JPH06510861A - Ｃ型肝炎アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎アッセイ 発明の背景 本発明は一般に、Ｃ型肝炎ウィルス抗原と免疫学的に反応する抗体の試験サンプ ル中における存在及び／又は量を同定するためのアッセイ、特にＣ型肝炎ウィル ス抗原のエピトープを少なくとも１つ有するポリペプチドと抗体との複合体を検 出するためのアッセイに関する。

急性ウィルス性肝炎は、明確に定義された患者の症状の組合せ（例えば黄痕、肝 性圧痛、並びにアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパルテートアミノト ランスフェラーゼの血清レベルでの上昇）によって臨床学的に診断される。原因 である特定の型のウィルスを診断するには一般に、他の血清学的イムノアッセイ が実施されている。歴史的には、臨床的に肝炎の症状を示すが、Ａ型肝炎、Ｂ型 肝炎、エプスタインバー又はサイトメガロウィルスに感染していない患者は、除 外法によって非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）に感染していると臨床学的に診断さ れた。この疾患から慢性肝臓障害に至ることもあり得る。

免疫学的に特徴のある良く知られた肝炎誘発ウィルス（例えばＡ型肝炎ウィルス （ＨＡＶ）　、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）及びＤ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ） ）は各々、別科のウィルスに属し、独自のウィルス構成、タンパク質構造及び複 製機構を有する。

ＮＡＮＢＨウィルスを、既知の肝炎ウィルスのいずれかとのゲノム類似性によっ て同定しようとしたが失敗した。

このことは、ＮＡＮＢＨが独自の構成及び構造を有するこ−２４７（１９８７） 。

ＮＡＮＢＨに関連する抗原の正確な同定が困難であることが特に、ＮＡＮＢＨに 特異的な抗体を検出するアッセイの開発の障害になっていた。例えば、Ｊ、Ｗａ ｎｄｓ等ｒｏ　！、２０　：　４３−５６　（１９８６）　、Ｂ、５ｅｔｏ等の 米国特許出願第０７／２３４．６４１号（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ 　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａ ｔｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｎｏ 、８９１３８１６８より入手可）、１９８８年１１月３０日公開のに、Ｔａｋａ ｈａｓｈｉ等のヨーロッパ特許出願第０　２９３　２７４号、及びＲ，Ｓｅｅｌ ｉｇ等のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ８８１００１．２３号を参照されたい。

近年、他の肝炎誘発ウィルスが、Ｍ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等によってＣ型肝炎ウィ ルス（ＨＣＶ）として明確に同定された（ヨーロッパ特許出願公開第０　３１８ 　２１６号、１９８９年５月３１日）。このウィルスを記載した関連文れる。Ｍ 、　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等は、ＮＡＮＢＨに感染した患者の持つ抗体と免疫学的に 反応する抗原をコードするＨ　ＣＶ由来のｃＤＮＡ配列を単離したと報告し、こ れによりＨＣＶがＮＡＮＢＨを引起こす原因ウィルスであることが確定した。

ＨＣＶに関連するｃＤＮＡ配列は、慢性ＨＣＶ感染チンパンジーの血清をプール して得られたＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから単離した。ｃＤＮＡ ライブラリーは、平均約２００塩基対からなるｃＤＮＡ配列を含んでいた。ｃＤ ＮＡライブラリーをスクリーニングして、ＮＡＮＢＨ既往歴のある患者の血清中 の抗体と結合できるコードされたエピトープをクローン中に発現した。

前記ヨーロッパ特許出願の中で、Ｍ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等は更に、幾つかのスー パーオキシドジスムターゼ融合ポリペプチド（ＳＯＤ）の製造、及びＨＣＶスク リーニングアッセイを開発する上でのこれらＳＯＤ融合ポリペプチドの使用を記 述した。ヨーロッパ特許出願に記載された最も複雑なＳＯＤ融合ポリペプチドは Ｃ１００−３と称され、アミノ末端にヒトＳＯＤのアミノ酸１５４個、制限部位 ＥｃｏＲＩを含む合成りＮＡアダプターの発現に由来するアミノ酸残基５個、ク ローン化されたＨＣＶ　ｃＤＮＡフラグメントの発現に由来するアミノ酸３６３ 個、及びＭＳ２クローニングベクターのヌクレオチド配列由来のカルボキシ末端 アミノ酸５個を含むと記載されている。このポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列は、プラスミドを用いて酵母細胞に形質転換された。形質転換した細胞を培養 し、発現した分子量５４．０００のポリペプチドを分別抽出法によっておよそ８ ０％の純度まで精製した。

Ｓ　ＯＤ　Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂ　ｓ−＋−＋及び５ＯＤ−ＮＡＮＢＨ□と称される他 のＳＯＤ融合ポリペプチドは、組換えバクテリア内で発現された。大腸菌融合ポ リペプチドは、分別抽出法、また陰イオン及び陽イオン交換カラムを用いるクロ マトグラフィーにより精製された。この精製法により、純度約８０％のＳ　ＯＤ 　Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂ　５−Ｉ−＋　、及び純度約５０％のＮＡＮＢＨ３８が製造で きた。

Ｍ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等によって記述された組換えＳＯＤ融合ポリペプチドは、 マイクロタイターウェル又はポリスチレンビーズにコーティングされて、血清サ ンプルのアッセイに用いられた。簡潔に言えば、コーティングしたマイクロタイ ターウェルは、希釈サンプルと共にインキュベートした。インキュベーション後 、マイクロタイターウェルを洗浄し、放射性標識したヒツジ抗ヒト抗体又はマウ ス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ　（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合体を用いて発色 ／現像した。これらのアッセイは、後急性期及び慢性期双方のＨＣＶ感染を検出 するために用いられた。前述の調製方法のために、アッセイでは、サンプルに酵 母菌又は大腸菌抽出物を添加して、血清サンプル中に存在する任意の酵母菌又は 大腸菌抗体との望ましくない免疫学的反応を防ぐことが特に必要であった。

０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ、は、ＨＣＶ抗原 に対する抗体を検出する酵素免疫アッセイを開発した。０ｒｔｈｏアツセイ法は 、組換え酵母／Ｃ型肝炎ウィルスＳＯＤ融合ポリペプチドＣ１００−３でコーテ ィングしたマイクルウエル中で行なわれる三段階の血清／血漿検査である。

第１段階では、検体を直接テストウェル中で希釈して、一定時間インキュベート する。検体中にＨＣＶ抗原に対する抗体が存在する場合、マイクロウェルの表面 に抗原−抗体複合体が形成される。抗体が存在しない場合は、複合体は形成され ず、結合しない血清又は血漿タンパク質は洗浄段階で除去される。

第２段階では、抗ヒトＩｇＧマウスモノクロナール抗体西洋ワサビペルオキシダ ーゼ結合体をマイクロウェルに加える。結合体は、抗原−抗体複合体の抗体部分 に特異的に結合する。抗原−抗体複合体が存在しなければ、結合しなかった結合 体も洗浄段階で除去される。

第３段階では、０−フェニレンジアミン２ＨＣＩ　（ＯＰＤ）と過酸化水素とか らなる酵素検出系がテストウェルに添加される。結着した結合体が存在すれば、 ＯＰＤは酸化されて、着色した最終生成物が得られる。着色した最終生成物の形 成後、希硫酸をマイクロウェルに添加して、色素形成検出反応を停止させる。

最終生成物の着色の程度は、マイクロウェルリーダーで測定する。このアッセイ を使用して、患者の血清及び血漿をスクリーニングしてもよい。

ＨＣＶが汚染された血液及び血液製剤によって伝染し得ることは確定している。

輸血を受けた患者が輸血後肝炎にかかる率は１０％に達する。この内約９０％が 、ＨＣＶと診断される感染症の結果である。血液及び血液製剤によるＨＣＶ感染 を防ぐには、ＨＣＶキャリア並びに汚染された血液及び血液製剤を識別するため の、信頼性が高く、感受性及び特異性のある診断及び予後のツールが必要である 。

従って、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在を正確に検出する、信頼性が高く有効な 試薬や方法を用いるＨＣＶアッセイが必要である。

発明の要約 本発明は、ＨＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ含むポリペプチドをサンプ ルと接触させることにより、試験サンプル中においてＨＣＶ抗原に対する抗体の 存在を検出する改良アッセイを提供する。ポリペプチドは、ｐ３８０−ＪＨＩ、 ｐ−３８０，ＬＧＳｐ３８０−Ｊ及びｐ４０８からなる群の中から選択される。

本発明のアッセイ方式の−っは、ＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を 明確に同定するための確認アッセイ（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ　ａｓｓａｙ） である。簡潔に言えば、液体サンプルを使用して、第１及び第２のアリコートを 作成する。

次いで、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で、Ｉ−Ｉ 　ＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ含む、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を含むク ローンによって発現されるタンパク質中に含まれると推定される連続アミノ酸配 列の複製である少なくとも２種のポリペプチドをアリコートと接触させる。最後 に、抗体−抗原複合体を検出する。

第１のアリコート及び第２のアリコートは、ｐ３８０−ＪＨｌ、ｐ−３８０，Ｌ ＧＳｐ３８０−Ｊ及びｐ４０８Ｊからなる群の中から選択される少なくとも１種 のポリペプチドと接触させる。但し、第１のアリコートで使用するポリペプチド は第２のアリコートには使用しないものとする。

別のアッセイ方式は、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件 下で、ｐ３８０ＪＨ１、ｐ３８０Ｊ、ｐ３８０．ＬＧ及びｐ４０８Ｊからなる群 の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ含む少なくとも１ 種のポリペプチドを結合した固相をサンプルと接触させ、抗体−ポリペプチド複 合体を検出することからなる、液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に 反応する抗体の存在を同定するアッセイである。

別のアッセイ方式は、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件 下で、ｐ３８０ＪＨ１、ｐ３８０Ｊ、ｐ３８０．ＬＧ及びｐ４０８Ｊからなる群 の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ含むポリペプチド をサンプルと接触させ、抗体−ポリペプチド複合体を慢性ＨＣＶ感染の指標とし て検出することからなる、液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応 する抗体の存在を同定するアッセイである。

別のアッセイ方式は、抗体と少なくとも１種のポリペプチドとの複合体を形成す るのに適した条件下で、ｐ３８０ＪＨＩ、ｐ３８０Ｊ、ｐ３８０．ＬＧ及びｐ４ ０８Ｊからなる群の中から選択され、各々がＨＣＶ抗原の明瞭なエピトープを含 む少なくとも２種のポリペプチドを同時にサンプルと接触させ、複合体を発色剤 と反応させて抗体−ポリペプチド複合体を検出することによって、ＨＣＶ抗原と 免疫学的に反応する抗体の存在を同定するイムノドツトアラ別のアッセイ方式は 、陽性結果が誤認でないことを確認するために、サンプルを用いて第１及び第２ の免疫学的に同一のアリコートを作成した液体サンプル中においてＨＣ■抗原と 免疫学的に反応する抗体の存在を同定する競合アッセイである。第１のアリコー トは、抗体と結合して検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成するのに適し た条件下で、ＨＣＶ抗原のエピトープを少な（とも１つ含む結合ポリペプチド（ ｐ３８０ＪＨ１、ｐ３８０ＪＳｐ３８０゜ＬＧ及びｐ４０８Ｊからなる群の中か ら選択）を含む固相担体と接触させ、第２のアリコートは、最初にｐ３８０ＪＨ １、ｐ３８０Ｊ、ｐ３８０．ＬＧ及びｐ４０８Ｊからなる群の中から選択される 未結合ポリペプチドと接触させ、次いでｐ３８０ＪＨ１、ｐ３８０ＪＳｐ３８０ ．ＬＧ及びｐ４０８Ｊからなる群の中から選択される結合ポリペプチドを含む同 じ固相担体と接触させる。

