JPH06510288A - Ｓｉｒｓワクチンおよびｓｉｒｓ診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５ＩＲＳワクチンおよび５ＩＲＳ診断方法１且且浦 １９８７年以降、養豚産業は未知の病気で、しばしば［ブタミステリー病Ｊ　（ ＭＳＤ、最近は「ブタ下前呼吸器不全症候群Ｊ　（Ｓ　Ｉ　Ｒ３）と呼ばれてい る）と呼ばれる壊滅的伝染病の被害にあっている。これは、研究者らが病原を同 定できなかったためである。ＭＳＤは、化アメリカおよび欧州の全域にわたって 何十万ものブタに被害を与えてきた。ブタ１頭がＭＳＤに感染すると、３乃至７ 日以内に群れ全体にＭＳＤが感染する場合もある。１９８７年から１９９１年に かけて、養豚産業はＭＳＤが原因で何百万ドルもの利益を損失してしまった。最 近の調査から、ＭＳＤによって棚卸した雌ブタあたり　２５０ドルから５００ド ルの財務上の損失が生じたと推定されている。

ＭＳＤは、ブタに複数の症状をもたらす。ブタの飼育群におけるＭＳＤの最初の 徴候は、一般に、食欲不振および軽度の発熱である。さらに、この群のブタの特 に、耳、乳頭、鼻ならびに頚および肩の前頭部の皮膚に青みがかった変色が見ら れることがある。感染した皮膚の損傷は、非回復性になることがある。ただし、 ＭＳＤの関最も壊滅的な症状は、ブタの飼育群に生じる生殖不全である。ＭＳＤ によって、雌ブタは仔ブタを死産したり、呼吸困難の標準より小さい虚弱な仔ブ タを産んだり、離乳前に死亡する仔ブタを産んだりする。ＭＳＤ起因のその他の 生殖性の徴候には、早産、受胎率の低下、複数の雌ブタにおける周期不全および 同腹の仔ブタ総数の減少などがある。生殖不全によるブタの損失数は、年間のブ タ生産量の約１０乃至１５％であると推定されている。

このため、研究は、ＭＳＤの病原を単離する方向に向けられてきた。この結果、 多くの潜在的細菌病原体が単離されている、。ただし、潜在的細菌病原体の型は 、養豚場によってさまざまであった。ウィルス調査には、蛍光抗体試験、電子顕 微鏡検査、血清学的方法などがある。

これらの方法によって、ＭＳＤの病原を追求することはできなかった。その結果 、ブタの集団治療に使用することができるワクチンの開発に成功した者はいない 。

したがって、本発明の目的は、ブタの飼育群に投与した場合に、飼育集団中のＭ ＳＤの発現を低減することができる血清含有ワクチンを提供することにある。本 発明の別の目的は、ブタ母集団をそのワクチンで治療し、そのブタ母集団からＭ ＳＤを根絶する方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ＭＳＤ 診断方法を提供することにある。

ｌ匪皇入Ｉ 上記のおよび別の目的は、ブタにおけるＭＳＤの予防および治療するための血清 含有ワクチンならびにその診断方法に向けられた本発明によって達成することが できる。

本発明のワクチンは、ブタにＭＳＤを感染させる病原菌由来である。病原菌は、 ＭＳＤに感染したブタの調整組織接種材料から得られ、肺組織から得られること が好ましい。病原菌は、ブタ感染組織の接種材料に感染したサル細胞系などの動 用」は乳類細胞培養生成物であることが好ましい。この接種材料は、大きさが約 １．０ミクロン以下の生物学的粒子であることが好ましく、０．５ミクロン以下 であることが好ましく　０．２ミクロン以下であることが最も好ましい。接種材 料、は一般的な抗体で中和することも好ましい。

本発明に従って、ノドパイオートの仔ブタおよび妊娠ブタに鼻腔内接種した場合 、５ＩＲ８影響下群の仔ブタから得られた組織ホモジネートは、５ＩＲ８の呼吸 性生殖性形態を複製した。ノドパイオートの仔ブタに、未濾過接種材料または濾 過接種材料（０，４５，０，２２または０．１μｍ）で同様に接種したところ食 欲不振に陥り、５ＩＲ８影響下の群れに見られる病変に類似した顕微鏡的肺病変 を発現した。同様の接種材料は、５ＩＲＳ影響下群に見られる生殖的効果と同一 の効果も引き起こした。ウィルス因子を組織ホモジネートから検出した。このウ ィルス因子によって、仔ブタおよび妊娠豚の５ＩＲ８類似の疾患が生じる。ウィ ルス因子は、現在まで分類されていない。ただし、ウィルス因子は、選好性非血 球凝集外被ＲＮＡウィルスである。５ＩＲＳを引き起こすウィルス因子は、１９ 旧年０７月１８日、メリーランド州ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）　、登録番号ＡＴＣＣＶＲ−２３３２テ寄託 されテイル。

感染したブタの治療に用いる血清は、は乳類抗体をＭＳＤ病変まで輸送する。こ れは、上述の病原菌で前処理した（ブタであるか否かを問わず）は乳類血漿から 得られる。

選択的に、血清をハイブリドーマ法によって生成したＭＳＤに対するモノクロナ ール抗体から調合する。

ＭＳＤ診断方法は、ＭＳＤに対する免疫特異抗体の使用に基づく。本方法は、肺 生検試料の濾過ホモジネートまたは生検試料もしくは他の組織から得た同様の（ 生検またはホモジネート）試料と免疫特異抗体とを結合させる必要があり、この 結合で形成された接合体には既知の検出技術を利用する。接合体の定着または沈 殿と、ＥＬＩＳＡＳＲＩＡ、サザンプロット法、ノーサンプロット法、ウェスタ ンプロット法などの検出技術を用いることによって、ＭＳＤを診断できる。

本発明によれば、ＭＳＤに対して抗体を使用する治療方法および診断方法には、 上述の選好性非血球凝集外被ＲＮＡウィルスに対するモノクロナール抗体（Ｉｇ Ｇや１ｇＭ）が必要である。模範的な抗体には、５ＤＯＷ　１２と５ＤＯＷ１７ があり、各々登録番号ＨＢ　１０９９６とＨＢ　１０９９７で１９９２年３月２ ７日付けでアメリカン・タイプ・カルチャーに寄託されている。

の　な　Ｕ 図１は、５ＩＲＳウィルスＶＲ−２３３２によって観察される細胞変性効果を示 す。図ＩＡは、非感染未染色細胞単層である。図ＩＢは、小型顆粒状成熟変性細 胞に感染した単層であり、該５ＩＲＳウイルスの６回目の継代を伴う接種３日後 に観察された。

図２は、５ＩＲＳウィルス感染ＭＡ−１０４細胞の直接免疫蛍光染色を示す。図 ２Ａは、非感染細胞単層である。図２Ｂは、強度で、しばしば接種後３８後観察 される顆粒状細胞質蛍光を有する感染細胞である。

図３は、ＣｓＣ１密度勾配にかけて精製した５ＩＲＳウイルスの密度勾配プロフ ィルである。ウィルスの感染力は１．１８−１．１９　ｇ／ｍｌで最大になる。

図４は、密度１．１８−１．１９　ｇ／ｍｌのＣｓＣ１勾配画分に観察されるウ ィルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。図４Ａは、これら４粒子が直径６６０−６ ５ｎの球形であることを示す。

２粒子は、「中空」であり、高電子密度核であることを示しく矢印）、残り２粒 子は完全である。棒線の長さは１１００ｎである。図４Ｂは、ウサギ高度免疫血 清および金粒子で標識化した抗ウサギＩｇＧを用いた５ＩＲＳウイルスの免疫− 全電子顕微鏡検査の結果を示す。このピリオン内に直径約２２５−３０ｎの核粒 子が存在することに注目されたい。棒線の長さは、５０ｎｍである。

図５は、５ＩＲＳウイルスの４℃（黒三角）、３７℃（黒丸）、５６℃（白丸） における温度安定性を示す。

光ｊ目と１１ノ０１朋 ブタミステリー病（ＭＳＤ）の決定は困難であった。

しかし、本発明によって、ＭＳＤを引き起こす病原菌を単離し成長させることが できた。本文中に使用するように「病原菌」は、ブタに対して下前症候群および 呼吸器症候群を生じさせることができるウィルスを言う。さらに詳述すると、病 原菌は、ブタに対して下前と呼吸器疾患とを生じさせる能力がある選好性非血球 凝集外被ＲＮＡウィルスおよびその動物病理学的突然変異体である。

病原菌の単離は大発見である。この発見によって、ワクチンの生産、感染したブ タを治療するための抗体血清の生産および診断方法の確立が可能になる。

ワクチンは、不活性のまたは弱毒化したＭＳＤ病原菌から成り、ＭＳＤの特性的 損傷を示すブタ感染肺組織またはその他のブタ組織調整の接種材料由来である。

病原菌の機能的誘導体として、サブユニットワクチン、ベクターワクチン、組換 体ワクチン、合成ペプチドワクチンなども、考えられる。ＭＳＤワクチンの開発 には、複数のステップを踏む方法を利用する。初めに、ＭＳＤ病原菌を感染ブタ 組織、好ましくは肺組織から分離および単離することによって接種材料として得 る。次に、ＭＳＤ病原菌を既知のワクチン学的技法を使用して処理し、抗ＭＳＤ ワクチンを生成する。

ＭＳＤ病原菌は、ＭＳＤによって呼吸が急速なブタの肺組織から接種材料として 単離することが好ましい（胎児組織などのその他の組織を使用してウィルスを回 収することもできる）。このようなブタを殺処分し、肺組織を摘出する。次に、 摘出その肺組織を、肺胞腔中にマクロファージ、変性細胞およびデブリの存在に よって生じる肥大した肺胞間について調べる。これらの特性は、ＭＳＤ病原菌の 存在を示すものである。この種の損傷を示す別のブタ組織を使用して、ＭＳＤ病 原菌を単離することもできる。

続いて、（生理的塩類溶液、リンガ−溶液、ハンクス均衡塩類溶液、最小必須培 地などの）薬学的に耐用し得る水溶液で、肺組織またはその他のブタ組織を均質 化して、組織がホモジネートの容量に対して１０％の重量から成るようにする。

ホモジネートを、細孔直径が０，０５乃至１０ミクロンまでの、好ましくは０． ４５．０．２および０．１ミクロンの一連の濾過器にかけて、ＭＳＤ病原菌を含 む濾過ホモジネートを生成する。結果的に、濾過ホモジネートは、約１．０ミク ロン以下の、好ましくす０．２−０．１ミクロンの大きさの生物学的粒子を含む 。ホモジネートをさらにフロインド不完全アジュバントに混合して、抗体産生を は乳類への注射時に刺激することができる。この混合物をブタのＭＳＤ発現用接 種材料またはＭＳＤ病原菌のさらに進んだ研究用の接種材料として使用すること もできる。

病原菌を含む濾過ホモジネートを得た後に、ホルマリンやアセトアルデヒドなど を含むアルデヒド試薬、クレゾールやフェノールなどを含む反応性酸性アルコー ル、安息香酸やベンゼンスルホン酸などの酸、ベータープロピオンラクトンやカ プロラクトンなどのラクトン、カルボニルジイミダゾールなどの活性ラクタム、 カルボジイミド、カルボニルジへテロ芳香族化合物などの標準的化学的不活性化 剤を含む濾過ホモジネートを処理することによって、病原菌を不活性化または死 滅させることができる。紫外線照射やγ線などによる照射を使用して病原菌を不 活性化または死滅させることもできる。選択的には、この病原菌をブタ以外のは 乳動物または鳥の起点由来の細胞培養で反復成長させることによって弱毒化し、 病原菌が毒性を有して繁殖する能力を失わせることができる。細胞培養による弱 毒化技術に関する詳細は、以下に述べる。

死滅または弱毒化した病原菌を、免疫応答刺激用稀釈アジュバント溶液を添加す ることによって、適切な力価まで稀釈する。力価測定は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、 ＩＦＡなどの免疫学的試験または以下に述べる酵素基質検出試験において、ＭＳ Ｄ抗体を測定することによって、達成することができる。

病原菌の精製形態を生成するには、上述の濾過ホモジネートを一連のロガ１印細 胞試料に接種することもできる。腎臓、肝臓、心臓などのは乳類の器官細胞と、 脳細胞細胞、肺細胞、肺細胞、精巣細胞、鼻甲介、白血球細胞および赤血球細胞 ならびにリンパ節とによる細胞試料のほか、昆虫胚試料および鳥胚試料を使用す ることができる。これらの細胞試料に適切な培地には、ウシ胎児血清およびウシ 胎児寒天、浸出初物寒天、脳−心臓浸出物の肉汁および寒天などは乳類支持細胞 成長因子などを含む。は乳類細胞は、サル腎細胞であることが好ましく、アフリ カ産ミドリザル腎胚細胞−−サル腎細胞系（ＭＡ−１０４）　−一であることが 最も好ましい。

濾過ホモジネートを細胞試料に接種し、培養を増殖させた後、培養細胞から成る 個体凝集を細胞含有の無菌培地に収集し再導入する。この系列の最終培養由来の 培養液は、毒性病原菌の精製形態を提供する。また、一連の反復収集物を形成し た後、培養を育成し、培養液を収集しその液を異なる細胞種を培養するための接 種材料として使用することができる。この方法では、病原菌を弱毒化して、異種 培養由来の培養液によって弱毒化病原菌の精製形態を提供する。

