JPH09509052A - 肝炎ｃ型ウイルスエンベロープ遺伝子用の哺乳動物発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を産生させるための哺乳動物発現系。そのような発現系により、細胞外で高収率のＨＣＶタンパク質が得られ、グリコシル化構造抗原を含む診断用、ワクチン及び治療用試薬の開発並びにＨＣＶ病因物質の分離も可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】肝炎Ｃ型ウイルスエンベロープ遺伝子用の哺乳動物発現系 発明の背景 本発明は概して哺乳動物発現系に関し、より具体的には、肝炎Ｃ型ウイルス（ ＨＣＶ）エンベロープタンパク質を産生し得る哺乳動物発現系及び該タンパク質 の使用に関する。Ｅ１及びＥ２と称されるこれらのＨＣＶエンベロープタンパク 質は、慣用的に認められた部位とは異なる開裂部位を除去すると融合する。これ らのタンパク質は、培地中でも哺乳動物の細胞中でも発現する。 肝炎は、血液又は血液製剤の輸血、臓器移植及び透析により供血者から受血者 に伝染する最も重要な疾患の１種である。ウイルス性肝炎は今や種々の感染経路 を介して種々の重篤度の肝損傷を伴う肝炎を引き起こす特有のウイルス遺伝子及 び複製形態を有するウイルス因子群を含むことが知られている。急性のウイルス 性肝炎は、臨床的には、黄疸、肝圧痛及び高レベルの肝トランスアミナーゼ、例 えばアスパルテートトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナ ーゼ（ＡＬＴ）を含む明確に定義された患者の症状に基づいて診断される。 非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、１９７５年に最初に用いられた用語であり 、これは、肝炎Ａ型ウイルスや肝炎Ｂ型ウイルスによるものでない輸血後肝炎の 症例を意味する。Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２ ９２：４５４−４５７（１９７５）。ＮＡＮＢＨの診断は、初期には、Ａ型肝炎 とＢ型肝炎の存在が血清学的分析で認められないものという、排除法により行わ れた。現在、輸血後肝炎の症例の約９０％はＮＡＮＢＨにより引き起こされてい る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｎ．Ｒ．Ｒｏｓｅら編のＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌ ｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ,Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ ｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，５５８− ５７２（１９８６）。 非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）因子とされる肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）が同定され た。Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３６１（１９８９）；Ｃｈｏ ｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２−３６４（１９８９）。現在では、非経 口伝染性ＮＡＮＢＨの主要因子として認識されたＨＣＶのクローン化及び配列決 定が、該疾患の疫学、発病学及び自然発達における興味及び研究の的となってい る。Ｋｕ ｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２−３６４（１９８９）。 臨床的にＮＡＮＢＨであると診断された患者の大多数に存在する抗体と免疫学 的に反応する抗原をコードするＨＣＶからの配列が同定された。ＨＣＶについて 入手し得る情報及びＨＣＶの分子構造によれば、該ウイルスの遺伝子は、約９． ５ｋｂの一本鎖直鎖状ＲＮＡ（＋鎖）と、約３０００個のアミノ酸からなるポリ タンパク質前駆体をコードする１つの連続翻訳読み取り枠（ＯＲＦ）とから構成 されている。この前駆体タンパク質は、目的の構造及び非構造タンパク質への、 開裂及びグリコシル化を含む共翻訳及び後翻訳プロセシングを受ける。Ｈｏｕｇ ｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３８１−３８８（１９９１）。構造 タンパク質は、コアタンパク質、並びに、分子量３３，０００のＥ１と分子量７ ２，０００のＥ２という高グリコシル化されたエンベロープタンパク質とされた 。Ｈｉｊｉｔａｋａら，Ｇｅｎｅ ８８：５５４７−５５５１（１９９１）。Ｈ ＣＶの複製は、チンパンジーにおいてはＨＣＶ感染後すぐに始まり、ＨＣＶタン パク質に対する抗体ができる前に長期のウイルス血症を発症し得る。Ｓｈｉｍｉ ｚｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３３ ９２−３４４４（１９９０）；Ｆａｒｃｉら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３ ２５：９８−１０４（１９９１）。 ＨＣＶ感染は、慢性肝炎、肝硬変及びＨＣＣの発症においても報告されている 。Ｇｅｎｅｓｃａら，Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ １１：１４７−１６４ （１９９１）。ＨＣＶに対する効果的な中和体液性免疫応答がないことは、ウイ ルスの増殖及び病気の進行にも基づく。Ｆａｒｃｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ：１３５−１４０（１９９２）。 肝炎Ｃ型ウイルス感染を血清学的に診断するための実験室テストができると、 血液又は血液製剤を投与されるか、あるいは、臓器移植及び透析を受けた患者の 肝炎の病因におけるＨＣＶの役割が明確化できる。供血者試料中のＨＣＶ抗体を 検出することにより、血液供給系からのＮＡＮＢＨ感染血液の７０〜８０％が除 外される。しかし、該抗体は見かけ上該疾患の慢性期になれば抗体を容易に検出 し得るが、急性ＮＡＮＢＨからの試料では僅か６０％がＨＣＶ抗体陽性であるに 過ぎない。Ｈ．Ａｌｔｅｒら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１４９４ −１５００（１９８９）。 ＨＣＶ抗体及び／又はＨＣＶ ＲＮＡの存在を検出する アッセイ試薬及び方法はあるが、ＨＣＶ抗体に対して血清反応陽性の患者並びに ＨＣＶウイルスに感染した患者の中には、これらの利用し得るアッセイ試薬及び 方法ではＨＣＶと診断されない患者もいる。例えば、腎移植を受けた患者にＨＣ Ｖ感染の罹患率が高いことは公知であり、現行のキットで検出し得るＨＣＶ抗体 は不在でも活性ＨＣＶ複製が発生し得ると想定される。Ｌａｕら，Ｈｅｐａｔｏ ｌｏｇｙ １８：１０２７−１０３１（１９９３）。さらに、ＨＣＶ感染のリス クが高い潜在的供血者を最初に高感度の血清学的スクリーニングアッセイでテス トした場合、テストを受けた１９人中１３人が該方法で検出された（６８％）の に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でテストすると、テストを受けた１ ９人の供血者全員がＨＣＶＲＮＡ陽性であった。Ｓｕｇｉｔａｎｉら，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３９：１０１８−１０１９（１９９２）。 従って、存在し得るが現在市販されているスクリーニングアッセイでは検出し 得ないような急性感染症及びウイルス血症を同定する、さらなるアッセイ試薬及 びアッセイ系の開発が求められている。予防法及び／又は治療法を開発するため に、急性感染症や、潜伏期間の長いもの、現在進 行中及び／又は慢性感染症に罹患している患者とそのＨＣＶ感染症が回復しつつ ある患者との区別を助け、且つＮＡＮＢ肝炎感染症の予後コースを明確にするた めに、これらの試薬及びアッセイ系が必要である。さらに、これらのグリコシル 化抗原を分泌する発現系は、診断及び治療薬の精製及び製造にも有用である。発明の要旨 本発明は、高レベルのＨＣＶ発現タンパク質を産生し得る新規な哺乳動物発現 系を提供する。