全てのアッセイでは、固相担体に吸着したポリペプチドに接触させる前に、サン プル、特に血清又は血漿を希釈しておくことが好ましい。しかしながら、試験サ ンプルを検査するときには、希釈していないか又は濃厚なサンプルが好まれ得る 。サンプルは、全血、血清、血漿、脳を髄液、尿、及びリンパ球又は細胞の培養 液上清のような種々の生物学的サンプルから得ることができる。固相担体の材料 としては、セルロース材料（例えば紙及びニトロセルロース）、天然及び合成の ポリマー材料（例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン）、綿、シリコンチッ プ、多孔質ゲル（例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン） 、装填材料を形成し得る粒子（例えばイオン捕捉アッセイで使用される粒子）、 並びに無機材料（例えば不活性化アルミナ、硫酸マグネシウム及びガラス）が含 まれ得る。

好適な固相担体材料は、良く知られた種々の物理的形状（例えばマイクロタイタ ーウェル、試験管、ビーズ、ストリップ、膜及び極微粒子）でアッセイに使用で き、磁性であっても、非磁性であってもよい。イムノドツト以外のアッセイでは 、ポリスチレンビーズを固相担体として用いることが好ましい。イムノドツトプ ロットアッセイでは、ニトロセルロースを固相担体として用いることが好ましい 。

本発明のアッセイで抗体−抗原複合体を検出するための適切な方法及び試薬は、 市販されているか又は関連技術として知られている。代表的な方法は、酵素、放 射性同位体、蛍光試薬、発光試薬又は化学発光試薬のような検出試薬を使用し得 る。これらの試薬は、既知の手順に従ってハプテン標識抗ハブテン検出系の作成 に使用でき、例えば、ビオチン標識抗ビオチン系を使用して、抗体−抗原複合体 を検出してもよい。

本発明は更に、固相担体に結合したＨＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ含 むポリペプチド、必須のサンプル調製試薬、洗浄剤、検出試薬、及びシグナル生 成試薬を含むアッセイキットも包括している。

目下好適な実施態様において本発明を説明する以下の詳細な説明を考慮すれば、 本発明のその他の態様及び利点は当業者には一目瞭然であろう。

図面の簡単な説明 図１ａ及び１ｂはＨＣＶゲノムを示す。

図２は、ＨＣＶ接種チンパンジーにおける抗体の存在を同定するための、抗原性 ポリペプチドの使用を示す。

図３ａ及び３ｂは、組合わせアッセイ方式を使用した場合の感受性の向上を示す 。

図４は、イムノドツトアッセイ用のテストカートリッジを示す。

図５は抗ＮＳ５　Ｓ／Ｎ抗体の量（白四角間の実線として示す）及び抗ＨＣＶ　 ２．ＯＳ／Ｃｏ抗体の量（黒四角間の実線として示す）を処理（ｐｒｅｓｅｎｔ ａｔｉｏｎ）後の日数に対してプロットした血清転換（５ｅｒｖｏｃｏｎｖｅｒ ｓｉｏｎ）のグ本発明は、試験サンプル中においてＨＣＶ抗原に対する抗体を検 出するためのアッセイに関する。好ましい方式では、ヒト血清又は血漿をサンプ ル希釈液で希釈し、ＨＣＶ抗原性エピトープを含むポリペプチドでコーティング したポリスチレンビーズと共にインキュベートする。サンプル中に抗体が存在す る場合、それらは抗原性ポリペプチドと共に複合体を形成して、ポリスチレンビ ーズに結合される。

複合体形成後、結合しない物質及び試薬はビーズの洗浄により除去され、ビーズ −抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、ヒト抗体に対 するヤギ抗体を含んだ溶液と反応させる。次いで、このペルオキシダーゼ酵素は 、既にビーズに固定された抗原−抗体複合体に結合する。最終反応では、西洋ワ サビペルオキシダーゼは０−フ二二レンジアミン及び過酸化水素と接触して、黄 橙色に発色する。色の濃さは、ビーズに固定した抗原と最初に結合する抗体の量 に比例する。

ＨＣＶ抗原性エピトープを有する好ましいポリペプチドは、免疫学的に反応性の ある他の既知物質と類似のアミノ酸配列を有し且つ免疫学的に何らかの反応性を 持つと同定された部分から選択した。ポリペプチドの免疫学的反応性は、ＨＣＶ ゲノムのｃＤＮＡフラグメントで形質転換させた大腸菌クローンの細胞抽出物と 、ＨＣＶ感染血清とを反応させて最初に同定した。クローンは、取込まれたｃＤ ＮＡによってコードされるポリペプチドを発現すると推定された。このポリペプ チドはＨＣＶ抗原に対する抗体を含んでいることが分かっている血清と免疫学的 に反応した。しかしながら、所与のアミノ酸配列の分析からは、免疫学的反応性 を予知する上での大まかな手掛かりしか得られない。

所与のアミノ酸配列を作成し、アッセイ中でその疑わしい配列をテストする以外 には、免疫学的活性を確定する一定不変の予想法は無い。表１に示す如く、免疫 学的反応性を提供すると予想される数種のペプチドが、実際のアッセイで使用す ると反応しないことが判明した。

表１ ＣＨＩＲＯＮ　ゲノム　ｔンブル　ＡＯＯ６４２量ンブル　＃４０１　ｔン１ル 　＃４２３ＵＰＤＡＴＥ　ａｍ　希釈度　結果　希釈度　結ＩＩ釈度　結果１６ ９４−１７３５　Ｃ−１００１＋８００　１性　１：４０　陽性　１：２０　１ 性１８６６−１９３０　Ｃ−１００１：１００　１性　−−−−１６８９−１８ ０５Ｃ−１００１：５００　１性　１：４０　１性　１：２０　！Ｉ性１６８４ −１７５０　Ｃ−１００１：５００　陽性　に４０　！ｉ性　に２０　ｍ性１８ ９９−１９３０　Ｃ−１００１：５０　陽性　１：４０　１性　１：２０　陰性 １１９２−１２４０　３３Ｃ１：８００　陽性　に４０　陽性　１：２０　ｍ性 １２２３−１２４０　３３Ｃ１：２００　陽性　１：４０　陽性　１：２０　１ 性１−７５　Ｐｕｔ、Ｃｏｒｅ　１：１００　陽性　１：４０　１性　１：２０ 　陽性３５−７５　Ｐｕｔ、　Ｃａｒｅｔ：５０　１性　１：４０　１１ｔ　１ ：２０　Ｉ性９９−１２６　Ｐｕｔ、Ｃｏｒｅｌ二５０　ｉ性　１：４０　Ｉ性 　１：２０　陽性１５６９−１５９３　Ｃ−１００１：２５　ｍ性　１：４０　 １性　１：２０　１性１３５７−１４０７　３３Ｃ１：２５　ｍ性　１：４０　 １性　１：２０　１性１４１８−１４５７　３３Ｃ１：２５　１性　１：４０　 １性　１：２０　ｍ性１９５−２６２　Ｐｕｔ、Ｃｏｒｅ／１：５０　１４　１ ：４０　ｍ性　１：２０　ｍ性Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ２３０−２６２　Ｐｕｔ、Ｃｏｒｅ／１：２５　１性　１：４０　１１ｔ　１： ２０　ｍｌＥｎｖｅｌｏｐｅ ４９２ｎｍでの吸光度が陰性対照の吸光度値の４倍以上であれば（Ｓ／Ｎ≧４． ０）、サンプル値は陽性であるとみなされる。

＾００６４２　ＮＡＮＢ　（ＨＣＶ）肝炎回復患者からのヒト血漿サンプル。患 者はＮＡＮＢであると臨床学的に診断され、ＨＢＶ及びＨＡＶマーカーに対して は陰性であった。

＃４９１　Ｃ−１００に基づ（スクリーニングアッセイで陽性のヒト血漿ドナー 。既知の臨床病歴はなし。

＃４２３　Ｃ−１００−３に基づくスクリーニングアッセイで陽性のヒト血漿ド ナー。既知の臨床病歴はなし。

ＨＣＶ抗原のエピトープを１つ以上有するポリペプチドを使用して行ったＨＣＶ 抗原に対する抗体の存在の検出を図２に示す。組換えＣ１００−３ポリペプチド を使用するアッセイ、及びｐ１６８９ポリペプチドを使用する他のアッセイで、 チンパンジーＭｅｌｉｌｏｔのＨＣＶ感染の過程をフォローした。いずれのアッ セイも接種前は陰性の結果が出た。またいずれのアッセイもこの動物がＨＣＶに 感染してから約１００日後に抗体の存在を検出した。

免疫学的に反応することが判明した本発明のポリペプチドを調製するために合成 法及び組換え法の両方を使用する方法は幾つか知られている。好ましくは、自動 化合成機を用いてポリペプチドを製造することができる。ｐ１６８４の合成を以 下に示す。