ポリクローナル抗体血清を、は乳類の免役応答を引き起こす抗原物質として病原 菌を使用することによって生成することができる。培養液または上述の方法で調 整した接種材料を、ウマ、ヤギ、マウス、ウサギなどのブタ以外のは乳動物に対 して刺激アジュバントを投与することができる。抗原刺激を反復した後、血液採 取した動物の血清に一般に認められる上述の疾患に特異的な抗体に対して固着し た抗体を使用して、血清の一部を取り出して抗原精製をすることができる。さら に、生理的塩類溶液と分子量約ｉｏ、ｏｏｏのタンパク様化合物の収集物とを含 む糖ゲルカラムなどによるクロマトグラフィーによって半精製した血清を処理し 、治療に用いる精製ポリクローナル血清を生成する。

モノクロナール抗体血清をハイブリドーマ技術によって生成することができる。

ＭＳＤ含有細胞培養ライゼートまたは上述の勾配−精製ＭＳＤでマウス、ブタ、 ラット、ウサギまたはその他の適切な種を免疫化した後、動物の牌臓を摘出し完 全な細胞試料に変換することができる。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの 方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ。

翻６．４５９−９７　（１９７５））に従って、牌臓細胞試料由来の免疫細胞を 骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成することができる。このハイブ リドーマを培養し、病原菌を輸送する培養液または接種材料に対して培養液を試 験することによって、ＭＳＤ病原菌に対するモノクロナール抗体を産生ずるハイ ブリドーマ培養を単離することができる。このハイブリドーマをホスト種の腹膜 に導入することによって、ハイブリドーマを腹膜で増殖させることができる。腹 水を収集することによって、病原菌に対するモノクロナール抗体を含む体液を生 成することができる。ハイブリドーマ細胞培養由来の細胞培養上澄みを使用する こともできる。モノクロナール抗体をマウス誘導ハイブリッド細胞系によって生 成することが好ましく、この場合の抗体は、ＩｇＧ型または１ｇＭ型の免疫グロ ブリンである。５ＩＲ３の病原菌に対する模範的モノクロナール抗体は、５ＤＯ Ｗ１２と５ＤＯＷ１７である。本明細書の別の箇所で述べる使用方法の他に、本 発明によるモノクロナール抗体を、診断用組成物および治療用組成物ならびに、 受動免疫方法や抗イデイオタイプワクチン調整方法などの診断方法および治療方 法を利用することができる。

本発明のワクチンは、ブタ母集団に見られるＭＳＤ感染を予防し治癒することが できる。ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、効果的に予防および抗感染用に使用するため に、ワクチンには死滅病原菌または弱毒化病原菌を含んでおり、単独でまたはブ タと適合する薬学的担体と組み合わせて投与することができる。このワクチンは 、経口、非経口、経鼻腔または経静脈的に誘導することができる。ワクチン容量 決定に関連する因子には、年齢、体重および感染したブタの母体抗体レベルなど が含まれる。投与量は、１ｍｌあたりの５０％組織組織感染価で１０”−１０’ であり、容量で１ｍｌ乃至５ｍｌで投与することが好ましい。ワクチン投与は、 約１４−２８日間で投与して、ブタがＭＳＤ感染に対して確実に免疫を発現させ ることが望ましい。

ＭＳＤワクチンは、様々な異なる投与形態で投与することができる。死滅または 弱毒化させたＭＳＤ病原菌を含む水性培地は、錠剤やカプセルなどの形態をした ラクトース、デンプン、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウムなどの薬学的に耐 用し得る不活性賦形剤および緩衝剤で乾燥させて組み合わせることができる。こ れらの組み合わせは、粉末状にしたり、水溶液に懸濁したりして、この粉末およ び水溶液またはそのいずれかを動物用飼料や動物用飲料水に添加しても良い。こ れらのＭＳＤワクチン粉末または溶液をさまざまな既知の薬剤によって、適当な 甘味や風味を与えて、ブタが経口でワクチンを摂取するように促進しても良い。

非経口投与を行なうには、死滅または弱毒化させたＭＳＤ病原菌を食塩水、水、 プロピレングリコール、などの当業者らには良く知られている薬学的に耐用し得 る担体と組み合わせることができる。この形態では、ワクチンを非経口的、経鼻 腔的および経口的手段で、獣医学関係の当業者には良く知られる方法によって投 与することができる。ＭＳＤワクチンは注射器によって静脈投与することもでき る。この場合、食塩水などの薬学的に耐用し得る水性担体と組み合わせる。ＭＳ Ｄワクチンの非経口的および静脈的製剤形態は、乳化剤および懸濁剤またはその いずれか一方であるが、薬学的に耐用し得る稀釈剤を併用し、ＭＳＤワクチンの 誘導および投与量を制御することもできる。

ＭＳＤ診断方法は、上述のポリクローナル抗体血清またはモノクローナル抗体血 清を用いて実行することができる。抗体血清または生検組織ホモジネートをポリ スチレン表面またはタンパク質を固定する別のポリマー表面に接触させることに よって固定することができる。さらに、抗体血清および抗体ホモジネートの残り を添加し、培養し、非固定材料を洗浄などによって除去する。抗体血清用の標識 種−特異抗体を加えて、標識の存在および量を測定する。標識測定は、検定する 組織にＭＳＤが存在することを示す。この方法の一般的な態様には、酵素結合免 疫吸着検定方法（ＥＬＩＳＡ）　、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　、免疫蛍 光検定（ＩＦＡ）　、ノーザンプロット免疫検定、サザンプロット免疫検定、ウ ェスタンプロット免疫検定などがある。

以下の例は、本発明の特異的態様をさらに説明するものである。ただし、以下の 例は、上述の開示において十分に特徴づけられた本発明の範囲を限定するもので はない。

例−−１ ＭＳＤ病原菌は、接種材料の処理後、ノドパイオートブタに接種して、ＭＳＤ病 原菌に病原性が残存するかどうかを測定し、物理化学的特性（大きさ、脂質溶剤 に対する感受性およびプロテアーゼ感受性）を測定することによって特徴付ける ことができる。

誘導方法および維持方法はＢｅｎ１ｆｉｅｌｄら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ。

夕をＭＳＤを含む生殖上の問題がない群れから得ることができる。死産およびミ イラ化した胎児またはそのいずれか一方を伴う同腹子は使用してはならない。

Ｍ　Ｓ　Ｄ　−ＭＮ９０−５Ｄ７６−ＧＰ２　ではＭＮＳＤ９０７６ＬまたはＭ ＳＮＤ９０７６−Ｐを２う　。　気管、肺、鼻甲介、扁桃、肝臓、脳、牌臓をＭ ＳＤに自然感染したミネソタ州の１群中養育中のブタから得ることができる（Ｃ ｏｆｆｉｎｓｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　５ｗ１ｎｅ　Ｃｏｎｆｅｒ ｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ、　２５ ４−５５　（１９９０）　）　ｏこれらの組織ホモジネート（ＭＮ　８９−３５ ４７７）を、抗体を用いずにバンクの塩類溶液で調整し、０．５ｍｌを経鼻腔に よりＮｅｂｕｌｉｚｅｒガラス（Ｔｅｄ　Ｐｅ１ｌａ　Ｃｏ、、　Ｒｅｄｄｉｎ ｇ、　ＣＡ）を使用して、日齢３日のノドパイオートブタに接種することができ る。接種した仔ブタは、自然感染のブタに観察されるのと同様の臨床的徴候およ び電子顕微鏡的損傷を発現する場合がある。これらのノドパイオートブタから得 た肺、肝臓、腎臓、牌臓および脳を、初回接種後８日後収集し、プールして別の ホモジネートを調整することができる。その後、第２回目に得られたホモジネー トを、ノドバイオート豚にもう一度接種することができる。また、ＭＳＤは肺組 織から理想的に増殖させことができるので、肺組織を分離ホモジネートとして調 整できる場合以外は、同様組織を収集し均質化しても良い。肺ホモジネートは、 ノドパイオートブタの初回接種材料（ＭＮ　８９−３５４７７）の第２の連続継 代に相当する（Ｃｏｌｌｉｎｓら、？１ｓｔ　Ｍｅｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅＣｏ ｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｗｏｒｋｅｒｓ　ｉｎ　Ａｎｉｍ ａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ。

Ａｂａｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、２　（１９９０））　、　２種の濾液を０．２０　 μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　 Ｍｌ）および０．１０μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いて調整することができる。これらの濾液を区分し て、−７０℃で保管することができる。すべての濾液は、細菌を有さず、ウィル スは、逆染色調整法を使用しても直接電子顕微鏡検査では観察されないことが望 ましい。

−鼠−０擬似感染ノドパイオートブタ２例から調整した肺組織ホモジネートを対 照ブタの接種材料として使用することができる。この対照接種材料をＭＳＤ接種 材料に関して述べたように、０．２０および０．１０μｍの濾液として調整する ことができる。

剖検　法および組　病理８゜　Ｃｏｆｆ１ｎｓら、７１ｓｔ　Ｍｅｅｔｉｎ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｗｏｒｋｅｒｓ 　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、２　（１ ９９０）で先述したように、初回接種７日後、ブタを安楽死させる。組織を収集 し、中性緩衝ホルマリンで固定し、Ｃｏｆｆ１ｎｓら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｙｅｔ。

Ｒｅｓ、、　５０．８２７−３５　（１９８９）で述べたように光学的顕微鏡試 験で処理することができる。標本を、鼻甲介、扁桃、気管、脳、胸腺、肺（根尖 葉、噴門側葉、隔膜側葉）、心臓、腎臓、牌臓、肝臓、胃、十二指腸、空隔、回 腸、上行結腸、下行結腸、血液、隔膜リンパ結節から収集することができる。こ れらの組織を処理し、光学顕微鏡を使用して、リンパ単核脳炎、間質性肺炎、リ ンパブラスマ細胞性鼻炎、タンパ単核心筋炎または門脈性肝炎が存在するか否か を測定する。病変は、ＭＳＤ接種群から得た自然感染ブタに常時認められる（Ｃ ｏｌｌｉｎｓら、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　５ｗ１ｎｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｆ ｏｒ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ。

２５４−５５　（１９９０））。糞含有物を収集し、先述のＲｉｔｃｈｉｅらに よる、Ａｒｃｈ、　Ｇｅ５ａｎｔｅ、　Ｖｉｒｕｓ−ｆｏｒｃｓｈｅ、　２３． ２９２−９８（１９６８）のように、ウィルス粒子を試験しても良い。血液を免 疫検定および免疫組織用に収集し、例３に述べるように細菌用に培養することが できる。

Ｂ、病原菌の単離 ５ＩＲＳ感染群中の感染仔ブタから得た肺組織および脳−牌一肝一腎結合組織を 個々に均質化した。１０％の組織ホモジネートを用いた。個々のホモジネートを １ｍｌ当たり約１００μｇでゲンタマイシンを含む最小必須培養液（Ｍ　Ｅ　Ｍ ）と混合した。両試料を約２５分間約４０００Ｘ　ｇで遠心分離にかけた。上澄 みを抽出して、０．４５　ミクロンのフィルターに通した。組織ホモジネートお よび肺ホモジネートを混合させ、この混合材料を使用してさまざまな組織培養細 胞系を感染させた。

用して２つの実験を行なった。試験番号１では、混合材料を以下に記載した細胞 系各々の完全細胞シーツを含むボトル２本に接種した。さらに、各細胞系を含む １ボトルに約２．５ｍｇのトリプシンを添加した。残りの条件はすべて、細胞系 を含む各ボトルに関して同一であった。血清は、培地に添加しなかった。接種材 料は１ｍｌだった。

すべてのボトルを約３４℃で７日間保管した。結果は、７日目の最後に記録した 。凍結し解凍した後、試料を同細胞系における第２の継代用に取り出す。残りの 材料は、凍結し約−６０℃で保管した。

試験番号２おいては、混合材料を、試験番号１で使用したものと同様の細胞を含 む１ボトルに接種した。ただし、細胞シーツは、接種時には２０−４０％しか融 合していなかった。培地は約１０％のウシ胎児血清を含んでいた。

さらに、接種材料は１ｍｌであり、培養を約７日間約３４℃で培養した。試験番 号１および試験番号２の結果を以下にまとめた。

使用細胞系　試験番号１　試験番号２ ウシ鼻甲介（ＢＴ）　−− ネコ腎臓（ＣＲＦＫ）　−− サル（Ｖｅｒｏ）腎臓　−− サル（Ｖｅｒｏ）肺　−− イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）　−− ブタ（ＰＫ２ａ）腎臓　−− ミンク肺　−− ケナガイタチ肺　−− ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）　−− ブタ精巣（ＳＴ）　−− サル腎臓（ＭＡ−１０４）　＋ ヒト直腸腫瘍（ＨＲＴ−１８）　ＮＴ ヒト肺　ＮＴ　− ＋＝ＣＰＥ効果 一＝ＣＰＥ効果なし ＮＴ＝未試験 細胞変性効果は、評価した細胞系を問わず試験番号１においては認められなかっ た。ただし、試験番号２においては、ＭＡ−１０４細胞の小凝集が肥大し、ボト ルの縁周辺の単層で「ウィーク・ホール」を形成し始めた。液体をボトルから分 離し、ＭＡ−１０４細胞（これも２０−４０％の細胞シーツである）を含む新た なボトルに継代した後、もう一度継代した。細胞変性効果は、継代を重ねる度に 大きくなった。上述の方法を、完全細胞シーツを使用して、ＭＡ−１０４細胞系 に対して繰り返した。その後の試験は、ウィルス剤は、３７℃でも繁殖すること を示した。血清の存在は、ウィルス剤の初回単離に役立てられる。ＭＡ−１０４ 細胞系におけるウィルス剤のその後の継代によって、血清を含まないＣＰＥを生 じさせるこさができる。さらに、より際立ったＰＥ効果をＭＡ−１０４細胞系用 の増殖培地に血清を用いることで認めることができる。