具体的に言えば、本発明は、哺乳動物の細胞における高レベルの 発現に有用な、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びＨＣＶ Ｅ１及びＥ ２からなる融合タンパク質の構築を提供する。これらの構築物は、ＨＣＶ Ｅ１ 及びＥ２遺伝子中に欠失部分を含み得、それによって、ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１− Ｅ２の分泌性融合タンパク質が産生される。これらのユニークな発現系により、 高レベルのＨＣＶタンパク質の産生、該系におけるウイルスタンパク質の適切な プロセシング、グリコシル化及び折りたたみが可能になる。具体的に言えば、本 発明は、プラスミドｐＨＣＶ−１７６、ｐＨＣＶ−１７２、ｐＨＣＶ−３５１及 びｐＨＣＶ−４２５を提供する。ＨＣ Ｖ Ｅ１遺伝子中に導入され、切頭型ＨＣＶ Ｅ２に融合された小さい欠失によ り、開示された哺乳動物発現系中では開裂不能な融合タンパク質が産生される。 本発明の哺乳動物発現系中でｐＨＣＶ−４２５から発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質は、細胞外でも細胞内でも回収し得る。 本発明はさらに、その改良点が、テスト試料と哺乳動物発現系中で産生された グリコシル化ＨＣＶ抗原とを接触させることにある、ＨＣＶ抗原又は抗体を含む おそれのあるテスト試料中のＨＣＶ抗原又は抗体の検出法を提供する。さらに本 発明は、その改良点が、テスト試料と哺乳動物発現系中で産生されたグリコシル 化ＨＣＶ抗原を用いて産生された抗体とを接触させることにある、ＨＣＶ抗原又 は抗体を含むおそれのあるテスト試料中のＨＣＶ抗原又は抗体の検出法も提供す る。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。 本発明はさらに、哺乳動物発現系中で産生されたグリコシル化ＨＣＶ抗原を含 む容器を含む、ＨＣＶ抗原又はＨＣＶ抗体を含むおそれのあるテスト試料中のＨ ＣＶ抗原又は抗体の存在を検出するためのテストキットを提供する。該 テストキットは、哺乳動物発現系中で産生されたグリコシル化ＨＣＶ抗原を用い て産生された抗体を含む容器をさらに含んでいてもよい。該テストキットにより 得られる抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。図面の簡単な説明 図１は、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶの概略図である。 図２は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ３５１，ｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣＶ４ １５及びｐＨＣＶ４１６により発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ２及びＡＰＰ−Ｈ ＣＶ Ｅ１融合タンパク質のアミノ酸の位置の概略図である。 図３は、ＨＣＶ陽性ヒト血清を用いてＨＥＫ−２９３細胞中でｐＨＣＶ１７２ 、ｐＨＣＶ４１５及びｐＨＣＶ４１６により発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１融 合タンパク質について得られた、放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）の結果を表す。 図４は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ４１８、ｐＨＣＶ４１９、ｐＨＣＶ４ ２０、ｐＨＣＶ４２１及びｐＨＣＶ４２２により発現された、ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質のアミノ酸の位置の概略図である。 図５は、ヒトＨＣＶ患者血清を用い、ＨＥＫ−２９３細胞中でｐＨＣＶ４１８ 、ｐＨＣＶ４１９、ｐＨＣＶ４２０、ｐＨＣＶ４２１及びｐＨＣＶ４２２により 発現された、ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質について得られたＲＩ ＰＡ結果を表す。 図６は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ４２３、ｐＨＣＶ４２４、ｐＨＣＶ４ ２５及びｐＨＣＶ４２９により発現された、ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タ ンパク質のアミノ酸の位置の概略図である。 図７は、ヒトＨＣＶ患者血清を用い、ＨＥＫ−２９３細胞中でｐＨＣＶ４２３ 、ｐＨＣＶ４２４、ｐＨＣＶ４２５及びｐＨＣＶ４２９により発現された、ＡＰ Ｐ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質について得られたＲＩＰＡ結果を表す。 図８は、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２の開裂及びＥ１エピトープに必須のＨＣＶ配列を 表す。発明の詳細な説明 本発明は、哺乳動物発現系中で発現されるグリコシル化ＨＣＶ Ｅ１及びＥ２ 又はＥ１−Ｅ２融合タンパク質の産生法を提供する。これらのグリコシル化タン パク質は、例 えば、スクリーニング及び予後に適用するためのアッセイ系を含む種々の態様に おいて診断上有用である。哺乳動物細胞中で発現されるこれらのＨＣＶウイルス エンベロープタンパク質はさらに、感受性細胞型、例えば、肝細胞など上の特異 的ウイルス結合部位若しくは配列及び／又はウイルスレセプターの解明を含む阻 害剤の研究にも有用である。 本明細書に記載のように哺乳動物発現系中で産生された特異的発現クローンを 得ることにより、ＨＣＶ感染段階、例えば、急性か進行中若しくは長期潜伏型感 染か、及び／又は最近の感染か過去の感染経験かの決定を支援し得る診断アッセ イ用の抗原が提供される。これらの特異的発現クローンは、ＨＣＶに起因する疾 患の消散と慢性肝炎とを区別するような疾患の消散についての予後指標ともなる 。グリコシル化構造抗原に対する過去の血清変換は、これらの哺乳動物発現系中 で産生されたタンパク質を用いて検出し得ると考えられる。抗体は、モノクロー ナル抗体でもポリクローナル抗体でも、これらの哺乳動物発現系由来のタンパク 質から産生され得、次いで、該抗体を診断、予後及び治療用に用い得る。 これらの哺乳動物発現系から産生されたタンパク質並び に該タンパク質から得られた試薬は、バイアル又はビンのような１つ以上の容器 を含むキットの形態で提供され得、各容器は、アッセイの実施に都合の良いテス トキットとしてパッケージされた別個の試薬、例えば、モノクローナル抗体、モ ノクローナル抗体のカクテル、又は組換えポリペプチドを含んでいる。本発明の 他の態様には、固相に結合したＨＣＶエピトープと固相に結合したＨＣＶエピト ープに対する抗体とからなるポリペプチドが含まれる。さらに、ポリペプチド発 現条件下に、ＨＣＶエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む哺乳 動物発現ベクターで形質転換した宿主細胞をインキュベートすることによる、Ｈ ＣＶエピトープを含むポリペプチドの生産法、並びに該方法により生産されたＨ ＣＶエピトープを含むポリペプチドも含まれる。 本発明は、本発明により提供される組換えタンパク質及び種々の形態で本明細 書に記載されている抗体を利用するアッセイを提供し、該アッセイはいずれも、 該アッセイにおいて測定可能なシグナルを生成するシグナル生成化合物を用い得 る。検出手段となるシグナル生成化合物を用いないアッセイも提供される。記載 されているどのアッセイも たいてい抗原若しくは抗体又はその両者を検出し、テスト試料と本明細書に提供 されている少なくとも１種の試薬とを混合して、少なくとも１種の抗原／抗体複 合体を形成する段階及び該複合体の存在を検出する段階を含む。これらのアッセ イは本明細書に詳細に記載されている。 本発明には、本明細書に記載のＨＣＶからのエンベロープ遺伝子を含む哺乳動 物発現系から得られた免疫原性ペプチドを含む、ＨＣＶ感染症治療用ワクチンが 包含される。さらに本発明には、ＨＣＶ抗体の産生法も包含され、該方法は、Ｈ ＣＶエピトープを含む分離された免疫原性ポリペプチドを、接種を受けた個体に 免疫応答を生起させるに十分な量で該個体に投与することを含む。 「身体構成成分を含む抗体」（即ち、テスト試料）という用語は、当該抗体の 供給源である患者の身体の構成成分を指す。