ｐ１６８４の合成： Ｈ−ＧＲＷＬＳＧＫＰＡＩＩＰＤＲＥＶＬＹＲＥＦＤＥＭＥＥＣ８ＱＨＬＰＹＩ ＥＱＧＭＭ−ＬＡＥＱＦＫＱＫＡＬＧＬＬＱＴＡＳＲＱＡＥＶＩＡＰＡＶ−ＯＨ Ｇ、　Ｂａｒａｎｙ及びＲ，Ｂ、ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄがＴｈｅ　Ｐｅｐｔ　１ ｄｅｓ　（Ｅ、Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄＲ，Ｍｅｉｎｈｏｅｆｆｅｒ、　ｅｄｓ、） ２．　１−２８４　（１９８０）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹに記載の一般的な手順に従って、完全に保護されたペ プチドを段階的固相合成（カルボキシル末端残基で始める）によってフェニルア セトアミドメチル（ＰＡＭ）上で組み立てた。オキシメチルフェニルアセトアミ ドメチル（ＯＭＰＡ）リンケージでＣ末端アミノ酸バリン（Ｃａｌ）を固相担体 にカップリングさせて、トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）での長い処理に対して 改善された安定性を示すＰＡＭ樹脂を得た。ＢＯＣ−Ｖａ　１−ＯＣＨ、−ＰＡ Ｍ−樹脂（０，７８ｍｍｏ　ｌ／ｇ、０．１３ｇ）をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒモデル４３０Ａの反応 容器に移した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの小規模高速サイクルプ ロトコルを用いて、Ｎ末端に向けてカルボキシル末端から始まる全てのその後の アミノ酸を段階的にカップリングさせた。保護されたアミノ酸を、アスパラギン 、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンの予備生成した対称無水物に関する化 学技術を用いてカップリングし、Ｎ−Ｎ’　−ジシクロヘキシルカルボジイミド （ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）に関する化学技術 を用いて２度カップリングした。第１のカップリングでは、予備生成した対称無 水物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したものを用いて、保護されたア ミノ酸をカップリングした。個々のアミノ酸の対称無水物を塩化メチレン中で生 成し、次いで溶媒をＤＭＦに変えて、ペプチド合成機の反応容器に移した。対称 無水物の第２の力・ノブリングもＤＭＦで実施した。使用した全てのアミノ酸の Ｎ−アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）リンケージで保護し た。種々のアミノ酸の側鎖官能基は以下の基で保護された： Ａｒｇ−Ｔｏｓ　（トシル） Ｌｙｓ−２Ｃ１ｚ　（２−クロロベンジルオキシカルボニル）Ｔｈｒ、５ｅｒ− Ｂｚｌ　（ベンジル）Ｔｙｒ−２８ｒＺ　（２−ブロモベンジルオキシカルボニ ル）Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ　（４−メチルベンジル）Ａｓｐ、　Ｇｌｕ−ＯＢｚ ｌ　（０−ベンジル）Ｈｉｓ−ＤＮＰ　ジニトロフェニル 完全に保護されたペプチド−樹脂（０，２ｇ）を５分間塩化メチレン（ＣＨｚＣ ｌｚ）中で膨潤させた。ペプチド−樹脂を手動操作の反応容器に移し、５％チオ フェノールのＤＭＦで２度、それぞれ２０分間処理し、次いでＣＨ，ＣＩ２で６ 度、それぞれ１分間洗浄し、次いで合成機の反応容器に移した。次に、製造業者 のプロトコルに従って６０％Ｔ　Ｆ　Ａ　／　ＣＨ２ＣＩ　ｚを用いてｔ−ＢＯ Ｃ保護基を除去し、次いで部分的に脱保護したペプチド−樹脂を真空下、室温で 一晩乾燥した。

部分的に脱保護したペプチド−樹脂を硫化ジメチル（ＤＭＳ　［１ｍｌコ、ｐ− クレゾール［１ｍｌコ、ｐ−チオクレゾール［０，２ｇ］及びＨＦ　［１０ｍ１ ｌ）によって０℃で１時間処理して、樹脂担体からペプチドを開裂させた。

ＨＦ／ＤＭＦ及び他の揮発物を０℃で真空蒸留した。開裂させたペプチドと樹脂 とを１５ｍ１のジエチルエーテルアリコートで３度洗浄し、それぞれ４０％酢酸 水溶液と１５％酢酸水溶液とからなるアリコートｌＱｍｌで３度洗浄して、開裂 したペプチドを抽出した。水性抽出物を合わせ、ジエチルエーテルアリコート１ ５ｍ１で３度洗浄し、次いで凍結乾燥して、粗ペプチドを得た。

Ｃ４，４，６Ｘ３０ｍｍカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、　Ｆ。

５ｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用い、１ｍ１／分の流速で、 ０．１％水性ＴＦＡ　（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系とする 逆相高速液体クロマトグラフィーで粗ペプチドの純度を分析した。このペプチド 分析で使用した好ましい溶媒勾配は最初、Ｂ溶媒を３０％にした。カラムを３０ ％Ｂで１分間保持し、次いで線形勾配を用いて２０分で５５％Ｂまで上昇させ、 そこで１分間保持した。最後に、カラム濃度を２分間で３０％Ｂに下げた。溶離 剤中でのペプチドの存在を、２２５ｎｍ及び２８０ｎｍで同時に監視した。精製 ペプチドの組成を酸加水分解で決定した。酸除去後に、Ｂｅｃｋｍａｒ６３００ アミノ酸分析機で氷解物を分析した。

精製ポリペプチドの量を増したければ、Ｃ４，１０１０Ｘ１００のカラム（Ｂｒ ｏｗｎｌｅｅ、Ａｐｐｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用い、前述したのと同じ０．１％ 水性ＴＦＡ　（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）の溶媒系を使用して、同 様に半製（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）逆相高速液体クロマトグラフィ ーを実施した。半製検査の好ましい溶媒勾配は最初、３ｍ１／分で２分間２７％ Ｂとし、次いで線形勾配を用いて２０分で５０％Ｂに増した。濃度を５０％Ｂで １分間保持し、次いで１分以内に２７％Ｂに下げた。

本明細書に記載する他のペプチドを、前述した合成と同様の方法で固相担体上に 組み立てた。アミノ酸；トリオドファン及びメチオニンが存在する場合、これら は側鎖を保護せずに使用した。通常鎖組み立て中にメチオニンを組み込んだ後に 、エタンジチオール（０，１％Ｖ　／　Ｖ　）をＴＦＡに加えて、その後ｔ−Ｂ ＯＣ基を全て除去した。しかしながらＤＮＰによって保護されたヒスチジンが配 列中に存在する場合は、エタンジチオールをＴＦＡに加えなかった。

代わりに、インドール（１％Ｖ／Ｖ）を使用した。更には、トリプトファンを組 み込んだ後に、インドール（１％Ｖ／Ｖ）をＴＦＡ溶液に加えた。

樹脂からのＨＦの開裂及びペプチドの精製を本質的には以下で説明するように実 施した。

前述した方法で合成したペプチドの抗原性／免疫原性を評価した。アミノ末端で 始まり、カルボキシ末端で終わる免疫学的に反応性のペプチドのアミノ酸配列の 概要を表２及び表８に示す。

表２ （注：Ｈはアミン末端を意味し、ＯＨはカルボキシル末端を意味する。） Ｇ−Ｐ−日−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｔ−Ｒ−に−Ｔ−３−Ｅ−Ｒ−Ｓ−（ツーＰ −Ｒ−Ｇ−（９９−１２６）　Ｔ−Ｌ−ＯＨ 表２（続き） （注、Ｈはアミノ末端を意味し、ＯＨはカルボキシル末端を意味する。） （１４１Ｂ−１４５７）　Ｇ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−３−Ｖ−１−Ｄ−Ｃ−Ｎ−Ｔ−Ｃ− ＯＨｐ１５６９　Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｈ−Ｆ−Ｌ−８−Ｑ−Ｔ−に−Ｑ−８−Ｇ−ε− Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｙ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｙ−０−Ａ−Ｔ−Ｖ−ＯＨＡ−６−Ｒ−Ｑ−Ａ− Ｅ−Ｖ−１−Ａ−Ｐ−Ａ−Ｖ−ＯＨＥ−Ｖ−１−Ａ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｑ−Ｔ−Ｎ− Ｗ−Ｑ−に−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ｆ−Ｗ−Ａ−に−Ｈ−Ｍ−Ｗ−Ｎ−Ｆ−１−８−Ｇ− １−Ｑ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｇ−Ｌ−ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ａ−１−Ａ−８− Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｆ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｖ−Ｔ−表１（続き） （注：Ｈはアミノ末端を意味し、ＯＨはカルボキシル末端を意味する。） （１８９９−１９３０）　Ｇ−Ｎ−Ｈ−Ｖ−８−０８表８ （注：Ｈはアミノ末端を意味し、ＯＨはカルボキシル末端を意味する。下線を引 いた２個のＴｒｙ残基はＨＣＶ配列の一部分ではなく、後でペプチドをヨウ素化 しやす（するためにそこで処理されている（　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。）乃ｒ −Ｇｌｙ−ＯＨ 表８ （注、Ｈはアミノ末端を意味し、ＯＨはカルボキシル末端を意味する。下線を引 いた２個のＴｒｙ残基はＨＣＶ配列の一部分ではなく、後でペプチドをヨウ素化 しやすくするためにそこで処理されている。） ｐ６４３ｂ　Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−（６４３−６８３）　Ａｓ ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔ■秩| Ｔｈｒ−ＧＩｎ−Ｔｒｐ−ＧＩｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−６ｅｒ− Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ＯＨ ｐ６６６　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇ ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−８ｅｒ−（６６６−６８３）　Ｐｉｅ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−一−０Ｈｐ６９１　Ｈ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ− Ｈ１ｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ ｙｒ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ｇ撃凵| （６９１−７１４）　Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｓｅ ｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−ｉｌｅ−ＯＨ（３８０−４３６）　Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈ ｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ−Ｇｌｙ−Ａ撃＝| Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｔ ｈ　ｒ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−）４１ｓ−ｌ@１ｅ− Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ− ８ｅｒ−Ｌｅｕ−ＧＩｎ−Ｔｈｒ−ＧＩｙ−ＯＨ ｐ３８０Ｊ　Ｈ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ− Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ| Ｓｅｒ− 表２に示すポリペプチドは、当業者に公知の種々の側鎖保護方法を用いて、段階 的に又はフラグメントカップリングプロトコルで調製しても良い。ポリペプチド を酵素方法を用いて調製しても良い。

更には、本発明を実施する上で有用なポリペプチドを組換え技術を用いて調製し ても良い。簡潔に言えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を所望の 完全配列のフラグメントから組み立てることが好ましい。フラグメントは一般に 、良く知られている自動化された方法及び装置を用いて作成する。完全な配列を 作成した後に発現ベクター内に所望の配列を組込み、宿主細胞内で形質転換させ る。

次いで、ＤＮＡ配列が宿主細胞によって発現されて、所望のポリペプチドが得ら れる。これを宿主細胞又は宿主細胞が培養されている培地から採取する。大抵の 場合、作成されたＤＮＡ配列は、宿主細胞内で最もよく発現されることが知られ ているコドンを用いて組み立てられる。組換え技術を用いてより小さいペプチド を調製しなければならないときには、鎖状につながった所望のポリペプチドの幾 つかのコピーをコードする単一のＤＮＡ配列を作成することが有利であり得る。

次いで長鎖を単離し、鎖を開裂させて、より短い所望の配列にする。

ｐ１６８４のアミノ酸配列を逆翻訳すると、大腸菌での高い発現レベルを容易に するために最適化された（フラグメントの組み立て及び合成と相客れないもので はない）表３に示すコドンが得られる。個々のオリゴヌクレオチドは製造業者が 推奨する方法及び試薬を用いてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８０Ａ　 ＤＮＡ合成機で合成される。これらの精製オリゴヌクレオチドをアニールし、連 結させてＤＮＡ配列全体を組み立て、ＢａｍＨＩ　５ａｌＩで消化し、連結によ ってｐＵｃ１８を得る。得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換 することが好適である。表３は更にｐｌ及びｐ１２２３を発現するための好まし いコドンを示す。