ウィルス剤をＭＡ−１０４細胞系で８回継代したところ、３日間後の５回目以降 の継代では、ＣＰＥは良好だった。

得られた力価は対数で約５−１７２であった（　１０ｓ、ｓ）。ライスル剤は、 さらにサル細胞系でも増殖することができる。

２、　１ｎｖｉｖｏ試験。　別の継代収集物を使用して日齢３日のノドバイオー ト仔ブタに接種した。両仔ブタとも経鼻腔で、一方は　１ｍｌであり、もう一方 は２ｍｌで暴露した。仔ブタを７日間観察し、安楽死させた。

組織試料を病理組織学的試験用とウィルス剤の回収用に収集した。病理組織学的 報告からは、感染仔ブタの肺病変は、５ＩＲ８にかかったことが判明している仔 ブタ由来の肺組織病変と一致することが確認された。組織試料は前述のように処 理され、ウシ胎児血清を含むＭＡ−１０４細胞系を２０−４０％含む単層と　１ ００％含む単層上で培養した。ウィルス剤を再び回収した。

別の継代収集物を雌ブタに接種し、疾患の繁殖効果を複製し確認することができ ることが証明するために使用した。経産雌ブタ２例に、妊娠９３日目に経鼻腔で 接種を行なった。この雌ブタは、それぞれ妊娠１１２１２日目び１１４日に５０ ％死産で同腹子の仔ブタを出産した（死産／生産比は、８／１３と６７１４）。

死産仔ブタ７例は、一部ミイラ化しており、生産仔ブタは弱く、強健に育成する ことはできなかった。このウィルス剤を死産仔ブタの組織から回収した。

ウィルス剤を５ＩＲＳとわかっている３群から回収した。ＡＴＣＣＶＲ−２３３ ２剤に対する抗体力価は、これらの同じ群で確認された。

臨床的徴候に違い、すなわち、ヨーロッパ産のブタにおける耳、尾、乳房のの皮 膚チアノーゼが若干あるが、化アメリカにおける疾患およびヨーロッパにおける 疾患は、同一のウィルスすなわちＡＴＣＣ寄託のＶＲ〜２３３２によって例証さ れるように選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイスルによって引き起こされるという のが、一般の意見である。

例ＩＡ−その他の病原菌特性 Ａ、　料および　法 ａ。　ネコ科Ｃｒａｎｄｅｌｌの腎臓（ＣＲＦＫ）およびサル腎臓（ＭＡ−１０ ４）の細胞を適切な細胞培養フラスコ内で３７℃で育成した。ＣＲＦＫ細胞およ びＭＡ−１０４細胞は、（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｌｅｎｅｘａ、　 ＫＳより入手可能な）１０％のγ線照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシ リン−ストレプトマイシンと２．５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢとを補足した （Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ Ｙより入手可能な）イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）で増殖させた。

ＭＡ−１０４細胞を１０％のＦＢＳと５０μｇ／ｌｌ１ｌのゲンタマイシンで補 足同様の培地で増殖させた。ＦＢＳおよび細胞は、先述のＭａｙｅｒら、Ｙｅｔ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１６．　３０３−３１４　（１９８８）、−ｉａ　 ｍ　Ｉｎｖｅｓｔ、、　２．３００−３０２　（１９９０）による方法で、ウシ ウィルス性下痢性ウィルスがないことが確認された。

２、ＶＲ−２３３２７−ス５ＩＲＳウイルス　本例の５ＩＲＳウイルスのソース および単離体は、以下記載の通りである。この試験に使用したウィルスは、１０ ５乃至１０’ＴＣＩＤ５０７ｍｌの力価のＭＡ−１０４細胞を５乃至７回継代し たものに乗せた。

ノドパイオートブタ。閉鎖子宮切開で得たノドパイオートブタを、先述のＭｉｎ ｉａｔａｓ　Ｏ，Ｐ、ら、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｏｍルムアイソレータで覆わせた ステンレス鋼タブに保管した。このアイソレータは、周囲温度３０℃で保管され 、ブタに１日３回商用ミルク代用品を推奨量摂取させた。実験接種前および剖検 時に、糞スワブを収集し、好気雰囲気および嫌気雰囲気中で、ヒツジ血液寒天、 ｔｅｒｇｉｔａｌ−ｓｅｖｅｎ寒天、ブリリアントグリーン寒天上に接種した。

剖検時に収集した糞も、上述のＲｉｃｈｉｅら、Ａｒｃｈ、　Ｇｅ５ａｎｔｅ。

皮４礼且又二Ｘ。　Ｗｅｓｔ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｍｎｎｄｅｓｏｔａの分娩から 仕上げまでの１６０頭の雌ブタの１群が典型的なＭＳＤ症候を有するＭＳＤを発 症した。生存雌ブタ、生存新生仔ブタおよび死産ブタ胎児をＭｉｎｎｅｓｏｔａ 　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＬＡｂＯｒａｔＯｒ）ｌに提 供し、全身剖検、組織病理学的調査および規定の微生物調査を含む試験を行なっ た。

接種材料を臨床的疾患新生仔ブタ由来の複数の組織を用いて実験するために調整 した。さらに詳しく述べると、感染した群れから動物間で流行中に日齢７乃至１ ０日の生存仔ブタおよび死亡仔ブタを各２例ずつ剖検し、試料を診断試験用に収 集した。生存仔ブタは、剖検前に安楽死用液を静注し安楽死させた。各ブタから プールした脳、肺および扁桃から成る１０％ホモジネート（ＭＮ８９−３５４７ ７）を、１００ＩＵペニシリンと　１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンと５μ ｇ／ｍｌアムホテリシンＢとを含むハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を使用 して調整した。

友鼠煎崖盃。　一連のノドパイオートブタ１４例に、日齢３８目にプールした組 織ホモジネートで抗原刺激を行なった。各仔ブタは、経鼻腔で、ブタの外鼻孔前 に置いたＮｅｂｕｌｉｚｅｒガラスに取り付けたゴムバルブを使用して、抗原刺 激を受けた。最初、ノドバイオート仔ブタ２例に濾過していない接種材料をそれ ぞれ０　、５ｍｌ接種し、疾患の臨床的徴候を監視し、暴露後７日後に感電（Ｐ Ｅ）させて安楽死させた。

前述のノドバイオート仔ブタがらプールした肺の１０％ホモジネート（ＭＮＳＤ −１）を、１例に０．５ｍｌの未濾過ホモジネートを投与し、別の１例に０．４ ５μｍ濾液を投与し、残り１例には０２２μｍの濾液を投与したノドバイオート 仔ブタ３例各々を０　、５ｍｌのホモジネートで暴露して、盲目的継代を行なっ た。仔ブタは、ＰＥによって８日後安楽死させ、組織を組織学的試験用、その後 のノドパイオートブタ継代用およびウィルス単離用に収集した。

ＭＮＳＤ−１ｍ　液０．４５　ｐ　ｍを接種した仔ブタノ肺（ＭＮＳＤ９０７６ −Ｌ）　トＥｉ、肝臓オヨび腎臓（ＭＮＳＤ９０７６−Ｐ）　ノ複合材料とから 成る２５％の懸濁液を、カナマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシンを それぞれ０．５　ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝塩類溶液を使用して調整した。ノド バイオート仔ブタ６例に肺ホモジネートＭＮＳＤ９０７６−Ｌを、４例に０．４ ５μｍｌの濾液を、２例に０．１μ（Ｉｌｌの濾液を投与した。

未感染対照ノドパイオート仔ブタ３例については、１例にＨＢＳＳに含有の未感 染コブタ組織ホモジネート０．４５μｍを接種し、残り２例にはＨＢＳＳのみを 接種した。

久不酉ス厘１゜　組織ホモジネート（ＭＮＳＤ９０７６−ＬおよびＭＮＳＤ９０ ７６−Ｐ）を２０分間４℃で１５００　ｇで遠心分離した。上澄みを１０μｇ／ ｍｌのゲンタマイシンを含む最小必須培地（ＭＥＭ）で稀釈し、Ｖｏｒｔｅｘ　 ミキサーを使用して完全に混合し、３０分間４℃で４５００　ｇで再び遠心分離 にかけた。上澄みを収集し０．４５μｍフィルターで濾過した。

肺ホモジネートおよび組織プールホモジネートから得た濾液を混合し、連続的継 代細胞系ＭＡ−１０４に接種した。ウィルス単離を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ ）含有の５０ｍ１Ｍ　ＥＭ　（ｐＨ７，５）を含むＭＡ−１０４細胞の２０−４ ０％密集単層を伴う　７５ｃｍ’フラスコで行なった。細胞培養は、７日間３４ ℃で保持した。細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）が７日以内に観察されない場合は、培 養を凍結し、融解し、ＭＡ−１０４細胞に接種し、上述のように培養した。

ウィルス滴定。　ウィルス滴定を９６ウエル型平底マイクロタイタ板で行なった 。ウィルスの１０回連続稀釈液を２％ＦＢＳを含むＭＥＭで調整した。３日後、 細胞育成培地をマイクロダイタ板から排除し、２００μｌのウィルス稀釈液を５ つのウェル各々に入れて、プレートを５％ＣＯ２中の培地を２％Ｆ　Ｂ　Ｓ　（ ｐＨ７，５）で補足したＭＥＭと取換えて、最終判定を培養５日目に行なった。

力価は、ＲｅｅｄらのＡｍ、　Ｊ、　Ｈｙｇ、、　２７．４９３−４９７　（１ ９３Ｂ）の方法によって算出された。

３、その　のウィルス。　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１ｎｇｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｏｕｔｈ　Ｄａｋｏｔａ　５ｃｈ ｏｏｌ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｖｅｒｍｉｌｌｉｏｎ、　ＳＤのＲｏｇｅｒ 　Ｋｏｍｅｎｔ博士から得た弱毒化ポリオウィルスをＭＡ−１０４細胞上で１０ ８　ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価まで増殖し、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔａｒｏｎ ａｒｙ　５ｅｒｖｉｓｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ａｍｅｓ、　ＩＡより得 られた仮性狂犬病ウィルスのショーブ菌株をＣＲＦＫ細胞上で成長させて、力価 １０’−’ＴＣＩｐ、。ｍｌになるまで育成した。これらのウィルスを、試験に おいてＲＮＡおよびＤＮＡのウィルス対照として使用し、５ＩＲＳウイルスのＶ Ｒ２３３２分離体の核酸型を決定した。

４、ＶＲ−２３３２単離　に・　る　血°の　整。

５回目の継代の５ＩＲＳウイルスのＶＲ２３３２単離体（力価１０’　ＴＣＩＤ ｓｏ／ｍｌ）を０，２５％ホルマリンで不活性化し、フロイントの不完全アジュ バントで１対１に混合し、ウサギにこの懸濁液２ｍｌを２週間間隔て６週間皮下 注射した。

最後の注入２週間後に調整した抗血清は、１対５１２の中和力価を有した。

５、ウィルス　試　ｖＮＴ　、　ＭＡ−１０４ｍ胞をＶＮＴ用の平底の９６ウエ ル型マイクロタイタ板に接種した。血清（１００μｍ）それぞれの２回連続稀釈 液をＭＥＭ稀釈液で調整し、１００−３００　ＴＣＩＤｉ。／１００μｌを含む 同容量（１００μｌ）単離体ＶＲ−２３３２と混合した。各混合液を３７℃で１ 時間培養し、２００μｌの血清ウィルス混合物それぞれを３重ウェルに添加する 。マイクロタイタ板をさらに３日間３７℃で培養し、細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ） について光学的顕微鏡で調査し、終点力価は、ＣＰＥを中和化した最高の血清稀 釈液の逆数として表わされた。

以下のポリクローナル抗血清は、別設の記載がない場合、ＶＲ−２３３２単離体 に関して記載されたように調整し、ＶＮＴに使用した。換言すれば、伝染性胃腸 炎のミラー株、ブタロタウィルスセロタイプ４　（Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ）　、ブ タロタウィルスセロタイプ５　（Ｏ３Ｕ）　、ブタレオウィルスセロタイプ１　 、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、　Ａｍｅｓ、　ＩＡより入手可能なブタエンテロウィルスセロタ イプ１乃至８、アメリカン・タイプ・カルチャーＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤよ り入手可能なブタバルボウイルスに対するモノクロナール抗体、Ｄｅｐａｒｔｍ ｅｎｔ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ、　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　１ｉｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｓｔ。

Ｐａｕｌ　ＭＮのＷ、　Ｃｈｒｉｓｔｔａｎｓｏｎ博士より入手可能な編心筋炎 ウィルス、ＮＡｔ１ｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ａｍｅｓ　ＩＡより入手可能な仮性狂犬病ウィルス、東部脳炎ウィルス、西部脳 炎ウィルスおよびベネズエラ脳炎ウィルス、ＮａｙｅｒらのＹｅｔ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、、　１６．３０３−３１４　（１９８８）に記載のＢＶＤＶに対す るＤ８９モノクロナール抗体、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅ ｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｍｅｓ、、ＩＡより入手可能なウマ動 脈炎ウィルス、風疹ならびにＤｅｐａｒｔｅｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｏｕｔｈ　Ｄａｋｏｔａ　５ｃｈｏ ｏ１　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｅｒｍｉｌｌｉｏｎ、　ＳＤのＷ、　Ｃａｆ ｒｕｎｙ博士より入手可能な乳酸脱水酵素である。