これらの成分は当該分野では周知で ある。これらのテスト試料には、本明細書に記載の本発明方法によりテストし得 る生物学的試料が含まれ、該試料には、ヒト及び動物の体液、例えば、全血、血 清、血漿、髄液、尿、リンパ液、並びに気道、腸管及び尿生殖路の種々の外分泌 液、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など、生物学的流体、例え ば、細胞培養上清、固定組織標本及び固定細胞標本が含まれる。 本発明により記載されている組換えタンパク質を調製した後、該組換えタンパ ク質を用いて、ＨＣＶに対する抗原又は抗体の存在を検出すべく、本明細書に記 載のユニークなアッセイを開発することができる。これらの組成物は、ＨＣＶの 免疫エピトープに特異的に結合する特異的組換えタンパク質によるモノクローナ ル及び／又はポリクローナル抗体の産生にも用い得る。さらに、少なくとも１種 の本発明組換えタンパク質を用い、当該分野において公知の以下の方法に従って ワクチンを製造し得る。 典型的には、そのようなワクチンは、溶液又は懸濁液として注射可能な物質と して製造されるが、注射の前に液中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態とし て準備してもよい。製剤を乳化してもよいし、タンパク質をリポソーム中に封入 してもよい。活性免疫原性成分を該成分に適合し得る薬理学上許容可能な賦形剤 と混合することが多い。適当な賦形剤には、水、塩水、デキストロース、グリセ ロール、エタノールなどが含まれるが、それらには限定されない。これらの賦形 剤を種々の量で組み合わせて用いてもよ い。ワクチンはさらに、少量の補助物質、例えば、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩 衝剤及び／又はワクチンの効果を増強するアジュバントを含んでいてもよい。例 えば、そのようなアジュバントには、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラ ミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル −ノルヌラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎ ｏｒ−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチルムラミウル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ ソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１′２′−ジパルミトイル−ｓｎ−グリ セロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５ Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）及び２％スクアレン ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が含まれ得る。アジュバントの効果は、種々のアジュバント からなるワクチン中に投与することから得られるＨＣＶ抗原配列を含む免疫原性 ポリペプチドに対する抗体の量を測定して評価し得る。 ワクチンは通常、静脈又は筋肉内注射により投与する。他の投与形態に好適な その他の製剤には、座薬、及び場合によって経口製剤が含まれる。座薬の場合、 慣用の結合剤 及び担体には、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれ得るが、 それらには限定されない。そのような座薬は、約０．５〜約１０％の範囲、好ま しくは約１〜約２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成し得る。経口製剤に は、例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム 、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬級の慣用賦 形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤 、制御溶出製剤又は粉剤形態を取り得、約１０〜約９５％、好ましくは約２５〜 約７０％の有効成分を含んでいる。 ワクチンに用いるタンパク質は、中性又は塩形態でワクチンに配合し得る。医 薬上許容し得る塩には、ペプチドの遊離アミノ基と共に形成されるもの及び塩酸 若しくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸のよ うな有機酸及び当業者には公知の他の酸と共に形成される酸付加塩である。遊離 カルボキシル基と共に形成される塩も、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウ ム、アンモニウム、カルシウム又は銅水酸化物など、並びに有機塩基、例えば、 イソプロピルアミン、トリメチルアミン、 ２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンプロカイン、及び当業者には公知の他 の塩基から誘導され得る。 ワクチンは、投与製剤に適合し得る経路で、予防上及び／又は治療上有効な量 で投与する。投与すべき抗原の量は一般に、投与対象患者、患者の免疫系の抗体 合成能及び必要とされる保護の程度に応じて、１回用量当たり約５〜約２５０マ イクログラムの範囲であってよい。投与すべき有効成分の正確な量も、処方者の 判断により、各患者毎に異なっていてよい。ワクチンは、単回又は複数回計画に 基づいて投与し得る。複数回とは、一次ワクチン接種コースを１〜１０回の別個 の用量で行い、次いで他の用量を免疫応答の維持及び／又は増強に必要な時間間 隔、例えば、２次用量の投与までに１〜４ケ月空けて、また患者によって必要な 場合には、次の用量の投与までに数ケ月の間隔を置いて投与し得る。投与方式は 、少なくとも部分的には患者の必要度に応じ、且つ処方者の判断に基づいて決定 される。免疫原性ＨＣＶエンベロープ抗原を含むワクチンは、他の免疫調節物質 、例えば免疫グロブリンと共に投与し得ると考えられる。 アッセイに用いられる試薬は、それそれがアッセイに用 いられる別個の試薬、例えば、モノクローナル抗体、又は種々のモノクローナル 抗体のカクテル、又はポリペプチド（組換え体又は合成体）を含むバイアル又は ビンのような１個以上の容器を含むキットの形態で提供され得るよう意図する。 「固相」（「固体担体」）は、当業者には公知であるが、重要ではなく、反応 トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性又は非磁性ビーズ、ニ トロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子のような微粒子、プラスチック チューブ、ガラス若しくはシリコンチップ、ヒツジの赤血球などが含まれ、それ らは全て好適な例である。固相上へのペプチドの固定化に適当な方法には、イオ ン相互作用、疎水性相互作用、共有相互作用などが含まれる。本明細書に用いら れている「固相」とは、不溶であるか、又はその後の反応により不溶とされ得る 任意の物質を指す。固相は、捕獲試薬を引きつけ且つ固定化するその固有の能力 に応じて選択し得る。あるいは、固相は、捕獲試薬を引きつけ且つ固定化する能 力を有する付加的レセプターを保持し得る。付加的レセプターは、捕獲試薬自体 又は捕獲試薬に結合した荷電物質と反対の電荷を帯びた荷電物質を含 み得る。あるいは、付加的レセプター分子は、固相に結合し、特異的結合反応に より捕獲試薬を固定化する能力を有する任意の特異的結合メンバーであってよい 。該レセプター分子は、アッセイの実施前又は実施中に捕獲試薬と固相物質とを 間接的に結合させ得る。 固相は、検出抗体のアクセスを可能にするに十分な多孔度及び抗原への結合に 適した表面親和性を有する任意の適当な多孔質物質をも含み得るように意図され ており、これも本発明の範囲内に含まれる。一般に微小孔性構造が好ましいが、 水和状態でゲル構造を有する物質も使用し得る。