JPH06153959A - Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット - Google Patents
Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキットInfo
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- JPH06153959A JPH06153959A JP4311572A JP31157292A JPH06153959A JP H06153959 A JPH06153959 A JP H06153959A JP 4311572 A JP4311572 A JP 4311572A JP 31157292 A JP31157292 A JP 31157292A JP H06153959 A JPH06153959 A JP H06153959A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＤＮＡ分子、その分子により発現されるポリ
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。 【構成】 ＨＣＶ非構造領域４のゲノムに由来するＨＣ
Ｖ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチド及びそ
の変性誘導体をコードするＤＮＡ分子、その分子により
発現されるポリペプチド及び診断へのそれらの使用並び
にそれらの生成方法に関する。
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。 【構成】 ＨＣＶ非構造領域４のゲノムに由来するＨＣ
Ｖ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチド及びそ
の変性誘導体をコードするＤＮＡ分子、その分子により
発現されるポリペプチド及び診断へのそれらの使用並び
にそれらの生成方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は、ＤＮＡ分子、その分子に
より発現されるポリペプチド及び診断へのそれらの使用
並びにそれらの生成方法に関する。より詳しくは、それ
はＣ型肝炎ウィルスのための診断用ＤＮＡ分子、診断用
タンパク質、診断用抗体及び保護ポリペプチドに関す
る。
より発現されるポリペプチド及び診断へのそれらの使用
並びにそれらの生成方法に関する。より詳しくは、それ
はＣ型肝炎ウィルスのための診断用ＤＮＡ分子、診断用
タンパク質、診断用抗体及び保護ポリペプチドに関す
る。
【０００２】
【発明の背景】輸血から生じる肝炎のほとんどの場合
は、ウィルス誘発され、そして既知の肝炎ウィルス、た
とえばＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）及びＢ型肝炎ウィル
ス（ＨＢＶ）により引き起こされる他の形のウィルス関
連肝臓疾患とは区別できる。前記非−Ａ，非−Ｂ肝炎
（ＮＡＮＢＨ）の病因性物質は、多くの研究グループに
よりこれまでずっと研究されており、そして現在、Ｃ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と思われている。後輸血肝炎
（ＰＴＨ）は輸血患者の約１０％に生じ、そしてＮＡＮ
ＢＨはそれらの患者の９０％以上に発生する。この疾患
における主問題は、慢性肝臓損傷への頻繁な進行である
（２５〜５０％）。従って、汚染された血液又は血液製
品におけるＨＣＶを検出するための感度の高く且つ特異
的な方法が要求されている。
は、ウィルス誘発され、そして既知の肝炎ウィルス、た
とえばＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）及びＢ型肝炎ウィル
ス（ＨＢＶ）により引き起こされる他の形のウィルス関
連肝臓疾患とは区別できる。前記非−Ａ，非−Ｂ肝炎
（ＮＡＮＢＨ）の病因性物質は、多くの研究グループに
よりこれまでずっと研究されており、そして現在、Ｃ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と思われている。後輸血肝炎
（ＰＴＨ）は輸血患者の約１０％に生じ、そしてＮＡＮ
ＢＨはそれらの患者の９０％以上に発生する。この疾患
における主問題は、慢性肝臓損傷への頻繁な進行である
（２５〜５０％）。従って、汚染された血液又は血液製
品におけるＨＣＶを検出するための感度の高く且つ特異
的な方法が要求されている。
【０００３】ＨＣＶは初め、分子クローニング及びその
ＲＮＡゲノムの特徴化により Choo,など．(Science 24
4： 359〜362, 1989)によって同定された。酵母におい
て組換えＤＮＡ法により合成された、Ｃ100-３と命名さ
れた前記ＨＣＶ抗原を用いることによる特異的アッセイ
が、またＨＣＶの抗体の検出のために開発された（Scie
nce 244 ： 362〜364)。ＨＣＶのゲノム、それに由来す
る cＤＮＡ配列及び前記ＨＣＶゲノム又はＨＣＶ cＤＮ
Ａに由来するポリペプチド並びに方法論に関する詳細な
説明は、Chiron Corporationの名でＥＰ第０３１８２１
６号に記載されている。特にそのヨーロッパ特許は、Ｈ
ＣＶ抗体の検出のために使用され得る、合成されたポリ
ペプチド、すなわち３６３個のウィルス性アミノ酸を含
むＣ100-３を提供する。現在、Ｃ100-３に基づくＨＣＶ
抗体の検出のためのキットは、Abbott Laboratories に
より商品化されている。
ＲＮＡゲノムの特徴化により Choo,など．(Science 24
4： 359〜362, 1989)によって同定された。酵母におい
て組換えＤＮＡ法により合成された、Ｃ100-３と命名さ
れた前記ＨＣＶ抗原を用いることによる特異的アッセイ
が、またＨＣＶの抗体の検出のために開発された（Scie
nce 244 ： 362〜364)。ＨＣＶのゲノム、それに由来す
る cＤＮＡ配列及び前記ＨＣＶゲノム又はＨＣＶ cＤＮ
Ａに由来するポリペプチド並びに方法論に関する詳細な
説明は、Chiron Corporationの名でＥＰ第０３１８２１
６号に記載されている。特にそのヨーロッパ特許は、Ｈ
ＣＶ抗体の検出のために使用され得る、合成されたポリ
ペプチド、すなわち３６３個のウィルス性アミノ酸を含
むＣ100-３を提供する。現在、Ｃ100-３に基づくＨＣＶ
抗体の検出のためのキットは、Abbott Laboratories に
より商品化されている。
【０００４】上記ヨーロッパ特許に示唆されるように、
ＨＣＶはフラビウィルス又はフラビ様ウィルスである。
一般的に、形態学的には、フラビウィルスは脂質の二層
によりとり囲まれる中央ヌクレオキャプシドを含む。Ｃ
型肝炎ウィルスタンパク質は、ヌクレオキャプシド（コ
ア）タンパク質(C) 及び２種のグリコシル化されたエン
ベロープタンパク質（Ｅ１，Ｅ２) を含む構造タンパク
質及び非構造タンパク質（ＮＳ１−５）から成ると思わ
れる。しかしながら、その対応するウィルスはまだ単離
されても又は特徴づけられてもいない。Choo, など．に
より開示された前記Ｃ100-３はＨＣＶゲノムの非構造領
域３−４の部分によりコードされるタンパク質であるこ
とのみが確かめられている。
ＨＣＶはフラビウィルス又はフラビ様ウィルスである。
一般的に、形態学的には、フラビウィルスは脂質の二層
によりとり囲まれる中央ヌクレオキャプシドを含む。Ｃ
型肝炎ウィルスタンパク質は、ヌクレオキャプシド（コ
ア）タンパク質(C) 及び２種のグリコシル化されたエン
ベロープタンパク質（Ｅ１，Ｅ２) を含む構造タンパク
質及び非構造タンパク質（ＮＳ１−５）から成ると思わ
れる。しかしながら、その対応するウィルスはまだ単離
されても又は特徴づけられてもいない。Choo, など．に
より開示された前記Ｃ100-３はＨＣＶゲノムの非構造領
域３−４の部分によりコードされるタンパク質であるこ
とのみが確かめられている。
【０００５】さらに、酵素結合イムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）が、 Chiba, など. (Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 88：4641〜4645, 1991) により組換えバキ
ュロウィルスにより合成されたＨＣＶコアタンパク質
(ｐ22) を用いて、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の
血清学的診断のために開発された。Chiba などは、グリ
コシル化されていない２２−kDa のヌクレオカプシド
（コア）タンパク質を用いることによってＨＣＶ感染を
診断するための特異的に感受性の方法を開発するために
抗体検出システムを確立した。本発明は、ＨＣＶ非構造