６、官　電　鏡　ＤＥＭ　０　セシウムクロライド勾配画分を、Ｂｅｎｆｉｅｌ ｄらのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

１６、１８６−１９０　（１９８２）、Ｈｏｒｚｉｎｅｋ、Ｎｏｎ−ａｒｔｈｒ ｏｐｏｄ−ｂｏｒｎｅＴｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ”　（Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｌｏｎｄｏｎ、　１９８１）、ＲｉｃｈｉｅらのＡｒｃｈ、　Ｇｅ５ａｎｔｅ 、　Ｖｉｒｕｓ−ｆｏｒｓｈｅに先述したように、ウィルス粒子に対してＤＥＭ によって試験し、７５ｋＶ電圧で電子顕微鏡（Ｈｆｔａｃｈｉ　ＨＵ１２Ａ、日 立、東京、日本）で検査した。

７、　疫電子　微鏡（ＩＥＭ　０　免疫−全標識化を、ヤギの抗つサギＩｇＧ金 コロイド粒子（５ｎｍ）を使用して行なった。簡潔に述べれば、ウィルスを４℃ で３０分間、４０．０ＧＯＸｇで濃縮した。ベレットを５０μｍの再懸濁で、２ ５μｌをバラフィルム１枚の上に置いた。コロジオン炭素被覆グリッドをウィル ス滴に１５分間浮かべて、２５μｍのウサギ抗５ＩＲ８血清に２分装置いた。グ リッドを０１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−トリス緩衝液を２回交換して 各５分間洗浄し、金標識化抗ウサギ−ＩｇＧ　１滴に１５分間浮かべた。各２分 間ずっＢＳＡ−）リス緩衝液で６回洗浄し、２回上流水で洗浄した後、ネガティ ブ染色し、上述のようにＤＥＭに対して試験した。

８、血液凝　反応　ＨＡＴ　０　ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、 ウサギ、モルモット、ヒト「０」型、カモおよびニワトリの赤血球を血液凝集さ せるＶＲ−２３３２単離体能力を標準的方法を使用して測定した。

ＶＲ−２３３２単離体の第５乃至第７継代の２回稀釈液をＵ底マイクロタイタ板 のリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ７，２−７，４）で調整した。上述の標本それぞれ から洗浄赤血球の１％懸濁液を等容量、ウィルス稀釈液に添加して、４℃、２２ ℃または３７℃で培養し、（ウィルス非含有の）赤血球対照をウェルの底のボタ ンに沈殿した１−２時間後に判定した。

９、疫　光　査　■ｍＦ　０　単離体ＶＲ−２３３２感染および非感染のＭＡ− １０４細胞の間接または直接Ｉ（ＯＦ染色を、ＶＮＴで試験したポリクロナール 抗体またはモノクロナール抗体を使用して行なった。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔ ｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ａｍｅｓ、　Ｉ Ａ　（Ａ型、ＨＩＮＩ）から入手可能なブタインフルエンザおよびＮａｔｆｏｎ ａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ａ ｍｅｓ、　ｒＡも使用した。先述のＢｅｎｆｉｅｌｄらのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、に記載されているように、細胞単層のスクラ・ツブを無菌接 種ル−プＩｍＦ染色を用いた７２時間ＰＩで除去する。陽性対照スライドを雌ブ タ由来の回復期抗血清または５ＩＲＳウィルスの■−２３３２単離体に対するモ ノクロナール抗体（本文でｇｔ、５ＤＯＷ１２または５ＤＯＷ１７）の何れかで 染色する。

１０　、　ＶＲ−２３３２の　きさ　のための濾過試験。

浄化−感染細胞培養上澄みを０．４５μｍ　（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃ ｎｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）　、０．２０μｍ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　 ＰｒｏｄｕｃｔｓＤｉｖ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）　および０．０５μｍ（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ ）の各フィルターで濾過した。濾過の前後の感染力価をマイクロタイター検定お よびＣｏｔｔｒａｌ、　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　５ｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ　Ｍｅ ｔｈｏｄｅｓ　ｆｏｒ　ＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　、　ｐｐ、 ８１−８２　（Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｔｂａｃａ、　 ＮＹ、　１９７８）で先述した方法を使用して測定した。感染力価において、１ ００倍の減少は有意と見なされた。

１　１　、　ＶＲ−２３３２単　の　配　１゜浄化培養上澄みから得た５ＩＲＳ ウィルスのＶＲ−２３３２単離体をＴＮＣ緩衝液（１０ｍＭ）リス、１００　ｍ ＭＮａｃｌおよび２ｍＭＣａＣ１，ｐＨ７，８）中の　２ｍｌの２０．３０．４ ０．５０おζこび６５％ショ糖（ｗｔ／ｖｏｌ）を含む非連続ショ糖勾配を介し て、２００．０ＯＯＸ　ｇ、　４℃１６時間で遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ 　４１　Ｔｉｒｏｔｏｒ）によって濃縮した。培養上澄みも１，１．２−トリク ロロトリフルオロエタン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ　Ｌ ｏｕｉｓ、　ＭＯ）で抽出し、１時間４℃、１００．００Ｘｇで超遠心分離にか けて、ショ糖勾配に関して述べたように、セシウムクロライド密度勾配（１，２ ０ｇ／ｍｌ）で精製した。何れかの勾配から得た両分を上部から収集し、屈折計 を使用して屈折率を測定し、選択画分を上述のウィルレス滴定用り１ンクの均衡 塩類溶液で稀釈した。

１２、クロロホルムおよびフルオロカーボンｆＬＯ等量の５ＩＲＳウイルス（Ｖ Ｒ−２３３２）およびクロロホルムを周囲室温で３０分間定期的に混合し、５Ｏ ＯＸｇ、　４℃で１５分間遠心分離した。□同様に、等量の１．１．２−トリク ロロトリフルオロエタンおよび５ＴＲＳウィルスを５分間渦状撹拌し、クロロホ ルム処理ウィルスζこ関して述べたように遠心分離した。遠心分離後、各処理試 料の水性相を収集し、稀釈し、マイクロタイター検定を使用して、残りのウィル ス感染力を測定した。非処理ウィルスと比較し、処理ウィルスの力価が１００倍 減少して０ること４を有意であると見なされた。

１３　、ＶＲ−２３３２に・　るＤＮＡウイｌレス且！、５−ブロモ−２−デオ キシウリジン（ＢｔｌＤＲ）　およびマイトマイシンの配合物は、ＤＮＡウィル ス複製阻害座として知られているが、レトロウィルレス科を除き、ＲＮＡウィル スを阻害することはない（Ｅａｓｔｅｒｎｂｒｏｏｋ　。

■胆旦ｕ、　１９．５０９−５２０）およびＲｅ１ｃｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　４７．１２１２−１２１７　（１９６１））　、仮性 狂犬病およびポリオウィルスを本実験では既知のＤＮＡウィルス対照およびポリ オウィルス対照として使用した。細胞（ＣＲＦＫまたはＭＡ−１０４）を９６ウ エル型ミクロタイター板に接種し、複製のウェルを仮性狂犬病ウィルス、ポリオ ウィルスまたは５ＩＲＳウイルス各々の１００μｌの１０倍稀釈液で接種した。

３７℃の１時間吸収期後、未吸収ウィルスを含む培地を取り出し、ＭＥＭ　（未 処理ウィルス対照）、４０もしくは１５０μｇ／ｍｌのＢＵＤＲで補足したＭＥ Ｍまたは２．１０もしくは２０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含むＭＥＭと取 換えた。マイクロタイター板をさらに４日間３７℃で培養し、ＣＰＨに対して光 学的顕微鏡法で調査をして、ウィルス力価を上述のＣｏｔｔｒａｌの文献（１９ ７８）による方法で計測した。非処理対照と比較したウィルス感染力価の１００ ０倍の減少は、有意であると見なされた。

１４．５ＩＲＳウイルスの温　定性。　ＭＥＭ中の２ｍｌのアリコートを４度ま たは水槽中で３７度および５６℃で少なくとも５日間培養した。３つの異なる温 度で容管から得たアリコートを１５．３０．６０および１２０分目に収集し、１ ２乃至１２０時間までは１２時間間隔で収集した。ウィルス試料をＭＥＭで１０ 倍稀釈し、ウィルス力価は上述のようになった。

Ｂ、結果。

１　、　ＭＡ−１０４胞に、するＶＲ−２３３２離　の　胞変性処】。　ＣＰＥ は小型の細胞球状凝集として発現し、この凝集は未感染単層残物上方に上昇する と考えられた（図ＩＢ）。球状凝集数は増加し、細胞の多く番マ核凝縮を起こし 、２乃至４日ＰＩ以内ζこ単層力箋ら剥離した。５乃至６日ＰＩまでに、ＣＰＥ は１００％の単層にお０て明ら力為となった。感染力価は、ウィルスの連続継代 ５度目および７度目には、各々１０’乃至１０フＴＣＩＤ８゜／１ｍｌと同様で あった。未接種のＭＡ−１０４細胞で（ま、ＣＰＥ１ｉ観察されな力１った（図 ＩＡ）。

蛍光は非接種ＭＡ−１０４細胞でＩ！観察されなめＡつた。図２Ｂは強烈な拡散 蛍光が（ＳＩＲＳのＶＲ−２３３２単離体に対して調整した）ブタ回復期血清、 ウサギ抗血清また＋１モノクローナル抗体のいずれ力１で染色した接種ＭＡ−１ ０４細胞の細胞質に認められることを示す。

２．５ＩＲＳウイルス　ＶＲ−２３３２単　体　の感染力に対する脂　溶剤の効 　。

クロロホルムによるウィルスの前処理？１、感染力を相殺した（１０６から１０ ’ＴＣＩＤ、、／１ｍｌまで減少）。従って、フルオロカーボン処理には有意な 効果（まな力）つた。

３、血球凝集。　ウィルス１′！、培養温度と（ま無関係に異なる１１種から得 られた赤血球を凝集させな力１つた。

４、濾′による５ＩＲＳウイルスの　きさ　。

ウィルス力価は、０．４５．０．２０および０．ＩＪｚａ＋　７４　ル９−によ る濾過後も変化しなかった。ただし、感染カ価葉、０．０５　ｐ　ｍ　（５Ｑｎ ｍ）による継代後には、（１０″−１０”　ＴＣＩＤ、。

／１−１まで）　１０００倍減少した。

５．５ＩＲＳウィルス　製に・　るＤＮＡ且　剤の１０　仮性狂犬病ＤＮＡウィ ルスだけは、ＢＵＤＲまたはマイトマイシンＣによって感染力が減少した。ポリ オウィルス（ＲＮＡ）対照およびＶＲ−２３３２単離体の複製は、影響を受けず 、５ＩＲＳウイルスのゲノムが恐ら＜ＲＮＡであることが示された（表１および ２）。

６、ウィルス　１゜　ウィルス帯はショ糖勾配では検出されなかった。ウィルス 力価のピーク（１０’ＴＣＩＤ、。／ｍｌ）は、１．１８−１．２３ｇ／ｍｌの 浮遊密度を有する両分から発見された。このピークウィルス懸濁液の感染力価（ １ｏ７ＴＣＩＤ、。／ｍｌ）　の１０００分の１以下であった。セシウムクロラ イド勾配によって、単一の僅かなタンパク光帯が１．１８−１．１９ｇ／ｍｌの 浮遊密度で生じた。ピークウィルス感染力は、１．３ｘ　ｔｏ’　ＴＣＩＤｓｏ ／１ｍｌであるが、これはショ糖勾配から得られるピーク感染力寄りも１３０倍 高く、この可視帯に一致した（図３）。

７、　’５ＩＲＳウィルス立　のＤＥＭ０相似形態であるが主に球状ピリオンが ＣｓＣ１画分中のＯＥＭによって認められた（１．１８−１．１９ｇ／■ｌ）。

ピリオンは、直径４８−８０ｒ＋ａ＋　（平均２５粒子＝　６２ｎｍ）であり、 薄膜または外皮に囲まれた完全な電子半透明または中空（電子密集中心）粒子か ら成っていた（図４Ａ）。［長さ約５ｎｍの短い突起を有する直径４４０−４５ ｎのインサヘドラルヌクレオチドカビドが観察された。］これらの粒子は、直径 ２２５−３５ｎの核を含んでいた（図４Ｂ）。ウサギ高度免疫抗血清と金標識化 抗−ウサギＩｇＧとを１次および２次抗体として使用した場合には、ピリオンを 免疫−全標識化した（図４Ｂ）。ＶＲ−２３３２単離体に対するウサギ高度免疫 血清の非存在下では、ピリオンを全標識化しなかった。

８、他のウィルスから′た　血′に・　る５ＩＲＳウイルスの　、。　既知のブ タウィルスとさまざまなトガウィルスは、感染ＭＡ−１０４細胞中の５ＩＲＳウ イルス抗原と中和化したり、反応したりしなかった。回復期のブタ抗血清および 高度免疫ウサギ血清は、各々１　：　２５６と１：５１２の中和化抗体力価を有 していた。

９．５ＩＲＳウイルスの　に・する温　効　。

ＭＡ−１０４細胞に対するウィルス感染力は、１２時間３７℃の培養後５０％減 少し、３７℃の４８時間培養および５６℃の４５分間培養後完全に不活性化した （図５）。感染力は（データを示さないが）４℃の１か月培養または４か月の一 ７０℃培養後は変化しなかった。５ＩＲＳウイルスに感染しハンクスの均衡塩類 溶液で均質化したノドパイオートブタから回収した肺組織は、少なくとも１８か 月間ブタに対する感染力を維持する。結果は、ＶＲ−２３３２単離体は選好性非 血球凝集外皮ＲＮＡウィルスであり、未知の属の非節足動物偏狭性トガウィルス に仮説的に分類することができる。