そのような有用な固体担体には ：天然高分子炭水化物及びそれらの合成変性された、架橋又は置換誘導体、例え ば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアルゴム、特に硝酸及 びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、及びセルロー スエーテル；窒素を含む天然ポリマー、例えばタンパク質、及び架橋若しくは変 性ゼラチンを含む誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えば、ラテックス及びゴム ；適当な多孔質構造をもって製造され得る合成ポリマー、例えば、ポリエチレン 、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニ ル及びその部分加水分解誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポ リメタクリレート、上記重縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えば、ポリ エステル、ポリアミド及び他のポリマー、例えば、ポリウレタン又はポリエポキ シド；多孔質無機物質、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ ムを含むアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩、アルカリ及び アルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；アルミニウム及 びシリコン酸化物又は水和物、例えば、粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼ オライト、シリカケル又はガラス（これらの物質は上記高分子物質と共にフィル ターとして用い得る）；並びに上記種の混合物又はコポリマー、例えば既に存在 する天然ポリマーの上に合成ポリマーを重合して得られるグラフトコポリマーが 含まれる。これらの物質は全て、適当な形状、例えば、フィルム、シート若しく はプレートとして用いてもよいし、あるいは、適切な不活性担体、例えば、ペー パー、ガラス、プラスチックフィルム若しくは繊維上にコーティングするか、接 着若しくは積層してもよい。 ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体 を含む多岐にわたる試薬に対する優れた吸収及び吸着特性を有している。ナイロ ンも同様な特性を有しており、これも適当である。本明細書に記載のそのような 多孔質固体支持体は、厚さが約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ のシート形態が好ましいと考えられる。孔径は、広範囲に変化し得、好ましくは 、約０．０２５〜１５ミクロン、特には、約０．１５〜１５ミクロンである。そ のような担体の表面は、該担体と抗原又は抗体の共有結合を引き起こす化学プロ セスによって活性化され得る。しかし一般に、良く解明されていない疎水力によ る多孔質物質上に吸着されることにより抗原又は抗体の不可逆結合が得られる。 適当な固体担体は、米国特許出願第２２７，２７２号にも記載されている。 「指示試薬」は、ＨＣＶに対する特異的な結合メンバーに接合した外部手段に より検出し得る測定可能シグナルを生成し得且つ生成する「シグナル生成化合物 」（標識）を含む。本明細書に用いられている「特異的結合メンバー」とは、特 異的結合ペアのメンバーを意味する。即ち、化学的又は物理的手段により一方の 分子が他方の分子に特異的に結合する２つの異なる分子である。指示試薬は、Ｈ ＣＶ に対する特異的結合ペアの抗体メンバーであると共に、ビオチン又は抗ビオチン 、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エ フェクター又はレセプター分子、補酵素及び酵素、酵素阻害剤又は酵素などのよ うなハプテン−抗ハプテン系を含む任意の特異的結合ペアのメンバーであっても よい。免疫反応性特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイではＨＣＶに、 コンペティティブアッセイでは捕獲試薬に、又は間接アッセイでは補助的な特異 的結合メンバーに結合し得る抗体、抗原、又は抗体／抗原複合体であってよい。 考えられる種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、色素原、触媒、例え ば酵素、蛍光化合物、例えばフルオレセン及びローダミン、化学発光化合物、例 えばアクリジニウム、フェナントリジニウム及びジオキセタン化合物、放射性元 素並びに直視標識が含まれる。酵素の例としては、アルカリフォスファターゼ、 西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。特定の 標識の選択は重要ではないが、それ自体のみからか又は１種以上の付加物質と組 み合わせてシグナルを生成させることができる。 種々の他の固相を用いる他の実施態様も意図されており、これも本発明の範囲 内に包含される。例えば、ＥＰ公開第０３２６１００号に対応する同時係属米国 特許出願第１５０，２７８号及び米国特許出願第３７５，０２９号（ＥＰ公開第 ０４０６４７３号）（両出願とも本出願人の所有になり、本明細書に参照として 組込むものとする）に記載の負に帯電したポリマーとの固定性反応複合体を分離 するためのイオン捕獲手順を用い、本発明に従って高速液相免疫化学反応を実施 することができる。固定性免疫複合体を、負に帯電したポリアニオン／免疫複合 体と前処理した正に帯電した多孔質基質との間のイオン相互作用により残りの反 応混合物から分離し、ＥＰＯ公開第０，２７３，１１５号に対応する同時係属米 国特許出願第９２１，９７９号（本出願人の所有になり、本明細書に参照として 組込むものとする）に記載の化学発光シグナル測定に記載のものを含む、既に記 載されている種々のシグナル生成系を用いて検出する。 さらに、本発明の方法は、固相が微粒子を含む自動化及び半自動化系を含む微 粒子技術を利用する系における使用に適合し得る。そのような系には、それそれ 公開ＥＰＯ出 願第０４２５６３３号及び同第０４２４６３４号に対応する係属米国特許出願第 ４２５，６５１号及び同第４２５，６４３号（本明細書に参照として組込むもの とする）に記載のものが含まれる。 免疫アッセイに走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を用いるのも、本発明のモノ クローナル抗体が容易に適合し得る技術である。走査型プローブ顕微鏡、特に原 子間力顕微鏡において、捕獲相、例えば、少なくとも１種の本発明モノクローナ ル抗体を固相に固定し、走査型プローブ顕微鏡を用いて、固相表面上に存在し得 る抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を使用すれば、通常多く の免疫アッセイ系で抗原／抗体複合体の検出に用いなければならない標識の必要 がなくなる。そのような系が、係属米国特許出願第６６２，１４７号に記載され ており、該出願も本出願人の所有になり、本明細書に参照として組込むものとす る。 特異的結合反応をモニターするためのＳＰＭの使用は、多くの態様で発生し得 る。１つの実施態様において、特異的結合パートナーの一方のメンバー（本発明 のモノクローナル抗体である分析物特異物質）を走査に適した表面に結 合する。分析物特異物質は、当業者には公知の方法に従って、プラスチック又は 金属表面の固相を含むテスト片に吸着結合させ得る。あるいは、誘導体化プラス チック、金属、シリコン又はガラスの固相を含むテスト片への特異的結合パート ナー（分析物特異物質）の共有結合を利用してもよい。共有結合法は当業者には 公知であり、テスト片に特異的結合パートナーを不可逆的に結合させる種々の手 段が含まれる。テスト片がシリコン又はガラスの場合、その表面は、特異的結合 パートナーとの結合の前に活性化させなければならない。活性化シラン化合物、 例えば、トリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（ Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（ ３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、それぞれアミノ、ビニル及び チオールのような反応性基を導入し得る。