タンパク質をコードするＤＮＡ分子を開示し、そしてさ
らにＨＣＶ抗体アッセイ手段を提供する。
イ（ＥＬＩＳＡ）が、 Chiba, など. (Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 88：4641〜4645, 1991) により組換えバキ
ュロウィルスにより合成されたＨＣＶコアタンパク質
(ｐ22) を用いて、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の
血清学的診断のために開発された。Chiba などは、グリ
コシル化されていない２２−kDa のヌクレオカプシド
（コア）タンパク質を用いることによってＨＣＶ感染を
診断するための特異的に感受性の方法を開発するために
抗体検出システムを確立した。本発明は、ＨＣＶ非構造
タンパク質をコードするＤＮＡ分子を開示し、そしてさ
らにＨＣＶ抗体アッセイ手段を提供する。
【０００６】
【発明の要約】従って、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）非
構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチドをコードす
るＤＮＡ分子を供給することが本発明の目的である。さ
らに詳しくは、本発明は、ＨＣＶのゲノムに由来するＤ
ＮＡ分子を供給する。そのＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）技法により、Ｃ型肝炎を有する患者の
血漿からクローンされた。
構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチドをコードす
るＤＮＡ分子を供給することが本発明の目的である。さ
らに詳しくは、本発明は、ＨＣＶのゲノムに由来するＤ
ＮＡ分子を供給する。そのＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）技法により、Ｃ型肝炎を有する患者の
血漿からクローンされた。
【０００７】前記ＤＮＡ分子の一部は、サンプルにおけ
るウィルスの存在を検出するためのプローブとして有用
である。同様に、本発明のＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造
タンパク質の抗原性を示すウィルスポリペプチドを適切
な宿主に生成できる。
るウィルスの存在を検出するためのプローブとして有用
である。同様に、本発明のＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造
タンパク質の抗原性を示すウィルスポリペプチドを適切
な宿主に生成できる。
【０００８】ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポ
リペプチドを供給することが本発明のもう１つの目的で
ある。前記ポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子により
形質転換された適切な宿主により生成される。
リペプチドを供給することが本発明のもう１つの目的で
ある。前記ポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子により
形質転換された適切な宿主により生成される。
【０００９】また、ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を
示すポリペプチドを生成するための方法を提供すること
も本発明の目的である。その方法は、本発明のＤＮＡ分
子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を
インキュベートすることを含んで成る。
示すポリペプチドを生成するための方法を提供すること
も本発明の目的である。その方法は、本発明のＤＮＡ分
子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を
インキュベートすることを含んで成る。
【００１０】さらに、プローブとして前記ＨＣＶ非構造
タンパク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗
体を検出するための方法を提供することが本発明のもう
１つの目的である。その方法は、抗原−抗体複合体を形
成するために、サンプル中のＨＣＶに対して向けられる
抗体に結合できるプローブとして前記ＨＣＶ非構造タン
パク質を用いることによって特徴づけられるイムノアッ
セイ又はウェスターンブロットにより実施され得る。
タンパク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗
体を検出するための方法を提供することが本発明のもう
１つの目的である。その方法は、抗原−抗体複合体を形
成するために、サンプル中のＨＣＶに対して向けられる
抗体に結合できるプローブとして前記ＨＣＶ非構造タン
パク質を用いることによって特徴づけられるイムノアッ
セイ又はウェスターンブロットにより実施され得る。
【００１１】本発明はまた、プローブとしてＨＣＶコア
抗原タンパク質と組合わされた前記ＨＣＶ非構造タンパ
ク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗体を検
出するための方法を包含する。
抗原タンパク質と組合わされた前記ＨＣＶ非構造タンパ
ク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗体を検
出するための方法を包含する。
【００１２】前記ＨＣＶ非構造タンパク質を含んで成
る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサンプルを
分析するためのキットを提供することが本発明のもう１
つの目的である。特に、ＨＣＶ抗体を検出するためのイ
ムノアッセイのためのキットは、前記ＨＣＶ非構造タン
パク質及び適切な固相を含んで成る。
る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサンプルを
分析するためのキットを提供することが本発明のもう１
つの目的である。特に、ＨＣＶ抗体を検出するためのイ
ムノアッセイのためのキットは、前記ＨＣＶ非構造タン
パク質及び適切な固相を含んで成る。
【００１３】前記ＨＣＶ非構造タンパク質に対して向け
られるモノクローナル及びポリクローナル抗体を供給す
ることが本発明のもう１つの目的である。また、前記Ｈ
ＣＶ非構造タンパク質により動物を免疫化することによ
って前記抗体を生成するための方法も、本発明に包含さ
れる。サンプル中のＨＣＶを分析するための方法が、そ
の獲得抗体を用いることによって確立され得る。
られるモノクローナル及びポリクローナル抗体を供給す
ることが本発明のもう１つの目的である。また、前記Ｈ
ＣＶ非構造タンパク質により動物を免疫化することによ
って前記抗体を生成するための方法も、本発明に包含さ
れる。サンプル中のＨＣＶを分析するための方法が、そ
の獲得抗体を用いることによって確立され得る。
【００１４】本発明の免疫原性ポリペプチド又は不活性
化された調製物又は弱められたその調製物を含んで成
る、ＨＣＶ感染の保護のためのワクチンを供給すること
が本発明のさらにもう１つの目的である。本発明のこれ
らの及び他の目的，利点及び特徴は、次の特定の記載及
び実施例からさらに十分に理解されるであろう。
化された調製物又は弱められたその調製物を含んで成
る、ＨＣＶ感染の保護のためのワクチンを供給すること
が本発明のさらにもう１つの目的である。本発明のこれ
らの及び他の目的，利点及び特徴は、次の特定の記載及
び実施例からさらに十分に理解されるであろう。
【００１５】
【発明の特定の記載】本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（Ｈ
ＣＶ）非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチドを
コードするＤＮＡ分子を供給する。そのＤＮＡ分子は、
ＨＣＶ感染された患者の血漿に存在する核酸配列から単
離され、そして患者の血漿からウィルス粒子を単離し、
そのウィルス核酸配列を抽出し、そして精製し、そして
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を通して所望するＤＮＡ
分子をクローン化する段階を包含する。ＰＣＲ技法は、
特定のプライマーを用いることによる選択及び逆転写酵
素を用いることによる増幅の段階を含んで成る。ＰＣＲ
に使用されるプライマーは、次のものである： (i) 5'-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3' 及び (ii) 5'-GGATCCAGCCAAATTTGGATTTGGCCGAATGTGGGGG-3'.