５ＩＲＳウイルスのＲＮＡゲノムの存在葉、ＤＮＡおよびあるＲＮＡウィルス系 統群の複製を阻害しその他のＲＮＡウィルスの複製を阻害しないことが知られる ５−ブロモ−２−デオキシウリジンおよびマイトマイシンＣの存在下で継続的に 複製するこのウィルスの能力によって確認された（　Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ　 、上述（１９６２）、Ｒｅ１ｃｈら、上述（１９６１）。ＲＮＡウィルスとして のＳＩＲウィルスの暫定的な著者らの分類は、このウィルスがＩｍＦによって検 出されるウィルスの存在によって示される細胞の細胞質で複製する観察結果に一 致する。

５ＩＲＳウイルスのＶＲ−２３３２単離体は熱に不安定であるが、４℃および一 ７０℃では比較的長期間安定である。

３７℃でのこのウィルスの熱不安定性は、ウィルスの増殖に対しては実用的であ り、このことから３７℃以下の温度での増殖によってウィルスの収率が高くなる ことが示唆される。短期間のウィルス単離体に対する診断試料の保存には、冷蔵 で十分であり、それ以外の場合には、試料を数ケ月以上冷凍することができる。

■−ユ 例１における実験から測定されたように、ＭＳＤ病原菌を含む接種材料の最も純 粋な形態を使用してＭＳＤ病原菌を妊娠ブタに伝達し、病徴の複数形態を複製す ることができる。

η扁。　最近、（当分野においてＭＳＤの顕著な臨床的徴候である）一過性食欲 不振および早期分娩は、ノドパイオートブタに呼吸器系疾患による病変を生じさ せる同一のＭＳＤ接種材料を接種した雌ブタ２例中２例に生じた。また、２９例 中１５例（５２％）のブタは死産で、残り１４例は衰弱し、十分に乳飲すること ができなかった。

肉眼的病変または顕微鏡的病変は、死産ブタには観察されなかったが、微生物剤 を検出する胎盤処理および単離処理が現在進歩している。従って、以下の試験は ＭＳＤの複数形態が経鼻腔で雌ブタに伝達されうるか否かと、胎児生存度の干渉 は胎児ではなく母系組織の複製から生じるのか否かを述べた実験である。

例１の実験から、どのように接種材料を処理（フィルターの大きさ、組織培養の 抽出およびプロテアーゼ診断またはそのいずれか一方）するかに関する情報が提 供され、接種材料（すなわちウィルス剤）に対するＭＳＤ因子の最も純粋な形態 が提供される。ＭＳＤ因子には若いブタに対する呼吸器形態とブタ成体の複数形 態とがあるので、症候群の後者の形態を複製し、さらに病原菌がＭＳＤの理論上 の原因であることを証明しなければならない。

ＭＳＤ病原菌を接種したブタに流産を実験的に誘導することは可能であるので、 妊娠９３日目のブタを実験動物として使用する。雌ブタは、生殖上の問題がなく 、ＭＳＤにかかっていない商用群から購入すれば良い。この群の完全な免疫学的 記録をコンピュータ処理すると、妊娠期間、同腹子の大きさ、死産児数の平均を 比較研究に利用することができる。３例の雌ブタから成るグループそれぞれに妊 娠９３日目に０．２０μｍｌの濾液（陽性対照）、病原性であるが、例１の結果 によって示される修飾接種材料、接種材料の０．２０μｍの濾液（陰性対照）ま たは例１の実験結果より示されるように修飾した対照接種材料の何れかを経鼻腔 で接種することができる。各グループのブタを個別隔離室に収容し、出産するま での間毎日調査を行なう。温度および（食欲不振や、咳、クシャミ、浅息呼吸、 呼吸数の増加などの呼吸器系統の問題など）１症的徴候を毎日記録する。ブタの サンプリングは、血清学上分娩前後の血液試料に限定される。実際の分娩日を記 録し、死産児、ミイラ化した胎児、生産「衰弱」ブタおよび生産「正常ブタ」を 決定する。胎児に例１に述べたように肉眼的病変および顕微鏡的病変について調 べ、する。胎児血清によってガンマグロブリンおよびＰＰＶならびにＥＭＣＶの 存在について調査することもできる（Ｊωら、Ｉｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　 ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ　５ｔｅｒ　５ｗ１ｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃ。

ａ＋１ｔｔｅｅ　Ｍｅｅｔ圭ｒ３３．　６２−６６　（１９９Ｇ）、　Ｋｉｎら 、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｄｉａｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　！、　１０１−４　（１９９０ ））。生産したブタを１週間観察し、罹患率および死亡率を記録し、ブタを安楽 死させた後、胎児について述べたように、光学顕微鏡検査および微生物学的検査 用に組織を収集した。

ＭＳＤ接種材料から成る０、２μｍの濾゛液および修飾した濾液は、ブタに対し て病原性があり、食欲不振や、時には微熱、各同腹子の多数が死産か衰弱してい る早期分娩を誘導する。これは、接種材料がＭＳＤ因子を含む証拠である。対照 接種材料を接種した雌ブタは、予定日近くに分娩したが、この群の利用可能な疫 学的データベースから分かるように、元の群の標準範囲内の同腹子を出産してい る。死産ブタの病変は認められず、生存衰弱ブタにおいては生後１週間以内の致 死率が高いことがわかった。

匠−１ Ｍ５Ｄ接種材料で接種し、接種後さまざまな時期に安楽死させたノドバイオート 仔ブタから収集した組織試料を使用して、ＭＳＤの病原菌を単離同定し、病変の 連続的発達を測定し、ＭＳＤ因子が免疫抑制的であることを確認する。

および　”　に・　る　′ 法。　凍結組織および細胞スクラップに対する免疫蛍光検査をＢｅｎｆｉｅｌｄ ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１６，１８６−１９０（１９ ８２）およびＢｅｎｆｉｅｌｄら、Ａａ＋、　Ｊ、　Ｖｅｒ、　Ｒｅｓ、、　４ ９．３３０−３６　（１９８８）に先述したような方法で実行する。凍結組織お よび細胞スクラップをＰＰＶＳＥＭＣＶ　（頭字語については例４参照）および ＭＳＤ因子についてスクリーニングを行なった。ＰＰＶおよびＥＭＣＶに対する 接合体は、５ｏｕｔｈ　Ｄａｋｏｔａ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで入手でき る。ノドパイオートブタにおける高度免疫血清をＭＳＤ接種材料の最も純粋な形 態から調整する。

ブタ２例を経鼻腔接種し、初回接種２週間後および４週間後にフロイントの不完 全アジュバント中の接種材料を皮下経由で追加抗原刺激する。血清を最後の追加 抗原刺激２週間後にこのブタから収集する。対照血清も、対照接種材料とＭＳＤ 接種材料に関して述べた同一の免疫化プロトコルを用いてノドパイオートブタ２ 例について調整する。これらの血清を一次抗体として使用し、フルオレセインイ ソジオチアン酸塩で接合したヤギまたはウサギの抗ブタ免疫グロブリンを二次抗 体として使用し、凍結組織片および細胞培養中のＭＳＤ抗原を検出することがで きる。

血清学的検査。　対照ブタまたは接種ブタから収集した血清について、ＰＰＶお よびＳＩＶ　（血球凝集阻害）、レプトスピラ（微細凝集）、ならびにＥＭＣＶ 　（ウィルス中和化）に対する抗体が存在するか否かを検査する（頭字語につい ては例４参照）。以前の結果は、他の一般の微生物学的因子に対する血清学的検 査には陰性であったことが示されている（Ｃｏｆｆｉｎｓら、？１ｓｔ　Ｍｅｅ ｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅｅ＊。　組織および血液をＭＳＤ接種ブタおよび対照ブタ から収集し、免疫学的状態を測定する。

ブタ白血球をＰｅ５ｃｏｖｉｔｚら、Ｊ、　ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３４．３７ −４４（１９８５）によって示されるように、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ　１０７７ にかけて、単回不連続勾配浮遊法によって末梢血から単離する。リンパ結節、牌 臓および胸腺から得た細胞を、生成細胞懸濁液の組織および収集物を適度にミン スすることによって、単細胞に分解する（Ｈｕｒｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ。

４７、３７２９−３５　（１９８７））。

ブタ白血球表現型をアメリカン・タイプ・カルチャーコレクションおよびＪｏａ ｎ　Ｌｕｎｎｅｙ（ＵＳＤＡ　Ｂｅ１ｔｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）経由で入手でき るモノクローナルパネルを使用して決定することができる。これらには、Ｔ細胞 、ｐｃＤＺ　（ＭＳＡ４　；ｕａｍｍｅｒｂｅｒｇら、Ｖｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、、１１．　１０７−２１　（１９８６）、ヘルパ ー／クラスＩＩ　ＭＨＣ依存Ｔ細胞、ｐＣＤ４　（７４−１２−：　Ｌｕｎｎｅ ｙら、　Ｖｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏ　ａｔｈｏｌ、。

１７、１３５−１４４　（１９８７））細胞傷害性−サプレッサー／りラスＩ　 Ｍ）ｆｃ依存Ｔ細胞、ｐＣＤ　８（７４−２−１１；　Ｊｂｉｄ）、マクロファ ージおよび顆粒細胞（７４−２２−１５Ａ：Ｉｂ１ｄ）　、ヒトＤＲＷと等価の ブタＭＨＣクラスＩＩ抗原（ＭＳＡ３；　Ｈａｍｍｅｒｂｅｒｇら、Ｖｅｔ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｍｍｕｎｏ　ａｔｈｏｌ、、　１１．１０７−２１　（１ ９８６）ならびにＤ　Ｑ　ｗ　（ＴＨ２１Ａ）およびその他ＶＲＭＤＳＰｕｌ１ ｍａｎ、　ＷＡ；Ｄａｖｉｓら、）ｌ　ｂｒｉｄｏａｒｎ　Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏ 　ｉｎ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　Ｒｏｗｍａｎ　ａｎｄ　Ａ１１ａｎｈｅｌｄ、　１２１−５０（１９８４ ））などがある。ブタ免疫グロブリンに対するイソタイプ−特異モノクローナル 抗体も利用可能であり（Ｐａｕｌら、Ｊ、　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、、　５０．４７ １−７９　（１９８９））　、末梢血、リンパ結節およびバイエル板から得た白 血球を間接蛍光染色するために２度に分けて最小飽和濃度で使用することができ る（Ｙｅｔ、　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏ　ａｔｈｏｌ、、２５．１ ７７−９３　（１９９０））。２色検査を実行するためには、ビオチン（Ｐｉｅ ｒｃｅ　ｋｉｔ　＃２１３３３）抗体で標識化した後、ｒＰＥ−標識化アビジン で細胞を染色すれば良い。細胞をフローサイトメトリーまたは２色解析蛍光顕微 鏡（ＰＴＩ　ＦＳＣＡＮシステム）で解析する。フローサイメトリ一時の４８８ ｎｍレーザー光線での相互検出または二重蛍光顕微鏡法の使用を容易に行なうこ とができる。細胞性蛍光強度および陽性細胞の百分率も測定する。

コンカナバリンＡ１アメリカヤマゴボウマイトジエン（ＰＷＭ）および植物性血 球凝集素（ＰＨＡ）を用いるレクチン有糸分裂法などのｉｎ　ｖｉｔｒｏ機能検 査法をＨａｍｍｅｒｂｅｒｇら、Ａｒｎ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、、　５０ ．８６８−７４　（１９８９）に記載のように実行する。リゾチームに対する抗 原特異ｉｎ　ｖｉｔｒｏＴ細胞反応を、それらの技術実行後にモデル化すること ができる。Ｂ細胞増殖検査を大腸菌およびネズミチフス菌ＬＰＳまたは抗免疫グ ロブリンによって、Ｓｙｍｏｎｓら、Ｉｎｔ工Ａｒｃｈｓ、　Ａ１１ｅｒ　Ａ　 １．　Ｉｍｍｕｎ、、　５４．６フー７７　（１９７７）において報告されてい るように行なうことができる。ＰＷＭを用いて誘導されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗体 生成は、Ｈａｍｍｅｒｂｅｒｇら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｒ、　Ｒｅｓ、、　５０ ．６６８−７４　（１９８９）に述べられているように達成され定量される。大 腸菌ＬＰＳに対する４８時間暴露後の１１−１のマクロファージ生成をマウス胸 腺細胞検査で測定することができる（Ｍｉｚｅｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａ ｌ匠、襲、　５１−７２　（１９８２））。ＰＨＡ−刺激リンパ球によるｌｌ− ２の生成を、５ｔｏｔｔら、Ｖｅｔ、　Ｉｍｔｎｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏ　ａ ｔｈｏｌ、ｊ３、３１−３８　（１９８６））に記載のように測定することがで きる。インタイブ−特異抗リゾチームＥＬＩＳＡをブタ免疫グロブリンイソタイ プに対するモノクローナル抗体を用いて行なうことができる（Ｐａｕｌら、Ａｍ 、　Ｊ、　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、、　５０゜４７１−７９　（１９８９））。