そのような活性化表面を用いて、結合 パートナーを直接結合したり（アミノ又はチオールの場合）、又は活性化表面を さらにリンカー、例えば、グルタルアルデヒ ド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ ９スクシンイミジル３− ［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４− ［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ （スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ （スクシンイミジル ４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）と反応させ て、該表面から結合パートナーを分離し得る。ビニル基を酸化して、共有結合用 の媒体とすることも可能である。ビニル基は、ポリアクリル酸のような種々のポ リマーの重合用アンカーとして用い、それによって特異的結合パートナー用の多 重結合部位を得ることもできる。アミノ表面を種々の分子量を有する酸化デキス トランと反応させて、種々のサイズ及び能力を有する親水性リンカーを得ること ができる。酸化性デキストランの例としては、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−４０（分子 量４０，０００）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１１０（分子量１１０，０００）、Ｄ ｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００（分子量５００，０００）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−２ Ｍ（分子量２，０００，０００）（これらは全てＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃ ａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）、又はＦｉｃｏ ｌｌ（分子量 ７０，０００）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）が挙げられる。さらに、高分子電解質相互作 用を用い、１９８８年１月２９日出願の係属米国特許出願第１５０，２７８号及 び１９８９年７月７日出願の同第３７５，０２９号（どちらも本出願人の所有に なり、本明細書に参照として組み込むものとする）に記載の技術及び化学を用い て、特異的結合パートナーをテスト片表面に固定化してもよい。好ましい結合法 は共有手段によるものである。特異的結合メンバーを結合した後、表面をさらに 、血清、タンパク質又は他のブロッキング剤で処理して、非特異的結合を最小限 にし得る。表面を、製造現場又は使用場所で走査して、アッセイ目的に対する表 面の適合性を検証し得る。走査法は、テスト片の特異的結合特性を改変しないも のでなければならない。 組換えタンパク質を用いてテスト試料中の抗ＨＣＶの存在を検出し得る。例え ば、テスト試料を少なくとも１種の組換えタンパク質が結合した固相と共にイン キュベートする。これらを、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下に 反応させる。インキュベーション後、抗原／抗体 複合体を検出する。選択されたアッセイ系によっては、指示試薬を用いて検出を 容易にし得る。別のアッセイ法においては、テスト試料と本明細書に記載のよう にして産生された組換えタンパク質が結合した固相とを接触させ、さらに、好ま しくは指示試薬で標識した組換えタンパク質に特異的なモノクローナル又はポリ クローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下 にインキュベートした後、固相を遊離相から分離し、ＨＣＶ抗体の存在を示すも のとして固相又は遊離相中で標識を検出する。本発明のタンパク質を用いる他の アッセイ法が考えられる。これらのアッセイには、テスト試料と、哺乳動物発現 系中で産生された少なくとも１種の組換えタンパク質が結合した固相とを接触さ せ、固相とテスト試料とを、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下に インキュベートし、次いで、固相と標識した組換え抗原とを接触させることが含 まれる。上記及び他のアッセイが、係属米国特許出願第０７／７８７，７１０号 （本出願人の所有になり、本明細書に参照として組込むものとする）に記載され ている。 免疫原として本発明の融合タンパク質を用いてモノクロ ーナル抗体及びポリクローナル抗体を産生させ得ることは本発明の範囲内に包含 される。モノクローナル抗体又はそのフラグメントはＨＣＶ抗原の検出に別個に 用い得る。本明細書に提供されているモノクローナル抗体（及びそのフラグメン ト）の組合わせは、それそれが異なる結合特異性を有する、本発明の少なくとも １種の抗ＨＣＶ抗体と他のＨＣＶ領域に対する抗体との混合物、即ち「カクテル 」の構成成分として一緒に用いることもできる。従って、このカクテルには、Ｈ ＣＶエンベロープタンパク質に対するモノクローナル抗体もＨＣＶゲノムの他の 抗原決定基に対する他のモノクローナル抗体も含まれ得る。モノクローナル又は ポリクローナル抗体の産生法は当該分野において周知である。例えば、Ｋｏｈｌ ｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９７５）；Ｊ． Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｃ ＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃｏ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）；及びＬ ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４−６１９（１９９０） （これらは本明細書に参照として組込むものとす る）を参照されたい。 アッセイ法に用い得るポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、アッセイ に用いられる特異的ＨＣＶ領域又は他のＨＣＶタンパク質に特異的に結合しなけ ればならない。ポリクローナル抗体は哺乳動物起源のものを用いるのが好ましい ；ヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジの抗ＨＣＶポリクローナル抗体を用い得る。最 も好ましいポリクローナル抗体は、ウサギのポリクローナル抗ＨＣＶ抗体である 。アッセイに用いられるポリクローナル抗体は単独又はポリクローナル抗体のカ クテルとして用い得る。アッセイ法に用いられるカクテルは異なるＨＣＶ特異性 を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から構成されているために 、ＨＣＶ感染の診断、評価及び予知、並びにＨＣＶタンパク質の鑑別及び特異性 の研究に有用である。 別のアッセイ法においては、ＨＣＶに対する抗体及び／又は抗原の存在を以下 のような同時アッセイで検出し得る。テスト試料を、固相に結合した第１分析物 に特異的な第１結合メンバーを含む第１分析物の捕獲試薬と、第２固相に結合し た第２分析物に対する第１結合メンバーを含む第２分析物の捕獲試薬とに同時に 接触させて混合物を形成する。 この混合物を、捕獲試薬／第１分析物及び捕獲試薬／第２分析物複合体の形成に 十分な時間及び条件下にインキュベートする。次いで、そのようにして形成され た複合体を、シグナル生成化合物で標識した第１分析物に特異的な結合ペアのメ ンバーを含む指示試薬と、シグナル生成化合物で標識した第２分析物に特異的な 結合ペアのメンバーを含む指示試薬とに接触させて第２混合物を形成する。この 第２混合物を、捕獲試薬／第１分析物／指示試薬複合体と捕獲試薬／第２分析物 ／指示試薬複合体の形成に十分な時間及び条件下にインキュベートする。テスト 試料中の１種以上の分析物の存在を示すものとして、固相のいずれか又は両方上 に形成された複合体と接触して生成されたシグナルを検出して１種以上の分析物 の存在を決定する。このアッセイ法においては、ヒト発現系から誘導されたタン パク質も、本明細書に開示されている哺乳動物発現系から誘導されたタンパク質 から産生されたモノクローナル抗体も用い得る。