コート・４７２（７２）発明者　ディサイ、シュアシュ・エムアメリカ合衆国、イリノイ・６００４８、リバテイビル、エイミー・レーン・１４０８（７２）発明者　デイベ乙スーシル・ジ−アメリカ合衆国、イリノイ・６００６２、ノースプルツク、ファーンズワース・レーン・

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＣＶ　ＮＳ５抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体。２．ＡＴＣＣ　ＨＢ１０８５５ハイブリドーマ細胞系により分泌されたモノクローナル抗体である請求項１のモノクローナル抗体。３．ＡＴＣＣ　ＨＢ１０８５４ハイブリドーマ細胞系により分泌されたモノクローナル抗体である請求項１のモノクローナル抗体。４，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されるモノクローナル抗体。５．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されるモノクローナル抗体。６．ＨＣＶ　ＮＳ５抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系。７．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５である請求項６のハイプリドーマ細胞系。８．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４である請求項６のハイブリドーマ細胞系。９．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５ハイブリドーマ細胞系。１０．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４ハイブリドーマ細胞系。１１．ＨＣＶを含んでいる可能性のある試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定する方法であって、ａ．固相に固定されておりＨＣＶ　ＮＳ５抗原と特異的に結合する、少なくとも１種の抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体と試験サンプルとを接触させて混合物を形成させ、ｂ．前記混合物を抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、ｃ．抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体と結合しており検出可能で定量可能なシグナルを発生し得るシグナル発生性化合物からなる指示試薬と前記複合体とを接触させて第２の混合物を形成させ、ｄ．前記第２混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、ｅ．試験サンプル中のＨＣＶの存在量に比例して発生した測定可能なシグナルを検出することにより試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定することからなる方法。１２．シグナル発生性化合物が発光性化合物、化学発光性化合物、酸素および放射性元素からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。１３．固相に固定された抗−ＨＣＶ抗体がポリクローナル抗体である請求項１２の方法。１４．前記固相に固定された抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体がモノクローナル抗体である請求項１２の方法。１５．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。１６．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。１７．前記指示試薬がポリクローナル抗体に結合したシグナル発生性化合物を含む請求項１１に記載の方法。１８．前記指示試薬がモノクローナル抗体に結合したシグナル発生性化合物を含む請求項１１に記載の方法。１９．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。２０．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されたそノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。２１．試験サンプル中に存在している可能性のあるＨＣＶの存在および量を決定する方法であって、ａ．固相に固定したポリクローナルまたはモノクローナル抗−ＨＣＶ　ＮＳ５抗体、およびシグナル発生性化合物と結合しておりＨＣＶ　ＮＳ５と特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる指示試薬と試験サンプルとを接触させて混合物を形成させ、ｂ．前記混合物を抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、ｃ．試験サンプル中のＨＣＶの存在量と比例して発生した測定可能なシグナルを試験サンプル中のＨＣＶの存在の指標として検出することにより試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定することを含む方法。２２．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２１に記載の方法。２３．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２１に記載の方法。２４．試験サンプル中に存在している可能性のあるＨＣＶ抗体の存在および量を決定するコンペティティブアッセイ注であって、ａ．ＨＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試験サンプルを、ＨＣＶ　ＮＳ５タンパクを塗った固相ならびにシグナル発生性化合物およびＨＣＶ　ＮＳ５タンパクと特異的に結合するモノクローナル抗体からなる指示試薬と、試験サンプルと固相および／または指示試薬と固相の抗原／抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下で接触させ、ｂ．試験サンプル中のＨＣＶ抗体の存在を決定することは負の試験サンプルから発生したシグナルと比較した指示試薬と固相との結合の減少を検出して試験サンプル中のＨＣＶ抗体の存在とを示すことである方法。２５．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。２６．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。２７．ＨＣＶ　ＮＳ５抗原と特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を含む容器からなる、試験サンプル中のＨＣＶ抗原または抗体の存在を決定するためのアッセイキット。２８．前記モノクローナル抗体が細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５５によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２７のアッセイキット。２９．前記モノクローナル抗体が細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ１０８５４によって分泌されたモノクローナル抗体である請求項２７のアッセイキット。