ＣＶ）非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチドを
コードするＤＮＡ分子を供給する。そのＤＮＡ分子は、
ＨＣＶ感染された患者の血漿に存在する核酸配列から単
離され、そして患者の血漿からウィルス粒子を単離し、
そのウィルス核酸配列を抽出し、そして精製し、そして
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を通して所望するＤＮＡ
分子をクローン化する段階を包含する。ＰＣＲ技法は、
特定のプライマーを用いることによる選択及び逆転写酵
素を用いることによる増幅の段階を含んで成る。ＰＣＲ
に使用されるプライマーは、次のものである： (i) 5'-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3' 及び (ii) 5'-GGATCCAGCCAAATTTGGATTTGGCCGAATGTGGGGG-3'.
【００１６】クローンされたＤＮＡ分子は、同定のため
に起源のＨＣＶ粒子とのハイブリダイゼーションを受け
やすい。このようにして得られた分子は、ＥＮ−80−1
と命名される。分子ＥＮ−80−1 のＤＮＡ配列は図１に
示される。そのＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造領域４のゲ
ノムに由来し、そして７００bpを有する。ＤＮＡ分子の
一部は、サンプル中のＨＣＶ核酸の存在を診断するため
にプローブとして有用である。
に起源のＨＣＶ粒子とのハイブリダイゼーションを受け
やすい。このようにして得られた分子は、ＥＮ−80−1
と命名される。分子ＥＮ−80−1 のＤＮＡ配列は図１に
示される。そのＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造領域４のゲ
ノムに由来し、そして７００bpを有する。ＤＮＡ分子の
一部は、サンプル中のＨＣＶ核酸の存在を診断するため
にプローブとして有用である。
【００１７】本発明のＤＮＡ分子は、発現ベクターを形
成するために適切なベクター中に挿入される。そのベク
ターは、宿主細胞中で複製できるプラスミド、バクテリ
オファジ又はいずれか他のＤＮＡ配列であり得る。好ま
しいベクターは、プロテーター lacを有するプラスミド
である。本発明の態様において、ビークルプラスミド及
び本発明のＤＮＡ分子により構成される発現プラスミ
ド、 pＥＮ−1 が図２に示される。
成するために適切なベクター中に挿入される。そのベク
ターは、宿主細胞中で複製できるプラスミド、バクテリ
オファジ又はいずれか他のＤＮＡ配列であり得る。好ま
しいベクターは、プロテーター lacを有するプラスミド
である。本発明の態様において、ビークルプラスミド及
び本発明のＤＮＡ分子により構成される発現プラスミ
ド、 pＥＮ−1 が図２に示される。
【００１８】適切な宿主が、本発明のＤＮＡ分子を含む
発現ベクターにより形質転換され、そしてＨＣＶ非構造
タンパク質の抗原性を示すポリペプチドがその形質転換
された宿主に生成され得る。ＨＣＶ非構造タンパク質の
抗原性を示すポリペプチドを生成するための方法が確立
された。
発現ベクターにより形質転換され、そしてＨＣＶ非構造
タンパク質の抗原性を示すポリペプチドがその形質転換
された宿主に生成され得る。ＨＣＶ非構造タンパク質の
抗原性を示すポリペプチドを生成するための方法が確立
された。
【００１９】本発明はまた、ＨＣＶ非構造タンパク質の
抗原性を示すポリペプチドも供給する。そのポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、図１に示される。そのポリペプチ
ドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ルを通しての電気泳動により測定される場合、約26,000
の分子量を有し、そして約２３万個のアミノ酸を有する
ことが推定される。その得られたポリペプチドのＨＣＶ
抗体への結合能力は、ウェスターンブロットにより確か
められる。明らかに、そのポリペプチドは、Ｃ型肝炎を
有する患者の血清と反応性であるが、しかしＣ型肝炎を
有さい人の血清とは反応性でない。この事実は、サンプ
ルにおけるＨＣＶ抗体の存在を検出できるポリペプチド
がＣ型肝炎の診断において可能性を有することを示唆す
る。さらに、ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポ
リペプチド又はその不活性化された調製物又は弱められ
た調製物の免疫学的有効量が、ＨＣＶ感染の防止のため
にワクチンとして配合され得る。
抗原性を示すポリペプチドも供給する。そのポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、図１に示される。そのポリペプチ
ドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ルを通しての電気泳動により測定される場合、約26,000
の分子量を有し、そして約２３万個のアミノ酸を有する
ことが推定される。その得られたポリペプチドのＨＣＶ
抗体への結合能力は、ウェスターンブロットにより確か
められる。明らかに、そのポリペプチドは、Ｃ型肝炎を
有する患者の血清と反応性であるが、しかしＣ型肝炎を
有さい人の血清とは反応性でない。この事実は、サンプ
ルにおけるＨＣＶ抗体の存在を検出できるポリペプチド
がＣ型肝炎の診断において可能性を有することを示唆す
る。さらに、ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポ
リペプチド又はその不活性化された調製物又は弱められ
た調製物の免疫学的有効量が、ＨＣＶ感染の防止のため
にワクチンとして配合され得る。
【００２０】サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶ非構造タンパク質の能
力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセイ
又はウェスターンブロットにより実施され得る。好まし
い方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえば
マイクロリッタープレート、ビーズ及び半透膜がそのイ
ムノアッセイを行うために使用され得る。ラベルとして
の物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検出さ
れ得るいずれか他の材料を包含する。イムノアッセイは
便利には、サンドイッチ法により達成される。特に、酵
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が確立
された。ＥＬＩＳＡは、 1) 固相上にプローブとして本
発明のポリペプチドを被覆し、 2) 抗原−抗体複合体の
形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆されたポリ
ペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプルを
インキュベートし、 3) 前記固相に結合されたその抗原
−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより接合さ
れる抗−抗体（たとえば抗−IgＧ）を添加し、そして
4) その捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含んで成
る。
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶ非構造タンパク質の能
力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセイ
又はウェスターンブロットにより実施され得る。好まし
い方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえば
マイクロリッタープレート、ビーズ及び半透膜がそのイ
ムノアッセイを行うために使用され得る。ラベルとして
の物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検出さ
れ得るいずれか他の材料を包含する。イムノアッセイは
便利には、サンドイッチ法により達成される。特に、酵
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が確立
された。ＥＬＩＳＡは、 1) 固相上にプローブとして本
発明のポリペプチドを被覆し、 2) 抗原−抗体複合体の
形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆されたポリ
ペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプルを
インキュベートし、 3) 前記固相に結合されたその抗原
−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより接合さ
れる抗−抗体（たとえば抗−IgＧ）を添加し、そして
4) その捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含んで成
る。
【００２１】他のアッセイ法は、プローブとしてＨＣＶ
コア抗原タンパク質と組合わされる本発明のポリペプチ