そのようなアッセイ系が、１９ ９０年８月２９日出願のＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅ ｔｅｃｔｉｎｇ Ｏｎｅ Ｏｒ Ｍｏｒｅ Ａｎａｌｙｔｅｓと題する係属米国 特許出願第０７／５７４，８２１号（本出願人 の所有になり、本明細書に参照として組込むものとする）にさらに詳細に記載さ れている。 さらに別の検出法において、本発明の融合タンパク質を用いて産生されたモノ クローナル抗体を、免疫組織化学的分析による固定組織部分及び固定細胞中のＨ ＣＶ抗原の検出に用いることができる。さらに、これらのモノクローナル抗体は 、ＣＮＢｒ活性化セファロースに類似の基質に結合し得、細胞培養株又は血液若 しくは肝臓のような生物組織からの特異的ＨＣＶタンパク質のアフィニティー精 製に用いることができる。さらにモノクローナル抗体は、治療用又は他の同様な 用途のキメラ抗体の産生にも用い得る。 別のアッセイ法においては、本発明の融合タンパク質を用いて産生された単一 のモノクローナル抗体又は１種以上のモノクローナル抗体の組合わせをＨＣＶタ ンパク質に対する抗体検出用のコンペティティブプローブとして用いることがで きる。例えば、単独又は組合わせたＨＣＶタンパク質を固相上にコーティングし 得る。次いで、ＨＣＶ抗原に対する抗体を含むおそれのあるテスト試料をシグナ ル生成化合物を含む指示試薬及び少なくとも１種のモノクローナル抗体と共に、 テスト試料及び固相に対する指示試薬又 は固相に対する指示試薬複合体を形成するに十分な時間及び条件下にインキュベ ートする。モノクローナル抗体と固相との結合における減少は定量的に測定し得 る。該テスト試料中のシグナルが、確実に陰性のＮＡＮＢ肝炎テスト試料から生 成されたシグナルに比べて測定し得る程度に減少すれば、テスト試料中に抗ＨＣ Ｖ抗体が存在することが示される。 本発明は固相の使用の選択を開示しているが、本発明のタンパク質は非固相ア ッセイ系に使用し得ると考えられる。これらのアッセイ系は当業者には公知であ り、本発明の範囲内に包含されるものとする。 本発明を実施例により説明するが、該実施例は、本発明の例示を意図し、本発 明の精神及び範囲を限定するものではない。 実施例 実施例１：ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１、ＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ２ 及びＡＰＰ−ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２融合クローンの産生 図１に示されているベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）中で全ての哺乳動物発現構築物を作製した。 しかし、本構築 物及び以下に記載の他の構築物を得るために当該分野で公知の標準手順に従って 他の発現ベクターを用い得ることも考えられる。本明細書に用いられているＨＣ Ｖ及びＡＰＰ配列の中には、参照として既に本明細書に組み込まれている米国特 許出願第０８／１４４，０９９号に既に記載されているものも含まれている。 図２に示されているように、ｐＨＣＶ１６８（ｐＨＣＶ１６８の核酸配列は配 列番号：３として示されており、ｐＨＣＶ１６８のアミノ酸配列は配列番号：４ として示されている）のヒト成長ホルモンシグナル配列の代わりに、Ｋａｎｇら により、既にＮａｔｕｒｅ ３２５：７３３−７３６（１９８７）に記載された アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）配列とＨＣＶ Ｅ１の全長を合わせてク ローンｐＨＣＶ１７２（配列番号：２）を構築した。先ず、ＡＰＰ配列のＨｉｎ ｄIII−ＫｐｎｌフラグメントをｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩ部位でサ ブクローン化した。このクローンのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントとｐ ＨＣＶ１６８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとをｐＲｃ／ＣＭＶのＨｉｎ ｄIII及びＸｂａＩ部位で連結し、ｐＨＣＶ１７２（配列番号：２）を得た。 Ｃ末端疎水性領域が欠失したクローンｐＣＨＶ４１５（配列番号：５）を以下 のように構築した：図２に示されているように、ｐＨＣＶ１７２（配列番号：２ ）をＰｖｕII及びＨｉｎｄIIIで消化し、ＡＰＰ及びＥＩの殆どの部分を含むフ ラグメントをｐＲｃ／ＣＭＶのＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位でクローン化した 。クローンｐＨＣＶ４１５（配列番号：５）はＨＣＶ Ｅ１のアミノ酸３３７〜 ３８３が欠失している。 図２に示されているように、Ｅ１の内部疎水性アミノ酸配列２６０〜２９６を 含むＡｃｙＩ−ＡｃｙＩフラグメントを除去して、ｐＨＣＶ４１５（配列番号： ５）からクローンｐＨＣＶ４１６（配列番号：６）を誘導した。クローンｐＨＣ Ｖ４１６（配列番号：６）は、ＨＣＶのアミノ酸配列１９２〜２５９及び２９７ 〜３３６を含んでいる。 クローンｐＨＣＶ３５１（配列番号：７）をｐＨＣＶ１６７（ｐＨＣＶ１６７ の核酸配列は配列番号：８で示されており、ｐＨＣＶ１６７のアミノ酸配列は配 列番号：９で示されている）から誘導した。ｐＨＣＶ１６７は米国特許出願第０ ８／１４４，０９９号に既に記載されている。図２に示されているように、ＨＣ Ｖ Ｅ２のアミノ酸６５４の 後に停止コドンを挿入してｐＨＣＶ３５１（配列番号：７）をクローン化した。 従って、このクローンは、Ｃ末端疎水性残基が欠失している。 クローンｐＨＣＶ４１８（配列番号：１０）を以下のように構築した：ｐＨＣ Ｖ１７２（配列番号：２）をＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIで消化し、ＡＰＰ及びＥ １配列（アミノ酸１９２〜３３６）を含むフラグメントを分離した。クローンｐ ＨＣＶ３５１（配列番号：７）もＮａｅＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｅ２のアミノ 酸３９３〜６５４を含むフラグメントを分離した。図４に示されているように、 これらのフラグメントをｐＲｃ／ＣＭＶのＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位の間で クローン化した。 図４に示されているように、クローンｐＨＣＶ４１８（配列番号：１０）から ＡｃｙＩ−ＡｃｙＩフラグメント上に存在する内部疎水性領域を除去してクロー ンｐＨＣＶ４１９（配列番号：１１）を構築した。従って、ｐＨＣＶ４１９（配 列番号：１１）は、ＨＣＶアミノ酸配列１９２〜２５９、２９７〜３３６及び３ ９３〜６５４を含んでいる。 クローンｐＨＣＶ１７６（配列番号：１２）は、配列番号：１で示されている ＨＣＶ配列の５′半の５２８１塩基 対を含んでいる。手短かに言えば、実験的にＨＣＶに感染させたチンパンジー（ 「ＣＯ」と称する）の血清又は血漿から分離したＲＮＡを、原始型ＨＣＶ−１配 列から誘導されたランダムヘキサマープライマー又は特異的アンチセンスプライ マーを利用する逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに転写した。該配列は、Ｃｈｏｏら （Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４ ５１−２４５５［１９９１］、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセス番号Ｍ６ ２３２１を介して入手可能）により報告されている。次いで、このｃＤＮＡを、 ＰＣＲ及びＡｍｐｌ スプライマーの約１０００−２０００ヌクレオチド上流に位置する第２センスプ ライマー又はＨＣＶの１０００−２０００ヌクレオチドフラグメントに隣接する センスプライマー／アンチセンスプライマーペアを用いて増幅する。当該分野に おいて公知の標準手順に従って２５〜３５サイクル増幅を行った後、該反応混合 物のアリコートを、第２セットのＰＣＲプライマー中に存在するエンドヌクレア ーゼ認識配列を用い、繰り込みＰＣＲ（又は「ＰＣＲ−２」）にかけ、ＰＣＲプ ライマーの初期ペアに対して内側に位置 するセンス／アンチセンスプライマーペアを用いて、ＨＣＶ遺伝子セグメントを 分析及びサブクローン化に十分な量にさらに増幅する。このようにして、７個の 隣接ＨＣＶ ＤＮＡフラグメントを作製し、次いで、遺伝子クローン化法を用い てこれを連結することができた。