ｉｎ　ｖｔｖｏ抗体生成を評価するためには、ＭＳＤ感染の仔ブタ３例および対 照接種材料接種３例に対し、ヒツジ赤血球の２％懸濁液およびウシ血清アルブミ ンの１０８１ｍｌ溶液を別々の部位に、初回接種５．７．１０．１４および２４ 日後に注入すれば良い。初回接種２４日後にブタを安楽死させて、例１に述べた ように組織病理学用に収集し、血液を収集し、抗体検査をする。全抗体濃度およ び各抗原に対する特異１ｇＧおよびＩｇＭ反応を抗原特異放射免疫拡散法または ＥＩＩＳＡで測定する。抗原−特異プラーク検査を牌細胞に対して実行し、感染 ブタおよび対照ブタのＢ細胞クローンの開度を評価する（Ｋａｐｐｌｅｒ、　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎ。

パイオートブタの高度免疫抗血清を調整し、診断試薬として使用して、ＭＳＤの 抗原特性を特徴化することにある。

ｕｏ　ミネソタ大学協力のサウスダコタ州立大学におけるノドパイオートブタの 先行研究により、現場症例ＭＮ−８９３５４７７より得たプール組織ホモジネー トがノトノ（イオートブタの肺病変を誘導したことが示された。これらのブタ由 来のプール組織ホモジネートは、その後、日齢３日のノドパイオートブタの臨床 的疾患および呼吸器ら、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　５ｗ１ｎｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ ｅ　ｆｏｒ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｉａｎｓ。

Ａｂｓｔｒａｃｔ、　２４５−５５　（１９９０））。肺ホモジネートおよび組 織ホモジネートをノドパイオートブタ（９０Ｘ７５）の初回接種材料の第２継代 から調整し、第２の接種材料を生成した。第２の接種材料を接種材料および抗原 として、この実験の高度免疫血清を生成するために使用することができる。

目的を達成するための　法。

ノドパイオートブタ。ノドパイオートブタを先述のＢｅｎｅｆｉｅｌｄらミＡｍ 、Ｊ、　Ｖａｔ、　Ｒｅｓ、、　４９．　３３０−３６　（１９８８）およびＣ ｏ１１ｉｎｓら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅｓ、、　５０８２７−８３５　（１９８９ ）に記載のように誘導し維持することができる。

ｉｎ’　［（ｌ　高度免疫血清を上述のようにノドパイオートブタ１例に初回接 種することによって調整することができる。その後、ブタには１ｍｌの第の接種 材料および１ｍｌのフロイントの不完全アジュバントを含む追加抗原を初回接種 １４および２１日後に投与する（ＨａｒｌＯｗおよびＬａｎｎｅ、　１９８８） 。このブタは、最終接種後１４日以後に安楽死させることが望ましい。血清を回 収し、適切なアリコートに調整し、−２０℃で凍結することが望ましい。

＊１主ｉｓｉ。　大半の診断研究所で一般に行なうように、高度免疫血清につい てブタ共通の病原体に対する抗体があるか試験をする。この血清をヘモフィルス 、プルセラ、レプトスピラ（６血液型亜型）、仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）　 、バルボウイルス（ｐｐｖ）　、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）およびブタインフ ルエンザウィルス（ＳＩ）に対する抗体について検査することができる。

１０　抗血清調整用のブタは、ブタ＃４Ｂ（実験番号９０ｘ　２３８）であった 。このブタは１９９０年１１月　１日に接種し、１９９０年１１月２９日殺処分 するまで毎日臨床的徴候について観察した。臨床的徴候は、表１にまとめた。残 念ながら、ブタの連続変性条件は、１９９０年１１月１３日の僅か１回の追加免 疫後に安楽死させることであった。初回追加免疫１６日後の１９９０年１１月２ ９日にブタを安楽死させた。

血清学的結果は、１６，３８４の力価を有するＰＰＶ以外の上述の因子はすべて 陰性だった（表２参照）。このブタの滴定前の血清は処理しなかった。

肺、心臓、脳、腎臓、結腸、小腸、鼻甲介、牌臓、胃および気管をブタ剖検時に 収集した。これらの試料を評価し、ブタ由来の肺がＭＳＤの現場症例を伴って典 型的にみられるその重篤な肺炎に関する病変を有することがわかった。

この実験結果は、病原菌は、ＭＳＤの自然症例に典型的に見られる臨床的疾患お よび病変を誘導するので、病原菌が第２の接種材料に存在するとする初期の試験 を確証するものである。

表−１ １１／ｌ　午後５時、Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒを用いて上述の接種材料０．５　ｍｌ を経鼻腔でブタに接種する。

１１／２　観察せず。

１１７３　当ブタは、対照のブタの２倍量のボウル入りミルクを飲んだ。ブタが 十分に食べているのか、病原菌が食欲不振の原因であるかどうかは確信できない 。糞は正常。

１１／４　多少動きが鈍くなったかもしれないが、機敏で健康である。ミルクを １７２残した。糞は柔らかく茶色である。

１１１５　午前９時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。

糞はムコイド様、茶色。

午後４時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。糞はムコイド様、茶色。

１１／６　午前９時：健康、機敏、ミルクの１７２を残す。

糞はムコイド様、茶色。

午後６時：健康、機敏、ミルクの１７２を残す。糞は下痢、茶黄色（２）。

１１／７　午前９時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。

糞は、薄茶色、ムコイド様（２）。

午後３時：健康、機敏、ミルクの大半を飲む。糞は薄茶色、ムコイド様。

１１／８　午後２時：機敏だが、対照はどミルクを飲まなず、対照よりも緩慢、 糞は黄色。

１１／９　午前８時：機敏、対照はど活発にミルクを飲まない。糞は糊状。

午後５時：午前８時と同様。

ＩＩ／１０　午後６時：機敏、強健、鼻を飼料皿に活発に擦りつける。糞は茶色 で緩い。対照のようには食べない。

表」」１直 １１／１１　午後６時：機敏、強健、飼料皿に活発に鼻をこすりつける。糞は糊 状。対照はどは食べない。

ミルクは飼料皿に残る。対照は午後６時３０分までに食べ終わる。

１１／１２　午前９時：機敏だが対照はどは活発でない。５分後に対照は食べ終 わったが、このブタはボウルの少なくとも２／３のミルクを残していた。鼻を若 干擦りつけた。

１１／１３　午後４時：ネプライザおよび試料ＩＦＡ　（１ｍ１）を用いて９０ ｘ７５１ｇおよびプールを接種する。機敏だが：対照はど活発ではなく、飼料皿 にミルクの１７２を残す。対照は残さずにミルクを飲んだ。鼻を擦ることはない 。糞は糊状。

１１／１５　午後７時二機敏だが対照はど活発ではなく、まだゆっくりと食べて いる。毛皮は荒い。対照と同様に体重は増えている。

１１７１６−　さほど変化はない。機敏だが、じっとして活動１１／２４　は鈍 くなっている。

午後１時（１１／２４）　：呼吸は速く、毛皮は荒いように思われる。対照のよ うな体重増加は見られない。

１１７２９　安楽死させる。Ｈ，１，用に血液を収集する。扁桃を含み、組織病 理学用に通常回数収集する。血液をリンパ球有糸分裂誘発検査用に収集する。

肉眼的病変は認められない。鼻甲介移植片の培養開始。

表−遣 種ブタの抗　試験 １、ブタインフルエンザ　−　陰性 ２、ブタ脳心筋炎　−陰性 ３、ブタＡＰＰ　−陰性 ４、ブタＰＲＶ　−陰性 ５、ブタＰＰＶ　−陰性 ６、ブタプルセラ　−　陰性 ７、ブタレプトスピラ　−　陰性 ８、ブタＥＰＩ　−陰性 例４Ａ−モノクローナル　調整 ？’７Ｘ逸兼１゜　ハイブリドーマ融合の８日前、ＢＡＬＢ／ＣＡｎＮマウスに フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）に抗原を含む１：１の懸濁液をＩＰ接 種した。使用する抗原の量は、抗原の免疫原性および毒性によって異なる。１マ ウス当たり、最大０　、３ｍｌのＣＦＡを使用する。

融合１週間前は、塩類溶液に含めた抗原でマウスをＩＰ免疫する。融合２日前は 、マウスＩＶを塩類溶液に含めた抗原を接種する。

ｉ■ｌＩ１．　１０％のウシ胎児血清を含むダルベツコの調整イーグル培地上で 、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３．ＭＳ−１−Ａｇ４−１．　（ＡＴＣＣＴＩＢ　１８ ））を維持する。約１０７−１０’個の細胞を、模範的なマウスの１牌臓から得 られたＢ細胞に融合する。ハイブリドーマ融合直前に、５０ｍ１の遠心分離管に 対数期培養から骨髄腫細胞を収集し、５分間の２００Ｘｇ遠心分離によってペレ ット細胞を収集する。上澄みを抽出し、細胞を２度無血清ＤＭＥＭで洗浄し、上 述のように遠心分離にかける。（ｔｏ’−ｉｏ”個の細胞を含む）ベレ・メトを １ｍｌの無血清ＤＭＥＭで再懸濁する。

臓リンパ球の　。　頚部脱臼によってマウスを安楽死させ、７分間７０％のエタ ノールに浸漬する。無菌処理によって牌臓を摘出し、５ｍｌの低温無血清ＤＭＥ Ｍを含む無菌ベトリ皿に移す。メスを使用し、長軸に沿って牌臓を切れ目を入れ 、牌臓の縦方向にそって徐々に解体して、牌細胞を培地に放出する。ビペ・ノド を使用して遊離細胞および培地を１５ｍ１の遠心分離管に移すが、牌臓ケーシン グは残す。管の組織デブリを５分間放置し、単細胞懸濁液を新たな管に移す。細 胞を５分間２００Ｘｇで遠心分離し、上澄みを捨て、ベレットを低温無血清ＤＭ ＥＭで洗浄する。細胞を１ｍｌの無血清ＤＭＥＭで再懸濁し、融合するまで水上 で保管する。

紋冷。　牌細胞を骨髄腫細胞を含む遠心分離管に添加し、５分間５００Ｘｇ遠心 分離する。上澄みをすべて除去し、管の側面を軽く叩くことによって細胞ベレッ トを解す。すべての試薬および細胞を３７℃に維持し、１．　ｍ　１５０％のポ リエチレングリコール溶液（ＰＥＧ　４０００．　Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　 ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）を適状で穏やかに混ぜながら１分間がけて添加する。３ ７℃で１分間混合物を放置する。１ｍｌの中温無血清ＤＭＥＭを穏やかに混ぜな がら滴状に１分間がけて添加する。最後２０ｍ１の無血清ＤＭＥＭを４分間滴状 添加して、すぐに２００Ｘｇで５分間細胞を遠心分離にかける。上澄みを除去し 、２０％のウシ胎児血清、０．２単位／ｍｌのインシュリン、０．５　ｍＭのピ ルビン酸ナトリウム、１ｍＭのオキザロ酢酸、２ｍＭのし一グルタミン、非必須 アミノ酸および１０％のＮＣＴＣ−１，０９リンパ球培地を含む４７ｍ１のＤＭ ＥＭで細胞を再懸濁する。１ｍｌ容量の細胞再懸濁を２４−ウェル型平底組織培 養板２枚のウェルに添加する。骨髄腫細胞の対照ウェルを含ませ、板を３７℃お よび１０％Ｃｏｗ　（ＳＤＭＥＭ）で培養する。

１晩培養した後、各ウェルから０５ｍ１の培地を細胞層を動揺させずに取り出す 。ＩＸ　１０−’Ｍのヒポキサンチン、４Ｘ　１０−７Ｍのアミノプテリンおよ び１．６Ｘ　１０−’Ｍのチミジン（ＨＡＴ）を、各ウェルに添加し、３７℃お よび１０％ＣＯ□で培養を続ける。２−３週間週に３回、１ｍｌの使用培地を１ ｍｌの新鮮なりＭＥＭ＋ＨＡＴを継続して取り替える。有意なりローン増殖が見 られた場合、ＥＬＩＳＡ　、間接ＦＡまた１まその他の適切な検定システムで特 異抗体がウェル（こ存在するか否かを検査する。

クローニング。　特異抗体に対して陽性試験をｉ：ｒなう一次ウエルを、サブク ローニングして直ち１こ安定した細胞系を得て、その他のクローンによる過剰増 殖を避（することか望ましい。選択した一次つエ）し細胞を再懸濁して、トリパ ンブルー染色法および血球計数器で細胞数を計測する。細胞を稀釈し、ＳＥＭＥ Ｍ＋ＨＴ中約２細胞／ｍｌの最終濃度を得る。非接種マウスから得た標準牌細胞 を１００Ｉｌ＋１培地当たり５０μｌの濃縮細胞を添加することによって支持細 胞層として用いる。

２５０μｌの細胞懸濁液を９６−ウェル型板の各ウェルに添加し、３７℃１０％ Ｃ０２で培養する。クローン番よ、２−３週間後には肉眼視できることが望まし く、単クローンを含むウェルから得た上澄みは、有意な増殖力（認められｔコ場 合に検査する。特異抗体に対する陽性試験を行なうウェルでクローニング処理を 繰り返す。選択クローンを組織培養フラスコに徐々に拡大し、さら１こ特徴イヒ し凍結保存するＯ 夏水生虞。　ハイブリドーマ細胞接種の２週間前、ＢＡＬＢ／ｃ　ＡｎＮｖウス に０．５　ａ＋１のブリスタンの！Ｐ投与で初回抗原刺激を行なう。ハイブリド ーマ細胞を収集し、ハンクスの均衡塩類溶液で１回洗浄する。’ＨＢＳＳで細胞 を再懸濁し、初回抗原刺激を受けたマウスに１０’−１０＠の生存可能細胞を接 種する。腹水生成が明らかである場合（通常は、接種１−２週間後）、鼠径部に １６　Ｇ　ｌ−１７２”ニードルを腹側挿入して抽出する。ニードルのハブを遠 心分離管上で固定し、腹水を管に排出する。腹水液を２００Ｘｇで遠心分離し、 ０．２　ｎｍのフィルターで濾過し、凍結保管する。