クローンがＤＮＡ配列を発現することを確定するために、クローンを２５０ｍ１ のＥｒｙｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内にて、５０ｍ１のＬｒ１ａ　Ｂｒｏｔｈを 用いて３７℃で成長させる。培養物の０Ｄ６００が０．３−０．５に達すると、 ＩＰＧＴを加えて最終濃度を１ｍＭにし、発現を誘発する。サンプル（１，５ｍ １）を１時間の間隔で除去し、細胞をベレット化し、２ｘＳＤＳ／ＰＡＧＥ装填 緩衝液に再度懸濁させて、０Ｄ６００を１０．０にする。調製したサンプルのア リコート（１５μｍ）を１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に装填し、発現したポリ ペプチドを分離し、次いでイムノプロットのために電気泳動でニトロセルロース に移動させる。移動したタンパク質を含むニトロセルロースシートをブロッキン グ溶液と共に１時間インキュベートし、５％大腸菌ＪＭ１０３溶解物を含むＴＢ Ｓで希釈したＨＣＶ患者血清と共に４℃で１晩インキユベートする。

ニトロセルロースシートをＴＢＳで３度洗浄し、次いで１０％ウシ胎児血清を含 むＴＢＳで希釈したＨ　ＲＰ　Ｏ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートす る。ニトロセルロースをＴＢＳで３度洗浄し、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの４−ク ロロ−１−ナブトールと、０．０２％過酸化水素と、１７％メタノールとを含む ＴＢＳで発色現像する。ＨＣＶ患者の血清では免疫反応の強いバンドが形成され 、このことは、合成ポリペプチドが免疫学的に反応性の形態で大腸菌に発現され ることを示している。

前述したポリペプチドを用いる好ましいアッセイ方式を以下の実施例で説明する 。しかしながら、当業者に公知の他のアッセイ方式を使用してもよい。これらの アッセイには、イオン捕捉アッセイ、極微粒子アッセイ、及び少なくとも１種の ポリペプチドを固相にくっ付けて、試験用血清と接触させ、抗原−抗体複合体に ついて固相表面を走査する走査型トンネリング（ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）顕微鏡検 査の使用が含まれる。

実施例１では確認アッセイを説明する。実施例２では組合わせアッセイを説明す る。実施例３では合成ポリペプチドをベースとするアッセイを説明する。実施例 ４ではイムノドツトアッセイを説明する。実施例５では競合アッセイを説明する 。実施例６では、ペプチド３８０−４３６．４４７−４８３．６４３−６８３及 び２３０２−２３５２を使用するＥＩＡアッセイを説明する。実施例７ではペプ チドｐ３ｓｏ、ＬＧを使用するＥＩＡを説明する。実施例８では、ペプチド２３ ０２　（ＮＳ−５）を使用するＥＩＡを、抗原ＮＳ３　（ＣＫＳ−３３Ｃ，ＮＳ ４　（Ｃ−１００）又はＣ０ＲＥ　（ＣＫＳ−ＣＯＲＥ）’Ｉを使用するＥＩＡ と比較して説明する。実施例９では適用するＰＥＰＳＣＡＭプロトコルを説明す る。実施例１０では、４つの異なるＨＣＶ単離物の配列をベースとする合成ペプ チドの調製を説明する。実施例１１では、実施例１０のへブチドを使用しての慢 性患者及び血漿ドナーに関する研究から得られたデータを説明する。これらの実 施例は例示的であって、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例 実施例１．確認アッセイ 確認アッセイは、異なる源から調製して、単離することが好ましい、ＨＣＶ抗原 性エピトープを含む少な（とも２種のポリペプチドを使用する。一方のポリペプ チドは血清又は血漿サンプルのスクリーニングに使用する。他方のポリペプチド は、スクリーニング手順によってＨＣＶ抗体を含むとして最初に同定されたサン プル中にＨＣ■抗体が存在することを確認するために使用する。

本発明の好ましい確認アッセイでは、スクリーニング手順で組換えＣ１００−３ ポリペプチドを使用する。Ｃ１００−３組換えポリペプチドは、１６８９−１８ ０６アミノ酸配列によって規定される免疫優性領域及び多数のエピトープを含む と考えられる。ヨーロッパ特許出願公開第０３１８　２１６号に記載の如く、Ｃ １００−３ポリペプチドを組換え酵母細胞中に発現して、細胞抽出物から単離す る。殆どがＣ１００−３の複製であるアミノ酸配列を含む他の組換えポリペプチ ドを使用しても良い。

確認アッセイで使用する他のペプチドは、ｐｌ、ｐ３５、ｐ９９、ｐ１１９２、 ｐ１２２３、ｐ１６８４、ｐ１６８９、ｐ１６９４、ｐ１８６６及びｐ１８９９ からなる群の中から選択される合成ペプチドである。好ましいペプチドはＰ１６ ８４又はｐ１８６６である。前述した手順に従ってこれらのペプチドを調製した 。確認アッセイでは、ｃｌｏｏ−３と、合成ペプチドのｐ１６８４、ｐ１６９４ 又はｐ１８６６とを別々にポリスチレンビーズ上にコーティングした。所望とあ れば、ポリスチレンビーズ上にコーティングした合成ペプチドを組合せて使用し ても良い。

ポリスチレンビーズをまず、蒸留水及びプロパツールで洗浄し、次いで約０．４ 〜０．５Ｍ　ＮａＣ１と約０．００２２％トリトンｘ−ｉｏｏとを含み、ｐＨを 約６．５〜１０．０に調整した適切なＯ，１Ｍ緩衝溶液で０．１〜２０．０μｇ 　／　ｍ　Ｉに希釈した粗又は精製ＨＣＶ合成ペプチドと共にインキュベートす る。以下の緩衝液ニドリス、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，硼酸及びクエン酸塩緩衝 液が好ましく、各ペプチドについて最適化されている。合成ペプチドのための好 ましい緩衝液１．Ｈ及びコーティング濃度を表４に示す。ｐＨが規定範囲よりも 低くなっても高くなってもうま（コーティングできる。ビーズを抗原溶液中にて ３８〜４２℃で約２時間インキユベートシ、リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄 し、０．１％トリトンｘ−ｉｏｏのＰＢＳ中に３８〜４２℃で６０分間浸軟させ る。次いでビーズをＰＢＳで２度洗浄し、５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液を用いて６０分間でオーバーコーテイングし、ＰＢＳで３ 度洗浄する。最後に、ビーズを５％（ｗ／ｖ）スクロースのＰＢＳでオーバーコ ーテイングし、窒素下又は空気中で乾燥する。

ペプチドをそれぞれ別個にポリスチレンビーズ上にコーティングして、抗体捕捉 方式で使用する。４００μｌのサンプル希釈液及びペプチドでコーティングした ビーズと共に、１０μｌのサンプルを反応トレーのウェルに加える。

サンプル希釈液は、約１０％（ｖ　／　ｖ　）以下のウシ血清及び約２０％（Ｖ 　／　Ｖ　）以下のヤギ血清の２０ｍＭ）リスリン酸塩緩衝液からなり、これに は０．２０％（Ｖ　／　Ｖ　）以下のトリトンＸ−１００と、３％（Ｗ／Ｖ）以 下のＢＳＡとが含まれている。組換え酵母Ｃ１００−３ポリペプチドを使用する ときには、試験サンプル中に存在し得る酵母抗原に対する抗体を、サンプル希釈 液に加える酵母抽出物（通常約２００μｇ／ｍｌ）と反応させる。サンプル希釈 液に酵母抽出物を加えて、偽陽性結果を防止する。最終材料を滅菌濾過し、プラ スチック瓶に詰め、０．１％アジ化ナトリウムで保存する。

４０℃で１時間インキュベートした後にビーズを洗浄し、反応トレーのウェルに 結合体２００μｍを加える。

好ましい結合体はヤギ抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体である。

結合体濃縮液は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄから購入し、力価を測定 して、処理濃度を決定する。次いで、濃縮液を処理濃度の２０倍の濃度になるま で希釈液で希釈する。結合体希釈液は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清と、１０％（ ｖ　／　ｖ　）ヤギ血清と、０．１５％トリトンＸ−１００との２０ｍＭトリス 緩衝液（ｐＨ７，５）中に０゜０１％ゲンタマイシンスルフェートと、ピンク色 素と、保存料としての抗菌剤とを加えたものからなる。結合体を滅菌濾過して、 プラスチック瓶に詰める。

結合体と共に４０℃で１時間インキュベートした後に、ビーズを洗浄し、ＯＰＤ 基質に室温で３０分間暴露し、ｌＮ　Ｈ２ＳＯ４を加えて反応停止させる。４９ ２ｎｍで吸光度を読取る。

ポリペプチドＣ１００−３を用いたスクリーニングアッセイで繰り返し反応性が あることが判明したサンプルを、ｐ１６８４又はｐ１６８９でコーティングした ビーズを用いて２組で検査する。反応性のある検体は確認されたサンプルとみな される。ｐ１６８４ともｐ１６８９とも反応しないサンプルは、ｐ１６９４及び ｐ１８６６ビーズを用いて２組で検査する。これらのペプチドの一方と又は両方 と反応するサンプルは確認されたとみなされる。これらのペプチドのいずれとも 反応しない検体は確認されないとみなされる。

許容し得る特異性を維持するために、アッセイのカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）は 、正常母集団平均の吸光度値よりも少なくとも５〜１５標準偏差高くなければな らない。これらの基準にそって、推定されるほとんどの“真の陰性”を“真の陽 性“検体から明確に区別するアッセイ用カットオフを選択してもよい。一般的な カットオフ値は、陰性対照の平均吸光度値の約２．１〜８倍として計算しても良 い。

確認アッセイの性能 １．静脈薬使用者ザンブル ＮＩＨから資金提供を受けた研究に登録された静脈薬使用者の母集団からサンプ ルを採取した。母集団は、個体、即ちイリノイ州メイウッドのＥｄｗａｒｄ　Ｈ ｉｎｅｓＪｒ、Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ。

ｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの患者からＣｏｎｎ１ｅ　Ｐａｃｈｕｃｋ　ｉ医師及び感 染病医員のメンバーが２年かけて選択した承認静脈薬使用者からなっていた。

表５に示すように、各々−人のドナーから得た総計２９６検体を、組換え酵母Ｃ １００−３ポリペプチドを用いてスクリーニングした。最初に検査した２９６検 体中合計２７１検体（９１，６％）が陽性であり、再検査では２７１検体中２６ ９検体（９９，３％）が繰り返し陽性であった。

確認検査によれば、繰り返し陽性であった２６９検体中２６３検体（９７，８％ ）がｐ１６８９と反応し、５検体がｐ１６８９とは反応せず、１検体は確認ポリ ペプチドを用いる検査を行わなかった。ｐ１６８９と反応しなかった５検体中４ 検体がｐ１８６６とのみ反応し、ｐ１６８９と反応しなかった１検体はｐ１６９ ４とのみ反応した。