連結する前に、個々のフラグメントのそれぞれ のＤＮＡ配列を決定し、配列番号：１で示されているゲノムアミノ酸配列に翻訳 した。２つのクローン（ｐＨＣＶ１４１［配列番号：１３］及びｐＨＣＶ１５０ ［配列番号：１４］）からの２つのフラグメント（ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII３２３ １ｂｐ及びＢｇｌII−ＸｂａＩ２０５０ｂｐフラグメント）を合わせて、ｐＨＣ Ｖ１７６（配列番号：１２）を作製した。この方法は、米国特許出願第０８／１ ４４，０９９号（参照として本明細書に既に組み込んだ）に記載されている。 図４の３つのフラグメント：アンピシリン耐性遺伝子（ＰｖｕＩ部位）の５′ 半からＡＰＰ及びＥ１（ＢａｍＨＩ部位）までを含むｐＨＣＶ１７２（配列番号 ：２）からのＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、アンピシリン耐性遺伝子（Ｐ ｖｕＩ部位）の３′半からＥ２（ＳａｌＩ部位）の３′末端までを含むｐＨＣＶ ３５１（配列番号：７）から のＰｖｕＩ−ＳａｌＩフラグメント、及びＥ１の３′半及びＥ２の５′半を含む ｐＨＣＶ１７６（配列番号：１２）からのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントを 合わせて、クローンｐＨＣＶ４２０（配列番号：１５）を構築した。従って、ｐ ＨＣＶ４２０（配列番号：１５）はＨＣＶアミノ酸配列１９２〜６５４を含んで いる。 図４に示されているように、ＡｃｙＩ−ＡｃｙＩフラグメント上に存在する内 部疎水性領域を除去して、ｐＨＣＶ４２０（配列番号：１５）からクローンｐＨ ＣＶ４２１（配列番号：１６）を誘導した。 図４に示されているように、３つのフラグメント：ＡＰＰ及びｐＨＣＶ４２０ （配列番号：１５）からのＥ１配列のアミノ酸１９２〜２７９を含むＨｉｎｄII I−ＡｖａIIフラグメント、ｐＨＣＶ３５１（配列番号：７）からのＥ２のアミ ノ酸配列３９３〜６５４を含むＮａｅＩ−ＸｂａＩフラグメント、及びｐＲｃ／ ＣＭＶからのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントを連結して、クローンｐＨＣ Ｖ４２２（配列番号：１７）を誘導した。 クローンｐＨＣＶ４２３（配列番号：１８）及びｐＨＣＶ４２４（配列番号： １９）を以下のように構築した：図 ６に示されているように、ｐＨＣＶ４２１（配列番号：１６）をＡｖａII及びＮ ａｅＩで消化して、Ｅ１のアミノ酸配列３３７〜３７９を除去するか、又はＰｖ ｕII及びＮｃｏＩで消化してＥ１のアミノ酸配列３３７〜３６３を除去した。 図６に示されているように、３つのフラグメント：ＡＰＰ及びＥ１のアミノ酸 配列３３６までを含むｐＨＣＶ１７２（配列番号：２）からのＨｉｎｄIII−Ｐ ｖｕII、Ｅ１のアミノ酸３８０〜３８３及びＥ２の３８４〜６５４を含むｐＨＣ Ｖ４２０（配列番号：１５）からのＮａｅＩ−ＸｂａＩフラグメント、並びにｐ Ｒｃ／ＣＭＶからのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩフラグメントからクローンｐＨＣＶ ４２５（配列番号：２０）を連結した。従って、ｐＨＣＶ４２５（配列番号：２ ０）は、ＨＣＶアミノ酸配列１９２〜３３６及び３８０〜６５４を含んでいる。 図６に示されているように、ｐＨＣＶ４２１（配列番号：１６）のＡｖａII− ＢａｍＨＩフラグメント上に存在するアミノ酸配列３２８〜３３９を含むフラグ メントを除去して、クローンｐＨＣＶ４２９（配列番号：２１）を作製した。 実施例２：ＲＩＰＡによるＨＣＶ抗原の検出 ＨＥＫ−２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）と称される、ヒトアデノ ウイルス５型で形質転換した一次ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞系を全てのトラン スフェクション及び発現分析に用いた。ＨＥＫ−２９３を、１０％ウシ胎児血清 （ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びフンギゾンを追加した最小必 須培地（ＭＥＭ）中に維持した。 Ｃｈｅｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ ７（８）：２７４５−２７５２（１９８７）により報告された修飾リン酸カ ルシウムプロトコルを用い、約３０μｇの精製ＤＮＡをＨＥＫ−２０３細胞にト ランスフェクトした。リン酸カルシウム−ＤＮＡ溶液をＨＥＫ−２９３細胞上で 約４〜６時間インキュベートした。溶液を除去し、次いで、細胞をＭＥＭ中さら に２４〜４８時間インキュベートした。タンパク質の発現を分析するために、ト ランスフェクトした細胞を、それぞれ１００μＣｉ／ｍｌのＳ−３５標識メチオ ニン及びシステインで８〜１４時間代謝標識した。培地を除去、貯蔵し、細胞を 先ずＭＥＭ中で洗浄し、次いで、１％トリトンＸ−１００ ｉｓ，ＭＯから入手可能）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び０ ．５％のデオキシクロエートを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）〔ＰＢＳ−ＴＤＳ と称される〕に溶解した。これらの細胞溶解物を氷上に１０〜１５分間放置し、 次いで、４℃で４５分間１２，０００×ｇで遠心して清澄化した。次いで、該標 識細胞溶解物及び／又は培地に対して標準放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）を行った 。手短かに言えば、標識した細胞溶解物（１５０μｌ）及び／又は培地（４００ μｌ）を３μｌのＪ７２８と称するＨＣＶ患者血清と共に、４℃で１時間インキ ュベートした。次いで、冷却ＨＥＫ−２９３細胞溶解物で前処理したタンパク質 Ａセファロースを加え、混合物を４℃で攪拌しながらさらに１時間インキュベー トした。次いで、試料を遠心し、ペレットをＰＢＳ−ＴＤＳ緩衝液で３回洗浄し た。免疫沈降法で回収したタンパク質を電気泳動試料緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉ ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１００ｍＭのジチオトレイトール［ＤＴＴ］、２％Ｓ ＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー及び１０％グリセロール）中で加熱して 溶 離した。炭素−１４標識分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬから得た）と共に溶離したタンパク質を、１３．５％ポリ アクリルアミド−ＳＤＳケルで分離し、次いでＥｎｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ 手可能）のようなフルオログラフィー試薬で処理し、真空下に乾燥、増感板を用 い、−７０℃でＸ線フィルムに暴露した。 図３は、ＡＰＰと全長又はＣ末端疎水性領域が欠失したＨＣＶ Ｅ１〔図２の ｐＨＣＶ１７２（配列番号：２）又はｐＨＣＶ４１５（配列番号：５）〕が、そ れらの産物を分泌し得なかったことを示している。内部及びＣ末端疎水性領域を 除去したものは、ＡＰＰシグナル配列によるＥ１の分泌には十分でなかった〔図 ２のｐＨＣＶ４１６（配列番号：６）〕。従って、ＡＰＰ構築物とのＨＣＶ Ｅ １−Ｅ２融合体を、効率的にＥ１を分泌し得る方法についてテストした。図５は 、Ｃ末端が欠失したＥ２が、ＡＰＰシグナル配列を用いて効率的に培地中にその 産物を分泌し得たことを示している〔図２のｐＨＣＶ３５１（配列番号：７）〕 。 先ず、いずれもアミノ酸配列３８３／３８４にあるＨＣ Ｖ Ｅ１及びＥ２の開裂部位〔Ｈｉｊｉｋａｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５４７−５５５１（１９９１）〕を欠失した、 ｐＨＣＶ４１８（配列番号：１０）、ｐＨＣＶ４１９（配列番号：１１）及びｐ ＨＣＶ４２２（配列番号：１７）を、Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の分泌について テストした。図５は、Ｅ１−Ｅ２が培地中でも細胞中でも発現され得たことを示 している。さらに、分泌された物質は、細胞溶解物中で発現された物質に比べて さらにグリコシル化が進んでいるようであった。