４−８ＩＲｓモノクローナル ５ＤＯＷ　１２および５ＤＯＷ１７ ＳＩＲＳウイスルに対するモノクローナル抗体５ＤＯＷ１２（ＡＴＣＣＮｏ、　 ＨＢ　１０９９６）および５ＤＯＷ１７　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ　１０９９７ ）を上述の標準モノクローナル抗体生成プロトコルを用いて調整した。マウス免 疫化に使用した抗原をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｈｅａｌｔｈ（ＢＩＡＨ）から得たＭＡ−１０４で育成した６回継代の５Ｉ ＲＳウイルス（ＶＲ−２３３２）であった。各免疫化には、マウスに力価１０” 　ＴＣＩＤＩ。／１００μｌヲ含む０．３　ｍｌの勾配生成ウィルスを接種した 。

間接蛍光抗体（ＩＦＡ）検査を用いて、ハイブリドーマ−次ウェルおよびクロー ンウェル中の特異抗体を検出した。９６−ウェル型組織培養板におけるアセトン 固定ウィルス感染および非感染の細胞単層をＩＦＡに用いた。これらのハイブリ ドーマ由来の細胞培養上澄みおよび腹水液によって、５ＩＲ３感染細胞中に明る い顆粒細胞質蛍光が生じた。

これらのモノクローナル抗体の予備的特性化には、免疫グロブリンイソタイピン グや５ＩＲＳウイルスタンパク質の放射性免疫沈殿解析などがある。モノクロー ナル抗体５ＤＯＷ１２および５ＤＯＷＩ？は、ＩｇＧ、イソタイプである。両抗 体は、１５ｋＤのウィルスタンパク質６ど放射性免疫沈殿解析時に結合した。

匠−１ ３つの予備試験について説明する。ノドパイオートブタ試験は、現場材料を使用 して、ノドパイオートブタにおける症候群の呼吸器系成分に感染し、それを誘発 することができることを示すために意図された。一般の離乳ブタを使用する第２ の試験は、ノドパイオートブタに見られる呼吸器疾患が一般のブタに再生されう るか否かを判定するために意図された。最後に、妊娠ブタ試験は、症候群の再生 不全成分を実験的に複製できるか否かを判定するために意図された。

ノドパイオートブタ試験。　子宮摘出誘導のノドバイオート仔ブタ６例に日齢３ 日目に現場接種材料（さまざなまな組織を含む１０％ホモジネート）を接種した 。濾過（０，２２μｌ１１）および非濾過の接種材料を使用した。対照仔ブタ２ 例には培地のみ接種した。臨床的徴候を毎日監視し高度免疫血清生成に保持する ブタ１例を除いて、接種後８日目に安楽死させた。ウィルス単離および組織学的 検査に用いる組織を剖検時に血清とともに収集し、血清をレプトスピラ、クラミ ジア、エペリスロゾーン、アウジエスキー病ウィルス、ブタパルボウイルス、編 心筋炎ウィルス、血球凝集性脳炎ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ウシ ＲＳウィルス、大ジステンパーウィルス、ウシ性下痢ウィルスおよびブタコレラ に対する抗体について、血清のスクリーニングを行なった。初回接種材料は、ノ ドバイオート仔ブタを連続的に３回継代するために初代細胞系に接種した。さら に、直接免疫電子顕微鏡検査を行なった。

通　飼　ブタ試験。　ＭＳＤ病歴のない農場から入手した通常飼育の日齢２８日 の離乳ブタ３例に、感染ノドバイオート仔ブタ由来のｌθ％肺ホモジネートを経 鼻腔接種した。陰性ノドパイオートブタからの肺ホモジネートを対照用の接種材 料として用いた。仔ブタの臨床的徴候について毎日監視し、接種８日後に剖検し た。血清／組織を上述の方法で処理した。

蜆！ブス１１゜　ＭＳＤのない農場から得た過去の出産日がわかっている経産雌 ブタ８例を本試験に使用した。予定分娩臼の３週間前、雌ブタ６例に感染ノドバ イオート肺ホモジネートを経鼻腔で接種し、２例には陰性肺ホモジネートを接種 した。毎日、臨床的徴候を監視した。雌ブタには自然分娩させ、可能であれば、 分娩に立ち会い、生産ブタから乳飲前の血清を収集した。雌ブタおよび生産ブタ を分娩後間もなく安楽死させ、組織病理学用およびウィルス単離用に収集した。

血清または胸部液も収集した。

災隻メ１゜　肉眼的病変は剖検時には見られなかった。養生ブタの顕微鏡的試験 から、壊死性間質性肺炎およびリンパ球単核脳炎があきらかになった。胎児には 病変がなかったが、雌ブタには軽度の脳炎があった。顕微鏡的試験では決定的な 結果は出なかった。

ノドバイオート試　。　接種後、仔ブタの食欲は減退し、毛皮が荒くなった。対 照動物は正常を維持した。

顕微鏡的病変が濾過または非濾過の材料を接種した当該のブタに認められた。病 変は現場症例に類似し、壊死性間質性肺炎（６／６［仔ブタ６例中６例］）、リ ンノく球形質細胞性鼻炎（４／６）、リンパ球単核脳炎（２／６）および心筋炎 （１／６）を含んでいた。病因学的因子は、接種前後の血清学的検査によっても 接種材料／組織試験によっても同定されなかった。

ブタ試験。　臨床的には、当該のブタ が接種２日後に鈍くなり食欲不振となった。これらのブタは、温度を十分に提供 していてさえも、身震いをしているように感じられた。１例の体温は、接種６日 後に上昇していた（４１．５℃）。間質性肺炎、脳炎および心筋炎は、当該のブ タには認められたが、対照には認められなかった。

妊娠ブタ試験。　臨床的には、２例に限っては、が接種後３または５日後、若干 の体温上昇があった（１．５℃）。ただし、食欲減退は、４／６の雌ブタについ て接種４または５日後に認められた。３例は最大７日早く分娩し、３例は予定通 り分娩した。感染雌ブタの胎児の５０％以上が死産であったが、対照は正常な同 腹子を産んだ。

実験室的所見は、決定的ではなく、特異因子は同定されず、病変は現在まで認め られていない。

原因的微生物は同定されなかったが、所見からＭＳＤは、（１農場からの現場組 織を使用して）実験的にノドパイオートブタおよび通常飼育ブタに伝達され得る ことが示唆された。ＭＳＤに対する呼吸器系形態および生殖的形態は、再生され た。当該因子は、伝染性で０．２２μｍにおいて濾過性があると思われるほか、 外見上選好性である。

米国だけではなく世界中でＭＳＤは重要で新種の疾患である。調整した環境にお いて疾患を研究するには、ノドパイオートブタには、ＭＳＤの臨床的徴候を経験 している農場から得た組織ホモジネートを用いて日齢３日月に経鼻腔接種した。

壊死性間質性肺炎を含む現場症例に類似しているが、リンパ球形質細胞性鼻炎、 リンパ球単核脳炎または心筋炎にはあまり類似性が少ない顕微鏡的病変は、実験 動物には見られたが対照には見られなかった。ノドパイオートブタから得た肺ポ モジネートを使用した場合、通常飼育の生後４週目の離乳ブタは同様の病変を引 き起こした。経産の妊娠ブタにも分娩日の３週間前にノドパイオートの肺ホモジ ネートを接種した。臨床的には、これらの雌ブタはある期間食欲不振になり、最 大７日間前までに分娩した。５０％以上の胎児は死産または初期の段階でミイラ 化しているがのいずれがだった。

これらの所見は、病滅菌に関する病気を単離し、実験的に現場組織を用いてノド パイオートブタに伝達させることができ、ノドパイオートのブタがら通常飼育の ブタまたは妊娠ブタに伝達させることができる。本研究は、疾患の呼吸器的形態 および生殖的形態のモデルを提供するので、ＭＳＤの発生病理および診断方法を さらに調査することができる。

ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、旧 ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、２８ ＦＩＧ、　３ １，１２　１．１６　１．υ　１２４ ＣｓＣＩ　密　度（９／ｍＩ） ＦＩＧ、　５ 培養時間 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） １、国際出願の番号 ＰＣＴ／ＵＳ９２１０６８７３ ２、発明の名称 ５ＩＲＳワクチンおよび５ＩＲＳ診断方法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　５５１１０　ミネソタ、ホワイト・住　所　アメリカ 合衆国　５７００６　サウス・ダコタ、氏　名　クラデック、ダニ−・ダブリ二 氏名　ハリス、ルイス・エル ４、代理人 東京都文京区本郷３丁目３０番９号 〒１１３　水郷ゼットニスビル２階 ５、補正書の提出年月日 １９９３年８月２７日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 ただし、潜在的細菌病原体の型は、養豚場によってさまざまであった。ウィルス 調査には、蛍光抗体試験、電子顕微鏡検査、血清学的方法などがある。これらの 方法によって、ＭＳＤの病原を追求することはできながった。

研究者らは、ブタミステリー病の臨床的徴候を示すオランダのブタから得たウィ ルスを単離し、Ｌｅｌｙｓｔａｄウィルスと名付けた。これについては、Ｗｅｎ ｓｖｏｏｒｔら、Ｙｅｔ。

並ｙカ猛ｎ１３：１２１−１２９　（１９９１）およびＴｅｒｐｓｔｒａら、鼠 副■ヰｙセ１３：１３１−１３６　（１９９１）に述べられている。このＬｅｌ ｙｓｔａｄウィルスは、エアゾールとして投与され、雌ブタにＭＳＤを再生させ 、その雌ブタから生まれた仔ブタから再単離された。しかし、ブタの集団治療に 使用することができるワクチンの開発に成功した者はいない。

したがって、本発明の目的は、ブタの飼育群に投与した場合に、飼育集団中のＭ ＳＤの発現を低減することができる血清含有ワクチンを提供することにある。本 発明の別の目的は、ブタ母集団をそのワクチンで治療し、そのブタ母集団からＭ ＳＤを根絶する方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ＭＳＤ 診断方法を提供することにある。

発明の大要 上記のおよび別の目的は、ブタにおけるＭＳＤの予防および治療するための血清 含有ワクチンならびにその診断方法に向けられた本発明によって達成することが できる。

本発明のワクチンは、ブタにＭＳＤを感染させる病原菌由来である。病原菌は、 ＭＳ　Ｄｉこ感染したブタの調整組織接種材料から得られ、肺組織力・ら得られ ること力（好ましい。病原菌は、ブタ感染組織の接種材料に感染したサル細胞系 などのｉｎ　ｖｉｔｒｏは乳類細胞培養生成物であることが好ましい。この接種 材料；マ、大きさ力（約１．０ミクロン以下の生物学的粒子であること力（好ま しく、０．５ミクロン以下であることが好ましく０．２ミクロン以下であること が最も好ましい。接種材料番よ、一般的な抗体で中和することも好ましい。

請　求　の　範　囲 １、　ブタミステリー病の予防に使用するために適したワクチンにおいて、 薬学的担体と組み合わせた、ブタミステリー病感染組織由来の不活性化または弱 毒化した病原菌を有することを特徴とするワクチン。

２、前記病原菌をブタミステリー病感染のブタ肺組織を含む濾過ホモジネートか ら成る接種材料から得ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。

３、　ホモジネートが、血友病、プルセラ症、レプトスピラ症、バルボウイルス 症、仮性狂犬病、編心筋炎、エンテロウィルス症、ブタインフルエンザおよびそ の組み合わせからなるグループから選択したブタの疾患に対する血清を用いて中 和化することによって精製されていることを特徴とする請求の範囲第２項記載の ワクチン。

４、病原菌が、ブタ下前および呼吸器系症候群疾患を有することが知られている ブタ肺組織から単離した病原菌で一次的または継続的に処理したｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ培養の鳥類、昆虫またはは乳類の器官細胞を含む細胞培地から得られることを 特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。

５、濾過ホモジネートが１．０ミクロン以下の大きさの生物学的粒子を含むこと を特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。

６、大きさが５ミクロン以下であることを特徴とする請求の範囲第５項記載のワ クチン。

７、病原菌がウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン 。

８、前記ウィルスが選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウィルスであることを特徴とす る請求の範囲第７項記載のワクチン。

９、病原菌がブタ下前および呼吸器系症候群ウィルスＡＴＣＣＶＲ−２３３２と その動物発生病理的変異株とがら成る生物学的に純粋な培養であることを特徴と する請求の範囲第１項記載のワクチン。

１０、ウィルスが勾配または連続細胞培養によって精製されていることを特徴と する請求の範囲第７項記載のワクチン。

１１、　ブタに対するブタミステリー病の診断方法において、 ブタから肺組織試料を得て、 試料の液体ホモジネートを生成し、 液体ホモジネートを容器に添加し、ウィルス材料を固定して固定混合物を生成し 、 ブタミステリー病に対する、ＡＴＣＣ寄託取得番号ＨＢ　１０９９６またはＨＢ 　１０９９７を有するハイブリドーマ細胞系から誘導自在のモノクローナル抗体 を、固定混合物に添加し、複合体を生成し、 標識化航程抗体を添加し、複合体を検出することを特徴するブタミステリー病の 診断方法。