繰り返し反応性のあった全ての検体がＨＣＶ合成ペプチドを用いるアッセイで反 応性ありと確認された。

表５ 静脈薬使用者サンプル 確認検査　繰り返し陽性と 確認された数 Ｃ１００−３Ｃ１００−３ 最初陽性　繰り返し陽性　ｐ１６８９　ｐ１８６６　ｐ１６９４２、チンパンジ ーサンプル 確認アッセイを使用して、６匹のチンパンジーの９２サンプルを評価した。最初 全てが組換えＣ１００−３と反応した。（これらの検体の性質が稀なものであり 、また他のＨＣＶ抗原を用いる血清学的研究に使用するために、チンパンジー血 清は２度繰り返して検査しなかった）。ｐ１６８９を使用すると、９２検体中８ ３検体（９０，２％）が反応性ありと確認された。ｐ１６９４及びｐ１８６６を 用いて繰り返し検査すると、最初に反応性ありと確認された割合が９６．７％（ ９２検体中８９検体）に向上した。

３、Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ非ＡＩＦ、Ｂ型肝炎ウィルス向上（ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）パネル＃２ＨＣＶ　Ｃ１００−３に対する抗体を含む 検体（１２検体）を包含する純粋及び希釈ヒト血漿からなる向上パネルをＣｈｉ ｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの科学者から入手した。このパネルは、他のア ッセイでの反応性が低いものから高いものまでを包括する検体、非反応性である と推定される“真の陰性”検体、及び希釈すると結果が低レベルになるか又は陰 性になる反応性検体からなる。

Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル非Ａ非Ｂ型肝炎ウ ィルス向上パネル付２た結果は、事前のスクリーニングアッセイで反応性を示し た９検体中９検体（１００％）がｐ１６８９によって確認されることを示してい る。全ての陰性検体は非反応性であった。

４、ＮＡＮＢパネル■での確認検査 感染性ＨＣＶ血清と、陰性血清と、他の疾病対照とからなる、Ｄｒ、Ｈ，Ａｌｔ ｅｒ、ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

ＭＤの血統の明らかな（ｈｉｇｈｌｙ　ｐｅｄｉｇｒｅｅｄ）既往歴の高いヒト 血清のパネルを検査した。総計４４検体がパネルに存在した。

表６に示すように、Ｃ１００−３を用いるアッセイで反応性を示した全ての検体 （１６／１６．１００％）がｐ１６８９によって確認された。更には、全ての血 統の明らかな陰性又は“他の疾病“対照はペプチドアッセイで反応性を示さなか ったので、非特異的反応性はなかった。

示すデータはＨＣＶ抗原に対する抗体の検出での確認アッセイの有効性を証明し ている。このアッセイはＨＣＶ抗原に対する抗体の検出に感受性及び特異性を示 す。

データは更に、合成ペプチドを用いる確認方式の有用性を証明している。合成ペ プチドは、イムノアッセイで使用する独立した抗原源として機能する。危険性の 高い又は血統の明らかな陽性ＨＣＶパネルで繰り返し反応性を示す検体の平均９ ９％を確認できるということはこの方式が有用であることを証明している。

実施例２９組合せアッセイ 組合せアッセイは同一ビーズ上にコーティングされた１種以上のポリペプチド抗 原を使用する。複数のポリペプチドを含むビーズを調製するには、実施例１で記 述したポリスチレンビーズを適切な緩衝溶液中で同時にポリペプチドに接触させ る。ビーズをポリペプチドと接触させた後に、更に前述したように処理する。

Ｃ１００−３及びｐ１６９４を含むポリスチレンビーズの場合、アッセイの感受 性は増す。図３ａに示すグラフのように、実施例１の検出手順を使用するときに 、コーティング溶液にそれぞれ約０．３．０．９５及び３μｇのｐ１６９４を加 えると、シグナルがかなり増す。図３ｂのグラフのデータからは、陰性ヒト血漿 から発生する（非特異的結合に伴い得るような）シグナルの対応的な上昇がない ことが分かる。

実施例３１合成ポリペプチドをベースとするアッセイＨＣＶ抗原のエピトープを 含む合成ポリペプチドを使用して、ＳＯＤ融合ポリペプチドＣ１００−３を用い るＨＣＶ免疫アッセイよりも特異的であり得る、感受性の増した免疫アッセイを 行う。ポリスチレンビーズ上でより短いアミノ酸配列を使用すると、感受性が増 す。

合成ポリペプチドを用いるアッセイでは、組換えＣ１００−３ポリペプチドの場 合と比べて感受性が増すことを系列希釈研究で実証した。系列希釈研究では、組 換えＣ１００−３スクリーニングアツセイを用いてＨＣＶ抗原に対する抗体を有 すると同定された１５サンプルを使用した。第１のアッセイでは組換えＣ１００ −３ポリペプチドを、第２のアッセイではｐ１６８９ポリペプチドを用いて各陽 性サンプルをアッセイした。次いで、Ｓ／Ｃｏ値が１未満になるまでサンプルを ２倍に希釈した。１２サンプルではｐ１６８９ポリペプチドが全ての希釈度で感 受性を増しくＳ／Ｃｏ値がより大きくなり）、２サンプルではｐ１６８９ポリペ プチドと組換え酵母Ｃ１００−３ポリペプチドとがほとんど同等であった。１サ ンプルではｐ１６８９ポリペプチドが全ての希釈度で陽性サンプルに対して陰性 反応を示す。

急性ＨＣＶ感染の回復症例を示す３匹のチンパンジーと、慢性ＨＣＶ感染を示す ３匹のチンパンジーとの連続採血からのサンプルに関する他の研究で、免疫反応 に相違があることが判明した。この差は感染の型及びアッセイで使用するポリペ プチドによるものと考えられる。この研究では、ＨＣＶを接種した６匹のチンパ ンジーの連続採血からの血清をアッセイした。アッセイプロトコルは実施例１に 記述したプロトコルと同様であったが、以下の点が異なる。

西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングされたヒトＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇ Ａに対する親和性精製ヤギ抗体を０．２．ｃｚｇ／ｍｌ抗ＩｇＧ、０．５μｇ／ ｍｌ抗ＩｇＭ及び０．２μｇ／ｍｌ抗ＩｇＡの処理濃度で使用して、抗体ＩｇＧ 、ＩｇＭ及びＩｇＡを検出した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌ ａｎｄ）。各アッセイの血清希釈度は、ＩｇＧで１＝４１、ＩｇＭで１　：　１ ０１、ＩｇＡで１：４１であった。

この研究で使用したポリペプチドはＣ１００−２、ｐ１６９４、ｐ１６８９及び ｐ１８６６である。

簡潔に言えば、ポリペプチドを含むビーズを希釈血清と共に４０℃で１時間イン キユベートシ、次いでビーズを洗浄し、適切なりギ抗体と共に４０℃で１時間イ ンキュベートした。ビーズを再度洗浄し、ビーズをＯＰＤと共に室温で３０分間 インキュベートすることによってアッセイを発色現像した。発色現像をＩＮ硫酸 で終了し、結果を４９２ｎｍで読取った。

全てのチンパンジーは、７〜１７の接種後ウェル（ＷＰＩ）内で０１００−３、 ｐ１６８４及びｐ１８６６によって検出される抗体を産生じた。各チンパンジー 内では、Ｃ１００−３、ｐ１６８４及びｐ１８６６と反応するＩｇＧ抗体がほぼ 同時に出現した。ｐ１６９４及びｐ１８６６に対する反応はこの期間内に変動し 、このことは、これら２種のペプチドに対する抗体がＨＣＶ感染後に検出不能で あるか又はかなり遅れて検出されることを示している。これらのデータは、検査 した５種のペプチドの中で、０１００−３、ｐ１６８４又はｐ１６８９に対する 抗体がＨＣＶ感染を最も早く示す、最も一貫した血清学的指標であることを示唆 している。

ＩｇＭ抗体は、検査した６匹のチンパンジーのうち３匹だけで検出された。３匹 の動物の各々のＣ１００−３、ｐ１６８４、ｐ１６８９及びｐ１６９４に対する 反応を７〜１０のＷＰＩで検出したが、ｐ１８６６に対するＩｇＭ抗体は２匹の チンパンジーで検出されず、残りの１匹は遅れて検出した。全てのＩｇＭ反応は 短命で、そのレベルは２週間から２２週間以内に陽性以下に下がった（Ｓ／Ｎは ３゜０未満）。

急性疾病から回復した３匹のチンパンジーでＩｇＭ抗体が確認されたが、慢性感 染の３匹のチンパンジーでＩｇＭ抗体が検出されなかったことは予想外である。

予備実験の結果によれば、好ましいＩｇＭ結合によって偽陰性１ｇＭ結果が出る ことはありそうもない。５種のペプチドを用いてこれら６匹のチンパンジーで観 察されたパターンが真実であれば、抗体アッセイは重要なＨＣＶ予後情報を提供 する。

６匹のチンパンジーのうち２匹だけで陽性ＩｇＡ反応（Ｓ／Ｎは３．０以上）が 検出され、反応が２段階であるか又はＩｇＧ又はＩｇＭ反応よりもかなり遅いこ とが証明された。これら２匹のチンパンジーは慢性疾患であったが、３匹の回復 したチンパンジーの血清は３０〜４０ＷＰ　Ｉでのみ利用可能なので、ＩｇＡ抗 体の重要性に関する結論を出すことはできない。

ポリペプチドは、ＨＣＶ抗原に対する抗体をアッセイするために使用すると、Ｈ ＣＶ感染の進行をフォローするのに有用であり、またポリペプチドは、ＨＣＶ感 染の臨床学的進行中に産生ずる種々の抗体に対して予期しない感受性を示すこと が結果から分かる。

実施例４．イムノドツトアッセイ イムノドツトアッセイ系は、ニトロセルロース固相担体上のアレーに置かれた精 製合成ポリペプチドのパネルを使用する。調製した固相担体をサンプルと接触さ せ、ＨＣＶ抗原に対する特異抗体を捕捉する。捕捉した抗体を結合体特異反応に よって検出する。１９８８年８月２日付は米国特許出願第０７／２２７．４０８ 号に記載の機器内で反射率光学素子アセンブリを用いて結合体特異反応を定量す ることが好ましい。関連する米国特許出願第０７／２２７゜２７２号、米国特許 出願第０７／２２７，５８６号及び米国特許出願第０７／２２７．５９０号は更 に、イムノドツトアッセイを実施するのに有用な特定の方法及び装置を開示して いる。簡潔に言えば、前記イムノドツトアッセイを実施するために自動化プロセ スで使用され得るニトロセルロースをベースとするテストカートリッジを図４に 示す。

各ポリペプチドはテストカートリッジ上の特異反応区域内に含まれる。全ての抗 原性ポリペプチドをニトロセルロース上に配した後に、ニトロセルロース上の過 剰結合部位を阻止する。次いで、サンプルが適切な抗体を含んでいれば、各反応 区域内の抗原性ポリペプチドが反応するようにテストカートリッジを試験サンプ ルと接触させる。反応後、テストカートリッジを洗浄し、良く知られた適切な試 薬を用いて任意の抗原抗体反応を同定する。

前述の特許出願に記載の如く、プロセス全体を自動化することが可能である。先 に引用したイムノドツトアッセイを実施するための方法及び装置に関するこれら の出願明細書は、参照によって本明細書の一部を構成するものとする。