ドを用いることによって実施され得る。そのアッセイ
は、より特異的で且つ高い感度を有すると思われる。
コア抗原タンパク質と組合わされる本発明のポリペプチ
ドを用いることによって実施され得る。そのアッセイ
は、より特異的で且つ高い感度を有すると思われる。
【００２２】本発明は、さらにＨＣＶ抗体の存在につい
てサンプル分析するためのキットを提供する。そのキッ
トは、ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプ
チド及び適切な固相（ここで、好ましくは、前記ＨＣＶ
非構造タンパク質は前記固相に被覆される）を含んで成
る。
てサンプル分析するためのキットを提供する。そのキッ
トは、ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプ
チド及び適切な固相（ここで、好ましくは、前記ＨＣＶ
非構造タンパク質は前記固相に被覆される）を含んで成
る。
【００２３】本発明は、前記ＨＣＶ非構造タンパク質に
対して向けられるモノクロナール及びポリクロナール抗
体を提供する。その抗体は、ハイブリドーマを調製する
ための標準の方法及び／又は従来の方法を通して、免疫
原として本発明のＨＣＶ非構造タンパク質を用いること
によって調製される。得られた抗体は、ＨＣＶを検出す
るための方法を開発する可能性を有する。次の例は例示
的であって、本発明を限定するものではない。
対して向けられるモノクロナール及びポリクロナール抗
体を提供する。その抗体は、ハイブリドーマを調製する
ための標準の方法及び／又は従来の方法を通して、免疫
原として本発明のＨＣＶ非構造タンパク質を用いること
によって調製される。得られた抗体は、ＨＣＶを検出す
るための方法を開発する可能性を有する。次の例は例示
的であって、本発明を限定するものではない。
【００２４】
例 Ｉ．ＨＣＶ cＤＮＡのクローニング Ｃ型肝炎ウィルスにより感染された患者の血漿を集め、
そして４０℃で超遠心分離し、そして次にウィルス粒子
を得る。続いて、ウィルス核酸（ＲＮＡ）を、ウィルス
粒子からグアニジンイソチオシアネート及び酸性フェノ
ールを用いて抽出し、そして精製する。
そして４０℃で超遠心分離し、そして次にウィルス粒子
を得る。続いて、ウィルス核酸（ＲＮＡ）を、ウィルス
粒子からグアニジンイソチオシアネート及び酸性フェノ
ールを用いて抽出し、そして精製する。
【００２５】このようにして得られた核酸は、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を受けやすい。 cＤＮＡ分子を前
記ＰＣＲによりクローン化し、ここで次のオリゴヌクレ
オチド配列がプライマーとして使用され： (i) 5'-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3' 及び (ii) 5'-GGATCCAGCCAAATTTGGATTTGGCCGAATGTGGGGG-3' そしてそのクローン化されたＤＮＡを、逆転写酵素を用
いて増幅する。
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を受けやすい。 cＤＮＡ分子を前
記ＰＣＲによりクローン化し、ここで次のオリゴヌクレ
オチド配列がプライマーとして使用され： (i) 5'-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3' 及び (ii) 5'-GGATCCAGCCAAATTTGGATTTGGCCGAATGTGGGGG-3' そしてそのクローン化されたＤＮＡを、逆転写酵素を用
いて増幅する。
【００２６】クローン化されたＤＮＡ分子は、同定のた
めに起源のＨＣＶ粒子によるハイブリダイゼーションを
受けやすい。得られた分子を、ＥＮ−80−1 と命名す
る。分子ＥＮ−80−1 のＤＮＡ分子は図１に示される。
ＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造領域４のゲノムに由来し、
そして７００bpを有する。
めに起源のＨＣＶ粒子によるハイブリダイゼーションを
受けやすい。得られた分子を、ＥＮ−80−1 と命名す
る。分子ＥＮ−80−1 のＤＮＡ分子は図１に示される。
ＤＮＡ分子は、ＨＣＶ非構造領域４のゲノムに由来し、
そして７００bpを有する。
【００２７】II．ＨＣＶ cＤＮＡを含むプラスミドの構
成 分子ＥＮ−80−1 を、前記ＨＣＶ cＤＮＡ配列を含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢam
ＨＩ及びＥcoＲＩにより処理する。得られたトランスポ
ゾンを、 pＥＮ−1 と命名される発現プラスミドを得る
ために制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩに
より初めに切断されたプラスミド中に挿入する。ＨＣＶ
cＤＮＡの発現はプロモーター lacの制御下にある。そ
の発現プラスミド pＥＮ−1 の構造及び制限地図は図２
に示される。
成 分子ＥＮ−80−1 を、前記ＨＣＶ cＤＮＡ配列を含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢam
ＨＩ及びＥcoＲＩにより処理する。得られたトランスポ
ゾンを、 pＥＮ−1 と命名される発現プラスミドを得る
ために制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩに
より初めに切断されたプラスミド中に挿入する。ＨＣＶ
cＤＮＡの発現はプロモーター lacの制御下にある。そ
の発現プラスミド pＥＮ−1 の構造及び制限地図は図２
に示される。
【００２８】III. Ｅ．コリ（E.coli) の形質転換 発現プラスミド pＥＮ−1 を、Ｅ．コリ JM109（ＤＥ
３）と共に３７℃で一晩インキュベートする。ＨＣＶ非
構造タンパク質を生成するＥ．コリコロニーを、ウェス
ターンブロットによりそれらの発現生成物をスクリーン
することによって選択する。
３）と共に３７℃で一晩インキュベートする。ＨＣＶ非
構造タンパク質を生成するＥ．コリコロニーを、ウェス
ターンブロットによりそれらの発現生成物をスクリーン
することによって選択する。
【００２９】IV. ＨＣＶコア抗原の生成 形質転換されたＥ．コリコロニーを、ならし培地におい
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約26,000の
分子量を有する。
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約26,000の
分子量を有する。
【００３０】Ｖ．ウェスターンブロットによるＨＣＶ抗
体とＨＣＶ非構造タンパク質との免疫学的に反応性 精製されたポリペプチドは、標準方法によるＳＤＳ電気
泳動を受けやすい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを脱イオン水
により４℃で１５分間洗浄し、そしてブロット用緩衝液
（0.15Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、 pＨ 6.7) により
４℃で２０分間洗浄する。次に、ゲル上のペプチド地図
を、ブロット用緩衝液下でニトロセルロース紙上に１．
３Ａで１〜１．5 時間、エレクトロブロットする。その
紙を洗浄用緩衝液（PBS-Tween 20、pH 7.4) により洗浄
し、そしてブロッキング緩衝液（0.１Ｍの NaCl 、５mM
のＥＤＴＡ、５０mMのトリス、pH 7.2〜7.4 、0.２％の
ウシ胎児血清アルブミン、0.05％の Nonidet p-40 、１
Ｍの尿素）により一晩ブロックする。
体とＨＣＶ非構造タンパク質との免疫学的に反応性 精製されたポリペプチドは、標準方法によるＳＤＳ電気
泳動を受けやすい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを脱イオン水
により４℃で１５分間洗浄し、そしてブロット用緩衝液
（0.15Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、 pＨ 6.7) により
４℃で２０分間洗浄する。次に、ゲル上のペプチド地図
を、ブロット用緩衝液下でニトロセルロース紙上に１．
３Ａで１〜１．5 時間、エレクトロブロットする。その
紙を洗浄用緩衝液（PBS-Tween 20、pH 7.4) により洗浄
し、そしてブロッキング緩衝液（0.１Ｍの NaCl 、５mM
のＥＤＴＡ、５０mMのトリス、pH 7.2〜7.4 、0.２％の
ウシ胎児血清アルブミン、0.05％の Nonidet p-40 、１
Ｍの尿素）により一晩ブロックする。
【００３１】前記紙と、初めに４０％ＮＢＢＳ／トリス
−ＨCl (pH 7.4) により１０倍に希釈されたＣ型肝炎を
有するか又は有さない対象の血清とを４０℃で２時間反
応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝液により３
度洗浄する。前記紙と抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体（こ
の後に記載されるようにして調製される）とを４０℃で
２時間、反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝
液により３度洗浄し、そして次に１０mlの基質溶液（0.