１２、　標識化航程抗体が放射性または呈色酵素標識を輸送することを特徴とす る請求の範囲第１１項記載のブタミステリー病の診断方法。

１３、ブタに対するブタミステリー病の診断方法において、 ブタ由来のブタミステリー病病原菌組織試料を有する疑いがある試料の液体ホモ ジネートを生成し、ブタミステリー病に免疫特異性のあるＡＴＣＣ寄託取得番号 ＨＢ　１０９９６またはＨＢ　１０９９７を有するハイブリドーマ細胞系から誘 導自在な免疫反応抗体を、液体ホモジネートに添加し、抗体−抗原複合体の沈殿 の存在を検出することを特徴とするブタミステリー病の診断方法。

１４、　不活性または弱毒化したＭＳＤ病原菌を含むＭＳＤワクチンを生成する ワクチン生成方法において、肥大肺胞間、変性細胞および肺胞間中のデブリを有 するブタ肺組織を同定し、 薬学的に耐用し得る水溶液でブタ組織を同質化し、混合物を生成し、 一連のフィルターで混合物を濾過し、ＭＳＤ病原菌を含む濾過ホモジネートを生 成し、濾過ホモジネート中のＭＳＤ病原菌を不活性化または弱毒化してＭＳＤワ クチンを生成する ことを特徴とするワクチンに生成方法。

１５、ホモジネートを濾過し、約１．０ミクロン以下の粒子を含有させることを 特徴とする請求の範囲第１４項記載のワクチン生成方法。

１６、ホモジネートを濾過し、約０．５ミクロン以下の粒子を含有させることを 特徴とする請求の範囲第１４項記載のワクチン生成方法。

１７、ホモジネートを濾過し、約Ｏ，ｔ　ミクロン以下の粒子を含有させること を特徴とする請求の範囲第１４項記載のワクチン生成方法。

１８、ＡＴＣＣ取得番号ＶＲ−２３３２に寄託のウィルスに関する免疫学的特性 を有するウィルスの生物学的に純粋な培養において、前記培養がその発生病理的 変異株すべてを伴い、ブタに対するブタ下前および呼吸器系疾患に作用すること ができることを特徴とする純粋培養。

１９、　生物学的に純粋な培養において、ＲＮＡウィルスが、寄託取得番号ＡＴ ＣＣＶＲ−２３３２を有するブタ下前および呼吸器系症候群ウィルスであること を特徴とする請求の範囲第１８項記載の純粋培養。

２０、　マウス由来ハイブリッド細胞によって生成されるモノクローナル抗体に おいて、前記抗体が寄託取得番号ＨＢ　１０９９６またはＨＢ　１０９９７を有 するハイブリドーマ細胞系から由来自在であり、ブタに対するブタ下前および呼 吸器系疾患に作用する選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウィルスの抗原決定基のすく なくとも１つと特異的に結合自在であることを特徴とするモノクローナル抗体。

２１、　前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ型の免疫グロブリン分子であることを特 徴とする請求の範囲第２０項記載のモノクローナル抗体。

２２、　寄託取得番号ＡＴＣＣＶＲ−２３３２を有する修飾された生きたブタ下 前および呼吸器系症候群ウィルスと、ウィルスがブタに対して非発生病理的にな るように修飾された薬学的に耐用し得る担体と、を含むことを特徴とするワクチ ン組成物。

２３、　寄託取得番号ＡＴＣＣＶＲ−２３３２を有する死滅または不活性のブタ 下前および呼吸器症候群ウィルスと、薬学的に耐用し得る担体と、を含むことを 特徴とするワクチン組成物。

２、特許請求の範囲第２２項に記載したワクチン組成物をブタに投与することを 特徴とするブタ下前および呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。

２、特許請求の範囲第２３項に記載したワクチン組成物をブタに投与することを 特徴とするブタ下前および呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。

２、特許請求の範囲第１８項に記載された免疫学的に純粋な培養を増殖させ、寄 託取得番号ＡＴＣＣＶＲ−２３３２を有するブタ下前および呼吸器系症候群ウィ ルスを単離する増殖単離方法において、適切な増殖培地中の血清存在下でサル細 胞の完全または部分的シーツにウィルスを接種して、ＣＰＥが観察されるまでの 間約３４−３７℃で接種細胞シーツを培養することを特徴とする増殖単離方法。

２７、サル細胞系がＭＡ−１０４であることを特徴とする請求の範囲第２６項記 載の増殖単離方法。

２８、　ブタミステリー病に感染したブタ組織由来の病原菌を接種したは乳類の 半精製血清を、ブタミステリー病に感染したブタを治療するための薬剤を製造す るために使用することを特徴とする半精製血清使用方法。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０２　９ ２８１−４Ｂ ７１０４　９２８１−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　８３１０− ２Ｊ３３１５６９　Ｌ　８３１０−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　８３１０−２Ｊ ９２８１−４Ｂ （３１）優先権主張番号　８６０，４４４（３２）優先器　１９９２年３月３０ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，ＣＳ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ、　５Ｅ （７１）出願人　ハリス、ルイス・エルアメリカ合衆国　６４５０５　ミズーリ 、セント・ジョセフ、タンゲルウッド・ドライブＦＩ （７１）出願人　ゴーシカ、デイライト・イーアメリカ合衆国　６４５０６　ミ グ−１バセント・ジョセフ、エレファント・トレイル（７２）発明者　コリンズ 、ジエームズ・ニドワードアメリカ合衆国　５５１１０　ミネソタ、ホワイト・ ベア・レイク、リヴエリア・ドライブ・サウス　２６５８ （７２）発明者　ペンフィールド、デイライト・アレンアメリカ合衆国　５７０ ０６　サウス・ダコタ、ブルッキングズ、ツウエルフス・ストリート・サウス　 １５０９ （７２）発明者　クラデック、ダニ−・ダブリュアメリカ合衆国　６４５０５　 ミズーリ、セント・ジョセフ、工ヴアーグリーン・テラス（７２）発明者　ハリ ス、ルイス・エルアメリカ合衆国　６４５０５　ミズーリ、セント・ジョセフ、 タンゲルウッド・ドライブ（７２）発明者　ゴーシカ、デイライト・イーアメリ カ合衆国　６４５０６　ミズーリ、セント・ジョセフ、エレファント・トレイル

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．ブタミステリー病の予防に使用するために適したワクチンにおいて、 薬学的担体と組み合わせた、ブタミステリー病感染組織由来の不活性化または弱 毒化した病原菌を有することを特徴とするワクチン。
2. ２．前記病原菌をブタミステリー病感染のブタ肺組織を含む濾過ホモジネートか ら成る接種材料から得ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。
3. ３．ホモジネートが、血友病、ブルセラ症、レプトスピラ症、パルボウイルス症 、仮性狂犬病、脳心筋炎、エンテロウイルス症、ブタインフルエンザおよびその 組み合わせからなるグループから選択したブタの疾患に対する血清を用いて中和 化することによって精製されていることを特徴とする請求の範囲第２項記載のワ クチン。
4. ４．病原菌が、ブタ不育および呼吸器系症候群疾患を有することが知られている ブタ肺組織から単離した病原菌で一次的または継続的に処理したｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ培養の鳥類、昆虫またはほ乳類の器官細胞を含む細胞培地から得られることを 特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。
5. ５．濾過ホモジネートが１．０ミクロン以下の大きさの生物学的粒子を含むこと を特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。
6. ６．大きさが５ミクロン以下であることを特徴とする請求の範囲第５項記載のワ クチン。
7. ７．病原菌がウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン 。
8. ８．前記ウイルスが選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイルスであることを特徴とす る請求の範囲第７項記載のワクチン。
9. ９．病原菌がブタ不育および呼吸器系症候群ウイルスＡＴＣＣ　ＶＲ−２３３２ とその動物発生病理的変異株とから成る生物学的に純粋な培養であることを特徴 とする請求の範囲第１項記載のワクチン。
10. １０．ウイルスが勾配または連続細胞培養によって精製されていることを特徴と する請求の範囲第７項記載のワクチン。
11. １１．ブタミステリー病感染のブタを治療するのに適した血清であり、 ブタミステリー病感染のブタ由来の病原菌を接種したほ乳類の半精製血清を含む ことを特徴とする血清。
12. １２．病原菌がブタミステリー病に感染したブタ肺組織の濾過ホモジネートから 成る接種材料から得られることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の血清。
13. １３．病原菌がブタミステリー病に感染した肺組織から得た接種材料で処理した ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養の鳥類、昆虫またはほ乳類の器官細胞を含む細胞培地から 得られることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の血清。
14. １４．前記培養ほ乳類器官細胞がサル細胞系であることを特徴とする請求の範囲 第１３項記載の血清。
15. １５．ブタのブタミステリー病の診断方法において、ブタから肺組織試料を得て 、 試料の液体ホモジネートを生成し、 液体ホモジネートを容器に添加し、ウイルス材料を固定し、固定混合物を生成さ せ、 ブタミステリー病に対する非ブタほ乳類抗体血清を固定混合物に添加し、複合体 を生成させ、標識化抗種抗体を添加し、複合体を検出することを特徴とするブタ ミステリー病の診断方法。
16. １６．非ブタほ乳類抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範 囲第１５項記載のブタミステリー病の診断方法。
17. １７．標識化抗種抗体が放射性または呈色酵素標識を輸送することを特徴とする 請求の範囲第１５抗記載のブタミステリー病の診断方法。
18. １８．前記モノクローナル抗体がＳＤＯＷ１２またはＳＤＯＷ１７であることを 特徴とする請求の範囲第１６項記載のブタミステリー病の診断方法。
19. １９．ブタのブタミステリー病診断方法において、ブタから得たブタミステリー 病病原菌組織試料を有している疑いがある試料の液体ホモジネートを生成し、ブ タミステリー病ウイルスに対して免疫特異である免疫反応性抗体を液体ホモジネ ートに添加し、抗体−抗原複合体の沈殿の存在を検出することを特徴とするブタ ミステリー病の診断方法。
20. ２０．前記抗体がＳＤＯＷ１２であることを特徴とする請求の範囲第１９項記載 のブタミステリー病の診断方法。
21. ２１．前記抗体がＳＤＯＷ１７であることを特徴とする請求の範囲第１９項記載 のブタミステリー病の診断方法。
22. ２２．不活性または弱毒化したＭＳＤ病原菌を含むＭＳＤワクチンを生成するワ クチン生成方法において、肥大肺胞間、変性細胞および肺胞間中のデブリを有す るブタ肺組織を同定し、 薬学的に耐用し得る水溶液でブタ組織を同質化し、混合物を生成し、 一連のフィルターで混合物を濾過し、ＭＳＤ病原菌を含む濾過ホモジネートを生 成し、濾過ホモジネート中のＭＳＤ病原菌を不活性化または弱毒化してＭＳＤワ クチンを生成する ことを特徴とするワクチンに生成方法。
23. ２３．ホモジネートを濾過し、約１．０ミクロン以下の粒子を含有させることを 特徴とする請求の範囲第２２項記載のワクチン生成方法。
24. ２４．ホモジネートを濾過し、約０．５ミクロン以下の粒子を含有させることを 特徴とする請求の範囲第２２項記載のワクチン生成方法。
25. ２５．ホモジネートを濾過し、約０．１ミクロン以下の粒子を含有させることを 特徴とする請求の範囲第２２項記載のワクチン生成方法。
26. ２６．選好性非血球凝集外皮ＲＮＡウイルスの生物学的に純粋な培養において、 前記培養がその発生病理的変異株すべてを伴い、ブタにおけるブタ不育および呼 吸器系疾患に影響を与えることができることを特徴とする培養。
27. ２７．ネズミ誘導ハイブリッド細胞系によって生成されるモノクローナル抗体に おいて、前記抗体がブタに対してブタ不育および呼吸基疾患を生じさせる選好性 非血球凝集ＲＮＡウイルスの抗原決定基の少なくとも１つと特異的に結合するこ とができるモノクローナル抗体。
28. ２８．前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ型の免疫グロブリン分子であることを特徴 とする請求の範囲第２７項記載のモノクローナル抗体。
29. ２９．ＳＤＯＷ１２であることを特徴とする請求の範囲第２７項記載のモノクロ ーナル抗体。
30. ３０．ＳＤＯＷ１７であることを特徴とする請求の範囲第２７項記載のモノクロ ーナル抗体。
31. ３１．ブタ不育および呼吸器系症候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ　ＶＲ−２３３ ２の生物学的に純粋な培養において、前記培養が、その発生病理的変異株すべて を伴い、ブタに対してブタ不育および呼吸器系疾患に作用することができること を特徴とする培養。
32. ３２．修飾された生きたブタ不育および呼吸器系症候群ウイルスすなわちＡＴＣ Ｃ　ＶＲ−２３３２と、ウイルスがブタに対して非発生病理的になるように修飾 された薬学的に耐用し得る担体と、を含むことを特徴とするワクチン組成物。
33. ３３．死滅または不活性のブタ不育および呼吸器症候群すなわちＡＴＣＣ　ＶＲ −２３３２および薬学的に耐用し得る担体を含むことを特徴とするワクチン組成 物。
34. ３４．請求の範囲第３２項に記載したワクチン組成物をブタに投与することを特 徴とするブタ不育および呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。
35. ３５．請求の範囲第３３項に記載したワクチン組成物をブタに投与することを特 徴とするブタ不育および呼吸器症候群に対するブタの免疫化方法。
36. ３６．ブタ不育および呼吸器系症候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ　ＶＲ−２３３ ２の増殖単離方法において、適切な増殖培地中の血清存在下でサル細胞の完全ま たは部分的シーツにウイルスを接種し、ＣＰＥが認められるまでの間、約３４℃ 乃至３７℃で接種細胞シーツを培養することを特徴とする増殖単離方法。
37. ３７．サル細胞系がＭＡ−１０４であることを特徴とする請求の範囲第３６項記 載の増殖単離方法。