好ましいイムノドツトアッセイでは、合成ポリペプチドｐ１２２３、ｐ１６８４ 、ｐ１６８９、ｐ１８６６を緩衝水溶液（ポリペプチド希釈剤：０．０３％トリ トンＸ−１００及び０．１％アジ化ナトリウムの５０ｍＭへベス緩衝液、ｐＨ７ ，６）中で希釈し、各反応区域で約４Ｑｎｇを、予め組み立てたニトロセルロー ステストカートリッジに適用した。カートリッジを室温で一晩乾燥した後に、ニ トロセルロース相の非特異的結合能力を阻止した。ブロッキング溶液は１％ブタ ゼラチンと、１％カゼイン酵素氷解物と、５％トウィーンー２０と、０．１％ア ジ化ナトリウムと、０．５Ｍ塩化ナトリウムと、２０ｍＭｈリスｐＨ７，５とか らなっていた。

テストカートリッジをサンプル００６４２．４２３（表１参照）及びＡＬＴ２７ と共にインキュベートした。サンプルＡＬＴ２７は、アラニンアミノトランスフ ェラーゼのレベルが高い有志ドナーから入手した。サンプルをインキュベートし た後に、ビオチン結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン特異抗体、アルカリ性ホスファ ターゼ結合つサギ抗ビオチン特異抗体及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インド リルホスフェートで続けてインキュベートして、反応部位で着色産物を得た。

検出可能な反応は、アレー上の抗原部位に肉眼で識別できる物質が生成されるこ とによって規定される。機器で定量すると、バックグラウンド上方で（ａｂｏｖ ｅ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）約０．０１５０以上の反射率密度値（Ｄｒ）が得ら れる。

被試験ポリペプチドのいずれも、組換えＣ１００−３ポリペプチドを用いてＨＣ Ｖ抗原に対する抗体に対して予め陰性であることが証明された陰性対照血清との 検出可能な反応を引出さなかった。

調製した試験細胞をサンプル００６４２　（陰性血清が１：１００で希釈）又は サンプル４２３（陰性血清が１＝４０で希釈）と共にインキュベートすると、合 成ポリペプチドｐ１６８４、ｐ１６８９、ｐ１６９４、ｐ１８６６の各々との反 応が生起した。ポリペプチドｐ１６８４、ｐ１６８９、ｐ１６９４及びｐ１８６ ６の他に、ポリペプチドｐ１２２３がＡＬＴ２７の多い検体とかなり反応した。

全ての検体でｐ１６８９との反応性が最も高かった。抗原希釈を微妙に変えると 、ポリペプチドｐ１６８４とサンプル００６４２との反応性が高まった（改変し たポリペプチド希釈剤は０．５Ｍ塩化ナトリウムと、０．００２２％トリトンｘ −ｉｏｏと、０．１Ｍトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８，５とからなっていた）。

陽性反応又は陰性反応を示すポリペプチドｐ１２２３、ｐ１６８４、ｐ１６８９ 、ｐ１６９４及びｐ１８６６を含むテストカートリッジの正味（ｎｅｔ）反射率 （Ｄｒ）を表７に示す。

表７ 正味反射率密度（説明＊） サンプル　ｐ１２２３　ｐ１６Ｂ４　ρ１６８９　ρ１６９４　ｐ１８６６・Ｄ ｒ／Ｂｋｇ　＜　２．５ ＋　２．５　＜　Ｄｒ／Ｂｋｇ　＜　１００←１００　＜　ＤｒｆＢｋＱ　＜　 １００→Ｄｒ／Ｂｋｇ　＞　１０００ 実施例５．競合アッセイ 抗原性ＨＣＶエピトープを含む合成ポリペプチドは競合アッセイにおいて有用で ある。中和アッセイを行うには、Ｃ１００−３領域にあるエピトープを表わすペ プチド（例えばｐ１６９４、ｐ１６８４又はｐ１６８９）が３４であり、最終濃 度が０．５−５０μｇ　／　ｍ　］になるように検体希釈剤と混合する。検体又 は希釈検体１０μｌを反応ウェルに加え、ペプチドを含む検体希釈剤４００μｌ を加えて、所望とあれば混合物を約１５分から２時間ブレインキュベートしても よい。次いでＨＣＶのＣ１００−３抗原でコーティングしたビーズを反応ウェル に加えて、４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、結合体希釈剤中のペル オキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　２００μｌを添加して、４０℃で１時間イ ンキュベートする。洗浄後、ＯＰＤ基質を加えて、室温で３０分間インキュベー トする。ＩＮの硫酸を添加して反応を停止させ、吸光度を４９２ｎｍで読み取る 。

Ｃ１００−３抗原に対する抗体を含んだサンプルは、溶液中にあるこれら抗体に 対するペプチドの競合的結合によってシグナルの低下を起こす。競合結合率％は 、合成ペプチドの存在下でのサンプルの吸光度値と、合成ペプチドなしでアッセ イしたサンプルの吸光度値とを同一希釈度で比較して計算してもよい。

実施例５．ＥＩＡアッセイ 実施例１に記載の方法に従って、ビーズをペプチド３８０−４３６と、４４７− ４８３．６４３−６８６又は２３０２−２３５３とでコーティングした。但し、 ペプチド３８０−４３６及び４４７−４８３は同一の固相担体上で同時にコーテ ィングした。いずれの配列もＨＣＶの推定上のエンベロープ領域に由来するもの である。この型のアッセイでは一方のペプチドだけが活性を示した。本明細書に 記載の各ビーズ配置を用いてＥＩＡを実施した。ＥＩＡ法を実施例１に記載の如 〈実施し、カットオフは陰性対照値の４倍に設定した。慢性ＮＡＮＢＨと診断さ れた患者の血清検体で行ったこれらのアッセイで得られたデータを表９に示す。

表９ 抗原 陽性＃／被試験数 ｐ３８０　ｐ６４３ｂ　ｐ２３０２ （４２％）（３８％）（６２％） 実施例７．ｐ３８０．ＬＧ及びｐ３８０を使用するＥＩＡビーズを実施例１に従 ってｐ３８０．ＬＧ又はｐ３８０でコーティングした。実施例１の手順に基づ＜ ＥＩＡを用いて、サンプルをアッセイした。表１０に示すデータで分かるように 、ｐ３８０．ｔ、ｃペプチドは、ｐ３８０に対して陰性の検体中で抗体を検出し た。ＨＣＶ配列は領域３８０−４３６ａ、ａ、で変異性が大きい。従って恐らく 、これらのエンベロープ領域ペプチド配列の一方とヒト検体との反応性に基づ＜ ＨＣＶ“血清型“間の分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が可能であろう 。表１０のデータは、ｐ　３８０゜ＬＧが、ｐ３８０に対して陰性の慢性ＨＣＶ 感染患者を検出できることを示唆している。

表１０ サンプル　ＯＤＳ／Ｎ０ＤＳ／Ｎ ＃８　．１５５　２．１２　．３９９　５．８７＃２８　．２４６　３．３７　 ．９５０　１３．９７＃２３　．１１４　１．５６　．４５８　６．７４実施例 ８．１）２３０２を使用するＥＩＡ実施例１の方法に従って、ビーズをｐ２３０ ２又は組換えＨＣＶ抗原でコーティングした。組換え抗原でコーティングしたビ ーズは、ＨＣＶゲノムのＮＳ３　（ＣＫＳ−３３Ｃ）、ＮＳ４　（Ｃ−１００） 及びＣｏ　ｒ　ｅ　（ＣＫＳ−ＣＯＲＥ）領域由来の抗原を含んでいた。ＨＣＶ ２．０の抗原ではな（、ｐ２３０２への血清転換を示した患者サンプルを図５に 示す。従って、このペプチドはＨＣＶ感染患者を検出する能力を向上させる。

実施例９．ＰＥＰＳＣＡＮプロトコル ａ、ａ、６００−７２０由来のＨＣＶゲノム１７）ＮＳＩ領域をＰＥＰＳＣＡＮ 分析でマツピングした。この分析は、免疫原性領域を同定するためのタンパク質 配列に及ぶ一連の重複ペプチドの血清学的分析である。製造業者の指示（Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｖａｌｌｅｙ　Ｓ ｔｒｅａｍ、ＮＹ）ｉ二従って、ポリプロピレンピン上で合計１０６個の重複す るヘキサマーペプチドを合成した。これらのペプチドを用いて、ＨＣＶに対して 血清反応陽性の個体の血清から精製したＩｇＧのＦａｂダイマーを検査した。（ 製造業者が記載する指示に従って実施した）ＥＩＡの反応性に基づいて、表１１ に示すように４つのペプチド配列を選択した。

表１１ ＰＥＰＳＣＡＮ分析に基づ（ＨＣＶゲノム（Ａ、Ａ、６００−７２０）のＮＳＩ 領域から選択したペプチドのアミノ酸配列 ＨＣＶゲノムのＡ、＾１番号　ペプチド配列６９１−７１４　８ＬＨＯＮＩＶＤ ＶＱＹＬＹＧＶＧＳＳＩＡＳＷＡＩカルボキシ末端残基を初めとして、これらの ペプチドの各々を段階的固相合成で合成した。ＨＣＶのＣ−１００りンパク質に 対する抗体に対して血清反応陽性のパネルで、抗体とＮＳペプチドとの反応性を 以下に記載するようにマイクロタイターＥＩＡで検査した。

ＥＩＡプロトコル １０Ｍｇ／ｍｌのペプチドを含む０．０２Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）１０ ０μｍで、マイクロタイタープレートのウェルを室温で１２〜１６時間かけてコ ーティングした。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に０．０１％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）と０．０５％トウィーンー２０（登録商標）（カルフォルニア州す ッチモンドのＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手可）とを加えた もので洗浄した後に、遊離した部位を１％ＢＳＡの重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５ ）でオーバーコーテイングした。プレートを４℃で貯蔵し、次いで最後に洗浄し た。

ＨＣＶ　Ｃ−１００に対する抗体に対して血清反応陽性の個体由来の血清を、２ ０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７゜４）と、０．１５Ｍ　ＮａＣｌと、２０％正 常ヤギ血清と、１０％ウシ胎児血清と、５ｍＭ　ＥＤＴＡと、１０ｍＭＥＧＴＡ と、５０ｍＭトリスと、０．２％トウィーンー２０と、保存料としてのアジ化ナ トリウム（ｐＨ６，８）とからなる緩衝液１００μｌで系列希釈した。希釈した 血清を、マイクロタイターウェルのペプチドと３７℃で３時間又は室温で一晩反 応させた。プレートを洗浄し、適切に希釈したヤギ抗マウス（ＨＨ）西洋ワサビ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　Ｏ）結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ）１００μｍを加えた。プレー トを３７℃で２時間インキュベートした。最後に洗浄した後に、Ｏ−フェニレン ジアミン２ＨＣ１（ＯＰＤ）着色試薬１００μｌを加えた。暗所にて室温で２０ 〜２５分間反応させ、Ｉ　Ｎ　Ｈ２Ｓ　ＯＪ’　１００μｌを加えて反応を停止 させた。反応混合物の吸光度を４９２ｎｍで記録した。ＨＣＶ感染について陰性 であることが予め確認された陰性対照を含め、各プレートは３組にした。希釈度 が１　：　２０００のサンプルの吸光度が同一希釈度の陰性対照の吸光度の３倍 ならば、サンプルは反応性を示すとみなした。これらのサンプルと各ペプチドと の反応性を表１２に示す。