01％の 4−ethloro −１−Napthol 、１８％のメタノー
ル、0.04Ｍのトリス、pH 7.2〜7.4 、0.１Ｍの NaCl 及
び 0.01%のH2O2) と２０分間反応せしめる。本発明のポ
リペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血清と反
応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性でな
い。
−ＨCl (pH 7.4) により１０倍に希釈されたＣ型肝炎を
有するか又は有さない対象の血清とを４０℃で２時間反
応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝液により３
度洗浄する。前記紙と抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体（こ
の後に記載されるようにして調製される）とを４０℃で
２時間、反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝
液により３度洗浄し、そして次に１０mlの基質溶液（0.
01％の 4−ethloro −１−Napthol 、１８％のメタノー
ル、0.04Ｍのトリス、pH 7.2〜7.4 、0.１Ｍの NaCl 及
び 0.01%のH2O2) と２０分間反応せしめる。本発明のポ
リペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血清と反
応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性でな
い。
【００３２】VI. ＨＣＶ抗体についてのＥＬＩＳＡ (1) マイクロリッタープレートの処理 マイクロリッタープレートを、本発明の精製されたポリ
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロリッタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。 (2) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体の調製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈIgＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。その
接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロリッタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。 (2) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体の調製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈIgＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。その
接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
【００３３】(3) 試薬の成分 (a) 洗浄用溶液: ０．９％ NaCl 及び Thimerosal を含
むリン酸緩衝液。 (b) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質安定
剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記のよ
うにして調製された抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体。 (c) サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を含
むトリス緩衝液。 (d) ＯＰＤ基質溶液： H2O2 を含むクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ). (その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は汚
染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 (e) 停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 (f) 陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定剤
及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型肝
炎を有する又は有さない人の血清サンプル。
むリン酸緩衝液。 (b) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質安定
剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記のよ
うにして調製された抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体。 (c) サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を含
むトリス緩衝液。 (d) ＯＰＤ基質溶液： H2O2 を含むクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ). (その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は汚
染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 (e) 停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 (f) 陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定剤
及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型肝
炎を有する又は有さない人の血清サンプル。
【００３４】(4) 方法： (a) サンプル希釈剤により希釈された（１: 10 )の試験
サンプル１５０μl及び陽性／陰性の対照を、処理され
たマイクロリッタープレートのウェル中に添加する。い
くつかのウェルは、基質ブランクとして保持されるべき
である。 (b) 前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３７
〜４０℃で１時間インキュベートする。 (c) プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により３
度洗浄する。 (d) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μl を個々
のウェルに添加する。 (e) プレートを３７〜４０℃で３０分間、振盪しながら
インキュベートする。 (f) プレートを５度洗浄する。 (g) ＯＰＤ基質溶液１００μl を個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 (h) 停止溶液１００μl を個々のウェルに添加し、そし
て軽く混合し、反応を停止する。 (i) ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計により
測定する。
サンプル１５０μl及び陽性／陰性の対照を、処理され
たマイクロリッタープレートのウェル中に添加する。い
くつかのウェルは、基質ブランクとして保持されるべき
である。 (b) 前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３７
〜４０℃で１時間インキュベートする。 (c) プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により３
度洗浄する。 (d) 抗−ｈIgＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μl を個々
のウェルに添加する。 (e) プレートを３７〜４０℃で３０分間、振盪しながら
インキュベートする。 (f) プレートを５度洗浄する。 (g) ＯＰＤ基質溶液１００μl を個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 (h) 停止溶液１００μl を個々のウェルに添加し、そし
て軽く混合し、反応を停止する。 (i) ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計により
測定する。
【００３５】(5) 決定：ウェル当たりのＯＤ492nm 値
は、ブランク（バックグラウンド）の読取りの平均を引
き算する。陽性対照（ＰＣx)の読取りの平均と陰性対照
（ＮＣx)の読取りの平均との間の差異（ＰＣx −ＮＣx)
は、０．５に等しいか又はそれ以上であるべきである。
は、ブランク（バックグラウンド）の読取りの平均を引
き算する。陽性対照（ＰＣx)の読取りの平均と陰性対照
（ＮＣx)の読取りの平均との間の差異（ＰＣx −ＮＣx)
は、０．５に等しいか又はそれ以上であるべきである。
【００３６】カット−オフ（ＣＯ）値は、次の式により
計算される： ＣＯ＝ＰＣx ×０．１５＋ＮＣx 試験サンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプ
ルは陰性であると思われる（すなわち、ＨＣＶ抗体はサ
ンプルに検出されない）。
計算される： ＣＯ＝ＰＣx ×０．１５＋ＮＣx 試験サンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプ
ルは陰性であると思われる（すなわち、ＨＣＶ抗体はサ
ンプルに検出されない）。
【００３７】試験サンプルの読取りがＣＯ値に等しいか
又はそれ以上である場合、サンプルは陽性であることが
予測されるが；しかしながら、サンプルについてのアッ
セイを二重反復する必要がある。いずれかの二重反復サ
ンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプルは陰
性であろう。二重反復サンプルがＣＯ値以上か又はそれ
に等しい場合、それらのサンプルは陽性であろう。
又はそれ以上である場合、サンプルは陽性であることが
予測されるが；しかしながら、サンプルについてのアッ
セイを二重反復する必要がある。いずれかの二重反復サ
ンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプルは陰
性であろう。二重反復サンプルがＣＯ値以上か又はそれ
に等しい場合、それらのサンプルは陽性であろう。
【００３８】試験サンプルの読取りがＮＣx 以上である
が、しかしＣＯ値よりも２０％低い場合、そのサンプル
は疑わしいサンプルとして見なされるべきであり、そし
てアッセイをサンプルについてくり返すべきである。
が、しかしＣＯ値よりも２０％低い場合、そのサンプル
は疑わしいサンプルとして見なされるべきであり、そし
てアッセイをサンプルについてくり返すべきである。
【００３９】２７種のサンプルを、本発明に従ってＥＬ
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ100-3 を用いることによってＨＣＶ抗体ア
ッセイにより試験した（すなわち Abbott's キット(I)
及び (II) 。Abbott's キットの試験結果と本発明のア
ッセイの試験結果との間の比較を、表１に示す。サンプ
ルＧ３０及びＧ１２８の結果は Abbott's キット(I) に
より陰性であるが、しかし本発明のアッセイによれば陽
性であり、ところが本発明の結果は Abbott'sキット(I
I)による結果と同じであることが注目される。
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ100-3 を用いることによってＨＣＶ抗体ア
ッセイにより試験した（すなわち Abbott's キット(I)
及び (II) 。Abbott's キットの試験結果と本発明のア
ッセイの試験結果との間の比較を、表１に示す。サンプ
ルＧ３０及びＧ１２８の結果は Abbott's キット(I) に
より陰性であるが、しかし本発明のアッセイによれば陽