第２セットの構築物〔図４のｐ ＨＣＶ４２０（配列番号：１５）及びｐＨＣＶ４２１（配列番号：１６）〕は、 アミノ酸配列３８３／３８４にあるＥ１及びＥ２開裂部位の欠失を含んでいなか った。図５のＲＩＰＡは、Ｅ１及びＥ２が開裂されたが、Ｅ２のみが培地中に分 泌され得たことを示している。さらに図５は、Ｅ１の発現が、Ｅ１の３′側にＥ ２を含まないｐＨＣＶ１７２からの発現に比べて、ｐＨＣＶ４２０（配列番号： ５）又はｐＨＣＶ４２１（配列番号：６）からの方がはるかに効率的であること を示している。Ｅ１の後にＥ２が続くこの種の融合構築物が、発現レベルの増強 並びに培地中へのＥ１及びＥ２の分泌に良好 な手段であると推定される。 クローンｐＨＣＶ４２３（配列番号：１８）、ｐＨＣＶ４２４（配列番号：１ ９）、ｐＨＣＶ４２５（配列番号：２０）及びｐＨＣＶ４２９（配列番号：２１ ）（図６）は、Ｅ１−Ｅ２の開裂部位（アミノ酸３８３／３８４）を含んでいた ので、該クローンを構築して同一構築物からのＥ１及びＥ２の分泌をテストした 。驚くべく且つ予想外なことには、図７に示されているように、Ｅ１及びＥ２の 開裂部位（Ｅ１の末端の４個のアミノ酸及びｐＨＣＶ４２０と同じＥ２）を含む ２つの構築物〔ｐＨＣＶ４２３（配列番号：１８）及びｐＨＣＶ４２５（配列番 号：２０）〕がＥ１及びＥ２を開裂しなかったことが判明した。しかし、それら の産物はＥ１−Ｅ２の融合タンパク質として培地中に分泌された（図７）。クロ ーンｐＨＣＶ４２４（配列番号：１９）及びｐＨＣＶ４２９（配列番号：２１） では、ｐＨＣＶ４２３（配列番号：１８）に比べてＥ１のＣ末端配列が増大した 。このようにして、種々の量のＣ末端疎水性配列及び一定量の内部疎水性配列を 除去して、同一構築物からのＥ１及びＥ２の分泌をテストした。図７は、Ｅ１末 端の２０個のアミノ酸とＥ２とにより、Ｅ１及びＥ２の部分開 裂が得られたことを示している。しかし、４４アミノ酸配列（ｐＨＣＶ４２９、 配列番号：２１）は、ゲル上のＥ２の移動度から判断すると、Ｅ１及びＥ２の完 全な開裂を生起した。ｐＨＣＶ４２９（配列番号：２１）から発現されたＥ１は 細胞溶解物中で容易に検出されたが、ｐＨＣＶ４２４（配列番号：１９）から発 現されたＥ１は細胞溶解物中にも培地中にも全く検出されなかった。さらに、Ｅ １は本明細書に記載の一連のクローンでテストしたどの構築物からも全く分泌さ れなかった。これらのデータは、ＥＣＶアミノ配列３４０〜３６３がＥ１エピト ープを含んでいることを示している。従って、ＨＣＶ Ｅ１抗原が哺乳動物の発 現系中に分泌され得たことは予想外であった。Ｅ１のＣ末端に最小欠失〔図８に 示されている配列（配列番号：２２で示されている）〕及びＥ１−Ｅ２の提案開 裂部位（アミノ酸３８３／３８４）を含んでいたクローンｐＨＣＶ４２５（配列 番号：２０）は、ＨＣＶアミノ酸配列１９２〜３３６及びアミノ酸３８３〜６５ ４からなる融合タンパク質としてＥ１及びＥ２を分泌する。 クローンｐＨＣＶ１７２（配列番号：２）、ｐＨＣＶ１７６（配列番号：１２ ）、ｐＨＣＶ３５１（配列番号：７） 及びｐＨＣＶ４２５（配列番号：２０）を、ブダペスト条約の下に、１９９４年 １月１４日、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークローンドライブ １２３０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎに寄託し、以下のＡＴＣＣ受託番号を得た：クローンｐＨＣＶ１７２は６９ ５３３、クローンｐＨＣＶ１７６は６９５３４、クローンｐＨＣＶ３５１は６９ ５３５及びクローンｐＨＣＶ４２５は６９５３６。示されている寄託物は、寄託 日から３０年間、該寄託物に対する最終要求から５年間、又は米国特許の有効年 数の中で最も長い期間保持される。これらの寄託物及び本明細書に記載の他の寄 託物は便宜のためのみを意図しており、本明細書の記載に鑑みて本発明の実施に 必要なものではない。 本明細書に提供されているタンパク質及び哺乳動物発現系の使用についての他 の種々の用途は当業者には明らかであろう。従って、本発明は添付請求の範囲に よってのみ限定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/576 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ０７Ｋ 16/08 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/08 (72)発明者 デサイ，シヨアシユ・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、エイミー・レイン・1408 (72)発明者 デベア，スシル・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノー スブルツク、フアーンズワース・2492

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プラスミドｐＨＣＶ−１７６。 ２．プラスミドｐＨＣＶ−１７２。 ３．プラスミドｐＨＣＶ−３５１。 ４．プラスミドｐＨＣＶ−４２５。 ５．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１７２により発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ１融合タンパク質。 ６．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−３５１により発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ２融合タンパク質。 ７．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−４２５により発現されたＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質。 ８．ＨＣＶ抗原又は抗体を含むおそれのあるテスト試料中のＨＣＶ抗原又は抗体 を検出する方法であって、その改良が、テスト試料と、ｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣ Ｖ３５１又はｐＨＣＶ４２５からなる群から選択されたグリコシル化ＨＣＶエン ベロープ抗原融合タンパク質とを接触させることからなり、前記融合タンパク質 が哺乳動物発現系中で産生される前記方法。 ９．ＨＣＶ抗原又は抗体を含むおそれのあるテスト試料中 のＨＣＶ抗原又は抗体を検出する方法であって、その改良が、テスト試料と、ｐ ＨＣＶ１７２、ｐＨＣＶ３５１又はｐＨＣＶ４２５からなる群から選択されたグ リコシル化ＨＣＶエンベロープ抗原融合タンパク質を用いて産生された抗体とを 接触させることからなり、前記融合タンパク質が哺乳動物発現系中で産生される 前記方法。 １０．ＨＣＶ抗原又は抗体を含むおそれのあるテスト試料中の該ＨＣＶ抗原又は ＨＣＶ抗体の存在を検出するためのテストキットであって、 哺乳動物発現系中で産生されたｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣＶ３５１又はｐＨＣＶ ４２５からなる群から選択されたグリコシル化ＨＣＶエンベロープ抗原融合タン パク質を含む容器を含む前記テストキット。 １１．哺乳動物発現系中で産生されたｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣＶ３５１又はｐＨ ＣＶ４２５からなる群から選択されたグリコシル化ＨＣＶエンベロープ抗原融合 タンパク質を用いて産生された抗体を含む容器をさらに含む請求項１０に記載の テストキット。 １２．ＨＣＶ抗原又はＨＣＶ抗体を含むおそれのあるテスト試料中の該ＨＣＶ抗 原又はＨＣＶ抗体の存在を検出する ためのテストキットであって、 哺乳動物発現系中で産生されたｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣＶ３５１又はｐＨＣＶ ４２５からなる群から選択されたグリコシル化ＨＣＶエンベロープ抗原融合タン パク質を用いて産生された抗体を含む容器をさらに含む前記テストキット。 １３．医薬上許容し得る賦形剤中に、哺乳動物細胞中のｐＨＣＶ１７２、ｐＨＣ Ｖ３５１又はｐＨＣＶ４２５からなる群から選択された融合タンパク質から発現 された免疫原性グリコシル化ＨＣＶタンパク質を薬理学上有効量含むＨＣＶ感染 症治療用ワクチン。