表１２の記号の意味は以下の通りである：十＝Ａ　４９２が陰性対照の３倍を示 すサンプル十＋＝１　：　５０００希釈度まで力価が測定されたサンプル＋＋＋ ＝１　：　１０．０００希釈度まで力価が測定されたサンプルと強い反応性を示 す 表１２ マイクロタイターＥＩＡによるＨＣＶ血清反応陽性のサンプルとＮＳＩペプチド との反応性検査 ＮＳＩ領域から選択したペプチド（Ａ、＾０番号）サンプルＩＤ本　６０７−６ ２７　６４３−６６３　６６６−６８３　６９１−７１４３０１０６０　→　← →　＋ ＰＢ３１７８　→　十　＋　＋ ＰＢ３１８０　←＋　＋＋＋　＋＋ ＊全てのサンプルは、ＥＩＡ及びウェスタンプロット分析によってＣ型肝炎ウィ ルスに対する抗体の存在を示した。

実施例１０．Ｅ２／ＮＳＩの５゛末端の合成ペプチドＨＣＶのＥ２／ＮＳＩ推定 構造領域の５゛末端は、世界中で研究されている多数のウィルス単離物の中では 核酸含量及びアミノ酸含量に関して超可変性であることが判明した。この領域は 宿主免疫監視機構を破壊（ｄｅｆｅａｔ）するためにウィルス機構に含まれてい ると考えられるが、証明はされていない。この領域が体液免疫選択的圧力下で突 然変異しなければならないならば、ウィルスの遺伝子型変異に対する特異抗体反 応がＨＣＶ感染患者で検出できねばならない。我々は、この超可変領域内に多数 のエピトープが存在することを実証し、かくして、フラビウィルス及びペスチウ ィルスでは、このＥ２／ＮＳＩ領域が宿主の免疫系及び抗原の異なる変異体に対 する以後の選択的圧力にさらされるという仮定を裏付けた。

４つの異なるＨＣＶ単離物の配列に基づいて合成ペプチドを調製した。ペプチド は、ＨＣＶの広い読み取り枠のアミノ酸３８０からアミノ酸４３６までの配列を 示した。アミノ酸４０８−４３６によってコードされるより小さいペプチドも合 成した。配列はＨＣＶ−１（Ｃｈ　ｉ　ｒｏｎ原型）、ＨＣＶ　Ｇ８３　（ｐ３ ８０．ＬＧ）　、ＨＣＶ−ＪＨ−１及びＨＣＶ−Ｊから得た。ペプチドＨＣＶ− ＪＨ−１は、記載されているものであり、ペプチドＨＣＶ−ＪはＮ、　Ｋｒ、　 １９９０）に記載されているものであった。これらのペプチドは各々同一のゲノ ム領域によってコードされるが、５７アミノ酸の長さのアミノ酸配列を基準に最 低限２５％（２５〜３５％の範囲）が互いに異なっている。この領域では同一の ＨＣＶ−ＪＨ−１及びＨＣＶ−Ｊの配列に基づいてペプチド４０８−４３６を調 製した。これらのペプチドの各々を、表４に示すコーティング条件下で固相上に コーティングし、先に説明したエンザイムイムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）に関す る方法に基づいて、別々のＥＩＡの抗原ターゲットとして使用した。正常血漿ド ナーの母集団を検査して個々のＥＩＡの特異性を実証した。全ての分析では、陰 性対照サンプルの４倍のカットオフ値を使用した。

米国及びイタリアの慢性ＨＣＶ患者、米国及びイタリアの急性期ＨＣＶ患者、並 びに米国及び日本のＨＣＶ抗体陽性血漿ドナーからなる母集団を検査した。

表４ へ１チド　コーティング　コーティング緩ｉｉ波　コーティング溶液φの濃度μ ｇ／ｍｌ　Ｉｋの成分 １−７５　２．０　０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５０，４ＭＮａＣ１， ，００２２％）リドンＸ−１００３５−７５２，００，１Ｍリン酸ナトリウム、 Ｉ）１１６．５　０．４ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００９９−１ ２６２，００，１１１リン酸ナトリウム、ｐＨ６，５０，４ＭＮａＣ１，，００ ２２％トリトンＸ−１００１９５−２６２２，００，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６，５０，４ＭＮａＣ１，，００２２％）リドンＸ−１００２３０−２６２２ ，００，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５０，４１１ＮａＣ１，，００２２％ トリトンＸ−１００１３５７−１４０７２，００，ＩＭ硼１．ｐＨ９，００，４ ＭＮａＣ１，，００２２％）リド：／Ｘ−１００１４１８−１４５７２，００， ＩＭ硼１．ｐＨ９，００，４ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００１５ ６５−１５９３３，００，ＩＭ）リス／ＭＣＩ、ｐＨ８，５０，５ＭＮａＣ１， ，００２２％トリトンＸ−１００１８９９−１９３０２，００，ＩＭ）リス／ｌ ｌＣｌ、ｐＨ８，５０，５ＭＮａＣ１，，００２２％）リドンＸ−１００１１９ ２−１２４０２゜０　０．ＩＭＩｌ、ｐＨ９，００，４ＭＮａＣ１，，００２２ ％）リドンＸ−１００１２２３−１２４０５，００，ＩＭＩｌ、ｐＨ９，００， ４ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００１６８４−１７５０１，００， ＩＭＩｌ、ｐＨ１０，００，４ＭＮａＣ１，，００２２％）リドンＸ−１００１ ６８９−１８０５１，００，ＩＭｍｌ、ｐＨ１０，００，４ＭＮａＣ１，，００ ２２％）リドンＸ−１００１６９４−１７３５３，００，ＩＭ）リス／ＨＣＩ、 ｐＨ８，５０，５ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００１８６６−１９ ３００，７５０，ＩＭＦリス／ＨＣＩ、ｐＨ８，５０，５ＭＮａＣ１，，００２ ２％トリトンＸ−１００３８０−４３６３，００，ＩＭ）リス／ＨＣＩ、ｐＨ８ ，５０，９ＭＮａＣ１４４７−４８３３，０ ６４３−６８３３，００，ＩＭ）リス／ＨＣＩ、ｐＨ８，５０，５ＭＮａＣ１， ，００２２％トリトンＸ−１００２３０２−２３５２３，００，ＩＭＩｌｌ　０ ．４ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００ｐ３８０ＪＨ１５，００，Ｉ Ｍｌｌｍ、ｐＨ１０，００，４ＭＮａＣ１，，００２２％トリトンＸ−１００ｐ ３８０Ｊ　５．０　０．ＩＭＩｌ塩、ｐＨ１０，００，４ＭＮａＣ１，，００２ ２％トリトンＸ−１００ｐ４０８Ｊ　５．０　０．ＩＭＩＩｌ、ｐＨ１０，００ ，４ＭＮａＣ１慢性患者及び血漿ドナーに関する研究データを表１３に示す。慢 性ＨＣＶ患者では４種の異なる合成ペプチドの各々に対して抗体を検出した。米 国の患者の中で最もよく認識された血清型はＨＣＶ−１（４３，５％）であり、 ＨＣＶ−Ｊが最も反応性が低かった（１２゜９％）。しかしながら、イタリアの 患者の中では、ＨＣＶ−Ｇ８３が最も優性な血清型であり（５２，０％）　、Ｈ ＣＶ−１（１２，０％）がこれらの患者で最も少なかった。他のＨＣＶ抗体に対 して陽性を示す米国血漿ドナーの中で最もよく認識された型はＨＣＶ−１であっ た。反対に、ＨＣＶ−１型は日本のドナーの中で最も認識されなかった型である 。ＨＣＶ　−Ｇ８３型は日本のドナーで最もよく認識され、米国のドナーのＨＣ Ｖ　−１とほぼ同様の反応性を示した。

数人のＨＣＶ感染患者の急性期で、これらの血清型の少なくとも一つへの血清転 換が観察された。ある血清型に対する抗体シグナルの損失及び第２の血清型への 併発（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）血清転換が１人の患者で観察された。

米国の血漿ドナーのグループの中には、使用する４つ全ての型のペプチドに対し て検出可能な抗体を有する検体が３つあった。このことは、３８０−４３６領域 内に少なくとも１つの保持されたエピトープが存在することを示唆している。こ の領域の後半部分（ａ、ａ、４０８−４３６）内の配列は４つのウィルス単離物 の中により保持されているので、このペプチドは、この領域では同一のＨＣＶ− ＪＨ−１配列及びＨＣＶ　−Ｊ配列に基づいて調製された。これら３つ全ての検 体は更に、このようにより小さく、より保持された領域と反応を示した。このこ とはこれらの境界内に保持されたエピトープが存在することを示していた。

表１３ ＨＣＶ血清型分析 母集団　ＨＣＶ−Ｉ　Ｇ８３　ＪＨ−Ｉ　Ｊ　合計米国慢性　２９／６２　２０ ／６２　１７／６２　ｇ／６２　３６／６２Ｎ＝６２　（４３，５％）　（３２ ，３％’Ｉ　（２７，４％）　（１２，９）　（５８，１％）１つに反応　１／ ３６　３／３６　４／３６　０／３６　８／３６（２，８％）　（８，３％）　 （１１，１％）　（２２，２％）イタリア慢性　６１５０　２６１５０　１９１ ５０　８／４７本　３４／６ＯＮ＝５０　（１２，０％）　（５２，０％）　（ ３８，０％’）　（１７，０％＞　（６８，０％）１つに反応　１／３４　１１ ／３４　６／３４　１／３０本　１９／３４（２，９％）　（３２，４％）　（ １７，７％）（３，３％）　（５８，８％）米国ＨＣ■陽性 血漿ドナー　１６１５５　１２１５５　１０１５５　５／４８＊　２２１５５Ｎ ＝５５　（２９，１％）　（２１，８％）　（１８，２％）　（１０，４％’） 　（４０，０％）１つに反応　６／２２　５／２２　１／２２　０／１”１本　 １２／２２（２７，３％）　（２２，７％）　（４，６％）（５４，６％）日本 ＨＣｖ陽性 血漿ドナー　１／２７　１３／２７　９／２７　４／２７　１８／２７Ｎ−２７ （３，７％＞　（４８，２％＞　（３３，３％）　（１４，８％＞　（６８，７ ％）１つに反応　０／１８　５／１８　２／１８　３／１８　１０／１８（２７ ，６％＞　（１１，１％）　（１６，７％）　（５５，６％）我々のデータはこ のように、ＨＣＶ　Ｅ２／ＮＳＩの超可変額域内に少な（とも２つのエピトープ が存在することを示している。結論としては、この領域内で遺伝子型が変異する と、抗原の異なるＨＣＶ変異体が生じる。世界の様々な地域の急性期及び慢性期 のＨＣＶ感染患者、並びに血漿ドナーで単一のＥ２／ＮＳＩ抗体反応を認めるこ とができる。我々の予備データは更に、ＨＣＶに対する抗体反応に関しては地理 的な変動があり得ることを指摘している。