性であり、ところが本発明の結果は Abbott'sキット(I
I)による結果と同じであることが注目される。
【００４０】
【表１】
【００４１】VII. ＨＣＶコア抗原タンパク質と組合わ
されたＨＣＶ非構造タンパク質によるＨＣＶ抗体の検出 この方法は、上記ＥＬＩＳＡに類似するが、しかしＨＣ
Ｖコア抗原タンパク質と組合わされた（１：９）本発明
のＨＣＶ非構造タンパク質がプレート上に被覆されるべ
きＨＣＶ非構造タンパク質交換される。２４種のサンプ
ルを上記方法により試験した。同時に、サンプルをまた
Abbott's キット(II)により試験した。結果は下記表２
に示される。 Abbott's アッセイの結果は上記方法と同
じであることが示唆される。
されたＨＣＶ非構造タンパク質によるＨＣＶ抗体の検出 この方法は、上記ＥＬＩＳＡに類似するが、しかしＨＣ
Ｖコア抗原タンパク質と組合わされた（１：９）本発明
のＨＣＶ非構造タンパク質がプレート上に被覆されるべ
きＨＣＶ非構造タンパク質交換される。２４種のサンプ
ルを上記方法により試験した。同時に、サンプルをまた
Abbott's キット(II)により試験した。結果は下記表２
に示される。 Abbott's アッセイの結果は上記方法と同
じであることが示唆される。
【００４２】
【表２】
【００４３】VIII. ＨＣＶに対する抗体の調製 ＨＣＶ非構造タンパク質に対する抗体を、本発明の非構
造タンパク質により動物を免疫化することによって生成
することができる。モノクローナル抗体を製造するため
の標準の方法によれば、BAL-b/c マウスを、アジュバン
ドと共に混合された、例IIに記載されるような精製され
た非構造タンパク質により免疫化し；そして次に、脾臓
細胞を、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫
細胞（ＦＯ細胞系）により融合し、ハイブリドーマ細胞
を形成する。所望するクローン生成モノクローナル抗体
を、そのようにし調製されたハイブリドーマクローンに
より生成された抗体の力価をスクリーンすることによっ
て得ることができる。本発明の態様において、クローン
されたハイブリドーマをＥＮ−80−１−99と命名する。
そのクローンにより生成される抗体は高い力価を有し；
すなわち2.56×１05倍に希釈された抗体でもまだ高い力
価を有する。
造タンパク質により動物を免疫化することによって生成
することができる。モノクローナル抗体を製造するため
の標準の方法によれば、BAL-b/c マウスを、アジュバン
ドと共に混合された、例IIに記載されるような精製され
た非構造タンパク質により免疫化し；そして次に、脾臓
細胞を、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫
細胞（ＦＯ細胞系）により融合し、ハイブリドーマ細胞
を形成する。所望するクローン生成モノクローナル抗体
を、そのようにし調製されたハイブリドーマクローンに
より生成された抗体の力価をスクリーンすることによっ
て得ることができる。本発明の態様において、クローン
されたハイブリドーマをＥＮ−80−１−99と命名する。
そのクローンにより生成される抗体は高い力価を有し；
すなわち2.56×１05倍に希釈された抗体でもまだ高い力
価を有する。
【００４４】サンプル中のＨＣＶの存在を検出するため
の診断キット又はＨＣＶ細胞が都合良く培養されるかど
うかを決定するためのキットを、ＥＩＡ及びサンドイッ
チ法により、関連するその得られた抗体を用いて改良す
ることができる。
の診断キット又はＨＣＶ細胞が都合良く培養されるかど
うかを決定するためのキットを、ＥＩＡ及びサンドイッ
チ法により、関連するその得られた抗体を用いて改良す
ることができる。
【００４５】本発明の１つの態様のみがここに記載され
ているが、その修飾が当業者により容易に行われ得るで
あろう。従って、本明細書に言及される修飾及び本発明
の範囲内でのすべての他の修飾は、本発明の特許請求の
範囲内に包含される。
ているが、その修飾が当業者により容易に行われ得るで
あろう。従って、本明細書に言及される修飾及び本発明
の範囲内でのすべての他の修飾は、本発明の特許請求の
範囲内に包含される。
【図１】これは、本発明のＨＣＶ非構造領域４のゲノム
に由来するＤＮＡ配列及びそこにコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。
に由来するＤＮＡ配列及びそこにコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。
【図２】これは、ＨＣＶ非構造タンパク質をコードする
cＤＮＡをプラスミド中に挿入することによって構成さ
れる発現ベクターの構造を示す。この図はまた、ベクタ
ー pＥＮ−1 の有意な特徴を示す制限地図も示す。
cＤＮＡをプラスミド中に挿入することによって構成さ
れる発現ベクターの構造を示す。この図はまた、ベクタ
ー pＥＮ−1 の有意な特徴を示す制限地図も示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶ非構造タンパク質の能
力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセイ
又はウェスターンブロットにより実施され得る。好まし
い方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえば
マイクロタイタープレート、ビーズ及び半透膜がそのイ
ムノアッセイを行うために使用され得る。ラベルとして
の物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検出さ
れ得るいずれか他の材料を包含する。イムノアッセイは
便利には、サンドイッチ法により達成される。特に、酵
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が確立
された。ＥＬＩＳＡは、１) 固相上にプローブとして本
発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複合体の
形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆されたポリ
ペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプルを
インキュベートし、３）前記固相に結合されたその抗原
−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより接合さ
れる抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、そして
４) その捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含んで成
る。
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶ非構造タンパク質の能
力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセイ
又はウェスターンブロットにより実施され得る。好まし
い方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえば
マイクロタイタープレート、ビーズ及び半透膜がそのイ
ムノアッセイを行うために使用され得る。ラベルとして
の物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検出さ
れ得るいずれか他の材料を包含する。イムノアッセイは
便利には、サンドイッチ法により達成される。特に、酵
素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が確立
された。ＥＬＩＳＡは、１) 固相上にプローブとして本
発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複合体の
形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆されたポリ
ペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプルを
インキュベートし、３）前記固相に結合されたその抗原
−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより接合さ
れる抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、そして
４) その捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含んで成
る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】II．ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドの
構成 分子ＥＮ−８０−１を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列を含
むトランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたト
ランスポゾンを、ｐＥＮ−１と命名される発現プラスミ
ドを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩにより初めに切断されたビークル中に挿入す
る。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーター１ａｃの制
御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−１の構造及び
制限地図は図２に示される。
構成 分子ＥＮ−８０−１を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列を含
むトランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたト
ランスポゾンを、ｐＥＮ−１と命名される発現プラスミ
ドを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩにより初めに切断されたビークル中に挿入す
る。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーター１ａｃの制
御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−１の構造及び
制限地図は図２に示される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】IV. ＨＣＶ非構造タンパク質の生成 形質転換されたＥ．コリコロニーを、ならし培地におい
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約２６，０
００の分子量を有する。
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約２６，０
００の分子量を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】前記紙と、初めに４０％ＮＢＢＳ／トリス
−ＨＣｌ (pH７．４) により１０倍に希釈されたＣ型肝
炎により感染された／感染されていない個人の血清とを
４０℃で２時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄
用緩衝液により３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：
ＨＲＰＯ接合体（この後に記載されるようにして調製さ
れる）とを４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の
後、紙を洗浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１
０mlの基質溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１
−Ｎａｐｔｈｏｌ，１８％のメタノール、０．０４Ｍの
トリス、pH７．２〜７．４，０．１ＭのＮａＣｌ及び
０．０１％のＨ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発
明のポリペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血
清と反応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性
でない。
−ＨＣｌ (pH７．４) により１０倍に希釈されたＣ型肝
炎により感染された／感染されていない個人の血清とを
４０℃で２時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄
用緩衝液により３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：
ＨＲＰＯ接合体（この後に記載されるようにして調製さ
れる）とを４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の
後、紙を洗浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１
０mlの基質溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１
−Ｎａｐｔｈｏｌ，１８％のメタノール、０．０４Ｍの
トリス、pH７．２〜７．４，０．１ＭのＮａＣｌ及び
０．０１％のＨ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発
明のポリペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血
清と反応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性
でない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】VI. ＨＣＶ抗体についてのＥＬＩＳＡ （１）マイクロタイタープレートの処理マイクロタイター プレートを、本発明の精製されたポリ
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロタイタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。 （２）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体の調製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈＩｇＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。そ
の接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロタイタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。 （２）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体の調製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈＩｇＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。そ
の接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】（３）試薬の成分 （ａ）洗浄用溶液: ０．９％ＮａＣｌ及びＴｈｉｍｅｒ
ｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ). (その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は
汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｇ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎により感染された／感染されていない個人の血清サ
ンプル。
ｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ). (その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は
汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｇ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎により感染された／感染されていない個人の血清サ
ンプル。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】（４）方法： （ａ）サンプル希釈剤により希釈された（１：１０）の
試験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理
されたマイクロタイタープレートのウェル中に添加す
る。いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持され
るべきである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを振盪することにより軽く混合し、そし
て３７〜４０℃で３０分間インキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
試験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理
されたマイクロタイタープレートのウェル中に添加す
る。いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持され
るべきである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを振盪することにより軽く混合し、そし
て３７〜４０℃で３０分間インキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】１８種のサンプルを、本発明に従ってＥＬ
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ１００−３（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓキ
ット（Ｉ））及びプローブとして構造及び非構造タンパ
ク質（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓキット（II））を用い
ることによってＨＣＶ抗体アッセイにより試験した。Ａ
ｂｂｏｔｔ’ｓキットの試験結果と本発明のアッセイの
試験結果との間の比較を、表１に示す。サンプルＧ３０
及びＧ１２８の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキット（Ｉ）に
より陰性であるが、しかし本発明のアッセイによれば陽
性であり、ところが本発明の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキ
ット（II）による結果と同じであることが注目される。
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ１００−３（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓキ
ット（Ｉ））及びプローブとして構造及び非構造タンパ
ク質（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓキット（II））を用い
ることによってＨＣＶ抗体アッセイにより試験した。Ａ
ｂｂｏｔｔ’ｓキットの試験結果と本発明のアッセイの
試験結果との間の比較を、表１に示す。サンプルＧ３０
及びＧ１２８の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキット（Ｉ）に
より陰性であるが、しかし本発明のアッセイによれば陽
性であり、ところが本発明の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキ
ット（II）による結果と同じであることが注目される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】 表 １ ─────────────────────────────────── サンプル番号 ＯＤ492nm 結果 対 照 Abbott's キット (I) (II) ─────────────────────────────────── ＴＳＧＨ 56 ＞２.0 陽性 陽性 陽性 Ｇ 23 0.813 陽性 陽性 陽性 Ｇ 26 1.607 陽性 陽性 陽性 Ｇ 30 ＞２.0 陽性 陰性 陽性 Ｇ 32 ＞２.0 陽性 陽性 陽性 Ｇ 56 ＞２.0 陽性 陽性 陽性 Ｇ 128 ＞２.0 陽性 陰性 陽性 Ｇ 186 ＞２.0 陽性 陽性 陽性 Ｇ 208 ＞２.0 陽性 − 陽性 Ｇ 214 ＞２.0 陽性 − 陽性 Ｇ 231 ＞２.0 陽性 − 陽性 Ｙ 1 ＞２.0 陽性 − 陽性 ＵＳＢ 9 ＞２.0 陽性 − 陽性 ＵＳＢ 19 ＞２.0 陽性 − 陽性 ＵＳＢ 20 ＞２.0 陽性 − 陽性 Ｇ 201 0.062 陰性 − 陰性 Ｇ 202 0.072 陰性 − 陰性 Ｇ 211 0.059 陰性 − 陰性 ───────────────────────────────────
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】VIII. ＨＣＶに対する抗体の調製 ＨＣＶ非構造タンパク質に対する抗体を、本発明の非構
造タンパク質により動物を免疫化することによって生成
することができる。モノクローナル抗体を製造するため
の標準の方法によれば、ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスを、アジ
ュバンドと共に混合された、例IIに記載されるような精
製された非構造タンパク質により免疫化し；そして次
に、脾臓細胞を、ポリエチレングリコールを用いてマウ
ス骨髄腫細胞（ＦＯ細胞系）により融合し、ハイブリド
ーマ細胞を形成する。所望するクローン生成モノクロー
ナル抗体を、そのようにし調製されたハイブリドーマク
ローンにより生成された抗体の力価をスクリーンするこ
とによって得ることができる。本発明の態様において、
クローンされたハイブリドーマをＥＮ−８０−１−９９
と命名する。そのクローンにより生成される抗体は高い
力価を有し；すなわち２．５６×１０5 倍に希釈された
抗体でもまだ高い力価を有する。
造タンパク質により動物を免疫化することによって生成
することができる。モノクローナル抗体を製造するため
の標準の方法によれば、ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスを、アジ
ュバンドと共に混合された、例IIに記載されるような精
製された非構造タンパク質により免疫化し；そして次
に、脾臓細胞を、ポリエチレングリコールを用いてマウ
ス骨髄腫細胞（ＦＯ細胞系）により融合し、ハイブリド
ーマ細胞を形成する。所望するクローン生成モノクロー
ナル抗体を、そのようにし調製されたハイブリドーマク
ローンにより生成された抗体の力価をスクリーンするこ
とによって得ることができる。本発明の態様において、
クローンされたハイブリドーマをＥＮ−８０−１−９９
と命名する。そのクローンにより生成される抗体は高い
力価を有し；すなわち２．５６×１０5 倍に希釈された
抗体でもまだ高い力価を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ 1/70 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/535 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (42)
- 【請求項１】 ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス）非構造領域
４のゲノムに由来するＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性
を示すポリペプチド及びその変性誘導体をコードするＤ
ＮＡ分子。 - 【請求項２】 図１に示されるようなＤＮＡ配列を有す
るＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチド
及びその変性誘導体をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 ＨＣＶにより感染された患者の血漿から
単離される請求項１又は２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 ＨＣＶ非構造領域４のゲノムに由来する
ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチド及
びその変性誘導体をコードするＤＮＡ分子に由来するＣ
型肝炎ウィルスヌクレオチドのためのプローブ。 - 【請求項５】 適切な宿主においてＨＣＶ非構造タンパ
ク質の抗原性を示すポリペプチドを生成することができ
る請求項１又は２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス）非構造領域
４のゲノムに由来するＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性
を示すポリペプチド及びその変性誘導体をコードするＤ
ＮＡ分子をクローニングするための方法であって、Ｃ型
肝炎の患者の血清からＲＮＡを単離し、そしてポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を通して前記ＤＮＡ分子をクロー
ニングすることを含んで成る方法。 - 【請求項７】 下記配列がプライマーとして使用され
る： (i) 5'-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3' 及び (ii) 5'-GGATCCAGCCAAATTTGGATTTGGCCGAATGTGGGGG-3' 請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ＨＣＶの非構造領域４のゲノムによりコ
ードされるＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリ
ペプチド、及びその誘導体。 - 【請求項９】 図１に示されるアミノ酸配列を有するＨ
ＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペプチド、及
びその誘導体。 - 【請求項１０】 26,000の分子量を有する請求項８又は
９記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子によ
り形質転換された適切な宿主により生成されるポリペプ
チド。 - 【請求項１２】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子の発
現によりＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示すポリペ
プチドを生成するための方法。 - 【請求項１３】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を含
む発現ベクターにより形質転換された適切な宿主細胞と
インキュベートすることを含んで成る請求項１２記載の
方法。 - 【請求項１４】 ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示
すポリペプチドの発現のためのベクターを調製するため
の方法であって、請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を適
切なベクター中に挿入することを含んで成る方法。 - 【請求項１５】 前記適切なベクターを、プラスミド及
びバクテリオファージから選択する請求項１４記載の方
法。 - 【請求項１６】 pＥＮ−1 と命名された、ＨＣＶ非構
造タンパク質の抗原性を示すポリペプチドの発現のため
のプラスミド。 - 【請求項１７】 ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示
すポリペプチドを生成するための宿主を調製するための
方法であって、請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を含む
発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換すること
を含んで成る方法。 - 【請求項１８】 前記適切な宿主がＥ．コリである請求
項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 ＨＣＶ非構造タンパク質の抗原性を示
すポリペプチドを生成するための宿主。 - 【請求項２０】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの方法であって、抗原−抗体複合体を形成するために
サンプルにおけるＨＣＶに対して向けられた抗体に結合
できる請求項８又は９記載のポリペプチドをプローブと
して使用することを特徴とする方法。 - 【請求項２１】 イムノアッセイ又はウェスターンブロ
ットにより実施され得る請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 イムノアッセイにより実施される請求
項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 1) 抗原−抗体複合体を形成を可能にす
る条件下でプローブとしての請求項８又は９記載のポリ
ペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプルを
インキュベートし；そして 2) 前記抗原−抗体複合体を検出することをを含んで成
る請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 固相−イムノアッセイにより実施され
る請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 固相としてマイクロリッタープレート
を用いることを特徴とする請求項２４記載の方法。 - 【請求項２６】 ラベルとして酵素を用いることを特徴
とする請求項２２，２３又は２４記載の方法。 - 【請求項２７】 プローブとしてＨＣＶコア抗原タンパ
ク質と共に組合わされた請求項８又は９記載のポリペプ
チドを用いることを特徴とする請求項２０記載の方法。 - 【請求項２８】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
であって： 1) 固相上に抗原としての請求項８又は９記載のポリペ
プチドを被覆し、 2) 抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で前記
固相上に被覆されたポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含
むと思われるサンプルをインキュベートし、 3) 前記固相に結合された抗原−抗体複合体により捕獲
されるべきラベルにより接合された抗−抗体を添加し、
そして 4) 前記捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを測定することを含んで成
る方法。 - 【請求項２９】 前記固相がマイクロリッタープレート
である請求項２８記載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３０】 前記ラベルが酵素である請求項２８記
載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３１】 前記ラベルがホースラディシュペルオ
キシダーゼである請求項３０記載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３２】 請求項８又は９記載のポリペプチドを
含んで成る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサ
ンプルを分析するためのキット。 - 【請求項３３】 請求項８又は９記載のポリペプチド及
び適切な固相を含んで成る、サンプル中のＨＣＶ抗体を
検出するイムノアッセイのためのキット。 - 【請求項３４】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
のためのキットであって、適切な固相上に被覆された請
求項８又は９記載のポリペプチド及びラベルにより接合
された抗−ヒト抗体を含んで成るキット。 - 【請求項３５】 前記ラベルが酵素である請求項３４記
載のキット。 - 【請求項３６】 前記ラベルがホースラディシュペルオ
キシダーゼである請求項３４又は３５記載のキット。 - 【請求項３７】 免疫源として請求項８又は９記載のポ
リペプチドを用いることによって誘発されるＨＣＶ非構
造タンパク質に対して向けられた抗体。 - 【請求項３８】 ポリクローナル抗体を含んで成る請求
項３７記載の抗体。 - 【請求項３９】 モノクローナル抗体を含んで成る請求
項３７記載の抗体。 - 【請求項４０】 請求項８又は９記載のポリペプチドに
より動物を免疫化することを含んで成る、ＨＣＶ非構造
タンパク質に対して向けられた抗体を生成するための方
法。 - 【請求項４１】 プローブとして請求項３７，３８又は
３９記載の抗体を用いることを特徴とする、サンプル中
のＨＣＶを分析するための方法。 - 【請求項４２】 請求項８又は９記載の免疫原性ポリペ
プチド、その不活性化された調製物及び弱められた調製
物を含んで成るＨＣＶ感染を防ぐためのワクチン。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4311572A JPH06153959A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
| EP93308188A EP0593291A3 (en) | 1992-10-16 | 1993-10-14 | Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96298992A | 1992-10-16 | 1992-10-16 | |
| JP4311572A JPH06153959A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153959A true JPH06153959A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=26566803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4311572A Pending JPH06153959A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153959A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02500880A (ja) * | 1987-11-18 | 1990-03-29 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン |
| JPH04504715A (ja) * | 1989-03-17 | 1992-08-20 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬 |
| JPH04281792A (ja) * | 1990-08-24 | 1992-10-07 | Abbott Lab | 組換え抗原を用いるｃ型肝炎アッセイ |
-
1992
- 1992-11-20 JP JP4311572A patent/JPH06153959A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02500880A (ja) * | 1987-11-18 | 1990-03-29 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン |
| JPH04504715A (ja) * | 1989-03-17 | 1992-08-20 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬 |
| JPH04281792A (ja) * | 1990-08-24 | 1992-10-07 | Abbott Lab | 組換え抗原を用いるｃ型肝炎アッセイ |
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