米国及びイタリアの慢性患者のそれぞれ５８％及び６８％が、４つのＨＣＶ単離 物のみに由来する配列を使用するこの領域に反応を示すことを検出したので、慢 性ＨＣＶに感染した多数の患者はＥ２／ＮＳＩの超可変領域に対する抗体を有す ることになろう。ウィルスを中和するエピトープがこの超可変額域内に存在する ならば、ＨＣＶワクチン開発の意味は重要である。

これらのペプチドを独自のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の開発に 使用しても良い。本発明並びに米国特許出願第０７／４り６，１６２号及び米国 特許出願第０７／６１０，１８０号（いずれの特許出願も予め参照によって本明 細書の一部を構成するものとした）のポリペプチドを、ＨＣＶの種々のエピトー プの検出のための独自のアッセイを開発するために組合わせて使用することがで きる。例えば、固体表面を１つ以上のペプチドでコーティングして、又はＨＣＶ に対する２種以上のポリペプチドを単にブレンドしたものからなる固相担体の混 合物を使用してポリペプチドをこのように組み合わせることができる。これらの 技術は当業者には公知である。本明細書に記載の如き本発明の特定例の用途及び 変形の他の態様は当業者には自明である。従って、本発明は以下の請求の範囲に よってのみ限定されるものとする。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出１１人：　ＬＥＳＮＩＥＷＳＫｌ、ＲＩＣＨＡＲＤ　Ｒ。

ＬＥＵＮＧ、　ＴＡＴ　Ｋ。

（ｉｉ）発明の名称二Ｃ型肝炎アッセイ（ｉｉｉ）配列の長さ＝２７ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）宛テ名：ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　ＣＨＡＤ３７７／Ａ Ｐ６Ｄ（Ｂ）通す：ＯＮＥ　ＡＢＢＯＴＴ　ＰＡＲＫ　ＲＯＡＤ（Ｃ）市：ＡＢ ＢＯＴＴ　ＰＡＲＫ （Ｄ）州：ＩＬＬＩＮＯＩＳ （Ｅ）国：Ｕ、Ｓ、＾。

（Ｆ）郵便番号：６００６４−３５００（Ｖ）コンピューターの読取り可能形態 ：（＾）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター＋ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）オヘレーティンクシス テム：Ｐｃ−Ｄｏｓ／ＭＳ−Ｄｏｓ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒ ｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜バージョン＄１．２５ （ｖｉ）現出願データ： （＾）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ＰＯＲＥＭＢＳＫＩＰ、　ＰＲＩＳＣＩＬＬＡ　Ｅ。

（Ｂ）登録番号：３３，２０７ （Ｃ）参照／事件整理番号：　４７６７、　Ｐ３．０３（ｉｘ）電気通信情報： （＾）電話：　７０８−９３７−６３６５（Ｂ）テレファックス：　７０８−９ ３７−９５５６（２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さニア５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号１の配列： Ｈａ！　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ＾ｓｎ　Ｔｂｒ　ＡｓｎＩ　Ｓ　’　１０　１ ５ （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　４１個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （ｉｉ）分子の型ペプチド （ｘｉ）配列番号２の配列 （２）配列番号３の情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ　２８個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）分子の型ペプチド （ｘｌ）配列番号３の配列。

Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ｋｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌ＊　 Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ（２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ・６８個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （１１）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号４の配列： Ｓ＠ｒ　工１＠　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 工１＠　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ（２）配列番号５の 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・３３個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号５の配列・ ｘｌ・ （２）配列番号６の情報 （り配列の特徴 （Ａ）長さ　４９個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （ｘｌ）配列番号６の配列： ２０　２５　３Ｇ （ｉ）配列の特徴− （ｘｉ）配列番号７の配列。

（２）配列番号８の情報： （１）配列の特徴 （ｘｉ）配列番号８の配列・ （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝３９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （ｉｉ）分子の型ペプチド （Ｘｌ）配列番号９の配列： （２）配列番号１０の情報。

（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２５個のアミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （１１）分子の型ペプチド （ｘｉ）配列番号１０の配列： Ａｊｐ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｐｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　’ｒｈｒ　Ｌｙｓ　 Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　！＋ｕ　Ｐｒ。

ｌ　Ｓ　１０　１５ （２）配列番号１１の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ二６７個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数６一本重 鎖Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）分子の型、ペプチド （ｘｉ）配列番号１１の配列： （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、１１７個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （１１）分子の型ペプチド （ｘｉ）配列番号１２の配列 ｃｌｙ　Ｍａｔ　Ｍｅセ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｇｌｕ　にｉｎ　Ｐｈｓ　Ｌｙｅ　 Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌ＋ｕ（２）配列番号１３ の情報 （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ２４２個のアミノ酸 （Ｂ）型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （ｘｌ）配列番号１３の配列・ （２）配列番号１４の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、６５個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）分子の型、ペプチド （ｘｉ）配列番号１４の配列： Ｐｈｓ　Ｌｙｓ　工ｉｓ　Ｍｅｔ　５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ｓａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ａｊ■ （２）配列番号１５の情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ　３２個のアミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号１５の配列： （２）配列番号１６の情報。

（１）配列の特徴 （Ａ）長さ　５７個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の型ペプチド （Ｘｌ）配列番号１６の配列 （２）配列番号１７の情報・ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝５７個のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （１１）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号１７の配列。

（２）配列番号１８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列番号１８の配列・ （２）配列番号１９の情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２１個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−重鎖 （Ｘｌ）配列番号１９の配列 入ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＊　Ｐｈａ（２）配列番号２ｏの情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｘｌ）配列番号２０の配列。

（２）配列番号２１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ４１個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （ｘｉ）配列番号２１の配列： （２）配列番号２２の情報・ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　１９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）分子の型・ペプチド （ｘｌ）配列番号２２の配列。

Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｔａｒ （２）配列番号２３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２４個のアミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型・ペプチド （ｘｉ）配列番号２３の配列： （２）配列番号２４の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ、５１個のアミノ酸 （Ｂ）型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ペプチド （ｘｌ）配列番号２４の配列 社ｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ （２）配列番号２５の情報。

（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、５７個のアミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃン鎖の数−重鎖 （Ｄ）トポロジー直鎖状 （１１）分子の型ペプチド （ｘｌ）配列番号２５の配列： Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｊｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇνａｌ　’７’ｈｒ 　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＨＬｓ　Ｖａ■ ｌ　５　１０　１５ （２）配列番号２６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・５７個のアミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の型ペプチド （ｘｌ）配列番号２６の配列。

Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　）ｌｉＩＩ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｃ１ｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　r＠ｒ ｌ　Ｓ　、１０　’　１５ （２）配列番号２７の情報・ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （Ｘｌ）配列番号２７の配列・ Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ｇｉｎ　Ｌ＊ｕ　Ｖａｌ　Ａｍｎ　笥ｒ　Ａ ｊｎ　Ｏｌｙ　Ｓａｔ　Ｔｒｐ　）ｌｉｓ　Ｚ１＊　ｋｍｎｌ　Ｓ　１０　１５ 特表千６−５１０８６１（２４） μｇ　７ｍ１ ＦＩＧ、３ａ ＦＩＧ、３ｂ ＦＩＧ、４ Ｎ５−５　Ｓ／Ｎ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定 するためのアッセイであって、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適 した条件下で、ｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。 ＬＧ及びｐ４０８からなる群の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少な くとも１つ含むポリペプチドをサンプルと接触させ、抗体−ポリペプチド複合体 を慢性ＨＣＶ感染の指標として検出することからなるアッセイ。
2. ２．ポリペプチドを固相担体に結合する請求項１に記載のアッセイ。
3. ３．液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在のため の組合せアッセイであって、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適し た条件下で、ｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。 ＬＧ及びｐ４０８からなる群の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少な くとも１つ含む少なくとも１種のポリペプチドを結合した固相担体をサンプルと 接触させ、抗体−ポリペプチド複合体を慢性ＨＣＶ感染の指標として検出するこ とからなる組合せアッセイ。
4. ４．固相担体がポリスチレンビーズである請求項３に記載のアッセイ。
5. ５．液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定 するための確認アッセイであって、サンプルを使用して第１及び第２のアリコー トを作成し、第１のアリコートは、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するの に適した条件下で、ｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。ＬＧ及びｐ ４０８からなる群の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少なくとも１つ 含む第１のポリペプチドと接触させて、第１の抗体−抗原複合体を検出し、 第２のアリコートは、第２の抗体−抗原複合体を形成するのに適した条件下で、 ｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。ＬＧ及びｐ４０８からなる群の 中から選択され、第１のポリペプチドとは異なる第２のポリペプチドと接触させ て、第２の抗体−抗原複合体を検出することからなる確認アッセイ。
6. ６．抗原を固相担体に結合する請求項５に記載のアッセイ。
7. ７．前記固相担体がポリスチレンビーズである請求項６に記載のアッセイ。
8. ８．液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定 するためのイムノドットアッセイであって、 抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で、ｐ３８０−ＪＨ １、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。ＬＧ及びｐ−４０８からなる群の中から選択さ れ、各々がＨＣＶ抗原の明瞭なエピトープを含み、固相担体上にコーティングさ れた少なくとも２種のポリペプチドを同時にサンプルと接触させ、 複合体を発色剤と反応させて抗体−ポリペプチドを検出することからなるイムノ ドットアッセイ。
9. ９．液体サンプル中においてＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定 するための競合アッセイであって、サンプルを使用して第１及び第２の免疫学的 に同一のアリコートを作成し、 試験サンプルの第１のアリコートは、抗体と結合して検出可能な抗体−ポリペプ チド複合体を形成するのに適した条件下で、ＨＣＶ抗原のエピトープを少なくと も１つ含むポリペプチドでコーティングされた固相担体と接触させ、第２のアリ コートは未結合ポリペプチドと接触させ、次いでｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０− Ｊ、ｐ−３８０。ＬＧ及びｐ４０８からなる群の中から選択される少なくとも１ 種のポリペプチドでコーティングされた固相担体と接触させて、 結合又は未結合ポリペプチドの存在を検出することからなる競合アッセイ。
10. １０．ｐ３８０−ＪＨ１、ｐ３８０−Ｊ、ｐ−３８０。 ＬＧ及びｐ４０８からなる群の中から選択され、ＨＣＶ抗原のエピトープを少な くとも１つ含むポリペプチドと、１つ以上のサンプル調製試薬と、 １つ以上の検出／シグナル生成試薬 とからなるイムノアッセイキット。
11. １１．ポリペプチドを固相担体上にコーティングする請求項１０に記載のキット 。